KONTROLLE DER OVARAKTIVITÄT VON HÜNDINNEN MITTELS ...members.yline.com/~ursula.hoffmann/diss.pdf · Aus dem Institut für Biochemie der Veterinärmedizinischen Universität Wien

Aus dem Institut für Biochemie

der Veterinärmedizinischen Universität Wien

(Vorstand: O. Univ.-Prof. Dr. Dr. h. c. Elmar Bamberg)

KONTROLLE DER OVARAKTIVITÄT VON HÜNDINNENMITTELS ÖSTROGENBESTIMMUNG IM KOT

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung der Würde eines

DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE

vorgelegt von

Diplom-Tierärztin Ursula Hoffmann

Wien, Februar 2000

1.Begutachter: a. Univ. Prof. Dr. Erich Möstl

Institut für Biochemie

2. Begutachter: Univ. Prof. Dr. Egbert Knaus

Universitätsklinik für Geburtshilfe,Gynäkologie und Andrologie

Danksagung

Zum Gelingen der vorliegenden Arbeit hat eine erhebliche Anzahl von Menschen (undTieren!) beigetragen, denen an dieser Stelle Dank ausgesprochen werden soll.Ein Gutteil der Arbeit für diese Dissertation bestand in der Sammlung von Kotproben beiHündinnen. Es sei daher allen Sammlern und Helfern Dank gesagt:�� den Betreuern der Österreichischen Militärhundestaffel Kaisersteinbruch, die ein

Einsammeln der Kotproben auch bei Minustemperaturen auf sich genommen haben,insbesondere Dr. Christian Schantel;

�� Veterinärrat Dr. Edmundo Taussig-Shaw, der den Kontakt zum Wiener Tierschutzhausvermittelt hat und stets ein guter Freund war;

�� der Präsidentin des Wiener Tierschutzvereins, Frau Lucie Loubé und Ihrem Mitarbeiter,Herrn Markus Hübel;

�� Herrn Hafenscher von der Firma Masterfoods, der einen Großteil der Hündinnenbesitzervermittelt hat;

�� allen Züchtern und Hundehaltern, das sind Fam. Hadjikyriacou, Frau Hanke, Frau Hanko,Frau Höfer, Fam Huber, Frau Janes, Frau Kamleitner, Fam. Müller, Herr Rath, FrauRumpelmayr, Herr Schwarz, Frau Spiegel, Frau Stingl, Frau Wurzer, Frau Zanghellini;

�� meinen Kollegen Michael Allnoch, Gerlinde Gruber, Isabell Hanisch, Ulrike Hutl, Dr.Alfred Kallab, Dr. Klein, Dr. Miriam Kleiter, Pascal Kühn, Ruth Schintag und Dr. MonikaTeinfalt, die bereitwillig ihre Hündinnen für diese Studie zur Verfügung stellten;

Auch im universitären Umfeld bin ich auf freundliche und hilfsbereite Personen gestoßen,denen Dank gebührt:�� Frau Kuchar-Schulz vom Institut für Biochemie für ihre Hilfe, die mir die Laborarbeit zum

Vergnügen und die dazugehörige Theorie verständlich gemacht hat;�� Frau Dr. Schneider vom Institut für Medizinische Statistik der Universität Wien für Ihre

Beratung im Bereich Statistik;�� Herrn Prof. Dr. Rost und Frau Dr. Lore Hoffmann, meine Tante, vom Institut für die

Pädagogik der Naturwissenschaften der Universität Kiel für die statistische Hilfe zurTestentwicklung;

�� schließlich dem Ludwig Boltzmann Institut für Veterinärmedizinische Endokrinologie,welches Teile der Laborarbeit finanziert hat.

Schließlich bleibt mir, allen aus meinem persönlichen Umfeld zu danken, die mir die Stangegehalten haben:�� allen Freunden und Familienmitgliedern, die ziemlich vernachlässigt wurden, inklusive

meinem Kater Muck;�� meinen Eltern, die mich nicht nur finanziell, sondern noch mehr moralisch unterstützt

haben, und die immer für mich da waren,�� und Dr. Dieter Schmalstieg, meinem Freund, der mich mit seinem Scharfsinn liebevoll

unterstützte.

Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG ..................................................................................................................................... 1

2. LITERATURÜBERSICHT................................................................................................................. 22.1. FORTPFLANZUNGSZYKLUS BEI DER HÜNDIN ................................................................................ 22.2. SEXUALSTEROIDE - AUFBAU UND ÜBERBLICK............................................................................. 52.3. WIRKUNG VON ÖSTROGENEN....................................................................................................... 92.4. KONZENTRATION UND MESSUNG VON SEXUALSTEROIDEN....................................................... 142.5. MESSUNG DER SEXUALSTEROIDKONZENTRATION IM KOT......................................................... 20

3. FRAGESTELLUNG ......................................................................................................................... 27

4. MATERIAL UND METHODEN ..................................................................................................... 284.1. KOTPROBENSAMMLUNG............................................................................................................. 284.2. EXTRAKTION DER ÖSTROGENE................................................................................................... 294.3. VERGLEICH DER EXTRAKTIONSVERFAHREN............................................................................... 304.4. NACHWEISVERFAHREN FÜR ÖSTROGENE................................................................................... 334.5. ENZYMIMMUNOASSAY ................................................................................................................ 344.6. HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) ....................................................... 354.7. QUALITÄTSKONTROLLEN ............................................................................................................ 374.8. AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE................................................................................................. 38

5. ERGEBNISSE................................................................................................................................... 395.1. KONTROLLE DER PRÄZISION....................................................................................................... 395.2. ERGEBNISSE DER HPLC-TRENNUNG DER EXTRAKTE................................................................. 405.3. ZUSAMMENHANG VON ÖSTROGENKONZENTRATION UND SEXUALSTATUS................................ 425.4. VERLAUF DER ÖSTROGENKONZENTRATION IN DER LÄUFIGKEIT ............................................... 465.5. EINFLUß DER RASSE, HALTUNG UND FÜTTERUNG AUF DIE ÖSTROGENAUSSCHEIDUNG............ 485.6. EINFLUß DER ERSTEN LÄUFIGKEIT AUF DIE ÖSTROGENAUSSCHEIDUNG.................................... 49

6. DISKUSSION ................................................................................................................................... 526.1. PROBANDEN................................................................................................................................ 526.2. AUFBEREITUNG DER PROBEN...................................................................................................... 536.3. HPLC .......................................................................................................................................... 556.4. ENZYMIMMUNOASSAY ................................................................................................................ 566.5. VERGLEICH DER ÖSTROGENMESSUNG IM KOT MIT DER IM BLUT .............................................. 576.6. MÖGLICHE ANWENDUNGEN........................................................................................................ 58

7. ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................................. 59

8. SUMMARY ...................................................................................................................................... 60

9. LITERATURVERZEICHNIS........................................................................................................... 61

10. ANHANG........................................................................................................................................ 7310.1. FRAGEBOGEN AN DEN HUNDEHALTER...................................................................................... 7310.2. QUELLDATEN ZUR STUDIE ........................................................................................................ 75

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1. Einleitung

Überwachungsmöglichkeiten in der Reproduktion sind für die Tiermedizin im Hinblick aufZucht oder Arterhaltung von Bedeutung. Eine zentrale Rolle in der Fortpflanzung spielen dieSexualhormone, hierzu gehören auch die Östrogene. Aus folgenden Gründen wurde dieAusscheidung von Östrogenen im Kot bei der Hündin untersucht:

�� Traditionell wird die Konzentration der Östrogene im Blut gemessen. Eine Blutabnahmekann mit Streß für das Tier verbunden sein. Es wird diskutiert, ob Medikamente zurBeruhigung des Tieres und die erwähnte Streßsituation den Zyklusverlauf der Hündinbeeinflussen können. Wildlebende hundeartige Säugetiere (Caniden) müssen zurBlutabnahme in Narkose gelegt werden. Bei jeder Blutabnahme ist ein Tierarzterforderlich, auch bei Verlaufsuntersuchungen, bei denen Östrogene mehrmals gemessenwerden. Für diese Fälle wäre ein weniger belastendes Verfahren zur Östrogenbestimmungein großer Fortschritt.

�� Carnivoren produzieren in der Plazenta keine Östrogene. Dies könnte ein natürlicherAdaptationsmechanismus sein, weil Hunde bei Östrogengaben toxische Erscheinungenzeigen können, die bis zum Tod führen. Der niedrige Östrogengehalt im Blut macht eineUnterscheidung, ob eine Hündin nicht kastriert und gerade nicht läufig ist oder aberkastriert ist, äußerst schwierig.

Als Alternative zur Östrogenbestimmung im Blut wird seit mehreren Jahren bei einigenTierarten die Bestimmung von Östrogenen im Kot erfolgreich eingesetzt. DieseNachweisverfahren konnten bisher bei Hunden kaum angewendet werden, weil sie zu wenigempfindlich waren für die geringen Östrogenmengen, welche die Hündin über den Kotausscheidet.

In der vorliegenden Arbeit sollte ein Nachweisverfahren entwickelt werden, mit dem auchgeringe Östrogenmengen im Kot nachgewiesen werden können. Hiermit war es möglich beikastrierten Hündinnen und bei Hündinnen in der Eierstockruhephase Östrogene im Kotnachzuweisen. Weiters konnten mit dieser nicht invasiven UntersuchungsmethodeÖstrogenverlaufsstudien während der Läufigkeit durchgeführt werden.

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2. Literaturübersicht

2.1. Fortpflanzungszyklus bei der Hündin

Der Sexualzyklus der hundeartigen Säugetiere (Caniden) besteht aus einer sexuell inaktivenPeriode (Anöstrus, AÖ) und einer daran anschließenden Aktivitätsperiode mit einer einzigenLäufigkeit. Man bezeichnet diese Form des Sexualzyklus als saisonal monöstrisch.

Die Aktivitätsperiode wird aufgrund des äußeren Erscheinungsbildes und der hormonellbedingten Veränderungen der Hündin traditionell in vier Phasen eingeteilt, die nahtlosineinander übergehen und die im folgenden näher beschrieben werden. Man unterscheidetzwischen Proöstrus (PÖ), Östrus (Ö), frühen Metöstrus (f MÖ) und späten Metöstrus (spMÖ). Als Läufigkeit bezeichnet man im deutschen Sprachraum die Zeit des PÖ, Ö und f MÖ(ARBEITER, 1994). Während der Läufigkeit sondert die Hündin ein Läufigkeitssekret ab undist für den Rüden attraktiv.

Die Hündin ist ein- bis zweimal im Jahr sexuell aktiv mit einem Abstand von 5 bis 12Monaten (CONCANNON et al., 1989). Die erste Läufigkeit der Hündin kann im Alter von 3Monaten bis zu 2 Jahren auftreten (FELDMAN u. NELSON, 1996). Meist tritt sie dann auf,wenn die Hündin ausgewachsen ist und ihr Endgewicht erreicht hat. Zu diesem Zeitpunkt istdie Hündin in ihrem Hormonmuster und der Blutungsintensität noch nicht vollkommenentwickelt, auch zeigt sie noch nicht das typische Verhaltensmuster. Man spricht daher auchvon der pubertierenden Hündin. Es kann aufgrund der Hormonimbalancen bei der erstenLäufigkeit der Eisprung ausbleiben (CHAKRABORTY et al., 1980; FELDMAN u. NELSON,1996; WILDT et al., 1981). Aus diesem Grund wird empfohlen, zumindest eine normaleLäufigkeit vor der Deckung der Hündin abzuwarten. Wenn die Hündin ihr optimalesZuchtalter überschreitet (etwa das siebente Lebensjahr), können leichte Veränderungen in derLänge der Zyklusabschnitte auftreten. Es kommt auch zunehmend zu kleineren Würfen,angeborenen Mißbildungen und Problemen während der Geburt. Generell bleibt die Hündinbis an ihr Lebensende sexuell aktiv (FELDMAN u. NELSON, 1996).

Die Hündin ovuliert spontan. Für den Eisprung verantwortlich ist dasLuteinisierungshormon (LH), 93 % aller Ovulationen finden innerhalb von 96 Stunden nachdem im Blut gemessenen Höchststand des Luteinisierungshormons (LH-Peak) statt (WILDTet al., 1978). Die freigesetzten Eier sind primäre Oozyten. Sie befinden sich noch in der erstenPhase der Meiose. Die Eier müssen daher eine Reifungszeit von 24-72 Stunden im Eileiterdurchlaufen und können danach 2 bis 3 Tage lang von den Spermien befruchtet werden(FELDMAN u. NELSON, 1996). Die Spermien können innerhalb von 25 Sekunden nach der

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Ejakulation den Eileiter erreichen. Für eine Befruchtung der Eizellen ist allerdings noch eineKapazitation (Endreifung) der Spermien von 7 Stunden nötig (FELDMAN u. NELSON,1996). Da sie intrauterin bis zu 7 Tage befruchtungsfähig bleiben können, ergibt sich eineziemlich weite Zeitspanne, in der die Hündin während ihrer Läufigkeit erfolgreich gedecktwerden kann, nämlich 2 Tage vor dem LH-Peak und bis zu 5 Tagen nach dem LH-Peak(CONCANNON u. LEIN, 1989).

Es folgt auf die Ovulation eine Gelbkörperphase von durchschnittlich 9 Wochen,unabhängig davon, ob die Hündin trächtig ist oder nicht. In dieser Zeit sind die Hormonprofileim Blut bei trächtigen und nicht trächtigen Hündinnen sehr ähnlich. Dies gilt insbesondere fürden Progesteronblutspiegel, mit Ausnahme der Zeit kurz vor und während der Geburt(CONCANNON u. LEIN, 1989). Die Progesteronbestimmung im Blut ist daher für dieTrächtigkeitsdiagnose ungeeignet. Mit einer Relaxinbestimmung im Blut kann man allerdingszwischen trächtigen und nicht trächtigen Hündinnen unterscheiden (STEINETZ et al., 1989).ONCLIN u. VERSTEGEN (1997) konnten zeigen, daß Prolaktin, das möglicherweise vonRelaxin geregelt wird, ebenfalls bei trächtigen Hündinnen ab dem 25. Tag nach dem LH-Peakim Vergleich zu nicht trächtigen Hündinnen deutlich erhöht ist.

Aufgrund der ähnlichen Hormonabläufe bei trächtigen und nicht trächtigen Hündinnenbezeichnen viele Autoren die Zeit der Gelbkörperphase bei allen nicht trächtigen Tieren alsPseudogravidität bzw. als Scheinträchtigkeit (ARBEITER, 1994; CONCANNON u. LEIN,1989; FELDMAN u. NELSON, 1996; SMITH u. McDONALD, 1974). Bei nicht trächtigenHündinnen kann es in dieser Zeit auch zur Laktation (Pseudolaktation) kommen. Daherverstehen einige Autoren und auch die Tierbesitzer unter pseudograviden, scheinträchtigenHündinnen nur jene Tiere, die gegen Ende der Gelbkörperphase ein ähnliches Verhalten wieeine trächtige Hündin zeigen und bei denen es zur Gesäugeanbildung und Milchsekretionkommt (ALLEN, 1992; ARNOLD, 1994; GILBERT u. BOSU, 1987). CREEL et al. (1991)untersuchten die Laktation ohne vorangegangene Trächtigkeit bei Mungos. Hier säugen imRudel untergeordnete, nicht trächtige Weibchen die Jungen dominanter Weibchen.Entwicklungsgeschichtlich könnten auch bei der Hündin Pseudogravidität undPseudolaktation ähnliche Wurzeln haben.

Im anglikanischen Raum hat es Tendenzen gegeben, die Fachbezeichnungen der einzelnenZyklusabschnitte bei den Säugetieren zu vereinheitlichen (HOLST u. PHEMISTER, 1974).Als Diöstrus (DÖ) wird die Phase des Zyklus bezeichnet, in der Progesteron das dominierendeHormon ist. MÖ wird bei den Säugetieren als die kurze Übergangsphase zwischenFollikularphase zur Gelbkörperphase bezeichnet. Es ist der MÖ per definitionem nur einekurze Zeitspanne zwischen Ö und DÖ. Die Bezeichnung DÖ ist für verschiedene Abschnittedes Sexualzyklus bei der Hündin verwendet worden. Manche Autoren wie HOLST u.PHEMISTER (1974) unterschieden eine sehr kurze Phase des MÖ (entspricht in etwa denersten 3 Tagen des f MÖ) und daran anschließend den DÖ, wobei die überbleibende Phase desMÖ durch die Bezeichnung DÖ ersetzt wurde. Andere Autoren, wie zum BeispielBUCKRELL et al. (1985) und CONCANNON u. LEIN (1989) ersetzten den TerminusMetöstrus durch Diöstrus. Diese Bezeichnung hat sich im anglikanischen Raum durchgesetzt.

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Im folgenden soll auf die einzelnen Abschnitte des Sexualzyklus bei der Hündin nähereingegangen werden, wobei die in Österreich noch übliche Nomenklatur PÖ, Ö, f MÖ, sp MÖund AÖ verwendet wird.

Proöstrus

Proöstrus ist die Periode erhöhter Follikelaktivität vor dem Östrus und steht unter demEinfluß der Östrogene. Östrogene bewirken ein Anschwellen der Vulva (Scheide), und eskommt zu Diapedesisblutungen (Durchtrittsblutungen) im Endometrium. Die Erythrozytenbilden gemeinsam mit dem Sekret der holokrinen Drüsen der Gebärmutterschleimhaut dasLäufigkeitssekret, von außen als blutiger Scheidenausfluß erkennbar. Die Menge kann starkvariieren - von kaum wahrnehmbar bis zu sehr ausgeprägt. Schon während des Proöstrus sinddie Hündinnen für die Rüden attraktiv, lassen sich aber meist nicht decken (ARNOLD, 1994).Man konnte das gleiche Bild bei kastrierten Hündinnen mit einer Gabe von Östrogenenerzeugen (CONCANNON et al., 1977 a). Die Dauer des Proöstrus beträgt meist 6 bis 11Tage, im Durchschnitt 9 Tage, aber auch eine Dauer von 2 bis 25 Tagen gilt noch alsphysiologisch (FELDMAN u. NELSON, 1996).

Östrus

Der Beginn ist gekennzeichnet durch die Deckbereitschaft der Hündin. Die Hündin animiertden Rüden durch das Seitwärtsdrehen des Schwanzes, Hochziehen der Labien undZuwendung des Hinterteils zum Rüden. So präsentiert sie die Nuß (Scham) und duldetDeckversuche des Rüden. CONCANNON et al. (1979) konnten bei Hündinnen, denen dieEierstöcke entfernt worden waren, durch Hormongaben dieses Verhalten hervorrufen, wennentweder der Östrogenblutspiegel sank und/oder der Progesteronblutspiegel anstieg. Bei 25untersuchten Läufigkeiten (WILDT et al., 1979) wurde das Verhaltensmuster der Hündin imÖstrus durch den Anstieg von Progesteron maßgeblich beeinflußt. Östrogenspitzenwertewurden bei 14 Hündinnen im Östrus und bei 11 Hündinnen ein- bis dreieinhalb Tage vorBeginn des Östrus gemessen. Die Änderung des Verhältnisses von Östrogenen zu Progesteronerkennt man am Welken (Kleiner- und Weicherwerden) der Vulva und an der Abnahme derDiapedesisblutungen. Das Läufigkeitssekret wird daher fleischwasserähnlich und eventuellleicht schleimig. Es kann auch fehlen. Die Dauer des Östrus beträgt meist 5 bis 9 Tage. Wieim PÖ kann die Dauer stark variieren. So kann sich der physiologische Östrus nur über 1 bis 2Tage erstrecken, oder sich auf 18 bis 20 Tage ausdehnen (FELDMAN u. NELSON, 1996).

Metöstrus

MÖ ist die Periode des Zyklus mit Progesterondominanz, die an den Östrus anschließt. Siebeginnt mit dem Ende der Deckbereitschaft der Hündin und endet mit dem Absinken derProgesteronkonzentration unter 1 ng/ml Blutplasma. Die Hündinnen lassen sich in den ersten1 bis 5 Tagen eventuell noch decken. Diese Zeit wird traditionell als f MÖ bezeichnet undwird der Läufigkeit noch zugerechnet (HOLST u. PHEMISTER, 1974). Die Hündin läßt sichdanach nicht mehr decken, gleichzeitig nimmt ihre Attraktivität für die Rüden ab. Äußerlichkommt es zu einem Abschwellen der Vulva auf Normalgröße und zu einem Sistieren des

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Läufigkeitssekretes. Von außen ist die Hündin von einer Hündin im AÖ nicht zuunterscheiden (FELDMAN u. NELSON, 1996). Das Ende des Metöstrus ist bei trächtigenHündinnen durch die Geburt definiert. Die durchschnittliche Dauer des Metöstrus beträgt 56bis 58 Tage bei trächtigen Hündinnen und 60 bis 100 Tage (Minimum 50 Tage; Maximum120 Tage) bei nicht trächtigen Hündinnen (CONCANNON, 1986; FELDMAN u. NELSON,1996).

Anöstrus

An das Ende des Metöstrus schließt sich der Anöstrus an. Äußerlich ist es die Periode dersexuellen Inaktivität. Hormonmessungen in dieser Zeit wurden bei Hündinnen meistausschließlich im Anschluß an den Metöstrus oder kurz vor der zu erwartenden Läufigkeitdurchgeführt. Es sind im Anöstrus nur sporadisch Hormonbestimmungen durchgeführtworden. Oft wird diese Periode auch als die Zeit der Ovarruhe bezeichnet, weil beiStichproben nur geringe Hormonkonzentrationen gemessen werden konnten (GRÄF, 1978;HADLEY, 1975; MELLIN et al., 1976; NETT et al., 1975). OLSON et al. (1982) konntenaber nachweisen, daß sowohl das Ovar als auch die Hypophyse während dieser Zeit aktiv sind.Bei 3 der 6 Mischlingshündinnen dieser Studie, die die Läufigkeit miteinschloß, wurden sogardie höchsten Meßwerte der Östrogenkonzentration im Blut während des Anöstrus gemessen.Auffallend war weiters, daß immer wieder kleinere LH-Peaks gemessen wurden, dieallerdings nie die Höhe des präovulatorischen LH-Peaks erreichten. Das follikelstimulierendeHormon hatte im Gegensatz dazu während dieser Zeit ein Plateau in der Höhe despräovulatorischen LH-Peaks und sank erst bei Beginn des Proöstrus ab. Weiters war dieProgesteronkonzentration im Anöstrus durchgehend niedrig. Die Autoren nahmen an, daß esin dieser Zeit zu Eifollikelanbildungen kommt, der Eisprung allerdings ausbleibt. Die Dauerdes Anöstrus ist sehr variabel, im Schnitt beträgt sie viereinhalb Monate (FELDMAN u.NELSON, 1996).

2.2. Sexualsteroide - Aufbau und Überblick

Steroide

Die Steroidhormone sind lipophile Moleküle, die vom Cholestan abgeleitet werden. Es gibtvier Hauptgruppen: Gestagene, Androgene, Östrogene und Corticoide. Diese bestehen aus 21,19, 18 und 21 Kohlenstoffatomen (C-Atomen) (LINDZEY u. KORACH, 1997).

Die Grundstruktur dieser Hormone ist das Gonan, chemisch-systematisch einCyclopentanoperhydrophenanthren. Phenanthren ist eine aromatische Ringstruktur. Siebesteht aus drei Ringen mit je 6 C-Atomen. Der Zusatz „Cyclopentano“ bedeutet in derchemischen Systematik, daß den 3 Ringen noch ein Fünferring angehängt ist. „Perhydro“ zeigtan, daß anstelle der Doppelbindungen zwischen den C-Atomen Wasserstoffatome an die C-Atome angelagert sind. Das Ringsystem ist daher nicht aromatisch, sondern gesättigt (sieheAbbildung 1).

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P henanth ren G on an

AA BB

CC D

Abbildung 1: Phenanthren und Gonan

Aufgrund ihrer Struktur sind Steroide lipophil. Für ihre Synthese sind Enzyme wieDehydrogenasen und Cytochrom P450 Enzyme notwendig. Die Synthese vonSteroidhormonen findet im Zellinneren statt, weil diese Enzyme entweder an der innerenMitochondrienmembran oder an der Membran des endoplasmatischen Retikulums dessteroidsynthetisierenden Gewebes gebunden sind (LINDZEY u. KORACH, 1997).

Im Gegensatz zu den hydrophilen Hormonen wie dem Luteinisierungshormon und demfollikelstimulierendes Hormon (FSH), die an Hormonrezeptoren an der Außenseite derZielzellenmembran binden, können die lipophilen Steroide die Zellmembran durchdringen.Ihre Rezeptoren befinden sich im Zellinneren. Für Östrogene, Androgene und Gestagene sindsie im Zellkern, für Corticoide im Zellplasma. Es kommt in der Zelle zur Anlagerung anSteroidrezeptoren. Der Steroid-Rezeptor-Komplex bindet sich an spezifische Stellen derDesoxyribonucleinsäure (DNA) im Zellkern. Die Bildung von Messenger-Ribonucleinsäuren(mRNA) an der DNA wird durch den Rezeptorkomplex gehemmt oder gefördert. Dievermehrt gebildeten Proteine oder ihr Mangel sind für die Wirkung der Steroideverantwortlich. Das erklärt auch die langsame Reaktion des Körpers auf Steroide, weil diewirkenden Substanzen erst gebildet werden müssen. Bei hydrophilen Hormonen erfolgt dieReaktion mittels bereits vorhandener zweiter Botenstoffe (second messengers) im Zellinneren.Die Wirkung ist also wesentlich schneller (LINDZEY u. KORACH, 1997).

Da auch auf Steroide sehr schnelle Reaktionen im Körper auftreten können, dies aber nurbei zellmembranvermittelter Wirkung möglich zu sein scheint, wird seit kurzem auch beiSteroiden in dieser Richtung geforscht (LINDZEY u. KORACH, 1997).

Sexualsteroide

Zu den Sexualsteroiden gehören die Gestagene, Androgene und Östrogene. DieAusgangssteroide werden in der Zona reticularis der Nebenniere und in den Keimdrüsensynthetisiert (LINDZEY u. KORACH, 1997). Die Nebenniere produziert vor allem schwachwirksame Androgene, aber auch einige Östrogene. Die Produktion in den Nebennieren nimmtnach der Pubertät zu. Weniger als 10 Prozent der Gesamtandrogene werden beim Rüden inden Nebennieren produziert (FELDMAN u. NELSON, 1996). Die adrenalen Androgene

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dienen vor allem als Vorläufer anderer Sexualsteroide. Ihre Umwandlung erfolgt imperipheren Gewebe.

Gestagene

Gestagene sind Steroide mit 21 C-Atomen. Pregnenolon (siehe Abbildung 2) ist dasAusgangssteroid für alle Steroide, die in den Eierstöcken, den Hoden oder den Nebennierengebildet werden können.

1102

34

56

7

8

9

1911

1213

14 1516

17

1820

21

H 3C

H 3C

C H 3

C

Abbildung 2: Pregnenolon, das Ausgangssteroid für alle Steroide

Pregnenolon wird aus Cholesterin mit Hilfe eines Cytochrom-P450-Enzyms unterAbspaltung der Seitenkette gebildet. Durch das Enzym 3�-Hydroxysteroid-Dehydrogenasekommt es zur Umwandlung zum wirksamsten natürlichen Gestagen, dem Progesteron. In denEierstöcken wird Progesteron in allen Phasen der Eifollikelentwicklung produziert. Es dientzum einen als Intermediärstoff für die Androgen- und Östrogenproduktion und wird zumanderen in der Zeit um den Eisprung und während der Gelbkörperphase als Endproduktsezerniert. Bei der Hündin ist Progesteron das die Schwangerschaft erhaltende Hormon, das inder zweiten Hälfte vom luteotropen Hormon Prolaktin unterstützt wird. Progesteron wird inden Gelbkörpern gebildet, wobei die Anzahl der Gelbkörper die Konzentration offensichtlichnicht beeinflußt (SCHAEFFERS-OKKENS, 1996). Es stimuliert das Wachstum derUterindrüsen, fördert ihre Sekretion, ist verantwortlich für die Verankerung der Plazenta,hemmt die Wehentätigkeit und erhöht die basale Körpertemperatur (FELDMAN u. NELSON,1996).

Androgene

Androgene sind Steroidhormone mit 19 C-Atomen. Die wichtigsten Androgene sindDihydrotestosteron, Testosteron, Androstendion und Dehydroepiandrosteron (gereiht nachabnehmender biologischer Wirksamkeit). Sie werden beim Rüden von den Leydig’schenZwischenzellen synthetisiert, bei der Hündin im Ovar von den Thekazellen sowie bei beiden

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Geschlechtern von den Zellen der Zona reticularis der Nebenniere (FELDMAN u. NELSON,1996). Die Synthese wird durch LH stimuliert. Testosteron ist ein Androgen, das imZielgewebe zu dem aktiveren 5�-Dihydrotestosteron enzymatisch umgewandelt werden kann.Ebenso können Testosteron und Androstenedion durch ein Cytochrom-P450-Aromatase-Enzym zu 17�-Östradiol, beziehungsweise Östron umgebaut werden. Man nennt diesenVorgang auch Aromatisation, weil der A-Ring der Östrogene aromatisch ist. Tatsächlichberuhen viele Wirkungen von Testosteron auf der Umwandlung zu entweder 5�-Dihydrotestosteron oder Östradiol im Zielgewebe (LINDZEY u. KORACH, 1997).Androgene sind für die Ausbildung der männlichen primären und sekundärenGeschlechtsmerkmale sowie für die Aufrechterhaltung ihrer Funktionen verantwortlich. Siekommen auch in niedrigerer Konzentration bei weiblichen Individuen vor, weil sie alsZwischenprodukte der Östrogensynthese anfallen (LINDZEY u. KORACH, 1997).

Östrogene

Östrogene sind Steroide mit 18 C-Atomen (Abbildung 3). Das Besondere an ihnen ist deraromatisierte A-Ring. Die wichtigsten Östrogene sind (gereiht nach abnehmender biologischerWirksamkeit) 17�-Östradiol, Östron, 17�-Östradiol und Östriol (BAMBERG, 1994). Wiebereits bei den Androgenen erwähnt, werden Östrogene aus Androgenen mit Hilfe derAromatase synthetisiert.

Ö stro n1 7 -Ö strad io lβ

1 7 -Ö strad io lα

Abbildung 3: Die drei wichtigsten Östrogene sind 17�-Östradiol, Östron und 17�-Östradiol

Man findet diese Enzyme in den Granulosazellen des Ovar (Eierstockes), in denLeydig’schen Zwischenzellen des Hodens und auch in den Zellen der Plazenta. Sie kommenauch außerhalb der Geschlechtsorgane vor, und zwar im Gehirn, in der Hypophyse, in derLeber, in den Skelettmuskeln, in den Haarfollikeln und im Fettgewebe. All diese Zellenkönnen, wenn ihnen Androgene zur Verfügung stehen, Östrogene produzieren (LINDZEY u.

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KORACH, 1997). Im Ovar werden unter dem Stimulus von LH in den ThekazellenAndrostendion und Testosteron gebildet. Diese diffundieren durch die Basalmembran in dieGranulosazellen, welche unter LH- und FSH- Einwirkung die Androgene zu Östrogenenaromatisieren (FELDMAN u. NELSON, 1996).

2.3. Wirkung von Östrogenen

Physiologische Wirkung während des Sexualzyklus

Die Wirkung der Östrogene erfolgt über Bindung an Östrogenrezeptoren. Dabei ist diephenolische Hydroxy-Gruppe am C3-Atom, ein Sauerstoffatom am C17-Atom in Form einerOH-Gruppe bzw. eines Ketons maßgeblich beteiligt. Generell bewirken Östrogene eineHyperämie (verstärkte Durchblutung) und eine Stimulierung der Proteinsynthese. Dies äußertsich im Wachstum und der Differenzierung der weiblichen Geschlechtsorgane. Bei adultenTieren sorgen sie für die Ödemisierung (vermehrter Flüssigkeitseinlagerung) und vermehrteDurchblutung des Genitaltraktes bis hin zu Diapedesisblutungen im Endometrium. Sie sindfür die Reifung der Follikel im Eierstock verantwortlich, für die Proliferation desEndometriums in der Gebärmutter sowie für die vermehrte Bildung von Uterindrüsen und dieAusbildung von mehr Zellagen. Die Stimulierung von spezifischer mRNA durch Östrogenefördert auch die Bildung von Oxytozinrezeptoren gegen Ende der Trächtigkeit und dieSynthese von Hormonen wie Prostaglandin F2� (PGF2�). Sie sind daher wichtige Hormonewährend der Schwangerschaft (LINDZEY u. KORACH, 1997).

COCK et al. (1997), COCK et al. (1996), FERNANDES et al. (1989) und JOHNSTON etal. (1985) konnten zeigen, daß der Gehalt an Östrogenrezeptoren im Endometrium des Uteruswährend des Sexualzyklus schwankt, und zwar fördern Östrogene die Bildung vonÖstrogenrezeptoren wie auch die von Progesteronrezeptoren. Progesteron hingegen hemmt dieBildung von Steroidrezeptoren. So nehmen die Östrogenrezeptoren während des Proöstrusstetig zu und erreichen die höchste Konzentration 12 Tage nach Beginn des Östrus. Dannsinkt die Zahl der Rezeptoren, weil in dieser Zeit Progesteron das dominierende Hormon ist.Die hemmende Wirkung von Progesteron auf die Ausbildung von Östrogenrezeptorenkonnten auch WEST et al. (1976) im Eileiter und im Uterus bei Katzen nachweisen. Dieniedrigste Konzentration findet man 40 Tage nach Beginn des Östrus. Mit Absinken desProgesterongehaltes steigt die Östrogenrezeptorkonzentration wieder an. Es ist anzunehmen,daß auch die Östrogenrezeptoren im übrigen Gewebe abhängig von der jeweiligenSteroidkonzentration schwanken. Östrogenrezeptoren konnten auch in anderen Geweben wieim Zentralnervensystem (ZNS), in der Leber, im Herzen und im Knochengewebenachgewiesen werden (LINDZEY u. KORACH, 1997).

Hormonwechselwirkungen

Die Regulation der Biosynthese von Hormonen erfolgt im allgemeinen über Regelkreise.Verändert sich die Konzentration eines Hormones, so sind automatisch auch jene Hormone,die in dem jeweiligen Regelkreis zusammenwirken, mitbeteiligt. In einem

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Feedbackmechanismus regeln die Testosteron- und Östradiol-Serumkonzentrationen die LH-und FSH-Sekretion über die Beeinflussung der GnRH-(Gonadotropin-releasing hormone)-Synthese und/oder der GnRH-Freisetzung (MILLER, 1989).

Über 90 Prozent der Sexualsteroide sind an das Sexualhormon bindende Protein (SHBP)gebunden und sind inaktiv. Bei erwachsenen Hunden ist die SHBP-Konzentration bei denWeibchen höher als bei den Rüden, während sie bei den pubertierenden Tieren annäherndgleich ist. Das Sexualhormon bindende Protein hat die höchste Bindungsaffinität zuDihydrotestosteron, bindet aber auch andere Androgene, Östrogene und Progesteron. All dieseSexualsteroide konkurrieren um dieselbe Bindungsstelle am SHBP. Ist ein Sexualsteroid imÜberschuß vorhanden, werden die anderen von der Bindungsstelle verdrängt und sind frei.Ungebundene Hormone sind biologisch aktiv und können im peripheren Gewebe zu anderenHormonen umgewandelt werden. Die SHBP-Konzentration wird durch Östrogene undSchilddrüsenhormone erhöht, durch Androgene, Gestagene und das Wachstumshormonerniedrigt (MILLER, 1989).

Man konnte nachweisen, daß Progesteron beim Menschen an Dihydrotestosteronrezeptorenbindet und das Enzym, das Testosteron zu Dihydrotestosteron umwandelt, hemmt. Es kommtdann lokal zu Hormonimbalancen. Generell ist bei Überangebot eines Steroides auch einerhöhter Gehalt der anderen Sexualsteroide über Enzymmetabolismus möglich (CHALMERSu. MEDLEAU, 1990; MILLER, 1989).

Östrogeninduzierte Dermatosen

Bei Säugetieren wird der individuelle Haarwuchs durch Hormone beeinflußt, unter anderemauch durch die Sexualsteroide. Die Wirkung der Sexualsteroide erfolgt über Androgen-,Östrogen- und Gestagen-Rezeptoren, die beim Menschen in ihrer Konzentration in der Hautvariieren, abhängig vom Geschlecht und dem Körperbereich. Bei Hunden gibt es wenigInformation über die Verteilung von Steroidrezeptoren in der Haut. Hormonstörungenverursachen aber einen Haarverlust mit einem bestimmten, offenbar hormonabhängigenMuster. Dies läßt eine unterschiedliche Verteilung der Steroidrezeptoren auch bei Hunden inder Haut vermuten (MILLER, 1989).

Die Diagnose und auch die Erklärung solcher hormoninduzierter Dermatosen ist schwierig,weil viele Faktoren zusammenwirken bzw. sich gegenseitig beeinflussen. Es gibt daher keingeschlossenes Modell, mit dem man alle dermatologischen Erscheinungen erklären könnte.Insbesondere ist die früher vorherrschende These vom Hormonmangel nicht ausreichend. Manist daher dazu übergegangen, von Geschlechtshormonimbalancen zu sprechen (ROSSER,1993).

Im folgenden soll zunächst ein Überblick über die Steuermechanismen (Keimdrüsen- undNebennierentätigkeit, Sexualsteroidrezeptoren, Steroidhormon bindendes Protein sowiehormoneller Feedback-Kreislauf) der Sexualsteroidkonzentration in der Haut gegeben werden.Anschließend werden typische Krankheitsbilder beschrieben, bei denen eineHormonimbalance als Ursache vermutet wird.

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Steuermechanismen der Sexualsteroidkonzentration

Der Hauptteil der Sexualsteroide wird in den Keimdrüsen produziert, wobei es zu einerUnter- bzw. Überproduktion kommen kann. Man nimmt an, daß einem durch die Kastrationbedingten Hormonmangel dadurch vorgebeugt wird, daß die Nebennieren basal notwendigeSexualsteroide produzieren. Eine Sexualsteroidüberproduktion kann durchhormonproduzierende Tumore hervorgerufen werden (METZGER u. HATTEL, 1993).

Die Wirkung der Sexualsteroide auf die Haut erfolgt über Rezeptoren und wird daher auchvon der lokalen Dichte der Rezeptoren beeinflußt. Leider ist über die tatsächliche Dichte derRezeptoren beim Hund wenig bekannt. EIGENMAN et al. (1984) induzierten durchÖstradiolgabe bei einer von sechs Hündinnen Alopezie in der Flankengegend. Sie konnten beidieser Hündin eine 6fach höhere Konzentration der Östrogenrezeptoren in der Haut derhaarlosen Stellen feststellen. MECKLENBURG (1998) untersuchte ebenfallsSteroidrezeptoren in der Haut von Hunden mit endokriner Dermatopathie. Die Dichte derRezeptoren wurde nicht bestimmt. Auch unkonjugiertes Testosteron kann in der Peripherie zuÖstrogen konvertiert werden, so daß ein im Blut gemessener Östrogenspiegel keinen direktenRückschluß auf die lokal wirksamen Östrogenkonzentrationen auf der Haarfollikelebenezuläßt, was die Diagnose erheblich erschwert (MILLER, 1989).

Eine Veränderung der SHBP-Konzentration kann bei physiologischerHormonkonzentration zu Steroidimbalancen führen (MILLER, 1989).

Schließlich existiert ein weiterer Mechanismus, der die Sexualsteroidkonzentration imKörper regelt. Es ist dies der Regelkreislauf vom Hypothalamus über die Hypophyse zu denKeimdrüsen. Hier haben die jeweiligen Hormone in ihrer Konzentration einen regelndenEinfluß (GnRH, FSH, LH und Sexualsteroide). Von außen kann die Empfindlichkeit diesesRegelkreises durch Somatotropin, Melatonin und die adrenalen Sexualsteroide beeinflußtwerden.

Hormonimbalance als Ursache von Störungen - Krankheitsbilder

Steroidinduzierte Dermatosen sind endokrine Dermatosen und als solche meist bilateralsymmetrisch. Bei durch Östrogenimbalance hervorgerufenen Erkrankungen entwickeln Hundeeine Alopezie sowie eine Atrophie der Epidermis und der Talgdrüsen (EIGENMAN et al.,1984; WATSON, 1985). Die Hautveränderung beginnt meist im Perineal- und Genitalbereich.Sie breitet sich dann im kaudalen Schenkelbereich, dem ventralen Abdomen, den Flanken unddem Hals aus. Der distale Extremitätenbereich und der Kopf bleiben meist unverändert.Dieses Muster läßt vermuten, daß die höchste Östrogenrezeptorkonzentration im Perineal- undGenitalbereich zu finden ist. Manchmal bleibt der Haarausfall auch nur auf die Flankenregionbeschränkt. Histologisch findet man das Bild einer Hautveränderung mit endokriner Ursache.Aus diesem Befund kann man allerdings nicht schließen, welches Hormon die Veränderungverursacht hat.

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Im folgenden sollen einige in der Literatur besprochene Krankheitsbilder erörtert werden.Allerdings sei angemerkt, daß nicht vollständig geklärt ist, wie das genaue Zusammenspiel derHormone funktioniert, obwohl viele Autoren die folgende Charakterisierung verwenden.

�� Hyperöstrogenismus, also Östrogenüberproduktion, kann durch Granulosazelltumore bzw.Ovarialzysten (ARBEITER, 1981; FIORITO, 1992) hervorgerufen werden. EIGENMAN(1984) und WATSON (1985) berichten über Haarausfall nach Östrogengaben. Bei einemweiteren Fleischfresser, dem Frettchen, kann es zu einer Dauerraunze und damit einerlangdauernden Östrogenproduktion der Follikel kommen; es finden sich dann ähnlicheHautveränderungen wie beim Hund (HAGE u. DORRESTEIN, 1995; KOCIBA u.CAPUTO, 1981; ROSENTHAL, 1994; WILLIAMS, 1995). Weit häufiger alsGranulosazelltumore bei der Hündin findet man beim Rüden östrogenproduzierendeSertolizell-Tumore (CHASTAIN, 1993; MEDLEAU, 1989; METZGER u. HATTEL,1993).

�� Hypoöstrogenismus tritt bei früh kastrierten Hündinnen auf. Man findet die gleichenHautveränderungen wie bei Hyperöstrogenismus, nur Scham und Milchleiste sind juvenil.Sowohl Östrogen- wie auch Testosterongaben führten zu einer Heilung (MILLER, 1989).

�� An Hypoandrogenismus erkranken Rüden mittleren bis hohen Alters, insbesondere, wennsie frühzeitig kastriert wurden. Das Krankheitsbild ist ähnlich dem Hypoöstrogenismus(SCOTT et al., 1995). Als Therapie werden Testosterongaben bei kastrierten Tieren undbei nicht kastrierten Tieren die Kastration vorgeschlagen.

Außer der Sexualsteroidimbalance können noch folgende Krankheitsursachen vorkommen:

�� Latenter Somatotropinmangel, welcher zur saisonalen Flankenalopezie beim Rüden führenkann (MILLER, 1989).

�� Störungen in der Somatotropin- und adrenalen Sexualsteroid-Produktion werden alscongenital adrenal hyperplasia-like syndrome, als adrenal sex hormone dysfunction bzw.growth hormone responsive alopecia beim Hund (CHALMERS u. MEDLEAU, 1989;MORIELLO, 1995; MORISSE, 1998; ROSYCHUK, 1998; SCHILLY u. PANCIERA,1997; SCHMEITZEL et al., 1995) bzw. adreno-associated endocrinopathy beim Frettchenbezeichnet (HAGE u. DORRESTEIN, 1995; KOCIBA u. CAPUTO, 1981; LAWRENCEet al., 1993; LIPMAN et al., 1993; ROSENTHAL, 1994; ROSENTHAL et al., 1993;WILLIAMS, 1995).

Östrogene als Therapeutika

Östrogene werden nicht nur auf natürliche Weise im Körper produziert, sondern könnenauch gezielt als Therapeutika eingesetzt werden. Hierbei macht man sich die Tatsachezunutze, daß Östrogenrezeptoren in vielen Geweben vorkommen.

Nebenwirkungen der Östrogengaben können Knochenmarksdepressionen (BOWEN et al.,1985; OLSEN u. JOHNSTON, 1993), Dermatosen oder eitrige Gebärmutterentzündungen(PURSWELL, 1994) sein. Der Einsatz von Östrogenen ist aus diesen Gründen zumindest

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fragwürdig. In vielen Anwendungsbereichen sind Östrogene deshalb durch effektivere bzw.mit weniger Nebenwirkungen behaftete Behandlungen ersetzt worden (ARBEITER u.FLATSCHER, 1996; OLSON u. JOHNSTON, 1993; OLSEN et al., 1986; PAGE, 1991).Noch heute werden bei folgenden Indikationen Östrogene eingesetzt:

�� Harninkontinenz : Eine Ursache der Harninkontinenz ist eine Schwächung desHarnröhren-Schließmuskels. Da Östrogene die Bildung von �-adrenergen Rezeptoren desSchließmuskels stimulieren, tritt Harninkontinenz häufig bei kastrierten älteren Hündinnenauf. Wenn die gewünschte Wirkung bei Behandlung mit �-adrenergen Medikamenten wieEpinephrin oder Phenylpropanolamin ausbleibt, werden Östrogene zusätzlich verabreicht(ARBEITER, 1986; BLENDINGER et al., 1995; HOLT, 1985; JANSZEN et al., 1997;MOREAU u. LAPPIN, 1989; NENDICK u. CLARK, 1987).

�� Ungewollte Deckung: Kommt es zu einer unerwünschten Deckung, kann ein Abbruch derTrächtigkeit durch Östrogengaben innerhalb der ersten Tage nach der Deckungherbeigeführt werden (ARBEITER, 1994; SHILLE, 1982; SUTTON et al., 1997).Östrogene verlängern die Transportzeit des befruchteten Eis vom Eileiter in den Uterus unddadurch eine rechtzeitige Einnistung (OLSEN u. JOHNSTON, 1993). Außerdem verändernÖstrogene die biochemische Umgebung und den Aufbau in der Schleimhaut des Eileiterund Uterus (BRAAKMAN et al., 1993).

Knochenmarksdepression durch Östrogene

Beim Einsatz von Östrogenen als Therapeutika können im Blutbild, besonders wennÖstrogene hoch dosiert werden, Veränderungen auftreten (BAUMGÄRTNER u. POSSELT,1982; COCK et al., 1989; HALL, 1992; HOENIG, 1989; KRUININGEN u. FRIEDLAND,1987; SCHWARZ et al., 1982; WEISS u. KLAUSNER, 1990). Ursache für dieseVeränderung ist eine Hemmung der Stammzellen des Knochenmarks. Bereits vor mehr als 50Jahren wurde diese toxische Wirkung von Östrogenen auf das Knochenmark beim Hundbeschrieben (ARNOLDS et al., 1937; DOUGHERTY et al., 1943).

Die individuelle Empfindlichkeit variiert sehr stark. Die Untersuchung von ATTIA (1989)läßt eine höhere Empfindlichkeit bei nicht kastrierten Hündinnen vermuten. Ein ähnlichesBild wie bei der iatrogenen Östrogenintoxikation findet man manchmal bei Östrogenproduzierenden Tumoren wie Granulosazelltumoren, insbesondere aber bei Serolizelltumorendes Rüden (CHASTAIN, 1993; METZGER u. HATTEL, 1993; TESKE, 1986).

Acht Tage bis drei Wochen nach der Östrogengabe zeigen die Hunde Apathie, Anorexie,starken Durst und Erbrechen. Die Schleimhäute können blaß sein. Hauptsymptome sindBlutungen aus den natürlichen Körperöffnungen, Blutungen in die Unterhaut und in denSchleimhäuten. Durch Verminderung der Gesamtleukozytenzahl (Leukozytopenie) könnensekundär schwere Infektionen auftreten.

Untersuchungen des Knochenmarks zeigen oft einen vollständigen Schwund derMegakaryozyten (Vorläuferzellen der Thrombozyten) und bei schweren Intoxikationsfällennach einer anfänglichen Hyperplasie der Vorläuferzellen der myeloiden Reihe ein nicht

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reaktives Knochenmark mit nur wenigen Blutstammzellen (Panzytopenie). Diese aplastischeAnämie endet oft tödlich.

TESKE (1986) vermutet als Ursache der Knochenmarkssupression durch Östrogene primäreine Hemmung der Wirkung des Erythropoetins. Dieses stimuliert im Knochenmark dieStammzellen der roten Blutkörperchen. Nach Wegfall der Erythropoetinwirkung kommt es zueiner Gegenregulation, zu einer unspezifischen Stimulierung des Knochenmarks. Diesebewirkt eine vermehrte Proliferation und Reifung der anderen Stammzellen, wasschlußendlich in einer Erschöpfung aller Zellen endet. Dies erklärt aber nicht die kurz nachder Östrogengabe auftretende Thrombozytopenie.

ELLING et al. (1981) wiesen mit einem Radio-Rezeptor-Test spezifische, absättigbareBindungsstellen für 17�-Östradiol im Knochenmark gesunder Hunde nach.

GAUNT u. PIERCE (1986) konnten keine Östrogenrezeptoren bei normalenhämatopoetischen Zellen im Knochenmark nachweisen. In In vitro-Studien setzten sie 17�-Östradiolsulfat dem Nährmedium von Knochenmarkzellkulturen zu. Sie konnten keinehemmende Wirkung von Östradiol auf das Zellwachstums feststellen, was nach Meinung derAutoren auch für die Abwesenheit von Östrogenrezeptoren spricht. Sie konnten bei Hundennach einer einmaligen Gabe von 17�-Östradiol-Cyclopentylpropionat in der ersten undzweiten Woche einen Megakaryozytenschwund im Knochenmark nachweisen und zwei bisdrei Wochen später eine Thrombozytopenie im Blut. Sie vermuteten eineÖstrogenbeeinflussung der Lymphozyten oder anderer Zellen, welche die Hämatopoeseregulieren, oder aber eine durch Metaboliten hervorgerufene Myelotoxizität.

FARRIS u. BENJAMIN (1992, 1993a, 1993b) isolierten aus Hundethymuszellkulturen,denen 17�-Östradiol zugesetzt worden war, einen myelopoiesis-inhibiting factor (MIF). Mitmonoklonalen Antikörpern wurden Östrogenrezeptoren in Zellkernen nichtlymphoider Zellendes Thymus nachgewiesen. Dieser MIF hemmte das Wachstum von Zellkulturen desKnochenmarks. Mit Seren von Hunden, die mit Östradiolcypionat behandelt worden waren,konnten ebenfalls Knochenmarkszellkulturen in ihrem Wachstum gehindert werden.

2.4. Konzentration und Messung von Sexualsteroiden

Wie aus den vorangegangenen Erörterungen ersichtlich, hat die Kenntnis derphysiologischen Sexualsteroidkonzentration für die veterinärmedizinische Diagnostik eineerhebliche Bedeutung. Ein Nutzen ist natürlich nur dann gegeben, wenn der entsprechendeHormonspiegel auch praktisch ermittelt werden kann. In diesem Abschnitt soll ein Überblickder Möglichkeiten zur Messung der Konzentration von Sexualsteroiden gegeben werden.

Zur Überprüfung der Hormonproduktion und der Konzentration im Körper eignet sich dieMessung der Hormone im Blut und auch im Harn (RIJNBERK, 1996). Da ein Teil derHormone auch über den Kot ausgeschieden wird, haben sich in letzter Zeit neben derBlutanalyse die Hormonbestimmungen im Kot als diagnostische Verfahren etabliert(BROWN u. WILDT, 1997; BROWN et al., 1994; MÖSTL et al., 1987; PALME u. MÖSTL,

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1993; PALME u. MÖSTL, 1997; SCHWARZENBERGER et al., 1996; SHIDELER et al.,1993; WASSER et al., 1991; WASSER et al., 1988; WASSER et al., 1993).

Sexualsteroidmessung im Blut

Vorraussetzung für eine Bestimmung der Sexualsteroide im Blut ist eine Blutentnahme. DieBlutentnahme ist eine dem Tierarzt vorbehaltene Tätigkeit (Tierärztegesetz, 1975). Neben denrechtlichen Rahmenbedingungen ergeben sich auch noch einige praktische Notwendigkeiten:Bei der Blutentnahme muß das Tier ausreichend ruhig und gut fixiert sein, die Blutgefäßemüssen entsprechend groß und zugänglich sein. Eine Blutentnahme ist demzufolgebeispielsweise bei Wildtieren, aber auch bei nicht handzahmen oder stark abwehrenden Tierennur in Narkose möglich. Dieser Umstand erschwert eine routinemäßige Untersuchung derSexualsteroide im Blut dermaßen, daß diese Methode als diagnostisches Hilfsmittel nureingeschränkt tauglich ist.

Dennoch ist die Blutuntersuchung die etablierteste Methode, weil sie recht sichere undreproduzierbare Ergebnisse liefert. Der Nachweis von Hormonen im Blut erfolgt meist mitHilfe von Immunoassays. Hierzu gehören unter anderem der Radioimmunoassay (RIA) undder Enzymimmunoassay (EIA). Letzterer hat aufgrund der Vermeidung der Verwendung vonradioaktiven Isotopen und seiner hohen Empfindlichkeit als Routineverfahren für dieDiagnostik Verbreitung erlangt. Beim Vergleich der einzelnen Meßergebnisse verschiedenerAutoren müssen die Aufbereitungen der Blutproben (Serum versus Plasma), die Isolierung derHormone (Extraktion, chromatographische Trennung) und die unterschiedlichen Assaysmitberücksichtigt werden (WILDT et al., 1979).

Bei der Blutuntersuchung wird die zum Zeitpunkt der Entnahme sich im Blut befindlicheHormonmenge bestimmt. Da gerade bei Hormonen zirkadiane Rhythmen beschrieben werden,haben STEINETZ et al. (1990) Progesteron, Relaxin, Prolaktin und 17�-Östradiol auf ihreTagesschwankungen untersucht. Diese konnten nur bei Progesteron in der dritten bis sechstenTrächtigkeitswoche nachgewiesen werden. Die morgendlichen Messungen ergaben teilweisemehr als doppelt so hohe Progesteronwerte wie die am Nachmittag durchgeführten. NETT etal. (1975) hingegen wiesen auch bei 17�-Östradiol erhebliche Schwankungen innerhalb von 3Stunden nach.

Progesteron

Im Verlauf der einzelnen Sexualstadien weist das Progesteron deutlich unterschiedlicheKonzentrationen im Blut auf. Ausgehend von einem niedrigen Basalwert steigt dieProgesteronkonzentration bei der Hündin bereits vor dem Eisprung deutlich an und dieMessung dieses Hormons wird deswegen zur Präzisierung der Deckzeitbestimmungverwendet (ARBEITER et al., 1991).

OLSON et al. (1982) konnten bei 6 Hündinnen während des Anöstrus und des ProöstrusProgesteronwerte von weniger als 1 ng/ml Blut nachweisen. Der Progesteronspiegel stieg amTag des präovulatorischen LH-Peaks über 1 ng/ml und erreichte um den 15. Tag nach demLH-Peak bis zu 25 ng/ml.

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Laut CONCANNON u. LEIN (1989) werden während der Zeit des Anöstrus bis zum spätenProöstrus Progesteronwerte unter 1 ng/ml festgestellt. Während der Zeit des LH-Peaks steigtdie Progestronkonzentration auf 2 - 4 ng/ml. Zur Zeit der Ovulation erreicht sie 4 - 10 ng/ml.Ein Peak von 15 - 80 ng/ml wird um den 15. - 30. Tag nach dem LH-Peak gemessen, danachfällt die Konzentration kontinuierlich ab. Bei nicht trächtigen Hündinnen sinkt derProgesterongehalt zwischen Tag 50 und 120 bis unter 1 ng/ml. Bei trächtigen Hündinnenkommt es zu einem ähnlichen Abfall, wobei jedoch immer Progesteronkonzentrationen von3 - 15 ng/ml bis zu zwei bis drei Tage vor der Geburt nachgewiesen werden können. Eskommt zu einem Abfall auf 1 - 2 ng/ml während der letzten 24 Stunden vor der Geburt.

Für die tierärztliche Praxis wurden EIA-Schnelltests zur Bestimmung von Progesteronentwickelt, wobei die Konzentration semiquantitativ mittels eines Farbumschlages bestimmtwird (z. B. „TARGET Canine Ovulation Test“). Dieser ermöglicht eine Differenzierungaufgrund des Farbumschlages von blau zu farblos in 4 Stufen: 0 - 1 ng/ml, 1 - 2,5 ng/ml, 2,5 - 5ng/ml und > 5ng/ml, wobei bei diesem Testverfahren zur Zeit des LH-Peaks Werte von 1 - 2,5 ng/ml gemessen werden (entnommen aus dem Beipacktext zum “TARGET CanineOvulation Test” der Firma Albrecht). BOUCHARD et al. (1991) verglichen einen anderenkommerziellen EIA-Test, genannt „OVUCHECK�, Cambridge Veterinary Science,Cambridge, England” mit einem Radioimmunoassay (RIA) und konnten eine Korrelationzwischen den unterschiedlichen Messungen nachweisen. Allerdings ergaben sich zwischenden absoluten Meßwerten Unterschiede. Die Autoren empfehlen daher anzugeben, auf welcheWeise die Progesteronkonzentration ermittelt wurde. ARBEITER et al. (1991) untersuchtenebenfalls „OVUCHECK�”, diesmal aber in Vergleich mit dem EIA “Serozyme�-Progesteron”(Serono Diagnostika GmbH, Wien), einem auf Magnettrennungs-Basis arbeitenden EIA-System mit digitaler Anzeige. Hier entsprach der semiquantitativ geschätzte Wert des TestsOvucheck > 10ng/ml einem digital gemessenen Wert des EIAs “Serozyme�-Progesteron” von21,2 ng/ml (s = 9,8, n = 43).

NETT et al. (1975) bestimmten die Progesteronkonzentration im Blut mit einem RIA.Während des Proöstrus wurden Werte von 1,7 � 0,3 ng/ml gemessen, im frühen Östrus Wertevon 3,5 � 0,3 ng/ml. 2 Tage nach dem LH-Peak stiegen die Progesteronkonzentrationen underreichten ein Maximum von 24,2 � 3,3 ng/ml 7 Tage nach dem LH-Peak. Im Diöstruskonnten bei nicht trächtigen Hündinnen 18,2 � 6,06 ng/ml, bei trächtigen Hündinnen Wertevon 14,88 � 10,32 ng/ml gemessen werden.

DREIER et al. (1987) gaben einen Progesteronmittelwert für den fünften Zyklustag(Proöstrus) von 3 ng/ml an, für den 10. Tag (Übergang Proöstrus/Östrus) 15 ng/ml, für dasEnde des Östrus 28ng/ml. Um den 50. Tag wurden 15 ng/ml gemessen, danach fiel dieProgesteronkonzentration kontinuierlich auf 2 ng/ml (am 80. Zyklustag) ab.

ONCLIN u. VERSTEGEN (1997) untersuchten den Progesteronspiegel bei 10 trächtigenund bei 10 nicht trächtigen Hündinnen. Sie gaben für den Tag des LH-Peaks 1,9 � 0,1 ng/mlan. 7 Tage später wurde ein Plateau von 35,1 � 2,6 ng/ml erreicht, welches die folgenden 3Wochen anhielt. Ab dem 30. Tag nach dem LH-Peak fiel die Progesteronkonzentrationkontinuierlich ab und erreichte bei trächtigen Hündinnen um den 64. Tag (� 1 Tag)

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Basalwerte, während bei nicht trächtigen Hündinnen diese erst um den 67. Tag (� 2,1 Tage)erreicht wurden.

Östrogen

OLSON et al. (1982) bestimmten 17�-Östradiol im Blut. Dies ist eine der wenigenUntersuchungen, in denen auch bei Hündinnen im Anöstrus die Östrogenblutkonzentrationregelmäßig, nämlich täglich und über eine längere Zeit untersucht worden ist. Interessantdabei ist, daß bei 3 der 6 Hündinnen die Östrogenhöchstkonzentrationen außerhalb derLäufigkeit gemessen worden sind (in der Zeit vom 61. bis zum 47. Tag vor Beginn desProöstrus). Bei einer Hündin wurde am Tag vor Beginn des Proöstrus derÖstrogenmaximalwert gemessen, bei einer Hündin während des Proöstrus und bei einerHündin am ersten Tag der Duldungszeit (siehe auch Abschnitt 2.1.- Anöstrus). DieÖstrogenkonzentrationen im Anöstrus waren denen im Proöstrus sehr ähnlich (Anöstrus:20,2 � 6,1 pg/ml bis zu 45,7 � 19,7 pg/ml; Proöstrus: 24,4 � 6,6 pg/ml bis zu 44,8 � 14,8pg/ml). Die niedrigsten Östrogenwerte konnten 15 Tage vor dem LH-Peak gemessen werden(7,9 � 2,8 pg/ml), danach folgte ein kontinuierlicher Anstieg.

CONCANNON u. LEIN (1989) gaben in einem Überblicksartikel folgende Östradiolwertean: 5 bis 10 pg/ml im späten Anöstrus, 10 bis 20 pg/ml bei Beginn des Proöstrus,Maximalwerte von 50 bis 100 pg/ml gegen Ende des Proöstrus und 1 bis 2 Tage vor dem LH-Peak; während des Östrus sank die Konzentration ab.

DREIER et al. (1987) gaben einen Östrogenmittelwert für den fünften Zyklustag (Proöstrus)von 110 pg/ml, für den 10. Tag (Übergang Proöstrus/Östrus) von 90 pg/ml, für das Ende desÖstrus von 50 pg/ml an. Um den 50. Tag wurden 4 pg/ml gemessen.

NETT et al. (1975) bestimmten im Blut mit einem RIA die 17�-Östradiolkonzentration.Während des Proöstrus wurden Werte von 56,7 � 6,5 pg/ml gemessen, 24 Stunden vor demLH-Peak die höchsten Östrogenwerte mit 68,9 � 11,0 pg/ml, danach fielen die Östrogenwerteab und erreichten 5 Tage nach dem LH-Peak Basalwerte von 17,8 � 6,3 pg/ml. Im Diöstruskonnten bei nicht trächtigen Hündinnen am 28. Tag 23,4 � 7,28 pg/ml, und bei trächtigenHündinnen 14,28 � 1,6 pg/ml gemessen werden. Interessant ist weiters, daß bei Blutabnahmealle 20 Minuten über einen Zeitraum von 3 Stunden am zweiten Tag der StehzeitSchwankungen in der Östrogen- und Progesteronkonzentrationsmessung auftraten (Östrogen:36,4 pg - 104,9 pg/ml; Progesteron: 1,6- 5,0 pg/ml; n = 5).

WILDT et al. (1979) sehen eine mögliche Erklärung für die zum Teil stark differierendenMeßergebnisse in den unterschiedlichen subjektiven Kriterien, die zur Bestimmung des erstenTages der Läufigkeit herangezogen werden. In ihrer Studie untersuchten sie während 25Läufigkeiten im Serum Östron-, Östradiol- und Progesteronkonzentrationen. Die Zyklenwurden in Bezug auf den Tag des LH-Peaks normalisiert. Insgesamt konnte der 17�-Östradiolhöchstwert 2 Tage vor dem LH-Peak (42,8 � 5,9 pg/ml) gemessen werden, währendÖstron etwas später sein Maximum erreichte (0,5 Tage vor dem LH-Peak: 57,0 � 9,9 pg/ml).Allgemein folgte auf Anstieg und Abfall der 17�-Östradiolkonzentrationen 12 - 36 Stundenspäter eine ähnliche Veränderung der Östronkonzentration. Die Autoren führen die zeitliche

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Verzögerung der Veränderung der Östronkonzentration darauf zurück, daß ein Teil derÖstronmenge direkt vom Hundeovar gebildet wird, während der Rest aus 17�-Östradiolsynthetisiert wird und deshalb die erhöhten Werte einige Zeit nach den erhöhten 17�-Östradiolwerten im Blut gemessen werden. Sie schließen aufgrund ihrer Ergebnisse, daß derProgesteronanstieg im Blut einer bestimmten Zeit im Zyklus zugeordnet werden kann,während die Östrogensekretion variabler zu sein scheint und auch von der Anzahl der sichallmählich am Ovar entwickelnden Follikel abhängig ist.

Sexualsteroidmessung im Harn

Harnsammlung

Eine Alternative zur Messung von Hormonen im Blut ist die Messung im Harn. DieSammlung der dazu nötigen Proben kann im Gegensatz zur Blutabnahme auch nicht invasivdurchgeführt werden und ist somit mit weniger Streß für den Hund verbunden. Die Sammlungkann auf mehrere Arten erfolgen (BISTNER u. FORD, 1995):

�� Die Harnprobennahme kann direkt beim Harnabsatz aufgefangen werden und erfordertkeine tierärztliche Hilfe.

�� Harn kann aber auch bei Tieren, die in einem Käfig mit Gitterboden gehalten werden, ohnedirekte Manipulation am Tier von außen entnommen werden. Wenn man die Harnmengeeines ganzen Tages auffängt, kann die tägliche Menge an Hormonen bestimmt werden, dieüber den Harn ausgeschieden wird (BATCHELOR et al., 1972; HORST et al., 1973).

�� Neben den zuvor genannten nicht invasiven Methoden gibt es auch zwei invasiveMethoden Harn zu nehmen, nämlich die Zystozentese und das Setzen eines Harnkatheters.Letztere Methode bietet die Möglichkeit, die Harnmenge eines ganzen Tages ohne Verlusteaufzufangen.

Gemessene Konzentrationen

Besonders bei Hormonen mit niedriger Konzentration im Blut kann es, wenn das Hormonüber die Niere ausgeschieden wird, zu einer Anreicherung im Harn kommen. Bei Östrogenen,welche ja meist in niedriger Konzentration vorkommen, finden wir im Blut Konzentrationenim Pikogramm-Bereich, im Harn im Mikrogramm-Bereich. Dies ermöglicht eine Messung imHarn noch dann, wenn im Blut nichts mehr nachgewiesen werden kann (RICHKIND, 1983).Anders als bei der Messung im Blut ist die Messung im Harn keine Momentaufnahme derHormonkonzentration im Körper, sondern sie korreliert mit der Hormonkonzentration imKörper während des Zeitraums, in dem die entnommene Harnmenge produziert wurde(RICHKIND, 1983).

Da Kreatinin primär in den Glomeruli der Niere aus dem Blut filtriert wird und nicht mehrrückresorbiert werden kann, kann man bei gleichzeitiger Bestimmung derKreatininkonzentration im Harn über das Hormon/Kreatinin-Verhältnis auf dieGesamttagesmenge der über den Harn ausgeschiedenen Hormone zu schließen, ohne dasTagesvolumen der Harnproduktion sammeln zu müssen (RIJNBERK, 1996).

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Hauptmetaboliten

Östrogene können über den Harn und über den Kot ausgeschieden werden. Für denNachweis ist es von Interesse, welche Hauptmetaboliten im Harn zu finden sind und inwelcher Form sie auftreten. Östrogene können aufgrund ihrer chemischen Struktur alsunkonjugierte, lipophile und damit nicht wasserlösliche, oder aber als konjugierte,wasserlösliche Östrogene ausgeschieden werden. MONFORT et al. (1997) wiesen nach, daß94 % der Östradiol-Metaboliten im Harn von Afrikanischen Wildhunden konjugiert waren. Inkonjugierter Form kommen Östrogene als Glucuronide, Sulfatide und Phosphatide vor.STIMMEL (1955) zeigte, daß bei subkutaner Applikation von radioaktiv markiertemÖstradiol und Östron an Hunde diese über den Kot beinahe ausschließlich in nichtkonjugierter Form und über den Harn sowohl konjugiert als auch nicht konjugiertausgeschieden wurden. KIRDANI u. SANDBERG (1974) untersuchten die Ausscheidung vonradioaktiv markiertem Östriol. Sie konnten nachweisen, daß innerhalb von vier Stunden26,8 % der verabreichten Menge über den Harn und 32,7 % über die Galle ausgeschiedenwurden.

SIEGEL et al. (1962) zeigten, daß nach intravenöser Gabe von 6,7-³H-17�-Östradiolsowohl ³H-markiertes Östron als auch 17�-Östradiol und 17�-Östradiol im Harn isoliertwerden konnten. Die Östrogene waren vorwiegend glukuronidiert. Östriol war im Harn nichtnachzuweisen. 29 % der verabreichten Menge konnten am ersten Tag aus dem Harn isoliertwerden, 2 % am zweiten Tag. BACHELOR et al. (1971) und BATCHELOR et al. (1972)wiesen während des Anöstrus im Harn mittels der Kober-Ittrich fluorescence reactionGesamtöstrogenmengen von 0,1 �g/24 Stunden nach, im Proöstrus konnten sie bis zu2,2 �g/24 Stunden nachweisen, gegen Ende des Östrus 0,5 �g/24 Stunden. Weiters wurde einesignifikante Korrelation zwischen der Blut- und Harnöstrogenmenge nachgewiesen. Östriolkonnte nicht gemessen werden beziehungsweise war unter der Nachweisgrenze.

Es gab auch einige Untersuchungen mit dem Ziel, bei der Hündin - wie beim Menschen -die Gravidität mittels der Östrogenkonzentration im Harn nachzuweisen. HORST et al. (1973)untersuchten zwei Hündinnen in der Spätgravidität und konnten mittels Gel-Chromatographiesowohl Östriol-, Östron-, 17�-Östradiol- als auch 17�-Östradiol-Fraktionen aus dem Harnisolieren. Die Konzentrationen waren auch hier im �g-Bereich. RICHKIND (1983) verglichdie tägliche Harnöstrogenkonzentration von vier pseudograviden Hündinnen mit der von dreiträchtigen Hündinnen während der frühen Trächtigkeit. Während des 14. - 25. Tages nachdem ersten Deckakt konnten im Vergleich zu den nicht trächtigen Hündinnen bei denträchtigen Hündinnen signifikant höhere Östrogenkonzentrationen gemessen werden (0,6 - 4,9�g/dl, x = 1,87 Gesamtöstrogen/Harn gegenüber 0,3 - 0,4 �g/dl, x=0,34). Dies korreliert mitdem Zeitpunkt der Implantation der Blastozyste. Diese produziert und sezerniert Östrogene.Später konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen trächtigen und nicht trächtigenTieren nachgewiesen werden.

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Ort der Umwandlung

Letztlich bleibt in bezug auf die Hormonmetaboliten im Harn noch die Frage zubeantworten, wo im Körper die im Harn gefundenen Östrogenmetaboliten gebildet werden.Hierzu finden sich in der Literatur einige Hinweise:

KIRDANI u. SANDBERG (1974) verabreichten radioaktiv markiertes Östriol undüberprüften die Exkretion über die Galle und den Harn. Sie wiesen nach, daß es im Gegensatzzum Menschen zu keiner Reabsorption der über die Galle ausgeschiedenen Östriole aus demMagen-Darm-Trakt über den enterohepatischen Kreislauf kommt.

DUPUY et al. (1982) untersuchen die Interkonversion zwischen Östron und Östradiol. Siekonnten zeigen, daß mehr Östradiol zu dem weniger wirksamen Östron umgewandelt wird alsumgekehrt. 60 % des Östrogenmetabolismus findet im Splanchnikus-Gebiet statt.

COLLINS et al. (1976) konnten bei radioaktiv markiertem Östriol keine Umwandlung inandere Östrogenmetaboliten nachweisen. Östriol wird hauptsächlich glukuronidiert über dieNiere ausgeschieden.

COHN u. HUME (1960) applizierten beim Hund radioaktiv markiertes Etiocholanolon undAndrosteron in die Arteria renalis. Die Autoren konnten nachweisen, daß in der Niere in vivobis zu 16,5 % der injizierten Menge innerhalb von sechs bis acht Minuten pro 100 ml Plasmaglukuronidiert wurden.

Sexualsteroidmessung im Kot

Als letzte Variante bleibt die Bestimmung der Sexualsteroide im Kot. Da es in dervorliegenden Arbeit um Aspekte des Sexualsteroid-Vorkommens im Hundekot geht, soll dieMessung der Konzentration im folgenden Abschnitt ausführlicher besprochen werden.

2.5. Messung der Sexualsteroidkonzentration im Kot

Sammlung

So wie die Harnuntersuchung ist die Bestimmung der Sexualsteroide im Kot eine nichtinvasive Methode. Im Gegensatz zur Harnsammlung kann auch bei Tieren in freier Wildbahndas Exkrement relativ problemlos gesammelt werden, weil es nicht in die Erde einsickert.

Hormonvorkommen im Kot

Beim Nachweis von Hormonen im Kot ist zu berücksichtigen, in welcher Form dieHormone ausgeschieden werden. BRUNNER u. MÖSTL (1997) untersuchten vierProgestagenassays zur Bestimmung von Progesteronmetaboliten im Kot bei der Hündin.Hierbei erwies sich ein Enzymimmunoassay mit Antikörpern gegen 20-oxo-3-hydroxy-Pregnan als am besten geeignet. Mittels High Performance Liquid Chromatography (HPLC)konnten die Autoren nachweisen, daß nur eine geringe Menge nicht metabolisiertesProgesteron im Kot vorkommt.

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Da Immunoassays in der Bindungskapazität ihrer Antikörper an die im Kot vorkommendenMetabolite variieren können, empfehlen SCHWARZENBERGER et al. (1997) bei Vergleichvon Untersuchungsergebnissen aus unterschiedlichen Labors die Kreuzreaktionen derjeweiligen Assays zu berücksichtigen. Ein Antikörper kann nämlich im Assay nicht nur dasHapten binden, gegen das er gebildet wurde, sondern auch Substanzen die diesem Hapten inihrer biochemischen Struktur ähnlich sind. Die Kreuzreaktion gibt an, wieviel Prozent einerSubstanzmenge bei 50 %iger Bindung mit diesem Assay gemessen werden können.

Es können daher bei Assays, die eine hohe Kreuzreaktion mit ähnlichen, ebenfalls im Kotvorkommenden Substanzen zeigen, wesentlich höhere Werte gemessen werden, als bei Assaysmit geringer Kreuzreaktion. Assays, die mehrere biochemisch ähnliche Strukturenmiterfassen, werden gruppenspezifische Assays genannt. Diese gruppenspezifischen EIAseignen sich besonders gut für Hormonbestimmungen im Kot, weil hier verschiedensteMetaboliten vorkommen, die in einem solchen Test gleichermaßen erfaßt werden.

Kot und Harn als Probenmatrix

Der feste Aggregatzustand des Kots hat - im Vergleich zum Harn - den Nachteil, daß einehomogene Zusammensetzung, wie sie zur Bestimmung von Sexualsteroiden wünschenswertist, nicht unbedingt vorausgesetzt werden kann.

Es wurde überlegt, für den Kot eine Substanz zu finden, die ähnlich dem Kreatinin beimHarn eine Aussage über die Dichte von in der Ausscheidung befindlichen Substanzen zuläßt.WASSER et al. (1993) konnten zeigen, daß der Cholestanongehalt mit dem Rohfasergehalt imKot korreliert. Trotzdem erachten sie und auch SHIDELER et al. (1993) es als nichtnotwendig, den Rohfasergehalt im Kot bei den Hormonmessungen zu berücksichtigen, weilunabhängig vom Rohfasergehalt eine gute Relation zwischen Serum- und Kot-Konzentrationen nachgewiesen werden konnte.

Abgesehen von den Absolutwerten an Sexualsteroiden in der Ausscheidung ist auch dasAufteilungsverhältnis zwischen Kot und Harn von Interesse. Bei Fleischfressern wurdenVerhältnisse der Steroidausscheidung zwischen Harn und Kot bestimmt. Bei der Katze kamenSHILLE et al. (1990) zu der Schlußfolgerung, daß 97,1 % der intravenös verabreichten Mengean radioaktiv markiertem Östradiol über den Kot ausgeschieden werden. MONFORT et al.(1997) untersuchten die Ausscheidung von radioaktiv markiertem Östradiol und Progesteronbeim afrikanischen Wildhund (Lycaon pictus). Es wurden von der verabreichten Menge58,9 % Östradiol und 60,3 % Progesteron über den Kot ausgeschieden und der Rest (41,1 %Östradiol und 39,7 % Progesteron) über den Harn. In dieser Studie waren im Harn über 90 %der Metaboliten konjugiert. Im Kot konnten fünf Metaboliten des verabreichten radioaktivmarkierten 3H-Östradiols mittels HPLC nachgewiesen werden, wobei zwei Metabolitenzeitgleich mit den Standards Östradiol und Östron eluierten, die 44 % und 56 % derGesamtradioaktivität ausmachten. Bei Gabe von radioaktiv markiertem 14C-Progesteronwurden mindestens 5 Metaboliten mittels HPLC nachgewiesen, wobei keiner mit Progesteroncochromatographierte. Bei der Messung mit dem in dieser Untersuchung eingesetzten RIA fürProgesteron wurde nur einer dieser Metaboliten erfaßt. Die Progesteronmetaboliten wurden

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mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie als diverse 20-oxo-Pregnane identifiziert.Allerdings ist Lycaon pictus innerhalb der Familie der Caniden sehr weit entfernt verwandtzum Hund, so daß ein Rückschluß auf den Hund nur bedingt angebracht scheint. Für denHund selbst sind keine diesbezüglichen Studien publiziert worden.

Einfluß des Feuchtigkeitsgehalts

Abhängig von den Umständen der Verdauung kann der Feuchtigkeitsgehalt im Kot starkvariieren. BROWN et al. (1994) untersuchten beispielsweise bei der Katze denFeuchtigkeitsgehalt im Kot und stellten Variationen zwischen 41 % und 80 % fest. Aus dieserProblematik heraus wurden zwei Ansätze zur Konzentrationsbestimmung entwickelt:

�� Die Arbeitsgruppe der University of Washington (BROWN u. WILDT, 1997; BROWN etal., 1994; MONFORT et al., 1997; WASSER et al., 1995; WASSER et al., 1991;WASSER et al., 1988; WASSER et al., 1994; WASSER et al., 1993) trocknet dieKotproben und bestimmt den Hormongehalt pro Gramm Trockenmasse Kot.

�� Die Arbeitsgruppen der University of California, Davis (GUDERMUTH et al., 1998;SHIDELER et al., 1993; SHILLE et al., 1990) und die Arbeitsgruppe derVeterinärmedizinischen Universität Wien (MÖSTL u. BRUNNER, 1997a u. 1997b;MÖSTL et al., 1993; MÖSTL et al., 1987; MÖSTL et al., 1983; PALME u. MÖSTL, 1993;PALME u. MÖSTL, 1997) hingegen bestimmen den Hormongehalt pro GrammOriginalsubstanz.Generell dürfte aber die Konzentrationsschwankung der Trockensubstanz in bezug auf die

Originalsubstanz nicht mehr als 10 % betragen, sodaß die verfahrensimmanentenUnterschiede zumeist vernachlässigt werden können. BROWN et al. (1994) verglichen diebeiden Methoden miteinander. Sie entnahmen von einem Kotballen mehrere Proben undverglichen die gemessenen Werte nach Anwendung unterschiedlicher Extraktionsverfahren,aber auch nach mehrfacher Anwendung desselben Extraktionsverfahrens. Man konnte eineKorrelation zwischen gefriergetrockneten und nassen Proben nachweisen. Allerdingsschwankten die Meßwerte selbst bei ein- und derselben Methode stark. BROWN u. WILDT(1997) empfehlen zur Verringerung der Meßwertschwankungen die Kotproben vor derAufbereitung gut zu durchmischen.

Messung der Sexualsteroidkonzentration im Kot bei Caniden

Während die Bestimmung von Sexualsteroiden im Kot allgemein schon als einigermaßenerforscht angesehen werden kann, finden sich nur wenige Vorarbeiten, die sich konkret mitden Caniden und insbesondere mit dem Hund auseinandersetzen:

Den ersten Versuch, bei Caniden Fäkalsteroide zu messen, führten WASSER et al. (1995)beim weiblichen Mähnenwolf (chrysocyon brachyurus) durch. Dieser Canide ist in seinerfreien Wildbahn im Brasilianischen Hochland durch den schnellen Habitatschwund extremgefährdet und darum ist seine Fruchtbarkeitsüberwachung von großer Bedeutung. Es wurdenbei neun in Zoos gehaltenen weiblichen Wölfen 3 - 5 Monate lang 2 - 3 mal wöchentlichKotproben genommen. Die Kotproben wurden getrocknet und in einem Verfahren extrahiert,

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das im wesentlichen aus 20 Minuten Kochen mit Ethanol bestand. Die Messung vonÖstrogen- und Progesteronkonzentrationen pro Gramm Trockensubstanz erfolgte mittels RIA.Fäkale Östrogene und auch Progesteron waren bei den 4 trächtigen Wölfinnen im Mittelwerthöher als bei den 4 nicht trächtigen Wölfinnen während der 63 Tage nach der Ovulation. Einestatistische Signifikanz im Unterschied in der Östrogenkonzentration wurde ab dem 20. Tagnach der Ovulation erreicht, bei Progesteron konnte diese bereits nach dem 5.postovulatorischen Tag nachgewiesen werden. So ist es möglich, über die Messung derFäkalsteroide zwischen Trächtigkeit und Nicht-Trächtigkeit zu unterscheiden und das beiWölfen in Zoohaltung vorkommende Verschlingen der frischgeborenen Welpen kann sovermieden werden. Die genauen Meßergebnisse sind in Tabelle 1 angeführt.

MONFORT et al. (1997) untersuchten einen anderen Caniden, den afrikanischen Wildhund(lycaon pictus). Sie bestimmten neben dem Ausscheidungsverhalten der Sexualsteroide desafrikanischen Wildhundes (bereits in Abschnitt 2.4 ausgeführt) eineinhalb Jahre dieSexualsteroidkonzentration im Kot und im Harn sowohl für zwei männliche als auch einenweiblichen afrikanischen Wildhund. Die Extraktion der Fäkalsteroide erfolgte wie beiWASSER et al. (1995) beschrieben. Gesamtöstrogene wurden mittels eines kommerziellenRadioimmunoassays ((125I) RIA ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA) gemessen. Dieser erfaßteeinen Großteil der im Kot ausgeschiedenen Östrogenmetaboliten. Im Gegensatz dazu konntenur ein Progesteronmetabolit von fünf im HPLC-Verfahren getrennten mit dem hierverwendeten RIA (bei WASSER et al. (1994) beschrieben) gemessen werden. Dies könnte dieim Vergleich zu WASSER et al. (1995) niedrigen Progesteronwerte erklären. Die Autorengeben an, daß etwa 30 % der im Kot ausgeschiedenen radioaktiven Progesteronmetabolitenüber 90 % der im RIA gemessenen Progesteronkonzentration ausmachten. Die genauenMeßergebnisse sind in Tabelle 1 angeführt.

MÖSTL u. BRUNNER (1997a; 1997b) setzen sich zum ersten Mal mit dem Haushundauseinander. Sie untersuchten bei 12 Hündinnen unterschiedlicher Rassen die Progesteron-und Androgenmetaboliten in den Faeces. Für den Nachweis von Progesteron wurden 0,5 gKot mit 2,5 ml destilliertem Wasser und 3 ml Methanol extrahiert. Nach 30 MinutenSchütteln wurden die Proben 15 Minuten zentrifugiert (1500 g), und ein Teil des Überstandesnach entsprechender Verdünnung mit dem Assaypuffer in den EIA eingesetzt. Mittels HPLCkonnten im Kot hauptsächlich 3�-hydroxylierte Progestagene mit einer 20-oxo-Gruppenachgewiesen werden. Aus diesem Grund eignete sich auch, im Vergleich mit zwei anderenEIAs und einem RIA, ein EIA, dessen Antikörper gegen 20-oxo-3-hydroxypregnane gerichtetwaren, zum Nachweis von Progesteronmetaboliten im Kot am besten. Die Autoren stelltenmit diesem EIA ein Ansteigen der Progesteronkonzentration beim Weibchen bereits einigeTage vor dem Deckakt fest. Es wurden am Tag des Deckaktes Maximalwerte von 5,77�mol/kg Kot (Medianwert) erreicht. Die höchsten Werte wurden bis zum ersten Monat nachdem Deckakt gemessen. Danach fiel die Konzentration langsam ab und erreichte am Ende deszweiten Monats 2,68 �mol/kg Kot (Medianwert).

Die Ausscheidung von Androgenmetaboliten wurde ebenfalls während der Läufigkeituntersucht (MÖSTL u. BRUNNER, 1997b). 10 Tage vor dem ersten Deckakt stiegen die

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Werte an (0,93 �mol 17-oxo-Androgenäquivalent/kg Kot), erreichten kurz vor dem Deckaktihren Höchstwert (2,2 �mol/kg Kot mit Maximalwerten bis zu 10 �mol/kg Kot) und fielendanach wieder ab. Daraus schlossen die Autoren, daß das Ovar 17-oxo-Androgene oder seineVorläufer produziert und daß die Ovaraktivität über Androgenmessung im Kot überwachtwerden kann.

BRUNNER (1995) ermittelte auch die Östrogenkonzentrationen im Kot. Die Extraktionerfolgte wie bei MÖSTL et al. (1987), der EIA wie bei PALME u. MÖSTL (1993)beschrieben. In dieser Arbeit konnten während der ersten 12 Tage der Läufigkeit bei 6untersuchten Hündinnen Östrogenkonzentrationen von 411,22 � 79,8 pmolÖstronäquivalent/kg Kot gemessen werden; vom 13. - 20. Tag sanken die Werte auf163 � 73,52 pmol/kg Kot. Allgemein waren die Östrogenwerte sehr niedrig. Für denVergleich mit den anderen Publikationen siehe auch Tabelle 1.

GUDERMUTH et al. (1998) untersuchten bei 22 Beagle-Hündinnen dieFäkalkonzentrationen von Östradiol, Testosteron und Progesteron. Es wurden alle ein bis vierTage Kotproben genommen, und zwar vom späten Anöstrus durchgehend bis zum 76. Tagnach dem LH-Peak. Dies entsprach der Zeit bis zum Ende des Metöstrus bei den 11 nichtträchtigen Hündinnen, beziehungsweise der Zeit bis zum Ende der Trächtigkeit inklusive derersten Zeit der Laktation bei den 11 trächtigen Hündinnen.

Sowohl für die Östradiol-, Testosteron- als auch die Progesteronextraktion wurden dieProben mit einer modifizierten Phosphat-Pufferlösung, die 20 % Methanol enthielt, versetztund zweimal jeweils 24 Stunden kontinuierlich geschüttelt. Der Hormonnachweis in denExtrakten erfolgte mittels EIA. Für den Progesteronassay wurde ein Antikörper gegenProgesteron-11�-hemisuccinat-GSA verwendet. Für den Östrogennachweis wurde einAntikörper gegen Östradiol benutzt. Der Östrogenassay war sehr spezifisch für 17�-Östradiolund zeigte eine Kreuzreaktion zu 100 % mit 17�-Östradiol, nur zu 3,3 % mit Östron, undweniger als 1 % mit anderen Steroiden.

Die Autoren konnten für Östrogen, Testosteron und Progesteron eine hohe Korrelationzwischen der Hormonkonzentration im Serum und der Hormonkonzentration im Kot desdarauffolgenden Tages nachweisen. Im Gegensatz zu den niedrigen Hormonkonzentrationenim Anöstrus kam es während der Läufigkeit um den Zeitpunkt des LH-Peaks im Blut zueinem Ansteigen der Östrogen- und Testosteronkonzentration. Zu einem zweiten Ansteigenkam es nur bei trächtigen Hündinnen während des 26. bis 45. Tag nach dem LH-Peak.

Progesteron stieg 1 bis 3 Tage nach dem ovulatorischem LH-Peak an und blieb - imVergleich zu anöstrischen Hündinnen - in der frühen, mittleren und späten Lutealphase erhöht.Auch hier kam es um den 26. - 45. Tag zu einem signifikanten Unterschied zwischen dennicht trächtigen Hündinnen und den trächtigen Hündinnen (164 � 23 ng/g Kot bzw. 401 � 60ng/g Kot). Zwischen dem Östrogenbasalwert und dem Östrogenmaximalwert wurde ein 5 - 10facher Anstieg der Hormonkonzentration im Kot gemessen, im Gegensatz zu dem im Blutgemessenen 12 - 50fachen Anstieg. Auch bei drei ovariektomierten Hündinnen wurden dieHormonkonzentrationen im Kot bestimmt (Östrogen: 27 � 2 ng/g Kot, Testosteron: 36 � 6

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ng/g Kot und Progesteron: 86 � 15 ng/g Kot). Die Autoren geben in der Diskussion an, daßdie Herkunft der Basalwerte bei ovariektomierten Tieren und bei anöstrischen Tieren nichtuntersucht wurde. Nach Meinung der Autoren sind die gemessenen Hormone adrenalen oderaber auch ovariellen Ursprungs oder eine nicht spezifische Reaktion des Assays. Dieeinzelnen Meßwerte sind in der Tabelle 1 angeführt.

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Tabelle 1: Vergleich der Publikationen, die sich mit der Messung von Hormonen im Kot vonCaniden beschäftigen

Publikation WASSER et al. 1995 MONFORT et al. 1997 MÖSTL und BRUNNER 1997a,bBRUNNER 1995

GUDERMUTH et al.1998

Canidenart Mähnenwolf afrikan. Wildhund Hündinnen verschiedener Rassen BeaglesKotaufbereitung getrocknet getrocknet feucht feuchtExtraktions-verfahrenfür Östrogene

Ethanol/kochend wie bei WASSER 1,5 ml KOH + 0,5 ml Chloroform/n-Hexan

modifizierterPhosphatpuffer(mit Methanol)2x 24 h geschüttelt

Extraktions-verfahrenfür Progesteron

Ethanol/kochend wie bei WASSER 2,5 ml H2O und 3 ml Methanol modifizierterPhosphatpuffer(mit Methanol)2x 24 h geschüttelt

Progesteron-Assay RIA (125I)gruppenspezifisch fürProgesteron

wie bei WASSER gruppenspezifischer EIA(Antikörper gegen20-oxo-3-Hydroxypregnan)

gruppenspez. EIA(Antikörper gegenProgesteron)

Östrogen- Assay RIA (125I) RIA ICNBiomedicals,gruppenspezifisch

gruppenspezifischer EIA(Antikörper gegenÖstradiol-17�-17HS:BSA)

EIA, spezifisch f.Östradiol

VerwendeteMeßeinheitfür Östrogen

ng/gTrockensubstanz Kot


pmol Östronäquivalent/kg Kot(pmol/kg x 0,00027= ng/g)

ng/g Kot

Östrogen in ng/gÖstrus

240 (Maximum)n=8 Hündinnen

200 (Maximum)n=1 Tier

0,1 � 0,0 (411,22 � 79,8pmol/kg, 1.-12. Tag)0,0 � 0,0 (163 � 73,52pmol/kg, 13.-20. Tag)n=6 Hündinnen

302 � 38 (Mittelwert)n=22 Hündinnen

Östrogen in ng/gMetöstrus trächtig

84 � 7,02 (63 Tage postovulationem)n=4 Hündinnen

keine Angabe Jeweils 10 Tage zusammengefaßt, Mittelwerte 0,0 - 0,1(146-300 pmol/kg Kot)(52 Proben von 3 Hündinnen)

71 � 8 frühe117 � 13 mittlere92 � 5 späteLutealphasen=11 Hündinnen

Östrogen in ng/gMetöstrusnicht trächtig

46,01 � 2,17 (63 Tage postovulationem)n=4 Hündinnen

Jeweils 10 Tage zusammengefaßt, Mittelwerte 0,0 (130-199 pmol/kg Kot)(21 Proben von 3 Hündinnen)


Östrogen in ng/gAnöstrus

10-50 57 � 5n=22 Hündinnen

Östrogen in ng/gkastrierte Hüdinnen

27,2n=3 Hündinnen

VerwendeteMeßeinheitfür Progesteron

�g/gTrockensubstanz Kot(�g/g x 1000 = ng/g)


�mol Progesteronäquivalent/kg Kot (pmol/kg x 314.5= ng/g)

ng/g Kot

Progesteron ng/gDeckzeit

1814,5 (5,77 pmol/kg)n=12 Hündinnen

111 � 16(nicht trächtig)96 �12 (trächtig)

Progesteron ng/gMetöstrus trächtig

27200 � 2650 (63 Tagepost ovulationem)n=4 Hündinnen

80 (im Vergleich zuWASSER 1/1000 desMeßwertes)

1. Monat: 3281,3 (10,45pmol/kg Median, Meßwertebis 20-30 pmol/kg)Ende 2. Monat: 842,9(2,68 pmol/kg)n=12 Hündinnen


Progesteron ng/gMetöstrusnicht trächtig

7600 � 730 (63 Tage postovulationemn=4 Hündinnen


Progesteron ng/gAnöstrus

63,9n=22 Hündinnen

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3. Fragestellung

Enzymimmunoassays zum Nachweis von Östrogenen im Kot sind bei Rindern, Pferden,Ziegen und Schafen zur Trächtigkeitsdiagnose etabliert (BAMBERG et al., 1986). Bei diesenSpezies werden während der Trächtigkeit plazentäre Östrogene gebildet (HOFFMANN,1994). Hier finden sich Östrogenkonzentrationen im Blut im Nanogramm-Bereich. Da die zuerwartende Östrogenmenge im Kot groß ist, kann mit Extraktionsverfahren gearbeitet werden,die die ursprüngliche Substanz stark verdünnen.

Im Gegensatz dazu kommt es bei der Hündin zu keiner graviditätsbedingtenÖstrogenproduktion in der Plazenta (HOFFMANN, 1994). Bei der Hündin findet man dieÖstrogenmaxima im Blut während der Läufigkeit im Pikogramm-Bereich (siehe Abschnitt2.2). Die Hündin reagiert auf höhere Östrogenkonzentrationen im Blut empfindlich, wie siebei Östrogengaben durch den Tierarzt oder bei Östrogen-produzierenden Tumoren auftretenkönnen (siehe Abschnitt 2.3). Es könnte sein, daß bei vermehrter Östrogenproduktion einbeschleunigter Stoffwechsel die Östrogenmenge im Blut niedrig hält.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, folgende Fragen zu beantworten:

Gibt es eine Möglichkeit, im Kot von Hündinnen Östrogene in der zu erwartenden niedrigenKonzentration nachzuweisen?

Welche Endprodukte kommen bei der Hündin im Kot vor?

Kann man diese mit den herkömmlichen Enzymimmunoassays nachweisen?

Kann man durch Kotproben erkennen, ob die Hündin sich im Anöstrus befindet (imGegensatz zu kastrierten Hündinnen, die klinisch nicht von Hündinnen im Anöstrus zuunterscheiden sind)?

Wieweit hat dabei das Gewicht, die Größe und die Rasse, Einfluß auf den Östrogengehalt imKot der Hündin?

Kann man durch tägliche Östrogenbestimmung im Kot die Ovaraktivität über längere Zeitverfolgen ohne täglich Blut abnehmen zu müssen?

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4. Material und Methoden

Die Planung der Dissertation erfolgte im Frühjahr 1998, Beginn der Probennahme war Juli1998, Ende der Probennahme April 1999.

4.1. Kotprobensammlung

Um eine systematische Untersuchung der Hormone zu gewährleisten, mußte zunächst eineausreichend große Anzahl an Proben gesammelt werden. Für die Studie von Interesse warinsbesondere die Östrogenausscheidung von Hündinnen während der Läufigkeit unternormalen Haltungsbedingungen. Deswegen wurden die notwendigen Kotproben von denHundehaltern eingesammelt. Eine Sammlung unter Laborbedingungen (Haltung im Zwinger)hätte zwar gegenüber der gewählten Sammlungsmethode den Vorteil eines standardisiertenUmfelds geboten, aber keine repräsentative Untersuchung der Hundepopulation geliefert.

61 Hündinnen, 33 von verschiedenen Haltern und Züchtern, 18 Rottweilerhündinnen derMilitärhundestaffel Kaisersteinbruch und 10 Hündinnen des Wiener Tierschutzvereinesstanden in dieser Studie zur Verfügung. Tabelle 2 gibt einen Überblick über die Verteilungder Hündinnen und deren Sexualstatus.

Tabelle 2: Übersicht über Anzahl der Versuchstiere, aufgeschlüsselt nach Herkunft undSexualstatus während der Untersuchung

Kategorie Halter Militär Tierschutzhaus gesamtnur läufig 12 1 0 13nur nicht läufig 1 11 3 15läufig +nicht läufig

9 6 0 15

kastriert 11 0 7 18gesamt 33 18 10 61

Bei der Auswahl der Hündinnen war der Sexualstatus von Interesse:

�� Probensammlung während der Läufigkeit: Von besonderem Interesse waren Hündinnen(n = 28) während der Läufigkeit. Der Sammelplan sah die Sammlung einer Kotprobetäglich vom ersten bis zum 20. Tag der Läufigkeit vor. Als erster Tag wurde der Tagdefiniert, an dem der Hundehalter erste Blutungen bemerkte. Während der Läufigkeitwurden 8 Hündinnen gedeckt, wobei bei 6 Hündinnen die Deckung erfolgreich war.

�� Probensammlung vor der Läufigkeit: Zusätzlich wurden die Hundehalter gebeten, einige

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Kotproben aus der Zeit vor der Läufigkeit als Referenz zu sammeln. Unglücklicherweiseist dieser Teil der Sammlung nur bei 15 der Hündinnen geglückt. Deswegen wurdenzusätzlich einige Proben von 15 nicht läufigen, nicht kastrierten Hündinnen mitverwendet.

�� Probensammlung bei kastrierten Hündinnen: Zum Vergleich mit den obigen Tierenwurden Kotproben von 18 kastrierten Tieren gesammelt.Die Kotproben (ca. 5 g) wurden in numerierten Plastikröhrchen gesammelt und bis zur

Verarbeitung bei -20°C tiefgefroren gelagert.

Um Informationen für eine eventuelle rechnerische Synchronisation der Tage desSexualzyklus zu erhalten, wurde den Hundebesitzern mit den Röhrchen zurKotprobensammlung ein Fragebogen (s. Anhang, Abschnitt 10) mitgegeben. Die erhobenenInformationen enthielten u. a. Fragen nach Geburtstermin bei erfolgreicher Deckung,Duldungszeit gegenüber dem Rüden, nach Zykluslänge sowie eventuellen durch den Tierarztbestimmten Blutprogesteronwerten. Tabelle 13 im Anhang (Quelldaten zur Studie) gibt einenÜberblick über Sexualstatus, Alter, Rasse und andere Attribute der Versuchstiere.

4.2. Extraktion der Östrogene

Es wurde angenommen, daß in den Kotproben von Hündinnen niedrigeÖstrogenkonzentrationen vorliegen.

Bei der Extraktion von Östrogenen wurde die nur bei den Östrogenen vorkommendephenolische Ringstruktur zur Trennung von den übrigen Steroiden benützt (Abbildung 4):

U nk on jug ie r te Ö s trog enew erden m it D ie thy lä th eraus d em K o t g e lö st

M it K a lilau ge lö sen s ichÖ strog ene a ls S a lze

E isess ig b ring t Ö strog enein u rsp rü ng lich e F o rm

K O+ -

Abbildung 4: Das Extraktionsverfahren für Östrogene besteht aus drei wesentlichen Schritten:1. Extraktion mit Diethyläther, 2. Bildung von Östrogenaten, 3. Rückführung zu Östrogenen

Das Extraktionsmittel Diethyläther löst alle lipophilen apolaren Stoffe, die in der Probevorkommen, darunter auch die unkonjugierten Steroide. Der Überstand und damit auch die

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darin gelösten Steroide wurden abpipettiert und eingedampft. Die so isolierten lipophilenStoffe wurden in Chloroform/n-Hexan wieder gelöst. Bei Zusatz von Kalilauge zu dieserChloroform/n-Hexan-Lösung bildeten die Östrogene an ihrer Phenolgruppe Kalisalze,Östrogenate. Diese nun polaren Östrogenate waren nicht mehr lipophil und daher imKalilaugenüberstand gelöst, während die übrigen Steroide in der Chloroformphase gelöstblieben. Nach Abpipettieren des Kalilaugenüberstandes und der Veränderung des pH-Wertes(Zusatz von Eisessig) gingen die Östrogene wieder in ihre Ausgangsstruktur zurück. Die soisolierten Östrogene konnten nun mit spezifischen Nachweisverfahren gemessen werden.Folgende Ansätze, die auf diesem Prinzip beruhen, wurden in Erwägung gezogen:

Modifiziertes Verfahren nach Fuchs: FUCHS (1994) beschreibt folgende Methode: 0,5 gKot und 0,5 ml Wasser werden mit 3 x 2 ml Diethyläther/n-Hexan (1/4) extrahiert. Dieenthaltenen Extrakte werden eingedampft, in 0,5 ml Chloroform/n-Hexan (4/6) wiederaufgenommen und mit 500 µl 1-molarer KOH reextrahiert. 100 µl der KOH werdenabpipettiert, mit 5 µl Eisessig versetzt, mit 400 µl Assaypuffer verdünnt und 50 µl dieserLösung im Enzymimmunoassay (EIA) eingesetzt.

Für die vorliegende Arbeit wurde dieses Verfahren modifiziert: Zur Extraktion wurden 2 x5 ml Diethyläther/n-Hexan verwendet, die evaporierten Extrakte wurden in 0,5 mlChloroform/n-Hexan gelöst, in 500 µl KOH reextrahiert und 200 µl der KOH mit 5 µlEisessig versetzt und mit 800 µl Assaypuffer verdünnt. 10 µl dieser Lösung wurden in denEIA eingesetzt. Auf diese Weise wurde die Ausgangsmenge Kot im Verhältnis 1:500verdünnt.

Verfahren mit Diethyläther : Dieses Verfahren war ähnlich dem modifizierten Verfahrenvon Fuchs, nur wurde Diethyläther/n-Hexan durch reinen Diethyläther ersetzt. Das übrigeVerfahren blieb gleich. Auch hier wurden 10 �l schlußendlich in den EIA eingesetzt.

Verfahren mit Natriumkarbonat : Hier wurde der Kot nicht mit Wasser, sondern mit 0,5ml 10 %-igem Natriumkarbonat versetzt. Das übrige Extraktionsverfahren entsprach demmodifizierten Verfahren nach Fuchs.

Gesucht wurde ein Extraktionsverfahren mit einem möglichst großen Extraktionsvermögenund einer möglichst signifikanten Korrelation zwischen tatsächlich enthaltenem undgemessenem Hormon.

4.3. Vergleich der Extraktionsverfahren

Ziel der vorbereitenden Untersuchungen war unter anderem die Identifikation einesgeeigneten Extraktionsverfahrens für die zu erwartenden niedrigen Meßwerte. Hierzu standendas modifizierte Verfahren nach Fuchs, das Verfahren mit Diethyläther und das Verfahren mitNatriumkarbonat zur Auswahl.

Analyse der Recovery

Zunächst wurden die drei Extraktionsmethoden bezüglich ihres Extraktionsvermögensüberprüft. Jedes Extraktionsverfahren wurde mit 3 Wiederholungen nach folgender

- 31 -

Vorgangsweise getestet: Je 0,5 g Kot der Probe Pool 0 (siehe Abschnitt 4.7) wurde radioaktivmarkiertes 3H-Östron (Total count: 3700 counts per minute) vor der Extraktion zugesetzt unddie Kotmenge im Handvortex gut vermischt. Nach der Extraktion wurde der Anteil derzugesetzten Radioaktivität ermittelt, der im Gesamtextrakt wiedergefunden werden konnte.Diese Recovery entspricht der aus dem Kot extrahierten Menge an 3H-Östron.

Es wurde nun nach jenem Verfahren gesucht, bei dem die höchste Recovery zu finden war.Das modifizierte Verfahren nach Fuchs und das Verfahren mit Natriumkarbonat waren inihrem Extraktionsvermögen gegenüber dem Verfahren mit Diethyläther weit überlegen: (65 %und 62 % gegenüber 47 %). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle 3: Ergebnisse der Analyse der Recovery

Recovery V. nach Fuchs V. mit Diethyläther V. mit Natriumkarbonat1. Extraktion 2255 cpm/61 % 1719 cpm/46 % 2476 cpm/67 %2. Extraktion 2328 cpm/63 % 1682 cpm/45 % 2269 cpm/61 %3. Extraktion 2580 cpm/70 % 1862 cpm/50 % 2132 cpm/58 %Mittelwert 2388 cpm/65 % 1752 cpm/47 % 2292 cpm/62 %

Korrelation zwischen gemessenem und tatsächlich enthaltenem Östrogen

Ziel der Korrelationsanalyse war, jenes Verfahren zu finden, das eine möglichst großeKorrelation von tatsächlich enthaltenem und gemessenem Hormon ergibt und gleichzeitig einmöglichst günstiges (großes) Vertrauensintervall bietet.

Hierzu wurden für die einzelnen Extraktionen wieder 0,5 g Kot des Pools 0 (siehe Abschnitt4.7) verwendet. 10 �l des Extrakts wurde Östron (Fa. Steraloids, Bestellnummer E 2300) insteigender Konzentration zugesetzt (0; 0,13; 0,33; 0,82; 2,05; 5,12; 12,8 und 32 pg). MittelsEIA (siehe Abschnitt 4.5) wurde dann versucht diese Konzentration wieder zu messen.

Die Korrelation wurde wie bei WASSER et al. (1991) mittels Korrelationsanalysebestimmt. Diese ist für die drei Extraktionsverfahren in den folgenden Diagrammen(Abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7) dargestellt: Je weniger die gemessenen Werte umdie Regressionsgerade streuen, um so leichter läßt sich von dem gemessenen Wert auf dentatsächlichen Wert schließen. Lägen alle Werte auf der Regressionsgerade, wäre dasBestimmtheitsmaß R2 = 1. Es ist also ein R2, das möglichst gegen 1 geht, anzustreben.

Das modifizierte Verfahren nach Fuchs und das Verfahren mit Natriumkarbonat kamendiesen Ansprüchen am nächsten. Hier lag R2 bei 0,98, bzw. 1, während das Verfahren mitDiethyläther ein R2 von 0,61 zeigte. Zusätzlich war beim Verfahren mit Diethyläther imVergleich zu den beiden anderen Extraktionsverfahren ein wesentlich höherer Ausgangswertgemessen worden.

Da bei der Korrelationsanalyse das modifizierte Extraktionsverfahren nach Fuchs und dasExtraktionsverfahren mit Natriumkarbonat annähernd gleich gute Ergebnisse lieferten, wurdeaufgrund der etwas besseren Recovery das modifizierte Extraktionsverfahren nach Fuchs fürdie Östrogenextraktion aus dem Kot der Hündinnen gewählt.

- 32 -

Extraktion nach Fuchs

y = 1,17x + 3,09R2 = 0,98

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 2 4 6 8 10 12 14

zugesetzte Menge Östron in pg

gem

esse

ne M

enge

Öst

ron

in p

g

Abbildung 5: Korrelationsanalyse der modifizierten Extraktion nach Fuchs

Diethylätherextraktion

y = 1,06x + 6,99R2 = 0,61

0

2

4

6

8

10

12

14

0 1 2 3 4 5 6


gem

esse

ne M

enge

Öst

ron

in p

g

Abbildung 6: Korrelationsanalyse der Extraktion mit Diethyläther

Natriumkarbonatextraktion

y = 1,17x + 2,71R2 = 1,00

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 2 4 6 8 10 12 14


gem

esse

ne M

enge

Öst

ron

in p

g

Abbildung 7: Korrelationsanalyse der Extraktion mit Natriumkarbonat

- 33 -

Linearität der Messung für das Verfahren nach Fuchs

Das Verfahren nach Fuchs wurde auf seine Tauglichkeit für Messungen von Östrogenen inhöheren Konzentrationen getestet. Aus zwei Kotproben mit niedriger Östrogenkonzentration(etwa 8 ng/g), drei mit mittlerer Konzentration (etwa 26 ng/g) und zwei mit hoherKonzentration (etwa 180 ng/g Östronäquivalent/Kot) wurden Extrakte gewonnen. Aus denExtrakten dieser Proben wurden mehrere Verdünnungen in unterschiedlichen Konzentrationenhergestellt. Das Verdünnungsverhältnis war für die Extrakte mit niedrigerÖstrogenkonzentration 1:1000 bis 1:5000, für die Extrakte mit mittlererÖstrogenkonzentration 1:2500 bis 1:5000 und für die Extrakte mit hoherÖstrogenkonzentration 1:20000 bis 1:30000. Alle diese Verdünnungen wurden in den EIAeingesetzt. Mittels Korrelationsanalyse wurde überprüft, wieweit die berechneten Werte fürdie einzelnen Verdünnungsstufen mit den tatsächlich gemessenen Werten im EIAübereinstimmten. Für die Verdünnungen aus den Extrakten mit niedrigenÖstrogenkonzentrationen konnte ein Bestimmtheitsmaß R2 von 0,99 festgestellt werden, fürdie mittleren Konzentrationen ein Bestimmtheitsmaß R2 von 0,97 und für die hohenKonzentrationen ein Bestimmtheitsmaß R2 von 0,71.

Zusammenfassend erwies sich das Extraktionsverfahren nach Fuchs zur Extraktionniedriger Östrogenkonzentrationen als geeignet und lieferte auch bei hohenÖstrogenkonzentrationen, die eine mehrmalige Verdünnung der Extrakte erforderten, gutreproduzierbare Ergebnisse. Deswegen wurde es in der Folge für die Analysearbeitenausgewählt.

4.4. Nachweisverfahren für Östrogene

Der Zweck des Nachweisverfahrens ist die Bestimmung der Menge an Hormonen in einerProbe. Als Nachweisverfahren in Frage kamen Immunoassays, insbesondereEnzymimmunoassays (EIA), weiters Chromatographie-Verfahren, insbesondere HighPerformance Liquid Chromatography (HPLC):

�� EIAs sind in der Lage, auch geringe Mengen an Hormonen nachzuweisen, was sie für diezu lösende Aufgabe besonders interessant machte. Die zur Verfügung stehenden EIAswaren gruppenspezifisch, weil die darin enthaltenen Antikörper auf bestimmte chemischeStrukturen (Haptene) reagierten, und somit Verbindungen, die diese räumliche Strukturaufweisen, binden konnten.

�� Die HPLC trennt die in der Probe enthaltenen Stoffe und kann somit zur Reinigung einesbestimmten Hormons verwendet werden. Gleichzeitig können Mengenmessungen mittelsUV-Detektoren erfolgen, welche aber nur bei ausreichend hoher Konzentration derSubstrate verwertbare Werte liefern. Bei niedrigen Konzentrationen kann man in dengetrennten Extrakten die Hormone mittels EIA messen. Die HPLC wurde zur Validierungdes eingesetzten EIAs verwendet. Details finden sich im Abschnitt 4.6.

- 34 -

Gewählte Vorgangsweise

�� Die Extraktion der Östrogene wurde mit dem Verfahren nach Fuchs in den obenangegebenen Mengenänderungen durchgeführt.

�� Zur Qualitätskontrolle wurde die Recovery von zugesetztem radioaktiv markierten Östronin bekannter Menge bestimmt (siehe Abschnitt 4.7).

�� Es wurden einige repräsentative Proben mittels HPLC getrennt und danach dieÖstrogenkonzentration in den Einzelfraktionen mit einem EIA bestimmt. Damit wurdegetestet, ob der EIA auf Östrogene der Hündin - und nicht etwa auf Störfaktoren -anspricht.

�� Für die eigentliche Messung der Östrogenkonzentration wurde ein gruppenspezifischerÖstrogen-EIA verwendet. Diese Messung lieferte einen Gesamtüberblick über alleausgeschiedenen Östrogene und deren Metaboliten.

4.5. Enzymimmunoassay

Enzymimmunoassays bedienen sich der Antikörper-Antigen-Reaktion, wobei in weitererFolge ein Enzym diese Reaktion durch einen Farbumschlag deutlich macht. Es wurden für denhier eingesetzten EIA Antikörper gegen Östradiol-17ß-17HS:BSA verwendet. Dieser EIA wargruppenspezifisch, seine Kreuzreaktion ist in Tabelle 4 zusammengefaßt.

Tabelle 4: Kreuzreaktion des EIA gegen Östradiol-17ß-17HS:BSA

Steroid % KreuzreaktionÖstron 10017�-Östradiol 35017�-Östradiol 14517�-Dihydro-Equilenin 14,2Östriol 141,3,5(10)6,8-Östrapentaen-3ol-17one 6,417�-Dihydro-Equilin < 1Equilin < 11,3,5(10)7-Östratetraen-3,17�-diol < 12-OH-Östradiol < 1Östron-Glucoronid < 1Cortisol < 0,1Nortestosteron < 0,1Progesteron < 0,1Testosteron < 0,15�-Östron-17�-ol-3on 0

Das Prinzip des in der vorliegenden Arbeit eingesetzten EIAs ist in der Abbildung 8verdeutlicht. Das Reagenzgefäß war mit Schaf-Antikörpern beschichtet, die von Schafengegen Kaninchenantikörper gebildet worden waren. Um zu verhindern, daß später zugesetzteSubstanzen sich wie die Schafantikörper direkt an die Gefäßwand binden könnten, war diese

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mit bovinem Plasma gegenbeschichtet. Die Kaninchenantikörper gegen Östradiol-17ß-17HS:BSA wurden zugesetzt und von den Schafantikörpern gebunden, die ja gegen diesegerichtet waren.

R e ag en zg efäß

B o v in e s P lasm a

S ch af-A n tik ö rper

K an in ch en -A n tik ö rp er

H o rm o n d er P rob e Ö strad io lB io tin E n zy m lab e l

P O D m it S trep ta v id in

}

Abbildung 8: Biotin-Streptavidin Enzymimmunoassay mit doppelter Antikörpertechnik

Die Kaninchenantikörper banden Hormone des Probenmaterials, die eine ähnliche Strukturaufwiesen wie Östradiol-17ß-17HS:BSA. Abhängig von der Hormonkonzentration in denProben wurden unterschiedlich hohe Quantitäten von Kaninchenantikörpern besetzt. Es wurdedann ein an Biotin gekoppeltes Östradiol, das im Enzymimmunoassay als Label verwendetwurde, hinzugefügt. Dieses Östradiol wurde kompetitiv an die Kaninchenantikörpergebunden. An das an Östradiol gekoppelte Biotin konnte das Enzym Peroxidase (POD),gekoppelt an Streptavidin, binden, und das Östradiol wurde so quantifiziert. Die gebundenePeroxidase setzte nämlich Tetramethylbenzidin (TMB-3,3’,5,5’) um, und der Farbumschlagvon blau nach gelb wurde mittels Photometer gemessen.

4.6. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Es wurde sowohl die Adsorptionschromatographie (straight phase HPLC) als auch dieUmkehrphasenchromatographie (reversed phase HPLC) durchgeführt.

Die Menge an immunreaktiven Substanzen in den Fraktionen wurde mit Hilfe eines EIAsbestimmt, man nennt diese Messungen auch Immunogramme. Zum Nachweis von nichtkonjugierten, apolaren Östrogenen wurde die straight phase HPLC verwendet, zum Nachweisvon konjugierten, polaren Östrogenen die reversed phase HPLC.

Straight phase HPLC

Es wurden mittels der modifizierten Methode jeweils dreimal 0,5 g Kot des Pools 0 und desPools I (siehe Abschnitt 4.7) extrahiert. Aus dem mit Eisessig versetzten Kalilaugenextraktwurden die in der Extraktionslösung befindlichen Östrogene mit 5 ml Diethylätherreextrahiert. Die Diethylätherextrakte je eines Pools wurden zusammengeschüttet und das

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Lösungsmittel (Diethyläther) wurde eingedampft. Der Rückstand im Reagenzglas wurde in100 �l CHCl3/n-Hexan (50:50) Gemisch aufgenommen. Für die straight phase HPLC wurdeeine HPLC-Modulanlage der Firma Waters verwendet, welche mit einer Li-Chrosorb-Si-60-Säule (Porengröße 10 �m, 4 mm x 290 mm) der Firma Seibersdorf ausgestattet war. Vor derTrennung der Kotextrakte wurde ein Standardsteroidgemisch unter denselben HPLC-Bedingungen getrennt. Als Standardsteroide wurden Östron, 17�-Östradiol und 17�-Östradiolder Firma Steraloids (Bestellnummer: E 2300, E 870, E 950) verwendet. Der Nachweis dieserÖstrogene erfolgte mittels Photodioden-Array (PDA)-Detektoren der Firma Waters(WatersTM 996) bei einer Wellenlänge von 280 nm. Die Trennbedingungen sind aus Tabelle 5ersichtlich.

Tabelle 5: Trennbedingungen für die straight phase HPLC von Östrogenen (linearerGradientenverlauf)

Laufzeit (min) Durchfluß (ml/min) CHCl3/n-Hexan50:50 (%)

CH30H ( %)

0’ 2 100 025’ 2 100 030’ 2 90 1040’ 2 90 1045’ 2 100 060’ 2 100 0

Mittels Fraktionskollektor wurden bis zur 38. Minute 76 Fraktionen (2/min á 1 ml)gewonnen. Die Fraktionen wurden evaporiert und der Rückstand in 250 �l Assaypufferaufgenommen. Davon wurden je 50 �l in den Östrogen-EIA eingesetzt.

Reversed phase HPLC

Da mittels reversed phase HPLC auch die konjugierten Östrogene getrennt werden, wurdeein Extrationsverfahren gewählt, mit dem diese extrahiert werden können: Es wurden sowohlvom Pool 0 als auch vom Pool I jeweils dreimal 0,5 g Kot und 0,5 ml Wasser mit 4 ml 100 %Methanol extrahiert.

Zur Reinigung vor der reversed phase HPLC wurden die Extrakte in einer Verdünnung von1:10 mit Wasser auf eine Sep-Pak-C18-Cartridge aufgetragen. Die Cartridge wurdeanschließend mit 10 ml Wasser gewaschen. Die in der Cartridge verbliebenen Substanzenwurden mit 5 ml 80 % Methanol eluiert. Die drei Eluate eines Pools wurden vereinigt undeingedampft, der Rückstand in 300 �l 20 % Methanol aufgenommen.

Für die reversed phase HPLC wurde eine HPLC-Modulanlage der Firma Waters verwendet,mit einer Nova-Pak-C-18-Säule (3,9 mm x 150 mm). Um zu erkennen, in welcher Fraktionsich welches Östrogen befindet, wurde vor der Trennung der Kotextrakte ein Gemisch vonStandardsteroiden unter denselben HPLC-Bedingungen getrennt. Als Standardsteroide wurden17�-Östradioldisulfat, Östronglucuronid, Östronsulfat und Corticosteron der Firmen Sigma(Bestellnummer E 1636) und Steraloids (Bestellnummer E 2321, E 2335, Q 1550) verwendet.

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Der Nachweis dieser Östrogene erfolgte mittels PDA-Detektoren der Firma Waters(WatersTM 996) bei einer Wellenlänge von 275 nm. Weiters wurden in einem VorversuchKotprobenextrakten radioaktiv markierte Östrogene zugesetzt (3H-Östron und 3H-Östronsulfat) und nach erfolgter HPLC-Trennung die Radioaktivität pro Fraktion mit demGerät TOP Count� der Firma Packard gemessen, was die Berechnung der Wiederfindung von3H-Östron und 3H-Östronsulfat ermöglichte.

Die Trennbedingungen sind aus Tabelle 6 ersichtlich.

Tabelle 6: Trennbedingungen für die reversed phase HPLC von Östrogenen (linearerGradientenverlauf)

Laufzeit (min) Durchfluß (ml/min) Methanol ( %)0’ 2 205’ 2 2035’ 2 10045’ 2 100

Mittels Fraktionskollektor wurden bis zur 32. Minute 95 Fraktionen (3/min á 330 �l)gewonnen. Von diesen 330 �l wurde die eine Hälfte zur Messung der unkonjugiertenÖstrogene, die andere Hälfte zur Messung der konjugierten Östrogene verwendet:

�� Nachweis der unkonjugierten Östrogene: Die Hälfte der reversed phase HPLC-Fraktionwurde eingedampft und in 200 �l Assaypuffer aufgenommen. 100 �l dieser Lösung wurdenmit 400 �l Asssaypuffer vermischt, 10 �l davon wurden in den EIA eingesetzt.

�� Nachweis von mit �-Glucuronidase/Arylsulfatase spaltbaren Östrogenen: Die zweite Hälfteder reversed phase HPLC-Fraktion wurde eingedampft. Der Rückstand wurde in 200 �leiner verdünnten �-Glucuronidase/Arylsulfatase Lösung (helix pomatia der Firma Merck�,Bestellnummer 4114; 1:250 verdünnt in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 4,8) bei 40°C überNacht gespalten. 100 �l dieser Lösung wurden mit 400 �l Asssaypuffer vermischt. Davonwurden 10 �l in den EIA eingesetzt.

4.7. Qualitätskontrollen

Gewinnung von Referenzproben (Pools): Eine Mischkotprobe setzte sich aus gleichenMengen verschiedener Kotproben zusammen und wurde so lange mit einer Moulinettegemischt, bis das Material optisch homogen aussah. Für die Mischkotprobe von kastriertenHündinnen wurden Kotproben der Hündinnen Nr. 60 - 64 genommen (Pool 0). Für dieMischkotprobe mit höherer Östrogenkonzentration wurden Kotproben von Hündinnen Nr. 4,6 und 17 jeweils einen Tag nach Beginn der Stehzeit bis einen Tag nach Ende der Stehzeitverwendet (Pool I). Für die Mischkotproben mit niedriger Östrogenkonzentration wurde Kotvon Hündinnen Nr. 13, 17 und 6 außerhalb der Läufigkeit bzw. am Ende der Läufigkeitvermengt (Pool II). Diese Kotprobengemenge wurden auch bei der Etablierung derNachweisverfahren, sowohl des EIAs als auch der HPLC, eingesetzt.

- 38 -

Interassay-Variationskoeffizient: Dieser bestimmt die Varianz der Meßergebnisse in allenVersuchsreihen. Zur Überprüfung wurden Extrakte des Pools 0 und des Pools II bei jederVersuchsreihe im EIA mitgemessen (am Anfang und am Ende der Versuchsreihe). DerVariationskoeffizient dieser Messungen wurde ermittelt. Die Varianz zwischen den einzelnenMessungen in diesen Versuchsreihen war allein vom EIA-System abhängig, nicht vomExtraktionsverfahren, weil die Extrakte der Pools nicht gleichzeitig mit den Proben derVersuchsreihen extrahiert wurden.

Intraassay-Variationskoeffizient: Dieser bestimmt die Varianz der Meßergebnisse ineiner einzigen Versuchsreihe. Es wurden in Versuchsreihe Nr. 21 (Liste 21) 8 Proben derStandardkotproben zu 0,5 g Kot des Pools II extrahiert und im EIA bestimmt. Auch hierwurde der Variationskoeffizient bestimmt. Hier hatte auch die Extraktion Einfluß auf dieMeßergebnisse, weil jede einzelne Probe extrahiert wurde.

Recovery: Zum Überwachen der Extraktionseffizienz wurde jeder Probe der17. Versuchsreihe 50 �l 3H-Östron-hältiges Substrat mit einer Radioaktivität von 49.259counts per minute (cpm) vor der Extraktion zugesetzt. Nach der Extraktion wurde in denExtrakten die Radioaktivität gemessen, und somit auf den extrahierten Anteil an 3H-Östronrückgeschlossen. Dieser wurde als Recovery in Prozent angegeben. Die Recovery wurde nurdurch das Extraktionsverfahren beeinflußt und nicht durch den EIA.

4.8. Auswertung der Ergebnisse

�� Für die Verlaufsuntersuchung der Östrogenkonzentration im Kot bei den läufigenHündinnen wurde als erster Tag der Läufigkeit der Tag definiert, an dem der Hundehaltererste Blutungen bemerkte. Dies ist ein subjektives Kriterium, zum einen, weil die Blutungnicht immer sofort bemerkt wird und zum anderen, weil auch die Länge der Läufigkeitstark variieren kann. Deshalb wurde zusätzlich die Progesteronkonzentration in denKotproben bestimmt, weil MÖSTL u. BRUNNER (1997a) beschrieben, daß es währendder Läufigkeit zu einem deutlichen Anstieg der Progesteronkonzentration in den Faeceskommt. In der vorliegenden Arbeit wurden nur jene Hündinnen für eine weitereAuswertung selektiert, bei denen ein Ansteigen der Progesteronkonzentrationnachgewiesen werden konnte. Zum Nachweis des Progesteronanstiegs wurde in einerVerdünnungsstufe 1:5000 mit einer oberen Nachweisgrenze von 600 ngProgesteronäquivalent/g Kot und einer unteren Nachweisgrenze von 30 ngProgesteronäquivalent/g Kot gearbeitet.

�� Alle statistischen und graphischen Daten wurden mit Microsoft Excel 97 und SPSS 8.0 fürWindows erstellt.

- 39 -

5. Ergebnisse

5.1. Kontrolle der Präzision

Interassay: Es konnten folgende Variationskoeffizienten ermittelt werden: Die ersten 19Versuchsreihen wurden zeitlich knapp hintereinander durchgeführt, die letzten beiden mehrals 2 Monate später, hier wurden deutlich niedrigere Meßwerte im EIA festgestellt. Ausdiesem Grund wurden bei der Auswertung die letzten 2 Versuchsreihen (Nr. 20 und Nr. 21)separat ausgewertet.

�� Pool 0: (19 Versuchsreihen , n = 38, MW = 1,2 (0,2) : Variationskoeffizient: 19 %

�� Pool 0: (2 Versuchsreihen , n = 6, MW = 0,6 (0,1) : Variationskoeffizient: 17 %

�� Pool II: (19 Versuchsreihen , n = 33, MW = 5,8 (1,2) : Variationskoeffizient: 20 %

�� Pool II: (2 Versuchsreihen , n = 8, MW = 5,1 (0,8) : Variationskoeffizient: 15 %

Intraassay: Es konnte folgender Variationskoeffizient ermittelt werden:

�� Pool II: (n = 8, MW = 3.81 (0,24) : Variationskoeffizient: 6 %

Recovery: Die Recovery für die einzelnen Proben der Versuchsreihe 17 ist in der Tabelle 7angeführt. Die Schwankungen der Recovery unterliegen einer Normalverteilung mit einemMittelwert von 51 % � 8 %, und einem Variationskoeffizienten von 15 %.

Tabelle 7: Recovery der Proben aus Versuchsreihe 17

Probe Nr. Recovery Probe Nr. Recovery Probe Nr. Recovery1 39% 13 48% 25 53%2 54% 14 30% 26 37%3 50% 15 58% 27 51%4 46% 16 54% 28 56%5 56% 17 53% 29 54%6 49% 18 48% 30 50%7 55% 19 56% 31 61%8 55% 20 52% 32 40%9 52% 21 58% 33 55%10 53% 22 77% 34 42%11 53% 23 51% 35 44%12 56% 24 52% 36 54%

- 40 -

5.2. Ergebnisse der HPLC-Trennung der Extrakte

Straight phase HPLC

Die Durchführung der straight phase HPLC erfolgte wie unter Abschnitt 4.6 beschrieben.Die Ergebnisse der PDA-Messung für die Standardsteroide Östron, 17�-Östradiol und 17�-Östradiol sowie der EIA-Messung für Pool 0 und Pool I nach straight phase HPLCFraktionierung sind in Abbildung 9 dargestellt.

-100,00

0,00

100,00

200,00

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Fraktionen

pg Ö

stro

näqu

ival

ent p

ro N

apf

EIA POOL 0 EIA POOL I Standards

(1) (2) (3)

Abbildung 9: Straight phase HPLC (EIA-Meßergebnisse der Pools in pgÖstronäquivalent/Napf), Verwendete Standards: (1) Östron, (2) 17�-Östradiol, (3) 17�-Östradiol

Die drei Hauptpeaks bei der straight phase HPLC-Fraktionierung der beiden Pools traten inetwa zeitgleich (19. - 22. , 45. - 47., 58. - 60. Fraktion) mit den Standardsteroiden Östron,17�-Östradiol und 17�-Östradiol (17. - 19., 45. - 47., 58. - 60. Fraktion) auf.

Reversed phase HPLC

Es wurde eine HPLC-Trennung eines Standardsteroidgemisches aus 17�-Östradioldisulfat,Östronglucuronid, Östronsulfat und Corticosteron vor der eigentlichen HPLC-Trennung derKotproben durchgeführt. Die Ergebnisse der PDA-Messung für die Standardsteroide 17�-Östradioldisulfat, Östronglucuronid, Östronsulfat und Corticosteron und die der EIA-Messung für Pool I nach reversed phase HPLC-Fraktionierung sind im einzelnen inAbbildung 10 dargestellt.

- 41 -

-4

-2

0

2

4

6

8

10

0 20 40 60 80 100

Fraktionen

pg Ö

stro

näqu

ival

ent p

ro N

apf

EIA POOL I ungespalten EIA POOL I gespalten Standards

(1) (2) (3) (4)

Abbildung 10: Reversed phase HPLC für Pool I gespalten und ungespalten (EIA-Meßergebnisse der Pools in pg Östronäquivalent/Napf). Verwendete Standards: (1) 17�-Östradioldisulfat, (2) Östronglucuronid, (3) Östronsulfat, (4) Corticosteron

-200-100

0100200300400500

0 20 40 60 80 100

Fraktionen

Rad

ioak

tivitä

t (cp

m)

radioakt. Östron/Östronsulfat Standards

(1) (2) (3) (4)

Abbildung 11: Elutionsverhalten von radioaktiv markiertem 3H-Östronsulfat (Pfeil) und 3H-Östron (Doppelpfeil) in der reversed phase HPLC. Verwendete Standards: (1) 17�-Östradioldisulfat, (2) Östronglucuronid, (3) Östronsulfat, (4) Corticosteron

Sowohl bei Pool 0/ungespalten als auch bei Pool 0/gespalten konnten in den reversed phaseHPLC-Fraktionen mittels EIA keine immunreaktiven Substanzen nachgewiesen werden.

Pool I/ungespalten hatte erst in den Fraktionen Nr. 71, 76, 77, 78 im EIA immunreaktiveSubstanzen. Standard-Corticosteron, das mittels PDA-Detektoren in der 68. - 69. Fraktiongemessen wurde, diente als Marker für den Beginn der Elution von nicht konjugierten

- 42 -

Steroiden aus der reversed phase HPLC-Säule. Die in Pool I/ungespalten im EIA reagierendenSubstanzen wurden nach Corticosteron eluiert und zeigten ein Elutionsverhalten von nichtkonjugierten Steroiden. Bei dieser HPLC-Anlage wurde in einem Vorversuche bei gleichenTrennbedingungen während der 76. - 78. Fraktion 3H-Östron nachgewiesen (Abbildung 11).

Bei Pool I/gespalten konnten in den Fraktionen Nr. 14, 77 und 78 immunreaktiveSubstanzen nachgewiesen werden. Die erste Fraktion zeigte ein Elutionsverhalten wieStandard-Östronglucuronid, die 77. und 78. Fraktion zeigte ein Elutionsverhalten wie 3H-Östron (Abbildung 10).

5.3. Zusammenhang von Östrogenkonzentration und Sexualstatus

Untersucht wurden 28 Hündinnen während der Läufigkeit, 30 Hündinnen im Anöstrus (15davon auch während der Läufigkeit), und 18 ovariohysterektomierte Hündinnen. Ziel derUntersuchung war es, einen Zusammenhang von Sexualstatus und Östrogenkonzentration imKot nachzuweisen.

Bei 28 Hündinnen wurden vom Besitzer bzw. vom Betreuer ab Beginn der Läufigkeittäglich für 20 Tage Kotproben gesammelt. Die für jede Hündin täglich erhobenen Östrogen-und Progesteronkonzentrationen im Kot sind in der Tabelle 14 und der Tabelle 15 im Anhangangeführt. Folgende Hündinnen wurden für die weitere statistische Auswertung nicht in dieGruppe der läufigen Hündinnen aufgenommen, weil der für eine Läufigkeit physiologischeAnstieg der Progesteronkonzentration im Kot nicht nachgewiesen werden konnte.

Bei den Hündinnen Nr. 14, Nr. 41 und Nr. 59 war bereits am ersten Sammeltag dieProgesteronkonzentration über der Nachweisgrenze. Bei Hündin Nr. 25 blieb der erwarteteProgesteronanstieg aus. Bei den Hündinnen Nr. 28 und Nr. 29 war zu wenig Kot für einezusätzliche Progesteronkonzentrationsbestimmung gesammelt worden. Allerdings warenbeide Hündinnen jeweils am 17. Tag der Läufigkeit erfolgreich gedeckt worden und wurdendeshalb, trotz fehlender Progesteronbestimmung, in die Studie mitaufgenommen.

Die statistischen Kenngrößen der Gruppe der kastrierten Hündinnen, der Gruppe dernichtläufigen Hündinnen und der Gruppe der läufigen Hündinnen sind in der Tabelle 8dargestellt. Bei keiner der Gruppen konnte eine Normalverteilung nachgewiesen werden.

Tabelle 8: Statistische Kenngrößen der untersuchten Gruppen gemessen inng Östronäquivalent/g Kot

Gruppe kastriert nicht läufig läufigMinimum 0,2 0,6 0,3Maximum 4,9 17,6 145,7Mittelwert 1,5 6,2 22,5Standardabweichung 1,0 4,3 21,2Median 1,2 5,0 15,1unteres Quartil 0,8 3,6 6,9oberes Quartil 1,8 7,8 31,0

- 43 -

Die Unterschiede zwischen den Gruppen werden durch eine Darstellung der Daten mittelsBoxplots noch deutlicher (Abbildung 12).

0 ,1

1

1 0

1 0 0

n = 1 8

k a s t r i e r tn i c h tl ä u f i g

P r o b a n d e ng r u p pe

Öst

ron

äq

uiv

ale

nt

in n

g/g

Ko

t

l ä u f i g

n = 6 0 n = 4 2 5

Abbildung 12: Vergleich der nach Sexualstatus gruppierten Probanden anhand von Boxplots

Um den Nachweis zu führen, daß sich die Gruppen statistisch signifikant unterscheiden,wurden die Gruppen paarweise mittels U-Test nach Wilcoxon-Mann-Whitney verglichen.Dieser auf Rangsummen basierende Test wurde statt einer einfachen Varianzanalyseeingesetzt, weil die vorliegenden Streuungen nicht normalverteilt waren (SACHS, 1997).Sämtliche Ergebnisse weisen mit sehr großer Signifikanz (Signifikanzniveau 0,Irrtumswahrscheinlichkeit p � 0,001) auf einen Unterschied zwischen den drei Gruppen hin,das heißt, die gemessenen Werte der einzelnen Gruppen stammen nicht aus einerGrundgesamtheit.

Es wurde untersucht, inwieweit diese Tatsache in der Praxis eine Verwendung finden kann.Konkret wurde überprüft, ob durch Messung der Östrogenkonzentration in Kotprobenerkennbar ist, daß eine Hündin kastriert ist.

Die Ergebnisse aus den Gruppen der kastrierten Hündinnen, der nicht läufigen Hündinnenund der Hündinnen in der Läufigkeit wurden in Klassen eingeteilt und diese mit Hilfe vonHistogrammen graphisch dargestellt (Abbildung 13, Abbildung 14 und Abbildung 15).

- 44 -

Östronäquivalent in ng/g Kot

5,00

4,50

4,00

3,50

3,00

2,50

2,00

1,50

1,00,5

0

0,00

kastrierte Hündinnen

Anz

ahl d

er M

essu

ngen

5

4

3

2

1

0

Abbildung 13: Histogramm der Meßergebnisse der Gruppe kastrierter Hündinnen


18,0

0

17,0

0

16,0

0

15,0

0

14,0

0

13,0

0

12,0

0

11,0

0

10,0

0

9,00

8,00

7,00

6,00

5,00

4,00

3,00

2,00

1,00

0,00

nicht läufige Hündinnen

Anz

ahl d

er M

essu

ngen

20

15

10

5

0

Abbildung 14: Histogramm der Meßergebnisse der Gruppe nicht läufiger Hündinnen


140,

00

130,

00

120,

00

110,

00

100,

00

90,0

0

80,0

0

70,0

0

60,0

0

50,0

0

40,0

0

30,0

0

20,0

0

10,0

0

0,00

läufige Hündinnen

Anz

ahl d

er M

essu

ngen

120

100

80

60

40

20

0

Abbildung 15: Histogramm der Meßergebnisse der Gruppe läufiger Hündinnen

Man beachte die Unterschiede in der Größe der Werte auf den X-Achsen. Nur im Bereichder niedrigen Meßergebnisse überlappen sich die drei Histogramme.

- 45 -

kastrierte Hündinnen

036

(0,0-0,5]

(0,5-1,0]

(1,0-1,5]

(1,5-2,0]

(2,0-2,5]

(2,5-3,0]

(3,0-3,5]

(3,5-4,0]

(4,0-4,5]

(4,5-5,0]


Mes

sung

en

Abbildung 16: Histogramm der Meßergebnisse der Gruppe der kastrierten Hündinnen imBereich von 0-5 ng Östronäquivalent/g Kot. 17 von insgesamt 18 Meßwerten sind kleinergleich 2,5 ng/g (Grenzwert 2,5 ng /g Kot mit Pfeil gekennzeichnet).

nicht läufige Hündinnen

02468

101214

(0,0-0,5]

(0,5-1,0]

(1,0-1,5]

(1,5-2,0]

(2,0-2,5]

(2,5-3,0]

(3,0-3,5]

(3,5-4,0]

(4,0-4,5]

(4,5-5,0]


Mes

sung

en

Abbildung 17: Histogramm der Meßergebnisse der Gruppe der nicht läufigen Hündinnen imBereich von 0-5 ng Östronäquivalent/g Kot. Es liegen nur wenige Meßergebnisse (voninsgesamt 60) unter dem Grenzwert 2,5 ng /g Kot (Pfeil).

lä u f i g e H ü n d in n e n

05

1 01 5

(0,0-0,5]

(1,0-1,5]

(2,0-2,5]

(3,0-3,5]

(4,0-4,5]

Ö s tro n ä q u iv a le n t in n g /g K o t

Mes

sung

en

Abbildung 18: Histogramm der Meßergebnisse der Gruppe der läufigen Hündinnen imBereich von 0-5 ng Östronäquivalent/g Kot. Es liegen nur wenige Meßergebnisse (voninsgesamt 425) unter dem Grenzwert 2,5 ng /g Kot (Pfeil).

- 46 -

Um den Überlappungsbereich genauer definieren zu können, wurden die Ergebnisse allerGruppen im Meßbereich von 0 bis 5 ng Östronäquivalent/g Kot Klassen mit einem Intervallvon 0,5 ng zugeordnet (siehe Abbildung 16, Abbildung 17 und Abbildung 18). Hieraus warersichtlich, daß der Bereich der Meßergebnisse der kastrierten Hündinnen - bis auf einenAusreißer - sehr kompakt zwischen 0 und 2.5 ng/g Kot liegt. Genauer gesagt sind 94 % allerMessungen kastrierter Hündinnen � 2,5 ng/g Kot.

Die Effizienz eines diagnostischen Tests zur Differenzierung der sich klinisch nichtunterscheidenden Gruppen, kastrierte Hündinnen und nicht läufige Hündinnen, wurde miteiner Vierfeldertafel, wie von SACHS (1997) beschrieben, überprüft. Als Grenzwert zurDiagnose „nicht kastriert“ wurde ein Östronäquivalentwert größer als 2,5 ng/g Kotangenommen.

Tabelle 9: Vierfeldertafel zur Differenzierung der Gruppen kastrierte Hündinnen und nichtläufige Hündinnen (negatives Testergebnis bei Östronäquivalentwerten größer 2,5 ng/g Kot)

KastrationTest positiv

(� 2,5ng/g Kot)Test negativ

(� 2,5 ng/g Kot) Summeja 17 1 18

nein 9 51 60Summe 26 52 78

Daraus ergeben sich folgende Kenngrößen des Tests: Sensitivität: 17/18 = 0,94; Spezifität:51/60 = 0,85; Voraussagewert eines negativen Tests: 51/52 = 0,98; Voraussagewert einespositiven Tests: 17/26 =0,65; Anteil richtiger Testresultate: 17/26 +51/52 =1,63.

5.4. Verlauf der Östrogenkonzentration in der Läufigkeit

Besonderes Interesse galt dem Verlauf der gemessenen Östrogenkonzentration im Kot inder Läufigkeit. Ein Überblick über die gemessenen Daten findet sich in Tabelle 10 undTabelle 11.

Tabelle 10: Vergleich der gemessenen Östrogenkonzentrationen der läufigen Hündinnen am1., 5., 8., 10., 15. und 20. Läufigkeitstag (in ng Östronäquivalent/g Kot)

Kenngröße 1. Tag 5. Tag 8. Tag 10. Tag 15. Tag 20. Tag

Minimum 2,5 5,2 5,9 4,1 2,3 1,9

Maximum 62,4 69,7 145,7 77.9 51,1 25,2

Mittelwert 16,6 29,8 40,6 32,5 14,6 7,5

Std.-Abw. 13,9 19,1 35,7 23,0 15,2 6,0

Median 12,3 28,2 30,8 27,7 7,6 5,6

Unt. Quantil 9,4 12,6 21,3 11,0 4,9 4,0

Ob. Quantil 21,1 44,3 44,0 21,1 17,7 7,7

- 47 -

Tabelle 11: Kenngrößen der gemessenen Östrogenkonzentration der läufigen Hündinnen Eswurden für jede Läufigkeit Minimum, Mittelwert und Maximum bestimmt. Aus diesen Datensowie den Gesamtdaten wurden die statistischen Kenngrößen ermittelt.

Kenngröße Min. Mittelw. Max. Gesamt

Minimum 0,3 12,0 36,8 0,3

Maximum 10,1 37,2 145,7 145,7

Mittelwert 3,4 22,3 75,2 22,5

Std.-Abw. 2,0 5,1 27,4 21,2

Median 3,3 21,8 63,5 15,1

Unt. Quantil 2,5 19,0 60,4 6,9

Ob. Quantil 4,3 25,5 81,8 31,0

Da auch die an den einzelnen Tagen ab Eintritt der Läufigkeitsblutung gemessenenÖstrogenkonzentrationen im Kot keiner Normalverteilung folgen, ist der Verlauf dergemessenen Östrogenkonzentration mit Hilfe der Medianwerte in Abbildung 19 graphischgezeigt. Zum Vergleich sind auch die zur Kontrolle gemessenen Progesteronwertemitaufgeführt. Zur besseren Darstellung wurden die Progesteronergebnisse gefünftelt. Esergibt sich ein charakteristischer Verlauf, wobei die Östrogenkonzentration im Kot etwa biszum 8. Tag ab Beginn der Läufigkeit ansteigt und dann wieder abfällt, während derProgesteronspiegel deutlich ansteigt und die Meßwerte bis zum Ende der Untersuchung hochbleiben.

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Läufigkeitstag

ng/g

Kot

Abbildung 19: Verlaufsgraphik der Medianwerte der Konzentration von Östrogen (dunkleBalken) in ng Östronäquivalent/g Kot und Progesteron (helle Balken) in ngProgesteronäquivalent/g Kot. Die Progesteronwerte wurden mit 1/5 skaliert, um einenbesseren Vergleich mit den Östrogenwerten zu gestatten.

- 48 -

Zuletzt soll noch die Streuung der Meßwerte aller Hündinnen pro Tag graphisch anhandeiner an Boxplots angelehnten Östrogenverlaufskurve (Abbildung 20) illustriert werden(Mediane und Whiskers mit Darstellung der oberen und unteren Quartile).

Östrogen - Verlauf von Median und Verteilung

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Läufigkeitstag

Öst

ronä

quiv

alen

t in

ng/g

Kot

Abbildung 20: Darstellung der Streuung der Östrogenmeßwerte (in ng Östronäquivalent/gKot) aller Hündinnen pro Tag - zu sehen sind Mediane sowie obere und untere Quartile(Whiskers) für jeden Tag

Es wurde die Hypothese geprüft, ob sich die gemessenen Werte im Verlauf der Läufigkeitsignifikant ändern. Dazu wurden zwei repräsentative Tage ausgewählt, nämlich der erste Tagder Läufigkeit (niedriger Östrogentagesmedianwert) und der achte Tag der Läufigkeit(höchster Östrogentagesmedianwert). Diese Tage ließen auch aufgrund der deskriptiven Dateneinen signifikanten Unterschied erhoffen. Mittels U-Test nach Wilcoxon-Mann-Whitneykonnte die Hypothese die Werte entstammen nicht einer Grundgesamtheit auf einemSignifikanzniveau von knapp 0,1 % (zweiseitig) bestätigt werden. Der mittlere Rang fürdiesen Rangsummentest lag beim ersten Läufigkeitstag bei 15,4 mit einer Rangsumme von308,5, und beim achten Läufigkeitstag bei 27,7 mit einer Rangsumme von 637,5.

5.5. Einfluß der Rasse, Haltung und Fütterung auf dieÖstrogenausscheidung

Eine Gruppe von Rottweilerhündinnen der Militärhundestaffel Kaisersteinbruch (insgesamt18 Tiere, davon sieben während der Läufigkeit, drei in der ersten Läufigkeit) nahmen andieser Studie teil. Diese Teilgruppe war in ihrer Rasse (es nahmen keine weiteren Rottweileran dieser Studie teil) und in ihrer Haltung inklusive der Fütterung einheitlich.

Da CHAKRABORTY et al. (1980) während der ersten Läufigkeit bei Labradorhündinnenein anderes Hormonmuster als bei späteren Läufigkeiten beschrieben, wurden nur Hündinnenin späterer Läufigkeit erfaßt und zunächst die Gruppen mittels Boxplots verglichen.

- 49 -

71304N =

Rottweilerkeine Rottweiler

Öst

ronä

quiv

alen

t in

ng/g

Kot

160

140

120

100

80

60

40

20

0

-20

Abbildung 21: Vergleich der Östronäquivalentkonzentration im Kot läufigerRottweilerhündinnen (Rottweiler) mit der anderer läufiger Hündinnen (keine Rottweiler)mittels Boxplots

Es wurde nun mittels U-Test nach Wilcoxon-Mann-Whitney die Hypothese überprüft, obdie Rottweiler-Population (einheitliche Rasse, Haltung, Fütterung) sich bezüglich ihrerÖstrogenkonzentration während der Läufigkeit im Kot vom Rest (Mischpopulation mitunterschiedlichen Haltungsbedingungen) unterscheidet. Es konnte kein statistischsignifikanter Unterschied zwischen den Meßergebnissen beider Gruppen nachgewiesen(Signifikanzniveau 0,324; Irrtumswahrscheinlichkeit 32,4 %) werden und somit dieHypothese, beide Gruppen entstammen einer Grundgesamtheit, weder verworfen nochbestätigt werden.

5.6. Einfluß der ersten Läufigkeit auf die Östrogenausscheidung

In dieser Studie waren drei Hündinnen während ihrer ersten Läufigkeit (Franka, Nr. 43,Nikita, Nr. 48, und Anka, Nr. 50). Die Meßergebnisse der Östrogenkonzentrationen im Kotder drei Hündinnen in der ersten Läufigkeit wurden mit denen der Hündinnnen in spätererLäufigkeit verglichen.

Auch hier konnte kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Meßergebnissenbeider Gruppen mittels U-Test nach Wilcoxon-Mann-Whitney nachgewiesen werden(Signifikanzniveau 0,229; Irrtumswahrscheinlichkeit 22,9 %). Bei Betrachtung des Verlaufsder Tagesmittelwerte (siehe Abbildung 23) beider Gruppen zeigte sich allerdings, daß dieVerlaufskurve der Hündinnen in der ersten Läufigkeit langsamer anstieg.

Aus diesem Grund wurde die Läufigkeit in zwei Phasen eingeteilt, in die Phase der erstenWoche (1.-7. Tag) und in die Phase der zweiten und dritten Woche (8.-20. Tag). Danachwurden die beiden Gruppen wieder mittels U-Test nach Wilcoxon-Mann-Whitney verglichen.

- 50 -

Es wurden diesmal statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Meßergebnissen beiderGruppen nachgewiesen. (Signifikanzniveau 0,036; somit Irrtumswahrscheinlichkeit 3,6 % fürdie erste Läufigkeitswoche; Signifikanzniveau 0,005; somit Irrtumswahrscheinlichkeit 0,5 %für die zweite und dritte Läufigkeitswoche). Es konnte die Hypothese, beide Gruppenenstammen einer Grundgesamtheit, verworfen werden.

50375N =

erste Läufigkeitspätere Läufigkeit

Öst

ronä

quiv

alen

t in

ng/g

Kot

160

140

120

100

80

60

40

20

0

-20

Abbildung 22: Vergleichende Darstellung mittels Boxplots der Östrogenkonzentrationenwährend der Läufigkeit in der ersten und in späteren Läufigkeiten

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

45,00

50,00

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19

Läufigkeitstag

EG ng/g Kot

Abbildung 23: Graphische Darstellung der Mittelwerte des Östrogenverlaufs (in ngÖstronäquivalent/g Kot) bei Hündinnen in der ersten Läufigkeit (dunkle Balken) und beiHündinnen in späteren Läufigkeiten (helle Balken)

- 51 -

Die Meßergebnisse in der ersten Läufigkeitswoche waren deutlich niedriger in der erstenLäufigkeit als in den späteren Läufigkeiten, in der zweiten und dritten Läufigkeitswochewaren sie deutlich höher als in den späteren Läufigkeiten (erkennbar am mittleren Rang). DieErgebnisse sind in der Tabelle 12 dargestellt.

Tabelle 12: Vergleich von Hündinnen in der ersten Läufigkeit mit Hündinnen in späterenLäufigkeiten (U-Test nach Wilcoxon-Mann-Whitney)

erste Läufigkeitswoche

GRUPPE N Mittlerer Rang Rangsumme Test Wertspätere Läufigkeit 137 80,16 10981,5 Mann-Whitney-U 800,5erste Läufigkeit 17 56,09 953,5 Wilcoxon-W 953,5Gesamt 154 Z -2,099

Signifikanz (2-seitig) ,036

zweite und dritte Läufigkeitswoche

GRUPPE N Mittlerer Rang Rangsumme Test Wertspätere Läufigkeit 238 131,0 31178,5 Mann-Whitney-U 2737,5erste Läufigkeit 33 172,05 5677,5 Wilcoxon-W 31178,5Gesamt 271 Z -2,819

Signifikanz (2-seitig) 0,005

- 52 -

6. Diskussion

Östrogene wirken über Östrogenrezeptoren im Zellinneren, wobei sie die Proteinsynthesebeeinflussen können. Um Östrogene in ihrer Wirkung besser erforschen zu können, ist eswichtig, ein geeignetes Verfahren zu finden, mit dem man die Menge an produziertenÖstrogenen und damit die dem Körper, i. e. den Zellen, zur Verfügung stehendeHormonmenge messen kann.

In dieser Arbeit wurde die Bestimmung von Östrogenen in den Faeces bei der Hündindurchgeführt. Die Planung der Dissertation erfolgte im Frühjahr 1998, Probennahme war vonJuli 1998 bis April 1999. Im November 1998 veröffentlichten GUDERMUTH et al. (1998)eine ähnliche Untersuchung. Es soll in der Folge diese Arbeit insbesondere im Vergleich mitder Arbeit von GUDERMUTH et al. (1998) diskutiert werden.

6.1. Probanden

Insgesamt standen in der vorliegenden Studie 61 Hündinnen zur Verfügung, davon waren18 Hündinnen Rottweilerhündinnen der Militärhundestaffel, der Rest waren Hündinnenunterschiedlicher Rassen. Letztere wurden in einer nicht standardisierten Umgebung gehaltenund nicht täglich konstant gefüttert. Die hier durchgeführte Studie entspricht somit denFeldbedingungen, mit denen der Tierarzt normalerweise konfrontiert ist. Natürlich könneninfolgedessen bei einer Studie wie dieser mehr Störfaktoren einwirken. Es soll unter diesemAspekt das Probenmaterial dieser Studie mit dem anderer Studien verglichen werden.

Einfluß der Rasse und Fütterung auf den Hormongehalt im Kot

Bei in der Literatur beschriebenen Untersuchungen wurden meist Beagles (CONCANNONet al., 1977b; GRÄF, 1978; MELLIN et al., 1976; NETT et al., 1975; ONCLIN u.VERSTEGEN, 1997; WILDT et al., 1981; WILDT et al., 1978; WILDT et al., 1979),Labradors (CHAKRABORTY, 1987; CHAKRABORTY et al., 1980; STEINETZ et al., 1990)oder Schäferhündinnen (MESTRE et al., 1990) in standardisierter Umgebung verwendet.Seltener wurden Mischlinge untersucht (BOUCHARD et al., 1991; OLSON et al., 1982),allerdings wieder in standardisierter Umgebung.

VAN HAAFTEN et al. (1989) konnten bei 216 Hündinnen unterschiedlicher Rassen, diezur Deckzeitbestimmung an der Universität Utrecht vorgestellt wurden, mit Hilfe einesSchemas, das den Progesteronblutspiegel berücksichtigte, den Deckzeitpunkt bestimmen. Diesläßt die Vermutung zu, daß der Progesterongehalt im Blut bei der Hündin nicht von der Rasseund der Größe des Tieres abhängt.

- 53 -

Bei der Auswertung der im Fragebogen ermittelten Fütterung in dieser Studie zeigte sich,daß die Gruppe der Rottweilerhündinnen einheitlich gefüttert wurde. Die Fütterung derHündinnen in Einzelhaltung konnte statistisch nicht ausgewertet werden, weil keine konstantebzw. kalkulierbare Futtergabe erfolgte. Es wurde, weil Rassen und Fütterung der Tiere indieser Studie nicht einheitlich waren, die Statistik zum Großteil nur deskriptiv durchgeführt.

Bei Vergleich der Gruppe der läufigen Rottweilerhündinnen (einheitliche Rasse, Haltung,Fütterung) mit der Gruppe der übrigen läufigen Hündinnen konnte zwischen denMeßergebnissen der Östrogenkonzentrationen kein statistisch signifikanter Unterschiednachgewiesen werden. Somit konnte die Hypothese des Unterschiedes der beiden Gruppenweder verworfen noch bestätigt werden. Die Frage nach dem Einfluß der Rasse und Fütterungauf den Östrogengehalt im Kot bleibt somit in dieser Studie ungelöst.

Bei einem Vergleich der Ergebnisse der vorliegenden Studie mit den Ergebnissen vonGUDERMUTH et al. (1998), die in ihrer Studie Beagles unter standardisierten Bedingungenverwendeten, muß daher bedacht werden, daß es nicht auszuschließen ist, daß Rasse, Haltungund Fütterung Einfluß auf die Ergebnisse haben.

Einfluß der ersten Läufigkeit auf den Hormongehalt im Kot

Laut CHAKRABORTY et al. (1980), FELDMAN u. NELSON (1996) sowie WILDT et al.(1981) kann es bei der pubertierenden Hündin in der ersten Läufigkeit aufgrund einer nochnicht vollentwickelten Ovaraktivität zu Hormonimbalancen kommen. Es können im Blutniedrigere Hormonspiegel im Vergleich zu späteren Läufigkeiten nachgewiesen werden undder Eisprung kann eventuell sogar ausbleiben.

In dieser Studie befanden sich 3 Hündinnen in ihrer ersten Läufigkeit. Bei Vergleich derÖstrogenmeßwerte bei Hündinnen in der ersten Läufigkeit mit denen von Hündinnen inspäterer Läufigkeit konnte ein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden, wenn man die20 Tage ab Beginn der Läufigkeit in zwei Phasen teilte, die der ersten Woche und die der zweidarauffolgenden Wochen. In der ersten Woche waren die Meßwerte der ersten Läufigkeitendeutlich niedriger als die der späteren Läufigkeiten, danach war es genau umgekehrt.

Auf diesen Ergebnissen aufbauend könnte in einer Folgestudie die Hypothese überprüftwerden, ob die Östrogenkonzentration im Kot bei Hündinnnen in der ersten Läufigkeitlangsamer ansteigt und danach auch später wieder abfällt als bei Hündinnen in spätererLäufigkeit.

6.2. Aufbereitung der Proben

Vergleich Naßverfahren-Trockenverfahren

WASSER et al. (1993) beschrieben, daß die Progesteronaussscheidung im Kot, unabhängigvom Rohfasergehalt, mit dem (zwei Tage zuvor) im Blut gemessenen Progesteronspiegelkorreliert. BROWN et al. (1994) zeigten, daß unter physiologischen Bedingungen dieKonzentrationsschwankungen der Trockensubstanz nicht mehr als 10 % betragen. Die

- 54 -

Autoren sind der Meinung, daß der Feuchtigkeitsgehalt des Kotes zumeist vernachlässigtwerden kann. Es hat bei physiologischer Kotkonsistenz die Aufbereitung des Kotes (Einsatzder Originalsubstanz oder Trocknung und Pulverisierung) nur wenig Einfluß auf die Messungder Hormonkonzentration. Deshalb sind die beiden möglichen Verfahren in ihrerAussagekraft gleichwertig. Bei Bestimmung pro Gramm Trockensubstanz muß mit etwashöheren Werten gerechnet werden (BROWN et al., 1994). Angesichts des viel größerenArbeitsaufwandes ist allerdings das Naßverfahren dem Trockenverfahren vorzuziehen.

In dieser Arbeit unterschied sich die Recovery der einzelnen unbehandelten Kotproben vonjener aus Vorversuchen mit gepoolten Kotproben: In den Vorversuchen wurde eine Recoveryvon 64 % (Minimum 61 %, Maximum 70 %) erreicht. Bei Bestimmung der Recovery in dereigentlichen Studie wurde eine niedrigere Recovery festgestellt (Mittelwert 51 � 8 %,Varationskoeffizient 15 %, Minimum 30 %, Maximum77 %).

Es ist möglich, daß die zur Erstellung einer gepoolten Kotprobe nötige Homogenisierungder Kotmischprobe die Extraktion von Östrogenen erleichtert und deshalb eine bessereRecovery ermöglicht hat. Auch BROWN u. WILDT (1997) empfehlen zur Verringerung derMeßwertschwankungen die Kotproben vor der Aufbereitung gut zu durchmischen. BeiBerücksichtigung der in der Konsistenz teilweise sehr unterschiedlichen Kotproben ist eineRecovery von im Schnitt 52 % mit entsprechender Normalverteilung zufriedenstellend.Eventuell könnte erwogen werden, die Kotproben vor der Extraktion zu homogenisieren, umeine bessere Recovery zu erhalten. Auch ohne Homogenisierung konnten zufriedenstellendeVerlaufskurven gemessen werden. Bei Bestimmung der tatsächlichen Exkretionsmenge anÖstogenen müßte die Recovery aber berücksichtigt werden.

Entscheidend für die Meßergebnisse ist das eingesetzte Extraktionsverfahren. Dieses dientder Konzentrierung der in sehr niedriger Konzentration im Kot vorkommenden Östrogene,aber auch der Entfernung von Störsubstanzen im Kot, die mit demÖstrogennachweisverfahren interagieren und die Ergebnisse verfälschen können. Hierauf sollim folgenden genauer eingegangen werden.

Vergleich der Extraktionsverfahren

Gesucht war ein Extraktionsverfahren, das die nachzuweisende Substanz selbst effizient ausdem Kot lösen kann, dabei aber möglichst unempfindlich für Störsubstanzen ist. In derLiteratur werden folgende Extraktionsverfahren für Östrogene im Canidenkot beschrieben:Aufkochen von 0,1 - 0,2 g getrocknetem, pulverisiertem Kot in 10 ml 100 % Ethanol für 20Minuten (WASSER et al., 1995; MONFORT et al., 1997); Schütteln von 0,5 g unbehandeltenKot in 5 ml modifiziertem Phosphatpuffer, der unter anderem 20 % Methanol enthält(GUDERMUTH et al., 1998).

Diese beiden Extraktionsverfahren extrahieren sowohl apolare, nicht konjugierte, als auchpolare, konjugierte Östrogen-, Progesteron- und Testosteronmetaboliten. Zu erwarten ist, daßbei diesem relativ unspezifischen Extraktionsverfahren auch entsprechend viele Störfaktorenmitextrahiert werden. Im Gegensatz dazu extrahierte BRUNNER (1995) 0,5 g unbehandeltenKot mit 1,5 ml KOH und 0,5 ml Chloroform/n-Hexan. Dieses Extraktionsverfahren extrahiert

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spezifisch freie Östrogene über die Bildung von Kaliöstrogenaten (siehe auch Abschnitt 4.2).Bei diesem Extraktionsverfahren konnten allerdings aus dem Kot läufiger Hündinnen (indieser Zeit ist die höchste Konzentration von Östrogenen zu erwarten) nur sehr geringeKonzentrationen (unter 1 ng Östrogen/g Kot) isoliert werden. Somit war dieses Verfahren fürdie Aufgabenstellung dieser Arbeit (Östrogenmessung bei erwarteter niedriger Konzentration)nicht geeignet.

In dieser Studie wurde nun ein Extraktionsverfahren entwickelt, das spezifisch freieÖstrogene mit einer ausreichend hohen Ausbeute isoliert. Es erwies sich für die Extraktionniedriger Östrogenkonzentrationen als geeignet, lieferte aber auch bei hohenÖstrogenkonzentrationen, die erforderten, daß die Extrakte mehrmals verdünnt werdenmußten, gut reproduzierbare Ergebnisse. Der niedrigste Verdünnungsfaktor betrug 1:500.

Eine Möglichkeit, die Extraktionsverfahren von WASSER et al. (1995), von MONFORT etal. (1997) und von GUDERMUTH et al. (1998) zu vergleichen, ist mittels derWiederfindungsrate (Recovery) von vor der Extraktion zugesetzten Östrogenen. So gebenWASSER et al. (1995) für ihr Extraktionsverfahren eine Recovery von 88,3 � 0,7 % fürzugesetztes 3H-Östradiol und von 90,6 � 0,6 % für zugesetztes 14C-Progesteron an. Ähnlichsind die Werte von MONFORT et al. (1997), diesmal aber für 3H-Östradiol- und 14C-Progesteron-Metaboliten, weil die radioaktiv markierten Hormone der Wildhündin appliziertworden waren (95,9 � 1,1 % bzw. 92,7 � 1,7 %).

GUDERMUTH et al. (1998) bestimmten die Recovery auf eine andere Methode: Siesetzten zwei unterschiedliche bekannte Mengen Standardhormon zwei gleichen Kotproben zuund bestimmten nach Extraktion die Differenz der Hormonmenge mittels EIA. Hier konnteeine Recovery für Östradiol von 68 � 4 % und für Progesteron von 60 � 5 % gemessenwerden. Die Recovery in dieser Untersuchung lag für zugesetztes 3H-Östron in denVorversuchen bei 64 % (Minimum 61 %, Maximum 70 %), in der eigentlichen Studie bei51 � 8 % (siehe auch Abschnitt 6.2).

Die in der Literatur angegebenen Recovery-Raten waren hoch. Es ist allerdings zubedenken, daß die Bestimmung der Recovery mittels Messung von radioaktiv zugesetztenHormonen angibt, wieviel radioaktive Hormone sich nach der Extraktion im Extrakt befinden,aber nicht, wieviel Hormone schlußendlich auch im Assay gemessen werden. Ein bei jederExtraktion systematisch hinzukommender Blankwert wird auf diese Weise nicht miterfaßt.Das gleiche gilt auch bei Bestimmung der Recovery mittels Zusatz zweier bekannter Mengen,bei denen der Blankwert bei beiden Messungen gleich wäre, und nur die Differenz zwischenden beiden Messungen ausschlaggebend für die Bestimmung der Recovery ist.

6.3. HPLC

Bei MONFORT et al. (1997) und auch in dieser Arbeit konnten mittels HPLC im Kotneben 17�Östradiol noch weitere Östrogenmetaboliten nachgewiesen werden. MONFORTet al. (1997) identifizierten vier Hauptmetaboliten. Zwei davon konnten genauer spezifiziert

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werden. Einer hatte ein Elutionsverhalten wie 17�Östradiol, der andere ein Elutionsverhaltenwie Östron.

Auch in dieser Arbeit konnten vier Metaboliten nachgewiesen werden. Das zeitgleicheAuftreten der Hauptpeaks bei der straight phase HPLC-Fraktionierung mit denStandardsteroiden Östron, 17�-Östradiol und 17�-Östradiol läßt den Schluß zu, daß dieunkonjugierten Östrogenmetabolite im Kot bei der Hündin hauptsächlich aus Östron, 17�-Östradiol und 17�-Östradiol bestehen. Bei Vergleich der HPLC-Trennung von Pool 0 mitPool I fällt auf, daß die Konzentration der 17�-Östradiolfraktion bei kastrierten und nichtkastrierten Hündinnen in etwa gleich ist, während die Konzentration von Östron und 17�-Östradiol im Kot von nicht kastrierten Hündinnen wesentlich höher ist. Bei nicht kastriertenHündinnen besteht demnach der Hauptanteil der immunreaktiven Substanzen im Kot aus derÖstronfraktion, gefolgt von der 17�-Östradiolfraktion und der 17�-Östradiolfraktion. Die abder 62. Fraktion gemessenen immunreaktiven Substanzen lassen vermuten, daß auch bei derHündin weitere Östrogenmetaboliten auftreten, wie sie auch beim Afrikanischen Wildhundbeschrieben worden sind (MONFORT et al., 1997).

Als vierter Hauptmetabolit konnte ein konjugiertes Östrogen, Östronglucuronid,nachgewiesen werden. Da zur HPLC-Trennung von konjugierten Östrogenen im Kot sowohlein anderes, nicht so sensibles Extraktionsverfahren als auch ein anderes HPLC-Verfahren(siehe Abschnitt 4.6) verwendet werden mußte, konnte der Anteil von Östronglucuronid ander Gesamtmenge der Östrogenmetaboliten im Kot nicht beurteilt werden.

6.4. Enzymimmunoassay

Bei der Verwendung und beim Vergleich von Messungen mit unterschiedlichenEnzymimmunoassays ist zu beachten, daß die Antikörper der einzelnen Assaysunterschiedliche Bindungskapazitäten zu ihrem Antigen haben. Manche Assays weisenhauptsächlich eine einzige Substanz nach, gruppenspezifische Assays weisen mehrereSubstanzen ähnlicher Struktur nach.

Das Verwenden von EIAs mit unterschiedlicher Bindungskapazität erschwert den Vergleichvon Meßergebnissen der einzelnen Assays (SCHWARZENBERGER et al., 1997).

Dies ist auch der Fall beim Vergleich der Untersuchungen, die sich mitÖstrogenkonzentrationen im Kot von Caniden befassen. In der vorliegenden Untersuchungwurde ein gruppenspezifischer Enzymimmunoassay für Östrogene verwendet. Dieser zeigteKreuzreaktion mit folgenden Östrogenen: 17�-Östradiol (350 %), Östron (100 %), 17�-Östradiol (145 %) und Östriol (14 %). MONFORT et al. (1997) verwendeten für ihreUntersuchung ebenfalls einen gruppenspezifischen Radioimmunoassay, der Östrogen undÖstradiol erfaßte, Kreuzreaktionen sind keine angegeben. GUDERMUTH et al. (1998)wiederum verwendeten zur Bestimmung von Östrogenen im Hundekot einen EIA für 17�

Östradiol.

Ein EIA, der alle im Hundekot vorkommenden Metaboliten nachweisen kann, sollte einehöhere Östrogenkonzentration im Kot messen als ein Assay, der nur einen einzigen

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Metaboliten erfaßt. Deshalb überrascht der Vergleich der Meßergebnisse dieser Arbeit mitdenen von GUDERMUTH et al. (1998), wo ein Assay für 17�-Östradiol verwendet wurde.Trotzdem konnten GUDERMUTH et al. (1998) weitaus höhere Konzentrationen im Kotmessen (kastrierte Hündinnen 27 � 2 ng/g Kot, Hündinnen im Anöstrus 57 � 5 ng/g Kot,Hündinnen im Östrus 302 � 38 ng/g Kot). Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung sindweit niedriger (kastrierte Hündinnen 1,5 � 1 ng Östronäquivalent/g Kot, Hündinnen imAnöstrus 6,22 � 4,26 ng Östronäquivalent/g Kot, Hündinnen im Östrus 75,3 � 29,2 ngÖstronäquivalent/g Kot). Bei letzterer Arbeit findet während des Zyklus ein Anstieg um dasmehr als 10fache im Durchschnitt statt, bei der Arbeit von GUDERMUTH et al. (1998)kommt es nur zu einem 5fachen Anstieg. Die Ergebnisse dieser Arbeit kommen dem vonCONCANNON et al. (1989) beschriebenen 12-50fachen Anstieg im Blut ziemlich nahe. Einemögliche Erklärung für die Ergebnisse von GUDERMUTH et al. (1998) könnte ein hoherBlankwert sein, der die Relation Anöstrus/Östrus ungünstig beeinflußt.

6.5. Vergleich der Östrogenmessung im Kot mit der im Blut

Blutspiegelmessungen unterliegen Tagesschwankungen. NETT et al. (1975) konntenzeigen, daß innerhalb von 3 Stunden die Meßwerte von 17�-Östradiol bei ein- und derselbenHündin zwischen 36,4 pg/ml und 104,9 pg/ml lagen. Östrogenblutspiegel unterschiedlicherHündinnen können auch bei Verwendung desselben Nachweissystems sowohl im Verlauf alsauch in ihrer Konzentration variieren (WILDT et al., 1979). Die Höhe eines Hormonspiegelsim Blut ist nicht nur abhängig von der im Körper befindlichen Hormonmenge, sondern auchvom Blutvolumen und vom Verteilungsmuster des jeweiligen Hormons (CONCANNON etal., 1977b).

Im Gegensatz dazu wird bei Konzentrationsmessung im Harn und im Kot die während dergesamten Zeit der Exkretbildung ausgeschiedene Hormonmenge gemessen. MONFORT et al.(1997) zeigten, daß nach intramuskulärer Gabe von radioaktiv markierten Progesteron undÖstradiol diese innerhalb von 48 Stunden zu 86,1 % bzw. zu 71,5 % ausgeschieden wurden.Die im Kot gemessene Hormonmenge korreliert, wenn auch mit zeitlicher Verzögerung, mitder Produktionsmenge des Hormons.

GUDERMUTH et al. (1998) konnten eine signifikante Korrelation zwischen dergemessenen Östrogenkonzentration im Blut und der 24 Stunden später im Kot gemessenenKonzentration nachweisen. In der vorliegenden Studie wurde im Kot im Anöstrus einMedianwert von 5,0 ng Östronäquivalent/g Kot, im Östrus wurden Maximalwerte mit einemMedian von 63,5 ng Östronäquivalent/g Kot gemessen. Somit entspricht der relative Anstiegder Östrogenwerte dem Anstieg im Blut.

Über die Messung von Östrogenen im Blut bei kastrierten Hündinnen ist nichts bekannt. Indieser Arbeit konnte mittels straight phase HPLC das Vorhandensein von Östrogenen im Kotkastrierter Hündinnen bestätigt werden. Es konnten bei kastrierten Hündinnen Östrogene miteinem Medianwert von 1,2 ng/g Kot identifiziert werden. Östrogene können in der zonareticularis der Nebenniere gebildet werden. Es können zusätzlich Androgene (die auch in derNebenniere gebildet werden) enzymatisch zu Östrogenen in der Hypophyse, der Leber, den

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Skelettmuskeln, in den Haarfollikeln und im Fettgewebe umgewandelt werden (LINDZEY u.KORACH, 1997). Dies erklärt das Vorhandensein von Östrogenen bei Hündinnen, bei denendie Ovarien entfernt worden sind.

6.6. Mögliche Anwendungen

Wie bereits diskutiert, korreliert der Östrogengehalt im Kot mit dem im Blut. Es könntealso dieses Verfahren insbesondere dort angewendet werden, wo nicht invasiveUntersuchungsmethoden erwünscht sind. Dies könnte zum Beispiel der Fall sein bei nichthandzahmen oder aggressiven Hündinnen, bei kontinuierlichen Untersuchungen, bei denendie Alternative mit einer oftmaligen Blutabnahme verbunden ist, in Tierheimen oder beiCaniden in freier Wildbahn. Die Kotuntersuchung hätte den Vorteil, daß die Untersuchungohne Streß für das Tier erfolgt und daß am Ort der Probennahme kein Tierarzt nötig ist.

Östrogenmessungen könnten beim Hund zur Kontrolle der Ovaraktivität, zurZykluskontrolle, zur Diagnose von östrogenproduzierenden Tumoren, von Hauterkrankungen,die durch eine Östrogen-Über- oder -Unterfunktion hervorgerufen werden, sowie zurDiagnose von auf Östrogenmangel beruhender Harninkontinenz eingesetzt werden.

Die Signifikanz der Unterschiede der Meßergebnisse zwischen kastrierten und nichtläufigen Hündinnen läßt hoffen, daß eine nichtinvasive Differenzierung von kastrierten undnicht läufigen Hündinnen, die klinisch nicht von einander zu unterscheiden sind, möglich seinwird. Im Ergebnisteil 5.3 wurde die Effizienz eines Tests zur Kastrationsdiagnose für die hierdurchgeführten Meßergebnisse bestimmt.

Lag die Östrogenkonzentration der Kotprobe über 2,5 ng/g Kot, so konnte mit 98%igerWahrscheinlichkeit angenommen werden, daß die Probe von einer nicht kastrierten Hündinstammt. War der Wert kleiner gleich 2,5 ng/g Kot, so konnte mit einer Wahrscheinlichkeitvon 65 % angenommen werden, daß die Kotprobe von einer kastrierten Hündin stammt. MitHilfe der Kotanalyse konnte daher bei Meßwerten � 2,5 ng/g Kot mit großer Sicherheit eineKastration ausgeschlossen werden, bei Werten kleiner gleich 2,5 ng/g Kot eine Kastrationaber nicht bestätigt werden. Die Sensitivität zum positiven Nachweis von kastriertenHündinnen lag bei 94 %, die Spezifität zur richtigen Diagnose von nicht kastriertenHündinnen lag bei 85 %.

Eine Stichprobe von 18 kastrierten, 30 nicht läufigen und 24 läufigen Hündinnen ist aber zuklein, um auf die Hundepopulation rückschließen zu können. Trotzdem ermutigen dieErgebnisse dieser Arbeit, in einer Folgeuntersuchung mit größerer Probandenzahl einen fürdie Hundepopulation allgemeingültigen Test zu entwickeln, der es ermöglicht eine Kastrationauszuschließen. In Tierheimen könnte ein solcher Test bei Hündinnen, deren Kastrationsstatusnicht bekannt ist, eine bereits durchgeführte Kastration mit großer Wahrscheinlichkeitausschließen.

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7. Zusammenfassung

Im Vergleich zu Blutabnahmen ist das Sammeln von Kotproben leicht durchführbar. Eskönnen auch Tierbesitzer die Probennahme durchführen. Aus diesem Grund wird dieBestimmung von Östrogenen im Kot bei Huftieren, Wiederkäuern und Suiden bereitserfolgreich angewandt. Da bei Caniden während des Anöstrus nur geringeÖstrogenkonzentrationen im Blut zu finden sind, wurde für die Quantifizierung der Östrogeneim Hundekot eine Extraktionsmethode entwickelt, welche Messungen niedrigerÖstrogenkonzentrationen ermöglicht.

Der Kot von Hündinnen verschiedener Rassen (n=24) wurde täglich für 20 Tage beginnendmit dem ersten Tag der Läufigkeit gesammelt. Zum Vergleich wurden auch einzelne Probenvon Hündinnen im Anöstrus (n=30, 15 davon wurden auch im Östrus untersucht) undkastrierten Hündinnen (n=18) genommen. Der Kot wurde bei -20°C bis zur Analyse gelagert.

Die Proben (0,5 g gemischt mit 0,5 ml Wasser) wurden mittels 10 ml Diethyläther/n-Hexan(1/4) extrahiert. Die organische Phase wurde abpipettiert und eingedampft; danach wurde derRückstand in 0,5 ml Chloroform/n-Hexan (6/4) gelöst und mit 0,5 ml 1M Kalilaugereextrahiert. 200 �l dieser Kalilaugenphase wurden mit 10 �l Eisessig versetzt. DieKonzentration der unkonjugierten Östrogene wurde mittels eines gruppenspezifischenEnzymimmunoassays gemessen. Zur Charakterisierung der immunreaktiven Östrogene wurdedie Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) eingesetzt. Die Ergebnisse des HPLC-Immunogramms zeigten, daß das dominierende Östrogen im Kot Östron ist, gefolgt von 17�-Östradiol und 17�-Östradiol.

In den am ersten Läufigkeitstag gesammelten Proben wurden Östrogene in einerKonzentration von 2,5 bis 62,4 ng Östronäquivalent/g Kot (Median 12,3 ng/g) gemessen. Amachten Läufigkeitstag konnte ein Konzentrationsbereich von 5,9 bis 145,7 ngÖstronäquivalent/g Kot (Median 30,8 ng/g) festgestellt werden. Im Vergleich dazu enthieltenKotproben von Hündinnen im Anöstrus 0,6 bis 17,6 ng Östronäquivalent/g Kot (Median5,0 ng/g) und von kastrierten Hündinnen 0,2 bis 4,9 ng Östronäquivalent/g Kot (Median1,2 ng/g). Die Unterschiede zwischen den drei Gruppen waren signifikant (p < 0,001).

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8. Summary

In comparison to blood analysis, measurement of oestrogens in the faeces is more feasible,if repeated sampling is necessary. As during anestrus low oestrogen concentrations are presentin the blood of bitches, a sensitive method for measuring these hormones was established.

Daily faecal samples of bitches (n=24) of various breeds for 20 days after the start of theoestrus and single samples of bitches in anestrus (n = 30, 15 of them were also analysedduring oestrus) or ovariohysterectomized bitches (n = 18) were collected. The faeces werestored at -20°C till analysis.

Samples (0.5 g mixed with 0.5 ml water) were extracted using 10 ml diethylether/n-hexane(1/4). The organic phase was decanted and evaporated, redissolved in 0.5 ml chloroform/n-hexane (6/4) and reextracted with 0.5 ml 1 M KOH. 10 �l glacial acetic acid was added to 200�l of the recovered KOH. The concentration of total unconjugated oestrogens was measured,using a group specific enzyme immunoassay. High performance liquid chromatography(HPLC) was used to identify the immunoreactive oestrogens.

The results of the HPLC immunogramme showed that the dominating oestrogen in faeceswas oestrone, followed by oestradiol-17� and oestradiol-17�.

In samples collected on the first day of oestrus the oestrogen concentration was in the rangeof 2.5 to 62.4 ng/g faeces (median 12.3 ng/g). On day eight a range of 5.9 to 145.7 ng/g(median 30.8 ng/g) was measured whereas bitches in anestrus (median 5.0 ng/g, range 0.6 to17.6 ng/g) and ovariohysterectomized bitches (median 1.2 ng/g; range 0.2 to 4.9 ng/g)excreted lower amounts of estrogens. Significant differences (p < 0.001) between these threegroups were seen using the Wilcoxon-Mann-Whitney U-Test.

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10. Anhang

10.1. Fragebogen an den Hundehalter

Protokollnummer 1Name des Tierbesitzers : ..........................................................................................................Straße : ....................................................................................................................................Ort : .........................................................................................................................................Telefonnummer : ......................................................................................................................Name der Hündin : ...................................................................................................................Rasse : .....................................................................................................................................Geburtsdatum : ........................................................................................................................Gewicht : .................................................................................................................................

1. Umfeld der Hündin

Haltung: Zwinger Haus einziges Haustier mit anderen Tieren :

andere Tiere (ausgenommen Hunde) : .........................................................Hunde: nein ja :

Rüden : nein ja wieviel ?..... Weibchen : nein ja wieviel?

Gibt es eine Rangordnung unter den Hündinnen? nein ja:In welcher Position befindet sich die Hündin, die an dieser Studie teilnimmt ? ... . StelleSind die Läufigkeiten der einzelnen Hündinnen zeitlich aneinander gekoppelt? nein ja

2. Eventuelle Erkrankungen der Hündin

(Mit Angabe des Datums und, soweit bekannt, der Medikamente. Bitte auch aus anderen Gründen verabreichteMedikamente angeben):..........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

3. Fütterung der Hündin : Fertigfutter „Selbstgekochtes“ teils/teils

Angaben zum Futter:..........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

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4. Fragen zum Sexualzyklus der Hündin

LäufigkeitAlter beim Auftreten der 1. Läufigkeit: ...... MonateIntervalle zwischen den Läufigkeiten: unregelmäßig

regelmäßig : ......bis ........MonateWenn bekannt, bitte Daten der einzelnen Läufigkeiten angeben:............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................Durchschnittliche Dauer der Läufigkeit:.......................TageIn der wievielten Läufigkeit befindet sich die Hündin in dieser Studie: ..........Erkennen des ersten Tages der Läufigkeit: einfach schwierigBlutung (Färben) während der Läufigkeit: deutlich eher wenigWie attraktiv ist die Hündin während der Läufigkeit für Rüden:

sehr (attraktiver als andere läufige Hündinnen) durchschnittlich wenig

Wurde die Läufigkeit jemals mit Medikamenten verhindert ? nein ja: wie oft und wann ?..............................................................................................................................................................................Um den wievielten Tag der Läufigkeit duldet die Hündin den Rüden (ließe sie sich decken):..............................................................................................................................................................................War die Hündin nach der Läufigkeit scheinträchtig? nein ja: wie oft und wann?..............................................................................................................................................................................Wurde sie deshalb medikamentell behandelt? nein ja

TrächtigkeitWar die Hündin schon trächtig ? nein jaWurde vor der Deckung der Hündin der günstigste Zeitpunkt hierfür bestimmt? nein jaWelche Methoden (einschließlich evtl. Behandlung) wurden eingesetzt?............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................Anzahl der Trächtigkeiten: .........Daten der Geburten: ....................................................................................................Durchschnittliche Wurfgröße: ............... Welpen insgesamt: ...............(davon tot : .......)Durchschnittliche Tragzeit: ................TageKomplikationen bei der Trächtigkeit:Abnormale Trächtigkeit: nein jaAbnormale Geburt: nein jaHohe Sterblichkeit der Welpen nach der Geburt: nein jaProbleme mit der Nachgeburt: nein ja

Zu der an dieser Studie beteiligten LäufigkeitLänge der Läufigkeit: .............................................Duldung des Rüden am .....-....... . Tag der LäufigkeitWurde die Hündin gedeckt? nein jaAn welchem Tag?...................Mit Erfolg ? nein jaTragzeit: .................Anzahl der Welpen: ....... (davon tot: .....)Wurde Ihre Hündin in dieser Zeit tierärztlich betreut und wäre der behandelnde Arzt bereit uns die Befunde zurVerfügung zu stellen? nein ja

Herzlichen Dank für Ihre Mitarbeit!

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10.2. Quelldaten zur StudieTabelle 13: Überblick über die VersuchstiereName Gruppe Rasse Gewicht (kg) Jahre wiev. Läuf. Kommentar1 BLACKY läufig/nicht läufig Mischling 10 6,02 TARA läufig/nicht läufig Mischling 25 2,5 53 BOSSY läufig/nicht läufig Staffordshire Bullterrier 17 4,9 94 ASRA läufig/nicht läufig Schäfer 28 5,8 116 ISI läufig/nicht läufig Engl. Cocker Spaniel 11 1,9 313 JOSEY läufig/nicht läufig Bullmastiff 40 1,8 514 MYSTERY läufig Schapendoes 14 1,4 2 11.-12. Tag gedeckt,nicht aufg.17 MARIE läufig Golden Retriever 34 5,6 6 16. Tag gedeckt, nicht aufg.22 VARGA läufig/nicht läufig Beagle 15 11,3 2225 BILLY läufig/nicht läufig Mischling 16 11,8 2228 NANGOMA läufig Rhodesian Ridgeback 34 3,8 7 17. Tag gedeckt, aufgenommen29 MAHARA läufig Rhodesian Ridgeback 33 5,8 11 17. Tag gedeckt, aufgenommen34 ANTEA läufig Alaskan Malamut 48 6,1 17 13. Tag gedeckt, aufgenommen35 CORINA läufig Alaskan Malamut 32 1,4 340 MAEVA läufig Berger des Pyrénées 11 2,0 341 MOMO läufig Mischling 7 2,5 442 RONJA läufig/nicht läufig Jack Russel Terrier 7 1,8 5 8. Tag gedeckt, aufgenommen43 FRANKA läufig Berner Sennenhund 38 0,7 145 LINDA läufig/nicht läufig Rottweiler 33 1,0 2 Militärhundestaffel46 ERNIE läufig/nicht läufig Rottweiler 36 2,2 4 Militärhundestaffel47 ILSE läufig/nicht läufig Rottweiler 33 1,5 3 Militärhundestaffel48 NIKITA läufig/nicht läufig Rottweiler 30 0,8 1 Militärhundestaffel49 AMY läufig/nicht läufig Rottweiler 38 8,2 14 17.Tag gedeckt, aufg., Militärh.50 ANKA läufig Rottweiler 34 0,8 1 Militärhundestaffel51 NELLI nicht läufig Rottweiler 34 0,8 Militärhundestaffel52 NANA läufig Berner Sennenhund 46 2,2 453 LIESL läufig Entlebucher Sennenh. 25 7,5 1456 BEA läufig Hovawart 33 5,1 8 13. Tag gedeckt, aufgenommen59 INA läufig/nicht läufig Rottweiler 31 1,5 3 Militärhundestaffel60 CHAOS kastriert Beagle 12 3,761 IFFI kastriert Beagle 15 5,362 EICHE kastriert Beagle 13 5,363 FEE kastriert Beagle 10 5,364 DIANA kastriert Kanad. Schäferhund 26 2,165 SCHINTAG kastriert Irish Setter 30 13,766 Hirtl kastriert Mischling 23 11,01937/98 kastriert Staffordshire Bullterrier 14 5,8 Tierschutzhaus1602/97 nicht läufig Dogo Argentino 0,9 Tierschutzhaus2323/97 kastriert Mischling 25 4,0 Tierschutzhaus1601/98 kastriert Dogo Argentino 4,0 Tierschutzhaus2145/97 kastriert Staffordshire Bullterrier 14 3,0 Tierschutzhaus643/98 kastriert Bullterrier 20 2,0 Tierschutzhaus1930/98 kastriert Staffordshire Bullterrier 14 2,0 Tierschutzhaus2078/97 kastriert Staffordshire Bullterrier 14 2,0 Tierschutzhaus2119/98 nicht läufig Mischling Tierschutzhaus184/99 nicht läufig Mischling 4,0 Tierschutzhaus77 Scampi kastriert Mischling 18 3,578 AICHINGER kastriert Kleiner Münsterländer 18 8,479 DAGI nicht läufig Rottweiler Militärhundestaffel80 CORA nicht läufig Rottweiler Militärhundestaffel81 NIKOLA nicht läufig Rottweiler Militärhundestaffel82 EVA nicht läufig Rottweiler Militärhundestaffel83 AURA nicht läufig Rottweiler Militärhundestaffel84 FANNY nicht läufig Rottweiler Militärhundestaffel85 IRIS nicht läufig Rottweiler Militärhundestaffel86 BONNY nicht läufig Rottweiler Militärhundestaffel87 NENZI nicht läufig Rottweiler Militärhundestaffel88 LONA nicht läufig Rottweiler Militärhundestaffel89 KLEIN kastriert Mischling90 KLEIN nicht läufig MischlingTEINFALT kastriert Mischling

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Tabelle 14: Östrogenmessungen in ng Östronäquivalent/g Kot bei allen läufigen Hündinnenvom 1. bis zum 20. Läufigkeitstag (n.b.: Östrogenkonzentration nicht bestimmt)

HundTag \ 1 2 3 4 6 13 14 17 22 25 28 29 34 35

1. n.b. 41,6 8,3 2,5 9,8 5,9 104,5 12,4 n.b. 4,0 11,0 n.b. 62,4 12,22. n.b. 34,0 12,1 19,2 n.b. 22,4 61,0 28,0 21,2 9,4 14,7 31,2 18,4 21,13. 14,9 54,3 5,5 17,7 60,4 n.b. 37,7 40,2 9,8 13,4 13,0 35,6 27,9 44,14. 18,1 79,8 4,9 16,1 11,4 26,3 58,3 40,0 43,4 6,3 20,0 20,7 19,9 46,75. 46,3 55,7 10,9 16,3 28,2 19,6 148,1 17,1 62,4 15,2 5,2 28,2 n.b. 29,66. 40,8 57,8 15,6 22,7 31,0 23,8 33,8 24,7 15,1 12,4 40,0 14,6 27,1 99,57. 13,9 45,8 11,4 21,0 42,1 14,9 14,0 n.b. 5,6 11,1 5,7 30,4 16,3 29,28. 13,4 30,8 31,0 30,2 58,5 5,9 7,6 28,0 6,4 15,1 50,9 8,9 42,7 26,89. n.b. 13,3 n.b. 7,0 21,6 43,6 9,9 46,4 5,6 3,9 57,8 55,4 25,2 46,310. 45,6 42,2 57,4 59,1 7,1 49,1 3.0 63,9 5,3 26,1 64,6 56,5 8,6 47,511. 63,2 20,8 37,8 68,4 6,9 61,2 6,5 21,7 n.b. 16,2 23,2 17,9 n.b. 128,812. 8,5 24,3 78,8 31,0 6,1 35,6 12,4 25,6 n.b. 22,1 32,0 43,3 39,0 44,813. 13,0 10,6 87,7 22,4 21,0 n.b. 8,2 36,1 n.b. 18,1 10,7 60,3 n.b. 97,014. n.b. 10,7 48,8 12,2 5,1 40,5 7,5 29,4 3,6 29,4 13,6 5,3 24,1 60,415. 34,7 11,3 43,1 2,3 2,4 51,1 3,0 4,7 5,9 59,2 n.b. 8,1 15,7 23,916. 6,0 9,7 30,1 3,5 4,3 7,6 7,0 7,4 n.b. 9,7 n.b. n.b. 6,4 27,417. n.b. 9,2 15,1 9,2 4,1 22,3 6,6 5,9 n.b. 3,4 5,6 n.b. 8,5 15,918. 1,9 12,0 5,2 7,0 6,7 4,9 5,6 7,7 n.b. 4,0 6,3 3,3 7,0 13,519. n.b. 11,0 10,9 1,6 2,4 n.b. 6,0 8,4 n.b. 6,2 8,2 4,4 8,6 12,120. 5,5 5,0 3,4 6,7 5,5 1,9 12,5 3,3 n.b. 4,1 n.b. 3,6 4,7 7,6

HundTag \ 40 41 42 43 45 46 47 48 49 50 52 53 56 59

1. 13,8 20,6 18,0 n.b. 24,8 21,0 10,2 10,2 12,5 5,8 21,5 21,6 6,1 n.b.2. 35,2 46,2 19,4 n.b. 19,3 41,1 17,6 15,0 10,7 5,1 5,6 13,4 11,2 39,53. 36,6 n.b. 22,4 15,9 56,3 52,5 13,6 10,1 18,1 6,5 44,8 60,0 38,6 42,84. 47,9 16,8 25,2 28,6 n.b. 43,9 23,4 n.b. 10,8 18,2 39,4 30,7 20,5 4,95. 44,4 43,5 14,0 43,8 69,7 49,6 8,4 n.b. 10,5 12,2 38,2 10,7 34,7 16,96. 16,0 51,0 13,2 37,4 60,9 16,2 59,7 16,6 26,3 4,7 49,1 n.b. 24,4 57,57. 9,4 37,7 36,8 61,5 79,9 9,1 32,5 20,8 4,5 16,8 51,8 69,5 110,7 23,98. 11,6 n.b. 26,6 31,3 112,5 15,9 45,3 30,9 40,8 30,6 109,5 145,7 n.b. 25,59. 19,6 19,8 15,1 68,4 34,1 4,1 9,6 19,4 37,4 46,3 15,8 40,5 50,8 22,310. 4,1 20,8 5,8 77,9 19,0 4,2 32,3 15,3 23,8 26,3 11,8 23,8 29,1 5,211. 2,9 51,0 10,6 n.b. 2,7 n.b. 8,2 21,8 32,7 11,3 23,9 23,1 10,2 6,212. 78,6 49,1 6,0 19,3 n.b. 6,6 8,4 40,6 11,9 63,1 26,5 8,6 5,0 8,413. 6,6 25,9 6,4 11,7 3,3 8,5 n.b. 50,1 33,9 36,8 n.b. 6,7 3,3 3,414. 2,6 46,6 0,3 13,9 4,5 5,8 4,8 12,5 27,2 n.b. 13,6 4,3 5,2 n.b.15. 4,9 n.b. 3,7 n.b. 7,5 3,9 5,9 40,0 10,6 n.b. n.b. 5,1 7,8 n.b.16. 4,4 30,9 1,0 2,6 4,9 n.b. 3,8 14,4 21,3 13,3 19,2 3,8 3,9 4,917. 11,4 9,7 2,5 n.b. 10,8 10,7 6,5 30,7 n.b. 11,1 41,7 4,3 6,4 4,018. 12,2 n.b. 3,5 3,6 5,7 6,6 6,6 30,9 n.b. 17,3 19,4 n.b. 4,1 n.b.19. 10,9 18,2 3,5 9,2 4,7 n.b. 23,0 55,0 6,3 21,6 n.b. 7,0 11,8 9,820. 13,0 n.b. 6,8 2,3 8,2 n.b. 25,2 n.b. 4,2 9,7 5,7 6,4 21,0 9,2

- 77 -

Tabelle 15: Progesteronmessungen in ng Progesteronäquivalent/g Kot bei allen läufigenHündinnen vom 1. bis zum 20. Läufigkeitstag (n.b.: Progesteronkonzentration nicht bestimmt;> NG: Progesteronkonzentration über der Nachweisgrenze; < NG: Progesteronkonzentrationunter der Nachweisgrenze)

HundTag \ 1 2 3 4 6 13 14 17 22 25 28 29 34 35

1. n.b. 38,3 123,4 83,5 31,1 < NG > NG 43,0 n.b. < NG n.b. n.b. < NG < NG2. n.b. 63,8 68,1 247,4 n.b. < NG 458,3 52,4 < NG < NG n.b. n.b. < NG < NG3. 131,1 79,0 < NG 203,9 99,2 n.b. 423,8 63,8 < NG < NG n.b. n.b. < NG < NG4. 232,8 88,4 < NG 247,4 151,0 < NG 373,4 124,6 < NG < NG n.b. n.b. < NG < NG5. 261,9 65,4 45,7 370,9 85,5 292,3 > NG 59,8 46,5 49,7 n.b. n.b. n.b. < NG6. 225,3 106,5 76,2 473,8 88,1 < NG > NG 62,8 162,6 38,6 n.b. n.b. < NG 48,67. 102,4 154,3 85,0 366,1 116,5 < NG > NG n.b. 358,9 54,7 n.b. n.b. < NG < NG8. 232,8 72,8 117,0 429,7 270,4 < NG > NG 219,5 > NG 82,7 n.b. n.b. < NG < NG9. n.b. 92,4 n.b. > NG 160,0 < NG > NG 103,1 > NG 68,0 n.b. n.b. < NG < NG10. 291,3 > NG 313,8 > NG 515,5 49,7 > NG 458,8 > NG 73,3 n.b. n.b. 51,0 < NG11. 257,5 > NG 313,8 > NG 393,2 75,4 > NG 416,8 n.b. 137,3 n.b. n.b. n.b. < NG12. > NG > NG 364,0 > NG > NG < NG > NG 490,1 n.b. 104,8 n.b. n.b. 55,0 < NG13. > NG > NG > NG > NG > NG n.b. > NG 342,3 n.b. 87,8 n.b. n.b. n.b. < NG14. n.b. > NG 381,1 > NG > NG 81,2 > NG > NG > NG 43,5 n.b. n.b. > NG 40,115. > NG > NG 364,0 > NG > NG 180 > NG 437,1 > NG 155,2 n.b. n.b. 471,6 50,816. > NG > NG > NG > NG > NG 451,4 > NG 529,9 n.b. 157,6 n.b. n.b. 437,6 235,017. > NG > NG > NG > NG > NG 458,8 > NG 586,5 n.b. 141,5 n.b. n.b. > NG 295,918. > NG > NG > NG > NG > NG 332,4 > NG > NG n.b. 95,9 n.b. n.b. 543,5 > NG19. n.b. > NG > NG > NG > NG n.b. > NG > NG n.b. 148,2 n.b. n.b. 478,9 > NG20. > NG > NG > NG > NG > NG > NG > NG > NG n.b. 288,9 n.b. n.b. 526,2 > NG

HundTag \ 40 41 42 43 45 46 47 48 49 50 52 53 56 59

1. 153,9 > NG 53,4 n.b. 121,0 211,1 96,2 n.b. 31,8 35,3 < NG < NG 183,9 n.b.2. 348,7 > NG 49,6 n.b. 32,0 62,1 64,9 123,8 < NG < NG < NG < NG 138,1 > NG3. 321,8 n.b. 79,3 160,5 145,4 53,9 68,3 61,5 < NG < NG < NG < NG 215,4 > NG4. > NG > NG 64,8 30,1 n.b. 81,6 59,5 n.b. < NG < NG < NG 59,3 378,9 281,75. 321,8 > NG 46,9 < NG 193,4 187,5 97,9 n.b. < NG 61,1 31,1 229,2 243,4 > NG6. 402,4 > NG 143,1 < NG 125,5 48,5 203,0 32,7 59,3 < NG < NG n.b. 176,9 > NG7. 358,5 > NG 232,9 36,7 159,7 108,3 191,9 n.b. < NG < NG 171,3 68,3 451,0 > NG8. > NG n.b. 408,4 < NG 162,8 37,9 223,3 < NG < NG < NG 82,8 241,1 n.b. > NG9. > NG > NG > NG < NG 151,0 353,0 184,9 < NG < NG 61,1 n.b. 176,4 > NG > NG10. > NG > NG > NG 93,3 240,9 488,1 232,1 < NG < NG < NG 376,5 110,4 378,9 > NG11. > NG > NG > NG n.b. 153,8 n.b. 442,0 44,1 < NG < NG 250,4 221,7 488,1 > NG12. > NG > NG > NG 108,4 n.b. > NG 219,0 < NG < NG 146,8 > NG 496,5 > NG > NG13. > NG > NG > NG 152,5 291,0 > NG n.b. 32,7 < NG 208,7 n.b. > NG 475,2 > NG14. > NG > NG > NG 292,3 > NG > NG 351,1 33,5 56,8 n.b. > NG > NG > NG n.b.15. > NG n.b. > NG n.b. > NG > NG 375,4 48,9 24,6 n.b. n.b. > NG > NG n.b.16. > NG > NG > NG 485,5 > NG n.b. 421,4 < NG 177,5 51,2 > NG > NG > NG > NG17. > NG > NG > NG n.b. > NG > NG 411,6 97,3 n.b. 57,6 > NG > NG > NG > NG18. > NG n.b. > NG > NG 310,7 > NG 402,1 189,6 n.b. 180,2 > NG > NG > NG n.b.19. > NG > NG > NG > NG 399,6 n.b. > NG 479,1 481,5 474,3 n.b. > NG > NG > NG20. > NG n.b. > NG > NG > NG n.b. > NG n.b. 504,1 182,8 > NG > NG 211,1 > NG

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KONTROLLE DER OVARAKTIVITÄT VON HÜNDINNEN MITTELS ...members.yline.com/~ursula.hoffmann/diss.pdf · Aus dem Institut für Biochemie der Veterinärmedizinischen Universität Wien