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GE Healthcare

Life Sciences

ImageQuant TL (IQTL) software

사용자 설명서

GE Healthcare

Life Sciences Korea

Ver 1.0 @ 2016

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내용

1 IQTL software 설치 방법 ……………………………………………………………………………………………….... 3

1.1 Software 설치 …………..……………………………………………………………………………………………..….… 3

1.2 Electronic licensing …………..……………………………………………………………………………………………. 3

1.3 IQTL 실행 …………..………………………………………………………………………………………………….………. 4

2 IQTL 소개 ………………………………………………………………………………………………………………..….…………. 5

3 IQTL software 사용 방법 ………………………………………………………………………………………….…….. 6

3.1 Image 열기와 Image 분석 결과 …………..…………………………………………………………………… 6

3.2 Step-wise Image 분석 …………..…………………………………………………………….……………….………. 9

3.2.1 Lane Creation

3.2.2 Background Subtraction

3.2.3 Band Detection

3.2.4 Parameters

3.2.5 Molecular Size Calibration

3.2.6 Quantity Calibration

3.2.7 Normalization

3.2.8 Report

3.3 Array 분석 …………..………………………………………………………………………………………..………………. 29

4 FAQ …………..………………………………………………………………………………………………………………….……….. 34

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1. IQTL software 설치 방법

1.1. Software 설치

Disc를 넣으면 아래와 같은 화면이 뜹니다.

그러면 [Install ImageQuant TL],[Install IQTL Security], [Install License Server]를 차례대로 설치합니다.

1.2. Electronic licensing

발급 받은 access code로 license를 받아야 합니다.

받은 access code를 GE 직원에게 알려주면, electronic license를 아래와 같이 이메일로 발송해 드립

니다

이메일로 받은 license을 아래 장소에 저장합니다.

Window7(C:) - Program files (x86) – GE healthcare – eLicense server – License

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1.3. IQTL 실행

아래 이미지에서 1D gel analysis 를 누르고,

아래와 같이 사용할 license 타입을 고릅니다. 첫 번째, I am using a Node Locked E-license 를 선택합

니다.

그리고 Next 버튼을 누른 후, 아래 Browse 에서 저장한 license를 불러와 e-license Activation 버튼

을 누르면 IQTL software를 사용하실 수 있습니다.

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2. IQTL software 소개

ImageQuant TL software는

1D gel analysis, Colony Counting, Array analysis, Toolbox component를 하나의 패키지로

갖고 있는 쉽고 편리한 software 입니다.

1D gel analysis SDS-PAGE gel, Nucleic acid gel, Membrane, File 등 각종

application으로부터 얻은 결과를 분석할 수 있습니다.

Colony Counting Agar 배지의 colony와 2D gel의 spots을 분석할 수 있습니다.

Array analysis Microplate와 Microarray, Dot/Slot blot을 분석할 수 있습니다.

Analysis Toolbox 이미지 자료들을 기능 툴을 이용하여 분석할 수 있습니다.

모든 기능을 초기 화면에서 바로 시작할 수 있습니다.

모든 모듈은 멀티태스킹을 할 수 있으면서도, 각각 독립적으로 실행됩니다.

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3. IQTL software 사용 방법

3.1. Image 열기와 Image 분석 결과

image open window에서는 tif, gel등 GE Healthcare Life Sciences에서 공급하는 모든 imaging

instrument에서 생성된 file을 open할 수 있다.

Preview를 통해서 image를 확인하여 선택한 후 Open button을 누릅니다.

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[Automatic Analysis]

다음과 같이 image가 열리고 왼쪽 column에는 image 분석의 순서가 기재되어 있습니다.

Automatic analysis steps 밑의 Lane Creation, Background Subtraction, Band Detection은 1D

image 분석의 가장 핵심적인 과정이며 이 세가지 step을 모두 선택하고 automatic button

을 누르면 band detection에서 정량까지가 모두 자동으로 이루어지게 됩니다.

자동 분석을 원할 때, 이 mode를 사용하면 수 초안에 원하는 결과를 얻을 수 있으며

accuracy도 매우 높습니다.

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[Automatic Analysis의 결과]

① Gel image에 Lane, Band를 바로 detection합니다.

② 선택한 Lane의 Band 위치에 다른 profile을 보여줍니다.

③ Measurement window에서 Lane별 Volume비교를 해줍니다.

④ 세부적 editing을 하며 수행하려면 Stepwise button을 누릅니다.

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3.2. Step-wise Image 분석

3.1.1. Lane Creation

[Automatic Lane creation]

Lane Creation을 하려면 왼쪽의 Create button을 누르면 Lane을 자동으로 인식하여 만들어줍니다.

이때 Lane Creation의 조건을 조작하려면 window하단의 parameter를 누르고 number of Tiers에

원하는 수를 넣으면 층으로 나누어 Lane을 만들어줍니다. (예: 아래그림)

Layer가 한 층만 있을 경우에는 바로 Automatic button을 눌러 Lane을 자동으로 만들 수 있습니다.

(예: 아래 그림)

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[Manual Lane creation]

원하면 오른쪽 하단의 parameter에서 Number of Tiers, Number of Lanes, Lane width를 입력한

후 image에 mouse 왼쪽 button을 누르고 drag하면 원하는 폭으로 원하는 수만큼의

Lane을 만들 수 있습니다.

Drag하여 Lane을 image에 적합하게 맞춰 놓고 gel의 distortion이나 Band의 휘어진 정도에

따라 single단위로 또는 multiple 단위로 Lane을 휘게 만들 수 있습니다.

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3.1.2. Background Subtraction

Lane Creation이 완성되면 Next button에서 Background Subtraction을 선택합니다.

Background를 고려한 Band 자체의 volume을 구하려면 반드시 Background Subtraction을 해야

합니다.

Background Subtraction방법을 결정하여 check한 후, Subtract button을 누르면 자동으로

이루어집니다.

Background Subtraction 방법은 다음 page를 참고하시기 바랍니다.

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[Automatic Subtraction Method]

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<Rubber Band>

Lane profile이 시작되고 끝나는 point를 고무줄로 연결해 놓는 다고 가정할 때 그

line을 background로 여기고 빼주는 방법입니다.

Profile의 양 끝 값이 다른 부분의 value보다 낮을 경우엔 사용할 수 없습니다.

<Minimum Profile>

각 Lane의 profile에서 intensity값이 가장 낮은 값을 그 Lane의 background로

계산합니다.

Lane의 양 끝 값이 profile 중 최저 값일 때는 사용하지 않기를 권합니다.

Lane boundary는 user가 정하기 나름이므로 재현성이 떨어지는 방법이라고 할 수 있습니다.

<Rolling Ball>

User가 rolling ball의 size값을 입력하면 rolling ball의 radius에 따라 ball이 profile 밑을

굴러가는 track이 다양하게 만들어지는데, 그 line을 background로 규정하는 방법입니다.

Radius가 커질수록 background는 낮아집니다.

[Manual Subtraction Method]

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<Image Rectangle>

Image에서 user가 정해주는 rectangle의 평균 intensity를 background로 지정하게 됩니다.

이렇게 지정되는 background는 모든 Lane의 background로 계산됩니다.

<Manual Baseline>

Profile상에서 mouse로 base line을 drag해서 user가 만들어내는 line이 background가 됩니다.

분석의 재현성을 위해서는 자주 사용하지 않는 것이 좋습니다.

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3.1.3. Band Detection

Background Subtraction이 끝나면 Next step에서 Band Detection mode로 들어갑니다.

Band Detection은 Peak Detection parameter와 Edge Parameter를 조절하여 semi-automatic

detection을 수행하면 됩니다.

각 Parameter에 대한 자세한 설명은 20 page를 참조하시기 바랍니다.

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Band Detection이 끝나면 image view에서는 Band Detection이 완성된 pattern을 볼 수

있으며 click된 Lane의 pixel intensity profile을 monitor 할 수 있습니다.

또한, profile 아래에는 선택한 Lane의 Band Detection pattern이 있어서 profile과 match되어

나타나므로 이 pattern 중 detection되지 않은 부분이 있으면 manual로 editing 할 수

있습니다.

또한, 각 Lane의 Band에 해당하는 numerical data를 Measurement Window에서 얻을 수

있습니다.

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[Band Detection – Measurement Window]

모든 lane에 대한 결과입니다.

동일한 위치의 band에 대한 comparison data를 볼 수 있습니다.

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Menu View Options Tables :

Measurement Window에서 표시하고 싶은 항목을 click합니다.

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[Manual Editing of Band Detection]

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Profile과 image상에 band가 존재하는데 detection 되지 않은 것이 확인되면 image상에

mouse를 가져가면 이 나옵니다.

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이때, 마우스 왼쪽 button을 누르면 Peak Detection이 되며 mouse를 drag하여 Band의 폭을

조절하여 Band Detection을 완성합니다.

* ** Undo를 원할 경우에는 mouse 오른쪽 button을 누릅니다

3.1.4. Parameters

[Peak Detection] <Noise Reduction>

Noise reduction의 조절을 통해 profile에서 무시되어 제거될 small local peak의 정도를 결정할 수

있습니다. 그 결과 image 상의 noise를 줄일 수 있으며 profile 자체에는 어떠한 영향도 주지

않으면서 detection되는 peak의 수를 줄이게 됩니다. 일반적으로 Noise Reduction value가 클 수록

detection되는 peak의 수는 적어지게 됩니다. Range 0-20 사이로 설정하면 됩니다.

<Percentage Maximum Peak>

Gel상에서 peak 값이 가장 큰 peak에 대해 상대적으로 특정 값 이하의 peak을 버리도록 결정하는

threshold parameter입니다. Percentage value가 클수록 peak 개수가 적게 detection됩니다.

Peaks의 size는 background subtraction이 끝난 다음 계산되며, range 0-100 사이로 설정합니다.

[Edge Detection Parameters]

입력한 peak detection parameters에 만족하면 edge detection parameter를 설정합니다.

<Automatic detection>

일반적으로 사용자가 system이 자동적으로 band edges를 결정하기 원할 때 이 방법을 많이

사용합니다.

<Fixed width>

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사용자가 각 band의 폭을 pixels 값으로 지정하길 원한다면 각 edge의 위치를 결정해주고 Fixed

Width radio button을 누른 후 적절한 width를 입력해주면 band edge가 peak의 양쪽으로 같은

거리만큼 해당되는 부분에 형성됩니다.

3.1.5. Molecular Size Calibration

Next button을 click 해서 molecular size calibration을 선택합니다.

Standard top-down menu에서 원하는 protein standard를 선택하고 menu에 없을 경우 [Edit]

button을 눌러서 새로운 marker를 입력합니다.

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넣어줄 marker를 입력하고 단위와 scale을 입력합니다

Size marker를 선택한 후 gel 상에서 marker를 선택하면 자동으로 band에 marker가 assign되고,

만약 적합하지 않을 경우에는 단순히 drag을 하여 marker의 assignment를 바꿀 수 있습니다.

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Marker 선택을 완료하고 나서 Compute button을 누르면 marker calibration curve가 나타나고

동시에 Measurement Window에는 분자량이 계산되어 나타납니다.

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3.1.6. Quantity Calibration

알고 있는 band의 protein 양에 대해서 다른 band의 상대적 양을 측정하고 싶다면, parameter를

선택한 다음에 양적인 scale을 선택합니다. Band에 cursor를 대고 알고 있는 protein 양을 직접

입력하면 band 정보가 자동으로 나타나면서 calibrated curve가 만들어집니다.

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Calibration button을 누르면 각 band의 상대적 양이 계산되어 아래처럼 볼 수 있습니다.

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3.1.7. Normalization

Raw volume data가 아닌 normalized volume을 얻고 싶은 경우에는, 특정하게 선택된 band들의

average volume이나 collective volume에 대해 각 band들을 normalization할 수 있습니다.

Quantity calibration이 되어 있는 상태에서는 normalization을 동시에 할 수 없으므로 위와 같은

창이 나타나면 이전에 했던 quantity calibration information을 지워야 합니다.

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Measurement window에서 각 lane 별 band에 대한 normalized value를 알 수 있습니다.

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3.1.8. Report

Menu analysis create lane report, 또는 좌측 하단의 report button을 누르면 선택된 lane에 대한

report가 형성됩니다.

Finish를누르면 1D gel에 대한 모든 분석은 완료입니다.

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3.3. Array 분석

Array component는 micro-titer plate images, gridded arrays 및 dot, slot blots 분석을 목적으로 합니다.

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[Image Load]

Blot image 또는 Micro-titer array image를 open 합니다.

[Image 분석]

Array data 역시 1D image와 마찬가지로,

spot definition background subtraction normalization을 기본으로 합니다.

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[Spot Definition & Spot Detection]

Spot Definition button을 누르면 Spot Detection parameter를 볼 수 있습니다.

먼저 sample의 수와 형식에 따라 Grid type을 선택한 후에, Row와 column 그리고, spot

shape을 설정합니다.

Create & Stretch button을 누른 상태에서 A1에서 시작하여 mouse 왼쪽 button을 누르고 drag 하면

spot definition이 생겨나며 이와 동시에 Measurement Window에 Volume 값이 측정되어 나타납니다.

[Background Subtraction]

Background subtraction method에는 4가지가 있습니다.

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<Spot Surface Minimum>

Spot boundary안에서 가장 intensity 값이 낮은 값을 background로 빼주는 방법으로, noise가 적고

background 정도가 비슷한 image에 사용합니다.

<Spot Edge Average>

Spot outline을 구성하는 pixel intensity의 평균을 background로 빼주는 방법입니다.

Spot 마다 background가 다르게 빠지므로 region 마다 차이가 있는 경우나 noise가 큰 경우에

사용하기 좋습니다.

<Negative Controls>

Flagged spot안에 포함되는 모든 pixel의 intensity의 평균을 background라고 생각합니다.

따라서 어떤 spot을 background로 두는 지가 중요합니다. Micro-titer plate를 분석할 때 control이

있는 경우에 유리합니다.

<Image Rectangle>

특정 image area에 image rectangle을 설정하여 이 area안에 들어가는 pixel intensity의 평균을

background intensity로 계산합니다. Noise가 많고 spot의 밀도가 조밀할 경우에 사용합니다.

<None>

추천하는 방식이 아닙니다.

[Normalization]

① Normalization할 spot을 selection 합니다.

② Normalization parameter에서 collective volume에 대하여 할 것인 지, average volume에 대해서

계산할 것인지를 선택하고, normalization volume 합계와 scale을 설정합니다.

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③ Normalization button을 누릅니다.

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4. FAQ

4.1. LAS에서 찍은 이미지를 16bit로 저장해서 window 7에서 열면, 이미지가 제대로 구현이 안됩니

다. 이미지를 제대로 볼 수 있는 방법을 알려주세요. LAS에서 찍은 16bit 이미지는 IQTL이라는

전용 분석 소프트웨어에서만 원래 데이터를 제대로 구현해 낼 수 있습니다. 만일 Window XP에서

이미지를 클릭해서 view용으로 보기만 하고자 하실 때는 8bit TIFF로 저장하시면 되지만, 논문용의

이미지가 필요하신 경우에는 16bit 가 필요하므로, 함께 저장해서 준비하시는 것을 추천 드립니다.

4.2. LAS 장비에서 찍은 이미지를 IQTL로 가져 가면, 너무 진하게 보이면서 background가 올라

오는 것처럼 contrast가 변합니다. LAS에서 본 이미징 그대로 볼 수 있는 방법이 궁금해요.

LAS는 16bit를 구현합니다. 즉, 0 에서 65536의 range에서 sample signal intensity를 보기 때문에

sample signal이 강하게 보이지 않지만, IQTL software는 contrast range를 자동으로 sample 주위로

좁혀서 보여주기 때문에 background가 올라오는 것처럼 보이게 됩니다. 이때는 IQTL 소프트웨어

상단에 있는 contrast를 클릭하신 후, max 값을 보여주는 box내에 15,000 또는 20.000의 값을 입력

하시면 LAS에서 보셨던 이미지 그대로 보실 수 있습니다.