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UNTERSUCHUNGEN ZUR
GENREGULATORISCHEN AKTIVITÄT
EVOLUTIONÄR KONSERVIERTER,
NICHT-KODIERENDER REGIONEN
IM SOX10 LOCUS
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Torsten Werner aus Greifswald
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Universität Erlangen-Nürnberg.
Tag der mündlichen Prüfung: 19.10.2007
Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. Michael Wegner
Zweitberichterstatter: PD. Dr. Robert Slany
„Carpe diem.“
HORAZ
Inhaltsverzeichnis
IV
Inhaltsverzeichnis
ABBILDUNGSVERZEICHNIS.......................................................................................IX
TABELLENVERZEICHNIS ............................................................................................ X
ZUSAMMENFASSUNG...................................................................................................XI
1 EINLEITUNG..................................................................................................... 1
1.1 Entwicklung des Nervensystems ....................................................................... 1
1.1.1 Entwicklung des Neuralrohrs (Neurulation)......................................................... 1
1.1.2 Entwicklung der Neuralleiste ............................................................................... 3
1.2 Zelltypen des Nervensystems............................................................................. 6
1.2.1 Zelltypen des zentralen Nervensystems (ZNS) .................................................... 6
1.2.2 Zelltypen des peripheren Nervensystems (PNS) .................................................. 7
1.3 Pathologie der Neuralleiste (Neurocristopathien) ........................................... 8
1.3.1 Die Hirschsprung-Erkrankung (HSCR) ............................................................... 8
1.3.2 Das Waardenburg-Syndrom (WS) ....................................................................... 9
1.3.3 Das Shah-Waardenburg-Syndrom (WS4) .......................................................... 10
1.4 Die Familie der Sox-Proteine........................................................................... 10
1.4.1 Gruppe E der Sox-Proteine................................................................................. 11
1.4.1.1 Sox8.................................................................................................................... 12
1.4.1.2 Sox9.................................................................................................................... 13
1.4.1.3 Sox10.................................................................................................................. 14
1.4.1.3.1 Zielgene von Sox10............................................................................................ 16
1.4.1.3.2 Regulation der Sox10 Genexpression ................................................................ 17
1.5 Identifikation von evolutionär konservierten, genregulatorischen
Regionen durch vergleichende Genomanalysen ............................................ 18
1.5.1 Bedeutung von konservierten, nicht-kodierenden Regionen für
entwicklungsbiologische Prozesse ..................................................................... 20
Inhaltsverzeichnis
V
1.5.2 Bedeutung von konservierten, nicht-kodierenden Regionen für die
Genregulation von Sox-Proteinen ...................................................................... 20
1.5.3 Strategien zur experimentellen Validierung und Charakterisierung von cis-
regulatorischen Elementen ................................................................................. 21
2 PROBLEMSTELLUNG .................................................................................. 24
3 ERGEBNISSE................................................................................................... 26
3.1 Untersuchungen zur genregulatorischen Aktivität evolutionär
konservierter, nicht-kodierender Regionen im Sox10 Locus ....................... 26
3.1.1 Identifikation von sieben evolutionär konservierten, nicht-kodierenden
Regionen im Sox10 Locus.................................................................................. 26
3.1.2 Konstruktion der transgenen Vektoren............................................................... 29
3.1.3 Statistik der transgenen Mäuse........................................................................... 29
3.1.3 Genregulatorische Aktivität der evolutionär konservierten, nicht-kodierenden
Regionen während der frühen Embryogenese (9.5 dpc) .................................... 30
3.1.4 Genregulatorische Aktivität der evolutionär konservierten, nicht-kodierenden
Regionen am Embryonalstadium 11.5 dpc......................................................... 33
3.1.5 Genregulatorische Aktivität der evolutionär konservierten, nicht-kodierenden
Regionen während der späten Embryogenese (16.5 dpc)................................... 35
3.1.6 Zelltypspezifische Aktivität der evolutionär konservierten, nicht-kodierenden
Regionen entlang peripherer Nerven.................................................................. 37
3.1.7 Zelltypspezifische Aktivität der evolutionär konservierten, nicht-kodierenden
Regionen in den Spinalganglien......................................................................... 39
3.1.8 Zelltypspezifische Aktivität der evolutionär konservierten, nicht-kodierenden
Regionen im embryonalen Rückenmark ............................................................ 42
3.1.9 Untersuchungen zur Bindung von Neuralleisten assoziierten
Transkriptionsfaktoren an die evolutionär konservierten, nicht-kodierenden
Regionen............................................................................................................. 43
3.2 Untersuchungen zur genregulatorischen Aktivität der evolutionär
konservierten, nicht-kodierenden Region U1 ................................................ 45
3.2.1 Identifikation von cis-regulatorischen Elementen im U1 Enhancer................... 46
Inhaltsverzeichnis
VI
3.2.2 Untersuchungen zur genregulatorischen Aktivität der evolutionär
konservierten, nicht-kodierenden Region U1 in Sox10 defizienten Mäusen ..... 48
4 DISKUSSION ................................................................................................... 51
4.1 Identifizierung von evolutionär konservierten, nicht-kodierenden
Regionen im Sox10 Locus ................................................................................ 51
4.1.1 Regulation der Sox10 Genexpression durch mehrere Enhancer ........................ 52
4.1.2 Sequenzhomologie der Enhancer zu anderen Spezies........................................ 52
4.2 Expressionsmuster der genregulatorischen, evolutionär konservierten,
nicht-kodierenden Regionen............................................................................ 53
4.2.1 Überlappende, genregulatorische Aktivität der evolutionär konservierten,
nicht-kodierenden Regionen............................................................................... 54
4.2.2 Ektope Aktivität der evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Regionen .. 57
4.3 Autoregulatorischer Rückkopplungsmechanismus für den Erhalt der
Sox10 Genexpression........................................................................................ 58
5 MATERIAL ...................................................................................................... 61
5.1 Mausstämme und Tierhaltung ........................................................................ 61
5.2 Bakterienkultur ................................................................................................ 61
5.3 Chemikalien und allgemeine Reagenzien....................................................... 62
5.4 Zellen und Zellkultur ....................................................................................... 62
5.5 Zusammensetzung der Medien und Lösungen .............................................. 63
5.6 Oligonukleotide................................................................................................. 64
5.6.1 Oligonukleotide für Genotypisierungen ............................................................. 64
5.6.2 Oligonukleotide für Klonierungen der transgenen Konstrukte .......................... 65
5.6.3 Oligonukleotide für Gelretardierungsexperimente............................................. 66
5.7 Antikörper......................................................................................................... 67
5.7.1 Primärantikörper................................................................................................. 67
5.7.2 Sekundärantikörper............................................................................................. 68
Inhaltsverzeichnis
VII
6 METHODEN .................................................................................................... 70
6.1 Molekularbiologische Standardmethoden ..................................................... 70
6.1.1 Isolierung von genomischer DNA zur Genotypisierung .................................... 70
6.1.2 Polymerasekettenreaktion (PCR) ....................................................................... 70
6.1.2.1 Herstellung von DNA-Fragmenten mittels PCR................................................ 70
6.1.2.2 Genotypisierungs-PCR ....................................................................................... 71
6.1.2.3 Reverse Transkription und RT-PCR .................................................................. 72
6.2 Tierhaltung........................................................................................................ 73
6.3 Generierung transgener Mäuse....................................................................... 73
6.3.1 Generierung und Aufreinigung der transgenen Konstrukte ............................... 73
6.3.1 Mikroinjektion von Oozyten .............................................................................. 74
6.4 Histologische Methoden ................................................................................... 74
6.4.1 Präparation von Embryonen ............................................................................... 74
6.4.2 X-Gal Färbung.................................................................................................... 75
6.4.3 Immunhistochemie ............................................................................................. 75
6.5 Zellkultur-Methoden........................................................................................ 76
6.5.1 Kultivierung tierischer Zelllinien ....................................................................... 76
6.5.2 Transiente Transfektion von DNA in eukaryotische Zellen............................... 76
6.5.3 Luziferase-Aktivitätstest..................................................................................... 77
6.6 Detektion von DNA-Protein-Komplexen........................................................ 77
6.6.1 Herstellung von Proteinextrakten aus eukaryontischen Zellen .......................... 77
6.6.2 Radioaktive Markierung von DNA .................................................................... 78
6.6.3 Gelretardierungsexperimente ............................................................................. 78
6.7 Statistische Auswertung................................................................................... 79
7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS.................................................................... 81
8 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................ 85
Inhaltsverzeichnis
VIII
PUBLIKATIONEN ......................................................................................................... 111
LEBENSLAUF ................................................................................................................ 112
DANKSAGUNG .............................................................................................................. 113
Abbildungsverzeichnis
IX
Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Schematische Darstellung der Neurulation. ........................................................... 2
Abb. 2: Schematische Illustration der BMP und Shh Konzentrationsgradienten entlang
der dorso-ventralen Achse des Rückenmarks......................................................... 3
Abb. 3: Entwicklung von Neuralleistenzellen..................................................................... 5
Abb. 4: Domänenstruktur von SoxE-Proteinen. ............................................................... 11
Abb. 5: Identifikation und Lokalisation von sieben evolutionär konservierten, nicht-
kodierenden Sequenzen im Sox10 Locus............................................................. 27
Abb. 6: Schematische Illustration der transgenen Vektoren. ............................................ 29
Abb. 7: Nachweis der β-Gal Expression in transgenen Embryonen am Tag 9.5 dpc. ...... 31
Abb. 8: Nachweis der β-Gal Expression in transgenen Embryonen zum Zeitpunkt
11.5 dpc. ............................................................................................................... 33
Abb. 9: Nachweis der β-Gal Expression in transgenen Embryonen zum Zeitpunkt
16.5 dpc. ............................................................................................................... 36
Abb. 10: Nachweis der β-Gal Expression im enterischen Nervensysten zum Zeitpunkt
16.5 dpc................................................................................................................. 37
Abb. 11: Zelluläres β-Gal Expressionmuster unter der Kontrolle der evolutionär
konservierten, nicht-kodierenden Regionen entlang peripherer Nerven.............. 39
Abb. 12: Zelluläres β-Gal Expressionmuster unter der Kontrolle der evolutionär
konservierten, nicht-kodierenden Regionen in den Spinalganglien. .................... 41
Abb. 13: Zelluläres β-Gal Expressionsmuster unter der Kontrolle der evolutionär
konservierten, nicht-kodierenden Regionen U2 und U3 im embryonalen
Rückenmark an 16.5 dpc. ..................................................................................... 42
Abb. 14: Bindung von Transkriptionsfaktoren an die evolutionär konservierten, nicht-
kodierenden Sequenzen der Sox10 genomischen Region. ................................... 44
Abb. 15: Multipler Sequenzvergleich der U1 Kernsequenz................................................ 46
Abb. 16: Funktionelle Charakterisierung der Sox Bindestellen im U1 Enhancer............... 47
Abb. 17: Nachweis der β-Gal Expression in Embryonen an 11.5 dpc................................ 49
Tabellenverzeichnis
X
Tabellenverzeichnis Tab. 1: Aufstellung der identifizierten, homologen Regionen. ........................................ 28
Tab. 2: Zusammenfassung der erhaltenen transgenen Gründer........................................ 30
Tab. 3: Zusammenfassung der LacZ Expression der transgenen Linien.......................... 54
Tab. 4: Verwendete genetisch veränderte Mauslinien...................................................... 61
Tab. 5: Verwendete Wildtyp-Inzucht-Mausstämme......................................................... 61
Tab. 6: Verwendete Bakterienstämme.............................................................................. 61
Tab. 7: Verwendete Zelllinien. ......................................................................................... 62
Tab. 8: Verwendete Medien und Lösungen...................................................................... 64
Tab. 9: Verwendete Oligonukleotide für Genotypisierungen........................................... 65
Tab. 10: Verwendete Oligonukleotide für Klonierungen der transgenen Konstrukte........ 65
Tab. 11: Verwendete Oligonukleotide für Gelretardierungsexperimente. ......................... 66
Tab. 12: Verwendete Primärantikörper. ............................................................................. 67
Tab. 13: Verwendete Sekundärantikörper. ......................................................................... 68
Tab. 14: Zusammenfassung der in Genotypisierungs-PCRs verwendeten Primer und der
Größen der amplifizierten PCR-Produkte. ........................................................... 71
Tab. 15: Zusammenfassung der Reaktionsbedingungen der Genotypisierungs-PCRs. ..... 72
Tab. 16: Zusammenfassung der Reaktionsbedingungen der RT-PCRs.............................. 73
Zusammenfassung
XI
Zusammenfassung
Die Transkriptionsfaktorfamilie der Sox-Proteine ist durch grundlegende Funktionen in der
Entwicklung verschiedener Zelltypen, Gewebe und Organe gekennzeichnet. So ist der
Transkriptionsfaktor Sox10 in der Neuralleiste und deren Derivaten sowie in
Oligodendrozyten des zentralen Nervensystems exprimiert und ist in diesen Geweben
entscheidend an Determinierungs- und Differenzierungsvorgängen beteiligt. Mutationen
im Sox10-Gen verursachen schwere Neurocristopathien.
Um zu verstehen, wie die Sox10-Genexpression während der Entwicklung reguliert wird,
wurden im Rahmen dieser Arbeit evolutionär konservierte, nicht-kodierende Regionen im
Sox10-Genlocus identifiziert. Insgesamt sieben Regionen wiesen eine Sequenzhomologie
von mehr als 70% über mindestens 100 bp zwischen verschiedenen Säugergenomen und
dem des Huhns auf. Keine dieser Regionen zeigte hingegen eine signifikante
Sequenzkonservierung gegenüber Xenopus laevis, Danio rerio oder Fugu rubripes. Die
genregulatorischen Aktivitäten der entsprechenden Sequenzen aus der Maus wurden
anschließend in transgenen Mausmodellen analysiert. Fünf der sieben identifizierten
Regionen führten zu einer Reportergenexpression in verschiedenen Sox10 exprimierenden
Zelltypen und Geweben, wenn sie in einem Transgen einem Hsp68 Minimalpromotor und
einem LacZ Reportergen vorgeschaltet sind. Sie vermitteln die Sox10 Genexpression im
sich entwickelnden Innenohr, in Oligodendrozyten und in verschiedenen
Neuralleistenderivaten, inklusive des peripheren Nervensystems und der chromaffinen
Zellen des Nebennierenmarks. Interessanterweise weisen die evolutionär konservierten,
nicht-kodierenden Regionen zeitlich und räumlich überlappende Aktivitäten auf. Sie
werden zudem in Gelretardierungsexperimenten von ähnlichen Kombinationen von
Transkriptionsfaktoren gebunden. Untersuchungen an U1 als einem dieser Enhancer
zeigten darüberhinaus, dass seine Aktivität in Sox10 defizienten Embryonen stark
vermindert ist. Damit trägt Sox10 über einen positiven, autoregulatorischen
Rückkopplungsmechanismus zum Erhalt der eigenen Genexpression bei. Die Identifikation
von Sox Bindestellen in diesem Enhancer und deren Mutationsanalysen deuten darauf hin,
dass dieser Einfluss von Sox10 direkt ist. Die Summe aller nachgewiesenen
Enhanceraktivitäten ist ausreichend, um die essentiellen Merkmale der Sox10 Expression
während der frühen Embryogenese quantitativ und qualitativ wiederzugeben.
Summary
XII
Summary
The Sox family of transcriptional regulators is characterised by essential functions in the
development of several cell types, tissues and organs. Sox10 is expressed in the neural
crest, its derivatives, as well as in oligodendrocytes of the central nervous system. It plays
an important role in these tissues during determination and differentiation processes. Sox10
mutations are associated with severe neurocristopathies.
In order to understand how Sox10 expression is regulated during development
evolutionary conserved non-coding sequences were identified in the Sox10 genomic
region. Seven regions exhibited a greater than 70% sequence identity over at least 100 bp
between mammalian genomes and the chicken genome. In contrast none of these regions
exhibited a significant degree of conservation in Xenopus laevis, Danio rerio or Fugu
rubripes. Each of these regions was then studied for its gene regulatory activities in
transgenic mouse models. By linking the corresponding mouse sequences to a lacZ marker
gene under the control of a hsp68 minimal promoter, five of seven regulatory regions were
found to direct marker gene expression to Sox10 expressing cell types and tissues. These
enhancers mediate Sox10 expression in the developing inner ear, in oligodendrocytes, and
in several neural crest derivatives including the peripheral nervous system and chromaffine
cells of the adrenal gland. Interestingly, they exhibit overlapping spatiotemporal activities
and share binding sites in gelshift experiments for similar combinations of transcription
factors. Additional analyses on U1 as one of these enhancers showed that its regulatory
activity in Sox10 deficient embryos is strongly reduced. Therefore Sox10 seems to play a
role in maintaing its own expression by a positive autoregulatory feedback mechanism.
The identification of Sox binding sites in U1 and mutation analyses argue that the effect of
Sox10 on U1 activity is direct. The combined enhancer activities are sufficient to explain
the essential characteristics of Sox10 expression in early development both quantitatively
and qualitatively.
Einleitung 1
1 Einleitung
1.1 Entwicklung des Nervensystems
Das Nervensystem der Vertebraten entwickelt sich in der Embryogenese aus dem äußeren
Keimblatt, dem Ektoderm. Während sich aus einem Teil des Ektoderms das Neuralrohr
bildet (Neurulation), entsteht aus benachbarten ektodermalen Zellen die Neuralleiste.
Zellen des äußeren Keimblatts ohne neuronale Kompetenz formen die Epidermis des
Körpers (Colas and Schoenwolf, 2001; Gammill and Bronner-Fraser, 2003).
1.1.1 Entwicklung des Neuralrohrs (Neurulation)
Die Neurulation ist ein fundamentales Ereignis der Embryogenese, dessen Höhepunkt die
Bildung des Neuralrohrs darstellt. Aus ihm entsteht später das Gehirn und das
Rückenmark. Dieser Vorgang wird im Allgemeinen in primäre und sekundäre Neurulation
unterteilt, wobei der anteriore Anteil des Neuralrohrs durch primäre und der posteriore
Anteil durch sekundäre Neurulation ensteht (Copp et al., 2003).
Bei der primären Neurulation (Abb. 1) bildet sich zunächst im Bereich des äußeren
Keimblattes eine Verdickung, die als Neuralplatte bezeichnet wird (Abb. 1 A) (Kelly and
Melton, 1995). Die Ränder dieser Neuralplatte stülpen sich nach außen und bilden bilateral
in Längsrichtung des Embryos die Neuralwülste, zwischen denen eine Vertiefung, die
Neuralrinne, liegt (Abb. 1 B) (Smith and Schoenwolf, 1997). Die Neuralrinne senkt sich
weiter ab und die Neuralwülste verschmelzen miteinander. Es entsteht das Neuralrohr
(Abb. 1 C). Der Verschmelzungsvorgang beginnt in der Mitte des Embryos und setzt sich
kranial und kaudal fort. Zum selben Zeitpunkt beginnen Neuralleistenzellen aus der
dorsalen Region des entstehenden Neuralrohrs bilateral in die Peripherie auszuwandern
(Abb. 1 C, D) (Jessen and Mirsky, 2005). Im kranialen Bereich des Neuralrohrs, dem
späteren Gehirn, nimmt die Zahl der neu gebildeten Zellen rascher zu als in der kaudalen
Region, dem späteren Rückenmark. Das Neuralrohr wird im Verlauf der weiteren
Entwicklung vom epidermalen Ektoderm bedeckt, welches zuvor die Neuralwülste
flankierte. Das posteriore Neuralrohr entwickelt sich aus dem Zusammenschluss von
Einleitung 2
Mesenchymzellen. Innerhalb dieses durchgängig gebildeten Streifens unterhalb des
epidermalen Ektoderms formt sich das sekundäre Neuralrohr. Der Übergang vom primären
zum sekundären Neuralrohr bei Wirbeltieren ist im Bereich der Sakralwirbel lokalisiert
(Nievelstein et al., 1993; Schoenwolf and Desmond, 1984). Folglich entsteht nur der
äußerst posteriore Bereich des Rückmarks durch sekundäre Neurulation. Das Gehirn und
der Großteil des Rückenmarks werden durch primäre Neurulation gebildet.
Abb. 1: Schematische Darstellung der Neurulation. A) Formation der Neuralplatte B) Absenkung der Neuralrinne C) Verschmelzung der Neuralwülste und beginnende Migration von Neuralleistenzellen D) Absenkung des Neuralrohrs und Auswanderung von Neuralleistenzellen entlang definierter Pfade (Abbildung geändert aus Jessen und Mirsky, 2005).
Im weiteren Verlauf bilden sich im kranialen Neuralrohr drei Primärvesikel, aus denen
später Prosencephalon (Vorderhirn), Mesencephalon (Mittelhirn) und Rhombencephalon
(Hirnstamm mit Rautenhirn) hervorgehen. Hingegen entwickelt sich der kaudale Bereich
des Neuralrohrs zum Rückenmark. Die Sekretion von Signalmolekülen aus den
verschmelzenden Neuralwülsten und dem Notochord (Chorda dorsalis) bewirkt die
Einleitung 3
Entstehung eines dorso-ventralen Differenzierungsgradienten. Mitglieder der BMP-Familie
(bone morphogenetic proteins) veranlassen an der dorsalen Seite des Neuralrohrs die
Bildung der Deckplatte. Ventral führt Sonic Hedgehog (Shh) zur Formation der
Bodenplatte (Jones and Trainor, 2005). Des Weiteren steuern die Konzentrationsgradienten
dieser Proteine diverse Differenzierungsprozesse in der proliferativen Epithelschicht der
Ventrikulärzone des Neuralrohrs, aus denen die unterschiedlichen neuronalen und glialen
Subtypen hervorgehen (Abb. 2).
Abb. 2: Schematische Illustration der BMP und Shh Konzentrationsgradienten entlang der dorso-ventralen Achse des Rückenmarks. Die Ventrikulärzone unterteilt sich in diskrete Bereiche (p0, p1, p2, pMN, p3), aus denen zunächst die verschiedenen neuronalen Zellpopulationen, wie Interneurone und Motoneurone, bestimmt werden. Im weiteren Verlauf differenzieren Astrozyten und Oligodendrozyten aus den gleichen Stammzellen. (Abbildung geändert aus Anderson, 2001)
1.1.2 Entwicklung der Neuralleiste
Während der Schließung des Neuralrohrs wandern einige Zellen aus der dorsalen Region
des entstehenden Neuralrohrs bilateral in das benachbarte Mesoderm ein. Diese als
Neuralleiste bezeichnete Zellpopulation ist zwischen dem Neuralrohr und dem
epidermalen Ektoderm lokalisiert und besitzt das Potential, sich zu verschiedenen
Zelltypen zu differenzieren. Aus diesen multipotenten Zellen entsteht unter anderem der
überwiegende Teil des peripheren Nervensystems (Baroffio et al., 1991; Bronner-Fraser
and Fraser, 1988; Collazo et al., 1993).
Die Formation von Neuralleistenvorläuferzellen an der Grenze von Neuralplatte und
Epidermis wird durch verschiedene Ereignisse initiiert. Einerseits sind Signale zwischen
neu induzierten neuralem Gewebe und Zellen des äußeren Keimblatts ohne neuronale
Kompetenz von Bedeutung. Des Weiteren spielen auch Signale des paraxialen Mesoderms
Einleitung 4
für die Bildung dieser Zellpopulation eine Rolle (Crane and Trainor, 2006; Noden and
Trainor, 2005).
Sezernierte Proteine der BMP-Familie, der FGF-Familie (fibroblast growth factors) sowie
Signalmoleküle des Wnt- (wingless) und Notch-Signalweges induzieren in Zellen an der
Grenze zur Neuralplatte die Expression spezifischer Transkriptionsfaktoren (Sauka-
Spengler and Bronner-Fraser, 2006). Unter anderem werden Pax3 (paired box gene 3) und
Msx1 (Msh homeo box gene 3) an der Neuralplattengrenze exprimiert, wobei Pax3
stromabwärts von Msx1 agiert. In einer regulatorischen Kaskade führen Pax3 und Zic1
(Zic family member 1) Wnt-abhängig zur Induktion des Neuralleistenmarkers Snail2 (snail
homolog 2). Sowohl Wnt- als auch Fgf8-Signale sind für die Induktion der
Neuralplattengrenze durch Msx1 und Pax3 notwendig (Monsoro-Burq et al., 2005). In
einer komplementären Analyse wurde gezeigt, dass Pax3 und Zic1 essentiell für die
Spezifizierung der Region sind und die Expression von FoxD3 (forkhead box D3) und
Snail2 Wnt-abhänig zur Folge haben (Sato, 2005). Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen
zeigen eine Beteiligung von Dlx3 und Dlx7 (distal-less homeobox 3/7), sowie von Pax7
(paired box gene 7) an diesem Prozess (Basch et al., 2006; Sauka-Spengler and Bronner-
Fraser, 2006). Nach Formation der Neuralplattengrenze ist das proto-Onkogen c-Myc für
den Erhalt des multipotenten Zustands der Neuralleistenvorläuferzellen von Bedeutung
(Bellmeyer et al., 2003). Die Genexpression des Proteins Id3 (inhibitor of DNA binding 3)
wird direkt durch c-Myc reguliert. Id3 beeinflusst die DNA-Bindefähigkeit von bHLH-
Transkriptionsfaktoren (basic helix-loop-helix) (Light et al., 2005). AP2 (activator protein
2), Twist, Sox10 und Sox9 sind ebenfalls an der Determinierung früher Neuralleistenzellen
beteiligt (Aoki et al., 2003; Cheung and Briscoe, 2003; Kuhlbrodt et al., 1998b;
Meulemans and Bronner-Fraser, 2002). Neuere Erkenntnisse weisen darauf hin, dass nicht
nur die Regulation der Genexpression, sondern auch posttranslationale Modifikationen
beteiligter Proteine von Bedeutung sind (Gill, 2005; Ishitani et al., 2005; Taylor and
Labonne, 2005; Zhou et al., 2004).
Die multipotenten Neuralleistenzellen lösen sich schließlich aus dem Bereich zwischen
dem Neuralrohr und dem epidermalen Ektoderm heraus und migrieren bilateral des
Neuralrohrs entlang definierter Pfade in die Peripherie. Dort differenzieren sie zu
unterschiedlichen Zelltypen. Abhängig vom Ort und späterer Funktion der
Neuralleistenderivate unterscheidet man entlang der anterior-posterioren Achse des
Neuralrohrs zwischen kranialen, vagalen, trunkalen und sakralen Neuralleistenzellen
(Anderson, 1997). Kraniale Neuralleistenzellen wandern dorso-lateral aus und
Einleitung 5
differenzieren zu Neuronen, Gliazellen, Pigmentzellen, sowie zum kranio-fazialen
Mesenchym, aus dem Knorpel, Knochen und Bindegewebe des Gesichts und des Schädels
entstehen (Saldivar et al., 1997). Die kaudale Region der kranialen Neuralleiste ist an der
Bildung der aus dem Herzen austretenden Aorta und Lungenarterie, sowie an der Bildung
des Septums beteiligt (Chan et al., 2004; Hutson and Kirby, 2003; Kirby et al., 1983).
Trunkale Neuralleistenzellen migrieren entlang zweier Hauptpfade. Dorsolateral
auswandernde Zellen werden zu Melanozyten in der Epidermis (Erickson et al., 1992;
Jessen and Mirsky, 2005; Mayer, 1973; Tosney, 2004). Die Mehrzahl der Zellen migrieren
jedoch entlang eines ventralen Pfades in bzw. durch die Somiten. Neuralleistenzellen, die
in den Somiten verbleiben, bilden Spinalganglien. Die anderen wandern durch die Somiten
und sind an der Formation sympathischer Ganglien beteiligt bzw. differenzieren zu
Nervenfasern oder zu chromaffinen Zellen des Nebennierenmarks (Bronner-Fraser, 1993;
Le Douarin and Smith, 1988).
Abb. 3: Entwicklung von Neuralleistenzellen. Neuralleistenzellen migrieren entlang definierter Pfade und differenzieren zu verschiedenen Zelltypen. (Abbildung geändert aus Knecht und Bronner-Fraser, 2002)
Vagale und sakrale Neuralleistenzellen differenzieren zu Gliazellen in den autonomen
Ganglien des enterischen Nervensystems. Erstere wandern von anterior in den Vorderdarm
Einleitung 6
und besiedeln während der Embryogenese den ganzen Magen-Darm-Trakt. Hingegen
migrieren sakrale Neuralleistenzellen von posterior ein und sind vor allem für die
Kolonisation des Enddarms von Bedeutung (Doyle et al., 2004; Gershon, 1997; Pomeranz
et al., 1991; Taraviras and Pachnis, 1999; Young and Newgreen, 2001).
1.2 Zelltypen des Nervensystems
Das Nervensystem zählt zu den bedeutendsten und komplexesten Organen in Vertebraten.
Es wird aufgrund der Herkunft und Lage der Bestandteile in zentral und peripher unterteilt.
Der zentrale Anteil oder auch ZNS (Zentrales Nervensystem) besteht aus Gehirn und
Rückmark. Das periphere Nervensystem (PNS) umfasst den Teil des Nervensystems, der
außerhalb des Gehirns und Rückenmarks lokalisiert ist.
Das Nervensystem besteht aus zwei Zelltypen, den Neuronen und den Gliazellen. Beide
Zelltypen stammen von multipotenten neuralen Stammzellen ab, wobei die Neurogenese in
der Regel der Gliogenese vorangeht (Morrison et al., 2000).
1.2.1 Zelltypen des zentralen Nervensystems (ZNS)
Das ZNS der Vertebraten lässt sich morphologisch in graue und weiße Substanz
unterteilen. Die graue Substanz enthält vor allem Zellkörper von Neuronen und Gliazellen.
Hingegen besteht die weiße Substanz aus den Axonen der Nervenzellen und aus Gliazellen
(Makroglia).
Während sich Nervenzellen in mehrere hundert Subtypen unterteilen lassen, gibt es im
zentralen Nervensystem nur wenige Hauptklassen von Gliazellen. Oligodendrozyten
formen die Myelinschicht, die auch für die charakteristische Färbung der weißen Substanz
verantwortlich ist. Sie umgeben die neuronalen Axone. Die Mehrzahl der Gliazellen im
ZNS sind jedoch Astrozyten. Sie erfüllen eine Vielzahl von Aufgaben, wie z.B. die
Konstanthaltung des pH-Wertes und der Ionenkonzentrationen, die Aufrechterhaltung von
Zell-Zellkontakten und die Aufnahme überschüssiger Neurotransmitter. Sie sind zudem
Energieträger und Regulatoren des Blutgefäßsystems und für die Bildung der Blut-Hirn-
Schranke verantwortlich (Jessen, 2004). Ferner wurde gezeigt, dass Astrozyten und
Einleitung 7
Neurone über Synapsen kommunizieren (Fields and Stevens-Graham, 2002). Mikroglia
sind die Immunzellen des Gehirns. Diese mesodermalen Zellen nehmen
antigenpräsentierende und phagozytotische Aufgaben wahr (Barron, 1995; Kaur et al.,
2001). Die Müllerzellen bilden als gliale Zellen der Retina einen weiteren Gliazelltyp im
Zentralnervensystem (Cepko, 1999). Radialgliazellen sind morphologisch bipolare Zellen
im sich entwickelnden Gehirn. Sie bilden ein Gerüst für die radiale Migration von
Neuronen (Campbell and Gotz, 2002; Parnavelas and Nadarajah, 2001). Obwohl
Radialgliazellen einige charakteristische Eigenschaften von Astrozyten aufweisen, zeigen
Forschungsergebnisse mehrerer Arbeitsgruppen, dass diese Zellen eine heterogene Gruppe
von Stamm- bzw. Vorläuferzellen darstellen und damit trotz ihres Namens keine Gliazellen
sind (Hartfuss et al., 2001; Malatesta et al., 2000; Miyata et al., 2001; Noctor et al., 2001).
1.2.2 Zelltypen des peripheren Nervensystems (PNS)
Das periphere Nervensystem besteht wie das ZNS aus Nerven- und Gliazellen. Der
Hauptgliazelltyp des PNS sind die Schwann-Zellen, welche in eine myelinhaltige und eine
nicht-myelinhaltige Form eingeteilt werden. Die Hauptaufgabe der myelinbildenden
Schwann-Zelle ist die Isolierung der peripheren Axone. Im Gegensatz zu den
Oligodendrozyten des ZNS kann jede Schwann-Zelle nur ein Axon umgeben. Die nicht-
myelinhaltige Form weist funktionelle Gemeinsamkeiten mit den Astrozyten auf. Ihre
Aufgabe besteht in der metabolischen und mechanischen Unterstützung der Neurone.
Morphologisch sind sie mit mehreren Axonen kleineren Durchmessers assoziiert (Jessen,
2004). Eine weitere bedeutende Zellpopulation des PNS sind die enterischen Gliazellen.
Das enterische Nervensystem (ENS) ist in den autonomen Ganglien der Darmwand
lokalisiert (Gershon, 1997; Jessen and Mirsky, 1998). Zu den glialen Subtypen des PNS
zählen außerdem die Teloglia an den Synapsen zwischen Nervenendigung und
Muskelfaser (Georgiou et al., 1994), die Satellitenzellen in den Spinalganglien und in der
sympathischen Ganglienkette (Jessen and Mirsky, 2005) und die BC-Zellen (boundary
cap) am Übergang von ZNS zum PNS (Maro et al., 2004; Vermeren et al., 2003).
Einleitung 8
1.3 Pathologie der Neuralleiste (Neurocristopathien)
Neurocristopathien sind Erkrankungen, die auf Veränderungen der Migration, dem
Wachstum und der Differenzierung von Neuralleistenzellen zurückzuführen sind. Dabei
unterscheidet man eine einfache und eine komplexe Erscheinungsform. Zu der einfachen
Form zählen Neuroblastome, Melanome, Thyroid-Karzinome sowie die Hirschsprung-
Erkrankung. Hingegen sind komplexe Neurocristopathien durch Missbildungen und dem
neoplastischen Syndrom gekennzeichnet, bei denen einzelne oder mehrere Populationen
von Neuralleistenderivaten betroffen sind. Herzmissbildungen, Neurofibromatose,
Otocephalie, multiple endokrine Neoplasie Typ2 sowie das Waardenburg-Syndrom sind
Erkrankungen, die den komplexen Neurocristopathien zugeordnet werden (Nakamura,
1995).
1.3.1 Die Hirschsprung-Erkrankung (HSCR)
Die Hirschsprung-Erkrankung (HSCR) oder das aganglionische Megacolon wurde erstmals
1888 durch Harald Hirschsprung beschrieben (Hirschsprung, 1888). 60 Jahre später
erkannte F. Whitehouse, dass das Fehlen von enterischen Ganglienzellen in der distalen
Darmwand kennzeichnend für diese Krankheit ist (Whitehouse F, 1948). Den
Zusammenhang, dass Defekte in der Neuralleistenpopulation die Ursache sind, stellte
Robert P. Bolande her. Er prägte auch den Begriff der Neurocristopathie (Bolande, 1997).
Die Hirschsprung-Krankheit ist mit einer Inzidenz von 1:5000 eine häufige, genetisch
bedingte Erkrankung des enterischen Nervensystems (Bodian M, 1963; Bodian and Lake,
1963; Whitehouse F, 1948). Eine gestörte Migration von Neuralleistenzellen führt zu einer
unvollständigen Besiedelung des Dickdarms. Die daraufhin fehlenden enterischen
Ganglien im Plexus myentericus (Auerbach-Plexus) und Plexus submucosus (Meisner-
Plexus) führen zum Ausfall der Darmperistaltik in den betroffenen Bereichen. Durch
Überstimulation der Ringmuskulatur entsteht eine Obstruktion (Stenose) (Meier-Ruge,
1974; Whitehouse F, 1948). Klinische Symptome sind Darmverschluss bei Neugeborenen
und schwere chronische Verstopfung bei Kindern und Erwachsenen (Kapur, 1993). Die
Hirschsprung-Erkrankung wird autosomal dominant oder rezessiv vererbt. Abhängig von
der Länge des betroffenen aganglionischen Darmssegmentes unterscheidet man zwischen
Einleitung 9
der häufigeren S-Form der HCSR (80%) und L-HSCR (20%). Bei Patienten mit S-HSCR
ist nur ein kurzer Bereich betroffen. Hingegen weisen Erkrankte mit L-HSCR größere
aganglionische Segmente auf.
Bis heute wurden diverse Mutationen in verschiedenen Genen identifiziert, die mit der
Hirschsprung-Erkrankung in Zusammenhang stehen (Moore, 2006). So sind das Proto-
Onkogen c-Ret, GDNF (glial cell line derived neurotrophic factor), NTN (neurturin),
ENDRB (endothelin B receptor), EDN3 (endothelin 3), ECE1 (endothelin converting
enzyme 1), Phox2b (paired-like homeobox 2b), Sox10 und SIP1 (smad interacting protein
1) mit HSCR assoziiert (Amiel et al., 2003; Attie et al., 1995; Bidaud et al., 1997; Doray et
al., 1998; Edery et al., 1994; Hofstra et al., 1999; Lurie et al., 1994; Pingault et al., 1998;
Puffenberger et al., 1994; Salomon et al., 1996).
1.3.2 Das Waardenburg-Syndrom (WS)
Das Waardenburg-Syndrom wurde erstmals 1951 durch Petrus Waardenburg beschrieben
(Waardenburg, 1951). Die Inzidenz dieser Krankheit liegt bei 1:40000 und tritt damit
deutlich seltener auf als das Hirschsprung-Syndrom. Die Patienten leiden unter
Pigmentstörungen der Haut, Haare und Augen, unter Gesichtsdysmorphien und
kongenitaler, sensorineuraler Taubheit bzw. Schwerhörigkeit (Read and Newton, 1997).
All diese Symptome sind auf Defekte von Neuralleistenderivaten insbesondere der
Melanozyten zurückzuführen.
Das Waardenburg-Syndrom lässt sich aufgrund seiner klinischen Symptome in vier
Subtypen (WS1-WS4) unterteilen. WS1-Patienten sind durch weiße Wimpern und
Stirnlocken, durch Heterochromatie der Iris sowie durch Dystopia canthorum
charakterisiert. Verschiedene Mutationen im Pax3-Gen sind als Ursache für WS1
beschrieben (Baldwin et al., 1992; Tassabehji et al., 1992). WS2 weist ähnliche
Krankheitszeichen wie WS1 auf, jedoch haben diese Patienten keine Dystopia canthorum
(Hageman and Delleman, 1977). Weiterhin lässt sich WS2 in vier weitere Subtypen
unterteilen. Mutationen im Gen für Mitf (microphthalmia-associated transcription factor)
sind die Ursache für WS2A (Tassabehji et al., 1994), wohingegen für WS2D Mutationen
im Snail2-Gen beschrieben sind. Die zwei anderen Waardenburg-Syndrome Typ2 Loci
sind auf Chromosom 1p (WS2B) und Chromosom 8p23 (WS2C) kartiert. WS1 und WS2
werden autosomal-dominant vererbt. Der Subtyp WS3 wird auch als Klein-Waardenburg-
Einleitung 10
Syndrom bezeichnet und weist neben Pigmentstörungen auch Fehlbildungen der oberen
Extremitäten auf (Klein, 1983). WS3 Patienten haben ebenfalls Mutationen im Pax3-Gen
(Hoth et al., 1993). Im Gegensatz zu WS1 und WS2 wird WS3 autosomal-rezessiv vererbt.
Der Subtyp WS4 beinhaltet sowohl Symptome der Hirschsprung-Erkrankung als auch des
Waardenburg-Syndroms und wird im nächsten Abschnitt genauer beschrieben.
1.3.3 Das Shah-Waardenburg-Syndrom (WS4)
Die Kombination von HSCR und Waardenburg-Syndrom definiert das Shah-Waardenburg-
Syndrom (WS4) (Shah et al., 1981). Bei Patienten, die an WS4 leiden, sind
Pigmentstörungen und Taubheit bzw. Schwerhörigkeit der Subtypen WS1 und WS2 mit
dem aganglionischen Megacolon der Hirschsprung-Krankheit verknüpft. Mutationen im
Ednrb-, Edn3- als auch im Sox10-Gen sind als Ursache für das heterogene WS4
dokumentiert (Edery et al., 1996; Hofstra et al., 1996; Inoue et al., 2004; Pingault et al.,
1998; Pingault et al., 2001; Puffenberger et al., 1994). Sox10 und der Ednrb-Edn3
Signalweg besitzen eine Schlüsselrolle in der Entwicklung von Melanozyten und des
enterischen Nervensystems (Lee et al., 2003; Nagy and Goldstein, 2006; Stanchina et al.,
2006).
1.4 Die Familie der Sox-Proteine
Die Sox-Familie von Transkriptionsfaktoren ist durch grundlegende Funktionen in der
Entwicklung verschiedener Zelltypen, Gewebe und Organe gekennzeichnet. Ihre
Mitglieder sind durch die HMG-DNA-Bindedomäne (high mobility group) charakterisiert,
welche innerhalb der Familie hochkonserviert ist. Die Homologie der HMG-Box beträgt
innerhalb der Sox-Proteine mindestens 50%. Der Name der Sox-Familie leitet sich vom
Sry Protein ab (Sry Box), bei dem diese DNA-Bindedomäne ebenfalls beschrieben wurde
(Schepers et al., 2002; Wegner, 1999). Alle Mitglieder der Sox-Familie binden an das
gleiche spezifische heptamere DNA-Konsensusbindemotif (A/T)(A/T)CAA(A/T)G
(Harley et al., 1994). Im Gegensatz zu einer Vielzahl anderer Transkriptionsfaktoren
binden Sox-Proteine nicht in der großen, sondern in der kleinen Furche der DNA (van de
Einleitung 11
Wetering et al., 1993). Bisher wurden 20 Sox-Proteine in Säugern identifiziert, welche in
acht Subgruppen (A-H) eingeteilt werden (Bowles et al., 2000; Schepers et al., 2002;
Wegner and Stolt, 2005). Die Mitglieder einer Subgruppe haben innerhalb der HMG-
Domäne eine Sequenzhomologie von mindestens 80%. Eine weitere charakteristische
Eigenschaft innerhalb einer Subgruppe ist die ähnliche genomische Organisation (Wegner,
1999). Sox-Proteine spielen eine wichtige Rolle in entwicklungsbiologischen Prozessen.
Die Entwicklung der Blastocyste, die Gastrulation sowie die Bildung der Keimbahn, des
hämatopoietischen Systems, des Nervensystems, des Skeletts, der Gonaden, der Milz, des
Herzens, der Blutgefäße und der Melanozyten sind abhängig von der Expression der Sox-
Gene (Bowles et al., 2000; Sock et al., 2004; Wegner, 2005).
1.4.1 Gruppe E der Sox-Proteine
Die Gruppe E der Sox-Proteine umfasst die Mitglieder Sox8, Sox9 und Sox10.
Charakteristisch sind neben der hochkonservierten DNA-Binde- und der
Transaktivierungsdomäne, die N-terminal zur HMG-Box lokalisierte Dimerisierungs-
domäne und eine weitere Region mit hoher Sequenzhomologie. Diese befindet sich
zwischen DNA-Binde- und Transaktivierungsdomäne (Peirano and Wegner, 2000; Schlierf
et al., 2002; Schreiner et al., 2007).
Abb. 4: Domänenstruktur von SoxE-Proteinen. Gekennzeichnet sind Sox8, Sox9 und Sox10 durch die hochkonservierte HMG-Box, die dazu N-terminal gelegende Dimerisierungsdomäne, der Transaktivierungs-domäne am C-Terminus und einen weiteren konservierten Bereich zwischen DNA-Binde- und Transaktivierungsdomäne.
Einleitung 12
Als Transkriptionsfaktoren besitzen SoxE-Proteine Kernlokalisationssequenzen (NLS,
nuclear localisation sequence) (Kuhlbrodt et al., 1998b; Rehberg et al., 2002; Sudbeck and
Scherer, 1997). Zusätzlich weisen sie ein Kernexportsignal (NES, nuclear export signal)
auf (Gasca et al., 2002; Rehberg et al., 2002). Dieses ist wie die NLS in der HMG-Box
lokalisiert. SoxE-Proteine können DNA als Monomer oder kooperativ an zwei
benachbarten Bindestellen als Dimer binden. Zudem zeigen Sox8, Sox9 und Sox10
zumindest ein zum Teil überlappendes Expressionsmuster und vergleichbare, redundante
Funktionen bei entsprechender Koexpression (Chaboissier et al., 2004; Cheung and
Briscoe, 2003; Kellerer et al., 2006; Maka et al., 2005; Stolt et al., 2004). Auf die
Expressionsmuster und Aufgaben einzelner Mitglieder der SoxE-Gruppe wird in den
nächsten Abschnitten genauer eingegangen.
1.4.1.1 Sox8
Sox8 wurde als letztes Mitglied der SoxE-Gruppe identifiziert (Bell et al., 2000; Pfeifer et
al., 2000; Schepers et al., 2000). Trotz starker Sox8-Expression in vielen Geweben,
inklusive der Neuralleiste, dem Nervensystem, der Muskeln, der Knochen, den
Nebennieren, den Nieren und den Hoden entwickeln sich homozygot Sox8 defiziente
Mäuse in utero normal und sind lebensfähig. Auffällig hingegen ist die beträchtliche
Gewichtsreduktion bei diesem Genotyp (Schmidt et al., 2003; Schmidt et al., 2005; Sock et
al., 2001).
Der Transkriptionsfaktor Sox8 ist ein physiologischer Regulator der Knochenbildung.
Sox8 defiziente Mäuse sind durch eine verfrühte Osteoblastendifferenzierung
charakterisiert. Primäre Osteoblasten dieser Mäuse zeigen eine beschleunigte
Mineralisierung ex vivo und eine frühreife Expression von Differenzierungsmarkern.
Gestützt wird diese Aussage durch die Analyse transgener Mäuse, in denen Sox8
gewebespezifisch überexprimiert wird. In diesen Tieren ist die Knochenbildung
beeinträchtigt, was auf die reduzierte Expression des für die Osteoblastendifferenzierung
benötigen Transkriptionsfaktors Runx2 (runtrelated transcription factor 2) zurückgeführt
werden kann (Schmidt et al., 2005). Als Ursache für den relativ milden Phänotyp der Sox8
defizienten Mäuse wird die funktionelle Redundanz zwischen den SoxE-Proteinen
diskutiert. So erfolgt zum Beispiel die terminale Oligodendrozytendifferenzierung in
diesen Tieren verspätet (Stolt et al., 2004), hingegen kommt sie in Sox10 defizienten
Einleitung 13
Mäusen vollständig zum Erliegen (Stolt et al., 2002). Die Funktion von Sox8 kann in
Oligodendrozyten offenbar durch Sox10 kompensiert werden, jedoch wird in Sox10
defizienten Mäusen die fehlende Sox10-Funktion in diesen Zellen nicht durch Sox8
ausgeglichen (Stolt et al., 2004). Der zusätzliche Verlust von Sox8 in Sox9 defizienten
Oligodendrozyten verstärkt den negativen Sox9-Effekt, was ebenfalls auf eine ähnliche
Funktion hindeutet (Stolt et al., 2005). Im enterischen Nervensystem werden neben Sox10
auch geringere Mengen Sox8 exprimiert. Auch in diesem Gewebe führt der zusätzliche
Ausfall von Sox8 in Sox10 defizienten Mäusen zu einem schwerwiegenderen Phänotyp
(Maka et al., 2005). In Mäusen, in denen Sox10 durch Sox8 ersetzt ist, wurde die
Äquivalenz beider Sox-Proteine genauer analysiert. In Gliazellen und Neuronen des
sensorischen und sympathischen Teils des peripheren Nervensystems entwickelten sich die
entsprechenden Zellen annähernd normal. Hingegen konnte Sox8 die Expression von
Sox10 in Melanozyten nicht und im enterischen Nervensystem zumindest nicht vollständig
kompensieren (Kellerer et al., 2006). Im Gegensatz zu Säugern nimmt die Expression von
Sox8 in Xenopus laevis eine viel zentralere Rolle in der Neuralleistenentwicklung ein
(O'Donnell et al., 2006).
1.4.1.2 Sox9
Neben Sox8 spielt auch Sox9 eine wesentliche Rolle in der Embryogenese. Es
transaktiviert eine Vielzahl von Zielgenen und kontrolliert deren Expression. Während der
Embryonalentwicklung ist Sox9 in ausdifferenzierten Chondrozyten sowie in deren
Vorläuferzellen exprimiert. Weiterhin ist dieser Transkriptionsfaktor in männlichen
Gonaden, im Herzen, in der Neuralleiste, in neuralen Geweben sowie im Notochord, in der
Niere und im Pankreas nachweisbar (Akiyama et al., 2005; Ng et al., 1997; Zhao et al.,
1997). In vivo und in vitro Studien verschiedener Arbeitsgruppen haben die Bedeutung
von Sox9 für die Determinierung, Proliferation und Differenzierung von Chondrozyten
und für die Bildung extrazellulärer Matrix aufgezeigt (Akiyama et al., 2002; Mori-
Akiyama et al., 2003; Panda et al., 2001; Spokony et al., 2002; Stolt et al., 2003).
Sox9 spielt eine essentielle Rolle bei der Knochen- und Knorpelentwicklung (Akiyama et
al., 2002; Bi et al., 1999; Bi et al., 2001). Direkte Zielgene während der Chondrogenese
sind sowohl die Kollagengene Col2a1, Col11a2 sowie CD-Rap und Aggrecan
(Bridgewater et al., 1998; Lefebvre et al., 1997; Ng et al., 1997; Xie et al., 1999) als auch
Einleitung 14
die S100 Proteine S100A1 und S100B, welche für die Aufrechterhaltung der
Kalziumhomöostase benötigt werden (Saito et al., 2007). Zudem sind neben Sox9 auch die
SoxD-Proteine L-Sox5 und Sox6 für die Aktivierung des Col2a1-Enhancers während der
frühen Chondrogenese von Bedeutung (Lefebvre et al., 1998). Die konditionale
Inaktivierung der murinen Sox9 Allele in neuralen Stammzellen resultiert in
Spezifikationsdefekten von Oligodendrozyten und Astrozyten. Eine mögliche Erklärung
dieses Phänotyps ist eine nicht funktionierende Umstellung von der Neuro- auf die
Gliogenese (Stolt et al., 2003). Außerdem ist Sox9 an der Differenzierung der Neuralleiste
beteiligt (Cheung and Briscoe, 2003; Mori-Akiyama et al., 2003) und hat wie das
verwandte Protein Sry bei der männlichen Gonadenentwicklung erhebliche Bedeutung
(Canning and Lovell-Badge, 2002; Kent et al., 1996; Koopman, 2005; Morais da Silva et
al., 1996). In Sertoli-Zellen des Hodens wird das AMH-Gen (Anti-Müller Hormon) direkt
durch Sry und Sox9 über entsprechende Bindestellen in seinem Promotor reguliert (De
Santa Barbara et al., 1998). Ebenso bindet Sox9 direkt an cis-Elemente im SF1-Promotor
(Steroidogener Faktor 1) und reguliert so die Expression dieses Gens im Hoden (Shen and
Ingraham, 2002).
Heterozygote Sox9 Mutationen sind beim Menschen die Ursache für campomelische
Dysplasie (CD). Die Symptome für diese Erkrankung sind Hypoplasie und endochondrale
Knochen. Ein weiterer Phänotyp bei männlichen Patienten kann eine autosomale
Geschlechtsumkehr sein, welche die Bedeutung von Sox9 bei der Geschlechts-
determinierung widerspiegelt (Foster et al., 1994; Wagner et al., 1994).
Das humane Sox9-Gen wurde auf Chromosom 17 kartiert. Durch vergleichende Analysen
der genomischen Sequenz von Mensch und Takifugu rubripes wurden acht
hochkonservierte Bereiche ermittelt, welche in der Region von 290 kb stromaufwärts bis
450 kb stromabwärts vom humanen Sox9-Gen lokalisiert sind. Die genauere
Charakterisierung der Regionen resultierte in der Identifikation dreier Elemente, welche
für die Sox9 Expression in spezifischen Zelltypen und Geweben verantwortlich sind
(Bagheri-Fam et al., 2006; Wunderle et al., 1998).
1.4.1.3 Sox10
Das dritte Mitglied der SoxE-Gruppe ist Sox10. Es wurde erstmals in RT-PCR Analysen
an 11.5 Tage alten Mausembryonen (11.5 dpc) nachgewiesen (Wright et al., 1993). Später
Einleitung 15
wurden homologe Proteine in weiteren Vertebraten identifiziert (Cheng et al., 2000;
Dutton et al., 2001; Kuhlbrodt et al., 1998b; Pusch et al., 1998; Southard-Smith et al.,
1999a). In Invertebraten, wie Drosophila melanogaster, ist ein zu den Mitgliedern der
SoxE-Gruppe homologes Protein (Sox100B) nachgewiesen worden (Hui Yong Loh and
Russell, 2000).
Sox10 spielt eine entscheidende Rolle in der embryonalen Entwicklung der sich
entwickelnden Neuralleiste. Mutationen im Sox10-Gen sind an der Entstehung schwerer
Neurocristopathien beteiligt (siehe 1.3). Schon in der frühen Phase der
Embryonalentwicklung ist Sox10 in Neuralleistenzellen nachweisbar, die nach der
Schließung des Neuralrohrs aus der dorsalen Region des entstehenden Neuralrohrs bilateral
auswandern. Auch im weiteren Verlauf der Embryogenese ist die Expression und
funktionelle Relevanz dieses Transkriptionsfaktors sowohl in Neuralleistenderivaten, wie
den Satellitengliazellen der Spinalganglien und den Schwann-Zellen des PNS, als auch in
enterischen Ganglien und Melanozyten beschrieben (Britsch et al., 2001; Kuhlbrodt et al.,
1998b; Sonnenberg-Riethmacher et al., 2001). Für das Herauslösen der Zellen aus dem
dorsalen Neuralrohr und dem Beginn der Migration ist Sox10 noch nicht notwendig,
jedoch ist die Expression für den Erhalt undifferenzierter, auswandernder
Neuralleistenzellen essentiell. So wurde erhöhte Apoptose sowie abnehmende Proliferation
dieser Zellpopulation bei Sox10 Defizienz beschrieben (Paratore et al., 2001; Sonnenberg-
Riethmacher et al., 2001). Weiterhin führt die Sox10 Expression zum Erhalt der
Pluripotenz und inhibiert die neurale Differenzierung der Neuralleistenstammzellen (Kim
et al., 2003). Sox10 spielt auch eine Schlüsselrolle in der Entwicklung von
myelinbildenden Oligodendrozyten des zentralen Nervensystems und ist essentiell für die
gliale Differenzierung des PNS (Britsch et al., 2001; Kuhlbrodt et al., 1998a; Southard-
Smith et al., 1999b; Stolt et al., 2002). In Sox10 defizienten Mäusen entwickeln sich zwar
deren Vorläufer noch normal, jedoch ist die terminale Differenzierung gestört. Dies
resultiert in einer fehlenden Expression von Myelingenen, wie MAG (myelin associated
glycoprotein), PLP (proteolipid protein) und MBP (myelin basic protein) (Stolt et al.,
2002). Neuere Studien zeigen, dass neben den Mitgliedern der SoxE-Gruppe auch die
SoxD-Proteine Sox5 und Sox6 für die Differenzierung der Oligodendrozyten von
Bedeutung sind. Allerdings reprimieren diese die Differenzierung der glialen Zellen (Stolt
et al., 2006). Die spontane Mutation im Sox10 Gen in einem weiteren Mausmodell
(Sox10Dom Maus) führt zu einem der Sox10 defizienten Maus entsprechenden Phänotyp,
gekennzeichnet durch den Verlust enterischer Ganglien, eine veränderte Morphologie der
Einleitung 16
kranialen Ganglien und Pigmentierungsstörungen. Eine Verschiebung des Leserahmens ist
Folge der Mutation und führt zu einem verkürzten Protein (Britsch et al., 2001; Herbarth et
al., 1998b; Southard-Smith et al., 1998).
1.4.1.3.1 Zielgene von Sox10
Die Charakterisierung von Sox10 Bindestellen erleichtert die Identifizierung von Genen,
die direkt durch Sox10 reguliert werden und führt des Weiteren zur Aufklärung des
Mechanismus, über den die Genaktivierung vermittelt wird. So wurden im Promotor für
das MPZ Gen mehrere Sox10 Bindestellen dokumentiert. Die Analyse der proximalen
Promotorregion dieses für die Struktur der peripheren Myelinschicht bedeutenden
Glykoproteins (Suter and Snipes, 1995) führte zur Identifikation von zwei Typen von
DNA-Bindestellen (Peirano et al., 2000; Peirano and Wegner, 2000). Der eine erlaubt die
Bindung von Sox10 Monomeren, hingegen fördert der zweite Typ die kooperative
Bindung zweier Sox10 Moleküle. Diese Dimerbildung verbessert die Bindespezifität und
bewirkt eine verstärkte DNA-Biegung (Peirano and Wegner, 2000). Sox10 und Krox20
aktivieren zudem synergistisch das MPZ Gen über die Bindung an cis-Elementen im ersten
Intron des Gens (LeBlanc et al., 2006; LeBlanc et al., 2007). Weitere Sox10 Zielgene sind
die Gap Junctions formenden Connexine Cx32 und Cx47. Während Connexin 47 nur in
Oligodendrozyten exprimiert wird, aktiviert Sox10 Connexin 32 sowohl in
Oligodendrozyten des Zentralnervensystems als auch in Schwann-Zellen des PNS
(Bondurand et al., 2001; Schlierf et al., 2006). Ferner werden das c-ret-Gen in enterischen
Ganglien und CNTF (ciliary neutrotrophic factor) und Krox20 in Schwann-Zellen durch
diesen Transkriptionsfaktor reguliert (Ghislain and Charnay, 2006; Ito et al., 2006; Lang et
al., 2000). In der Melanozytendifferenzierung beeinflusst Sox10 über mehrere Bindestellen
direkt die Mitf Genexpression (Bondurand et al., 2000; Lee et al., 2000; Potterf et al.,
2000; Verastegui et al., 2000). Mitf ist ein bHLH-LZ (basic helix loop helix, leucine
zipper) Transkriptionsfaktor, der die Differenzierung von Melanozyten aus
Neuralleistenzellen fördert (Hodgkinson et al., 1993). Gemeinsam sind Mitf und Sox10 in
diesem Zelltyp für die direkte Regulation des Gens Dct (Dopachrome tautomerase) von
Bedeutung (Britsch et al., 2001; Hou et al., 2006; Ludwig et al., 2004a; Potterf et al.,
2001). Die Ednrb Expression wird ebenfalls durch Sox10 beeinflusst (Yokoyama et al.,
Einleitung 17
2006a; Yokoyama et al., 2006b; Zhu et al., 2004). Mutationen im Ednrb-Gen sind als
Ursache für das Shah-Waardenburg-Syndrom beschrieben (siehe 1.3.3).
Der Aktivierung dieser Gene bedarf des koordinierten Zusammenwirkens mehrerer
Proteine. Zum Beispiel wurden in unabhängigen Studien die synergistische Interaktion von
Pax3 und Sox10 sowohl am Mitf Promotor als auch am c-ret Enhancer beschrieben
(Bondurand et al., 2000; Lang et al., 2000; Potterf et al., 2000). Das Zusammenspiel dieser
beiden Proteine wird jedoch kontrovers in der Literatur diskutiert (Lee et al., 2000;
Mollaaghababa and Pavan, 2003; Verastegui et al., 2000). Weiterhin wirken die
Transkriptionsfaktoren Oct6, Brn2 und Sox10 am Krox20 Enhancer zusammen (Ghislain
and Charnay, 2006). In neueren Interaktionsstudien wurde gezeigt, dass die HMG-Boxen
von Sox8 und Sox10 zumindest schwach mit verschiedenen DNA-Bindedomänen anderer
Proteine wechselwirken können. Diese schwachen Interaktionen könnten die Grundlage für
die Etablierung von Kooperativität zwischen Sox-Proteinen und ihren Partnern an
Zielpromotoren sein und zu einer synergistischen Aktivierung der entsprechenden Gene
führen (Wissmuller et al., 2006).
Posttranslationale Modifikationen wie Sumoylierung und Phosphorylierung sind für die
funktionelle Aktivität von Sox10 wichtig (Gill, 2005; Girard and Goossens, 2006) (Kosian,
unveröffentliche Daten). So konnten drei Konsensus-Sumoylierungsmotive (K55, K246,
K3357) identifiziert werden, welche die Aktivität dieses Transkriptionsfaktors modulieren
(Girard and Goossens, 2006). Des Weiteren wurden für Sox10 Phosphorylierungsstellen
beschrieben, deren funktionelle Relevanz zurzeit analysiert wird (Kosian, unveröffentlichte
Daten).
1.4.1.3.2 Regulation der Sox10 Genexpression
Die Sox10 Expression in Neuralleistenzellen unterliegt sowohl extrinsischen als auch
intrinsischen Signalen. So wird in Xenopus laevis z.B. die Sox10 Expression extrinsisch
sowohl durch den Wnt-Signalweg als auch durch FGF-Signale reguliert (Aoki et al., 2003;
Honore et al., 2003). An Neuralleistenstammzellen des Nagers wurde gezeigt, dass die
Expression von Sox10 zudem BMP abhängig ist (Kim et al., 2003). Während Sox9 und
FoxD3 in der Neuralleistezelle Sox10 genetisch vorgeschaltet sind (Cheung et al., 2005),
haben Sox9 und Olig2 in Oligodendrozyten bei der Induktion der Sox10 Genexpression
erhebliche Bedeutung (Lu et al., 2000; Stolt et al., 2006; Zhou et al., 2001). Inwiefern diese
Einleitung 18
Transkriptionfaktoren die Sox10 Genexpression direkt bzw. indirekt beeinflussen, ist
bisher nur unzureichend verstanden, da entsprechende cis-regulatorische Elemente noch
nicht identifiziert wurden.
Das murine Sox10 Gen befindet sich auf Chromosom 15. In zwei unabhängigen Studien
wurde zumindest die Lokalisation der Regionen, die für die Sox10 Regulation wichtig
sind, eingegrenzt. Die Analyse von konservierten Bereichen im Sox10 Locus bei einer
kürzlich beschrieben transgenen Mauslinie ergaben, dass bei der Integration eines
transgenen Konstruktes eine 15,9 kb lange Region 47,3 kb stromaufwärts des Sox10
Transkriptionsstartes deletiert worden ist. Der Phänotyp dieser Mauslinie ist durch eine
partielle, enterische Aganglionose, Pigmentierungsdefekte und eine verminderte Sox10
Expression in homozygoten Embryonen gekennzeichnet (Antonellis et al., 2006). Die
Beteiligung distaler, cis-regulatorischer Elemente wird durch eine zweite Publikation
gestützt. Die Integration eines modifizierten BACs (bacterial artificial chromosome) in das
Mausgenom führte zu der Erkenntnis, dass alle an der Sox10 Regulation beteiligten
Elemente auf diesem 218 kb großen BAC enthalten sind. In diesem Versuchsaufbau
spiegelte ein LacZ Reportergen direkt vorm Sox10 Translationsstart die Expression des
Sox10 Gens wider. Zufällige Deletionsmutanten und vergleichende Genomanalysen
führten zu der These, dass mehrere, distal lokalisierte Regionen an der Regulation der
Sox10 Genexpression beteiligt sind. So hatte die Deletion sämtlicher stromaufwärts des
Promotors liegender Sequenzen zur Folge, dass die LacZ Expression auf ein Restniveau
absinkt. Das Vorhandensein von 20 – 30 kb zusätzlichen Sequenzen stromaufwärts des
Promotors führten zu einer Rekonstitution der Reportergenexpression in den meisten
Sox10 positiven Geweben. Jedoch wies diese Deletionsmutante gegenüber dem intakten
Transgen immer noch eine stark reduzierte Aktivität auf. Ferner wurde gezeigt, dass
weitere stromaufwärts gelegene 25 – 35 kb die Enhanceraktivität verstärken (Deal et al.,
2006).
1.5 Identifikation von evolutionär konservierten, genregulatorischen
Regionen durch vergleichende Genomanalysen
Biologische Prozesse wie Entwicklung, Proliferation, Apoptose, Differenzierung und
Altern benötigen die präzise zeitliche und räumliche Expression von Genen. Die
Einleitung 19
Vervollständigung der humanen Genomsequenz und computergestützte, vergleichende
Analysen führten zur Katalogisierung von 20000 – 25000 Protein kodierenden Genen
(Venter et al., 2001). Die Transkription dieser Gene wird häufig durch regulatorische
Elemente beeinflusst, die, im Gegensatz zum Promotor, bis zu einer Megabase entfernt
vom Transkriptionsstart liegen. Hierzu zählen Enhancer, Silencer, Insulatoren und
Locuskontrollregionen (Maston et al., 2006). Im Gegensatz zur Katalogisierung der Protein
kodierenden Gene führte die Verfügbarkeit der humanen Genomsequenz allein nicht zur
Identifikation bzw. zur präzisen Lokalisation von distal gelegenen cis-regulatorischen
Elementen (Lenhard et al., 2003). Die Herausforderung bei der Identifikation von
Transkriptionsfaktorbindestellen liegt unter anderem in der Größe der nicht-kodierenden,
humanen Genomsequenz (~ 98% von 3 x 109 bp), in der relativ kurzen Bindesequenz (6 –
12 bp) und der degenerierten Natur der cis-Elemente. Erst die Sequenzierung weiterer
Vertebratengenome ermöglichte die detaillierte Charakterisierung distaler gelegener
Transkriptionsfaktorbindestellen. Diese vergleichenden Genomanalysen basieren auf der
evolutionären Konservierung dieser genregulatorischen Regionen (Ureta-Vidal et al.,
2003).
Für die Identifikation potentieller Enhancer werden konventionell Kriterien wie 70%
Identität zwischen Mensch- und Nagergenomen über wenigstens 100 bp genutzt (Visel et
al., 2007). Diese Kriterien werden aufgrund der relativ kurzen evolutionären Zeitspanne
gewählt, seit dem Mensch und Nager ihre letzten gemeinsamen Vorfahren hatten. Ein
Herabsetzen dieser Parameter würde in einer für die meisten Anwendungen zu hohen Rate
falsch-positiver, genregulatorischer Regionen resultieren (Nobrega and Pennacchio, 2004;
Pennacchio, 2003). Ferner wurden in vergleichenden Genomanalysen zwischen Mensch,
Maus und Ratte 481 Segmente identifiziert, die als ultrakonserviert bezeichnet werden. Sie
sind mindestens 200 bp lang und absolut identisch (100% Identität, keine Insertionen und
Deletionen). Ca. 250 von diesen Elementen überlappen dabei nicht mit Protein
kodierenden Sequenzen. Obwohl ihre Funktionen noch nicht ausgiebig analysiert worden
sind, zeigen erste Untersuchungen einzelner Elemente ihre Bedeutung als distal lokalisierte
Modulatoren der Genregulation (Nobrega et al., 2003; Poulin et al., 2005).
Einleitung 20
1.5.1 Bedeutung von konservierten, nicht-kodierenden Regionen für
entwicklungsbiologische Prozesse
Vergleichende Sequenzanalysen von orthologen genomischen Regionen verschiedener
Spezies führten zur Identifikation von evolutionär konservierten, nicht-kodierenden
Regionen. Diese Bereiche hoher Sequenzhomologie sind vielfach cis-regulatorische
Abschnitte des Genoms. Oftmals sind diese Regionen in Nachbarschaft von Genen
lokalisiert, die für essentielle Regulatoren entwicklungsbiologischer Prozesse kodieren
(Sandelin et al., 2004; Woolfe et al., 2005). Einige solch wichtiger Gene sind Dach
(dachshund homolog), Sox9, Otx2 (orthodenticle homolog 2), Hand2 (heart and neural
crest derivatives expressed 2), Engrailed2, Fgf4, Gata1 (GATA binding protein 1), MyoD
(myoblast determination protein), Pax6, Pax9, Shh oder das Hoxd (Homeobox D)
Gencluster (Bagheri-Fam et al., 2001; Chen and Goldhamer, 2004; Ghanem et al., 2003;
Guyot et al., 2004; Iwahori et al., 2004; Kurokawa et al., 2004a; Kurokawa et al., 2004b;
Lettice et al., 2003; Li Song and Joyner, 2000; Miles et al., 1998; Nobrega et al., 2003;
Santagati et al., 2003; Santini et al., 2003; Spitz et al., 2003; Sumiyama et al., 2003;
Yanagisawa et al., 2003).
1.5.2 Bedeutung von konservierten, nicht-kodierenden Regionen für die
Genregulation von Sox-Proteinen
Für einige Mitglieder der Sox-Genfamilie wurde bereits das Vorhandensein evolutionär
konservierter Enhancer bestätigt. Hierzu zählen die Sox-Proteine Sox2, Sox3, Sox21, Sox9
und Sox10.
Sox2 spielt eine wichtige Rolle während der Bildung des Nervensystems in verschiedenen
Wirbeltierspezies. Dieser SoxB1 Transkriptionsfaktor wird durch eine ganze Anzahl von
distal lokalisierten Regionen reguliert. In initialen Experimenten wurden 11 Enhancer
identifiziert, indem eine 50 kb große genomische Region des Sox2 Locus aus dem Huhn
isoliert und Fragmente dieses Bereiches auf Enhanceraktivität untersucht wurden. Die
räumliche und zeitliche Aktivität dieser genregulatorischen Elemente spiegelt die
Komplexität des Sox2 Expressionsmusters wider. Ein anschließender genomischer
Vergleich zwischen Huhn- und Säugergenomen bewies, dass die charakterisierten
Einleitung 21
Enhancer im Säuger konserviert sind (Uchikawa et al., 2003; Uchikawa et al., 2004). Die
Expression von Sox3, einem weiteren SoxB1 Transkriptionsfaktor, wird ebenfalls durch
distal lokalisierte, evolutionär konservierte Regionen reguliert. Für diesen frühen
neuronalen Marker sind wie für Sox2 sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts des
Sox3 Leserahmens gelegene genregulatorische Bereiche beschrieben (Brunelli et al.,
2003). Sieben von acht Sox21 assoziierten, konservierten Regionen führten in
funktionellen Assays zu einer verstärkten Reportergenexpression im Zebrafisch (Woolfe et
al., 2005). Sox21 gehört zur SoxB2 Subgruppe. Als transkriptioneller Repressor in der
frühen Entwicklung weist er ein sehr komplexes und dynamisches Expressionmuster im
ZNS auf. Ferner ist endogene Sox21 Expression in den sich entwickelnden Sinnesorganen
beschrieben (Rex et al., 1997; Rimini et al., 1999; Uchikawa et al., 1999). Die SoxE
Transkriptionsfaktoren Sox9 und Sox10 sind ebenfalls durch hochkonservierte, nicht-
kodierende, genregulatorische Regionen in ihren entsprechenden Gen-Loci gekennzeichnet
(siehe 1.4.1.2 und 1.4.1.3.2). Sie unterstreichen damit die Bedeutung von distal
lokalisierten cis-Elementen für die akkurate räumliche und zeitliche Expression von Sox
Genen in der Embryonalentwicklung.
1.5.3 Strategien zur experimentellen Validierung und Charakterisierung von
cis-regulatorischen Elementen
Für die Charakterisierung der genregulatorischen Aktivität evolutionär konservierter,
nicht-kodierender Regionen werden verschiedene Tiermodelle, wie z.B. Zebrafisch,
Xenopus und Maus, genutzt (Gottgens et al., 2000; Rossant et al., 1991; Woolfe et al.,
2005). Validierungsexperimente in Zebrafisch und Xenopus eignen sich besonders gut für
eine hohe Anzahl von zu analysierenden genomischen Regionen, da der Versuchsaufbau in
diesen Organismen weniger aufwendig ist. Aufgrund des hohen phylogenetischen
Verwandtschaftsgrades innerhalb der Säuger sind Mausmodelle zweckmäßiger, um
Aussagen über die Relevanz der untersuchten, evolutionär konservierten Regionen in
Bezug auf den Menschen zu treffen. Nach der bioinformatischen Identifizierung
evolutionär konservierter, nicht-kodierender Regionen werden diese DNA Bereiche mittels
PCR amplifiziert und vor einem Hsp68 Minimalpromotor und ein LacZ Reportergen
kloniert. Das Reportergenkonstrukt wird anschließend in den männlichen Pronukleus der
Einleitung 22
befruchteten Eizelle injiziert, wo es dann an einer zufälligen Position in vielfacher
Kopiezahl ins Genom integriert. Transgene Techniken werden bereits seit vielen Jahren für
die Generierung verschiedenster Mausmodelle in der Forschung eingesetzt. Da das Hsp68-
LacZ Konstrukt allein nicht zu einer Reportergenexpression in embryonalen Geweben von
Säugern führt (Kothary et al., 1988; Kothary et al., 1989), kann die räumliche und zeitliche
Expression in Abhängigkeit von evolutionär konservierten Regionen mit diesem
Versuchsaufbau analysiert werden.
Für die Bestätigung und Charakterisierung der potentiellen, nicht-kodierenden,
genregulatorischen Regionen sind experimentelle Ansätze unerlässlich. Dies schließt
sowohl in vitro Methoden zur Bestimmung der Transkriptionsfaktorbindestellen, wie DNA
Footprint Analysen und Gelretardierungsexperimente als auch in vivo Chromatin-
immunpräzipitationsassays ein.
Problemstellung 24
2 Problemstellung
Der Transkriptionsfaktor Sox10 ist wesentlich an der Entwicklung von
Neuralleistenderivaten und Oligodendrozyten beteiligt. Seine Bedeutung für die
Differenzierung von Gliazellen des zentralen, peripheren und enterischen Nervensystems
sowie von Melanozyten wurde mit Hilfe von Mausmutanten charakterisiert. Die Analyse
der Promotoren direkter Zielgene von Sox10 trug zum Verständnis der Funktionsweise
dieses Transkriptionsfaktors bei. Obwohl große Fortschritte in der Identifizierung von
Genen, die direkt von Sox10 reguliert werden, gemacht wurden, sind Transkriptions-
faktoren, cis-regulatorische Elemente und Signalwege, welche die direkte Regulation von
Sox10 vermitteln, bisher weitestgehend unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit sollten
deshalb diese genregulatorischen Regionen identifiziert und charakterisiert werden.
Durch computergestützte, vergleichende Analysen des Sox10 Locus verschiedener Spezies
sollten zunächst Bereiche hoher Sequenzhomologie identifiziert werden. Um zu verstehen,
wie die Sox10 Expression während der Embryonalentwicklung reguliert wird, sollten diese
hochkonservierten Regionen vor ein β-Galaktosidasereportergen unter der Kontrolle eines
Minimalpromotors kloniert und die Expression des Reportergens in transgenen Mäusen
untersucht werden. Die zentrale Aufgabe dieser Arbeit lag vor allem in der Analyse der
räumlichen und zeitlichen Expression und der Verifizierung der Koexpression der β-
Galaktosidase (β-Gal) mit Sox10 und anderen zellspezifischen Markern.
Die Analyse von konservierten Bereichen im Sox10 Locus bei einer kürzlich beschrieben
transgenen Mauslinie führten zu der Feststellung, dass bei der Integration des transgenen
Konstruktes eine 15,9 kb lange Region 47,3 kb stromaufwärts des Sox10 Transkriptions-
startes deletiert worden ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte deshalb dieser genomische
Bereich detailliert analysiert werden, um den Phänotyp dieser Mauslinie zu erklären, der
durch eine partielle, enterische Aganglionose, Pigmentierungsdefekte und eine verminderte
Sox10 Expression in homozygoten Embryonen gekennzeichnet ist (Antonellis et al., 2006).
Ergebnisse 26
3 Ergebnisse
3.1 Untersuchungen zur genregulatorischen Aktivität evolutionär
konservierter, nicht-kodierender Regionen im Sox10 Locus
Vergleichende Sequenzanalysen von orthologen genomischen Regionen verschiedener
Spezies führten zur Identifikation von evolutionär konservierten, nicht-kodierenden
Regionen. Diese Bereiche hoher Sequenzhomologie sind vielfach cis-regulatorische
Abschnitte des Genoms und als Modulatoren der Genexpression beschrieben (Sandelin et
al., 2004). Oftmals sind diese Regionen in Nachbarschaft von Genen lokalisiert, die für
essentielle Regulatoren entwicklungsbiologischer Prozesse kodieren (Woolfe et al., 2005).
Der Transkriptionsfaktor Sox10 hat eine solch entscheidende Rolle in der embryonalen
Entwicklung der entstehenden Neuralleiste. Ebenso ist seine Expression und funktionelle
Relevanz im weiteren Verlauf der Embryogenese in Neuralleistenderivaten und
Oligodendrozyten beschrieben (Britsch et al., 2001; Kuhlbrodt et al., 1998b; Stolt et al.,
2002). Da zudem die Funktionen von Sox10 in der Embryogenese von Vertebraten
hochkonserviert sind (Kelsh, 2006; Wegner and Stolt, 2005), wurden im ersten Teil dieser
Arbeit mittels vergleichender Sequenzanalysen evolutionär konservierte Regionen
identifiziert und die Muster ihrer genregulatorischen Aktivität charakterisiert.
3.1.1 Identifikation von sieben evolutionär konservierten, nicht-kodierenden
Regionen im Sox10 Locus
Untersuchungen an verschiedenen transgenen Mauslinien führten zu der Erkenntnis, dass
Sequenzen ca. 60 kb stromaufwärts und ca. 50 kb stromabwärts des Sox10 Transkriptions-
starts ausreichend sind, um das Hauptexpressionsmuster von Sox10 während der
embryonalen Entwicklung widerzuspiegeln. So wurde mit Hilfe eines 120 kb PAC-
Fragments (P1 derived artificial chromosome), das die genomische Sequenz von Sox10
beinhaltet, eine transgene Mauslinie etabliert, in dem die Gene für GFP (grün
floureszierendes Protein) und DTA (Diphtherietoxin) unter der gleichen transkriptionellen
Ergebnisse 27
Kontrolle wie Sox10 standen (Kessaris et al., 2006). Ferner bestätigten Analysen zufälliger
Deletionensmutanten konservierter Bereiche im Sox10 Locus einer anderen transgenen
Mauslinie das Vorhandensein entfernter regulatorischer Sequenzen (Antonellis et al.,
2006). Studien dieser transgener Mäuse führten zu folgenden Erkenntnissen: zum einen
werden mehrere, stromaufwärts vom Sox10 Gen gelegene Enhancer für das vollständige
Sox10 Expressionsmuster benötigt. Zum anderen sind die für die Sox10 Expression
wichtigen cis-Elemente vorwiegend in Enhancern und nicht in seinem Promotor lokalisiert
(Deal et al., 2006). Außerdem konnte gezeigt werden, dass der Sox10 Leserahmen ohne
signifikante Abweichungen vom embryonalen Sox10 Expressionmuster ersetzt werden
kann. Somit liegen die wichtigen regulatorischen Elemente außerhalb des Sox10 Gens
(Britsch et al., 2001; Kellerer et al., 2006; Ludwig et al., 2004b).
Abb. 5: Identifikation und Lokalisation von sieben evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Sequenzen im Sox10 Locus. Dargestellt ist ein multipler Sequenzvergleich des Sox10 Locus. Die ubiquitär exprimierten Gene für Polr2f und Pick1 (in blau) flankieren die analysierte Region. Die potentiell genregulatorische Regionen U1, U2, U3, U4, U5, D6 und D7 wurden rot hervorgehoben. (Abbildung wurde mit Hilfe des UCSC-Browser generiert)
Potentielle Enhancer, die für die Regulation der Sox10 Genexpression verantwortlich sind,
wurden mit dem ECR-Browser (http://ecrbrowser.dcode.org) und der humanen Sequenz
als Basisgenom identifiziert. Diese vergleichende Analyse resultierte in dem Nachweis von
sieben konservierten Regionen mit mehr als 70% Sequenzhomologie über mindestens 100
bp zwischen dem humanen Genom und dem des Huhns (Abb. 5). Fünf dieser sieben
Bereiche (U1-U5) sind stromaufwärts und zwei (D6, D7) stromabwärts vom Sox10 Gen
Ergebnisse 28
lokalisiert. Ihre Länge variiert zwischen 150 und 400 bp. Während die Sequenzidentität der
potentiellen Enhancer zwischen Maus- und Huhngenom mindestens 67% über ihre
gesamte Länge betrug, lag sie zwischen murinen und humanen Genom bei über 89% (Tab.
1).
ECR Position im Genom von
M. musculus (Mm8)
Länge
(in bp)
Homologie zu
G. gallus (in %)
Homologie zu
H. sapiens (in %)
Fragment im transgenen
Konstrukt (Mm8)
U1 chr15:79040326-79040137 190 72 95 chr15:79040581-79039999
U2 chr15:79029135-79028946 190 82 91 chr15:79029364-79028694
U3 chr15:79020634-79020239 396 77 95 chr15:79020727-79020048
U4 chr15:79003457-79003309 149 79 89 chr15:79003594-79003025
U5 chr15:78993356-78993187 170 75 91 chr15:78993796-78992950
D6 chr15:78980249-78980021 229 69 92 chr15:78980440-78979859
D7 chr15:78979430-78979196 235 67 94 chr15:78979608-78978907
Tab. 1: Aufstellung der identifizierten, homologen Regionen. Für jede der evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Bereiche sind die exakten Positionen im Genom von M. musculus (Mm8) angegeben. Deren Länge, ihre Sequenzhomologie zu G. gallus und H. sapiens und die genauen Koordinaten des Fragmentes, welches für die Generierung des transgenen Konstruktes genutzt wurden, sind ebenfalls tabellarisch aufgeführt.
Die flankierenden Sequenzen der potentiellen Enhancer wiesen zwischen den beiden
Säugergenomen ebenfalls sehr hohe Sequenzhomologien auf. Die geringeren
Übereinstimmungen in der Sequenz und die kürzeren Längen in evolutionär nicht nahe
verwandten Spezies verglichen mit verwandten Tierarten wurden bereits in
vorausgegangen Genomstudien beschrieben (Prabhakar et al., 2006). Im Gegensatz zu der
hohen Sequenzidentität innerhalb der Amnioten wiesen keine der sieben identifizierten
Regionen eine signifikante Sequenzkonservierung gegenüber Xenopus laevis, Danio rerio
oder Fugu rubripes auf (Abb. 5).
Ergebnisse 29
3.1.2 Konstruktion der transgenen Vektoren
Die sieben identifizierten, evolutionär konservierten Regionen U1, U2, U3, U4, U5, D6
und D7 wurden inklusive ca. 150 bp (Tab. 2) flankierender Sequenz amplifiziert und direkt
stromaufwärts eines Hsp68 Minimalpromotors und eines LacZ Reportergens kloniert. Das
Genprodukt von LacZ, die β-Galaktosidase, ermöglicht den Nachweis, in welchen
Geweben das Transgen exprimiert wird. In früheren Studien wurde gezeigt, dass die
Hsp68-LacZ Kassette keine konstitutive Aktivität in transgenen Mäusen besitzt und
deshalb für Analysen genregulatorischer Elemente geeignet ist (Kothary et al., 1988;
Kothary et al., 1989; Mandemakers et al., 2000; Muta et al., 2002). Der Aufbau der
transgenen Konstrukte, die für die Pronukleusmikroinjektion in Oozyten verwendet
wurden, ist in Abb. 6 schematisch dargestellt.
Abb. 6: Schematische Illustration der transgenen Vektoren. Die evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Regionen (EKR) wurden direkt vor den Hsp68 Minimalpromotor (Hsp) und dem Gen für β-Galaktosidase (LacZ) kloniert. Das SV40-polyA-Signal (pA) ist unmittelbar hinter dem Reporter lokalisiert.
Da Vektorsequenzen, insbesondere prokaryotische Promotor- und ORI-Sequenzen die
Expression von Transgenen beeinträchtigen, wurden diese vom transgenen Konstrukt
mittels SpeI und KpnI bzw. NotI und KpnI hydrolytisch restringiert und durch
Agarosegelelektrophorese abgetrennt. Die aufgereinigten, transgenen Konstrukte wurden
von Dr. Michael R. Bösl am Max-Planck-Institut für Neurobiologie in Martinsried in den
männlichen Pronukleus befruchter muriner Oozyten mikroinjiziert. Anschließend wurden
diese Oozyten in den Uterus scheinschwangerer Mäuse eingesetzt.
3.1.3 Statistik der transgenen Mäuse
Die mittels PCR als positiv identifizierten, ersten Nachkommen einer Linie werden als
Gründer bezeichnet. Folgende Tabelle gibt Aufschluss über die Anzahl der getesteten
Ergebnisse 30
Nachkommen, die aus injizierten Oozyten hervorgegangen sind und über die Anzahl der
für jedes transgene Konstrukt erhaltenen Gründer und über die Gründer, die das Transgen
an ihre Nachkommen weitergaben (Tab. 2). Insgesamt waren von den 218 getesteten
Tieren 34 (15,6%) in der PCR für das jeweilige Konstrukt positiv, von denen wiederum 28
(82,4%) das Transgen an die Nachkommen vererbten. Für jede transgene Kassette standen
wenigstens zwei unabhängige Gründer für die Analyse zur Verfügung. Damit war es
möglich die genregulatorische Aktivität der evolutionär konservierten, nicht-kodierenden
Regionen zu verifizieren.
erhaltene Tiere aus
injizierten Oozyten transgene Gründer
Gründer mit transgenen
Nachkommen
U1 32 5 (15,6%) 5 (15,6%)
U2 40 3 (7,5%) 3 (7,5%)
U3 32 3 (9,4%) 3 (9,4%)
U4 52 12 (23,1%) 7 (13,5%)
U5 13 3 (23,1%) 3 (23,1%)
D6 30 3 (10%) 2 (6,7%)
D7 19 5 (26,4%) 5 (26,4%)
insgesamt 218 34 (15,6%) 28 (12,8%)
Tab. 2: Zusammenfassung der erhaltenen transgenen Gründer. Aufgelistet sind für jedes transgene Konstrukt die Anzahl der erhaltenen Mäuse, die aus injizierten Oozyten hervorgegangen sind, die Anzahl der transgenen Gründer und die Anzahl der Gründer mit transgenen Nachkommen.
3.1.3 Genregulatorische Aktivität der evolutionär konservierten, nicht-
kodierenden Regionen während der frühen Embryogenese (9.5 dpc)
Für die Analyse der genregulatorischen Aktivität der evolutionär konservierten, nicht-
kodierenden Regionen wurde zur Detektion der β-Galaktosidaseaktivität eine Farbreaktion
mit X-Gal als Substrat durchgeführt. Identische Färbezeiten für die zu untersuchenden
transgenen Mauslinien sollten eine gute Vergleichbarkeit der räumlichen und zeitlichen
Expression des LacZ Gens gewährleisten. Soweit nicht anders beschrieben, waren die
Ergebnisse 31
Expressionsmuster zwischen den einzelnen Linien der gleichen transgenen Konstrukte gut
reproduzierbar. Nur die Färbeintensität variierte geringfügig zwischen den einzelnen
Linien. Mögliche Ursachen hierfür sind unterschiedliche Kopienzahlen oder verschiedene
Integrationsstellen im Genom.
Die heterozygote Sox10 Mausmutante (Britsch et al., 2001) diente als Kontrolle für weitere
Experimente. Da in dieser Mauslinie ein Sox10 Allel durch das Gen für die β-
Galaktosidase ersetzt wurde, spiegelte die Aktivität der β-Galaktosidase die Expression
von Sox10 exakt wider (Britsch et al., 2001). Während der frühen Embryogenese (9.5 dpc)
war die LacZ Expression in Sox10LacZ/+ Mäusen in den otischen Vesikeln, den
Kranialganglien, in den Kiemenbögen, in den sich bildenden Spinalganglien und in den
sympathischen Ganglien detektierbar. Ferner waren in diesen Mäusen β-Gal positive
Zellen in der sich entwickelnden Neuralleiste und schwächer auch an der Mittel-
Hinterhirngrenze nachweisbar (Abb. 7A).
Abb. 7: Nachweis der β-Gal Expression in transgenen Embryonen am Tag 9.5 dpc. Die β-Galaktosidaseaktivität wurde in einer Farbreaktion mit X-Gal als Substrat sowohl in Sox10LacZ/+ (A), als auch in den transgenen Embryonen bestimmt, in denen die Expression des LacZ Gens von den evolutionären konservierten, nicht-kodierenden Regionen U1 (B), U2 (C), U3 (D), U4 (E), U5 (F), D6 (G) und D7 (H) reguliert wurde. Die transgenen Embryonen wurden für 9 h, die Sox10LacZ/+ Embryonen für 3 h gefärbt. Unter diesen Bedingungen wurde in Wildtypen keine Färbung beobachtet.
Ergebnisse 32
Die transgenen Embryonen konnten zum Zeitpunkt 9.5 dpc aufgrund der Verteilung der β-
Galaktosidaseexpression in drei Kategorien eingeteilt werden. In Embryonen, die das U4,
U5 bzw. das D7 Transgen trugen, war keine LacZ Expression nachweisbar (Abb. 7 E, F,
H). Eine zweite Gruppe bestand aus Embryonen, in deren Genom das U2 bzw. das D6
Konstrukt integriert war. Sie waren durch eine β-Galaktosidaseaktivität in Geweben
charakterisiert, die Teile des Sox10 Expressionsmusters widerspiegelten (Abb. 7 C, G).
Die genregulatorische Aktivität des D6 Transgens war stark in den otischen Vesikeln, in
den Ganglien des Nervus trigeminus, des Nervus facialis und des Nervus statio-acusticus
nachweisbar (Abb. 7 G). Zusätzlich wurde eine schwache β-Galaktosidaseaktivität in den
Spinalganglien beobachtet. Die Spinalganglien der U2 positiven Embryonen wiesen dem
gegenüber eine viel kräftigere X-Galfärbung auf (Abb. 7 C). Die Farbintensität dieser
Ganglien nahm in U2 Transgenen von kranial nach kaudal ab, vergleichbar mit
Embryonen, die ein Sox10LacZ Allel trugen (Abb. 7 A, C). Des Weiteren war die Aktivität
des U2 Transgens in den Kranialganglien besonders stark. Sowohl die Kiemenbögen als
auch die otischen Vesikel wiesen hingegen keine β-Galaktosidaseaktivität auf. Nur sehr
wenige Zellen waren zudem im frontonasalen Bereich gefärbt (Abb. 7 C).
Zur letzten Kategorie zählten Embryonen, die das U1 bzw. das U3 Transgen trugen. Ihr
LacZ Expressionsmuster korrespondierte weitestgehend mit dem von Sox10 (Abb. 7 B, D).
In U1 transgenen Embryonen waren alle Sox10 exprimierenden Gewebe mit Ausnahme
der Mittel-Hinterhirngrenze β-Gal positiv. Verglichen mit gefärbten Sox10LacZ/+
Embryonen war jedoch eine deutlich geringere β-Galaktosidaseaktivität zu beobachten.
Nur die otischen Vesikel zeigten in den U1 transgenen Linien eine starke Expression (Abb.
7 B). Das Expressionmuster des U3 Transgens stimmte in fast allen Geweben mit dem von
Sox10LacZ/+ Kontrollembryonen überein. Im Vergleich zu U2 wiesen sie allerdings keine β-
Galaktosidaseaktivität in den otischen Vesikeln auf (Abb. 7 D). Verglichen mit U1
Embryonen waren U3 positive Transgene kräftiger gefärbt, jedoch war die LacZ
Expression immer noch schwächer als in Sox10LacZ/+ Embryonen entsprechenden Alters.
Die phänotypische Analyse der U3 Transgene zum Zeitpunkt 9.5 dpc resultierte zusätzlich
in der Detektion β-Gal positiver Zellen im Herzen. Diese ektope Expression war in allen
drei U3 Linien reproduzierbar.
Ergebnisse 33
3.1.4 Genregulatorische Aktivität der evolutionär konservierten, nicht-
kodierenden Regionen am Embryonalstadium 11.5 dpc
Im weiteren Verlauf der Embryogenese veränderte sich die genregulatorische Aktivität der
potentiellen Enhancer signifikant. So zeigte kein transgener Embryo an 11.5 dpc eine
Färbung in den Kiemenbögen und im frontonasalen Bereich (Abb. 8 B-H). In Sox10LacZ/+
Embryonen analogen Alters verschwand die Expression des LacZ Gens in den
Kiemenbögen gleichermaßen und nahm auch signifikant in der frontonasalen Region ab
(Abb. 8 A). Die nachlassende Enhanceraktivität rekapitulierte also die Reduktion der
Sox10 Genexpression in diesen Geweben. Hingegen wies im Vergleich zur Sox10LacZ/+
Kontrolle keiner der Enhancer genregulatorische Aktivität in den sich entwickelnden
Pigmentzellen auf (Abb. 8 A-H). Die β-Gal positiven Melanoblasten der heterozygoten
Sox10 Embryonen waren besonders gut im Augen- und Schwanzbereich nachweisbar
(Abb. 8 A)
Abb. 8: Nachweis der β-Gal Expression in transgenen Embryonen zum Zeitpunkt 11.5 dpc. Die β-Galaktosidaseaktivität wurde in einer Farbreaktion mit X-Gal als Substrat sowohl in Sox10LacZ/+ (A) als auch in den transgenen Embryonen bestimmt, in den die Expression des LacZ Gens von den evolutionären konservierten, nicht-kodierenden Regionen U1 (B), U2 (C), U3 (D), U4 (E), U5 (F), D6 (G) und D7 (H) reguliert wurde. Die transgenen Embryonen wurden für 9 h, die Sox10LacZ/+ Embryonen für 3 h gefärbt. Unter diesen Bedingungen wurde in Wildtypen keine Färbung beobachtet.
Ergebnisse 34
An Tag 11.5 der Embryonalentwicklung wiesen U1, U2, U3 und D6 wie an 9.5 dpc
Enhanceraktivität auf (Abb. 8 B, C, D, G). Insbesondere das sich entwickelnde periphere
Nervensystem, inklusive der Ganglien und Nerven, zeigte eine kräftige X-Galfärbung in
diesen Embryonen. Die β-Gal Expressionsmuster von U1, U2, U3 und D6 waren,
verglichen mit den zuvor analysierten Embryonen früheren Stadiums, zudem deutlich
ähnlicher. Dies deutet auf eine überlappende, genregulatorische Aktivität in dieser Phase
der Embryonalentwicklung hin. Dennoch unterschieden sich diese vier transgenen Linien
in ihren Färbemustern. Im Allgemeinen zeigte U2 eine schwächere Aktivität in den
kranialen Ganglien. Während U1 und U2 eine besonders hohe β-Galaktosidaseaktivität in
den Spinalganglien und entlang der Nerven aufwiesen (Abb. 8 B, C), war die Färbung in
U3 transgenen Embryonen entlang der Nerven (Abb. 8 D) und in D6 positiven Embryonen
auf die Spinalganglien konzentriert (Abb. 8 G). Die Expression des LacZ Gens in Zellen
des enterischen Nervensystems konnte nur in U1 und U3 transgenen Embryonen detektiert
werden.
Übereinstimmend mit den analysierten Embryonen am Tag 9.5 dpc zeigten die Enhancer
U2 und U3 keine Aktivität in den otischen Vesikeln (Abb. 8 C, D). Die X-Galfärbung in
diesem Gewebe in U1 transgenen Embryonen war verglichen mit an 9.5 dpc analysierten
Embryonen bereits deutlich schwächer. Dies lässt vermuteten, dass die genregulatorische
Aktivität in dieser Struktur bereits am embryonalen Stadium 11.5 dpc abnimmt (Abb. 8 B).
Hingegen war die Färbung der otischen Vesikel in D6 Transgenen sehr ausgeprägt (Abb. 8
G).
Während U4, U5 und D7 an 9.5 dpc noch keine detektierbare β-Galaktosidaseaktivität
aufwiesen, konnte an 11.5 dpc in der transgenen Linie U5 eine Färbung im Trigeminus und
in den Spinalganglien beobachtet werden (Abb. 8 F). Das genregulatorische Potential von
U5 wird offenbar erst in der mittleren Phase der Embryonalentwicklung benötigt. Obwohl
Sox10 normalerweise nicht im dorsalen Rückenmark an 11.5 dpc exprimiert wird, wurden
gefärbte Strukturen in diesem Bereich in U5 und D6 transgenen Embryonen nachgewiesen.
D7 zeigte hingegen keinerlei aktivierendes Potential, weder an diesem noch an späteren
Stadien der Embryogenese. Auch nach signifikant längeren Färbezeiten konnte keine β-
Galaktosidaseaktivität für diesen potentiellen Enhancer nachgewiesen werden. Dies war
ebenso der Fall für fünf der sieben U4 transgenen Linien. Embryonen einer U4 Linie
zeigten eine schwache β-Galfärbung von Mittellinienstrukturen, in einer anderen färbte
sich das Blutgefäßsystem (Daten nicht gezeigt). Die Ursache für diese ektopen
Ergebnisse 35
Expressionsmuster könnte in den Integrationsstellen der transgenen Konstrukte im Genom
begründet sein, wenn diese z.B. nahe anderer genregulatorischer Elemente lokalisiert sind.
3.1.5 Genregulatorische Aktivität der evolutionär konservierten, nicht-
kodierenden Regionen während der späten Embryogenese (16.5 dpc)
Für die Analyse der Embryonen zum Zeitpunkt 16.5 dpc wurden 20 µm dicke
Gefrierschnitte angefertigt und die X-Gal Färbungen direkt auf den Objektträgern
durchgeführt. Die heterozygote Sox10 Mausmutante (Britsch et al., 2001) diente wiederum
als Kontrolle. An 16.5 dpc war eine spezifische β-Galaktosidaseaktivität in diesen Mäusen
in den peripheren Nerven, den Spinalganglien und im Rückmark zu beobachten (Abb. 9
A). Ferner war die Expression von LacZ in heterozygoten Sox10 Embryonen sowohl im
enterischen Nervensystem (Abb. 9 A, D) als auch in den sympathischen Ganglien, den
Melanozyten und den chromaffinen Zellen des Nebennierenmarks nachweisbar.
Während die X-Galfärbung in den transgenen Linien U1 und U2 in den Spinalganglien an
16.5 dpc vergleichbar mit Sox10LacZ/+ Embryonen war (Vergleiche Abb. 9 B, C mit A),
wiesen U5 transgene Embryonen ein punktuelles, ungleichmäßiges Färbemuster auf (Abb.
9 E). Dieses Resultat lies vermuten, dass die U5 transgenen Tiere nicht die für Sox10
typische Expression in Satellitengliazellen widerspiegeln (Britsch et al., 2001), sondern
dass in diesem Fall ein anderer Zelltyp gefärbt wurde. Embryonen, die das U3 bzw. das D6
Transgen trugen, zeigten hingegen keine signifikante β-Galaktosidaseaktivität in dieser
Struktur (Abb. 9 D, F). Dies spricht für eine Abnahme der D6 Enhanceraktivität in den
Spinalganglien zu diesem Zeitpunkt, da am embryonalen Tag 11.5 D6 positive Embryonen
eine kräftige Färbung dieses Gewebes aufwiesen.
Auf den Gefrierschnitten von U1, U2, U3 und D6 transgener Embryonen zeigte sich β-
Galaktosidaseaktivität entlang der peripheren Nerven. Parallele Färbungen von Sox10LacZ/+
Embryonen ergaben vergleichbare Resultate (Vergleiche Abb. 9 B, C, D und F mit A). Die
Analyse der genomischen Region U5 stellte in diesem Zusammenhang die Ausnahme dar,
da bei analogen Färbezeiten keine signifikante Aktivität entlang der peripheren Nerven
detektiert werden konnte (Abb. 9 E).
Während für die evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Regionen U1, U5 und D6
beinahe keine β-Galaktosidase an 16.5 dpc im embryonalen Rückenmark nachweisbar war
Ergebnisse 36
(Abb. 9 E, F), wiesen U2 und U3 genregulatorische Aktivität in diesem Gewebe auf (Abb.
9 C, D). Jedoch resultierte nur die Färbung von Embryonen der U2 transgenen Linie in
einer gleichmäßigen Verteilung β-Galaktosidase positiver Zellen im Parenchym des
Rückenmarks, wie sie für Oligodendrozytenvorläufer erwartet und bei heterozygoten
Sox10 Embryonen beobachtet und dokumentiert wurde (Vergleiche Abb. 9 C mit A). Im
Gegensatz dazu war die X-Galfärbung der transgenen Linie U3 vorwiegend im Bereich des
dorsalen Horns des Rückenmarks lokalisiert (Abb. 9 D), was für eine ektope Aktivität des
U3 Enhancers sprach.
Abb. 9: Nachweis der β-Gal Expression in transgenen Embryonen zum Zeitpunkt 16.5 dpc. Die β-Galaktosidaseaktivität wurde in einer Farbreaktion auf Gefrierschnitten mit X-Gal als Substrat sowohl in Sox10LacZ/+ (A), als auch in den transgenen Embryonen bestimmt, in denen die Expression des LacZ Gens von den evolutionären konservierten, nicht-kodierenden Regionen U1 (B), U2 (C), U3 (D), U5 (E) und D6 (F) reguliert wurde. Die angefertigten Gefrierschnitte wurden für 2 h gefärbt. Unter diesen Bedingungen wurde auf den Wildtypschnitten keine Färbung beobachtet.
Die Embryonen, die das U1 bzw. U3 Konstrukt integriert hatten, wiesen β-
Galaktosidaseaktivität im enterischen Nervensystem am embryonalen Tag 16.5 auf (Abb.
10 B, C, E, F). Heterozygote Sox10 Embryonen zeigten am selben Stadium und in
parallelen Experimenten eine vergleichbare Färbung (Abb. 10 A, D). Die β-Gal positiven
Zellen waren am Magen, am Dünn-, Blind- und Dickdarm zu dokumentieren (Abb. 10 A-
F).
Die sympathischen Ganglien des vegetativen Nervensystems der U1, U2 und D6
transgenen Embryonen wiesen am embryonalen Tag 16.5 dpc β-Galaktosidaseaktivität auf.
Ergebnisse 37
In den U1 und U3 transgenen Linien wurde LacZ Expression im Nebennierenmark
detektiert (Daten nicht gezeigt).
Abb. 10: Nachweis der β-Gal Expression im enterischen Nervensysten zum Zeitpunkt 16.5 dpc. Die β-Galaktosidaseaktivität wurde in einer Farbreaktion auf Gastrointestinaltraktgewebe mit X-Gal als Substrat sowohl in Sox10LacZ/+ (A) als auch in den transgenen Embryonen bestimmt, in denen die Expression des LacZ Gens von den evolutionären konservierten, nicht-kodierenden Regionen U1 (B, E), U3 (C, D) abhängt. Die präparierten und vorfixierten Gewebe wurden für 1 h gefärbt. Unter diesen Bedingungen wurde auf Wildtypgeweben keine Färbung beobachtet.
3.1.6 Zelltypspezifische Aktivität der evolutionär konservierten, nicht-
kodierenden Regionen entlang peripherer Nerven
Die X-Galfärbungen vermittelten einen sehr guten Überblick über die zeitlichen und
räumlichen Expressionsmuster der evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Regionen
in den verschiedenen Geweben (Abb. 7 – 10). Für eine detaillierte Analyse wurden
immunhistochemische Studien auf 10 µm dicken Gefrierschnitten durchgeführt. Hiermit
sollte überprüft werden, ob die β-Gal positiven Zellen den Sox10 exprimierenden Zellen
entsprechen.
Ergebnisse 38
Deshalb wurden für die transgenen Linien U1, U2, U3 und D6, in denen β-
Galaktosidaseaktivität entlang der peripheren Nerven nachgewiesen wurde,
immunhistochemische Untersuchungen auf Gefrierschnitten von 12.5 und 16.5 dpc alten
Embryonen durchgeführt. Im Entwicklungsstadium 12.5 dpc konnte in Mäusen, die das
U1, U2 und U3 Konstrukt trugen, das zytoplasmatisch lokalisierte Enzym β-Galaktosidase
und das im Kern befindliche Sox10 Protein in den selben Zellen nachgewiesen werden
(Abb. 11 A, B, C). Zu diesem Zeitpunkt ist der Transkriptionsfaktor Sox10 in Schwann-
Zell-Vorläuferzellen exprimiert (Britsch et al., 2001; Sonnenberg-Riethmacher et al.,
2001). D6 transgene Embryonen waren an 12.5 dpc entlang der peripheren Nerven β-Gal
negativ (Abb. 11 D).
Während am Tag 12.5 nach der Befruchtung nur eine mäßige β-Galaktosidaseaktivität in
diesem Gewebe beobachtet wurde, konnte auf Gefrierschnitten zum Zeitpunkt 16.5 dpc
eine deutlich kräftigere Färbung beobachtet werden (Vergleiche Abb. 11 A – C mit E – L).
Der Grund hierfür ist die steigende Zellzahl im sich stetig weiter entwickelnden peripheren
Nerven. Während um den Tag 12 dpc der Embryonalentwicklung aus einigen
ausgewanderten Neuralleistenzellen die ersten Schwann-Zell-Vorläufzellen entstehen,
entwickeln sie sich ab Tag 15 dpc bis hin zur Geburt zu unreifen Schwann-Zellen (Dong et
al., 1995; Dong et al., 1999; Jessen et al., 1994). In der D6 transgenen Linie war an 16.5
dpc im Gegensatz zum Zeitpunkt 12.5 dpc eine genregulatorische Aktivität dieses
Enhancers entlang der peripheren Nerven zu dokumentieren (Vergleiche 11 L mit D). Für
U1, U2 und U3 bestätigte sich die Kolokalisation von β-Gal und Sox10 in Schwann-Zellen
auch in dieser späteren Entwicklungsphase.
Zur Bestätigung dieser Ergebnisse wurden weitere immunhistochemische Untersuchungen
auf Gefrierschnitten von Embryonen im Entwicklungsstadium 16.5 dpc durchgeführt. Für
die frühen Differenzierungsprozesse der myelinisierenden Schwann-Zelle ist unter
anderem der POU-III Transkriptionsfaktor Oct-6 (Octamer-binding transcription factor 6)
von großer Bedeutung (Bermingham et al., 1996; Jaegle et al., 1996; Jaegle and Meijer,
1998). Oct-6 wurde deshalb für die Verifizierung der Ergebnisse verwendet. Am
Entwicklungstag 16.5 dpc überlagerten sich die mittels Immunfluoreszenz detektierten
Signale der Proteine Oct-6 und β-Galaktosidase (Abb. 11 I – L) und bestätigten somit die
vorangegangenen Analysen.
Ergebnisse 39
Abb. 11: Zelluläres β-Gal Expressionmuster unter der Kontrolle der evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Regionen entlang peripherer Nerven. Immunhistochemische Studien wurden auf transversalen Gefrierschnitten (10 µm) von Embryonen der Entwicklungsstadien 12.5 dpc (A – D) und 16.5 dpc (E – L) durchgeführt. Hierfür wurden Antikörper gegen β-Gal (grün) in Kombination mit Antikörpern gegen Sox10 (A – H) bzw. Oct-6 (I – L) (rot) angewendet.
3.1.7 Zelltypspezifische Aktivität der evolutionär konservierten, nicht-
kodierenden Regionen in den Spinalganglien
In den Spinalganglien wurde in den transgenen Linien U1, U2, U5 und D6
genregulatorische Aktivität der entsprechenden evolutionär konservierten, nicht-
kodierenden Regionen mittels X-Galfärbungen dokumentiert (Abb. 8, 9). Die Gliazellen
der Spinalganglien werden als Satellitenzellen bezeichnet und exprimieren wie alle
Gliazellen des peripheren Nervensystems Sox10 (Britsch et al., 2001; Sonnenberg-
Riethmacher et al., 2001). Mittels immunhistochemischer Analysen sollte die Expression
des LacZ Gens für die entsprechenden transgenen Linien in den Spinalganglien auf
zellulärer Ebene untersucht werden.
Zu diesem Zweck wurden zunächst Doppelfärbungen mit Antikörpern gegen β-Gal und
Sox10 durchgeführt. Auf 10 µm Gefrierschnitten von Embryonen der transgenen Linien
U1 und U2 wurde in den Spinalganglien das nukleäre Sox10 vom zytoplasmatischen β-Gal
Ergebnisse 40
Signal eingefasst (Abb. 12 A, B, M, N). Die Interpretation, dass es sich bei diesen Zellen
um Satellitenglia handelt, wurde durch weitere immunhistochemische Untersuchungen
verifiziert. Dazu wurden Doppelfärbungen mit Antikörpern gegen β-Gal und BFABP
(brain fatty acid binding protein) bzw. Brn3.0 (brain 3.0) angefertigt. Außerhalb des
zentralen Nervensystems ist die Expression von BFABP auf Gliazellen beschränkt. In
undifferenzierten Neuralleistenzellen ist BFABP zwar noch nicht nachweisbar, jedoch
beginnt die Expression dieses Proteins sehr früh in der Gliogenese (Kurtz et al., 1994). Der
Klasse IV POU-Domänen Transkriptionsfaktor Brn3.0 spielt hingegen in der Entwicklung
von sensorischen Neuronen eine wichtige Rolle. Aufgrund seiner frühen und spezifischen
Expression in sich differenzierenden Nervenfasern ist Brn3.0 ein geeigneter Marker für
diesen Zelltyp (Gerrero et al., 1993). Sowohl im Entwicklungsstadium 12.5 dpc als auch in
16.5 dpc alten Embryonen überlagerten sich die Signale der beiden zytoplasmatisch
lokalisierten Proteine β-Gal und BFABP (Abb. 12 E, F und R, S). Wie erwartet, resultierte
die entsprechende Doppelfärbung von β-Gal und Brn3.0 hingegen nicht in einer
Kolokalisation dieser zwei Proteine (Abb. 12 I, J und V, W). In U1 und U2 transgenen
Embryonen ist somit die Expression des LacZ Gens auf Satellitenzellen restringiert.
Im Gegensatz hierzu standen die Ergebnisse der immunhistochemischen Doppelfärbungen
der transgenen Linien U5 und D6 analoger Entwicklungsstadien. Das punktuelle, nicht
gleichmäßig verteilte LacZ Expressionsmuster in Spinalganglien von 16.5 dpc alten
Embryonen der transgenen Linie U5 ließ bereits mutmaßen, dass es sich bei den β-Gal
positiven Zellen nicht um Satellitenzellen handelte. Immunhistochemische Analysen mit
Antikörpern gegen β-Gal und Sox10 bestätigten dies. Weder Doppelfärbungen von β-Gal
und Sox10 noch von β-Gal und BFABP resultierten in Signalüberlagerungen (Abb. 12 C,
G und O, T). Andererseits kolokalisierte die β-Galaktosidase mit dem neuronal
exprimierten Transkriptionfaktor Brn3.0 (Abb. 12 K und X). Dies war auch für analoge
Untersuchungen an der transgenen Linie D6 an 12.5 dpc zu beobachten (Abb. 12 D, H, L),
während eine LacZ Expression an 16.5 dpc weder immunhistochemisch noch durch X-
Galfärbungen in Spinalganglien nachweisbar war. (Abb. 12 P, U, Y ; Abb. 9 F).
Ergebnisse 41
Abb. 12: Zelluläres β-Gal Expressionmuster unter der Kontrolle der evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Regionen in den Spinalganglien. Immunhistochemische Studien wurden auf transversalen Gefrierschnitten (10 µm) von Embryonen der Entwicklungsstadien 12.5 dpc (A – L) und 16.5 dpc (M – Y) durchgeführt. Hierfür wurden Antikörper gegen β-Gal (grün) in Kombination mit Antikörpern gegen Sox10 (A – D und M – P), BFABP (E – H und R – U) bzw. Brn3.0 (I – L und V – Y) (rot) angewendet.
Ergebnisse 42
3.1.8 Zelltypspezifische Aktivität der evolutionär konservierten, nicht-
kodierenden Regionen im embryonalen Rückenmark
Die Expression von Sox10 ist im zentralen Nervensystem auf die Myelin-bildenden
Oligodendrozyten beschränkt. In Sox10 defizienten Mäusen entwickeln sich zwar die
entsprechenden Vorläufer, jedoch ist die terminale Differenzierung gestört. Dies resultiert
in einer fehlenden Expression von Myelingenen, wie MAG, PLP und MBP (Stolt et al.,
2002). In den transgenen Tieren der Linien U2 und U3 wurde im Rückenmark signifikante
β-Galaktosidaseaktivität in einer Farbreaktion mit X-Gal als Substrat nachgewiesen (Abb.
9 B, C). Daher sollten zellspezifische, immunhistochemische Studien weiteren Aufschluss
über die Zelltypen geben, in denen eine genregulatorische Aktivität der Enhancer an
Embryonen im Entwicklungsstadium 16.5 dpc beobachtet wurde.
Abb. 13: Zelluläres β-Gal Expressionsmuster unter der Kontrolle der evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Regionen U2 und U3 im embryonalen Rückenmark an 16.5 dpc. Immunhistochemische Studien wurden auf transversalen Gefrierschnitten (10 µm) von Embryonen des Entwicklungsstadiums 16.5 dpc durchgeführt. Hierfür wurden Antikörper gegen β-Gal (grün) in Kombination mit Antikörpern gegen Sox10 (A, C), Olig2 (B) bzw. Lmx1b (D) angewendet.
U2 transgene Embryonen wiesen wie die Sox10LacZ/+ Kontrollembryonen über das
Parenchym des Rückenmark verstreute β-Gal positive Zellen auf. Immunhistochemische
Doppelfärbungen von β-Galaktosidase mit Sox10 bzw. mit Olig2 bestätigten, dass es sich
bei diesen Zellen um sich entwickelnde Oligodendrozyten handelte (Abb. 13 A, B). Der
bHLH-Transkriptionsfaktor Olig2 ist an der Initiation der Oligodendrozyten-
Ergebnisse 43
differenzierung beteiligt (Zhou et al., 2001) und wurde deshalb zur Verifizierung des
Zelltyps benutzt. Alle β-Galaktosidase exprimierenden Zellen im embryonalen
Rückenmark der transgenen Linie U2 sind am Tag 16.5 dpc auch positiv für die im
Zellkern lokalisierten Transkriptionsfaktoren Sox10 und Olig2 (Abb. 13 A, B).
Im Vergleich dazu konzentrierte sich die genregulatorische Aktivität der evolutionär
konservierten, nicht-kodierenden Region U3 in Embryonen analogen Entwicklungs-
stadiums vorwiegend auf das dorsale Horn des Rückenmarks (Abb. 9 D). Dies lies
vermuten, dass diese LacZ exprimierenden Zellen keine sich differenzierenden
Oligodendrozyten sind. Experimentell bestätigt wurde diese These durch
immunhistochemische Analysen, in denen neben anti-β-Gal und anti-Sox10 Seren auch
Antikörper gegen den dorsalen Interneuronenmarker Lmx1b (Chizhikov and Millen, 2004;
Gross et al., 2002) verwendet wurden. In keiner der β-Gal positiven Zellen des
Rückenmarks der U3 transgenen Embryonen ließ sich Sox10 detektieren (Abb. 13 C).
Hingegen wurde in einigen LacZ exprimierenden Zellen Lmx1b nachgewiesen (Abb. 13
D). So konnte geschlussfolgert werden, dass die genregulatorische Aktivität von U3 im
embryonalen Rückenmark auf eine Subspezies von Interneuronen restringiert ist.
3.1.9 Untersuchungen zur Bindung von Neuralleisten assoziierten
Transkriptionsfaktoren an die evolutionär konservierten, nicht-
kodierenden Regionen
Die evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Regionen U1, U2, U3, U5 und D6 im
Sox10 Locus wiesen ein zumindest zum Teil überlappendes Expressionsmuster auf. Daher
wurden diese Enhancer auf Sequenzhomologien untersucht. Trotz ähnlicher
Enhanceraktivität in den verschiedenen Sox10 exprimierenden Neuralleistenderivaten
wurden keine siginifikanten Sequenzübereinstimmungen zwischen den analysierten
Regionen detektiert (Daten nicht gezeigt). Dies schließt jedoch nicht aus, dass die
evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Regionen durch dieselben
Transkriptionsfaktoren erkannt werden. Deshalb wurden Transkriptionsfaktoren, deren
Rolle in der Neuralleistenentwicklung bekannt ist, auf ihre Bindung an diese Regionen
mittels Gelretardierungsexperimenten untersucht (Abb. 14).
Ergebnisse 44
Abb. 14: Bindung von Transkriptionsfaktoren an die evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Sequenzen der Sox10 genomischen Region. (A) Schematische Darstellung der in Gelretardierungs-experimenten verwendeten DNA Fragmente. (B-M) Jedes radioaktiv markierte Fragment wurde mit einem Kontrollextrakt (C) bzw. mit Extrakten, die überexprimiertes Sox9, Sox10, Pax3, AP2α oder Lef1 enthalten, inkubiert, bevor die Protein-DNA Komplexe von der ungebundenen DNA durch native Gelelektrophorese aufgetrennt wurden. Ungebundene DNA ist jeweils in der ersten Spur gezeigt und läuft im untersten Teil des nativen Gels. (B) U1-1; (C) U1-2; (D) U2-1; (E) U2-2; (F) U3-1; (G) U3-2; (H) U3-3; (I) U3-4; (J) U5-1; (K) U5-2; (L) D6-1; (M) D6-2.
Ergebnisse 45
Für die Gelretardierungsexperimente wurden die Regionen U1, U2, U3, U5 und D6 in
Fragmente ähnlicher Größe unterteilt, um eine gute Auflösung der Proteinkomplexe in der
nativen Gelelektrophorese zu ermöglichen (Abb. 14 A). Getestet wurden Sox9, Sox10,
Pax3, AP2α (activator protein 2), Lef1 (lymphoid enhancer-binding factor 1), FoxD3
(forkhead box D3) und Snail2. Mit Ausnahme des von U2-2 (Abb. 14 E) haben alle
Fragmente zumindest einen der analysierten Transkriptionsfaktoren gebunden. Keiner der
Enhancer zeigte Bindung von FoxD3 und Snail2 (Daten nicht gezeigt). AP2α wurde nur
von U3 und U5 gebunden (Abb. 14 I, K). Des Weiteren wiesen alle Enhancer zumindest
eine Bindestelle für Sox9, Sox10, Pax3 und Lef1 auf (Abb. 14 B-D, F-M). U1, U3 und D6,
die Enhancer mit hoher Neuralleistenaktivität, besitzen mehrere Bindestellen für Sox-
Proteine, Pax3 und Lef1 (Abb. 14 B, C, F, G, H, I, L, M). Als weiterer
Neuralleistenenhancer hat U2 ebenfalls mehrere Bindestellen für Sox-Proteine und Lef1,
aber nur eine Pax3 Bindestelle (Abb. 14 D). Einige der Fragmente binden Sox-Proteine als
Dimer (Abb. 14 B, C, D, F, G, I, L, M) andere als Monomer (Abb. 14 D, H). Diese
Ergebnisse gehen mit früheren Beobachtungen einher, denn auch für andere
genregulatorische Regionen wurde die Bindung sowohl von monomeren als auch von
dimeren Sox-Proteinen nachgewiesen (Wegner, 2005).
Im Gegensatz dazu enthält U5 zusätzlich zu seiner AP2α Bindestelle nur eine dimere Sox,
eine Pax3 und eine Lef1 Bindestelle (Abb. 14 J, K). U5 weist im Vergleich zu U1, U2, U3
und D6 auch nur eine schwache Enhanceraktivität in Neuralleistenderivaten auf.
Grundsätzlich binden die evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Regionen also eine
ähnliche Kombination von Neuralleisten assoziierten Transkriptionsfaktoren. Die Anzahl
der Bindestellen korreliert zudem in jedem Enhancer in etwa mit seiner Aktivität in der
Neuralleiste und deren Derivaten.
3.2 Untersuchungen zur genregulatorischen Aktivität der evolutionär
konservierten, nicht-kodierenden Region U1
Da in früheren Studien ebenfalls gezeigt wurde, dass U1 für die Regulation der Sox10
Genexpression von Bedeutung ist (Antonellis et al., 2006), sollten in weiteren Analysen
cis-regulatorische Elemente und Transkriptionsfaktoren genauer charakterisiert werden, die
für die Aktivität von U1 verantwortlich sind.
Ergebnisse 46
3.2.1 Identifikation von cis-regulatorischen Elementen im U1 Enhancer
Für die Identifikation cis-regulatorischer Elemente im U1 Enhancer wurden erneut
sequenzvergleichende Analysen angefertigt. Im Kernbereich dieser genomischen Region
wurde eine monomere und eine heterodimere Bindestelle für Sox-Proteine identifiziert
(Abb. 15). Alle Mitglieder der Sox-Familie binden an das gleiche spezifische heptamere
DNA-Konsensusmotiv (A/T)(A/T)CAA(A/T)G (Harley et al., 1994).
Abb. 15: Multipler Sequenzvergleich der U1 Kernsequenz. Dargestellt sind homologe Sequenzen des U1 Enhancers zwischen Maus, Ratte, Mensch, Schimpanse, Rhesusaffe, Hund, Kuh und Huhn. Hervorgehoben wurden die monomere SoxC und dimere SoxAB Bindestelle. * konserviertes Nukleotid
In ersten Experimenten sollte deshalb die Bedeutung der identifizierten, potentiellen Sox-
Bindestellen untersucht werden. Dazu wurde die genregulatorische Region U1 direkt vor
einem Hsp68 Minimalpromotor und ein Luziferasereportergen kloniert und die Sox-
Bindesequenzen einzeln oder in Kombinationen mutiert (Abb. 16 A). Da in der Schwann-
Zelllinie S16 mittels RT-PCR Analysen endogenes Sox10 nachgewiesen wurde (Abb. 16
B), war diese gliale Zelllinie geeignet, um Mutationsanalysen im U1 Enhancer in Form
von Luziferaseaktivitätstests durchzuführen. Für den U1 Enhancer wurde in S16-Zellen
Ergebnisse 47
eine starke, genregulatorische Aktivität dokumentiert. Die basale Promotoraktivität
(Hsp68min) wurde durch die genregulatorische Region U1 27-fach erhöht (Abb. 16 C).
Separate Mutationen in der monomeren Bindestelle (SoxCmut) und der heteromeren
Bindestelle (SoxABmut) führten zu einer deutlich geringeren Luziferaseaktivität. Die
Kombination beider mutierten Bindestellen verminderte die Reportergenexpression weiter
(Abb. 16 C).
Abb. 16: Funktionelle Charakterisierung der Sox-Bindestellen im U1 Enhancer. (A) Schematische Darstellung der verwendeten Luziferasekonstrukte. (B) RT-PCR Analyse von Rückenmark (RM) aus neugeborenen Ratten und S16 Schwann-Zellen. (C) Mutationsanalyse mittels Luziferaseaktivitätstest. Die angegebenen Werte repräsentieren den Mittelwert (± Standardabweichung) der Aktivität der jeweiligen Reporterkonstrukte. Die Aktivität des Hsp68min Konstruktes wurde dabei willkürlich gleich 1 gesetzt. Die Luziferaseaktivitäten wurden jeweils in Duplikaten aus drei unabhängigen Experimenten bestimmt.
Ergebnisse 48
3.2.2 Untersuchungen zur genregulatorischen Aktivität der evolutionär
konservierten, nicht-kodierenden Region U1 in Sox10 defizienten
Mäusen
In weiterführenden Experimenten wurde untersucht, ob die genregulatorische Aktivität des
U1 Enhancers Sox10 abhängig ist und damit ein autoregulatorischer Rückkopplungs-
mechanismus vorliegt. Dafür wurde die β-Galaktosidaseaktivität des U1 Transgens in
Sox10 defizienten Mäusen untersucht. Die zuerst beschriebene Sox10LacZ Mausmutante
(Britsch et al., 2001) konnte für diese Analyse nicht genutzt werden, da bei diesem
Versuchsaufbau nicht zwischen der LacZ Expression unter der Kontrolle des Sox10 Locus
und der β-Galfärbung der transgenen Linie U1 zu unterscheiden gewesen wäre. Deshalb
wurden diese Untersuchungen in Mäusen durchgeführt, die das U1 Transgen trugen und in
denen gleichzeitig der Sox10 Leserahmen durch das Gen für den reversen
Tetrazyklintransaktivator (rtTA) ersetzt wurde (Ludwig et al., 2004b).
In Embryonen, die das U1 Transgen integriert hatten, wurde zum Zeitpunkt 11.5 dpc β-
Galaktosidaseaktivität entlang der peripheren Nerven, in den Spinalganglien, in den
kranialen und sympathischen Ganglien, in den otischen Vesikeln und im enterischen
Nervensystem detektiert (Abb. 17 A). Während das genregulatorische Potential des U1
Enhancers in heterozygoten Sox10 Mutanten (Sox10rtTA/+) in etwa der Aktivität von U1 in
Sox10+/+ Mäusen entsprach (Abb. 17 B), nahm die LacZ Expression in Sox10 defizienten
Embryonen (Sox10rtTA/rtTA) signifikant ab (Abb. 17 C). Entlang der peripheren Nerven, in
den Spinalganglien sowie im sympathischen Nervensystem war nahezu keine
genregulatorische Aktivität von U1 messbar. Auch in den kranialen Ganglien waren nur
einzelne β-Gal positive Zellen nachweisbar. Hingegen wiesen die otischen Vesikel noch
eine relativ kräftige Färbung auf (Abb. 17 C). Im Gegensatz dazu waren die Unterschiede
zwischen hetero- und homozygoten Sox10LacZ Kontrollembryonen zwar deutlich, aber
nicht so ausgeprägt wie in U1 transgenen, Sox10 defizienten Tieren (Vergleiche Abb. 17 B
mit C und E mit F). Die Expression des LacZ Reportergens in homozygoten Sox10LacZ
Embryonen war im Bereich der kranialen Ganglien und Nerven gegenüber den
Heterozygoten deutlich reduziert. Ferner wurden sowohl im enterischen, als auch im
Großteil des peripheren Nervensystems mit Ausnahme der Spinalganglien keine bzw.
erheblich weniger β-Gal positive Zellen in Sox10LacZ/LacZ Embryonen detektiert. (Abb. 17
F). Die vergleichende Analyse zwischen Embryonen der Genotypen U1, Sox10rtTA/rtTA und
Sox10LacZ/LacZ führte zu dem Ergebnis, dass die LacZ Expression unter der Kontrolle des
Ergebnisse 49
U1 Enhancers bei Sox10 Defizienz sowohl im Trigeminus, als auch in den Satellitenzellen
der Spinalganglien kaum bzw. gar nicht mehr detektiert werden konnte (Vergleiche Abb.
17 E mit C).
Abb. 17: Nachweis der β-Gal Expression in Embryonen an 11.5 dpc. Die β-Galaktosidaseaktivität wurde in einer Farbreaktion mit X-Gal als Substrat bestimmt. Embryonen, die das U1 Transgen trugen, wurden für 9 h, die Sox10LacZ Embryonen für 3 h gefärbt. Unter diesen Bedingungen wurde in Wildtypen (Sox10+/+) keine β-Galaktosidasefärbung beobachtet.
Diskussion 51
4 Diskussion
4.1 Identifizierung von evolutionär konservierten, nicht-kodierenden
Regionen im Sox10 Locus
In den letzten Jahren wurde in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Arbeiten gezeigt,
dass evolutionär konservierte, nicht-kodierende Sequenzen gute Kandidaten für
genregulierende Regionen sind. Es ist daher davon auszugehen, dass nicht nur die
genetische Information für die Synthese von Proteinen, sondern dass auch die für die
Regulation ihrer Genexpression wichtige DNA-Sequenz in der Evolution konserviert
wurde. Diese Bereiche hoher Sequenzhomologie sind vielfach als Modulatoren der
Genexpression beschrieben (Sandelin et al., 2004). Häufig sind diese Regionen in
Nachbarschaft von Genen lokalisiert, die für essentielle Regulatoren entwicklungs-
biologischer Prozesse kodieren (Woolfe et al., 2005). Der Transkriptionsfaktor Sox10 ist
als solch ein wichtiger Regulator wesentlich an der Entwicklung von
Neuralleistenderivaten und Oligodendrozyten beteiligt. Seine Bedeutung bei
Differenzierungsprozessen von Gliazellen des zentralen, peripheren und enterischen
Nervensystems sowie von Melanozyten wurde mit Hilfe von Mausmutanten beschrieben
(Kelsh, 2006; Wegner and Stolt, 2005).
Durch computergestützte, vergleichende Analysen der Sox10 Loci verschiedener Spezies
wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Bereiche hoher Sequenzhomologie
identifiziert und ihre genregulatorische Aktivität in transgenen Mäusen räumlich und
zeitlich charakterisiert. Diese Untersuchung resultierte in der Identifikation von fünf
Regionen, die zumindest ein zum Teil überlappendes Expressionsmuster mit endogenem
Sox10 aufwiesen. Unter Berücksichtigung, dass die analysierte genomische Region von
den zwei ubiquitär exprimierten Genen Pol2rf und Pick1 eingefasst ist, schienen die fünf
evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Regionen gute Anwärter für
genregulatorische Bereiche zu sein, welche die zeitliche und räumliche Expression von
Sox10 vermitteln.
Diskussion 52
4.1.1 Regulation der Sox10 Genexpression durch mehrere Enhancer
Die genomische Organisation der SoxE Gene ist innerhalb ihrer Gruppe sehr ähnlich
(Wegner and Stolt, 2005). Vergleichbar mit dem nahe verwandten Sox9 Gen, wird auch
die Sox10 Expression offenbar durch mehrere Enhancer reguliert, die über einen großen
genomischen Bereich verteilt sind. In früheren Studien wurden durch vergleichende
Analysen der genomischen Sequenz von Mensch und Takifugu rubripes im humanen Sox9
Locus ebenfalls hochkonservierte Regionen identifiziert, die spezifische Sox9 Expression
vermittelten (Bagheri-Fam et al., 2006; Bagheri-Fam et al., 2001; Wunderle et al., 1998).
Das Vorhandensein mehrerer Enhancer im Sox10 Locus wird durch eine weitere Studie
gestützt, in der ebenfalls die Existenz cis-regulatorischer Abschnitte in dieser Region
diskutiert wird (Deal et al., 2006).
4.1.2 Sequenzhomologie der Enhancer zu anderen Spezies
Die Identifikation der fünf stromaufwärts und der zwei stromabwärts vom Sox10 Gen
gelegenen homologen Regionen erfolgte mittels Sequenzvergleichen verschiedener
Wirbeltierspezies. Dabei war die evolutionär entfernteste Spezies, in der diese Bereiche
noch eine Sequenzhomologie von mindestens 70% über wenigstens 100 bp aufwiesen, das
Huhn. Die analysierten Regionen zeigten keine offensichtliche Konservierung zum Frosch-
bzw. Zebrafischgenom, obwohl Sox10 vergleichbare Schlüsselfunktionen in der
Neuralleistenentwicklung aller Vertebraten hat (Aoki et al., 2003; Cheung and Briscoe,
2003; Dutton et al., 2001; Herbarth et al., 1998a; Honore et al., 2003; Kuhlbrodt et al.,
1998b; Southard-Smith et al., 1998). Sowohl für das nahe verwandte Sox9 Gen als auch
für viele andere Gene, die für wichtige entwicklungsbiologische Regulatoren kodieren,
sind nicht-kodierende, regulatorische Regionen in allen Wirbeltierspezies konserviert
(Bagheri-Fam et al., 2001; Blader et al., 2004; de la Calle-Mustienes et al., 2005; Woolfe
et al., 2005). Auf der anderen Seite wird die Genexpression der beiden SoxB1 Gene Sox2
und Sox3 ebenfalls von Enhancern reguliert, die nur in Amnioten eine hohe
Sequenzkonservierung aufweisen. In entfernteren Vertebraten konnten keine
entsprechenden homologen Bereiche identifiziert werden, obwohl diese zwei Gene in der
Diskussion 53
frühen Embryonalentwicklung und in der Neurogenese aller Wirbeltierspezies eine
wichtige Rolle spielen (Brunelli et al., 2003; Uchikawa et al., 2003).
Zwischen Säugetieren und Fischen wurden keine evolutionär konservierten, nicht-
kodierenden Regionen identifiziert. Es sind wenige Kilobasen stromaufwärts des
Zebrafisch Sox10 Gens für eine effiziente Genexpression in Melanophoren ausreichend
(Elworthy et al., 2003; Lister et al., 1999). Der 5’ flankierende Bereich des Maus Sox10
Gens (Exon3 bis -2.8 kb vor dem Transkriptionsstart) war hingegen nicht ausreichend für
eine detektierbare Reportergenexpression in M-3 Mausmelanomzellen (Deal et al., 2006).
Ferner führten weitere Analysen in Danio rerio zu dem Ergebnis, dass ein 7,2 kb großer
Bereich stromaufwärts des Zebrafisch Sox10 Gens für eine nachweisbare Expression in
Oligodendrozyten-Vorläuferzellen ausreichend ist (Kirby et al., 2006). Sox10-BAC
Deletionsstudien, in denen der Bereich direkt vor dem murinen Transkriptionsstart
untersucht wurde, resultierten hingegen nicht in einer Expression des Reportergens in
Oligodendrozyten (Deal et al., 2006).
Vergleichbare Expressionsmuster und Proteinfunktionen während der Embryogenese
verschiedener Spezies korrelieren also nicht zwangsläufig mit der Konservierung von cis-
regulatorischen Elementen, die für die genregulatorische Aktivität der entsprechenden
Gene von Bedeutung sind. Untersuchungen der Tyrosinrezeptorkinase c-Ret unterstützen
diese These. Obwohl die c-Ret Expression in Vertebraten hochkonserviert ist, weisen nur
die Exons eine hohe Sequenzhomologie zum humanen Genom auf (≥70% Identität, ≥100
bp). Trotz des Fehlens der orthologen Sequenz im Zebrafischgenom, führten humane, cis-
regulatorische Sequenzen zu einer spezifischen Reportergenexpression in diesem
Tiermodell, welche die endogene c-Ret Expression widerspiegelt (Fisher et al., 2006).
4.2 Expressionsmuster der genregulatorischen, evolutionär
konservierten, nicht-kodierenden Regionen
Die zentrale Aufgabe dieser Arbeit lag vor allem in der Analyse des räumlichen und
zeitlichen Expressionsmusters sowie in der Verifizierung der Koexpression von LacZ,
unter der Kontrolle der evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Regionen und
endogenem Sox10 bzw. weiteren zellspezifischen Markern. Die Untersuchungen der
genregulatorischen Aktivität der homologen Regionen resultierten sowohl in sehr
Diskussion 54
spezifischen, überlappenden als auch in ektopen Expressionsmustern, die in den folgenden
Abschnitten genauer diskutiert werden.
4.2.1 Überlappende, genregulatorische Aktivität der evolutionär
konservierten, nicht-kodierenden Regionen
Die genregulatorische Aktivität einzelner cis-Elemente trägt häufig zum gesamten
Expressionsmuster eines Gens nur einen räumlich und zeitlich begrenzten, sehr
spezifischen Anteil bei (Kammandel et al., 1999; Pennacchio et al., 2006; Woolfe et al.,
2005). Im Gegensatz dazu zeigten die analysierten, evolutionär konservierten, nicht-
kodierenden Regionen im Sox10 Locus ein zumindest zum Teil überlappendes
Expressionsmuster (Tab. 3)
U1 U2 U3 U4 U5 D6 D7
Anzahl der Gründer 5 3 3 7 3 2 5
Kranialganglien + + + - + + -
Dorsale Wurzelganglien + + - - + + -
Sympathische Ganglien + + - - - + -
Periphere Nerven + + + - - + -
Enterisches Nervensystem + - + - - - -
Melanozyten - - - - - - -
Nebenniere + - + - - - -
Otisches Vesikel + - - - - + -
Zentralnervensystem - + + - - - -
Ektope Expression - - + + + + -
Tab. 3: Zusammenfassung der LacZ Expression der transgenen Linien.
Zum Beispiel wiesen Embryonen der transgenen Linie U1, U2, U3 und D6 am
embryonalen Tag 11.5 im sich entwickelnden, peripheren Nervensystem bzw. an 16.5 dpc
Diskussion 55
in den Schwann-Zellen entlang der peripheren Nerven LacZ Expression auf. Entsprechend
ist die Sox10 Expression in einem speziellen Gewebe bzw. in einem Zelltyp das Resultat
der kombinierten Aktivität mehrerer evolutionär konservierter, nicht-kodierender
Regionen. In diesem Zusammenhang ist die Regulation der Sox10 Genexpression sehr
ähnlich der transkriptionellen Kontrolle des Sox2 Gens im sich entwickelnden Neuralrohr
(Uchikawa et al., 2003).
Das überlappende Expressionmuster von U1, U2, U3 und D6 könnte daraus resultieren,
dass ähnliche Kombinationen von Transkriptionsfaktoren an diese genregulatorischen
Regionen binden. Insbesondere ist das Vorhandensein multipler Bindestellen für Sox-
Proteine, für Pax3 und Lef1 kennzeichnend für diese Enhancer. Diese cis-Elemente
könnten Effekte des Wnt Signalweges auf die Sox10 Expression, eine Sox9 abhängige
Aktivierung der Sox10 Expression sowie Sox10 autoregulatorische Mechanismen
vermitteln (Aoki et al., 2003; Cheung et al., 2005; Honore et al., 2003).
Trotz der überlappenden Aktivität waren auch klare Unterschiede zwischen den
verschiedenen Sox10 Enhancern festzustellen. Während U1, U2 und U3 über einen
längeren, entwicklungsbiologischen Zeitraum kontinuierlich aktiv waren, wurde die
genregulatorische Aktivität von D6 in den Schwann-Zell bzw. deren Vorläufer durch eine
nicht-aktive Phase unterbrochen. Diese Beobachtung, dass einige regulatorische Regionen
eine ununterbrochene Aktivität in einem bestimmten Zelltyp hatten, während andere eine
mehr dynamische Aktivität aufwiesen, führte zu der Erkenntnis, dass diese cis-aktiven
Regionen zumindest zum Teil unter der Kontrolle verschiedener Signale sind.
Nichtsdestotrotz ist die gleichzeitige Aktivität mehrerer Enhancer im gleichen Zelltyp ein
wertvoller Sicherheitsmechanismus, der die kontinuierliche Sox10 Genexpression sogar
bei Inaktivierung oder Deletion eines bestimmten regulatorischen Bereiches garantiert.
Die Aktivität einer einzelnen genregulatorischen Region war zudem nicht auf ein Gewebe
oder einen Zelltyp begrenzt. Zum Beispiel wurde im Falle von U2 die Expression des LacZ
Gens sowohl in den Satellitenzellen, in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen als auch in
Schwann-Zellen an gleichen embryonalen Stadien nachgewiesen. Diese Resultate waren
insofern unerwartet, da die Expression anderer Gene in einem Gewebe bzw. Zelltyp häufig
mit der Aktivität eines bestimmten Enhancers korreliert (Kammandel et al., 1999;
Pennacchio et al., 2006; Woolfe et al., 2005).
Die kombinierte Aktivität der fünf identifizierten evolutionär konservierten, nicht-
kodierenden Regionen spiegelte ein Großteil des Sox10 Expressionsmusters wider. Dies
schließt jedoch nicht das Vorhandensein weiterer Enhancer mit gleichen bzw. redundanten,
Diskussion 56
genregulatorischen Aktivitäten aus. Gestützt wird die These weiterer, regulatorischer
Sequenzen dadurch, dass zum Beispiel in Melanozyten und in der frühen Neuralleiste für
keinen der fünf identifizierten Regionen Enhanceraktivität nachweisbar war. In früheren
Studien wurde gezeigt, dass die Sox10 Expression in Melanozyten und deren Vorläufern
über die Promotorregion vermittelt werden könnte (Deal et al., 2006). Dieser genomische
Bereich wurde in dieser Analyse jedoch nicht betrachtet. Eine andere Erklärung wäre ein
Zusammenwirken mehrerer aktivierender Regionen, die in diesem Versuchsaufbau nicht
nachgewiesen werden konnte. Die Lokalisation der cis-regulatorischen Elemente für die
Sox10 Expression in frühen Neuralleistenzellen bleibt ungeklärt.
Die Beteiligung distaler, cis-regulatorischer Elemente wird durch eine Studie einer anderen
Arbeitsgruppe gestützt. Die Integration eines modifizierten BACs in das Mausgenom
führte zu der Erkenntnis, dass alle an der Sox10 Regulation beteiligten Elemente auf
diesem 218 kb großen BAC enthalten sind. Zufällige Deletionsmutanten und vergleichende
Genomanalysen führten zu der These, dass mehrere distal lokalisierte Regionen an der
Regulation der Sox10 Genexpression beteiligt sind (Deal et al., 2006). Diese Studien
ergaben, dass die Deletion von stromaufwärts des Promotors liegender Sequenzen eine
sehr schwache Sox10 Restexpression zur Folge hat. Diese Restexpression wird damit
höchstwahrscheinlich durch den D6 Enhancer vermittelt. Das Vorhandensein von weiteren,
stromaufwärts lokalisierten 20 – 30 kb führten zu einer Expression des Transgens in den
meisten Sox10 positiven Geweben. Jedoch wiesen diese Deletionsmutanten eine stark
reduzierte Aktivität gegenüber dem intakten transgenen Konstrukt auf. Dieser zusätzliche
Bereich enthält die genregulatorischen Regionen U3 und wahrscheinlich U5, die damit für
die beobachtete Aktivität dieser Deletionsmutante verantwortlich sind. Die Analyse eines
weiteren BAC Transgens, in dem ein Bereich, der die evolutionär konservierten Regionen
U1 und U2 enthält, zufällig deletiert worden ist, weist darauf hin, dass das Fehlen dieser
beiden Regionen die Ursache für den quantitativen Unterschied in der Expressionsstärke
im Vergleich zum intakten BAC Transgen war.
In früheren Studien wurde weiterhin gezeigt, dass U1 für die Regulation der Sox10
Genexpression von Bedeutung ist (Antonellis et al., 2006). Der Phänotyp der in dieser
Studie untersuchten, transgene Mauslinie war durch Pigmentierungsdefekte, eine partielle,
enterische Aganglionose und eine verminderte Sox10 Expression in homozygoten
Embryonen gekennzeichnet. Diese Mäuse stellen somit ein Modell für das Shah-
Waardenburg-Syndrom (WS4) dar (Shah et al., 1981). Weitere Mauslinien mit dem
gleichen transgenen Konstrukt wiesen keinen vergleichbaren Phänotyp auf (Ward et al.,
Diskussion 57
1997). Die Integration des transgenen Konstruktes in Loci von Genen, die mit dem
Waardenburg-Syndrom assoziiert sind, könnte zu einer veränderten Expression dieser
Gene führen und damit die Ursache für diesen Phänotyp sein. Die Analyse dieser
Mauslinie zeigte, dass eine 15,9 kb große Region 47,3 kb stromaufwärts des Sox10
Transkriptionsstarts deletiert ist. Da U1 in dieser genomischen Region lokalisiert ist und
des Weiteren genregulatorische Aktivität in einer Melanozytenzelllinie zeigt, wurde diese
Region als Melanozytenenhancer postuliert (Antonellis et al., 2006). Die Untersuchungen
der U1 transgenen Linien unterstützen einen solch direkten Zusammenhang jedoch nicht.
Vielmehr könnten weitere, für die Sox10 Expression wichtige Elemente während der
Insertion des Transgens deletiert bzw. rearrangiert worden sein und zu diesem Phänotyp
beigetragen haben. Funktionelle Interaktionen zwischen verschiedenen Enhancern sind
eine weitere mögliche Erklärung für die Diskrepanz beider Studien.
4.2.2 Ektope Aktivität der evolutionär konservierten, nicht-kodierenden
Regionen
Neben spezifischen Sox10 Expressionsmustern wiesen einzelne evolutionär konservierte,
nicht-kodierende Regionen auch ektope Aktivität auf. Zumindest ein Teil dieser ektopen
Expressionsmuster könnte auf unterschiedliche Integrationsstellen der transgenen
Konstrukte im Mausgenom zurückgeführt werden. Fünf der sieben U4 transgenen Linien
zeigten auch nach verlängerten Färbezeiten kein aktivierendes Potential. Hingegen konnten
für die anderen beiden Linien ektope Aktivität des transgenen Konstruktes gezeigt werden.
Während Embryonen einer U4 Linie schwache Färbungen der Gefäße aufwiesen, wurde in
den Embryonen der anderen Linie eine schwache Mittellinie detektiert. Da diese
Expressionsmuster nur in den zwei Linien nachgewiesen wurden und die anderen fünf
diese Resultate nicht bestätigten, kann von einer ektopen Expression ausgegangen werden,
die auf unterschiedliche Integrationsstellen im Genom zurückzuführen ist. Für andere
untersuchte, genregulatorische Bereiche wurden hingegen reproduzierbare, ektope
Aktivitäten dokumentiert. Zum Beispiel wurde in Embryonen der transgenen Linie U3
Reportergenexpression im Herzen detektiert. Ferner zeigten U3 und U5 in verschiedenen
Phasen der Embryonalentwicklung Aktivität im dorsalen Rückenmark. Interessanterweise
wurden für einige evolutionär konservierte, nicht-kodierende Regionen neurale Aktivität
Diskussion 58
nachgewiesen, obwohl normalerweise nur differenzierte Gliazellen des Nervensystems
Sox10 exprimieren (Britsch et al., 2001). Diese ektopen Expressionsmuster
korrespondieren zum einen mit Zelltypen oder Geweben, die aus Sox10 exprimierenden
Vorläuferzellen hervorgehen. Dazu zählen zum Beispiel die kardiale Neuralleiste sowie
Vorläuferzellen der sensorischen Neurone in den Spinalganglien. Zum anderen wurde
ektope Aktivität in Zellen detektiert, die nur sehr transient und nur geringe Mengen Sox10
exprimierten. Ein Beispiel hierfür sind Zellen des dorsalen Rückenmarks. Eine Erklärung
für diese Expressionsmuster kann das nicht ordnungsgemäße Abschalten der
genregulatorischen Aktivität sein, wenn die evolutionär-konservierten, nicht-kodierenden
Regionen außerhalb ihres genomischen Kontexts untersucht werden.
Der Sox10 Locus könnte aus diesem Grund weitere Elemente enthalten, welche die Sox10
Expression während der Embryogenese sowohl zeitlich als auch räumlich begrenzt. Mit
dem in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Versuchsaufbau können diese
genregulatorischen Aktivitäten jedoch nicht analysiert werden. Da sowohl für U4 als auch
für D7 keine reproduzierbare, genregulatorische Aktivität nachgewiesen wurde, könnten
diese Elemente zudem als Silencer fungieren. Die Analyse transgener Konstrukte, in denen
aktivierende Regionen und potentielle Silencer kombiniert werden, könnten weiteren
Aufschluss über die Regulation der Sox10 Genexpression geben.
4.3 Autoregulatorischer Rückkopplungsmechanismus für den Erhalt
der Sox10 Genexpression
U1 wies in homozygot Sox10 defizienten Embryonen eine stark verminderte,
genregulatorische Aktivität in den Spinalganglien auf und demonstriert damit die
Bedeutung des Transkriptionsfaktors Sox10 für die Regulation seiner eigenen
Genexpression. Die Identifikation von Sox-Bindestellen im U1 Enhancer und deren
Mutationsanalysen deuten dabei auf einen direkten Effekt hin. Damit trägt Sox10 über
einen positiven, autoregulatorischen Rückkopplungsmechanismus zu dem Erhalt der
Sox10 Genexpression in den Satellitenzellen bei. Ferner ist dies auch eine Erklärung für
die robuste Sox10 Genexpression in diesem Gewebe während der Embryogenese.
Gestützt wird diese These durch eine weitere Mausmutante (Sox10ΔK2/ΔK2), in der das
Sox10 Gen durch einen verkürzten Leserahmen, in dem die konservierte K2 Domäne fehlt,
Diskussion 59
ersetzt wurde (Schreiner et al., 2007). Während sich die Spinalganglien in diesen Mäusen
anfangs normal entwickeln, nimmt die Expression dieser Sox10 Mutante während der
Embryonalentwicklung spezifisch in den Spinalganglien ab. Trotz der Tatsache, dass die
Satellitenzellen zunächst noch nachweisbar sind, beginnen die Spinalganglien durch die
Abnahme von Gliazellen und Neuronen zu degenerieren. Die K2 Domäne könnte über
einen positiven, autoregulatorischen Rückkopplungsmechanismus für den Erhalt der Sox10
Expression in den glialen Zellen der Spinalganglien benötigt werden und diesen über die
evolutionär konservierte, nicht-kodierende Region U1 vermitteln. Der genaue
Mechanismus dieser Regulation, muss in weiterführenden Experimenten geklärt werden.
Material 61
5 Material
5.1 Mausstämme und Tierhaltung
Folgende genetisch veränderte Mauslinien wurden in dieser Arbeit eingesetzt.
Mauslinie generiert / bezogen von Referenz
Sox10lacZ Derk E. Görich, AG-Wegner, Universität Erlangen Britsch et al., 2001
Sox10rtTA Andreas Ludwig, AG-Wegner, Universität Erlangen Ludwig et al., 2004
Tab. 4: Verwendete genetisch veränderte Mauslinien.
Folgende Wildtyp-Inzucht-Mausstämme wurden in der Zucht der genetisch veränderten
Mauslinien verwendet.
Mauslinie bezogen von
C3Heb/FeJ Charles River, Sulzfeld, Deutschland
129/SvJ Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA
Tab. 5: Verwendete Wildtyp-Inzucht-Mausstämme.
5.2 Bakterienkultur
Die in der vorliegenden Arbeit benutzten Bakterienstämme sind in Tabelle 6 aufgeführt.
Stamm bezogen von Referenz
Eschericha coli XL1 Blue
(recA1, endA1, gyr96, thi-, hsdRI, supE44,
relA1, lac, [F’proAB, lacZDM15, Tn10(tet)])
Stratagene,
La Jolla/USA
Bullock et al., 1987
Tab. 6: Verwendete Bakterienstämme.
Material 62
5.3 Chemikalien und allgemeine Reagenzien
Die in dieser Arbeit verwendeten Materialien, Chemikalien und allgemeinen Reagenzien
wurden, soweit nicht anders vermerkt, von den Firmen Carl Roth (Karlsruhe), Fluka
(Buchs, Schweiz), Merck (Darmstadt) und Sigma (Taufkirchen) bezogen.
Materialien, Medien und Puffersubstanzen zum Einsatz in der Zellkultur wurden von den
Firmen Invitrogen (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Renner (Darmstadt) bezogen.
Sämtliche Enzyme wurden von MBI Fermentas (St. Leon-Roth), New England Biolabs
(Frankfurt), Promega (Mannheim) und Roche Diagnostics (Mannheim) bezogen.
Für die Herstellung aller Lösungen, Puffer und Verdünnungen wurde ausschließlich
Reinstwasser aus einer Deionisationsanlage MilliQ der Firma Millipore (Eschborn) mit
einem spezifischen Widerstand von 18,2 MΩ/cm3 verwendet.
5.4 Zellen und Zellkultur
Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Zelllinien (Tab. 7) wurden in DMEM mit 10%
(v/v) FKS und 1% (v/v) Penicillin/Streptomycin bei einer Temperatur von 37°C, einer
Luftfeuchtigkeit von 95% und einem CO2-Gehalt von 5% im Brutschrank kultiviert.
Zelllinie Spezies Gewebe Referenz
HEK293 Mensch Niere American Type Culture Collection (ATCC)
S16 Ratte Schwannzellen American Type Culture Collection (ATCC)
Tab. 7: Verwendete Zelllinien.
Material 63
5.5 Zusammensetzung der Medien und Lösungen
Bezeichnung Zusammensetzung
DNA-Ladepuffer (10x) 49,8% TE; 50% Glyzerin; 0,1% Xylencyanol; 0,1%
Bromphenolblau
Detergenz-Lösung 1x PBS; 2 mM MgCl2; 0,02% NP-40; 0,01% SDC
ECL-Luminollösung A 0,025% Luminol; 0,1 M Tris pH 8,6
ECL-Lösung B 0,11% Para-Hydroxy-Cumarinsäure in DMSO
HBS (2x) 300 mM NaCl; 50 mM HEPES; 3 mM NaHPO4; pH 7,1
Hochsalzpuffer 1 M NaCl; 20 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; pH 7,4
Injektionspuffer 10 mM Tris; 0,2 mM EDTA; pH 7,5 in Aqua ad injectabila
LB-Agar LB-Medium; 1,5% Agar
LB-Medium 1% Bacto-Trypton; 0,5% Hefe-Extrakt; 0,5% NaCl;
Lower-Tris 1,5 M Tris pH 8,8; 0,4% SDS
Luciferase-Lysis-Puffer 88 mM Tris-HCl pH 7,8; 88 mM MES pH 7,8; 12,5 mM
MgOAc; 1 mM DTT; 0,1% Triton X-100; 2,5 mM ATP
Mowiol 3% Glycerol; 1,2% Mowiol 4-88; 0,05 M Tris pH 8,5
Niedrigsalzpuffer 0,2 M NaCl; 20 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; pH 7,4
PBS (1x) 140 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10 mM Na2HP04·2 H2O; 1,8 mM
KH2P04; pH 7,4
PBST PBS mit 0,1% Tween-20
PFA (4%) 4% Paraformaldehyd; 1x PBS
SDS-Probenpuffer (3x) 150 mM Tris-HCl pH 6,8; 6% SDS; 0,04% Bromphenolblau;
30% Glycerin; 84 mM ß-Mercaptoethanol
SDS-Elektrophoresepuffer 50,5 g Tris-HCL; 28,8 g Glycin; 1% SDS
TAE 40 mM Tris-Acetat; 1 mM EDTA; pH 8,0
Material 64
Tail-Lysis-Puffer 50 mM Tris-HCl pH 8,0; 10 mM EDTA; 0,1 M NaCl; 1%
SDS
TE-Puffer 10 mM Tris-HCl; 0,1 mM EDTA; pH 8,0
TENS 1 mM Tris; 0,1 mM EDTA; 0,1 N NaOH; 0.5% SDS
TBE 90 mM Tris-Base; 90 mM Borsäure; 2,5 mM EDTA; pH 8,3
X-Gal-Färbelösung 1x PBS; 0,75 mg/ml X-Gal; 20 mM Tris-HCl pH 7,5; 2 mM
MgCl2; 0,02% NP-40; 0,01% Natriumdesoxycholat; 5 mM
Kaliumferricyanid; 5 mM Kaliumferrocyanid
Upper-Tris 0,5 M Tris pH 6,8; 0,4% SDS
Westerntransferpuffer 25 mM Tris-HCL; 190 mM Glycin; 0,05% SDS; 30%
Methanol
Zelllysispuffer 10 mM HEPES pH 7,9; 10 mM KCl; 350 mM NaCl; 0,1 mM
EDTA pH 8,0; 0,1 mM EGTA; 1% NP-40; 2 mM DTT; 5
μg/ml Aprotinin; 5 μg/ml Leupeptin
Tab. 8: Verwendete Medien und Lösungen.
5.6 Oligonukleotide
Die im Folgenden aufgelisteten Oligonukleotide wurden von der Firma Invitrogen
(Karlsruhe) synthetisiert und für die angegebenen Anwendungen eingesetzt (Tab. 9, 10,
11).
5.6.1 Oligonukleotide für Genotypisierungen
Name Sequenz (5’ – 3’)
Hsp68min-tg AGTAGCTGTCAGCGTCTGGT
mSox10-U1-3 GTAGGCCACAGGACATCAAC
Material 65
mSox10-U2-3 GGCACAGAAAGGTCTCTTTG
mSox10-U3-3 GAGCCCTGCTCATAAACAAG
mSox10-U4-3 ACTGCGACTCTGCTGTCTCT
mSox10-U5-3 GCACTCCTCTATGCCTCAAG
mSox10-D6-3 ATTCAGAGGAAGGCCAGAGG
mSox10-D7-3 AGAAGGCAGCTGAGGTGTCT
Tab. 9: Verwendete Oligonukleotide für Genotypisierungen.
5.6.2 Oligonukleotide für Klonierungen der transgenen Konstrukte
Name Sequenz (5’ – 3’)
mSox10-U1-1
mSox10-U1-2
GGTCTGATCCTGACTCTACA
AGTAGGCCACAGGACATCAA
mSox10-U2-1
mSox10-U2-2
TCTGCCACAGGCCAGTGTTC
GAAGCCTATCGGCCACCATC
mSox10-U3-1
mSox10-U3-2
ACATCGGGTGCCATCTTGTC
GGCTGGCTTTCTTTGCTGTG
mSox10-U4-1
mSox10-U4-2
GACGAAGGAGAAGCCTTGTC
AAGGCGTGATAGCCACATGC
mSox10-U5-1
mSox10-U5-2
GTGGCAGACATTGGTAACAC
CACCTCTCAGCAGGTAGGTA
mSox10-D6-1
mSox10-D6-2
GCACTGGCATAGTTGGAAGA
GATGACCGTAAGCCTTAGGA
mSox10-D7-1
mSox10-D7-2
CGTGGACGAGCTTATCATCA
CAAGATGGCAGACCAGAGAA
Tab. 10: Verwendete Oligonukleotide für Klonierungen der transgenen Konstrukte.
Material 66
5.6.3 Oligonukleotide für Gelretardierungsexperimente
Name Sequenz (5’ – 3’)
Gelshift-U1-1
Gelshift-U1-2
GGGTTAAATCTCTCCCTGTC
GTTGGTAACAAGAGAACCAT
Gelshift-U1-3
Gelshift-U1-4
ATGGCTTCTGGGCATTGGGT
GGGCAGAGAAGAGCCAGAGA
Gelshift-U2-1
Gelshift-U2-2
GGGACTTCCCTGCAGCTGCA
GTCTCTTTGTTCTCTGCCTT
Gelshift-U2-3
Gelshift-U2-4
CTTTCTGTGCCTGGGCAGGC
GAGGGAGGGAGGGTCGACAG
Gelshift-U3-1
Gelshift-U3-2
CGCCACCTCTTAGAGAAGGG
GCCCCCAGCCCCTCTCTGAT
Gelshift-U3-3
Gelshift-U3-4
GAGGGGCTGCTTGGCAGGAC
AGAATGGTGGGAACAATGTC
Gelshift-U3-5
Gelshift-U3-6
GAGTGCAACAAATCCCTCTA
ACCACTGCCAAAGGAGCCCT
Gelshift-U3-7
Gelshift-U3-8
TCCAGCCCTGGGCGGGTGGA
AACATGTCATTACAGTAGAAAC
Gelshift-U5-1
Gelshift-U5-2
TGTTCGGGGCCTTGAAACAG
GTGTGTGTGTTAATCACATG
Gelshift-U5-3
Gelshift-U5-4
CACACACACACATAAAAAGC
TGCTTGCTGCTCCGTCCCTC
Gelshift-D6-1
Gelshift-D6-2
GGTTAATTCTGGGGGTCGGA
CAGCACAAAGGCGGCATTTC
Gelshift-D6-3
Gelshift-D6-4
CCAGGCAGCCTCCCCAGAGT
CCATCTCCCCTTAATCACAT
Tab. 11: Verwendete Oligonukleotide für Gelretardierungsexperimente.
Material 67
5.7 Antikörper
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die folgenden Antikörper und Konjugate für
immunhistochemische Analysen (IHC) verwendet (Tabelle 12, 13).
5.7.1 Primärantikörper
Antigen Spezies Verdünnung Verwendung bezogen von: / Referenz
α-BFABP Kaninchen
Antiserum
1:10.000 IHC T. Müller, MDC, Berlin
α-Brn3.0 Kaninchen
Antiserum
1:300 IHC E.Turner, UCSD,
San Diego, USA
α-Lmx1b Meerschwein
Antiserum
1:15.000 IHC T. Müller, MDC, Berlin
α-Olig2 Kaninchen
Antiserum
1:50.000 IHC D.Rowitch, DFCI,
Boston, USA
α-Sox10-1-gp Meerschwein
Antiserum
1:2.000 IHC E. Sock, Pineda
α-Tst1 (5499) Kaninchen
Antiserum
1:2.000 IHC Schreiber et al., 1997
Tab. 12: Verwendete Primärantikörper.
Material 68
5.7.2 Sekundärantikörper
Antigen Spezies Verdünnung Fluoreszenz-
farbstoff
bezogen von:
α-Maus Ziege 1:100 Cy2 Dianova, Hamburg
α-Maus Ziege 1:200 Cy3 Dianova, Hamburg
α-Ratte Ziege 1:200 Cy3 Dianova, Hamburg
α-Kaninchen Ziege 1:100 Cy2 Dianova, Hamburg
α-Kaninchen Ziege 1:200 Cy3 Dianova, Hamburg
α-Kaninchen Esel 1:100 Cy2 Dianova, Hamburg
α-Kaninchen Esel 1:200 Cy3 Dianova, Hamburg
α-Kaninchen Maus 1:100 Cy2 Dianova, Hamburg
α-Kaninchen Maus 1:200 Cy3 Dianova, Hamburg
α-Ziege Esel 1:100 Cy2 Dianova, Hamburg
α-Ziege Esel 1:200 Cy3 Dianova, Hamburg
α-Ziege Maus 1:100 Cy2 Dianova, Hamburg
α-Ziege Maus 1:200 Cy3 Dianova, Hamburg
Tab. 13: Verwendete Sekundärantikörper.
Methoden 70
6 Methoden
6.1 Molekularbiologische Standardmethoden
Standardmethoden wie die Isolierung von Plasmid-DNA, Gelelektrophorese von
Nukleinsäuren, Reinigung von Nukleinsäuren, Restriktionsspaltung, Klonierung von DNA
und Transformation von E. coli wurden allgemeinen Laborhandbüchern entnommen
(Ausubel et al., 1993; Sambrook et al., 1989).
6.1.1 Isolierung von genomischer DNA zur Genotypisierung
Bei der Präparation der Embryonen wurde eine Gewebebiopsie in Form eines Teils des
Dottersacks oder eines 5 mm langen Schwanzstücks genommen, in 250 µl Tail-Lysis-
Puffer mit 5 µl Proteinase K (20 µg/µl, Roth, Karlsruhe) bei 55°C 1 h lysiert und die DNA
anschließend mit 200 µl Isopropanol gefällt. Nach einer Zentrifugation von 10 min bei
13.200 Upm in einer Tischzentrifuge (Eppendorf, Hamburg) wurde das DNA-Pellet in 250
µl 70% EtOH gewaschen, anschließend getrocknet und in 500 µl TE-Puffer resuspendiert.
1 µl dieser genomischen DNA-Lösung wurde für Genotypisierungs-PCRs mit spezifischen
Primern benutzt.
6.1.2 Polymerasekettenreaktion (PCR)
6.1.2.1 Herstellung von DNA-Fragmenten mittels PCR
Die Reaktionsansätze zur Herstellung von DNA-Fragmenten mittels PCR (polymerase
chain reaction) setzten sich aus 1 µl template-DNA, 2 µl 10x Reaktionspuffer (MBI
Fermentas, St. Leon-Roth), 1,6 µl 25 mM MgCl2, 1 µl dNTP-Mix (je 2,5 mM), 1 µl
forward Primer (10 pmol/µl), 1 µl reverse Primer (10 pmol/µl), 0,4 µl Taq-DNA-
Methoden 71
Polymerase (2,5 U/µl; MBI-Fermentas, St. Leon-Roth) und 12 µl H2O in einem 0,2 ml
PCR-Reaktionsgefäß zusammen. Die Proben wurden in einem T3-Thermocycler
(Biometra, Göttingen) für 2 min bei 95°C denaturiert und durchliefen 25 bis 32 Zyklen von
Denaturierung (95°C, 30 sec), Annealing (30 sec bei geeigneter Temperatur) und
Elongation (72°C, 30-90 sec). Um die Verlängerung aller DNA-Fragmente sicherzustellen,
wurde der Ansatz zum Abschluss für 1 min bei 72°C inkubiert und schließlich auf 4°C
abgekühlt. Die auf diese Weise hergestellten DNA-Fragmente konnten direkt für die
Klonierung in pGEM-T Easy (Promega, Mannheim) verwendet werden bzw. wurden
aufgereinigt, restringiert und in den gewünschten Vektor kloniert.
6.1.2.2 Genotypisierungs-PCR
Im Folgenden sind die Bedingungen zusammengefasst, die für die verschiedenen
Genotypisierungs-PCR-Reaktionen verwendet wurden.
PCR Primer Fragmentgrößen
U1 Hsp68min-tg; mSox10-U1-3 tg: 749 bp
U2 Hsp68min-tg; mSox10-U2-3 tg: 534 bp
U3 Hsp68min-tg; mSox10-U3-3 tg: 603 bp
U4 Hsp68min-tg; mSox10-U4-3 tg: 427
U5 Hsp68min-tg; mSox10-U5-3 tg: 765 bp
D6 Hsp68min-tg; mSox10-D6-3 tg: 650 bp
D7 Hsp68min-tg; mSox10-D7-3 tg: 498 bp
Sx10LacZ Sox10cko5, Sox10cko6, LacZcko5 wt: 506 bp / ko: 600 bp
Sx10rtTA Sox10cko1, Sox10cko3, Sox10cko4 wt: 488 bp / ko: 618 bp
Tab. 14: Zusammenfassung der in Genotypisierungs-PCRs verwendeten Primer und der Größen der amplifizierten PCR-Produkte.
Methoden 72
Die PCR-Reaktionen wurden in einem Volumen von 20 µl durchgeführt und setzten sich
folgendermaßen zusammen: 1 µl template-DNA, 2 µl 10x-Reaktionspuffer (MBI
Fermentas, St. Leon-Roth), 1,6 µl 25 mM MgCl2 (MBI Fermentas, St. Leon-Roth), 1 µl
dNTP-Mix (je 2,5 mM), je 1 µl Primer (10 pmol/µl), 0,4 µl Taq-DNA-Polymerase (2,5
U/µl; MBI-Fermentas, St. Leon-Roth). Für folgende PCR-Reaktionen wurden zusätzlich
5% DMSO zugegeben: U1, U4, D6, D7 und Sox10rtTA.
Folgende Programme wurden für die einzelnen Reaktionen verwendet:
PCR Programm
U1-5, D6-7, Sox10rtTA 2 min 95°C, 34 x [30 sec 95°C, 30 sec 60°C, 35 sec 72°C]
Sox10LacZ 2 min 95°C, 34 x [30 sec 95°C, 30 sec 55°C, 30 sec 72°C]
Tab. 15: Zusammenfassung der Reaktionsbedingungen der Genotypisierungs-PCRs.
6.1.2.3 Reverse Transkription und RT-PCR
Bei der RT-PCR (Reverse Transkription PCR) wird als template-DNA eine aus Gesamt-
RNA (oder mRNA) mittels Erststrang-Synthese hergestellte cDNA eingesetzt. Die
Synthese der cDNA erfolgte aus 2 µg Gesamt-RNA, die in 13,5 µl RNase-freiem Wasser
(Roth, Karlsruhe) verdünnt wurde. Nach Zugabe von 1 µl Oligo(dT)-Primer (100 pmol/µl)
wurde der Ansatz für 10 min bei 72°C inkubiert und anschließend 2 min auf Eis abgekühlt.
Danach wurden 2,5 µl 10x Reverse Transkriptase Puffer (New England Biolabs,
Frankfurt), 2 µl dNTP-Mix (je 2,5 mM), 5 µl RNase-freies Wasser (Roth, Karlsruhe),
sowie 1 µl M-MuLV Reverse Transkriptase (200 U/µl; New England Biolabs, Frankfurt)
zugegeben und 1 h bei 37°C inkubiert. Abschließend wurde der Ansatz für 10 min bei
72°C inkubiert.
Für die semiquantitative RT-PCR Analyse wurden 4,4 µl H2O, 0,6 µl 25 mM MgCl2, 2 µl
Primer (je 20 pmol), 1 µl DMSO und 0,4 µl Taq-DNA-Polymerase gemischt. Als
Template-DNA wurde 1 µl einer 1:5 verdünnten cDNA eingesetzt.
Methoden 73
RT-PCR Programm
Sox10 2 min 95°C, 34 x [30 sec 95°C, 30 sec 60°C, 35 sec 72°C]
Aktin 2 min 95°C, 28 x [30 sec 95°C, 30 sec 55°C, 30 sec 72°C]
Tab. 16: Zusammenfassung der Reaktionsbedingungen der RT-PCRs.
6.2 Tierhaltung
Die Haltung aller Mauslinien erfolgte artgerecht gemäß Tierschutzgesetz (TSchG). Alle im
Rahmen dieser Arbeit verwendeten Mauslinien wurden kontinuierlich mit Wildtyp-Tieren
rückgekreuzt, um einen auf C3Heb/FeJ basierenden genetischen Hintergrund zu erzielen.
6.3 Generierung transgener Mäuse
6.3.1 Generierung und Aufreinigung der transgenen Konstrukte
Die Generierung der transgenen Vektoren erfolgte mithilfe molekularbiologischer
Standardmethoden (siehe 6.1).
Da Vektorsequenzen, insbesondere prokaryonte Promotorsequenzen und ORI-Sequenzen
die Expression von Transgenen beeinträchtigen, wurden diese mit Hilfe geeigneter
Restriktionsenzyme vom transgenen Konstrukt getrennt. Hierzu wurden 40 µg
restringierter Plasmid-DNA auf ein TAE-Gel aufgetragen und 3 – 4 h bei 100 V
aufgetrennt. Nach vollständiger Abtrennung wurde die Konstruktbande mit einem Skalpell
als schmaler Block ausgeschnitten, in einen Dialyseschlauch überführt, mit Laufpuffer
aufgefüllt und mit Klammern verschlossen. Bei quer zur Laufrichtung fixiertem
Dialyseschlauch wurde die Elektorphorese für eine weitere Stunde bei 80 Volt fortgesetzt.
Durch kurzes Umpolen (30 Sekunden) konnte die eluierte DNA von der Wand des
Dialyseschlauchs in die freie Lösung gelenkt und anschließend diese in ein Falcon-
Röhrchen überführt werden. Die DNA-Lösung wurde 1:2 mit Niedrigsalzpuffer (0,2 M
NaCl) verdünnt und mit 1 ml / Minute auf eine äquilibrierte Elutip-D Minisäule
Methoden 74
(Schleicher & Schüll, Dassel) gegeben. Nach zweimaligem Waschen der Säule mit 5 ml
Niedrigsalzpuffer wurde die DNA mit 400 µl Hochsalzpuffer (1 M NaCl) eluiert. Die
DNA wurde durch Zugabe von 1 ml Ethanol präzipitiert und das Pellet anschließend
dreimal mit eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen. Die getrocknete DNA wurde in 30 µl
Injektionspuffer gelöst und ihre Konzentration im Photometer bestimmt. Die auf 100 ng/µl
eingestellte DNA-Lösung wurde nochmals auf Intaktheit und Reinheit auf einem 0.7%
Agarosegel kontrolliert und mit standardisierter DNA als Referenz verglichen.
6.3.1 Mikroinjektion von Oozyten
Die Mikronjektion der aufgereinigten, transgenen Konstrukte in Oozyten von Mäusen der
Linie 129/SvJ wurde von Dr. Michael R. Bösl am Max-Planck-Institut für Neurobiologie
(Martinsried) durchgeführt. Die daraus erhaltenen Tiere, die das Transgen in die Keimbahn
transmittierten, wurden als Gründer der transgenen Linie verwendet.
6.4 Histologische Methoden
6.4.1 Präparation von Embryonen
Die Maus-Embryonen wurden im jeweiligen Entwicklungsstadium durch einen
Kaiserschnitt aus dem Bauchraum der Mutter entnommen und in PBS präpariert. Je nach
weiterer Verwendung wurden die Embryonen über Nacht bei 4°C in 1% PFA (X-Gal-
Färbung) oder je nach Alter 2 – 20 h in 4% PFA (Immunhistochemie) fixiert. Um dem
Fixativ die bestmögliche Penetration des Gewebes zu ermöglichen, wurden älteren
Embryonen (16.5 dpc) Kopf, Extremitäten und Haut entfernt.
Embryonen, von denen Gefrierschnitte angefertigt werden sollten, wurde nach dem
Fixieren mindestens viermal für 15 min auf Eis in PBS gewaschen und anschließend über
Nacht in Sucroselösung (30% in PBS) bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die
Embryonen in Gefriermedium (TissueTec, Jung HistoService, Nussloch) auf Trockeneis
eingebettet und anschließend bei -80°C gelagert. Für die Gefrierschnitte wurde der
Methoden 75
Cryostat CM 3050 S (Leica Microsystems, Nussloch) verwendet. Die angefertigten 10 µm
Schnitte (für Immunhistochemie) und 20 µm Schnitte (für X-Gal-Färbungen) wurden auf
HistoBond-Adhäsions-Objektträgern (Jung HistoService, Nussloch) aufgeschmolzen und
mindestens 2 h getrocknet, bevor sie in einer Gefrierbox bei -80°C gelagert wurden. Zur
besseren Vergleichbarkeit der Ergebnisse wurden die Schnitte prinzipiell aus der cervikal-
thorakalen Region angefertigt.
6.4.2 X-Gal Färbung
X-Gal Färbungen wurden sowohl von 9.5 dpc und 11.5 dpc whole-mount Embryonen als
auch von Geweben und 20 µm Gefrierschnitten 16.5 dpc alter Embryonen angefertigt.
Whole-mount Embryonen wurden nach viermaligen Waschen in 2 mM MgCl2 / PBS direkt
in 24-well Platten mit X-Gal-Färbelösung für 8 h bei 37°C im Dunkeln inkubiert.
Anschließend wurde durch dreimaliges Waschen in 5 mM EDTA / PBS die Färbung
abgestoppt und die Embryonen in 4% PFA bis zur Dokumentation am Leica MZFLIII
Stereomikroskop (Zeiss, Oberkochem) gelagert.
Gefrierschnitte auf HistoBond-Adhäsions-Objektträgern wurden vor dem Färben mit dem
PAP-Pen umrandet und zweimal für 5 min mit Detergenzlösung gewaschen. Nachdem die
X-Gal-Färbelösung aufgetragen wurde, erfolgte die Färbung in einer feuchten Kammer
ebenfalls für 8 h bei 37°C. Abstoppen der Färbung und Nachfixieren in 4% PFA erfolgte
analog zu den whole-mount Embryonen. Bevor die Objektträger mit Glycerol-Gelatine
GG-1 (Sigma, Taufkirchen) eingedeckt wurden, erfolgte ein einmaliges Waschen in PBS
zum Entfernen des restlichen PFAs. Die X-Gal gefärbten Gefrierschnitte wurden ebenfalls
am Leica MZFLIII Stereomikroskop dokumentiert.
6.4.3 Immunhistochemie
Die für immunhistochemische Analysen vorgesehenen 10 µm Gefrierschnitte wurden nach
dem Auftauen und Trocknen mit PAP-Pen umrandet, kurz getrocknet und anschließend
zweimal für 5 min mit PBS gewaschen. Daraufhin wurde das Gewebe zur
Permeabilisierung für 10 min bei RT in 1x PBS / 0,1% Triton X-100 inkubiert. Nach
Methoden 76
nochmaligem Waschen mit PBS wurden die Gefrierschnitte zum Blockieren in einer
feuchten Kammer für 1-2 h bei RT in 10% FKS / 1% BSA inkubiert. Die darauf folgende
Inkubation mit dem Primärantikörper (verdünnt in 10% FKS / 1% BSA in PBS) erfolgte
über Nacht bei 4°C in einer feuchten Kammer. Am nächsten Tag wurde überschüssiger
Primärantikörper durch gründliches Waschen mit PBS (6x 10 min) entfernt. Anschließend
erfolgte die Inkubation mit dem jeweiligen Sekundärantikörper (verdünnt in 10% FKS /
1% BSA in PBS) für 2 h bei RT im Dunklen. Die Sekundärantikörper waren zur
Signaldetektion mit einem Cy2- oder Cy3-Fluoreszenzfarbstoff konjugiert (siehe 5.7.2).
Nach erneuten gründlichem Waschen mit PBS (6x 10 min) wurden die Objektträger mit
Mowiol (Calbiochem/Merck Biosciences, Bad Soden) eingedeckt und nach Aushärten mit
einem Fluoreszenz-Mikroskop DM-IRB (Leica Microsystems, Bensheim) und einer
gekühlten SPOT-CCD-Kamera (Diagnostic Instruments, Michigan, USA) dokumentiert.
6.5 Zellkultur-Methoden
6.5.1 Kultivierung tierischer Zelllinien
Die verwendeten Zelllinien wurden in DMEM mit 10% (v/v) FKS und 1% (v/v) Penicillin
/ Streptomycin bei einer Temperatur von 37°C, einer Luftfeuchtigkeit von 95% und einem
CO2-Gehalt von 5% im Brutschrank kultiviert. Die Umsetzung der Zellen erfolgte
spätestens bei einer Konfluenz von 90%. Hierzu wurde das Medium abgenommen und die
Zellen 3 min mit Trypsin / EDTA (5 g/l Trypsin; 2 g/l EDTA) inkubiert. Die Aktivität des
Trypsin wurde anschließend durch Zugabe von 10 ml DMEM + FKS abgestoppt. Die
resuspendierten Zellen wurden in neue Zellkulturschalen ausgesät.
6.5.2 Transiente Transfektion von DNA in eukaryotische Zellen
Für die Transfektion von DNA in eukaryontische Zellen wurden im Rahmen dieser Arbeit
die Nierenzelllinie HEK293 und die Schwann-Zelllinie S16 verwendet.
Methoden 77
HEK293-Zellen wurden 24 h vor der Transfektion mit einer Dichte von 1 x 106 auf 10 cm
Zellkulturschalen ausgesät. Zur Transfektion wurde zu 0,5 ml Medium (-FKS/-PS) 30 µl
1x PEI und 10 µg Plasmid-DNA gegeben und der Ansatz durch kräftiges Vortexen
gemischt. Nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Ansatz zu dem Medium
in einer 10 cm Zellkulturschale gegeben. Nach 8 h wurde das Medium abgesaugt und die
Zellen mit frischem Medium versetzt. Die transfizierten Zellen wurden nach 48 h geerntet
und Zellextrakte hergestellt (siehe 6.6.1).
Transiente Transfektionen von S16-Zellen zur Luziferase-Aktivitätsmessung wurden mit 2
µl SuperFect (Qiagen, Hilden) je 1 µg DNA nach den Angaben des Herstellers in 3 cm
Zellkulturschalen durchgeführt. Hierzu wurden 0,5 µg des Reporterplasmids transfiziert.
Die Zellen wurden nach 48 h geerntet und für den Luziferase-Aktivitätstest verwendet
(siehe 6.5.3).
6.5.3 Luziferase-Aktivitätstest
Für den Luziferase-Aktivitätstest wurde das Medium von den 3 cm Zellkulturplatten
abgesaugt und 400 µl Luziferase-Lysispuffer gleichmäßig verteilt. Die Lyse der Zellen
erfolgte für 10 min bei Raumtemperatur. Anschließend wurden je 150 µl der Zellextrakte
in Luminometerröhrchen überführt. Die Messung wurde mit dem Luminometer Lumat LB
9501 (Berthold, Bad Wildbad) durchgeführt. Nach automatischer Injektion von 100 µl
Luciferinlösung (0,5 mM Luciferin (Serva, Heidelberg) in 5 mM Kaliumphosphat, pH 7,8).
konnten die relativen Lichteinheiten dokumentiert werden.
6.6 Detektion von DNA-Protein-Komplexen
6.6.1 Herstellung von Proteinextrakten aus eukaryontischen Zellen
Zur Herstellung von Gesamtzellextrakten wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen,
anschließend in 0,5 ml PBS geerntet und in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt. Durch
kurzes Zentrifugieren wurden die Zellen pelletiert und überschüssiges PBS abgesaugt. Die
Methoden 78
Zellen wurden in 350 µl Zelllysispuffer aufgenommen und 20 min auf Eis inkubiert. Nach
anschließendem Zentrifugieren (14.000 Upm, 10 min, 4°C) wurde der Überstand in ein
neues Reaktionsgefäß überführt und der Gesamtzellextrakt bis zur Verwendung bei -80°C
gelagert.
6.6.2 Radioaktive Markierung von DNA
Die Reaktionsansätze zur Markierung von DNA-Fragmenten mittels PCR setzten sich aus
1 µl template-DNA (20 ng Plasmid-DNA), 2 µl 10x-Reaktionspuffer (MBI Fermentas, St.
Leon-Roth), 1,6 µl 25 mM MgCl2, 1 µl dNTP-Mix (je 2,5 mM dATP, dTTP, dGTP und
0,25 mM dCTP), 1 µl 32P-dCTP, 2 µl Primer (je 10 pmol), 0,4 µl Taq-DNA-Polymerase
(2,5 U/µl; MBI-Fermentas, St. Leon-Roth) und 11 µl H2O in einem 0,2 ml PCR-
Reaktionsgefäß zusammen. Die Proben wurden in einem T3-Thermocycler (Biometra,
Göttingen) für 2 min bei 95°C denaturiert und durchliefen 30 Zyklen von Denaturierung
(95°C, 30 sec), Annealing (60°C, 30 sec) und Elongation (72°C, 20 sec). Um die
Verlängerung aller DNA-Fragmente sicherzustellen, wurde der Ansatz zum Abschluss für
1 min bei 72°C inkubiert und auf 4°C abgekühlt.
Anschließend wurde der Ansatz zur Abtrennung der freien (radioaktiven) Nukleotide über
eine mini Quick Spin Sephadex-Säule (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des
Herstellers aufgereinigt. 1 μl der Sonde wurde im Szintillationszähler (Tri-Carb 2800TR,
Perkin Elmer) vermessen.
6.6.3 Gelretardierungsexperimente
Zur Detektion von Protein-DNA-Komplexen wurden 5%ige native Polyacryamidgele
verwendet. Zur Herstellung eines 5%igen nativen Polyacrylamidgels wurden 3,75 ml 40%
Acrylamid-Bisacrylamid (29:1), 1,5 ml 10x TBE-Puffer, 24 ml H2O, 400 μl 20% APS
sowie 10 μl TEMED gemischt und zum polymerisieren in eine Vertikal-Gelapparatur
gegossen. Nach Polymerisation des Gels wurde dieses für 2 h bei 120 V in 0,5x TBE-
Puffer vorelektrophoretisiert.
Methoden 79
Ein 20 µl Reaktionsansatz setzte sich aus 2 μl 10x Mobility-Shift-Puffer (10 mM HEPES
pH 8,0; 2 mM DTT; 5 mM MgCl2; 0,1 mM EDTA; 25 mM NaCl; 5% Glycerin), 1 μl 100
mM DTT, 2 μl BSA (1,5 μg/μl), 2 μl poly-dGdC (0,5 μg/μl) bzw. poly-dIdC (1 µg/µl) und
1 μl des radioaktiv markierten Oligonukleotids (10.000 Cpm) zusammen. Zu diesem
Ansatz wurde der Proteinextrakt zugegeben. Nach 20 minütiger Inkubation auf Eis wurden
die Proben wurden mit 10x DNA-Probenpuffer versetzt, auf das Gel geladen und bei 120
V aufgetrennt. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel mit einem Whatman
3MM Papier (Whatman, Schleicher & Schüll, Dassel) auf einem Vakuum-Geltrockner bei
80°C für 45 min getrocknet. Anschließend wurde ein Röntgenfilm (Fuji Super RX)
aufgelegt und das Gel für 3 – 8 Stunden bei -80°C exponiert.
6.7 Statistische Auswertung
Für die statistische Auswertung der Ergebnisse dienten die Programme Graph-Pad-Prism
Version 4 und Microsoft Excel 2002. Die Bildbearbeitung erfolgte mit Adobe Photoshop
CS2.
Abkürzungsverzeichnis 81
7 Abkürzungsverzeichnis
α anti A Adenin oder Adenosin Abb. Abbildung AMH Anti-Müller-Hormon Amp Ampicillin AP2α activator protein 2 ATP Adenosin-5'-triphosphat BAC bacterial artificial chromosome BC boundary cap bp Basenpaare BFABP brain-related fatty acid binding protein bHLH basisches Helix-Loop-Helix-Protein β-Gal β-Galactosidase BMP bone morphogenic protein Brn Brain BSA Rinderserumalbumin bzw. beziehungsweise CD Campomelische Dysplasie cDNA komplementäre DNA CNTF ciliary neurotrophic factor Col Collagen Cx32 Connexin-32 Cx47 Connexin-47 Cy2, Cy3 Carbocyanin 2 und 3 Dach dachshund homolog Dct Dopachrome tautomerase Dlx distal-less homeobox DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dNTP Desoxyribonucleosid-5'-triphosphat DOM Dominant Megacolon dpc Tag post coitum der embryonalen Entwicklung DSHB Developmental Studies Hybridoma Bank DTA Diphtherietoxin DTT Dithiothreitol ErbB3 avian erythroblastosis viral (v-erb-B2) oncogene B 3 ECE endothelin converting enzyme E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat EDN3 endothelin 3 EKR evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Regionen ENDRB endothelin B receptor ENS enterisches Nervensystem EtOH Ethanol Fgf fibroblast growth factor
Abkürzungsverzeichnis 82
FKS fötales Kälberserum FoxD3 forkhead box D3 GATA GATA binding protein GDNF glial cell line derived neurotrophic factor GFP grün floureszierendes Protein GTF general transcription factor h Stunde Hand2 heart and neural crest derivatives expressed 2 HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2'-ethansulfonsäure HMG-Box high-mobility-group-DNA-Bindedomäne Hox homeobox D HSCR Hirschsprung Erkrankung Id3 inhibitor of DNA binding 3 IgG, IgM Immunglobuline der Subklasse G oder M IHC Immunhistochemie kb Kilobasenpaare kDa Kilodalton (relative Masse) Krox20 Krox20 homolog HSCR Hirschsprung-Krankheit Hsp Hitzeschockprotein LacZ β-Galactosidase-Gen aus E. coli LEF-1 lymphoid enhancer factor-1 Lmx1b LIM homeobox transcription factor 1, beta LZ Leuzinzipper M, mM, µM molar, millimolar, mikromolar mA Milliampére MAG Myelin-assoziiertes Glycoprotein MBP Basisches Myelin-Protein MDC Max-Delbrück Centrum MES 2-N-Morpholino-ethansulfonsäure min Minute mg, µg Milligramm, Mikrogramm ml, µl Milliliter, Mikroliter M-MLV Moloney Murine Leukemia Virus MPZ Myelin Protein Zero mRNA Boten-Ribonukleinsäure (messenger-RNA) Msx Msh homeo box gene Mitf microphthalmia associated transcription factor MyoD myoblast determination protein NES Kernexport-Signal NLS Kernlokalisierungs-Signal nm Nanometer NTN Neurturin Oct6 Octamer-binding transcription factor 6 Otx2 orthodenticle homolog 2 P0 Myelin Protein Null p0/p1/p2/p3-Domäne neuronale progenitor-Domänen der ventralen VZ PAC P1 derived artificial chromosome Pax paired-box homeotic gene PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung PCNA proliferating cell nuclear antigen
Abkürzungsverzeichnis 83
PCR Polymerase Kettenreaktion PDGF-Rα platelet-derived growth factor – receptor alpha Pick1 protein interacting with C kinase 1 PLP Proteolipid-Protein PNS peripheres Nervensystem PMD Pelizaeus-Merzbacher Krankheit PMP-22 Peripheres Myelinprotein 22 kDa pMN-Domäne Motoneuron-progenitor-Domäne RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuclease Pol2rf polymerase (RNA) II (DNA directed) polypeptide F RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion rtTA reverser Tetrazyklintransaktivator Runx2 runtrelated transcription factor 2 SDS Natriumdodecylsulfat sec Sekunde SF-1 Steroidogener Faktor 1 Shh Sonic Hedgehog SIP1 smad interacting protein 1 Snail2 snail homolog 2 Sox SRY-like box protein Sry sex determining region Y chromosome TAF TBP assozierter Faktor TBP TATA-Box bindendes Protein TBE Tris/Boratsäure/EDTA TE Tris-Puffer mit EDTA TF Transkriptionsfaktor Tm Hybridisierungstemperatur Tris Tris-hydroxymethyl-aminomethan Tween-20 Polyoxyethylen-sorbitanmonolaureat TSchG Tierschutzgesetz RT Raumtemperatur Upm Umdrehungen pro Minute V0/V1/V2-Interneuronen ventraler neuronaler Subtyp Vol Volumen VZ Ventrikulärzone WB Western Blot WS Waardenburg-Syndrom Wnt Wingless-Type MMTV integration site family 1 X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid z.B. zum Beispiel Zic Zic family member ZNS zentrales Nervensystem
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Publikationen 111
Publikationen
Werner, T., Hammer, A., Wahlbuhl, M., Bosl, M. R. and Wegner, M. (2007). Multiple
conserved regulatory elements with overlapping functions determine Sox10 expression in
mouse embryogenesis. Nucleic Acids Res.
Stolt, C. C., Schlierf, A., Lommes, P., Hillgartner, S., Werner, T., Kosian, T., Sock, E.,
Kessaris, N., Richardson, W. D., Lefebvre, V. et al. (2006). SoxD proteins influence
multiple stages of oligodendrocyte development and modulate SoxE protein function. Dev
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Schlierf, B., Werner, T., Glaser, G. and Wegner, M. (2006). Expression of connexin47 in
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Schlierf, B., Lang, S., Kosian, T., Werner, T. and Wegner, M. (2005). The high-mobility
group transcription factor Sox10 interacts with the N-myc-interacting protein Nmi. J Mol
Biol 353, 1033-42.
Präsentationen
Werner, T., Hammer, A., Wahlbuhl, M., Bosl, M. R. and Wegner, M. (2007). Sox10
expression is regulated by multiple conserved regulatory elements with overlapping
functions. GLIAL CELLS in Health and Disease (The VIII European Meeting ), London,
UK, Poster
Stolt, C. C., Schlierf, A., Lommes, P., Hillgartner, S., Werner, T., Kosian, T., Sock, E.,
Kessaris, N., Richardson, W. D., Lefebvre, V. et al. (2007). SoxD proteins influence
multiple stages of oligodendrocyte development and modulate SoxE protein function.
GLIAL CELLS in Health and Disease (The VIII European Meeting ), London, UK, Poster
Lebenslauf 112
Lebenslauf
PERSÖNLICHE DATEN
NAME: Torsten Werner
GEBURTSDATUM UND -ORT: 10.12.1978 in Greifswald
STAATSANGEHÖRIGKEIT: deutsch
FAMILIENSTAND: verheiratet
SCHULBILDUNG
1985 – 1995 M.-A.-Nexö-Schule, Greifswald
1985 – 1998 Johann-Gottfried-Herder-Gymnasium, Greifswald
1998 Erwerb der Allgemeinen Hochschulreife (Abitur)
WEHRDIENST
1998 – 1999
STUDIUM
1999 – 2004 Studium der Humanbiologie an der Ernst-Moritz-Arndt
Universität, Greifswald
2001 Diplom-Vorprüfung
2003 Diplom-Hauptprüfung
2003/2004 Diplomarbeit am Lehrstuhl für Biochemie, Greifswald
Thema: Regulation der Glucose-6-Phosphatase durch NFκB
2004 Diplom in Humanbiologie
2004 School of Life Science, Wellcome Trust Biocentre, Dundee (UK)
PROMOTION
2004 – 2007 Dissertation am Lehrstuhl für Biochemie und
Pathobiochemie der FAU Erlangen-Nürnberg
Thema: Untersuchungen zur genregulatorischen Aktivität
evolutinär konservierter, nicht-kodierender Regionen im
Sox10 Locus
Danksagung 113
Danksagung
Diese Arbeit wurde am Institut für Biochemie der Medizinischen Fakultät der Friedrich-
Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg durchgeführt. Herrn Prof. Dr. Michael Wegner
danke ich für die Überlassung des interessanten Themas, aber besonders für seine
hervorragende Betreuung, das stete Interesse am Fortschritt der Arbeit und nicht zuletzt für
die Durchsicht der Arbeit und die Übernahme der Erstberichterstattung.
Herrn PD Dr. Robert Slany danke ich herzlich für die freundliche und bereitwillige
Übernahme der Zweitberichterstattung an der Naturwissenschaftlichen Fakultät II der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg.
Ein großer Dank gilt auch Dr. Elisabeth Sock, Dr. Beate Schlierf, Sabine Guth und Mandy
Wahlbuhl für das Korrekturlesen und die kritischen Anmerkungen zur Arbeit.
Weiterhin bedanke ich mich herzlich bei allen aktuellen und ehemaligen Kollegen der
Arbeitsgruppe für die hilfsreiche Unterstützung bei allen Fragen und Problemen im
Laboralltag und für die schöne Zeit im Labor. Vor allem möchte ich hierbei den
Zusammenhalt und die gute Atmosphäre im Labor 4 hervorheben.
Insbesondere werde ich die sehr gute Zusammenarbeit im Labor und die tägliche Fahrt in
die Palmeria mit Thomas Kosian vermissen.
Im privaten Bereich danke ich meinen Freunden und meinen Eltern, die jederzeit vollstes
Vertrauen in mich gesetzt haben. Schließlich möchte ich einen ganz besonders herzlichen
Dank an meine Frau Susanne richten, die durch ihre großartige Unterstützung in
unzählbaren Dingen wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat. Sie war auch
in schwierigen Phasen stets für mich da, hat immer Verständnis gezeigt und mir Halt
gegeben.
