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Kriterien der Einteilung von RNA Viren entsprechend

Ihrer Genomorganisation

einzelsträngig

doppelsträngig circulär

(+)-Polarität (-)-Polarität ambisense

nicht segmentiert

ArenavirusPoliovirussegmentiert

Influenza A Virus

vesicular stomatitis virua (VSV)

Hepatitis -VirusReovirus

Prinzipien der Replikation und mRNA-Synthese

nicht-retroviraler RNA-Viren

RNA Genom

(+),(-), dsSynthese von mRNA

(+)

Kopie des RNA Genoms

(+),(-), ds

„Transkription“mRNA-Sysnthese

Replikation

Translation in virale Proteine(Strukturproteine, regulatorische Proteine)

Verpackung in neue Virionen(Verpackungssequenzen, Strukturproteine)

RNA-abhängige RNA Synthese

RNA RNA

Virale RNA-abhängige RNA Polymerasen (RdRPs) !!Ausnahme: Retroviren (RdDP)

RNA-abhängige RNA-Polymerasen

Zellextrakte Poliovirus-infizierter Zellen enthalten eine enzymatische Aktivität die die

„primer“ und „template“ abhängige Inkorporation von Ribonukleotiden katalysiert

Die Aktivität ist insensitiv gegenüber Actinomycin D

Die Aktivität konnte dem cytoplasmatischen viralen 3Dpol-Protein zugeschrieben werden

Vergleichbare Aktivitäten sind später in Partikeln von (-) Strang RNA Viren entdeckt worden

Die meisten RNA-abhängigen RNA Polymerasen (RdRPs) sind primerunabhängig

(vergleichbar den zellulären DNA-abhängigen RNA Polymerasen)

Aufgrund der präferentiellen Membranlokalisation ist die Reinigung der meisten RdRPs schwierig

Primärsequenzvergleiche verschiedener zellulärer und viraler Polymerasen weisen auf

einen gemeinsamen „Vorfahren“ hin

Primärstrukturvergleich und Sequenzhomologie viraler

und zellulärer Polymerasen

Poliovirus 3Dpol

HIV-I RT

Pol I KlenowRNA Pol T7

Metallbindung

© Flint et al. Principles of Virology

Tertiärstruktur der Poliovirus 3Dpol-Polymerase und

generelle Strukturhomologien von Polymerasen

YGDD

Klenow T7 RNAP HIV-I RT 3Dpol

Nur in RdXPs


Einige repräsentative Viren mit RNA-Genomen


Funktionen akzessorischer Proteine bei der

RNA-abhängigen RNA Synthese

1. Direktion der RNA-Polymerase zum korrekten zellulären Kompartiment

RNA-Synthese findet typischerweise nicht frei im Cytoplasma, sondern in bzw. an definierten zellulären Strukturen statt:(-) Strang Segmente von Influenza A Virus werden vermittels eines NLS im NP Proteinsin den Kern dirigiert.(+) Strang des Poliovirusgenoms wird vermittels der Interaktion von 3AB mit 3CD anein vesikuläres Kompartiment dirigiert.

2. Direktion der RNA-Polymerase zur korrekten Stelle der viralen Matrize

Die Matrizenspezifität viraler RdRP wird durch spezifische Interaktionen derPolymerase mit akzessorischen viralen oder zellullären Proteinen, die anspezifische Stellen in der Matrize binden (RNA-Sekundärstrukturen), vermittelt.Beispiel: Poliovirus 3CD/RNA Interaktion.

3. Stimulation der Polymeraseaktivität

4. Erleichterung der RNA-Synthese durch viruscodierte Helicasen

Basengepaarte Bereiche innerhalb der RNA werden durch Helicasen aufgeschmolzen.Dies stellt einen möglichen Angriffspunkt für therapeutische Intervention dar (HCV-Helicase)

Strategien der Replikation und mRNA Synthese von RNA Virusgenomen


Zelluläre Orte viraler RNA Synthese

Cytoplasma:

Die meisten RNA-Viren replizieren ihr Genom und synthetisieren ihre mRNAs im Cytoplasma

Synthese erfolgt nicht frei sondern ist an zelluläre Strukturen gebunden (Vesikel, Membranen,

Cytoskelett)

Die hohe lokale Konzentration der für die Replikation notwendigen Komponenten erhöht

die Effizienz der Replikation

Membranen stellen häufig den Ort der Verpackung neuer Virionen dar.

Problem: Alle normalerweise nukleären Aktivitäten des Wirtes müssen von viralen Proteinen

bereitgestellt werden (z.B. capping von mRNAs).

Nukleus:

Von den RNA Viren replizieren nur Influenza und Borna Viren im Nukleus

Vorteil besteht in der Möglichkeit der Ausnutzung des zellulären „splicing“-Apparates

Es müssen Mechanismen des Kerntransportes entwickelt werden. NP-Protein enthält

Kernlokalisationssequenz.

Replikation und RNA-Synthese von (+) Strang RNA Viren

RNA von (+) Strang RNA Viren ist infektiös- (+) Strang genomische RNA kann als direkte Matrize für die Synthese von RdRP dienen

(+) Strang RNA Viren bedürfen keine aktive RdRP im Viruspartikel

Genomreplikation erfolgt über ein komplettes (-) Strang Intermediat

Polivirus hat ein 5´VpG statt CAP

Struktur und Genomorganisation des (+) Strang

Picornavirus: Poliovirus


Replikationszyklus des (+) Strang

Picornavirus: Poliovirus

Bindung an PVR(Kapsidöffnung, RNA-Freisetzung)

Polyproteinsynthese(VPg-Entfernung, Ribosomenbindung

an IRES Element)

Polyproteinprozessierung(P1:Struktur; P2, P3: Proteasen und

RdRP)

Proteintransport in Vesikel(vesikuläre RNA-Synthese)

VPg (-) Strangsynthese

VPg (+) Strangsynthese

Zellkern

Membranvesikel


Struktur des 5´-Endes des Poliovirus (+) Strang RNA Genoms

22 AminosäurenVPg Peptid

Phosphosäureester mit Tyr 3 von VPg

5´-Uridylrest

Hydrolyse durch zelluläre Esterase(Generierung eines 5´-Up-Endes)

Kleeblattstruktur des 5´-Endes desPoliovirus RNA-Genoms


RNA Sekundärstrukturen

„stem-loops“ und „Pseudoknoten“

„stem-loop“ Strukturen Pseudoknoten

Basenpaarungen im Stamm (stem),Keine Basenpaarungen innerhalbder Schleife (loop)

Basenpaarungen im Stamm,Basenpaarungen der Schleife mitNukleotiden außerhalb der Schleife


Die Spezifität der Poliovirus RNA Synthese wird durch spezifische Interaktionen

viraler und zellulärer Proteine an RNA-Sekundärstrukturelemente gewährleistet

Bindung von viralem 3CD und dem zellulären

Poly (rC) Bindeprotein an „stem-loop“ D und B

Bindung von UTP und Anlagerung des Komplexes

an Membrangebundenes 3AB Protein

„Priming“ und proteolytische Abspaltung von

VPg aus 3AB durch die Protease 3C;Bindung von

3Dpol/VPg-primer an 3´-Ende; Erkennung des

3´“pseudoknot“ durch 3Dpol bedingt Spezifität

Elongation und (-) Strang Synthese


„Priming“ Reaktion am 3´-Ende der Poliovirus RNA

Proteolytische Abspaltung von

VpG durch virale 3C ProteaseBindung von 3AB an Membranen

(membranous web)

Uridylylierung von Tyr 3 des VPg-

Teils in 3AB durch 3Dpol

Rekrutierung des polyadenylierten

3´-Endes der Poliovirus RNA

Ausbildung eines „geprimten“

Ribonukleoproteinkomplexes

mit 2 Uriditylresten (VPgpUpU)Elongation des (-) Stranges

Synthese eines vollständigen

VPg gebundenen (-) Stranges


Translation viraler RNA in Proteine und

RNA-Synthese sind koordinierte Prozesse


Replikation und RNA-Synthese von (-) Strang RNA Viren

RNA von (-) Strang RNA Viren ist nicht infektiös- (-) Strang kann durch zelluläre Enzyme weder kopiert noch translatiert werden.

(-) Strang RNA Viren enthalten aktive RdRP im Viruspartikel

Genomreplikation erfolgt über ein komplettes (+) Strang Intermediat


Struktur und Genomorganisation des nicht segmentierten (-) Strang

Rhabdovirus: vesicular stomatitis virus (VSV)

leader© Flint et al. Principles of Virology

Replikationszyklus des nicht segmentierten (-) Strang

Rhabdovirus: vesicular stomatitis virus (VSV)

Bindung und Fusion(Freisetzung des helicalen

viralen Nukleokapsids)

Synthese von 5 mRNAs(ausgehend von leader-Sequenz)

Translation viraler mRNAs(an freien und ER-gebundenen Ribosomen)

Prozessierung und Lokalisierung des G-Proteins

(+) Strang Synthese(unter Beteiligung von N-, P- und L-Protein)

(-) Strang Synthese(unter Beteiligung von N-, P- und L-Protein)

Verpackung(unter Beteiligung von M-Protein)


Genomorganisation und mRNAs des vesicular stomatitis virus VSV

Genlokalisation korrespondiert zur mRNA Menge


Stop-Start Modell der VSV mRNA Synthese

Initiation der RNA Synthese am 3´-Ende des (-) Strang

Genoms von VSV (Primerunabhängig)

Synthese einer 47 nt langen „leader“-Sequenz;

Termination durch Ablösen der RNA von Polymerase

Reinitiation der RNA-Synthese am 3´-Ende des 1. Gens

(N) (nur ein Teil der Polymerasemoleküle reinitiieren)

Synthese der N mRNA und Termination in der

folgenden intergenischen Region.

Reinitiation der RNA-Synthese am 3´-Ende des 2. Gens (P)

(nur ein Teil der Polymerasemoleküle reinitiieren)


Funktion der VSV RNA-Polymerase an der Intergenregion

Komplementärer Einbau von 7A-Resten an der U7 Sequenz der IR

Verrutschen des neusynthetisierten Stranges am Template

„Stottern“ der viralen Polymerase

Termination nach Einbau von ca. 200 A Resten: Polyadenylierung

durch „stotternde“ Transkription einer U7 Sequenz

Reinitiation und „capping“ der nachfolgenden mRNA

(„capping“ erfolgt im Zytoplasma durch virale Polymerase

und ähnelt der cap Struktur zellulärer mRNAs)


Die Umschaltung von mRNA-Synthese zur Genomreplikation

Bei VSV wird durch das virale N-Protein reguliert

Niedrige N-Proteinkonzentration favorisiert mRNA Synthese

Hohe N-Proteinkonzentration favorisiert (+) Strang Synthese


Struktur und Genomorganisation des segmentierten (-) Strang

Orthomyxovirus: Influenza A


Replikationszyklus des segmentierten (-) Strang

Orthomyxovirus: Influenza ABindung über HA an Sialinsäure

(Endozytose)pH-induzierte Fusion

(Freisetzung der 8 Nukleokapsidsegmente)

Kerntransport des Nukleokapsids(NP/P/RNA-Komplex über NLS)

mRNA-Synthese/Export(cap-snatching)

mRNA-splicing(NS2/M2)

Synthese von HA, NA(am rER, Transport)

Synthese von PA, PB1, PB2(Kernimport)


Nukleäre RNA-Synthese bei dem Orthomyxovirus Influenza A

8 Segmente mit (-) Strang Polarität

als Nukleoproteinkomplex im Virion

Synthese gecappter und polyadenylierter

mRNA aus (-) Strang Segmenten Inhibierbar

durch -Amanitin und Actinomycin D !?

Genomisches RNA-Segment mit

5únd 3´konservierten Regionen

(vRNA)

? „Gecappte“ mRNA mit 10-13 zellulären

Nukteotiden und 3´-Poly A (mRNA)

Vollständige Kopie des (-) Segmentes

(cRNA)


Capping eukaryontischer mRNAs

Capping ist ein Prozess des Editings eukaryontischer mRNAs

Es involviert mehrere Transferasenkatalysierte Reaktionen

Es bildet sich u.a. ein 7N-methylguanosyl cap am 5Énde

Cap-Struktur stabilisiert mRNA

Gecappte mRNAs sind monocistronisch und polyadenyliert

Capping ist notwendige Voraussetzung für die Initiation der

Translation. Cap bindet an den eukariontischen Initiations-

Faktor eIF4F der die Bindung der RNA ans Ribosom vermittelt.


mRNA-Synthese bei Influenza A Virus: „cap snatching“

„Cap“-Raub im Nucleus der Wirtszelle

Hydrolyse einer beliebige zellulären mRNA

(„capping“ erfolgte durch zelluläre

Transferase) durch virales Protein

Initiation der (+) Strang Synthese durch

Einbau eines komplementären GTP an

vorletztem C im (-) Strang Segment:

Cap-primer-abhängige Initiation

Elongation durch sukkzessivem Einbau

komplementärer Nukleotide

CpG

G


Aktivierung des Influenza A Virus Polymerasekomplexes

3

51

42

1. Bindung der konservierten (-) Strang Segmentsequenz durch PB1 induziert Bindung gecappter zellullärer mRNA an PB2

2. Zur mRNA Synthese aktivierter Polymerasekomplex (Komplex ist inaktiv im freien Zustand)

3. Bindung des 3´-Endes an PB1 und Positionierung des hydrolysierten gecappten zellulären mRNA-Fragmentes zum 3Énde

4. Templatespezifische Elongation des gecappten primers bis zu einer U7 Sequenz vor dem gebundenen 5´-Ende.Die RNA wird dabei durch den Polymerasekomplex gefädelt (Polymerase ist Fixpunkt, RNA wandert).

5. RNA blockiert eigene Elongation und reiterativer Einbau von As führt zur Polyadenylierung und Termination.


Umschaltung von mRNA-Syntese auf Genomreplikation bei

Influenza A Virus durch Polymerasemodifikation

PB1 Polymerase wird durch die Bindung

von (-) Strang Bindung aktiviert.

Daraufhin bindet PB2 mRNA

PA hat hier keine Funktion.

In Gegenwart des viralen NP Proteins erfolgt Bindung an PA. Die

Polymerase PB1 wird primer-unabhängig und katalysiert eine

komplette cRNA-Synthese


Genetische Diversität bei Viren mit RNA-Genomen

Die fehlende Akkuratesse von RNA-Polymerasen bedingt den Fehleinbau von Nukleotiden

RNA-abhängige RNA Polymerasen haben keine „proof-reading“ Aktivität (keine Exonuklease).Dies führt zu einem Fehleinbau von jedem 1.000sten bis 10.000sten Nukleotid.Für die Translation hat dies gegebenenfalls Aminosäureaustausche und Funktionsverlustdes Proteins zur Folge.Bezüglich der Replikation bedeuted dies, das typischerweise jedes neue synthetisierte Virion 1-10Mutationen in seinem Genom aufweist.Eine Population von RNA-Viren ist immer heterogen und bildet somit eine „Quasispezies“

Die Segmentierung viraler Genome (Influenza A) ermöglicht Neukombinationen

Koinfektion einer Wirtszelle mit zwei verwandten segmentierten Viren erlaubt eine Neuver-Teilung der viralen Gensegmente.Bei Influenza A Viren führt dies regelmäßig zur neuen Virussubtypen mit antigener Diversität.

RNA-Rekombination ermöglicht den Austausch von viralen und zellulären Gensegmenten

Koinfektion einer Wirtszelle mit zwei verwandten Viren erlaubt Rekombination durch SprungDer Polymerase auf den anderen Strang (Template-abhängig).Rekombination viraler und zellulärer RNAs kann zur Integration neuer gene führen(z.B. Eibau zellulärer Gene der Zellzyklusregulation).

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