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Institut für Biophysikalische Chemie Universität Wien Wien, 23.02.2011 „Kupfer - ein Spurenelement mit vielseitiger biologischer Bedeutung“ ? Annette Rompel

„Kupfer - ein Spurenelement mit vielseitiger biologischer Bedeutung“ ?

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Page 1: „Kupfer - ein Spurenelement mit vielseitiger biologischer Bedeutung“ ?

Institut für Biophysikalische ChemieUniversität WienWien, 23.02.2011

„Kupfer - ein Spurenelement mit vielseitiger biologischer Bedeutung“ ?

AnnetteRompel

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Inhalt

Metalle in Lebensprozessen

Biologische Funktion von Kupfer

Korrespondenz von Eisen- und Kupferproteinen

Sauerstoffaktivierende Proteine

Tyrosinase

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Bioanorganische Chemie

Ein interdisziplinäres Forschungsgebiet

Vorführender
Präsentationsnotizen
Was war verantwortlich für die Erfolge der Bioanorganischen Chemie und welche Methoden tragen zu Ihrem Erfolg bei:� Biochemie: Fortschritte der Isolations- und Reinigungsmethoden (Chromatographie) Physik: apparative Nachweis- und Untersuchungsmethoden Biologie die verschiedenen Zweige der Biologie (Materialbereitstellung, gezielte gentechnologische Modifikation) Pharmazie: Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln und körpereigenen und körperfremden Substanzen Die Medizin: diagnostische Hilfsmittel, Tumortherapie Die Lebensmittelchemie, Toxikologie: Schadstoffpotential anorganischer Verbindungen, Konzentrationsprobleme
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Metalle in Lebensprozessen

Elemente, die für die Bioanorganische Chemie von Bedeutung sind, im Periodensystem

Natürlich vorkommende Elemente sind rot unterlegt,die als Sonden oder pharmazeutisch verwendeten grau.

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Elemente im menschlichen Körper

4550012600

700021001050

700175140105105

35

OCHNCaPSKClNaMg

SauerstoffKohlenstoffWasserstoffStickstoffCalciumPhosphorSchwefelKaliumChlorNatriumMagnesium

Masse (g)ElementsymbolElement

Durchschnittliche Werte (70 kg; nach Kieffer und Elmadfa, Leitzmann)

Vorführender
Präsentationsnotizen
Die Werte für Sauerstoff und Wasserstoff spiegeln den hohen Anteil an anorganischem Wasser wider. Erst an zweiter Stelle kommt der organische Kohlenstoff. Als erstes metallisches Element treffen wir an 5.ter Stelle das Calcium; es dient vorwiegend der Stabilisierung des Innenskelettes, Weiter weist die Tabellen noch relativ hohe Mengen von anorganischem Kalium, Natrium, Magnesium und Chlor auf (Mineralstoffe).
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Elemente im menschlichen Körper

a Nicht als essentiell bewertet. b Essentieller Charakter nicht eindeutig.

17. Jh.18961972

1931

1925

(1977)(1970)

4.22.31.41.10.80.30.20.140.110.100.080.070.030.03

FeZnSiRbFZrBrSrCuAlPbSbCdSn

EisenZinkSiliciumRubidiuma

FluorZirconiuma

Bromb

Strontiuma

KupferAluminiuma

Bleib

Antimona

Cadmiumb

Zinnb

Entdeckung als essentielles Element

Masse (g)Element-symbol

Element

Durchschnittliche Werte (70 kg; nach Kieffer und Elmadfa, Leitzmann)

Vorführender
Präsentationsnotizen
Es folgen mit Eisen und Zink, zwei weitere deutlich weniger häufige anorganische Elemente. Was sind Spurenelemente: in bezug auf den menschlichen Organismus werden solche Elemente als Spurenelement bezeichnet deren notwendiger täglicher Bedarf 25 mg nicht übersteigt. Als essentielle sollen nur solche Elemente bezeichnet werden, deren völliges Fehlen im Organismus schwere, irreversible Schäden hervorruft. Arsen, Blei und Cd sind als überwiegend toxisch bekannt - im Ultraspurenbereich (Nachweisgrenze!) werden jedoch wirksame positive Effekte diskutiert.
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“Anorganische” Elemente

1. Strukturfunktion

2. Ladungsträger für sehr schnelle Informationsübertragung

3. Auf- und Abbau organischer Verbindungen (Lewis-Säure/Base-gestützte Katalyse unter Verwendung von Metallionen)

4. Transport und Speicherung von Elektronen für Energiehaushalt

5. Aktivierung kleiner, hochsymmetrischer Moleküle

6. “Metallorganische” Reaktivität (Cobalamin-Coenzyme)

Biologische Funktionen anorganischer Elemente

Vorführender
Präsentationsnotizen
Aufbau fester Strukturen in Form von Innen- oder Außenskelett durch Biomineralisation.�Integrität von Zellwänden: Metallionen zur definierten Verknüpfung organischen Füllmaterials; DNA Zn2+ fixiert das Polyanion der DNA, welche die sonst dominierende elektrostatische Abstoßung zwischen den negativ geladenen Nukleotid-Phosphatgruppen vermindern; in diese Kategorie 1 gehören: Ca, Mg, Zn, Kationen; Anionen: P, O, C, S, Si und F. Einfache, kleine Ionen (Na, K, Ca) eignen sich als Ladungsträger für sehr schnelle Informationsübertragung; �Ionenpumpen: Aufrechterhalten von Konzentrationsgefällen,�elektrische Impulse in Nerven; Steuerung der Muskelkontraktion Der Auf- und Abbau organischer Verbindungen im Organismus erfordert häufig eine saure oder basische Katalyse; im Körper jedoch pH = 7. Eine Alternative zur Protonen- oder Hydroxid-Katalyse ist die Lewis-Säure/Lewis-Base-gestützte Katalyse unter Verwendung von Metallionen. In hydrolytisch arbeitenden Enzymen werde die relativ kleinen, zweifach positiv, geladenen Metallionen Mg2+ und Zn2+ gefunden. Transport von Elektronen: redoxaktive Metalle: Fe, Cu, Mn, Mo, W, V, Co, Ni Aufnahme, Transport und Speicherung (Fe, Cu) von molekularem Sauerstoff, oder auch die Erzeugung von Sauerstoff (Mn)�Fixierung von Stickstoff Nitrogenase�reversible Reduktion von CO2 zu Wasserstoff und Methan, Methanmonooxygenase Leichte Erzeugung von Radikalen: Cobalamin
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Funktionen von Metallen in Enzymen

Magnesium Struktur; Hydrolase; IsomeraseCobalt AlkylgruppenübertragungNickel Hydrogenase; HydrolaseMangan Photosynthese; KatalaseEisen Transport und Speicherung von O2;

Elektronenübertragung;N2-Fixierung

Kupfer Oxidase; Transport von O2; Elektronenübertragung

Zink Struktur; Hydrolase

Biologische Funktion ausgewählter Metall-Ionen

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Medizinischer Aspekt

Kupfer wird in jeder Zelle präzise reguliert, da überschüssiges Kupfer im Zytoplasma toxisch ist.

Die moderne westliche Diät deckt tendentiell den Kupferbedarf nicht.

Der Kupferstatus lässt sich nur an einer Leberbiopsie zuverlässig ablesen.

Dass Kupfer Alzheimer oder andere neurodegenerative Krankheiten bewirkt, ist unbewiesen.

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Korrespondenz von Eisen- und Kupferproteinen

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Sauerstoffaktivierende Proteine

Aktive Zentren von

Hämoglobin,

Hämocyanin

undHämerythrin

Lippard/Berg, S.4

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Sauerstoffaktivierende Proteine

Hämoglobin Hämocyanin

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Catecholamin-Metabolismus

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Catecholamin-Metabolismus

Tyrosinase (Cu)

Dopa-Decarboxylase

Dopamine β-Mono-oxygenase(Cu)

Noradrenalin N-Methyl-transferase

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Spezifität Tyrosinase/Catecholoxidase

O2+

Tyrosinase oderCatecholoxidase

+ 2H2O22

O2+OH

R

+ + H2

H. S. Mason, W. B. Fowlks, E. W. Peterson, J. Am. Chem. Soc. 1955, 77, 2914

Tyrosinase

O

OR

• Im Gegensatz zu Hämocyanin zeigen Tyrosinase and Catecholoxidase enzymatische Aktivität:Cresolase-Aktivität

Catecholase-Aktivität

2H+2HOH

R OH

OH

ROH

O

Vorführender
Präsentationsnotizen
Maso zeigte bereits, dass eins der Sauerstpoffe aus dem meolekularen Sauerstoff ins Substrate geht, während das zweite ins Wasser geht.
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Typ 3: Dinukleare Kupferzentren

Funktion: Aufnahme und Aktivierung von SauerstoffStruktur: verbrücktes Kupfer-DimerKenndaten: ESR silent; Charakt. Absorption nach Bindung von O2:

λ = 350 nm; λ = 600 nm (ε = 20000; 1000 M-1cm-1)

N

N

N

N

CuI

N

N N

N

N

N

CuI

N

N

(His)

(His)

(His)(His)

(His) (His)

H

H

HH

HH

+ O2

- O2CuII

OCuII

O

N

N

N

N

NN

N

N

N

NN(His)

(His)

(His)

(His)

(His)

(His)

H

H

H

H

H

H

N -

-

K. A. Magnus, H. Ton-That, J. E. Carpenter, Chem. Rev. 1994, 94, 727

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Tyrosinase aus Agaricus bisporus (abTyr)

Champignons (Agaricus bisporus) als ideale Quelle für Tyrosinase: Sie enthalten das Protein in hohen Mengen, was eine Grundvoraus-

setzung für die Isolierung ausreichender Mengen ist. Sie sind eine kostengünstige Quelle und die im Handel befindlichen

Sorten des “Weißen Champignons” zeigen ein hohe Homologie. Gegenüber den bekannten-Tyrosinase-produzierenden Bakterien haben

Sie als Eukaryonten den Vorteil der besseren Vergleichbarkeit mit anderen interessanten Tyrosinasen aus Pflanzen und Tieren.

Tyrosinase E.C. 1.14.18.1.

Agaricus bisporus:Tetramer H2L2

Vorführender
Präsentationsnotizen
R. M.; Mason, H. S. Methods Enzymol. 1970, XVIIA, 626. Jolley, R. L.; Evans, L. H.; Mason, H. S. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972, 46, 878. Jolley, R. L.; Evans, L. H.; Makino, N.; Mason, H. S. J. Biol. Chem. 1974, 249, 335. Strothkamp, K. G.; Jolley, R. L.; Mason, H. S. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976, 70, 519. Uiterkamp, A. J. M. S.; Evans, L. H.; Jolley, R. L.; Mason, H. S. Biochim. Biophys. Acta 1976, 453, 200. 1895; the cut flesh oh which turned red and then black on exposure to air.
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Motivation

Die Tyrosinase ist verantwortlich für die ungewünschteBräunungsreaktion in Obst und Gemüse, die durch Alterungoder Verletzung der Frucht stattfindet. Dies macht das Auffindeneines geeigneten Inhibitors äußerst wichtig.

Einige dermatologische Erkrankungen, wie Pigmentflecken undVertiligo, werden mit der Tyrosinase in Bezug gesetzt. Diekosmetische Industrie ist an der Depigmentation nach einemSonnenbrand interessiert.

Kürzlich wurde das Enzym Tyrosinase in Zusammenhang mitder Parkinson-Erkrankung und anderen neurodegenerativenErkrankungen gebracht. Die Erforschung dieser ist vonäußerster Wichtigkeit.

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Vorbereitung

Zuchtchampignon

Gefriertrocknung (Lyophile)

Zu feinem Pulver zermahlen

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Inhalt

+ PEG

Phasen-separatio

n(NH4)2SO4-

Fällung+ Triton X-114

Protein-Lösg. (latent)

Phasense-paration

Vorführender
Präsentationsnotizen
Die Champignons werden gewaschen, geschnitten, 2-3 Tage lyophilisiert und anschließend zu einen feinen Pulver gemixt. Das so erhaltene Ausgangsmaterial wird in einem Detergenz (Triton X-114) haltigen Phosphatpuffer aufgenommen. Nach einiger Zeit des Rührens unter Kühlung wird da Extrakt von unlöslichen Verbindungen und Feststoffen durch Zentrifugtaion befreit. Danach wird die Temperatur auf ca. 25°C erhöht um eine Phasentrennung zu erreichen. Die dichtere Farbstoff (Melanine, Tannine, kondensierte Polyphenole) haltige Detergenzphase wird durch Zentrifugation abgetrennt. Zur wässrigen Phase wird nun Polyethylenglycol (PEG) (ca. 20% w/w) und Ammoniumsulfat (ca. 1 M) zugegeben. Dabei bildet sich eine wässrige Farbstoff haltige PEG-Phase und ein wässrige Salz-Phase aus. Durch Zentrifugation können diese separiert werden. Dieser Vorgang wird mehrmals wiederholt bis die Lösung annähernd farblos erscheint. In weiterer Folge wird eine 80 % Ammoniumsulfatfällung durchgeführt und das Protein gefällt. Dieses kann resuspendiert werden und über säulenchromatographische Trennverfahren weiter auf gereinigt werden.
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Proteinreinigung: Übersicht

Reinigung mittels FPLC (Äkta Purifier)

Folgende Säulen wurden verwendet:

RRRR

Vorführender
Präsentationsnotizen
Da bei der Hydrophobe Interaktionschromatographie zu Anfangs im Hochsalzpuffer gearbeitet wird, eignet sich dies gut um das resuspendierte, noch Ammoniumsulfat haltige, Proteinextrakt aufzureinigen (kein Umpuffern nötig).    Anschließend ist die Anionen-Austauschchromatographie (Q-Sepharose) hinsichtlich der Abtrennung von Fremdproteinen die Methode der Wahl. Die Auftrennung über Hydroxylapatit erwies sich speziell für Tyrosinase aus Champignons als äußerst leistungsfähig. (zwei Isoformen)
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Proteinreinigung: IEX (Q-Sepharose)

0 100 200 300 400 500 6000

100

200

300

400

500

Absorption 280 nm [mAU] Cresolase-Aktivität [U/ml] Leitfähigkeit (f=0,5) [mS/cm] Gradient [% Puffer B]

Volumen [ml]

Abso

rptio

n [m

AU]

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

Gra

dien

t [%

], σ

[mS/

cm] (

*f)

Aktiv

ität [

U/m

l]

0102030405060708090100

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Aktivitätstest

O2+

Tyrosinase oderCatecholoxidase

+ 2H2O22O

OR

OH

ROH

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CHARAKTERISIERUNG: SEC (Size-Exclusion-Chromatography)

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CHARAKTERISIERUNG: SEC (Size-Exclusion-Chromatography)

Protein Elution [mL]CA 16,25 0,53OA 15,09 0,46AB 13,90 0,38AD 12,87 0,32$A 11,99 0,26AH 10,58 0,17TB 7,99 0,01

Kav

ve = Elutionsvolumen der Substanzvc = Gesamtvolumen der Säulev0 = Totvolumen

Vorführender
Präsentationsnotizen
Für die SEC wird eine Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) semipräperative (Vc = 24 ml)  Säule eingesetzt. Um mit dieser eine Massendeterminierung durchführen zu können muss diese kalibriert werden. Dazu wird das Totvolumen (V0) mit einem hochmolekularen Farbstoff (Blue Dextran 2000) bestimmt. Anschließen wird ein Proteinstandard, zusammengesetzt aus sieben Proteinen bekannter Massen im Bereich von 30- 600 kDa über die Säule aufgetrennt. Die Elutions-Volumina (Ve) der einzelnen Proteine wird bestimmt und mittels der angegebenen Gleichung wird das Kav (relativer Elutions-Parameter) berechnet. Dieser Wert wird dann gegen den Logarithmus der bekannten Proteinmassen aufgetragen und eine Regressionsgerade erstellt. Anschließend wird das Zielprotein (oder Gemisch) unbekannter Masse über die Säule aufgetrennt, das Elutionsvolumina bestimmt und über einsetzten in die Standardgeradengleichung die molekulare Masse berechnet.
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CHARAKTERISIERUNG: SEC (Size-Exclusion-Chromatography)

ve = Elutionsvolumen der Substanzvc = Gesamtvolumen der Säulev0 = Totvolumen

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CHARAKTERISIERUNG: SEC (Size-Exclusion-Chromatography

Iso1 Iso2

Elutionsvolumen 13,23 mL 13,18 mL

Die erhaltene Geradengleichung umformen und Messwerte des Proteins einsetzen =>

Iso-Form 1: 110 kDa113 kDaIso-Form 2:

Vorführender
Präsentationsnotizen
Die über SEC bestimmten Massen für die über Hydroxylapatit aufgespaltenen beiden Isoformen des Proteins ergaben 110 bzw. 113 kDa.
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SDS PAGE

abTyr Marker

94.0

43.0

30.0

20.1

14.4

~92~76~72~60

~46

~16~15

~4867.0

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UV/Vis Spektrum von abTyr

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UV/Vis Spektrum von abTyr + H2O2

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Katalase Aktivität von abTyr

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Aureusidinsynthase

• Synthese einer anderen Klasse von pflanzlichen Pigmenten, den Auronen beteiligt

• Flavonoiden• Chalkone• 39kDa

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Aureusidinsynthase

OH

OH

OH

H

HO

OH O OHO

OH O

OH

OH

OHO

OH O

OH

OHOH

+ H2O

+ H2O2´,3,4,4´,6´-Pentahydroxychalkon

Bracteatin

Aureusidin

Aureusidinsynthase

½ O2

O2

Literatur: T. Nakayama, K. Yonekura-Sakakibara, T. Sato, S. Kikuchi, Y. Fukui, M. Fukuchi-Mizutani, T. Ueda, M. Nakao, Y. Tanaka, T. Kusumi, T. Nishino; Science 2000, 290, 1163-1166

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Inhalt

Metalle in Lebensprozessen

Biologische Funktion von Kupfer

Korrespondenz on Eisen- und Kupferproteinen

Sauerstoffaktivierende Proteine

Tyrosinase

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Danksagung

Dr. Klaudia Büldt-KarentzopoulosDr. Thorsten BartuselDipl.-Chem. Christian MolitorMag. Stephan Mauracher

CNRS-DFG bilaterales Projekt: