Arch. exper. Path. u. t~barmakol., Bd. 2! I, S. 402 ~t09 (1950).

Aus der Medizinischen Klinik Kiel.

Kinetik der H~imiglobinbildung. IX+. Die Reduktion yon Hiimiglobin durch Phenylhydroxylamin.

~*OIl .~'|ANI,'REI) K1ESE und IN(~E REINWEIN.

Mit 5 Textabbildungen.

(Eingegangen am 2l. April 1950.)

Der Anstieg der Hgmiglobinkonzentration in roten Zellen w/~hrend des Kreisprozesses Phenylhydroxylamin-Nitrosobenzol verlangsamt mit der Zeit aueh in roten Zellen in vitro, wenn also ein Giftverlust dureh Ausscheidung yon unver/mdertem Phenylhydroxylamin oder Nitroso- benzol aus dem System nieht m6glich ist:. Da Phenylhydroxylamin, das im KreisprozeB dureh enzymatische i~eduktion des Nitrosobenzols immer urieder anf/~llt, Hgmiglobin wieder z~t Hgmoglobin zu reduzieren vermag2, 3, 4, ist anzunehmen, dab Phenylhydroxylamin bei Anwesenheit yon H/~miglobin in den Zellen nieht nur mit Sauerstoff und Hgmoglobin reagiert, sondern auch mit Hgmiglobin. Dann wiirde der weitere An- stieg der Hgmiglobinkonzentration auger durch den Giftschwund noch in zweifacher We, ise gehemmt, ngmlich erstens dadurch, dab ein Tell des Phenylhydroxylamins nieht in die l~eaktion mit Hgmoglobin und Sauerstoff eingeht und zweitens dadurch, daft dieser Tell des P henyl- hydroxylamins auch noch Hgmiglobin wieder zu H~tmoglobin reduzierL Um den Einfluft der Reduktion von Hgmiglobin durch Phenylhydroxyl- amin auf die Zunahme der I-Igmiglobinkonzentration in roten Zellen zu bestimmen, haben wir die t~eaktion gemessen.

Naeh unseren Messungsergebnissen vermag I Mol Phenylhydroxyl- ~mlin unter optimalen Bedingungen 2 24_quivalente Hgmiglobin zu redu- zieren. Die Gzschwindigkeit der Reduktion ist der Phenylhydroxylamin- konzentration proportionM, zeigt ~ber eine merkwiirdige Abh/tngigkeit yon der Hgmiglobinkonzentration.

In reinen H;gmiglobinl6sungen ist die Anf~mgsgesehwindigkeit der Reaktion

d [Hbtl] dt := K X [HblII] 1, 7 X [Ph.] .

Die Abh/ingigkeit der [~eaktionsgesehwindigkeit yon [HbllI] lr wird verstgndlieh dureh den Einfluft des Hgmoglobins auf die Reaktion. In Bhttft,rbstoffl6sungen, welehe nieht Tetra-Hgmi-Globin-Molekeln,

* V[[I. Nitteilung s. Arch. expet. Path. n. Pharmakol. 211. 392 (1950).

Kinetik der Iqiimiglobinbildung. IX. 403

sondern Di-Hi~mi-Di-Hi~mo-Globin-Molekeln enthalten, verli~uft die Reduktion des H~tmiglobins bei gleicher Konzentration an Ferri-tt~men langsamer als in L6sungen yon Tetra-H~mi-Globin. Durch Reduktion eines weiteren Ferri-Hgms in der Blutfarbstoffmolekel, also Bildung yon tt~mi-Tri-H~mo-Globin-~olekeln wird die Reaktionsgeschwindig- keit noch mehr vermindert. In ~¢[olekeln, die eine oder mehrere - - in unseren Versuchen an Kohlenoxyd gebundene - - Ferrohgme enthalten, ist also die t~eduktion der Ferri-H~me erschwert. Andernfalls sollte die Reaktionsgeschwindigkeit der Hgmiglobinkonzentration proportionM sein, da in jeder H~miglobinmo]ekel 4 Ferri-tt~me vorhanden sind. T~ts~ehlich haben aber je ein Ferri-Hgm zweier verschiedener Blut- farbstoffmolekeln eine grSBere Wahrscheinlichkeit, mit dem I)henyl- hydroxylamin zu reagieren, als zwei Ferri-tt~me der gleiehen )/[olekel.

Es besteht also in der Blutfarbstoffmolekel nieht nur eine tt~m- H~m-Beeinflussung in dem Sinne, dab die Abgabe eines Elektrons durch ein Hi~m die Sauerstoff- bzw. Kohlenoxydbindung 5 sowie die ]~lek- tronenal~gabe e eines andern erleichtert, sondern auch in dem Sinne, dab Kohlenoxydbindung eines Ferro-tt~ms die Elektronenaufnahme eines Ferri-H~ms in der gleichen Moleke] ersehwert.

Der EinfluB der Rednktion des Hgmiglobins durch Phenylhy- droxylamin auf den Ablanf der tIamiglobinbildurg ist infolge der Kom- plikation dureh die H~m-H~m-Beeinflusmmg nicht dureh eine einfaehe Funktion anzugeben. Vergleicht man die Gesehwindigkeit der Hgmi- globinbildung und I-I~miglobinreduktion fiir die Blutfarbstoffkonzen- tration in roten Zellen unter Verwendung der ftir reine tt~miglobin- 15sungen ermittelten Gesehwindigkeitskonstanten der ttgmiglobinreduk- tion, so ergibt sich, daB bei H~miglobinkonzentrationen, die die H~lfte der Gesamtbluffarbstoffkonzentrationen betragen, die Rednktion des H~miglobins dureh Phenylhydroxylamin noch viel langsamer verl~nft als die tt~miglobinbildung. Erst bei einer tI~miglobinkonzentration fiber 0,8 des (]esamtblutfarbstoffes erreiehen beide ~hnliehe Gr6Be. I)adureh dfirfte die Tatsaehe verst~ndlich werden, dab es im allgemeinen nicht gelingt, in roten Zellen mehr als 0,9 des Hgmoglobins durch Phenyl- hydroxylamin und Sauerstoff zu Hamiglobin zu oxydieren.

Bei der Berechnung yon WirkungsgrSBen H~miglobin bildender Gifte haben wir daranf hingewiesen, dab diese Minimalwerte sind, da in der Bereehnung der gesamten gebildeten H~miglobinmenge die Reduktion des H~miglobins durch Phenylhydroxylamin noch nieht beriieksiehtigt werden konnte ~. Fiir genaue Angaben der in der Zeiteinheit im Blute des Tieres durch Phenylhydroxylamin reduzierten ?¢[enge H~miglobin miiBte freilich die Phenylhydroxylaminkonzentration bekannt sein. Diese ist aus dem Ablauf der ttgmiglobinbildnng und der Kinetik der Reaktion zwisehen Hiimoglobin, Phenylhydroxylamin und Sauerstoff s

404 M. ]~IESE u. [. R EINWEIN:

ann~he rnd zu e rmi t t e ln ; sie ist sehr gering. Die Redukt ion des H~mi- globins durch P h e n y l h y d r o x y l a m i n w~hrend dessen Wi rkung in roten Zellen ist bei n iedr igen HKmiglobinkonzent ra t ionen gegenfiber der un- ka ta lys ie r ten enzymat i schen H~mig lob in reduk t ion belanglos und diirfte bei H~mig lob inkonzen t ra t ionen , die mehr als die Hi~lfte des Gesamt- blutfarbstoffs betragen, je nach der HKmiglobinkonzent ra t ion 0,1 bis 1,0 der unka ta ly s i e r t en I~eduktion ausmachen. Demnach s ind die ~-on uns angegebenen , ,Wirkungsgr6Ben" in F~illen starker Erh6hung der H~mig lob inkonzen t ra t ion u m einen Bruchtei l gr5ger, als wit sie ohne Beri icksicht igung der Hi~miglobinreduktion dutch Pheny lhydroxy lamin errechneten.

Versuche.

A. Methoden.

Zur Bestimmung der yon einer gegebenen Menge Phenylhydroxylamin maximal reduzierbaren Menge I~i~miglobin wurden sauerstofffreie H~miglobin- 15sungen im Wasserbad yon 37 ° C geschfittelt und nach Zusatz yon Phenylhydro- xylamin in Abst~nden yon 10~15 Minuten der ~i~miglobingehalt best immt, bis dieser konstant blieb.

Die Gasehwindigkeit der l~eduktion yon H~miglobin dutch Phenylhydroxyl- amin wurde optisch gemessen. In den niedrigsten ~amiglobinkonzentrationen warde die Zurlahme der Extinktion der LSsung fiir die Wellenlangen 546 and 577--79 m/~ bei Umwandlung des H~miglobins in Kohlenoxyd-Hitmoglobin zur ~¢[zssung der l~34uktionsgeschwindigkeit benutzt und in den hSheren I~miglobin- konzentrationen die Abnahme der Extinktion der L6sung fiir die Wellenl~nge 630 m/~ bei der gleichen Umwandlung. In den mittleren Hi~miglobinkonzen- trationen warden beide Verfahren angewandt. :Die ~)berftihrung des aus dem I~miglobin entstehenden I~moglobins in Kohlenoxydh~tmoglobin wurde gew~hlt, da sowohl bei 546 und 577--79 m/i als auch bei 630 m~ die Extinktionsdifferenzen zwischen tf~miglobin und Kohlenoxydh~moglobin grS[~er sind als zwisehen I~iimiglobin und ttiimoglobin. AuBerdem wurde durch Kohlenoxyd die Bildung yon Nitrosob~nzolh~moglobin verhindert, dessen Auftreten infolge seiner sowohl yore F[~'niglobin wie yore I-[iimoglobin abweiehenden Extinktionskonstanten die Eiehung der l~[eBmethode kompliziert h~tte.

Die Messungen wurden mit der gleichen Apparat~tr durchgefiihrt, die zur ~3ssung der I-I~mig|obinbildung durch Sauerstoff und Phenylhydroxylamin gedient hatte%

Die R3duk~ion des I-I~miglobins dltrch Phenvlhydroxylamin lief miter Aus- sehlug yon Sauerstoff ab. Dazu wurde das l~eaktionsgefaB mit einem Gummi- stopfen verschlossen, der yon 2 Glasrohren zur Ein- and Ausleitung yon Gasen and einem dureh KPG-l~ohr geffihrten Riihrer durchbohrt wurde. I)ber die I-I~miglobinlSsang wurde Kohlenoxyd geleitet, das dutch Kupfer bei 500 ° C yon Sauerstoff befreit war, ~lm einerseits den Sauerstoff aus der LSsung zu entfernen bzw. "con ihr fernzuh~lten uud andererseits das gebildete ]~moglobin sogleich in seine Kohlenoxydverbindung zu tiberfiihren. Nach Ausspiilen des Sauerstoffs aus dem R~aktionsgef~B wurde unter fortgesetzter Durchleitung yon Kohlenoxyd dutch das G~sausleitungsrohr Pheny]hydroxylamin injiziert, das in sauerstoffo freiem Wasser unter Stickstoff gelSst war.

I-I~miglobinlSsungen wurden aus roten Zellen vonl Rinde gewonnen. Naeh mehrmaligem ~raschen mit isotoner Natrimnchloridl6sung wurde das lff~imoglobin

Kinetik der H/imiglobinbildung. IX. 405

in den roten Zellen durch Nitrit zu I-[~miglobin oxydiert, das tiberschiissige Nitrit durch mehrm~liges Waschen entfernt, die Zellen mit W~sser h~mo]ysiert, die Stromata abzentrifugiert and durch Zus~tz yon 1/10 Volumen 0,1 molarer Phos- phatl6sung der LSsung die gewtinschte W~sserstoffionenkonzentration gegeben.

I-I~miglobin and tti~moglobin wurde nach der Methode yon K~ns]~ ~ im Photo- meter yon KOICT?iM s bestimmt.

B. Ergebnisse.

1. Ausbeute.

Zur B e s t i m m u n g der yon e inem 3/[ol P h e n y l h y d r o x y l a m i n m a x i m a l r eduz ie r t en H~mig lob inmenge wurden L6sungen yon 5 × 1 0 -a Aqui- vMenten H ~ m i g l o b i n × 1 -~ un te r K o h l e n o x y d mi t versch iedenen Kon-

i

o 7o -¢ d 4' 5' 3 70 -3 d // 5' '8 70 -2 z

Flol 2henylhyd~'oxylom/n. ~-z

Abb. 1 : Abh~ingigkeit der yon einem Mol Pheny lhyd roxy l amin in LSsungen yon 5 × 10 ~ -~quivalent H~imiglobin × ] - t r eduz ie r ten Xql l iva lente Hi imiglobin a'on der I Jhenylhydroxylaminkonzent ra t ion .

Mi t te l aus je 5 Messungen.

zen t r a t ionen von P h e n y l h y d r o x y l a m i n verse tz t . Die Ergebn i sse der Messungen s ind in Abb . 1 zusa~mmengestellt . Danach wurde durch e inen ~be r schuB von P h e n y l h y d r o x y l a m i n H~mig lob in vo l l s t~ndig reduz ie r t . I n Gemischen, die ein ~ o l P h e n y l h y d r o x y l a m i n au f 2 Aqu iva l en t e H~mig lob in en th ie l ten , wurde n ich t das gesamte H~mig lob in reduz ie r t , sondern mlr e twa ein :~quiva lent H~mig lob in . Bei grSfterem l~berschul~ von Hi~miglobin n~her te s ich die Ausbeu te umso mehr tier Gle ichung 2 H b III + 1 P h e n y l h y d r o x y l a m i n ---- 2 H b H -}- Ni t rosobenzol , je ger inger die P h e n y l h y d r o x y l a m i n k o n z e n t r a t i o n war.

2. Phenylhydroxylaminkonzentration.

Die Abhi ing igke i t der 1~eduktion des H~mig lob ins durch Pheny l - h y d r o x y l a m i n yon der P h e n y l h y d r o x y l a m i n k o n z e n t r a t i o n wurde fiir e inen Konzen t r a t i onsbe re i ch yon 5 × 10 - 5 bis 5 × 10 -a Mol × 1-1 in H~mi- g lobin lSsungen yon 7 × 10 -6 bis 3 × 10 -4 ~ q u i v a l e n t × 1 -~ bei pR 6,8 und 18°C b e s t i m m t . Die P h e n y l h y d r o x y l ~ m i n k o n z e n t r a t i o n e n mui~ten ver- h~ltnismi~itig hoch gew~hlt werden, u m bei den ger ingen Hi imig lob in- konzen t r a t i onen gu t mel~bare Reak t ionsgeschwind igke i t en zu erre ichen.

406 .Y]. KIESE U. I. REIN'iVEIN:

:A_ls Mal~ der ICeaktionsgeschwindigkeit ~ l r d e die Anfangsgeschwin- digkei t der ~ l d e r u n g (ter H~mig lob inkonzen t ra t ion gewahlt, die au~ dem Reak t ionsver lauf extrapol ier t ~'urde.

Aus der Anderung der einzelnen R.eaktionspartner im Ablau[ einer Reaktion zu errechnende Geschwindigkeitskonstanten warden nicht ais Geschwindigkeits-

.5

'~ 70 -5 £ ~/ 6 8 70 -~ g 4~ 5" 8 70 -3 g " t~ S 8 70 - z

MOl P h e n f / h y d g o x l l o m l ? ] . [-]

Abb. 2: Gcschwindigkeit tler llcduktion il(!s }]iimiglobins bci verschied~!nen l-liimiglobinkonzentr:,- tiom,n dureh Pheny lhydroxy lamin in Abh~ingigkeit yon tier Phenylhydroxy]aminkonzcnt ra t ion .

])H : : 6,8, Telnpera tu r 1~o C.

mall herangezogen, da erstens die _~lderung der Phenylhydroxylaminkonzen- tration infolge der Bildung yon Azoxybenzol aus Phenylhydroxylamin und ~Titroso- benzol nicht einfach zu iibersehen ist und zweitens der EinfluB der Hiimiglobin- kcnzentration auf die Geschwindigkei~ der einzelnen Reaktion mit der partie]len Reduktion des t/iimiglobins nicht konstant bleibt. Am Beginn der Reaktion liegen demgegentiber hinsichtlich der Konzentration der 1%aktionspartner genau definierte VerhMtnisse vor.

Kinetik der Hgmiglobinbiidung. IX. 407

Die Ergebnisse einer Reihe yon Messungen der Anfangsgeschwindig- keit bei verschiedenen H~tmiglobin- und Phenylhydroxylaminkonzen- t rat ionen sind in Abb. 2 niedergelegt. Auf Potenzpapier ist die Ab- h~ngigkei tderAnfangsgeschwindigkei tderReakt ion[Hb 11] × 1-1 × sec -1 yon der Phenylhydroxylaminkonzentrat ion dargestellt . Bei jeder unter- suchten H~miglobinkon- zentration ist der Loga- r i thmus der Reaktions- geschwindigkeit dem Loga- r i thmus der Phenylhydro- xylaminkonzentrat ion pro- portional. Die Geraden haben gleiche l~e[gung, ngmlich 1,0. Somit ist fiir eine best immte H~miglo- binkonzentrat ion die Re- aktionsgeschwindigkeit als Funktion der Phenylhydro- xylaminkonzentrat ion be- schrieben durch d [HblI]

dt : a[HblII ] X [Phi.

[Hb II] ~ Konzentrat ion des H£moglobins in Aqui- valent × 1-1, [Phi = Kon- zentrat ion des Phenylhy- droxylamins in Mol × 1-1, t = Zeit in Sekunden.

10_3 -- =

s b ~

~ 8 "

~ d _ ~

I0 -~ 2 ¢ 8 810 -5 Z ¢ 6"810 -¢ Z ¢ 8 870 -a

/l'quiwlente Ifdm~lcbin . F i

Abb. 3 : Abh~ngigke i t der Geschwindigke i t der B.eduktion des H~imiglobins durch P h e n y l h y d r o x y l a m i n VOlt der

Hi tmiglobinkonzentra t ion .

Die a[HbHI]-Werte der verschiedenen H~miglobinkonzentrationen ergeben sieh als 0rdinatensehni t tpunkte der Geraden.

3. Hdmiglobinlconzentration. Die Abhi~ngigkeit der Anfangsgeschwindigkeit der lZeaktion yon der

H~Lmiglobinkonzentration ergibt sich aus der Darstellung der a[l~blII ]- Werte als Funktion der H~miglobinkonzentrat ion in Abb. 3. Loga- r i thmus a[~blII ] als Funktion des Logari thmus der Hi~miglobinkonzen- t ra t ion ist eine Gerade mit der Neigung 1, 7. Die Reaktionsgeschwin- digkeit ist also be[nahe dem Quadrat der Hi~miglobinkonzentratlon proportional. Die Reakt ion verl~uft bei 18 ° C und einer Wasserstoffionen- konzentrat ion yon 10 -6.s ~ o l × 1-1 mit einer Anfangsgeschwindigkeit V O l l

d[HblI] -~ K × [l-Ib nI] ~' 7 × [Ph], t -- Zeit in Sekunden, K =: 104. dt

408 M. KIESE U. l. REIXWF~IN :

J . q ' e m p e r a t u r .

Die Abh/higigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit yon der Tempera, tur ~lr(te in LSsungen yon 6,5 >; 10- ~ Aquiva]ent H~miglobin × 1 -~ mid 1.3 ~ l0 -a Mol Phenylhydroxy]amin / ]-~ und pH 6,8 bestimmt. In

70 ~:

. , i J " "~

; + . . . . . . 711 i

7o i - - - + - - -

4 . - ~ .... ~ + - '~

I i

I

; I [ I ' °C gO lO dO 30 ~iO 70 -~ g ¢ 8870 "~ g q $870 "J g ¢ G d lO z

7emper~lur. r4ol Pkenylkydroxylomln. ~-I

A b b . 4. A b b . 5.

Abb. 4 : A b h ~ i n g i g k e i t d e r G e s c h w i n d i g k e i t d e r t ~ e d u k t i o n des H~imiglobins d u t c h P h e n y l h y d r o x y l - a m i n y o n d e r T e m p e r ~ t u r . A n f a n g s g e s c h w i n d i g k e i t e n in L S s u n g e n yon 6,5 x 10 -~ . ' -~quivalent H~imig lob in :~ I ' l i nd 1,:~ ~/ 10 -~ Mol P h e n y l h y d r o x y l a m i n x l ~, pit 6 ,8. M i t t e l allS je 3 Messt lngi!n .

O r d i n a t e l o g a r i t h i n i s e h ge to i l t .

A b b . 5 : E i n f l u B yon K o l d e n o x y d h g m o g l o b i n a n f (lie G e s c h w i n d i g k e i t d e r R e d u k t i o n des Hi imi - g lob in s d u r c h P h e n y l h y d r o x y l a m i n . T e m p . 18 o C, pH 6,8.

K u r ~ c A: 6.5 ~: 10 ~ "~qu iva len t H~ imig lob in × 1 *, o h n e K o h l e n o x y d h ~ i m o g l o b i n (de r Abb. 2 elltnOlllI~len).

Kurx ( ' I¢: 6.5 10 ~ . ~ q u i v a l e n t H i i m i g l o b i n / 1 ~ q 6,5 l 0 :' ; { q u i v a l e n t Kohh ,noxydh~ i mo- g lob in × 1 '.

K u r v ( ' ( ' : (i,5 / 10 " _'(( ]u iv l t lent H~ i l i l i g lob i l i X 1 - 1 + 1,95 10 - i - '~( l l i i ' ,alvi i l K o h l e n o x y ( I h i i l i i ( i - g lob in X 1 - L

Die M a r k e n s ind M i t t e l aus .ie 3 Messun~en .

Abb. 4 ist der Logarithmus der ICeaktionsgeschwindigkeit in Abhiingig- keit v o n d e r Temperatur dargestellt. Aus der Geraden ergibt sich ein Temperaturkoeffizient yon Q10 ~ 2.

5. H d m o g l o b i n u n d W a s s e r s t o / / i o n e n .

Der EinfluB der partiellen Reduktion des H~miglobins auf die Reaktionsgeschwindigkeit wurde an BlutfarbstofflSsungen untersucht, in denen das H~miglobin nur 0,5 bzw. 0,25 des Gesamtblutfarbstoffs betrug. Unter den Versuchsbedingungen lag das t-IKmoglobin dann als Kohlenoxydh~moglobin vor. In der Abb. 5 sind Messungsergebnisse zusammengestellt, (lie an L6sungen von 6,5 )/ ]0 -a Aquivalent HKmi- /Iobin × 1-1 sowie solchen erhalten walrden, die auBerdem noch die

Kinetik der H~miglobinbildung. IX. 409

gleiche bzw. doppel te K o n z e n t r a t i o n an Kohlenoxydh~moglob in ent- hiel ten. Die part iel le l~edukt ion des H~tmiglobins ver langsamte die Re~ktionsgeschwindigkei t . I n den LSsungen, die gleiche K onz e n t r a t i one n yon H~mig lob in und Kohlenoxydh~moglob in enth ie l ten , war die Reak- t ionsgeschwindigkei t nu r ha]b so groB wie in LSsungen gleicher Hiimi- g lob inkonzen t ra t ion ohne H~moglobin . I )urch die Anwesenhei.t der 3-f~chen Koh lenoxydh~moglob inkonzen t r a t ion wurde die Reakt ions- geschwindigkei t sogar auf ein Ffinfte] der ohne H~moglobin verr inger t .

Wassers toff ionen beeinf lussen im Bereich yon pH 8 bis p~ 5 die ]~eaktionsgesch windigkei t n icht .

Zusammen[assung.

Die G~schwindigkeit der l~edukt ion yon Hamig lob in zu Hi~moglobin durch P h e n y l h y d r o x y l a m i n wurde optisch gemessen. Die Reak t ion ver- li~uft mi t der G~schwindigkeit

d [HblI]dt ~ K X [Hbiii]1,7 × [Ph].

Fi ir die Tempera tu r yon 18 ° C ist K ~ 10 4. Der Temperaturkoeff i - zient der Reak t ion ist Q10 = 2,0. Durch die Anwesenhei t yon Ferro- I-I~men wird die Reak t ion gehemmt. Diese H e m m u n g wird aus der H~m-H~m-Bee in f lussung innerha lb der Blutfarbstoffmolekel gedeutet .

Die Reduk t i on des H£miglobins durch P h e n y l h y d r o x y l a m i n ver- l~uft ]angsamer als die H~tmiglobinbildung durch Pheny lhyd roxy l~min und Sauerstoff. I n ro ten Zellen erreichen beide Reak t ionen annAhernd gleiche Geschwindigkei t erst, wenn mehr als 0,8 des H~moglobins zu H~miglobin oxydier t ist.

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MA-NFRED KIESE, Marburg, Pharmakologisches Institut.