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BIOspektrum | 03.14 | 20. Jahrgang

AMY L. BEYNON, LINDSAY PARKES

CHROMATRAP, INSTITUTE OF LIFE SCIENCES 2, SWANSEA UNIVERSITY,

SINGLETON PARK, UK

Isolation of good quality, suitably fragmented chromatin is the mostimportant prerequisite for successful chromatin immunoprecipitation.Chromatin can be sheared enzymatically or by mechanical methods suchas sonication. Enzymatic shearing can be advantageous where expensivesonication equipment is not available or where native chromatin is to beexamined. Illustrated here is the effectiveness of enzymatic shearing inthe fragmentation and isolation of high quality ChIP grade chromatin. Wealso highlight comparable data for enzymatic shearing versus sonication.

10.1007/s12268-014-0445-y© Springer-Verlag 2014

ó Die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)ist eine effektive Methode zur Aufklärung vonProtein/DNA-Interaktionen, die zu einem besseren Verständnis der Genregulations -mechanismen beiträgt. Ein wichtiger Schrittim ChIP-Prozess ist die Präparation von Chro-matinfragmenten mit einer Länge zwischen100 und 500 Basenpaaren. Diese Fragmentewerden entweder durch mechanisches Scheren mit Ultraschall (z. B. Chromatrap®Spin Column Sonication Kit, Porvair Scien-ces) oder durch Verdau mit Restriktionsen-zymen (z. B. mit dem Chromatrap Enzyma-tic Shearing Kit, Porvair Sciences) gewonnen.Der enzymatische Verdau ist eine kosten-günstigere Alternative zum mechanischenScheren, da diese Methode ohne teure Gerä-te auskommt und die Behandlung schonen-

der ist. Die Vor- und Nachteile der beidenMethoden sind in Tabelle 1 zusammenge-fasst.

Zum Vergleich der Effizienz der beidenMethoden für die Chromatinpräparation wurde nach dem Chromatinaufschluss eineChIP zur Anreicherung von hoch abundan-tem Histon 3 (H3) auf Glycerinaldehyd-3-phos-phat-Dehydrogenase(GAPDH)-Genloci durch-geführt.

ChromatinpräparationDas Chromatin wurde aus der humanen Endo -metriumzelllinie Hec50 gewonnen [1, 2]. Fürdie Isolierung von Chromatin wurden eineMillion Hec50-Zellen sowohl mit dem Chro-matrap Enzymatic Shearing Kit als auch mitdem Chromatrap Spin Column Sonication Kit

nach Standardprotokoll verarbeitet (Abb. 1).Die Zellen wurden kurz bis zu einer Kon-fluenz von etwa 80 Prozent kultiviert undanschließend durch Zugabe von einem Pro-zent Formaldehyd durch Kreuzvernetzungfixiert. Danach wurde die Reaktion mit Glycingestoppt und die Zellen in eiskaltem PBS- Puffer gesammelt. Anschließend wurden dieZellen abzentrifugiert, wobei der Überstandverworfen und die Zellen zur Lyse der Zell-membranen in hypotonem Puffer resuspen-diert wurden. Für das enzymatische Scherenwurden die freigesetzten Zellkerne abzentri-fugiert und zur nukleären Chromatinverdau-ung in Digestionspuffer resuspendiert.

Ein 10-μl-Aliquot der Zellkernsuspensionwurde entnommen und lysiert, um die unge-fähre Konzentration mithilfe eines NanoDrop-Spektrophotometers zu messen. Ausgehendvon dieser Konzentration wurde das ange-messene Volumen des Scher-Cocktails zujeder Zellkern-Stammsuspension in einemVerhältnis von einem U/5  μg Chromatin hinzugefügt und diese bei 37 °C für fünfMinuten inkubiert. Die Reaktion wurde mitenzymatischer Stopplösung gestoppt und dieSuspensionen auf Eis gestellt. Die Zellkernewurden wiederum abzentrifugiert und durchZugabe von Puffer lysiert. Zum Schluss wur-den die Suspensionen zentrifugiert, damitsich die Zelltrümmer als Pellet absetzen, undder Überstand, der das gescherte Chromatinenthält, in ein frisches Mikrozentrifugen-röhrchen überführt. Ein 25-μl-Aliquot einerChromatinprobe wurde entnommen und nachReversion der Kreuzvernetzung mit Pro -teinase K verdaut, um die Konzentration zumessen und die Chromatinqualität mittelsAgarosegelelektrophorese zu bewerten(Abb. 1).

Bei der Chromatinpräparation mittels Ultra-schall wurden die Zellkerne nach Lyse derZellmembranen durch Zugabe mit Lyse-Pufferfreigesetzt und die isolierte Zellkernfraktionabzentrifugiert. Das Chromatin wurde imUltraschall-Wasserbad mit 30-Sekunden-Wel-len und in 30-Sekunden-Intervallen für 15Minuten fragmentiert, um optimale Frag-

DNA-Aufbereitung

Isolierung von Chromatin für die Target-Anreicherung

Tab. 1: Schermethoden für die Chromatinpräparation.

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mentierungslängen von 100 bis 500 Basen-paaren zu erzielen (Abb. 1, 2).

Antikörper-/Gen-Targets undImmunpräzipitationAls Antikörper-Target für die Studie dientedas Core-Histon H3, dessen Modifikation einehäufige epigenetische Markierung darstellt.H3 – eines von vier Histonen, die die Pro-teinkomponente des Chromatins aufbauen –kommt in den Chromosomen überall vor unddient deshalb als abundantes Antikörper-

Target für die ChIP. Des Weiteren bietetder Glycerinaldehyd-3-phosphat-De hydro -genase (GAPDH)-Locus ein abundantes Gen-Target und wird in allen Zelltypen aktiv expri-miert [3].

Für die Immunpräzipitation wurde dasChromatin in einer Konzentration von50 ng/μl eingesetzt. Dabei wurden Suspen-sionen mit 1 μg Gesamtchromatin und 2 μgdes relevanten Antikörpers hergestellt. DieChIP wurde mit einem Chromatrap-Pro-A-Auf-reinigungssäulen-Kit nach Standardprotokoll

durchgeführt. Parallel dazu wurden Kontrol-len präpariert, die 1 μg Chromatin von jederZelllinie in einem Gesamtvolumen von 20 μlenthielten. Die Kontrollen wurden keinerChIP-Anreicherung unterzogen. Nach der Elu-tion erfolgte die Reversion der Kreuzvernet-zung der Proben und der Kontrollen sowieein Proteinase-K-Verdau zur Freisetzung vonfür die qPCR geeigneter DNA. Jede Chroma-tin-Antikörper-Kombination wurde dreifachdurchgeführt, um die Reproduzierbarkeit derAnreicherung durch mit dem Kit gewonne-nes Chromatin nachzuweisen.

qPCREin Vorteil des Chromatrap-Aufreinigungs-säulen-Kits ist die Eignung des Puffersystemsfür den direkten Übergang zur nachfolgen-den Verarbeitung, ohne dass eine DNA-Auf-reinigung erforderlich ist. Die qPCR wurdeverwendet, um die Präzipitation von GAPDH-Genloci unter Verwendung von gegen H3gerichteten Antikörpern zu analysieren. Dar-über hinaus wurde die Präzipitation dieserLoci mittels nicht-spezifischer Immunglobu-lin-G(IgG)-Antikörper festgestellt. Der pro-

˚ Abb. 1: Chromatin-Fragmentierung mittels enzymatischem Verdau (A) und Ultraschall (B) für die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP). WeitereErklärungen im Text.

A B

¯ Abb. 2: Agarosegelelektrophorese mit einemHec50-Chromatin-Präparat nach enzymati-schem Scheren (Chromatrap® Enzymatic Shearing Kit, Porvair Sciences) und mechani-schem Scheren mit Ultraschall (Chromatrap®

Spin Column Sonication Kit, Porvair Sciences).A, Enzymatisches Scheren: Das Bandenmusternach enzymatischem Verdau zeigt Fragmentevon 200, 400 und 600 Basenpaaren. B, Mecha-nisches Scheren mit Ultraschall: Bei dem nachUltraschallbehandlung gewonnenen Chromatinsind einheitliche Chromatinfragmentlängen zwi-schen 100 und 500 Basenpaaren zu sehen.

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zentuale Anteil von echten Signalen wurdeals Anteil des Chromatin-Inputs berechnetund unter Verwendung des durch die nicht-spezifische Bindung von unspezifischem IgGerzeugten Signals normalisiert.

ErgebnisseDie Immunpräzipitation mit 1 μg Chromatin(entspricht ca. 160.000 Zellen) führte zueinem zwölf- und 16-fachen Anstieg der spe-zifischen H3-Anreicherung am GAPDH-Pro-motor, verglichen mit dem nicht-spezifischenIgG, und zwar sowohl bei enzymatisch

geschertem als auch bei Ultraschall-gescher-tem Chromatin (Abb. 3). Dies zeigt ein hohesSignal-Rausch-Verhältnis und weist auf einegute Reproduzierbarkeit sowie eine geringeVariabilität zwischen den Proben hin, die vonder Anfangszellzahl unabhängig ist.

FazitEnzymatisches Scheren mit dem ChromatrapEnzymatic Shearing Kit stellt eine kostenef-fizienten Alternative zur Ultraschallbehand-lung dar und ist für die Präparation von Chro-matin für die ChIP-Analyse gut geeignet. ó

Literatur[1] Holinka CF, Hata H, Kuramoto H et al. (1986) Responsesto estradiol in human endometrial adenocarcinoma cell line(ISHIKAWA). J Steroid Biochem 24:85–89[2] Albitar L, Pickett G, Morgan M et al. (2007) Models repre-senting type I and type II human endometrial cancers:Ishikawa H and Hec50co cells. Gynecol Oncol 106:52–64[3] Barber RD, Harmer DW, Coleman RA et al. (2005) GAPDHas a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expres-sion in a panel of 72 human tissues. Physiol Genomics21:389–395

Amy L. Beynon

Korrespondenzadresse:Dr. Amy L. BeynonChromatrapInstitute of Life Sciences 2Swansea UniversitySingleton Park, SA28PP, UKTel.: +44-(0)1792-606366amy.beynon@chromatrap.com

˚ Abb. 3: H3-Signalanreicherung am GAPDH-Promotor. Hec50-Chromatin zeigt nach enzymati-schem Scheren (Chromatrap® Enzymatic Shearing Kit, Porvair Sciences) und nach Ultraschallbe-handlung (Chromatrap® Spin Column Sonication Kit, Porvair Sciences) am GAPDH-Gen-Promotornach H3-Immunpräzipitation ein stark amplifiziertes Signal gegenüber dem unspezifischen Anti-körper Immunglobulin G als Kontrolle.Mittelwerte mit Standardfehler, n = 3. Weitere Erklärungenim Text.