Tierärztliche Hochschule Hannover

Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik

C18-Furanfettsäuren –

Toxikologische Charakterisierung der Oxidationsprodukte

von konjugierten Linolsäureisomeren

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften

- Doctor rerum naturalium -

(Dr. rer. nat.)

vorgelegt von

Imme Lengler

aus Hamburg

Hannover 2011

Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. Pablo Steinberg

2. Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen,

Abteilung Lebensmittelsicherheit,

Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR)

1. Gutachter: Prof. Dr. Pablo Steinberg und Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen

2. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann

Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2011

gefördert durch:

Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR)

Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; LA 1177)

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis .................................................................................. I

Abkürzungen ........................................................................................ V

1 Kurzdarstellung der Arbeit (Short Summary) ................................. 1

2 Einleitung .......................................................................................... 5

2.1 Konjugierte Linolsäureisomere (CLA) ............................................................. 7

2.1.1 Struktur und Biosynthese von CLA ................................................ 7

2.1.2 Gehalte in Lebensmitteln und Aufnahmemenge von CLA ........... 8

2.1.3 Antikarzinogene Effekte der CLA.................................................... 9

2.1.4 Effekte der CLA auf die Körperzusammensetzung ..................... 13

2.1.5 Weitere Wirkungen und mögliche Risiken von CLA ................... 14

2.2 Furanfettsäuren (FFA) .................................................................................... 16

2.2.1 Struktur von FFA ............................................................................ 16

2.2.2 Vorkommen und Biosynthese von FFA ....................................... 17

2.2.3 Reaktionen von FFA ....................................................................... 20

2.2.4 Physiologische Bedeutung und Toxikologie von FFA ................ 21

2.3 In vitro-Zellmodelle zur Untersuchung der Fettsäuren ................................ 23

2.4 Zielsetzung ...................................................................................................... 25

3 Material ............................................................................................ 26

3.1 Zelllinien........................................................................................................... 26

3.2 Zellkulturmedien und Zusätze ........................................................................ 26

3.3 Fettsäuren ........................................................................................................ 26

3.4 Laborgeräte und Laborhilfsmittel .................................................................. 27

3.5 Verbrauchsmaterialien ................................................................................... 28

3.6 Reagenzien und Chemikalien ......................................................................... 29

3.7 Molekular- und zellbiologische Kits .............................................................. 30

3.8 Primer und Antikörper .................................................................................... 31

3.9 Software ........................................................................................................... 31

Inhaltsverzeichnis

II

4 Methoden ......................................................................................... 32

4.1 Zellbiologische Verfahren .............................................................................. 32

4.1.1 Kultivierung .................................................................................... 32

4.1.2 Einfrieren und Auftauen der Zellen ............................................... 32

4.1.3 Zellzahlbestimmung ....................................................................... 33

4.1.4 Inkubation mit Testsubstanzen (Fettsäuren) ............................... 33

4.2 Zellassays ........................................................................................................ 34

4.2.1 Lipidfärbung ................................................................................... 34

4.2.2 Proliferation .................................................................................... 34

4.2.3 Zytotoxizität .................................................................................... 35

4.2.4 Apoptose ......................................................................................... 35

4.2.5 Transaktivierungsassay ................................................................ 36

4.3 Genotoxizitätstests ......................................................................................... 38

4.3.1 Ames-Test ....................................................................................... 38

4.3.2 Mikrokerntest .................................................................................. 39

4.4 Proteinbiochemische Methoden .................................................................... 39

4.4.1 Proteinisolierung ............................................................................ 39

4.4.2 Proteinbestimmung ........................................................................ 40

4.4.3 Eindimensionale Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ...................... 41

4.4.4 Westernblot und Immundetektion ................................................ 42

4.4.5 Zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE) .............................. 43

4.4.5.1 Isoelektrische Fokussierung (IEF) .................................................... 43

4.4.5.2 Equilibrierung ................................................................................... 45

4.4.5.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ............................................ 45

4.4.5.4 Färbung und Digitalisierung der Polyacrylamidgele ......................... 46

4.4.5.5 Digitale 2-DE Gelbild-Analyse .......................................................... 46

4.4.5.6 Massenspektrometrische Identifizierung von Proteinen ................... 47

4.5 Studien zur Genexpression ............................................................................ 47

4.5.1 RNA-Isolierung ............................................................................... 47

4.5.2 cDNA-Synthese .............................................................................. 48

4.5.3 Quantitative real-time PCR (qPCR) ............................................... 48

4.6 Statistik ............................................................................................................ 49

Inhaltsverzeichnis

III

5 Ergebnisse ...................................................................................... 50

5.1 Proteomische Analyse der intestinalen Zelllinie Caco-2 ............................. 50

5.1.1 Methodenetablierung anhand der Caco-2-Differenzierung ........ 50

5.1.1.1 Identifizierung differenzieller Proteine der Caco-2-Differenzierung ................................................................................. 51

5.1.1.2 Validierung der 2-DE Ergebnisse mittels Westernblot und qPCR .... 55

5.1.1.3 Netzwerkanalyse .............................................................................. 58

5.1.2 Caco-2-Proteomanalyse nach Behandlung mit t10,c12-CLA ..... 61

5.1.2.1 Identifizierung differenzieller Proteine nach Behandlung mit t10,c12-CLA ..................................................................................... 61

5.1.2.2 Netzwerkanalyse der durch t10,c12-CLA regulierten Proteine ......... 67

5.1.3 Caco-2-Proteomanalyse nach Behandlung mit 10,12-FFA ......... 69

5.1.3.1 Identifizierung differenzieller Proteine nach Behandlung mit 10,12-FFA ........................................................................................ 69

5.1.3.2 Netzwerkanalyse der durch 10,12-FFA regulierten Proteine ............ 72

5.2 Zelluläre Wirkungen von FFA in Caco-2-Zellen ............................................ 75

5.2.1 Zytotoxizität von FFA in Caco-2-Zellen ........................................ 75

5.2.2 Einfluss von FFA auf die Proliferation von Caco-2-Zellen .......... 76

5.2.3 Einfluss von FFA auf die Apoptose in Caco-2-Zellen ................. 78

5.2.4 Aufnahme von FFA in Caco-2-Zellen ............................................ 79

5.3 Zelluläre Wirkungen von FFA in HepG2-Zellen ............................................ 81

5.3.1 Zytotoxizität von FFA in HepG2-Zellen ......................................... 81

5.3.2 Einfluss von FFA auf die Proliferation von HepG2-Zellen .......... 83

5.3.3 Einfluss von FFA auf die Apoptose in HepG2-Zellen .................. 84

5.4 Untersuchungen zur Genotoxizität von 9,11-FFA ........................................ 85

5.4.1 Ames-Test ....................................................................................... 85

5.4.2 Mikrokerntest .................................................................................. 88

5.5 Transaktivierung von PPAR durch 9,11-FFA ................................................ 90

Inhaltsverzeichnis

IV

6 Diskussion ...................................................................................... 92

6.1 Identifizierung neuer Biomarker der Caco-2-Differenzierung ..................... 93

6.2 Mechanismen der antiproliferativen und differenzierungsfördernden Wirkung von t10,c12-CLA in Caco-2-Zellen .................................................. 96

6.3 Die 10,12-FFA beeinflusst keine toxikologisch relevanten Signalwege in Caco-2-Zellen ............................................................................................ 105

6.4 Zytotoxizität und Genotoxizität von FFA..................................................... 114

6.5 Kanzerogenität von FFA ............................................................................... 116

6.6 Schlussfolgerung und Ausblick .................................................................. 120

7 Literaturverzeichnis ...................................................................... 122

Anhang .............................................................................................. 144

Abkürzungen

V

Abkürzungen

2-DE zweidimensionale Gelelektrophorese

8,10-FFA 8,11-Epoxy-8,10-octadecadiensäure

9,11-FFA 9,12-Epoxy-9,11-octadecadiensäure

10,12-FFA 10,13-Epoxy-10,12-octadecadiensäure

11,13-FFA 11,14-Epoxy-11,13-octadecadiensäure

APC adenomatous polyposis coli-Protein

APS Ammoniumpersulfat

BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat

bp Basenpaare

BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)

c9,t11-CLA cis-9,trans-11-Octadecadiensäure

Caco-2 humane Kolonadenokarzinom-Zelllinie

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate

CLA konjugierte Linolsäure(n) (conjugated linoleic acid)

CYP Cytochrom P450 Monooxygenase(n)

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNase Desoxyribonuklease

dNTPs Desoxyribonukleotide

DTT 1,1,1-Trichlor-2,2-bis-(chlorophenyl)ethan

ECL verstärkte Chemilumineszenz

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EtOH Ethanol

FFA Furanfettsäure (furan fatty acid)

FKS fötales Kälberserum

gDNA genomische Desoxyribonukleinsäure

GST Glutathion-S-Transferase(n)

HCCA α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure

HCl Salzsäure

HepG2 humane hepatozelluläre Karzinom-Zelllinie

HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie

IC50-Wert mittlere inhibitorische Konzentration

IEF isoelektrische Fokussierung

IPA Ingenuity Pathway Analyse

IPG immobilisierter pH-Gradient

ITS Insulin-Transferrin-Selenium

Abkürzungen

VI

kDa Kilodalton

LC-MS/MS Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie

MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time Of Flight

MgCl Magnesiumchlorid

MMLV Moloney Murine Leukemia Virus

mRNA messenger Ribonukleinsäure

MW Molekulargewicht (molecular weight)

NaCl Natriumchlorid

NaOH Natriumhydroxyd

NBT Nitroblau-Tetrazoliumchlorid

nt Nukleotide

Oligo(dT) oligo-Desoxythymidin

ONPG o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid

ORF offener Leserahmen

PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung

PBS-T Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit TWEEN-20

PCR Polymerase-Kettenreaktion

Pen/Strep Penicillin/Streptomycin

pI isoelektrischer Punkt

PPAR Peroxisomen-Proliferator-aktivierter-Rezeptor

PUFA mehrfach ungesättigte Fettsäure (polyunsaturated fatty acid)

qPCR quantitative real-time Polymerase-Kettenreaktion

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

RNasin RNase-Inhibitor

RPMI Roswell Park Memorial Institute Medium

RT Raumtemperatur

SD Standardabweichung des Mittelwertes (standard derivation)

SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)

SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

SULT Sulfotransferase(n)

t10,c12-CLA trans-10,cis-12-Octadecadiensäure

TBS-T TRIS-gepufferte Kochsalzlösung mit TWEEN 20

TEMED Tetramethylethylendiamin

TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

TWEEN 20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat

UAS hefespezifische Erkennungssequenz für den GAL4 Faktor

üN über Nacht

v/v Volumen per Volumen

w/v Gewicht per Volumen

1 Kurzdarstellung der Arbeit (Short Summary)

1

1 Kurzdarstellung der Arbeit (Short Summary)

C18-Furanfettsäuren – Toxikologische Charakterisierung der Oxidations-

produkte von konjugierten Linolsäureisomeren

Imme Lengler – Dissertation Tierärztliche Hochschule Hannover 2011

Konjugierte Linolsäureisomere (conjugated linoleic acid, CLA) sind mehrfach

ungesättigte Fettsäuren, die vielfältige physiologische Wirkungen besitzen. Bisherige

Studien zeigen, dass insbesondere das Minorisomer t10,c12-CLA eine

antikarzinogene Wirkung besitzt. Der Mensch nimmt über Milchprodukte und Fleisch

von Wiederkäuern durchschnittlich 0,3 g CLA pro Tag zu sich. Der Europäischen

Behörde für Lebensmittelsicherheit liegen derzeit Zulassungsanträge für neuartige

Lebensmittelzutaten vor, die die tägliche Aufnahme an CLA verzehnfachen könnten.

Bei einer Einnahme dieser Präparate ist gleichzeitig von einer erhöhten Aufnahme

von Oxidationsprodukten der CLA, den Furanfettsäuren (FFA), auszugehen. Die

physiologischen Auswirkungen derartig gesteigerter Mengen CLA und ihrer

Oxidationsprodukte sind nicht bekannt. In dieser Arbeit wurden die zellulären und

molekularen Effekte der FFA im Vergleich zu denen der CLA erstmalig

charakterisiert. Da für CLA insbesondere in humanen Kolonkarzinomzellen

antiproliferative und differenzierungsfördernde Effekte beschrieben sind, wurde die

Kolon-Adenokarzinomzelllinie Caco-2 als in vitro-Modell verwendet.

Im ersten Teil der Arbeit wurden die molekularen Wirkungen der t10,c12-CLA in

Caco-2-Zellen denen der strukturell zugehörigen 10,12-FFA gegenübergestellt.

Mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese und Massenspektrometrie (MALDI-

TOF) wurden die proteomischen Veränderungen nach Einwirkung dieser Fettsäuren

analysiert. Nach der Behandlung von Caco-2-Zellen mit bis zu 100 µM t10,c12-CLA

wurden 40 Proteine mit mindestens 1,5fach veränderter relativer Expression im

Gegensatz zur Kontrolle identifiziert. Zum Einen wurden durch die CLA-Behandlung

Proteine beeinflusst, die die Transkription, Translation, Stabilität oder Aktivität von

p53 steigern, was auf eine p53-vermittelte Tumorsuppression hinweist. Zum Anderen

wurden sowohl potentielle Regulatoren des Wnt-β-Catenin-Signalwegs beeinflusst

1 Kurzdarstellung der Arbeit (Short Summary)

2

als auch Zielgene dieses Signalweges inhibiert. Dieses konnte als negative

Regulierung des Wnt-β-Catenin-Signalweges durch die t10,c12-CLA interpretiert

werden. Eine Inhibierung dieses Signalweges hat eine Abnahme der zellulären

Proliferation und eine Stimulation der Differenzierung der Zellen zur Folge und

korreliert somit mit der postulierten antikanzerogenen Wirkung dieser Substanz.

Nach Exposition von Caco-2-Zellen mit bis zu 1 mM 10,12-FFA wurden

30 differenziell exprimierte Proteine identifiziert, die jedoch komplett andere Effekte

im Vergleich zur korrespondierenden t10,c12-CLA anzeigten. Es wurden drei

Proteine induziert, die eine Rolle in der Lipidtröpfchenbiogenese spielen. Alle

anderen durch die 10,12-FFA regulierten Proteine waren reprimiert und betrafen den

Zellzyklus sowie allgemeine zelluläre Prozesse wie die Transkription, Protein-

biosynthese und die weitere Prozessierung von Proteinen. Eine Beeinflussung

toxikologisch relevanter Signalwege durch die 10,12-FFA wurde nicht gefunden.

Im zweiten Teil der Arbeit wurden die zellulären Effekte verschiedener FFA-Isomere

in Caco-2-Zellen untersucht. Unter Berücksichtigung einer möglichen metabolischen

Aktivierung des Furanringes der FFA in der Leber wurden die Untersuchungen auf

die metabolisch aktive humane hepatozelluläre Karzinomzelllinie HepG2

ausgedehnt. Es wurde gezeigt, dass die FFA in Caco-2-Zellen aufgenommen und

intrazellulär in Lipidtröpfchen verpackt wurden, in humanrelevanten Konzentrationen

jedoch weder in Caco-2- noch in HepG2-Zellen eine toxische Wirkung entfalteten.

Bei Konzentrationen bis zu 500 µM wiesen die FFA-Isomere weder eine ausgeprägte

Zytotoxizität auf noch beeinflussten sie zelluläre Parameter wie die Proliferation oder

Apoptose. Auch die Peroxisomen-Proliferator-aktivierten-Rezeptoren, die durch

zahlreiche Fettsäuren aktiviert werden und eine Rolle in der Karzinogenese spielen,

wurden durch die FFA nicht beeinflusst. Zudem wies die 9,11-FFA weder in einem

in vitro-Mikrokerntest mit Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters (V79-

Zellen) noch im Ames-Test eine genotoxische Wirkung auf.

Insgesamt geht aus den Ergebnissen dieser Arbeit hervor, dass die t10,c12-CLA

relevante Signaltransduktionswege in Darmzellen beeinflusst, wohingegen von den

Oxidationsprodukten der CLA weder zellulär toxische Wirkungen ausgehen noch

molekulare Signalwege signifikant beeinflusst werden.

1 Kurzdarstellung der Arbeit (Short Summary)

3

C18 Furan fatty acids – Toxicological characterisation of oxidation products

from conjugated linoleic acids

Imme Lengler – Thesis University of Veterinary Medicine Hanover 2011

Conjugated linoleic acids (CLA) are polyunsaturated fatty acids and offer a variety of

physiological effects. Recent studies revealed the anticarcinogenic properties of the

minor isomer t10,c12-CLA. The average estimated intake of CLA via milk products

and meat from ruminants by humans is 0.3 g CLA/day. The European Food Safety

Authority currently proves the application for approval of food supplements which

could result in a tenfold increase of daily CLA intake. In addition, ingestion of these

supplements could lead to a simultaneous increased uptake of CLA oxidation

products, the furan fatty acids (FFA). The physiological effects of high concentrations

of CLA and of their oxidation products are unknown.

In this study the cellular and molecular effects of FFA in comparison to CLA were

characterised for the first time. As CLA are known to have antiproliferative effects

and to induce differentiation in particular in human colon carcinoma cells the

colorectal adenocarcinoma cell line Caco-2 was used as in vitro model.

In the first part of this study, molecular effects caused by t10,c12-CLA were

compared with those caused by the corresponding 10,12-FFA in Caco-2 cells. By

using two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry (MALDI-TOF) a

detailed overview of proteomic changes after exposure of Caco-2 cells to these fatty

acids was achieved. Treatment of the cells with up to 100 µM t10,c12-CLA led to the

identification of 40 proteins with a more than 1.5-fold altered expression in

comparison to untreated control cells. These data revealed a detailed insight into the

antiproliferative mechanism initiated by CLA. On the one hand, t10,c12-CLA

regulated proteins which are involved in improvement of transcription, translation,

stability and activity of p53 protein. This indicates p53-mediated tumor suppression

triggered by t10,c12-CLA. On the other hand potential regulatory proteins of the

Wnt/β-catenin signaling pathway were affected. Moreover, target genes of the same

pathway were inhibited. This suggests an inhibition of Wnt/β-catenin signaling

through t10,c12-CLA. Repression of this signaling pathway results in a decrease of

1 Kurzdarstellung der Arbeit (Short Summary)

4

cellular proliferation and a stimulation of cellular differentiation. Therefore, the data

correlate with the postulated anticarcinogenic effect of this substance.

In case of 10,12-FFA, 30 differentially expressed proteins were identified upon

incubation of Caco-2 cells with up to 1 mM of the substance. However, these proteins

completely differed from those regulated by t10,c12-CLA. Three proteins were

upregulated and these proteins were associated with lipid droplet biogenesis. All

remaining differentially expressed proteins were downregulated. They were

considered to be associated with the cell cycle as well as with general cellular

processes such as transcription, protein biosynthesis and further protein processing.

There was no indication that any signal transduction pathway of toxicological

relevance was affected by 10,12-FFA.

In the second part of this study cellular effects of different FFA isomers were studied

by using the Caco-2 model. Based on the assumption that the furan ring of FFA

might be activated in the liver by cellular metabolic activity, the metabolically active

human hepatoma cell line HepG2 was included in the study. It was shown with

Caco-2 cells that FFA was taken up and stored as triglycerides in intracellular lipid

droplets. FFA showed neither in Caco-2 nor in HepG2 cells toxic effects at

concentrations that could be relevant for humans. At concentrations up to 500 µM,

the FFA isomers showed no pronounced cytotoxicity and did not influence cellular

proliferation or apoptosis. Moreover, FFA did not interact with proxisome proliferator-

activated receptors, which are activated by many fatty acids and which are supposed

to be involved in carcinogenesis. Additionally, 9,11-FFA was neither genotoxic in the

micronucleus test using Chinese hamster lung fibroblasts (V79) nor in the Ames test.

In summary, t10,c12-CLA have an impact on relevant signal transduction pathways

in colon carcinoma cells whereas oxidation products of CLA neither have toxic

cellular effects nor affect significant molecular signaling pathways.

2 Einleitung

5

2 Einleitung

Konjugierte Linolsäureisomere (conjugated linoleic acid, CLA) sind in Milch und

Fleisch von Wiederkäuern natürlich vorkommende, mehrfach ungesättigte

Fettsäuren. CLA stehen im Fokus des wissenschaftlichen Interesses, da ihnen

zahlreiche Effekte, insbesondere eine antikanzerogene Wirkung, zugeschrieben

werden. In den westlichen Industrieländern besteht ein ausgeprägtes Interesse an

Lebensmitteln mit einem „positiven Effekt“ auf die Gesundheit oder mit anderen

modulierenden Eigenschaften auf den menschlichen Organismus. Die Lebensmittel-

industrie führt stetig neue Produkte mit besonderen Eigenschaften in den in den

Markt ein, die funktionelle Wirkungen vielfältiger Art auf den Menschen besitzen

sollen (Functional Food). Solche Lebensmittel unterliegen einem Genehmigungs-

verfahren nach der sogenannten „Novel Food Verordnung“ (VO 258/97/EG), wenn

die entsprechenden Zutaten vor dem 15. Mai 1997 in Europa nicht in nennenswerten

Mengen als Lebensmittel verzehrt wurden. Diese Verordnung des Europäischen

Parlaments und des Rates der Europäischen Union wurde 1997 erlassen. Kernstück

des Genehmigungsverfahrens ist die Bewertung der gesundheitlichen Unbedenk-

lichkeit des neuartigen Lebensmittels bzw. der neuartigen Lebensmittelzutat. Den als

Novel Food eingestuften konjugierten Linolsäureisomeren wird neben der

antikarzinogenen Wirkung ein positiver Einfluss auf die Entwicklung von

Muskelmasse und die Reduzierung des Körperfettanteils zugeschrieben. Aufgrund

dieser vermuteten positiv anabolen Wirkung sind diverse Firmen daran interessiert,

CLA als Lebensmittelzusatz oder Nahrungsergänzungsmittel einzusetzen. Seit Mai

2007 wurden zwei Anträge auf Zulassung von CLA als Lebensmittelzutat gestellt.

Zuerst beantragte die spanische Cognis GmbH die Zulassung eines CLA-Produkts

namens Tonalin®TG 80. Im November 2007 folgte die irische Firma Lipid Nutrition

B.V. mit der Marke Clarinol®. Die genannten CLA-Produkte werden durch eine

alkalische Behandlung von Distelöl hergestellt, welches große Mengen an Linolsäure

beinhaltet. Dadurch entstehen Mischungen von CLA-Isomeren, so dass die

Präparate nach eigenen Angaben zu gleichen Teilen aus den Isomeren c9,t11-CLA

2 Einleitung

6

und t10,c12-CLA (siehe Abschnitt 2.1.1) bestehen. Dies entspricht nicht den

Gegebenheiten in natürlichen CLA-enthaltenden Lebensmitteln, in denen die

c9,t11-CLA bis zu 90% des Gesamt-CLA-Gehaltes ausmacht und das Minorisomer

t10,c12-CLA nur in sehr geringen Mengen vorhanden ist. Die durchschnittliche

Aufnahmemenge von CLA aus natürlichen Lebensmittelquellen beläuft sich auf

insgesamt etwa 0,3 g pro Tag (Abschnitt 2.1.2). Eine Ergänzung um 3 g CLA würde

die Aufnahmemenge demnach für die c9,t11-CLA um etwa das 6fache erhöhen,

wohingegen die Aufnahme der t10,c12-CLA um mehr als das 50fache steigen würde.

Die Sicherheitsbewertung der CLA-Präparate durch das Gremium für Dietätische

Lebensmittel, Ernährung und Allergien der Europäischen Behörde für Lebensmittel-

sicherheit (European Food Safety Authority, EFSA) kam zu dem Schluss, dass die

Sicherheit von 3 g CLA am Tag für gesunde Menschen nur bis zu einem halben Jahr

belegt ist. Außerdem kann wegen unklarer Effekte auf den Cholesterinspiegel und

auf Entzündungsparameter für Personen mit Diabetes Typ II keine Aussage getroffen

werden (siehe Abschnitt 2.1.5). Die Zulassung der beiden CLA-Präparate als

neuartige Lebensmittelzutaten durch die EU-Kommission steht daher bisher noch

aus.

Aus CLA können durch Photo- und Autoxidation Furanfettsäuren (furan fatty acids,

FFA) entstehen. Diese sollten in eine Bewertung mit einbezogen werden. FFA und

deren Abbauprodukte enthalten auf Grund des Furanringes ein toxisches Potential,

das bisher noch nicht charakterisiert wurde. Die physiologische Wirkung von FFA auf

den menschlichen Organismus ist nahezu unbekannt.

2 Einleitung

7

2.1 Konjugierte Linolsäureisomere (CLA)

Konjugierte Linolsäureisomere (CLA) sind seit den 1980er Jahren bekannt und

wurden zunächst als eine antikarzinogene Komponente in gegrilltem

Rinderhackfleisch beschrieben (Ha et al., 1987). Seitdem werden CLA eingehend

untersucht, so dass ihnen vielfältige - sowohl positive als auch negative - Wirkungen

auf den menschlichen Körper zugeschrieben werden konnten. CLA ist ein

Sammelbegriff für verschiedene positionelle und geometrische Isomere, in

natürlichen Lebensmittelquellen liegt meist ein komplexes CLA-Gemisch vor. Die

meisten Untersuchungen zu den Wirkungen von CLA wurden mit Isomeren-

gemischen durchgeführt. Somit ließen sich die beobachteten Effekte nicht eindeutig

den Isomeren zuordnen. In den letzten Jahren wurden jedoch vermehrt Publikationen

über Studien mit Einzelisomeren veröffentlicht, die demonstrierten, dass die Isomere

unterschiedlich potent sein können und die Wirkungsweise durchaus unterschiedlich

und zum Teil widersprüchlich sein kann (Churruca et al., 2009).

2.1.1 Struktur und Biosynthese von CLA

CLA sind Octadecadiensäuren (C18:2), also positionelle und geometrische Isomere

der Linolsäure (cis,cis-Octadeca-9,12-diensäure) mit konjugierten Doppelbindungen,

die in cis- oder trans-Stellung vorliegen können. Das Hauptisomer der natürlich

vorkommenden CLA ist die c9,t11-CLA, biologisch besonders aktiv ist hingegen das

seltener vorkommende Isomer t10,c12-CLA (Abb. 1).

Linolsäure

c9,t11-CLA

t10,c12-CLA

Abbildung 1: Strukturformel von Linolsäure im Vergleich zu c9,t11-CLA und t10,c12-CLA.

2 Einleitung

8

Das anaerobe Bakterium Butyrivibrio fibrisolvens aus dem Pansen von Wiederkäuern

isomerisiert Linolsäure zu CLA. Die Reaktion wird von dem Enzym Linoleat-

Isomerase katalysiert. Dieses ist substratspezifisch für ein cis9, cis12-

Doppelbindungssystem und eine freie Carboxylgruppe (Kepler et al., 1966 und

1970). Die Bildung anderer CLA-Isomere beruht auf einer Reihe verschiedener

Isomerasen (Griinari und Bauman, 1999).

2.1.2 Gehalte in Lebensmitteln und Aufnahmemenge von CLA

Der Mensch nimmt CLA hauptsächlich über tierische Nahrungsmittel auf. Aufgrund

ihrer Synthese im Pansen von Wiederkäuern sind CLA vor allem in Milch,

Milchprodukten, Fleisch und Fleischprodukten von Wiederkäuern zu finden. Die

höchsten CLA-Gehalte wurden in Rohmilch, Joghurt und Butter, aber auch in

Schafskäse, Lamm- und Rindfleisch nachgewiesen. Der CLA-Gehalt in Fisch ist

hingegen minimal (Fritsche und Steinhart, 1998; Tab. 1).

Tabelle 1: Durchschnittlicher Anteil an c9,t11-CLA in % der Gesamtmenge an Fettsäuremethylestern (FAMEs) in deutschen Nahrungsmitteln (Auszug aus Fritsche und Steinhart, 1998).

Milchprodukte c9,t11-CLA [%] Fleisch und Fisch c9,t11-CLA [%]

Rohmilch 1,16 Schweinefilet 0,12 Pasteurisierte Milch 0,98 Schweineschnitzel 0,15 Sahne 0,77 Rinderfilet 0,65 Butter 0,94 Rinderleber 0,43 Joghurt 0,69 Lamm 1,20 Probiotischer Joghurt 1,05 Truthahn 0,20 Gouda 0,40 Kaninchen 0,11 Emmentaler 1,16 Huhn 0,15 Gorgonzola 0,69 Karpfen 0,09 Brie 0,49 Dorsch 0,03 Ziegenkäse 0,50 Rotbarsch 0,06 Schafskäse 1,01 Lachs 0,07

Anhand des durchschnittlichen Verzehrs von tierischen und pflanzlichen Fetten in

Deutschland (Heseker et al., 1994) stellten Fritsche und Steinhart eine Schätzung

der durchschnittlichen täglichen Einnahme von CLA an, die besagt, dass Frauen

insgesamt 93,5 g Fett pro Tag zu sich nehmen, davon 0,35 g CLA. Männer nehmen

insgesamt 117 g Fett pro Tag auf, wovon 0,43 g CLA sind (Fritsche und Steinhart,

1998). Die Aufnahmemenge von CLA variiert je nach Geschlecht, Alter und

2 Einleitung

9

Ernährungsweise. Durch die Nahrung wird hauptsächlich die c9,t11-CLA

aufgenommen, da diese in tierischen Lebensmitteln 80 bis 90% des gesamten CLA-

Gehaltes ausmacht. Im Blut von Nicht-Vegetariern wurde ein CLA-Gehalt von 20 bis

70 µM nachgewiesen, wovon die c9,t11-CLA etwa 80% ausmachte (Fogerty et al.,

1988).

2.1.3 Antikarzinogene Effekte der CLA

Seit ihrer Entdeckung in den 1980er Jahren ist die Zahl der Untersuchungen zu den

physiologischen Wirkungen der CLA in eine schier unübersichtliche Menge

gewachsen. Zahlreiche Studien befassen sich mit der Wirkungsweise auf humane

Tumorzelllinien (Maggiora et al., 2004; Kelley et al., 2007). In vivo wurde in diversen

Fütterungsversuchen mit CLA-Gemischen an Ratten und Mäusen ein Rückgang von

chemisch induzierten Karzinomen insbesondere bei Kolon- und Brusttumoren

beobachtet (Liew et al., 1995; Ip et al., 1995; Ip et al., 1997; Park et al., 2001b;

Kohno et al., 2004). Es konnten sowohl für die c9,t11-CLA als auch für die

t10,c12-CLA antikarzinogene Effekte gezeigt werden (Kelley et al., 2007). Anhand

verschiedener intestinaler Krebszelllinien, wie u.a. der SW480 (O´Shea et al., 1999),

der HT29 (Shultz et al., 1992; Palombo et al., 2002; Cho et al., 2003) und auch der

Caco-2-Zelllinie (Kim et al., 2002a/b; Lampen et al., 2005) konnte gezeigt werden,

dass CLA das Wachstum von Krebszellen in vitro hemmen. Derselbe Effekt trat bei

Brust- (Durgam et al., 1997) und Leberkarzinomzelllinien (Yamasaki et al., 2001) auf.

Bezüglich des Mechanismus der Chemoprotektion von CLA in der Kolon-

karzinogenese wird ein Einfluss der Kernrezeptoren PPAR (Peroxisomen-

Proliferator-aktivierte-Rezeptoren) diskutiert. PPAR sind Transkriptionsfaktoren, die

durch Bindung eines in der Regel kleinen und lipophilen Liganden aktiviert werden.

Liganden sind u.a. Fettsäuren (Arachidonsäure, Palmitinsäure, u.a.) sowie deren

Derivate (Xu et al., 1999) und insbesondere mehrfach ungesättigte Fettsäuren

(Göttlicher et al., 1992; Moya-Camarena, 1999a). Auch für einige CLA-Isomere

konnte gezeigt werden, dass sie Liganden und Aktivatoren der PPAR sind (Moya-

Camarena et al., 1999b; Brown et al., 2003; Lampen et al., 2005).

2 Einleitung

10

Die Familie der PPAR besteht aus drei Mitgliedern, PPARα, PPARβ/δ und PPARγ,

die sich in ihrer lokalen Expression, Ligandenbindung und Funktion unterscheiden.

Alle drei bekannten Isoformen werden im Darm exprimiert (Braissant et al., 1996).

Die PPAR haben vielfältige Funktionen wie beispielsweise im Lipidmetabolismus

oder im Glukosestoffwechsel. Sie spielen zudem bei der Entstehung von Krebs und

der Tumorentwicklung eine entscheidende Rolle.

PPARα kann über den Tumorsuppressor p53 in die Regulation des Zellzyklus

eingreifen (Khan und Vanden Heuvel, 2003; Sumanasekera et al., 2003), scheint

jedoch in der Kolonkarzinogenese keine große Rolle zu spielen. Die Rolle von

PPARγ bezüglich der Tumorentstehung wird kontrovers diskutiert. Einige frühere

Studien zeigten, dass PPARγ-Liganden in vivo die Ausbildung von Polypen im Darm

von Mäusen fördern (Saez et al., 1998; Lefebvre et al., 1998), jedoch lediglich bei

genetischer Prädisposition in Form vom Mutationen im Tumorsuppressorgen APC

(adenomatous polyposis coli; Girnun et al., 2002). Andererseits wurden Mutationen,

die die Funktionalität der PPARγ-Ligandenbindedomäne beeinträchtigen, mit der

Entwicklung von humanen Kolonkrebs assoziiert (Sarraf et al., 1999) und

heterozygote Deletionen im PPARγ-Gen führten zu einer vermehrten Entwicklung

von chemisch induzierten Kolonkrebs in Mäusen (Girnun et al., 2002; Dai et al.,

2009). Außerdem wurde in einer aktuellen Studie gezeigt, dass die Expression von

PPARγ in Kolonkrebs mit einer günstigen Krebsprognose einhergeht, weshalb

PPARγ als Tumorsuppressorgen diskutiert wird (Ogino et al., 2009). In zahlreichen in

vitro-Studien wurden zudem antikanzerogene Wirkungen von PPARγ in Kolonkrebs

nachgewiesen. Es wurde sowohl eine Induktion der Apoptose (Chen et al., 2002; Lee

et al., 2006; Qiao et al., 2008; Dai et al., 2008) als auch eine Inhibierung der

zellulären Proliferation durch PPARγ-Agonisten nachgewiesen (Kitamura et al., 2001;

Theocharis et al., 2004) sowie eine differenzierungsfördernde Wirkung von PPARγ-

Liganden gezeigt (Yoshizumi et al., 2004; Kawamata et al., 2006). Weitere

Mechanismen der Chemoprotektion durch PPARγ-Liganden werden diskutiert. So

beeinflussen diese neben der Apoptose, Proliferation und Differenzierung

beispielsweise den Tumorsuppressor p53 positiv (Yasui et al., 2005), das Proto-

Onkoprotein β-Catenin negativ (Sharma et al., 2004; Fujisawa et al., 2008) und

2 Einleitung

11

inaktivieren den Transkriptionsfaktor NF-kappaB, was zu einer Inhibierung des

Zellwachstums von Kolonkarzinomzellen führt (Ban et al., 2010). Bezüglich der

Chemoprotektion von CLA in der Kolonkarzinogenese wird u.a. ein PPARγ-

abhängiger Mechanismus angenommen (Bassaganya-Riera et al., 2004; Evans et

al., 2010).

Die Bedeutung von PPARβ/δ in Bezug auf die Proliferation von Tumoren ist vielfältig

und eine tumorpromovierende Wirkung wird speziell für die Kolonkarzinogenese

diskutiert. PPARβ/δ wurde als Zielgen des Tumorsuppressors APC in

Kolonkarzinomzellen mit inaktivem APC identifiziert (He et al., 1999). Die Entstehung

von Kolonkarzinomen wird u.a. auf eine Mutation im APC-Tumorsuppressorgen

zurückgeführt (Abb. 2). Das APC-Protein ist ein wichtiger physiologischer Antagonist

des β-Catenins und damit auch des Wnt-Signaltransduktionsweges. Wird diese

Kaskade übermäßig aktiviert, kommt es zur Krebsentstehung beim Menschen.

Normalerweise bindet das APC-Protein an β-Catenin und Axin. In diesem Komplex

wird β-Catenin durch die Glycogen-Synthase-Kinase 3β (GSK3β) phosphoryliert und

nach Ubiquitinierung proteosomal degradiert (Aberle et al., 1997). Bei Zellen mit

inaktivem APC (z.B. Caco-2, siehe Abschnitt 2.3) ist der β-Catenin-Abbau nicht

möglich, wodurch es zu einer Anreicherung des intrazellulären β-Catenins kommt.

Dieses kann im Zellkern als Komplex mit dem T-Zellfaktor 4 (TCF4; Behrens et al.,

1996; Molenaar et al., 1996) als Transkriptionsaktivator die Expression spezifischer

Proliferationsgene wie beispielsweise c-myc (He et al., 1998) und cyclin D1

(Shtutman et al., 1999) induzieren, die das Tumorwachstum fördern. Ein weiteres

Zielgen des β-Catenin/TCF4-Komplexes ist PPARβ/δ (He et al., 1999).

Abbildung 2: Schematische Darstellung des APC/β-Catenin/TCF-Signalweges mit (A) aktivem wt-APC und (B) inaktivem, mutierten APC.

2 Einleitung

12

Nach Behandlung mit einem PPARβ/δ-Agonisten zeigen Mäuse mit einer Mutation

im APC-Gen, welche multiple intestinale Multiplasien auslöst, im Vergleich zum

Wildtyp ein deutlich erhöhtes Tumorwachstum (Gupta et al., 2004). Analog bilden

Mäuse mit einer homozygoten Deletion von PPARβ/δ deutlich kleinere

Kolonkarzinome als Wildtyp-Mäuse aus (Barak et al., 2002; Wang et al., 2006; Zuo et

al., 2009) und der tumorpromovierende Effekt des PPARβ/δ-Agonisten GW501516

wird inhibiert (Wang et al., 2006). In vitro zeigen dem entsprechend auch HCT116-

Zellen, deren PPARβ/δ genetisch inaktiviert wurde, eine Hemmung der Proliferation

(Park et al., 2001a) und eine Inhibierung von PPARβ/δ vermindert das Wachstum

verschiedener humaner Kolonkrebszelllinien (Shureiqi et al., 2003). Zudem wurde

gezeigt, dass PPARβ/δ die chemoprotektive Wirkung von PPARγ inhibiert. PPARβ/δ

kann eine ligandeninduzierte PPARγ-vermittelte Apoptose in Kolonkarzinomzellen

unterdrücken und somit tumorpromovierend wirken (Zuo et al., 2006). Allerdings führt

in einer aktuellen Studie ein PPARβ/δ-Knockdown in verschiedenen Kolon-

krebszelllinien durch eine Inhibierung der Differenzierung und Förderung der

Zelladhäsion zu einem kanzerogeneren Phänotyp (Yang et al., 2010).

Für PPARβ/δ wurde im Reportergenassay eine konzentrationsabhängige

Transaktivierung durch c9,t11-CLA und t10,c12-CLA bestimmt werden (Lampen et

al., 2005; Leifheit, 2006). Unklar ist bislang allerdings, ob diese Bindung eine

Aktivierung oder Repression des Rezeptors verursacht. Gezeigt werden konnte

hingegen, dass die mRNA-Expression von PPARβ/δ durch CLA gehemmt wird. Für

die c9,t11-CLA konnte außerdem gezeigt werden, dass sie sowohl die mRNA- und

Proteinmenge von β-Catenin als auch die Expression von Zielgenen des APC-

Weges wie c-myc, cyclin D1 und c-jun direkt hemmen und somit antiproliferativ

wirken (Lampen et al., 2005; Bozzo et al., 2007).

2 Einleitung

13

2.1.4 Effekte der CLA auf die Körperzusammensetzung

Zahlreiche Fütterungsversuche an Mäusen (West et al, 1998; DeLany et al., 1999,

Takahashi et al., 2002), Ratten (Azain et al., 2000) und Schweinen (Ostrowska et al.,

1999) zeigten, dass CLA eine Reduktion des Körpergewichtes durch Verminderung

des Fettgewebes verursachen kann, wenn dem Futter täglich über 0,5% eines CLA-

Gemisches beigemengt werden. Wenn diese CLA-Gemische vorwiegend das c9,t11-

CLA-Isomer aufwiesen, blieb ein Effekt auf das Körpergewicht aus, so dass die

t10,c12-CLA als das vorwiegend potente Isomer identifiziert werden konnte (Park et

al., 1999). Die Reduzierung von Fettgewebe durch CLA wird auf eine Erhöhung des

Energieumsatzes bei verringerter Fetteinlagerung und Lipogenese und erhöhter

β-Oxidation zurückgeführt. Außerdem wurde ein positiver Effekt auf Apoptose und

Zelldifferenzierung beschrieben (Baddini Feitoza et al., 2009).

Humanstudien sind weniger eindeutig. Der fettreduzierende Effekt von CLA wurde in

einigen Studien auch im Menschen gezeigt; andere Studien kamen hingegen zu dem

Schluss, dass eine Gabe von CLA keine Auswirkung auf die Körper-

zusammensetzung hat. So konnten Atkinson et al. (1999), Blankson et al. (2000) und

Risérus et al. (2001) an übergewichtigen bis adipösen, aber sonst gesunden

Menschen eine signifikante Abnahme des Körperfettanteils nachweisen, wobei ein

Zeitraum der CLA-Applikation von vier Wochen bis sechs Monate gewählt wurde.

Thom et al. (2001) und Gaullier et al. (2004) wiesen in Menschen mit einem

normalen BMI ebenfalls eine signifikante Abnahme des Körperfettanteils (ohne

Reduzierung des Körpergewichts) nach, wobei die Studien jeweils zwöf Wochen

bzw. zwölf Monate andauerten und die Gabe von CLA sowohl in Form von freien

Fettsäuren als auch als Triacylglyceride gebunden vorlagen. Die täglich

verabreichten Dosen von CLA wurden zwischen 1,7 g und 6,8 g gewählt, wobei in

keiner dieser Studien eine Unterscheidung zwischen den Isomeren gemacht wurde

und CLA-Isomerengemische ohne angegebene Mengenverhältnisse verwendet

wurden.

In anderen Studien konnten keine Effekte auf den Körperfettanteil festgestellt

werden. Zambell et al. (2000) verabreichten über einen Zeitraum von 64 Tagen 3 g

2 Einleitung

14

CLA pro Tag an übergewichtige Menschen, Risérus et al. (2004) verwendeten

c9,t11-CLA und Malpuech-Brugere et al. (2004) stellten eine vergleichende Studie

zwischen der c9,t11-CLA und der t10,c12-CLA an, wobei beide Isomere in gleichen

Mengen (1,5 g und 3 g pro Tag) und in Form von Triacylglyceriden gebunden

verabreicht wurden. In keiner dieser Studien wurden signifikante Effekte auf den

Körperfettanteil von übergewichtigen Menschen beobachtet. Kreider et al. (2002) und

Tricon et al. (2004) machten die gleichen Beobachtungen an gesunden,

normalgewichtigen Menschen.

2.1.5 Weitere Wirkungen und mögliche Risiken von CLA

CLA besitzen kein allergenes Potential und zeigen im Ames-Test und im in vivo-

Mikrokerntest keine Genotoxizität (O´Hagan und Menzel, 2003). Neben der in

zahlreichen Untersuchungen beschriebenen antikarzinogenen Wirkung und der

widersprüchlichen Literaturlage zum Einfluss auf die Körperzusammensetzung,

weisen viele Studien jedoch auf weitere Effekte von CLA hin. Insbesondere wird ein

vielfältiger Einfluss auf den Lipid- und Glukosemetabolismus beschrieben.

Einige Studien zeigten im Speziellen, dass CLA einen hemmenden Einfluss auf die

Entwicklung von Thrombosen und Arteriosklerosen besitzen. Eine durch

Arachidonsäure oder Kollagen induzierte Thrombocytenaggregation wurde durch die

Gabe von CLA zurückgebildet. CLA erwiesen sich demnach als Antagonisten einer

Blutplättchenaggregation (Truitt et al., 1999). In Fütterungsversuchen am Kaninchen

konnte zudem eine Reduktion des LDL-Cholesterinspiegels und des

Triacylglyceridgehalts im Serum mit einhergehendem antiatherogenen Effekt nach

Gabe eines CLA-Gemisches gezeigt werden (Lee et al., 1994a; Nicolosi et al., 1997;

Kritchevsky et al., 2000). Zudem wurden CLA als immunmodulierend beschrieben

(Cook et al.,1993; O´Shea et al., 2004).

Eine mögliche antidiabetogene Eigenschaft von CLA wird kontrovers diskutiert.

Ältere Studien an diabetischen Ratten zeigten eine Normalisierung der gesteigerten

Glukosetoleranz und eine Reduzierung des erhöhten Insulinspiegels im Blut

(Hyperinsulinämie) nach CLA-Fütterung (Houseknecht et al., 1998), wobei diese

2 Einleitung

15

Wirkungen auf die t10,c12-CLA zurückgeführt werden konnten (Ryder et al., 2001).

Andererseits wurde eine durch CLA verursachte Insulinresistenz mit gesteigerten

Insulinwerten im Blut in Tierstudien wie beispielsweise an übergewichtigen und

fettleibigen Mäusen (Tsuboyama-Kasaoka et al., 2000; LaRosa et al., 2006) und

in vitro in humanen Adipozyten gezeigt (Brown et al., 2003; Chung et al., 2005;

Kennedy et al., 2010a). In einer Humanstudie, bei der adipöse Männer 3,4 g

t10,c12-CLA pro Tag zu sich nahmen, konnte ebenfalls eine erhöhte Insulinresistenz

und eine Hyperglykämie nachgewiesen werden (Risérus et al., 2002). Eine

Insulinresistenz erhöht das Risiko zur Erkrankung an Diabetes. Die Insulinresistenz

kann durch inflammatorische Zytokine verursacht werden, wodurch außerdem die

Lipogenese in Adipozyten gehemmt wird und die Lipolyse steigt. Insgesamt wird die

Adipogenese demnach vermindert. Für die t10,c12-CLA konnte gezeigt werden, dass

sie die Expression und/oder Sekretion der Interleukine IL-6, IL-8 und IL-1β sowie des

Tumornekrosefaktors TNF-α in humanen Adipozytenkulturen steigert (Brown et al.,

2004; Chung et al., 2005).

Die Folge einer Delipidation des Fettgewebes durch hohe t10,c12-CLA-Gehalte im

Futter ist eine Verlagerung der Lipideinlagerung in die Leber, so dass eine

Vergrößerung der Leber bis hin zur Verfettung stattfindet, wie es in der Maus

(Tsuboyama-Kasaoka et al., 2000; Chardigny et al., 2003) und im Hamster (Tarling

et al., 2009; Navarro et al., 2009) gezeigt werden konnte. Dies kann sogar zur

Induktion einer nicht-alkoholischen Leberzirrhose in Mäusen führen (Clement et al.,

2002). Außerdem können freie Fettsäuren, die vom Fettgewebe durch Delipidation

ins Blut abgegeben werden, zu Hyperlipidämie, Hyperglykämie und Lipidystrophie

führen, wenn sie nicht in ausreichendem Maße oxidiert werden können (Kennedy et

al., 2010b).

Solche negativen Auswirkungen, insbesondere der t10,c12-CLA auf den Lipid- und

Glukosestoffwechsel und die Insulinresistenz, verdeutlichen, dass weitere

Untersuchungen notwendig sind, um die gesundheitlichen Folgen von CLA auf den

Menschen sicher beurteilen zu können.

2 Einleitung

16

OH3C-(CH2)m

R2R1

(CH2)n-COOH

2.2 Furanfettsäuren (FFA)

Bei Furanfettsäuren (FFA) handelt es sich um eine große Gruppe von Fettsäuren, die

durch einen Furanring charakterisiert sind. Natürlich vorkommende FFA sind an einer

oder an beiden β-Positionen des Furanringes methylsubstituiert. Nicht-

methylsubstituierte FFA kommen in der Natur nicht vor, können jedoch durch Photo-

oder Autoxidation von CLA entstehen.

2.2.1 Struktur von FFA

FFA weisen unterschiedlich lange, unverzweigte Alkyl- und Carboxylseitenketten auf,

die sich jeweils an den α-Positionen des Furanringes befinden. Die natürlich

vorkommenden FFA haben einen Propyl- oder Pentylrest und eine Carboxylkette mit

9, 11 oder 13 Kohlenstoffatomen. Die β-Positionen des Furanringes liegen mono-

oder dimethyliert vor (Abb. 3). Die häufigste, natürlich vorkommende FFA besitzt

einen Pentylrest und einen Säurerest mit 11 Kohlenstoffatomen und ist dimethyliert

(Spiteller, 2005).

Abbildung 3: Grundstruktur der häufigsten Furanfettsäuren. m= 2 oder 4 ; n= 8, 10 oder 12 ; R1/ R2 = Rest ( –H oder –CH3)

Unsubstituierte FFA können durch Oxidation von CLA entstehen und besitzen somit

18 Kohlenstoffatome, wobei die Alkyl- und Carboxylseitenketten am Furanring

unterschiedliche Längen aufweisen können. Gunstone und Wijesundera wiesen

erstmals 1979 eine Photooxidation von CLA zu FFA unter Temperatur- oder

Lichteinfluss nach. Yurawecz et al. zeigten 1995 zudem eine Autoxidation von CLA,

wobei folgende unmethylierte FFA als Oxidationsprodukte gebildet werden: 8,11-

Epoxy-8,10-octadecadiensäure (8,10-FFA), 9,12-Epoxy-9,11-octadecadiensäure

(9,11-FFA), 10,13-Epoxy-10,12-octadecadiensäure (10,12-FFA) und 11,14-Epoxy-

11,13-octadecadiensäure (11,13-FFA; siehe Abb. 4).

2 Einleitung

17

OCOOH

O

COOH

OCOOH

O

COOH

Abbildung 4: Strukturen der vier unsubstituierten Furanfettsäuren, die durch Oxidation aus CLA entstehen können.

Die Oxidationsrate der CLA wird durch das Lösungsmittel und die Temperatur

bestimmt. CLA können erst oxidieren, wenn der Wasseranteil des Lösungsmittels

über 10% liegt. Je mehr Wasser vorhanden ist, desto stärker werden die CLA

autoxidiert (Yurawecz et al., 1995). Bei Raumtemperatur ist nach 14 Tagen die Hälfte

der CLA oxidiert, während die Halbwertzeit bei 75°C bereits nach sieben Stunden

erreicht ist. Freie CLA werden leichter oxidiert als in Triacylglyceride oder

Phospholipide gebundene CLA (Zhang und Chen, 1997; Eulitz et al., 1999).

2.2.2 Vorkommen und Biosynthese von FFA

Furanfettsäuren wurden erstmals 1966 beschrieben. Morris et al. detektierten damals

eine unmethylierte FFA in einem Samenöl aus Exocarpus, einer Gattung der Familie

der Sandelholzgewächse. Allerdings wird heute davon ausgegangen, dass es sich in

diesem Fall um ein Artefakt der Probenaufarbeitung handelte. Glass et al.

identifizierten 1974 erstmals methylsubstituierte FFA als natürlichen Bestandteil in

Leber- und Testeslipiden des Europäischen Hechts (Esox lucius). Daraufhin wurden

FFA in diversen Süßwasserfischen (Glass et al., 1977; Gunstone et al., 1978) und

Salzwasserfischen detektiert (Gunstone et al., 1978; Ishii et al., 1988; Ota und

Takagi, 1992), wobei diese sowohl in unterschiedlichen Geweben als auch im Blut

vorkommen. Leber und Testes weisen die mit Abstand höchsten Gehalte an

8,11-Epoxy-8,10-octadecadiensäure (8,10-FFA) 9,12-Epoxy-9,11-octadecadiensäure (9,11-FFA)

10,13-Epoxy-10,12-octadecadiensäure (10,12-FFA) 11,14-Epoxy-11,13-octadecadiensäure (11,13-FFA)

2 Einleitung

18

methylsubstituierten FFA auf. Der FFA-Gehalt innerhalb der Leberlipide kann bei

manchen Fischen bis zu 40% betragen (Gunstone et al., 1978).

In den folgenden Jahren wurden methylsubstituierte FFA außerdem in

verschiedenen Pflanzen (Hannemann et al., 1989) nachgewiesen und seit den

1980er-Jahren kristallisierte sich ein ubiquitäres Vorkommen heraus, als FFA auch in

Invertebraten (Okajima et al., 1984), Amphibien, Reptilien (Ishii et al., 1988), Säugern

(Schödel und Spiteller, 1987) sowie in Hefen und anderen Pilzen (Hannemann et al.,

1989), marinen Bakterien (Shirasaka et al., 1995) und Algen (Kazlauskas et al.,

1982) detektiert werden konnten. Aus marinen Schwämmen wurden methyl-

substituierte FFA isoliert, die insofern ungewöhnlich sind, da sie mehrfach

ungesättigte Alkylreste aufweisen (Ciminiello et al., 1991). Auch im menschlichen

Blut sind FFA nachweisbar, wo sie als Cholesterylester vorliegen (Puchta et al.,

1988). Freie, methylsubstituierte FFA sind in lebenden Zellen nicht nachweisbar. FFA

sind stets in veresterter Form als Cholesterylester, Triacylglyceride oder

Phospholipide gespeichert (Gunstone et al., 1976 und 1978; Glass et al., 1975 und

1977; Ota und Takagi, 1992).

Eine de novo-Synthese von methylsubstituierten FFA findet entgegen damaliger

Vermutungen weder in Fischen (Sand et al., 1984) noch in Säugern (Ratten) statt

(Gorst-Allman et al., 1988). Eine Biosynthese von FFA in Pflanzen wurde hingegen

gezeigt. Die Arbeitsgruppe von Spiteller hat anhand von Zuckerrohr-Zellkulturen

(Saccharum spec.) die Biosynthese in Pflanzen untersucht und konnte nachweisen,

dass das Kohlenstoffgrundgerüst aus Acetat, das Sauerstoffatom des Furanringes

aus Luftsauerstoff und die Methylgruppen aus Methionin stammen, sowie dass die

Biosynthese von der Anwesenheit von Calciumionen abhängig ist (Batna und

Spiteller, 1991; Scheinkönig und Spiteller, 1991 und 1993). Batna et al. konnten 1993

in einer Algen-Zellkultur nachweisen, dass Linolsäure (C18:2) der Ausgangsstoff für

die Synthese einer C18-FFA mit einem Pentylrest ist (siehe Abb. 5). FFA mit einem

Propylrest werden aus 9,12-Hexadecadiensäure (C 16:2) gebildet. In beiden Fällen

wird zunächst ein Lipidhydroperoxid (LOOH) gebildet. Diese Reaktion wird von der

Lipoxygenase unter Verwendung von Luftsauerstoff katalysiert. Anschließend kommt

2 Einleitung

19

es zu einer Ringbildung und die β-Positionen des Furanrings werden mono- oder

dimethyliert. Der Säurerest der FFA kann durch den Einbau von Acetat-Einheiten

verlängert werden (Sand et al., 1984; Spiteller, 2005).

Abbildung 5: Biosynthese von Furanfettsäuren (nach Spiteller, 2005).

Des Weiteren können in Fischen vorkommende Bakterien FFA de novo

synthetisieren, wobei ein anderer Syntheseweg als in Pflanzen angenommen wird.

Hierbei wird zunächst cis-Vaccensäure methyliert und durch Einführung einer

zweiten Doppelbindung kann die entstandene zweifach ungesättigte Fettsäure mit

Sauerstoff reagieren. Anschließend kann es zum Ringschluss kommen (Shirasaka et

al., 1997).

Lipoxygenase (LOX) O2

Cyclisierung

FFA mit Pentylrest FFA mit Propylrest

Cyclisierung

Lipoxygenase (LOX) O2

methylsubstituierte FFA mit Pentylrest methylsubstituierte FFA mit Propylrest

Linolsäure (C18:2) 9,12-Hexadecadiensäure (C16:2)

2 Einleitung

20

Anhand der bisherigen Studien kann davon ausgegangen werden, dass alle FFA

ursprünglich in Pflanzen und Algen oder Mikroorganismen biosynthetisiert und über

die Nahrungskette von anderen Organismen aufgenommen werden. Auf diese Weise

sind methylsubstituierte FFA natürlicherweise in Nahrungsmitteln des Menschen zu

finden. Diese wurden somit beispielsweise in diversen Pflanzenölen wie Sojaöl (Guth

und Grosch, 1991) und Olivenöl (Boselli et al., 2000) oder in tierischen Fetten wie

Butter (Guth und Grosch, 1992) und in großen Mengen in Fischölen und Lebertran

(Scrimgeour, 1977; Wahl et al., 1994) detektiert. Unsubstituierte FFA kommen

normalerweise nicht in Lebensmitteln vor, allerdings könnten diese als Nebenprodukt

der CLA aufgenommen werden. Diese Aufnahmequelle könnte in dem Fall, dass

CLA als Nahrungsergänzungsmittel etabliert werden, relevant werden (siehe oben).

2.2.3 Reaktionen von FFA

FFA sind reaktive Verbindungen, die durch Photooxidation (Boyer et al., 1979) oder

Autoxidation (Boyer et al., 1979; Rosenblat et al., 1993) leicht oxidierbar sind.

Außerdem können FFA durch Lipoxygenasen oxidiert werden (Boyer et al., 1979;

Batna und Spiteller, 1994a/b). Die Photo- oder Autoxidation von FFA kann durch

Singulett-Sauerstoff (1O2) hervorgerufen werden, aber auch durch die Anwesenheit

von Radikalen (Takayama et al., 1977). Diese antioxidative Wirkung scheint der

Grund für das Vorkommen von FFA in Pflanzen zu sein. FFA sind sehr effektive

Radikalfänger und können beispielsweise vor der Wirkung von UV-Strahlung und vor

Hydroxyl-Radikalen schützen (Okada et al., 1996; Spiteller, 2008). Außerdem bieten

sie einen Schutz vor Lipidperoxidation (Spiteller, 2007). Zusätzlich könnten die

oxidativen Abbauprodukte eine wichtige Funktion bei der Abwehr von

Schadorganismen haben.

Der Unterschied zwischen methylsubstituierten und nicht-methylsubstituierten FFA

besteht in ihrer Reaktivität und der unterschiedlichen Stabilität der gebildeten

Oxidationsprodukte. Unmethylierte FFA besitzen lediglich eine minimale antioxidative

Wirkung (Okada et al., 1990) und die Reaktivität nimmt mit dem Substituierungsgrad

zu. Sowohl substituierte als auch unsubstituierte FFA können prinzipiell jedoch unter

2 Einleitung

21

OO

(CH2)8-COOHH11C5

CH3H3C

O

H3C CH3

H11C5 (CH2)8-COOH

Ringöffnung zu cis-Dioxoenfettsäuren oxidieren (Schödel und Spiteller, 1985; Jandke

et al., 1988; Abb. 6).

Abbildung 6: Oxidation von methylsubstituierten Furanfettsäuren unter Bildung von cis-Dioxoenfettsäuren.

Die aus nicht-methylsubstituierten FFA entstehenden cis-Dioxoenfettsäuren

isomerisieren anschließend zu trans-Dioxoenfettsäuren (Boyer et al., 1979;

Yurawecz et al., 1997; Eulitz et al., 1999). Diese sind so stabil, dass sie isoliert

werden können und gut charakterisiert sind (Boyer et al., 1979; Batna und Spiteller,

1994a). Die trans-Dioxoenfettsäuren können mit Thiolen wie beispielsweise Cystein

oder Glutathion Thioether bilden (Jandke et al., 1988).

2.2.4 Physiologische Bedeutung und Toxikologie von FFA

Wenn Fremdstoffe wie beispielsweise Furan oder Furanderivate in den Körper

gelangen, werden diese im Darm enzymatisch umgewandelt, um die Hydrophilie zu

erhöhen und das Ausscheiden zu ermöglichen. Die Metaboliten gelangen über die

Blutbahn zur Leber und werden anschließend über Galle oder Urin ausgeschieden.

Bei der Metabolisierung können jedoch reaktive Produkte entstehen. Furan wird

beispielsweise durch CYP2E1 zu einem instabilen Epoxid oxidiert, welches weiter zu

dem reaktiven Dialdehyd cis-Buten-1,4-dial reagiert (Kedderis et al., 1993; Parmar

und Burka, 1993; Chen et al., 1995; Abb. 7). Dieses kann aufgrund des elektrophilen

Charakters der Aldehyde irreversibel an Proteine und Nukleotide binden (Byrns et al.,

2002 und 2006). So lässt sich erklären, dass Furan selbst zwar biologisch inaktiv ist,

jedoch als leber- und nierentoxisch gilt und in Nagern ein Leberkarzinogen ist. Aus

diesem Grund wird Furan von der Weltgesundheitsorganisation WHO als

„möglicherweise krebsauslösend (karzinogen) für den Menschen“ eingestuft.

Oxidation

Furanfettsäure Dioxoenfettsäure

2 Einleitung

22

OR

OR

O

O O

RH

Abbildung 7: Metabolisierung von Furan: CYP2E1 katalysiert die Oxidation von Furan zu einem instabilen Epoxid, das unter Ringöffnung weiter zum reaktiven Dialdehyd cis-Buten-1,4-dial reagiert.

Die Metabolisierung von FFA ist im Detail nicht erforscht. Im Jahr 1979 untersuchten

Spiteller und Spiteller menschlichen Urin auf ihre Fettsäuren hin und fanden

Abbauprodukte der FFA, die sie aufgrund ihrer Herkunft als Urofuransäuren

bezeichneten. Die Hauptmetaboliten von methylsubstituierten FFA im menschlichen

Urin sind die Dicarbonsäuren 3-Carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropansäure und

3-Carboxy-4-methyl-5-pentyl-2-furanpropansäure (Spiteller et al., 1980). Diese

entstehen, indem der Carboxylrest der methylsubstituierten FFA durch β-Oxidaton

bis auf drei Kohlenstoffatome abgebaut wird. Anschließend ist eine Oxidation des

Methylrestes an Position 3 des Furanringes zu einer Carboxylgruppe möglich, so

dass die Dicarbonsäuren entstehen (Schödel et al., 1986). In einer aktuellen Studie

konnte gezeigt werden, dass auch der Säurerest von unsubstituierten FFA über

β-Oxidation bis auf drei Kohlenstoffatome verkürzt werden kann, wobei weder der

Alkylrest noch der Furanring beeinflusst werden (Göckler, 2009). Eine weitere

Metabolisierung wurde bisher nicht untersucht. Ebenfalls ist unklar, ob es in vivo zur

Bildung von toxischen Metaboliten von FFA kommen kann. In vitro konnte gezeigt

werden, dass nach oxidativer Umsetzung mit Rattenlebermikrosomen von 8,10-,

9,11- und 10,12-FFA Epoxide entstehen können, die jedoch in der GC-MS-Analyse

instabil und nur über ihre Reaktionsprodukte nachweisbar waren (Göckler, 2009).

Solche elektrophilen Epoxide der FFA sind unter toxikologischen Gesichtspunkten

interessant, da die Möglichkeit besteht, dass sie mit nukleophilen Gruppen reagieren

und Protein- oder DNA-Addukte bilden könnten, welche zu Schädigungen bis hin zu

Mutationen führen könnten. Das Vorkommen solcher Metaboliten in humanen Zellen

wurde jedoch bisher nicht untersucht.

CYP2E1

Furan cis-Buten-1,4-dial

2 Einleitung

23

Zur Toxizität von FFA gibt es nur wenige Untersuchungen. Eine unsubstituierte,

ungesättigte FFA mit 20 Kohlenstoffatomen, die in einem Schwamm (Hymiaridon

bauraki) als Sterylester vorliegt, wirkte in einer Untersuchung mit einer murinen

Monozyten-Makrophagen Zelllinie und einer Primaten-Nierenzelllinie zytotoxisch

(Prinsep et al., 1994). Eine weitere Studie zeigte, dass eine aus Schwämmen

isolierte, unsubstituierte FFA mit 22 Kohlenstoffatomen stark zytotoxisch auf die

humane Kolonkarzinom-Zelllinie COLO-250 und schwach zytotoxisch auf die

humane Nasopharynx-Zelllinie KB-16 wirkt (Shen et al., 2001). Zur Toxizität von

unsubstituierten, gesättigten C18-FFA gibt es bislang keine Studien.

2.3 In vitro-Zellmodelle zur Untersuchung der Fettsäuren

Zur Untersuchung der zellulären Wirkungen der CLA und FFA wurden in dieser

Arbeit die humane Kolon-Adenokarzinomzelllinie Caco-2 und die humane

hepatozelluläre Karzinomzelllinie HepG2 verwendet.

Die Caco-2-Zellen stammen aus einem Adenokarzinom des Kolons eines 72-jährigen

männlichen Kaukasiers (Fogh et al., 1977). Sie besitzen durch eine Mutation im

APC-Gen eine erhöhte β-Catenin Expression im Cytosol und induzieren somit die

β-Catenin-TCF4-Signalkaskade, die mit einer Induktion von PPARβ/δ und einer

Hyperproliferation der Tumorzellen einhergehen könnte (Ilyas et al., 1997;

Mariadason et al., 2001). Die Zelllinie Caco-2 besitzt eine herausragende Rolle, da

sie spontan differenzieren kann und somit ein weit verbreitetes in vitro-Modell für den

menschlichen Darm darstellt. Auf dem Differenzierungsprozess beruht die

kontinuierliche Erneuerung des Darmepithels. Aus proliferierenden Stammzellen

entstehen durch Differenzierung die vier Darmzelltypen Enterozyten, Becherzellen,

enteroendokrine Zellen oder Paneth-Zellen. Die Enterozyten bilden den Hauptanteil

an differenzierten Dünndarmzellen.

Proliferierende Caco-2-Zellen beginnen spontan den Differenzierungsprozess,

nachdem sie den konfluenten Zustand erreicht haben. Nach etwa dreiwöchiger

Kultivierung unter Standardbedingungen ist der Differenzierungsprozess

2 Einleitung

24

abgeschlossen. Differenzierte Caco-2-Zellen weisen mehrere morphologische und

biochemische Charakteristika von reifen Enterozyten des Dünndarms auf (Pinto et

al., 1983). Die differenzierten Zellen wachsen in einem epithelialen Monolayer und

zeigen eine zylindrische Morphologie mit einer deutlich ausgebildeten

Bürstensaummembran auf der apikalen, dem Medium zugewandten Seite (Hidalgo et

al., 1989). Hier sind typische Enzyme des Dünndarms wie beispielsweise die

Sucrase-Isomaltase, Intestinale Alkalische Phosphatase (IAP), Lactase und

Aminopeptidase N exprimiert (Zweibaum et al., 1984). Zudem entwickeln die

differenzierten Caco-2-Zellen Tight Junctions als Zell-Zell-Kontakte (Hidalgo et al.,

1989).

Die 1975 etablierte hepatozelluläre Karzinomzelllinie HepG2 entstammt dem

primären Hepatoblastom eines 15-jährigen argentinischen Jungens (Aden et al.,

1979). Die Morphologie der Zellen ist flach und polygonal und sie besitzen eine

Länge von 18 bis 23 μm. Die adhärenten Zellen wachsen größtenteils als Monolayer

in kleinen Aggregaten (Knowles et al., 1980). Im Zellrasen zeigten die Zellen

epithelioides Wachstum. Die HepG2-Zelllinie wurde als in vitro-Modell für die Leber

gewählt, da die HepG2-Zellen weitgehend normale Leberfunktionen besitzen und

viele Eigenschaften der primären Hepatozyten inklusive einer metabolischen

Aktivierung verschiedener Xenobiotika besitzen (Knowles et al., 1980; Lu und Huang

1994; Rueff et al., 1996; Urani et al., 1998). Im Vergleich zu primären Hepatozyten ist

die metabolische Aktivität allerdings gering (Rodriguez-Antona et al., 2002).

2 Einleitung

25

2.4 Zielsetzung

Mit Hilfe einer hypothesefreien proteomischen Screeningmethode sollen molekulare

Signal- und Stoffwechselwege entschlüsselt werden, die durch CLA in humanen

Darmzellen beeinflusst werden. Hierfür sollen die Effekte des potenten Minorisomers

t10,c12-CLA auf die Kolon-Adenokarzinomzelllinie Caco-2 mittels zweidimensionaler

Gelelektrophorese und Massenspektrometrie (MALDI-TOF) untersucht werden. In

einem parallelen Ansatz sollen die Effekte des zugehörigen Oxidationsproduktes der

t10,c12-CLA, die 10,12-FFA, auf das Proteom von Caco-2-Zellen analysiert werden,

um einen Vergleich der molekularen Wirkungen von CLA und FFA zu erlangen.

Des Weiteren soll im Rahmen dieser Arbeit erstmalig eine detaillierte toxikologische

Charakterisierung der Isomere 8,10-, 9,11-, 10,12- und 11,13-FFA, die nachweislich

durch Oxidation von CLA entstehen können, durchgeführt werden. Unter

Verwendung der Zelllinie Caco-2 sollen verschiedene toxikologische Parameter zur

Zytotoxizität, zellulären Proliferation und Apoptose getestet werden. Auf der Basis

der Hypothese, dass der Furanring der FFA metabolisch zu elektrophilen Epoxiden

aktiviert werden könnte, soll zusätzlich die metabolisch aktive hepatozelluläre

Karzinomzelllinie HepG2 in diese Studien mit einbezogen werden. Zudem soll

geprüft werden, ob FFA wie zahlreiche andere Fettsäuren die Fähigkeit besitzen, an

die Peroxisomen-Proliferator-aktivierte-Rezeptoren zu binden und diese zu

aktivieren. Schließlich soll das genotoxische Potential der FFA in einem in vitro-

Mikrokerntest und im Ames-Test bestimmt werden.

Die im Rahmen dieser Arbeit generierten Daten sollen einen Beitrag zur

Risikobewertung von FFA leisten, die Oxidationsprodukte der CLA darstellen und bis

dato toxikologisch nicht charakterisiert sind.

3 Material

26

3 Material

3.1 Zelllinien

Die Zelllinie Caco-2 ist eine permanente Zelllinie aus einem humanen

Adenokarzinom des Kolons (Fogh et al., 1977) und wurde von der ECACC

(European Collection of Cell Cultures, Nr. 860 10 202) bezogen. Die Zellen wachsen

in Kultur als epithelialer Monolayer und differenzieren spontan nach Erreichen der

Konfluenz. Die Zelllinie HepG2 (ECACC, Nr. 850 11 430) ist eine humane

hepatozelluläre Karzinomzelllinie. Die adhärenten, epithelialen Zellen wachsen als

Monolayer und in kleinen Aggregaten (Knowles et al., 1980). Die humane

embryonale Nierenzelllinie HEK293-T, kurz HEK-T (American Type Culture

Collection (ATCC) Nr. CRL-11268), weist eine hohe Transfektionseffizienz auf und

wurde daher für den Transaktivierungsassay verwendet (Abschnitt 4.2.5). Für die

Passagierung der adhärenten HEK-T-Zellen wurde kein Trypsin verwendet, die

Zellen lösten sich bereits durch leichtes Klopfen an die Zellkulturflasche.

3.2 Zellkulturmedien und Zusätze

DMEM high glucose + L-Glu & Na-Pyruvat PAA, Cölbe

RPMI1640 + GlutaMAX™-I + 25 mM HEPES Invitrogen, Karlsruhe

Fötales Kälberserum (FKS) PAA, Cölbe

Penicillin/Streptomycin (100 x) PAA, Cölbe

3.3 Fettsäuren

8,11-Epoxy-8,10-octadecadiensäure Universität Hamburg, Prof. Steinhardt

9,12-Epoxy-9,11-octadecadiensäure Biotrend, Köln

9(Z),11(E)-Octadecadiensäure Biotrend, Köln

10,13-Epoxy-10,12-octadecadiensäure Larodan, Malmö (S)

10(E),12(Z)-Octadecadiensäure Biotrend, Köln

11,14-Epoxy-11,13-octadecadiensäure Universität Hamburg, Prof. Steinhardt

3 Material

27

Die 8,10-FFA und 11,13-FFA wurden von der Arbeitsgruppe um Prof. Dr. Dr. Hans

Steinhart (Institut für Biochemie und Lebensmittelchemie, Universität Hamburg)

synthetisiert und im Rahmen des DFG-Verbundprojekts „Lipidnet“ zur Verfügung

gestellt.

3.4 Laborgeräte und Laborhilfsmittel

Absaugvorrichtung für Zellkultur neoLab Migge Laborbedarf, Berlin

Agfa Arcus II densitometer Biostep, Meinersdorf

Analysenwaage Sartorius, Göttingen

Blot-Apparatur Fast Blot B33 Biometra, Göttingen

ChemiDoc-XRS-System BioRad, München

CO2-Inkubator Heraeus, Hanau

ETTAN IPGphor® 3 IEF System GE Healthcare, Chalfont St.Giles (UK)

ETTAN Dalt twelve® separation unit GE Healthcare, Chalfont St.Giles (UK)

Gene Genius Bio Imaging System-Anlage Syngene, Cambridge (UK)

InvestigatorTM ProPicTM workstation Genomic Solutions, Ann Arbor (USA)

Kompaktschüttler KS 15 Edmund Bühler GmbH, Hechingen

Magnetrührer RH basic 2 IKA, Staufen

Mehrkanalpipette (8-/12-Kanal), 30-300 µl Eppendorf, Hamburg

Meßpipetten (5, 10, 20 ml), Blauband VWR International, Darmstadt

Mikroskop Labovert Leitz, Wetzlar

Mikrowelle Bosch, Gerlingen-Schillerhöhe

Mikrozentrifuge Roth, Karlsruhe

Mithras Multimode Reader LB 940 Berthold Technologies, Wien (A)

Multifuge 1S-R (Falcon-Zentrifuge) Heraeus, Hanau

Mx3005PTM Real-time Cycler Stratagene, Amsterdam (NL)

Nalgene Einfriercontainer VWR International, Darmstadt

NanoDropTM 1000 Spektrophotometer Nanodrop Techn., Wilmington (USA)

Niederspannungsnetzteil Power Pack P25 Biometra, Göttingen

PCR-Werkbank Heto-Holten, Allerod (DK)

3 Material

28

pH-Meter CG 837 Schott Instruments, Mainz

Pipetten (0,5 – 2.500 μl) Eppendorf, Hamburg

Pipettierhilfe Eppendorf, Hamburg

ProXPRESS®fluorescence PerkinElmer Lifesciences, Waltham,

imaging workstation Massachusetts (USA)

Schüttler für 96-well-Platte Heidolph, Schwabach

Sterilwerkbank HERAsafe KS15 Heraeus, Hanau

Thermomixer Eppendorf, Hamburg

Tischzentrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg

Ultraflex II Massenspektrometer Bruker, Bremen

Ultraschall Homogenisator Bandelin electronic, Berlin

Sonoplus HD 2070

Ultrazentrifuge Optima LE-80K Beckmann, München

Vortexer Heidolph, Kehlheim

Wasserbad GFL, Burgwedel

Zählkammer Neubauer Hennberg-Sander, Gießen

3.5 Verbrauchsmaterialien

6- bis 96-well Mikrotiterplatten Greiner bio-one, Frickenhausen

Falcon-Röhrchen (15 und 50 ml) Fischerbrand, Schwerte

Fast Optical 96 Well Reaction Plate Applied Biosystems, Darmstadt

Filterpapier Amersham Biosciences, Freiburg

Nalgene Kryoröhrchen VWR International, Darmstadt

Nitrocellulosemembran HybondTMECLTM Amersham Biosciences, Freiburg

Pasteurpipetten VWR International, Darmstadt

Pipettenspitzen 0,5-2.500 µl Eppendorf, Hamburg

Reaktionsgefäße (2, 1,5 und 0,5 ml) Eppendorf, Hamburg

Sterilfilter (0,45 µm), Whatman Schleicher & Schnell, Dassel

Zellkulturflaschen mit Filter, steril 75/ 25 cm2 Greiner bio-one, Frickenhausen

Zellschaber Greiner bio-one, Frickenhausen

3 Material

29

3.6 Reagenzien und Chemikalien

Sämtliche gängige Chemikalien, die nicht extra aufgeführt sind, wurden in

p.a.-Qualität von den Firmen Merck (Darmstadt), Sigma-Aldrich (Taufkirchen) oder

Carl Roth (Karlsruhe) bezogen.

Reagenzien und Chemikalien für Zellkultur und Zellassays

Ac-DEVD-AMC Calbiochem, Darmstadt

BSA (fettsäurefrei), 96% lyophylisiert Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Camptothecin Sigma-Aldrich, Taufkirchen

DMSO Sigma-Aldrich, Taufkirchen

GW501516 Enzo Life Sciences, Lörrach

GW7647 Calbiochem, Darmstadt

Insulin Transferrin Selenium (100 x ITS) Invitrogen, Karlsruhe

LipofectaminTM2000 Transfektionsreagenz Invitrogen, Karlsruhe

Neutralrot Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Ölrot-O Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Opti-MEM® Invitrogen, Karlsruhe

Troglitazon Biozol, Eching

Trypsin-EDTA PAA, Cölbe

Vectashield mounting Medium Vector laboratories, Peterborough(UK)

Reagenzien und Chemikalien für proteinbiochemische Arbeiten

Agarose Merck, Darmstadt

Anchor 600 Target Bruker Daltonics, Billerica, MA (USA)

APS, p.a. Serva, Heidelberg

Bromphenolblau Merck, Darmstadt

BSA (Albumin Fraktion V) Roth, Karlsruhe

DeStreak-Reagenz GE Healthcare, Chalfont St.Giles (UK)

Mineralöl (Drystrip Cover Fluid) GE Healthcare, Chalfont St.Giles (UK)

ECL Plus Western Blotting Detektionsreagenz AmershamBiosciences, Freiburg

Glycin Serva, Heidelberg

3 Material

30

HCCA-Matrix Bruker Daltonics, Billerica, MA (USA)

IPG-Gelstreifen, 24 cm, pH3-10 GE Healthcare, Chalfont St.Giles (UK)

Pepmix Standard 1000-4000 Care, Bremen

Ponceau-Rot Roth, Karlsruhe

Precision Plus Protein Western C Standard BioRad, München

Protease-Inhibitor Mix Calbiochem, Darmstadt

Protease-Inhibitor Cocktail Set III Merck, Darmstadt

Proteome Grade Wasser BioRad, München

SDS Serva, Heidelberg

TBE-Puffer 0,5 x Merck, Darmstadt

TEMED, 99% Serva, Heidelberg

TRIS, 99,9% Roth, Karlsruhe

Tween 20 Fluka AG, Buchs (CH)

Reagenzien und Chemikalien für RNA-Isolierung und qPCR

ABsolute qPCR SYBR Green Mix plus ROX ABgene, Hamburg

Desoxyribonukleosidtriphospat Promega, Mannheim

M-MLV Reverse Transkriptase Promega, Mannheim

M-MLV RT 5x Reaktions-Puffer Promega, Mannheim

Oligo (dT)15Primer Promega, Mannheim

Random-Hexamer-Primer Applied Biosystems, Darmstadt

RNasin Plus Promega, Mannheim

Wasser (RNase/ DNase frei) Fluka AG, Buchs (CH)

3.7 Molekular- und zellbiologische Kits

BioRad-Protein-Assay BioRad, München

Caspase-Glo®3/7 Assay Promega, Mannheim

Zellproliferationsreagenz WST-1 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden

3 Material

31

3.8 Primer und Antikörper

In Tabelle 2 sind die verwendeten Primer mit ihren Sequenzen aufgelistet.

Tabelle 2: Primersequenzen der untersuchten Gene

Gen Sequenz

human β-actin Forward

5´- gac aag tct gtg caa tgg atc aa - 3´

Reverse

5´- ata cga gac aca gcc tgg tag at - 3´

human TST Forward

5´- acg cac gtg gtg gtg tat aa - 3´

Reverse

5´- gcc acc act gag cac tga ta - 3´

human CES1 Forward

5´- agg agc tct tgg aga cga ca - 3´

Reverse

5´- tca atc aca gtg ccc aga ag - 3´

human BDH2 Forward

5´- caa gcc aga gga aat cct ga - 3´

Reverse

5´- acg cag agc atg gct att tc - 3´

Für die Westernblot-Analysen wurden folgende Antikörper verwendet:

anti-β-Actin Dunn Labortechnik, Asbach

anti-BDH2/ DHRS6 Everest Biotech, Oxfordshire (U.K.)

anti-CES1 Santa Cruz Biotech., Santa Cruz (USA)

anti-Rhodanese (anti-TST) Santa Cruz Biotech., Santa Cruz (USA)

3.9 Software

Delta2D (Version 3.6) Decodon, Greifswald

Ingenuity Pathway Analysis (Version 9) Ingenuity Systems, Redwood City (USA)

MASCOT-Plattform Matrixscience, London (U.K.)

Phoretix 1D advanced software Biostep, Meinersdorf

SwissProt-Datenbank http://www.expasy.ch

4 Methoden

32

4 Methoden

4.1 Zellbiologische Verfahren

4.1.1 Kultivierung

Die Kultivierung der verwendeten humanen Zelllinien erfolgte in 75 cm2-

Zellkulturflaschen in einem CO2-Brutschrank (CO2-Gehalt 5%) bei einer Temperatur

von 37°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 95%. Alle Arbeiten mit lebenden

Zellen wurden unter einer Sterilwerkbank durchgeführt.

Caco-2- und HEK-T-Zellen wurden in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)

mit 4,5 g Glucose, L-Glutamin und Natrium-Pyruvat kultiviert, HepG2-Zellen in

Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI-1640). Die Medien enthielten i.d.R.

10% hitze-inaktiviertes fötales Kälberserum (FKS) und 1% (v/v) Penicillin-

Streptomycin-Lösung („Komplettmedium“). Das Zellmedium wurde im Durchschnitt

alle drei Tage erneuert. Die Passagierung der Zellen erfolgte nach Entfernen des

Mediums und einmaligen Waschens mit PBS durch Behandlung mit 1 ml einer

Trypsin-EDTA-PBS-Lösung (0,2% Trypsin). Anschließend wurden die abgelösten

Zellen in frischem, 37°C warmen Medium aufgenommen und 5 min bei 350 x g

abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in frischem Medium resuspendiert und die

Zellen auf neue Zellkulturgefäße verteilt.

4.1.2 Einfrieren und Auftauen der Zellen

Zur Lagerung der Zelllinien wurden die trypsinierten, pelletierten Zellen in einem auf

4°C vorgekühlten speziellen Einfriermedium (70% DMEM bzw. RPMI, 20% FKS,

10% DMSO) aufgenommen. Der Inhalt einer 75 cm2-Zellkulturflasche wurde auf fünf

Kryoröhrchen (1 ml) verteilt. Um die Zellen stufenweise auf -80°C herunter zu kühlen,

wurden die Kryoröhrchen in einen auf 4°C vorgekühlten, mit Isopropanol isolierten,

Einfriercontainer gestellt und üN in einem -80°C-Gefrierschrank aufbewahrt. Am

folgenden Tag wurden die Zellen zur permanenten Lagerung in einen Behälter mit

flüssigem Stickstoff (–196°C) umgesetzt.

4 Methoden

33

Zur Kultivierung wurden die gefrorenen Zellsuspensionen bei 37°C schnell aufgetaut

und sofort in 9 ml vorgewärmtem Medium aufgenommen, um der toxischen Wirkung

des DMSO entgegenzuwirken. Nach einer Zentrifugation bei 350 x g wurde das

Zellpellet in 1 ml Medium resuspendiert und in eine 25 cm2-Zellkulturflasche mit 9 ml

Medium ausgesät. Am folgenden Tag wurde das Medium gewechselt, um die

abgestorbenen Zellen zu entfernen.

4.1.3 Zellzahlbestimmung

Zur Bestimmung der Zelldichte einer Zellsuspension wurde ein Aliquot der

Suspension in einer Neubauer-Zählkammer (0,1 mm Tiefe; 0,0025 mm2) ausgezählt.

Hierfür wurden die Zellen mit Trypsin vom Flaschenboden gelöst und vereinzelt.

Nach Aufnahme in einem definierten Volumen Medium wurden 40 µl der

Zellsuspension im Verhältnis 1:1 mit Trypanblau (0,4%) gemischt und auf das

Zählfeld pipettiert. Es erfolgte die Auszählung der farblosen, lebenden Zellen in vier

Großquadraten. Der Mittelwert der gezählten Zellen wurde gebildet und

anschließend mit dem Verdünnungsfaktor 2 und dem Volumenfaktor 1 x 104

multipliziert. Das Produkt stellte die Anzahl lebender Zellen pro ml Medium dar.

4.1.4 Inkubation mit Testsubstanzen (Fettsäuren)

Die Zellen wurden in einer definierten Zellzahl ausgesät und üN unter

Normalbedingungen kultiviert. Am Folgetag wurde das Medium abgenommen und

mit Medium ersetzt, das die Testsubstanzen enthielt. Für die Inkubationsansätze

wurde serumfreies Medium mit 1% Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) und 0,1 mg/ml

Rinderserumalbumin (BSA) verwendet („Inkubationsmedium“). Die zu testenden

Substanzen wurden mit fettsäurefreiem BSA im molaren Verhältnis von 4:1 versetzt

(Beispiel: 100 µM FS + 25 µM BSA) und dann ins Versuchsmedium gegeben.

Sämtliche Testsubstanzen waren in DMSO gelöst. Die DMSO-Konzentration wurde

für jeden Inkubationsansatz angepasst, wobei die Endkonzentration an DMSO

maximal 1% betrug. Als Negativkontrolle dienten stets unbehandelte Zellen, die

4 Methoden

34

ebenfalls mit der entsprechenden Konzentration DMSO inkubiert wurden (DMSO-

Kontrolle).

4.2 Zellassays

4.2.1 Lipidfärbung

Für die Lipidfärbung wurden Caco-2-Zellen in mit Deckgläsern (13 mm Durchmesser)

bestückten 24-well-Platten kultiviert. Pro well wurden 40.000 Caco-2-Zellen

ausgesät. Nach einer Kultivierung üN im CO2-Brutschrank wurde das Medium

abgenommen und mit Inkubationsmedium ersetzt, das die Testsubstanzen enthielt

(Abschnitt 4.1.4). Für jede Probe wurde eine Doppelbestimmung durchgeführt. Nach

48 h wurde eine Ölrot-O-Färbung zur spezifischen Färbung von Triacylglyceriden

durchgeführt. Hierfür wurden die Zellen zunächst einmal mit PBS gewaschen und

anschließend für 1 h mit 3,7% Formaldehydlösung fixiert. Die Färbung erfolgte für 1 h

mit 0,3%iger Ölrot-O-Lösung (in 60% Isopropanol) im Dunkeln. Zur Visualisierung

der Färbung wurden die Deckgläschen mit den angefärbten Caco-2-Zellen nach

unten auf einen mit 10 μl Vectashield mounting Medium benetzten Objektträger

platziert, mit H2Odest gewaschen und mikroskopisch ausgewertet.

4.2.2 Proliferation

Zur Messung des Proliferationsverlaufes der Zellen unter Einwirkung der

Testsubstanzen wurde das Zellproliferationsreagenz WST-1 verwendet. Hiermit ist

ein colorimetrischer Nachweis zur Bestimmung der Anzahl lebender, proliferierender

Zellen möglich. Der Test beruht auf der enzymatischen Spaltung des wasserlöslichen

Tetrazoliumsalzes WST-1 durch mitochondriale Dehydrogenasen. Die Entstehung

des dunkelroten Formazan-Farbstoffes korreliert mit der Anzahl proliferierender

Zellen.

Die Zellen wurden mit 100 µl ihres jeweiligen Komplettmediums in 96-well Platten

kultiviert. Caco-2-Zellen wurden mit 5.000 Zellen je well ausgesät und HepG2-Zellen

4 Methoden

35

mit 10.000 Zellen je well. Nach einer üN-Kultivierung im CO2-Brutschrank wurde das

Medium abgenommen und durch 100 µl Inkubationsmedium ersetzt, das die

Testsubstanzen enthielt (Abschnitt 4.1.4). Für jede Probe wurde eine

Fünffachbestimmung durchgeführt. Alle Zelllinien wurden drei Tage mit den

Testsubstanzen inkubiert. Zur Messung der Proliferationsrate wurden 10 µl des

WST-1-Reagenz in jedes well gegeben. Der Farbumschlag wurde nach einer

30minütigen Inkubation im Brutschrank bei einer Wellenlänge von 450 nm im Mithras

Multimode Reader LB 940 Photometer gemessen. Als Leerwert diente WST-1 in

Medium ohne Zellen. Nach Abzug des Leerwertes wurden die unbehandelten Zellen

(DMSO-Kontrolle) als 100% Wachstum definiert und alle anderen Proben auf diesen

Wert bezogen.

4.2.3 Zytotoxizität

Zur Messung der zytotoxischen Wirkung von Testsubstanzen wurde der

Neutralrotassay angewendet. Aussaat und Inkubation der Zellen erfolgte

entsprechend den Angaben zum Proliferationsassay (Abschnitt 4.2.2). Nach der

Inkubation der Testsubstanzen für drei Tage wurde das Medium entfernt und die

Zellen mit 200 µl frisch angesetzter Neutralrot-Gebrauchslösung (0,4%-

Neutralrotlösung 1:80 in Medium verdünnt) versetzt und für 3 h bei 37°C im CO2-

Brutschrank inkubiert. Alle lebenden Zellen nehmen den Farbstoff Neutralrot in ihre

Lysosomen auf. Anschließend wurden die wells zweimal mit je 100 µl PBS

gewaschen. Eine Zugabe von 200 µl essigsaurer Ethanollösung (50% EtOH, 1%

Eisessig) diente der Farbentwicklung. Durch 15minütiges Schütteln bei RT wurde

eine Homogenität der Farbe erreicht und die Ansätze konnten bei 540 nm

photometrisch vermessen werden. Die Werte der unbehandelten Zellen (DMSO-

Kontrolle) wurden als 100% Wachstum (entspricht 0% Zytotoxizität) gesetzt.

4.2.4 Apoptose

Zur Messung der Apoptose-induzierenden Wirkungen von Testsubstanzen wurden

die Zellen für 24 h mit verschiedenen Konzentrationen der Testsubstanzen inkubiert

4 Methoden

36

(Abschnitt 4.1.4). Anschließend wurde die Caspase-3-Aktivität gemessen. Als

Positivkontrolle diente das Tumortherapeutikum Camptothecin in einer Konzentration

von 25 µM. Die Werte der unbehandelten Zellen (DMSO-Kontrolle) wurden auf 1

gesetzt und alle anderen Proben auf diesen Wert bezogen, um eine Zunahme der

Apoptose zu visualisieren. Die Induktion der Caspase-3-Aktivität in Caco-2-Zellen

wurde mit Hilfe des Caspase-3-Substrates (Ac-DEVD-AMC, Cal