Physikalische Chemie für Pharmazeuten

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K3: Bestimmung der Michaelis-Menten-Kinetik von Urease

Einleitung:

In diesem Versuch soll die Umsetzung von Harnstoff durch das Enzym Urease beobachtet

werden. Fast alle Enzyme sind Proteine, manche bestehen auch aus katalytischer RNA. Sie

werden für den Zellstoffwechsel benötigt und ihre Aktivität ist stark vom vorherrschenden pH-

Wert als auch der Temperatur abhängig. Enzyme sind „Biokatalysatoren“, sie binden

Substrate im aktiven Zentrum; durch die Ausbildung von intermolekularen Anziehungskräften

(H-Brücken, ionische Wechselwirkungen etc.) bildet sich ein Enzym-Substrat-Komplex,

dadurch wird die Aktivierungsenergie der Reaktion herab gesetzt. Nach Ablauf der Reaktion

werden die Produkte aus dem aktiven Zentrum entlassen. Das Enzym liegt dann wieder frei

vor, es wird nicht verbraucht! Des Weiteren haben Enzyme keinen Einfluss auf das

Reaktionsgleichgewicht. Sie beschleunigen lediglich die Einstellung dieses Gleichgewichts!

Urease

Urease ist ein nickelhaltiges Enzym, das die Hydrolyse von Harnstoff in CO2 und Ammoniak

katalysiert. In wässriger Lösung bilden diese Produkte Ionen, deren Konzentrationen sich

mittels Leitfähigkeitsmessung bestimmen lassen. Urease wurde erstmals aus Schwertbohnen

extrahiert und war eines der ersten Enzyme, die bereits 1930 kristallisiert werden konnten.

Das Enzym taucht in der Bruttoreaktionsgleichung zwar nicht auf, jedoch ist die

Reaktionsgeschwindigkeit stark von der Enzymkonzentration abhängig (Schema 1).

Schema 1: Bruttoreaktionsgleichung

Die Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit

v von der Konzentration des Enzyms und der Substratkonzentration [S] (Gleichung (1)). Bei

einer enzymatischen Reaktion nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit durch den Verbrauch des

Substrats allmählich ab, bis sich ein Gleichgewicht zwischen Hin- und Rückreaktion einstellt

oder die Reaktion selbst zum Erliegen kommt.

Physikalische Chemie für Pharmazeuten K3: Michaelis-Menten-Kinetik

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v0= (d[P]

dt)

t=0=

vmax × [S]

KM + [S] (1)

v0: Reaktionsgeschwindigkeit zum Zeitpunkt t = 0; vmax: Maximale Reaktionsgeschwindigkeit;

[P]: Produktkonzentration; [S]: Substratkonzentration; KM: Michaeliskonstante

Die Michaeliskonstante KM ist definiert als die Substratkonzentration, bei der die

Reaktionsgeschwindigkeit v der halbmaximalen Reaktionsgeschwindigkeit vmax

2 entspricht. v0

beschreibt die Anfangsgeschwindigkeit der Umsetzung für eine bestimmte Substrat-

konzentration und entspricht der gebildeten Produktmenge pro Zeiteinheit zum Zeitpunkt

t = 0. vmax beschreibt die maximal erreichbare Reaktionsgeschwindigkeit.

Schema 2 zeigt die Umsetzung von Harnstoff durch Urease; zu Beginn liegen Enzym und

Substrat frei vor, sie bilden einen Enzym-Substrat-Komplex (ES) mit der

Geschwindigkeitskonstante k1. Dabei handelt es sich um eine Gleichgewichtsreaktion, da auch

die Rückreaktion, d.h. der Zerfall des Komplexes, mit der Geschwindigkeitskonstante k-1

möglich ist. Im geschwindigkeitsbestimmenden, zweiten Schritt wird mit der Geschwindig-

keitskonstante k2 der Harnstoff zu den Produkten umgesetzt, dieser Schritt ist nicht reversibel!

Letztendlich werden die Produkte (P; Ammoniak und CO2) freigesetzt und das Enzym liegt nach

Ablauf der Reaktion wieder in seiner Ausgansform vor.

Schema 2: enzymatische Umsetzung von Harnstoff

Durch graphische Auftragung der Reaktionsgeschwindigkeit v gegen die Substrat-

konzentration [S] entsteht ein typisches Michaelis-Menten-Diagramm (Abb. 1). Aus diesem

lassen sich vmax und KM bestimmen. Allerdings handelt es sich um eine Sättigungskurve, welche

sich vmax asymptotisch annähert. Zudem sind Abweichungen der Messwerte schwer zu

erkennen, weswegen die Bestimmung von vmax und KM aus einer linearen Auftragung

bevorzugt wird (siehe S.3 Lineweaver-Burk-Plot).

Die Michaelis-Konstante KM ist ein Maß für die Affinität des Enzyms zum Substrat. Ein kleiner

KM-Wert ist ein Zeichen für eine hohe Affinität zwischen Enzym und Substrat und die halbe

Maximalgeschwindigkeit wird schon bei einer niedrigen Substratkonzentration erreichet.

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Abb. 1: Michaelis-Menten-Diagramm. Die Umsatzgeschwindigkeit v ist gegen die Substratkonzentration [S] aufgetragen. Die Michaelis-Menten-Konstante KM entspricht 0,5 vmax.

Im Bereich der Sättigung hat das Enzym seine maximal mögliche Umsatzgeschwindigkeit

erreicht, d.h. diese lässt sich auch durch weitere Zugabe von Substrat nicht mehr steigern.

Mathematisch gesehen bedeutet dies, dass sich die Kurve asymptotisch an vmax annähert.

Lineweaver-Burk-Plot

Zur genaueren Auswertung der Versuchsergebnisse wird von Gleichung (1) der Kehrwert

gebildet. Es resultiert die Lineweaver-Burk-Gleichung (Gleichung (2)). Hierbei handelt es sich

um eine Geradengleichung und durch graphische Auftragung von 1

v gegen

1

[S] lassen sich vmax

und KM mittels linearer Regression ermitteln (Abb. 2).

𝟏

𝒗= (

𝑲𝑴

𝒗𝒎𝒂𝒙) ×

𝟏

[𝑺]+

𝟏

𝒗𝒎𝒂𝒙

(2)

𝒚 = 𝒎 × 𝒙 + 𝒃 (3)

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Abb. 2: Lineweaver-Burk-Plot. 1/v ist gegen 1/[S] aufgetragen. Mittels linearem Fit sind die maximale Reaktionsgeschwindigkeit vmax und die Michaelis-Menten-Konstante KM bestimmbar.

vmax lässt sich nun aus dem Schnittpunkt der Gerade mit der y-Achse (b) berechnen (Gleichung

(4)). Zur Bestimmung von KM gibt es zwei unterschiedliche Verfahren. Eine Möglichkeit ist die

Berechnung aus dem Schnittpunkt der Gerade mit der x-Achse (Schnittpunkt mit der x-Achse;

Gleichung (5)). Es ist jedoch auch möglich KM aus der Steigung (m) der Geraden zu berechnen

(Gleichung (6)).

𝒗𝒎𝒂𝒙 = 𝟏

𝒃

(4)

𝑲𝑴 = −𝟏

(𝑺𝒄𝒉𝒏𝒊𝒕𝒕𝒑𝒖𝒏𝒌𝒕 𝒎𝒊𝒕 𝒙−𝑨𝒄𝒉𝒔𝒆)

(5)

𝑲𝑴 = 𝒎 × 𝒗𝒎𝒂𝒙 (6)

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Versuchsdurchführung:

Versuchslösungen vorbereiten:

Man stellt eine Verdünnungsreihe aus einer Harnstofflösung frisch her. Hierfür wird zuerst

eine 0.4 %-ige Stammlösung (w/v) hergestellt: In einen sauberen 100 mL Messkolben werden.

Der Feststoff sollte sich vollständig lösen und keine „Schlieren“ mehr bilden.

Tipp: Den Harnstoff in ein kleines Becherglas einwiegen, in wenig TRIS-Puffer (100 mM) lösen

und in den Messkolben überführen. Das Becherglas zweimal mit wenig TRIS-Puffer

„nachspülen“, um möglichst wenig Harnstoff zu verlieren. Anschließend den Messkolben auf

100 mL auffüllen.

Im nächsten Schritt wird eine Verdünnungsreihe nach folgendem Schema hergestellt:

Mit einer Vollpipette werden 50 mL der 0.4 %-igen Lösung aus dem Messkolben entnommen

und in einen weiteren 100 mL Messkolben überführt. Dieser wird mit TRIS-Puffer (100 mM)

bis zur Eichmarke aufgefüllt, es ergibt sich eine 0.2 %-ige Lösung. Nach dem gleichen Prinzip

wird fortgefahren und es werden weitere Verdünnungen mit den Konzentrationen 0.1 %, 0.05

%, 0.025 % und 0.0125 % hergestellt.

Der Versuchsaufbau und die Durchführung:

Abb. 3: Der Versuchsaufbau. Die Messlösung befindet sich in einem Becherglas auf einem Magnetrührer. Die Elektrode ist in die Lösung getaucht.

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- Elektrode vom Assistenten aushändigen lassen

- Elektrode mit der Messeinheit verbinden und mit der Halterung befestigen

- Phywe-Measure Programm in Windows starten

- auf <Datei><neue Messung erstellen> gehen

- Messparameter mit dem Anhang vergleichen

- auf <weiter> klicken

- mit Hilfe der 20 mL Vollpipette insgesamt 40 mL Lösung der geringsten Konzentration

(0,0125%ige Harnstoff Lösung) entnehmen und in ein 50 mL Becherglas füllen

- einen kleinen Rührfisch in das Glas geben und den Magnetrührer einschalten (max.

mittlere Einstellung, falls ihr später im Leitfähigkeits-Zeitdiagramm keine

ansteigende Linie sondern eine eher zackige Kurve seht, ist die

Rührergeschwindigkeit zu hoch gewählt)

- Elektrode in die Halterung stecken

- Der Rührer darf die Elektrode nicht berühren und soll nur mit der Spitze in die Lösung

eintauchen!

- 50 μL Urease Lösung mit der Mikroliterpipette hinzufügen (Vorsicht, die Urease ist

ziemlich zähflüssig, auf 50 μL aufziehen und warten bis Flüssigkeit nachzieht) und

sofort die Messung starten (auf <Messung starten> klicken)

- Am Ende der Messung sollen die Daten mit <Datei> <Messung speichern unter> in dem

Ordner: Michaelis Menten/GruppeXX/0,0125.mrs gespeichert werden (XX ist die

entsprechende Gruppennummer)

- Die Lösung in einen Abfallbehälter schütten, den Erlenmeyerkolben, die Vollpipette,

den Rührfisch und die Elektrode vorsichtig mit destilliertem Wasser reinigen und

eventuell mit einem Papiertuch trocknen

- analog für die restlichen Konzentrationen vorgehen (als nächstes 0,025 %-ig ….)

- Am Ende auch die Mikroliterspritze mehrmals mit dest. Wasser spülen

- Elektrode beim Assistenten abgeben

- Am Ende sämtliche Kolben mit destilliertem Wasser reinigen und die Urease in den

Kühlschrank zurückstellen!!!

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Auswertung:

Das Messprogramm erstellt ein Leitfähigkeitsdiagramm gegen die Zeit. Für die Auswertung

wird nur die Steigung dieses Diagramms benötigt. Hierzu wird nach der Messung das „Survey“

Tool verwendet. Man erhält ein Viereck, dessen Ecken jeweils bei 100 s und 200 s auf der

Kurve stehen sollten. Somit entspricht Δx genau 100 s. Das Programm bestimmt dann

automatisch Δy (siehe Anhang). Um auf die Reaktionsgeschwindigkeit (entspricht der

Steigung Δy/Δx) zu kommen, wird der Δy durch 100 s (= Δx) geteilt.

Man erstellt eine Tabelle (vier Spalten) mit der Konzentration in %, der Konzentration in

mmol/L und der in Cobra3 ausgewerteten Steigung in μS*cm-1 sowie der umgerechneten

Reaktionsgeschwindigkeit v in μS*cm-1*s-1.

Um die Konzentration in % in die Konzentration in mmol/L umzurechnen, wird Formel (7)

verwendet.

[𝑆] =(W . 10000)

M

(7)

W = Konzentration in %; M = molare Masse von Harnstoff (60,06 g/mol)

Nun wird ein Michaelis-Menten Diagramm erstellt (Reaktionsgeschwindigkeit (y-Achse) gegen

Substratkonzentration (x-Achse) auftragen). Dieses Diagramm wird mithilfe von „Non-linear

Fit“, dort den Unterpunkt „Growth/Sigmoidal“ -> und mit der „Michaelis-Menten“ –Fitfuktion

gefittet. Bei den Parameter muss man einmal auf „Bis fit konvergiert“ klicken um den besten

Fit zu erreichen. Der Fit liefert Werte für vmax und KM.

Die Tabelle wird nun um zwei Spalten für 1

v und

1

[S] erweitert und ein Lineweaver-Burk-Plot wird

erstellt.

Anhand des Graphen werden vmax sowie KM bestimmt (zur Berechnung siehe Gleichung (2),

(4), (5) und (6)). Dieser Plot wird nun linear gefittet und wie in der Theorie beschrieben Km und

vmax bestimmt.

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Im Protokoll sollen beide Graphen beschrieben und die jeweils erhaltenen Km und vmax

diskutiert werden. Welche Auftragung liefert die besseren Ergebnisse bezogen auf die

Literaturwerte? Entspricht das den Erwartungen?

Fehlerbetrachtung für das Protokoll:

Die resultierenden Werte Km und vmax aus dem Michaelis-Menten- sowie Lineweaver-Burk-

Plot sollen signifikant aufgeführt werden. Hierbei sind für die Werte aus dem Lineweaver-

Burk-Plot Gauß’sche Fehlerfortpflanzungen nötig.

Anhang:

Auswertungstool

Gesuchter Wert

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