Kursplan Praktikum PflanzenphysiologieBotanik/... · 6.1 Einfluss von Abscisinsäure (ABA) auf die Samenkeimung 6.2 Keimfähigkeitsprüfung (Schnelltest) 6.3 Phytochrom-Einfluss auf

Kursplan und Skript zum Praktikum Pflanzenphysiologie

Wintersemester 2020/21

Leitung: Dr. Alexandra CU Furch Betreuer: Dr. Ute Holtzegel; Dipl. Biol. Björn Grübler

Lehramt

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Seiten 1. EINFÜHRUNG IN ARBEITSTECHNIKEN UND VERSUCHE ZUM THEMA BEWEGUNGSPHYSIOLOGIE 04.11.2020 5 0. Allgemeine Einführung (Pipettieren, Wiegen, Zentrifugieren, Spektrometer, Mik-roskop) 1.1 Thermonastische/Photonastische Öffnungs- und Schließbewegungen 1.2 Negativer und positiver Gravitropismus 1.3 Phototropismus 2. WASSERHAUSHALT DER ZELLE 11.11.2020 8 2.1 Saugwirkung eines Zweiges 2.2 Transpiration 2.3 Guttation 2.4 Einfluss von Streusalz auf die Wasseraufnahme 2.5 Plasmolyse 3. PHYSIKOCHEMIE DER ZELLE 18.11.2020 12 3.1 Quellungsdruck 3.2 Traubesche Zelle als Modell einer Pflanzenzelle 3.3 Abhängigkeit der Quellung von pH-Wert und Salzkonzentration 4. WACHSTUM UND ENTWICKLUNG 25.11.2020 16 4.1 Krümmung der Sproßachse und Bildung von Adventivwurzeln und Verhinderung des Blattabfalls 4.2 Einfluss von Licht auf die Entwicklung von Keimlingen 4.3 Zwergmutanten der Erbse und ihre Normalisierung durch Gibberellinsäure 4.4 Einfluss von Antibiotika auf Keimung und Wachstum 5. MINERALSTOFFWECHSEL 02.12.2020 20 5.1 Mangelkulturen als Beispiel für Biotests 5.2 Nachweis von Nitrat 5.3 Nachweis von Eisen 5.4 4-Farbversuch (Wassertransport in der Pflanze) 6. KEIMUNG 09.12.2020 25 6.1 Einfluss von Abscisinsäure (ABA) auf die Samenkeimung 6.2 Keimfähigkeitsprüfung (Schnelltest) 6.3 Einfluss des Umweltfaktors Wasser auf die Entwicklung von Keimpflanzen 6.4 Einfluss endogener Abscisinsäure auf Keimung

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6.5 Chemiewaffen im Pflanzenreich (Allelopathie)? 7. BODEN UND PFLANZE 16.12.2020 29 7.1 Mykorrhiza 7.2 Bestimmung der Bodenazidität 7.3 Bestimmung des Kalkgehaltes 7.4 Adsorption saurer und basischer Farbstoffe durch Bodenkolloide 8. CHLOROPLASTENPIGMENTE 06.01.2021 33 8.1 Vorversuch: Extraktion der Pigmente 8.2 Bestimmung des Chlorophyllgehaltes 8.3 Die Wirkung eines Herbizids - SAN 9789 (Norflurazon) 8.4 Dünnschichtchromatographische Trennung von Chloroplastenpigmenten 8.5 Nachweis von Sekundärcarotinoiden 9. PHOTOSYNTHESE 13.01.2021 38 9.1 Nachweis der O2-Abgabe (Glimmspanversuch) 9.2 C3- und C4-Pflanzen 9.3 Regulation der Stomata 9.4 Nachweis von Assimilationsstärke 10. ENZYMOLOGIE 20.01.2021 42 10.1 Meerrettich Peroxidase 10.2 Nachweis von α- und ß-Amylase-Aktivität 10.3 In-vivo-Bestimmung der Nitratreduktase-Aktivität 10.4 Kartoffel-Katalase-Versuch 10.5 Urease aus Sojabohnen 11. ATMUNG UND GÄRUNG 27.01.2021 52 11.1 Entwicklung von CO2 bei der Atmung und Temperaturabhängigkeit der Atmung 11.2 Vergärung verschiedener Kohlenhydrate 11.3 Baumannscher Versuch (Eisen-katalysierte Elektronenübertragung) 12. SÄUREN, SEK. PFLANZENSTOFFE + MOLEKULARBIOLOGIE 03.02.2021 54 12.1 Bestimmung der Azidität in Wein 12.2 Nachweis von Ascorbinsäure in pflanzlichen Produkten 12.3 Nachweis von Aesculin und Fraxin 12.4 DNA Isolation 13. Abschlussklausur am 24.02.2021 14:00Uhr Gr. Hörsaal Dornburgerstr. 159

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14. Nachklausur am 24.03.2021 16:00Uhr Gr. Hörsaal Dornburgerstr. 159 Köhler’sche Beleuchtung 58 Zusatzblatt zum Eisennachweis 59 Liste einiger im Pflanzenphysiologischen Praktikum verwendeter Pflanzen 60 65 Periodensystem 62 Konzentrationsberechnung 63

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Allgemeine Literatur-Hinweise KUTSCHERA, U.: Grundpraktikum zur Pflanzenphysiologie, Quelle & Meyer, Wiesbaden, 1998. *) KUTSCHERA, U.: Prinzipien der Pflanzenphysiologie. 2. Auflage. Spektrum Akademi-scher Verlag, Heidelberg 2002. NULTSCH, W.: Allgemeine Botanik. 11. Aufl., Thieme, Stuttgart 2001. *) SCHOPFER, P und A. BRENNICKE: Lehrbuch der Pflanzenphysiologie. 7. Aufl., Spektrum 2010. RICHTER, S.: Stoffwechselphysiologie der Pflanzen. 6. Aufl., Thieme, Stuttgart 1998. SCHOPFER, P.: Experimentelle Pflanzenphysiologie. Einführung in die Methoden. Band I. Springer-Verlag, Berlin 1986.

*SCHOPFER, P.: Experimentelle Pflanzenphysiologie. Einführung in die Anwendung. Band

II. Springer-Verlag, Berlin 1989. STRASBURGER. Lehrbuch der Botanik. 35. Aufl., Neubearb. P. SITTE, E. W. WEILER, J. W. KADEREIT, A. BRESINSKY und C. KÖRNER. Spektrum Akademischer Verlag 2002. Lincoln TAIZ, Eduardo ZEIGER. Plant Physiology. 4th Edition. Spektrum Akademischer Verlag, 2007. *) Besonders zu empfehlen

http://www.amazon.de/exec/obidos/ASIN/0878938230/qid=1090056981/sr=1-1/ref=sr_1_10_1/028-7955766-8425319

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1. KURS: BEWEGUNG 04.11.2020

0. Allgemeine Einführung (Pipettieren, Wiegen, Zentrifugieren, Spektrometer, Mikro-skop) 1.1 Thermonastische/ Photonastische Öffnungs- und Schließbewegungen (Demonstrationsversuch) 1.2 Negativer und positiver Gravitropismus 1.3 Phototropismus --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

0. Allgemeine Einführung

Mit einem „Stationsbetrieb“ möchten wir Ihnen eine Einführung in unerlässliche Techni-ken und Geräte der experimentellen Botanik ermöglichen. Es geht um den Umgang mit Waagen, Pipetten, Zentrifugen und verschiedenen Spektrophotometern. Zur Übung sollen Sie eine Standardkurve erstellen. Dazu wird eine Protein Lösung mit unbekannter Kon-zentration benötigt (Betreuer). Als Null-Probe dient Wasser. Außerdem werden wir Ihnen den Umgang mit dem Mikroskop näherbringen.

Versuchszeit: ca. 1.5 h

1.1 Thermonastische/ Photonastische Öffnungs- und Schließbewegungen

Allgemeines: Bei diesem Versuch handelt es sich um einen Demonstrationsversuch, der von einem Betreuer vorgeführt wird. Bitte protokollieren Sie diesen Versuch. Das Anlie-gen besteht darin, Temperatur als Reiz für Nastien zu erkennen. Bei vielen Blütenpflanzen beobachtet man für das Wachstum der Innen- und Außenseiten der Blütenblätter unter-schiedliche Temperaturoptima. Daher lösen Temperaturveränderungen oft thermonasti-sche Bewegungen aus. Pflanzen können teilweise auf sehr geringe Temperaturdifferenzen reagieren, die Perigonblätter von Crocus z.B. noch auf 0,2oC.

Literatur: Schopfer&Brennicke oder Kutschera (Prinzipien)

Materialien: Gänseblümchen (Bellis perennis), Mohn (Papaver

spec.) oder Wiesen-Pippau (Crepis biennis) sind nahezu ideale Objek-te für diesen Versuch. Die Blüten sollten geschlossen sein und dazu vorher in kaltem Wasser oder Kühlschrank aufbewahrt werden.

Chemikalien: keine

Geräte: 1. Zwei Bechergläser als Blumenvasen. 2. Kühlschrank.

Fertig hergestellte Lösungen: Leitungswasser mit Kühlschrank-temperatur

Durchführung: Die Pflanzen mit geschlossenen Blüten werden ins Praktikum (Zimmertemperatur) ge-bracht. Es ist darauf zu achten, dass das Wasser im Becherglas dann ebenfalls Raumtem-peratur hat. Sind die Blüten bereits geöffnet, so kann man sie bei 4oC in einen Kühlschrank stellen. Experimentell einfacher ist es, sie in ein Becherglas mit gekühltem Wasser zu stel-len. Es wird das Öffnen oder Schließen der Blüten beobachtet.

Versuchszeit: ca. 5 min zum Ansetzen, Ergebnis im Verlauf der Praktikumszeit.

Auswertung: Verlauf und zeitliche Dauer der Öffnungs- bzw. Schließbewegungen von Blü-tenblättern sind zu beobachten und zu protokollieren.

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1.2 Negativer und positiver Gravitropismus

Allgemeines: Unter Gravitropismus (=Geotropismus) versteht man die räumliche Ausrich-tung/Orientierung verschiedener Pflanzenorgane in Bezug auf den Schwerereiz der Erdan-ziehung (Gravitationsreiz). So zeigen Wurzeln vom Zeitpunkt der Keimung an das Bestre-ben, abwärts (positiver Gravitropismus = in Richtung der Schwerkraft), Hauptsprossachse und Koleoptilen das Bestreben, aufwärts (negativer Gravitropismus = entgegen Schwer-kraft) zu wachsen. Der Nachweis, dass es sich hierbei um die Reaktion auf einen Schwere-reiz handelt, kann mit nachfolgend beschriebenen Versuch erbracht werden. Zudem kön-nen Informationen über die Wachstumsgeschwindigkeit der Wurzel erhalten werden.

Literatur: Kutschera (Prinzipien), Kutschera (Grundpraktikum), aber auch Schopfer & Brennicke.

Materialien: Keimlinge von Zea mays Chemikalien: keine

Geräte: Plastikschale mit Deckel, Millimeterfolie,

doppelseitiges Klebeband, Binokular, Rasierklinge, Skalpell, Nadel

Fertig angesetzte Lösungen: keine

Durchführung: Auf die Außenseite einer durchsichtigen Plastikschale wird Millimeterfolie geklebt. 8 Keimlinge von Zea mays werden entnommen. Von der Hälfte wird unter dem Binokular vorsichtig die Wurzelhaube (Kalyptra) mittels eines Skalpells oder einer Rasierklinge ent-fernt. In eine Schale, deren Boden zuvor mit feuchtem Fließpapier ausgelegt wurde, wer-den 2 Keimlinge mit Kalyptra waagerecht, 2 Keimlinge senkrecht mit Klebeband an der Innenseite der Schale befestigt. Die andere Schale erhält die gleiche Ausstattung, aller-dings alle Keimlinge ohne Kalyptra. Die an der Plastikschaleninnenwand vorab befestigten Blöckchen können jeweils als Stütze für die Wurzeln der waagerecht befestigten Keimlin-ge dienen. Die Schale wird mit dem Deckel abgedichtet.

Versuchszeit: ca. 30 min

Auswertung: Protokollieren Sie das Wachstumsverhalten der Wurzel mit und ohne Kalyp-tra. Skizzieren Sie das Ergebnis nach einer Woche (11.11.) und beschreiben Sie die Ergeb-nisse. Bestimmen Sie die Längenwachstumsgeschwindigkeit von Wurzel und Koleoptile.

1.3 Phototropismus

Allgemeines: Das einseitig gerichtete Wachstum unter dem Einfluss von Licht beruht letzt-lich auf dem polaren Auxintransport.

Literatur: Besonders gut verständlich in Kutschera (Prinzipien), aber auch Schopfer & Brennicke.

Materialien: Pro Gruppe 2 - 3 Sonnenblumen-

keimlinge (oder Erbse), ca. eine Woche nach Aussaat in Vermiculit. 250 ml-Plastikbecher pro Gruppe

Chemikalien: keine

Geräte: „Phototropismuskäfig“ – muss meist neu aus einem Karton konstruiert werden. Es wird also ein Karton benötigt (Versuchsbetreuer).


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Durchführung: Ein Keimling wird in ein Plastikbecherglas mit Vermiculit gesetzt. Das Vermiculit wird gut gewässert (nicht mehr als ein Drittel stehendes Wasser). Das Becherglas wird in den „Pho-totropismuskäfig“ gesetzt und so geschlossen, dass Licht nur einseitig einfallen kann.


Auswertung: Nach einer Woche (11.11.) ist das Ergebnis zu skizzieren und zu protokollie-ren.

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2. KURS: WASSERHAUSHALT DER ZELLE 11.11.2020

2.1 Saugwirkung eines Zweiges 2.2 Transpiration 2.3 Guttation (Demonstrationsversuch) 2.4 Einfluss von Streusalz auf die Wasseraufnahme 2.5 Plasmolyse --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2.1 Saugwirkung eines Zweiges

Allgemein: Bitte nutzen Sie die Stichworte Transpiration, Einflüsse auf die Transpiration

und physikalische Aspekte der Transpiration zu Ihrer Vorbereitung.

Materialien: Zweige der Eibe (Taxus). Auch andere Zweige sind möglich.

Chemikalien: keine

Geräte: - kleines Becherglas - Fotoschale oder Eimer - dünner Schlauch - 1 ml Messpipette - Stativ - Stativmaterial - Gartenschere

Fertig angesetzte Lösungen: Tinte (1,5ml) in Glycerol (100ml) + Wasser (50ml)

Durchführung:

Vor Versuchsbeginn wird der Taxus-Zweig unter Wasser schräg abgeschnitten und ebenso unter Wasser durch einen wassergefüllten Schlauch mit einer wassergefüllten 1 ml Glaspipette verbunden. Dabei ist darauf zu achten, dass diese Verbindung luftblasenfrei ist! Die Pipette wird mit ihrem spitzen Ende in die gefärbte Tintenlösung gebracht. Dieses Konstrukt aus Zweig, Schlauch und Pipette wird über Stativmaterial an einem Stativ befes-tigt. Nach ca. 15 min nehmen Sie nun etwa 10 Minuten lang den Wasseranstieg anhand des Standes der Farblösung in der Pipette wahr. Notieren Sie in geeigneten Zeitintervallen (Sekunden- bzw. Minutenbereich) den Anstieg.


Auswertung: Stellen sie in einem Zeit-Volumen-Diagrammen den Wasseranstieg dar. Die Transpirationsrate ist durch eine Regressionsrechnung (lineare Regression) zu ermitteln.

Hinweis: Die nichtwässrige Farbstofflösung dient als Ersatz für Quecksilber.

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2.2 Transpiration

Versuchsteil A: Transpiration

Materialien: Topfpflanzen von Solanum lycopersi-

cum (gut gegossen und für mehrere Tage trocken gestellt)

Chemikalien: keine

Geräte: - Waage - kl. Plastiktüten - Lampe


Durchführung:

Eine trocken gestellt und eine gut gegossene Topfpflanze mit etwa gleich großer Blattflä-che werden ausgewählt. Die Töpfe werden mit Plastiktüten umhüllt, dann werden die Pflanzen gewogen und ihr Gewicht wird notiert. Für zwei Stunden werden die Pflanzen im Kursraum ans Fenster oder ins Gewächshaus (Licht!) gestellt, anschließend wird erneut das Gewicht der Pflanze gemessen und protokolliert.

Auswertung:

a) Protokollieren Sie die Versuchsergebnisse in der Tabelle

Trocken gestellte Pflanze Gut gewässerte Pflanze

Gewicht zu Kursbeginn

Gewicht nach 2h

Gewichtsdifferenz

Differenz MW

b) Stellen Sie fest, ob sich das Gewicht der untersuchten Pflanzen während des Ver-suchs geändert hat. Erklären Sie die Ergebnisse. Weshalb wurden die Töpfe der Pflanze während dieses Versuches mit Plastiktüten umhüllt? Welche anderen Pro-zesse in der Pflanze könnten ihr Gewicht ebenfalls beeinflusst und die Versuchser-gebnisse ggf. verfälscht haben? Schätzen Sie ab, wie viele ml Wasser eine Toma-tenpflanze pro Stunde durch Transpiration verliert.

Versuchszeit: ca. 10 min.

2.3 Guttation (Demonstrationsversuch)

Literatur: Kutschera, Schopfer

Materialien: Pflanzen (ca. 15 – 20 cm groß) von

Hordeum vulgare und Zea mays Chemikalien: -

Geräte: - Glasglocke (großes Becherglas zum Über-

stülpen) - Filterpapier

Fertig angesetzte Lösungen: -

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Durchführung:

Beobachten Sie die Guttation stark gewässerter Keimpflanzen, welche sich in einer was-serdampfgesättigten Atmosphäre in einer Glasglocke auf Filterpapier befinden.

Auswertung:

Beschreiben, skizzieren und diskutieren Sie ihre Beobachtungen.

Versuchszeit: ca. 5 min, Ergebnis im Verlauf der Praktikumszeit.

2.4 Einfluss von Streusalz auf die Wasseraufnahme

Allgemeines:

- Die Auswertung muss auch am 2. Tag nach Versuchansatz erfolgen!

Literatur: Tafelwerk

Materialien: Blätter vom Alpenveilchen Chemikalien: - Rapsöl

Geräte: - Reagenzglasständer - Reagenzgläser graduiert - Tropfpipette - Folienstift - Messer / Rasierklinge - Lineal

Fertig angesetzte Lösungen: - 10 %-ige NaCl-Stammlösung

Durchführung:

Vorbereitend wird eine Konzentrationsreihe hergestellt, dies kann von einer Gruppe für alle Gruppen durchgeführt werden. Herzustellen sind NaCl-Konzentrationsstufen von 0 %, 1 %, 2.5 %, 5 % und 10 %; V=10ml. Messen Sie den Innendurchmesser der von Ihnen verwendeten Reagenzgläser aus. Je eine Konzentrationsstufe ist in je ein Reagenzglas zu geben. Beschriften Sie die Reaktionsgefä-ße. In jedes Gefäß wird je ein Blatt mit einer Blattstiellänge von etwa 5 cm gestellt. Su-chen Sie Blätter mit etwa gleicher Größe aus und achten Sie darauf, dass die Blätter sofort nach dem Schnitt in die Lösung gebracht werden. Der Blattstiel sollte etwa 3 cm in die Lösung ragen. Überschichten Sie nun die Lösung, in der das Blatt steht mittels einer Tropfpipette vorsichtig mit etwa 0,5 ml Paraffinöl oder Rapsöl. Dies soll eine Verdunstung der NaCl-Lösung während des Versuchszeitraumes verhindern. Der Stand der NaCl-Lösung wird mit einem Folienstift am Glas markiert und notiert.

Auswertung:

Ermitteln sie nach 2 (13.11.) und nach 7 Tagen (18.11.) die aufgenommene Wassermenge in Milliliter. Messen sie dazu die Verringerung des Lösungsstandes und ermitteln Sie das Volumen nach der Volumenformel für Zylinder. Skizzieren, beschreiben und bewerten Sie das äußere Erscheinungsbild der Blätter.

Versuchszeit: ca. 1h, Ergebnis nach 2 Tagen und einer Woche.

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2.5 Plasmolyse

Allgemeines:

- Plasmolyse ist der durch Osmose verursachte Wasserentzug aus dem Protop-lasten einer Pflanzenzelle.

Literatur: Wanner 2004 Mikrokopisch-Botanisches Praktikum

Materialien: Rote Zwiebel von Allium cepa Chemikalien:

Geräte: - Rasierklinge - Objektträger/Deckgläschen - Pipette - Filterpapier - Mikroskop

Fertig angesetzte Lösungen: - 1M Lösung KNO3 - 0,7M Lösung Ca(NO3)2 x 4H2O

Durchführung:

Zur Herstellung eines Flächenschnittes schneidet man mit einer Rasierklinge parallel zur Oberfläche in möglichst gleichbleibender Tiefe durch das Gewebe der roten Unterseite der Speicherblätter von Allium cepa. Der Schnitt darf nicht zu dick sein, da anhaftende Reste des Mesophylls die Beobachtungen stören, aber auch nicht zu dünn, da sonst die Epidermiszellen verletzt werden und der Zellsaft ausläuft. In diesem Falle erscheint der Schnitt nicht mehr rot, sondern farblos. Das abgelöste Epidermisstück wird mit der Schnittfläche nach unten auf einen Objektträger mit einem Tropfen Wasser übertragen und mit einem Deckglas bedeckt. Zunächst wird in Wasser beobachtet. Dann saugt man das jeweilige Plasmolytikum durch das Präparat und lässt die Lösung etwa 5-20 Minuten einwirken. Zur Erzielung der Deplasmolyse wiederholt man diese Manipulation mit rei-nem Wasser, bis das Plasmolytikum restlos entfernt ist. Die Ablösung des Protoplasten erfolgt bei Anwendung beider Plasmolytika rasch und unregelmäßig, so dass in beiden Fällen zunächst das Bild einer Konkavplasmolyse entsteht. In der Kaliumnitratlösung run-det sich der Protoplast allmählich ab, so dass schließlich das Bild einer Konvexplasmolyse entsteht. Die Ursache für das Eintreten der Konvex- bzw. Konkavplasmolyse ist die ver-schiedenartige Wirkung der beiden Kationen auf den Quellungszustand des Plasmas. Die entquellend wirkenden Calcium-Ionen verfestigen das Plasma, die Kalium-Ionen hingegen verstärken den Quellungsgrad, und in dem Bestreben, die kleinstmögliche Oberfläche einzunehmen, rundet sich der Protoplast ab.

Auswertung:

Dokumentieren Sie die verschiedenen Formen der Plasmolyse und diskutieren Sie die Ur-sachen.

Versuchszeit: ca. 1h, Ergebnis sofort.

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3. KURS: PHYSIKOCHEMIE DER ZELLE 18.11.2019

3.1 Quellungsdruck 3.2 Traube‘sche Zelle als Modell einer Pflanzenzelle (Demoversuch) 3.3 Abhängigkeit der Quellung von pH-Wert und Salzkonzentration --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

3.1 Quellungsdruck

Allgemeines: Die Quellung ist ein rein physikalischer Prozess, bei dem durch Flüssigkeits- oder Dampfaufnahme eine Volumenvergrößerung des Quellkörpers erfolgt. Die Was-seraufnahme (z.B. während der Samenkeimung) erfolgt bis zur Sättigung des Wasserpo-tentials.

Literatur: Strasburger; Schopfer & Brennicke, Richter.

Materialien: - Erbsensamen, Weizenkaryopsen - Filterpapier - Petrischalen - Trichter

Chemikalien: - Gips

Geräte: Gipsbecher (Gummi), Spachtel Fertig angesetzte Lösungen: -

Durchführung: Zwei Trichter werden mit Filterpapier ausgelegt und zur Hälfte mit Gipsbrei beschickt. Bitte seien Sie zurückhaltend beim Anrühren, da der Brei schnell aushärten kann. Nach-dem man die Oberfläche mit reichlich trockenen Erbsensamen bzw. Weizenkaryopsen bestreut hat (die Ränder vermeiden), werden die Trichter mit Gipsbrei vollständig aufge-füllt und angepresst. Nach dem Erstarren (trocknen) werden die Gipskegel heraus-genommen und in eine Schale (Petrischale) mit genügend Wasser gestellt (am Ende des Kurses). Der Druck der quellenden Samen bzw. Früchte zersprengt die Kegel.

Versuchsdauer: etwa 10 min.

Auswertung: Diskussion der Abhängigkeit des Quellungsgrades bzw. Quellungsdrucks vom Proteingehalt des Quellkörpers. Die Auswertung muss nach etwa 2 Tagen erfolgen (20.11.)!

3.2 Traubesche Zelle als Modell einer Pflanzenzelle

Allgemeines: In diesem Versuch ist die Ausbildung einer „TRAUBEschen Zelle“ zu beobach-ten und zu diskutieren.

Materialien: - Erlenmeyerkolben (100 ml oder 250 ml)

Chemikalien: - Kaliumhexacyanoferrat(II), grobkristallin

Geräte: keine Fertig angesetzte Lösungen: - Kupfersulfat (4 % m/v)

Durchführung: Ein größeres Kristall Kaliumhexacyanoferrat (II): K4 [Fe(CN)6] wird einer 4 %igen CuSO4-Lösung zugesetzt. Das osmotisch bedingte "Wachstum" der semipermeablen Nieder-schlagsmembran ist etwa 30 Minuten zu verfolgen.

Eine Sonderaufgabe für eine interessierte Gruppe:

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Vergleichen Sie den Reaktionsablauf des oben beschriebenen Versuches mit einer Art von Umkehr. Stellen Sie eine 4 %-ige Lösung von Kaliumhexacyanoferrat (II) her und legen Sie einen Kupfersulfat-Kristall in diese Lösung.

Versuchsdauer: 30 min

Auswertung: Kurze vergleichende Betrachtung des benutzten Modells mit der intakten Pflanzenzelle und mit der Pfefferschen Zelle (Unterschiede und Gemeinsamkeiten).

3.3 Abhängigkeit der Quellung von pH-Wert und Salzkonzentration

Literaturhinweis: (Überprüft am 17.09.2015) www.herbstreith-fox.de/fileadmin/tmpl/pdf/broschueren/Naturprodukt_deutsch.pdf

Allgemeines: Quellkörper, wie z.B. Proteine, besitzen aufgrund ihrer chemischen Struktur Partialladungen, die auf die Dissoziation von funktionellen Gruppen zurückgehen. Die Ge-samtladung eines Quellkörpers wird dabei von den jeweiligen überwiegenden Partialla-dungen bestimmt. Für die Quellung spielen intern einander kompensierende Partialla-dungen keine Rolle; Hydrathüllen werden nur um überschüssige Ladungen gebildet. Das Dissoziationsverhalten funktioneller Gruppen hängt in entscheidendem Maße vom pH-Wert des umgebenden Mediums ab. So können Proteine in Abhängigkeit vom pH-Wert des Mediums in drei Ladungszuständen vorliegen:

Sauer: -NH3+, -COOH, Kation

Isoelektrischer Punkt: -NH3+, -COO-, Zwitterion

Basisch: -NH2, -COO-, Anion

Die Dissoziation der –COOH-Gruppen wird mit steigender Azidität der Lösung zurückge-drängt, die Ausbildung der NH3+-Gruppen hingegen gefördert. Bei steigender Basizität tritt der umgekehrte Vorgang ein. Zwischen den Extremzuständen liegt ein für jedes Pro-tein charakteristischer, enger Bereich, in dem beide Gruppen gleichzeitig dissoziiert sind und sich gegenseitig die Waage halten. Der pH-Wert, bei dem dieser Zustand erreicht wird und das Molekül als elektroneutrales „Zwitterion“ vorliegt, wird als isoelektrischer Punkt (IEP) des Proteins bezeichnet. Da sowohl NH3

+- als auch COO--Gruppen Wasserdipole anlagern können, quellen die Pro-teine sowohl im sauren als auch im basischen Milieu, nur dann kann ein Protein aktiv sein. Am isoelektrischen Punkt ist die Quellung eines Proteins am geringsten.

Gegenüber reinem Wasser fällt die Quellung in Elektrolytlösung stets schwächer aus; man spricht von einer relativ (bezogen aus Aqua dest.) entquellenden Wirkung. In welchem Umfang es durch Elektrolytlösungen zum Entquellen kommt, hängt von mehreren Fakto-ren ab: - von der Nettoladung des Quellkörpers - von der Größe und Ladung der Ionen und deren Möglichkeit zum Eintritt in den Quellkörper.

Werden Ionen durch eine semipermeable Membran von einem Eintritt in den Quellkörper abgehalten, spricht man von einem indirekten Ioneneffekt. Hierbei kommt es zur Konkur-renz zwischen Kolloid und den in der Außenlösung vorliegenden Ionen um hydratisieren-des Wasser. Bei Abwesenheit einer semipermeablen Membran können überschüssige Partialladungen im Kolloid und Ionen mit entgegengesetzter Ladung direkt in Wechselwirkung treten. Man spricht von einem direkten Ioneneffekt. Dabei verliert das Ion bzw. die Festladung einen

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Teil der Hydrathülle. Der Verlust wird umso geringer ausfallen, je schwächer die elektri-schen Wechselwirkungen sind. Die Größe der Hydrathülle der in der Lösung befindlichen Ionen entscheidet, wie stark ein Kolloid hydratisiert wird bzw. wie hoch die Konkurrenz um freies Wasser bei nicht per-meierenden Ionen ausfällt. Die Größe der Hydrathülle wird durch die Ladungsdichte an der Oberfläche des Ions bestimmt: Bei gleicher Wertigkeit hat ein kleineres Ion gegenüber einem größeren stets eine höhere Ladungsdichte und damit eine größere Hydrathülle. Die Proteine des Protoplasmas besitzen bei den in den Zellen vorliegenden pH-Werten einen Überschuss an negativen Ladungen, deren Anzahl den Hydratationsgrad des Plas-mas bestimmt. Kationen wirken entladend und damit entquellend. Besondere Bedeutung für den Quellungszustand des Plasmas haben K+ und Ca2+. Wird ein adsorbiertes K+ gegen Ca2+ ausgetauscht, nimmt die Quellung des Plasmas ab. Umgekehrt bewirkt ein Austausch von K+ gegen Ca2+ eine Zunahme des Quellungszustandes, da Ca2+ aufgrund seiner größe-ren Ladung stärker entquellend wirkt als K+ (K+/Ca2+-Antagonismus). Voraussetzung für die Demonstration dieses Effektes ist die Verwendung von isotonischen K- und Ca-Lösungen, daher wird in dem Versuch KNO3 als 1 M Lösung, Ca(NO3)2 aber nur in einer Konzentration von 0,7 M angeboten. Begründen Sie diese Konzentrationen!

Literatur: Schopfer/Brennike. Diesen Versuch haben wir aus dem Pflanzenphysiologischen Praktikum an der Universität Halle entnommen. Die ursprüngliche Idee soll aus der „Sendung mit der Maus“ stammen.

Materialien: - Quellkörper aus Gelatine - 100 ml-Erlenmeyerkolben - Pipetten - Pinzetten - Zellstoff

Chemikalien: -

Geräte: - pH-Meter (Der Versuchsbetreuer muss zuvor das pH-Meter mit Eichpuffern eingestellt haben) - Waage

Fertig angesetzte Lösungen: 0,1 M Natriumacetat (2 L) 0,1 M Essigsäure (1 L) 0,7 M Ca(NO3)2 1 M KNO3 Die Herstellung der Pufferlösungen sollte durch die Studenten erfolgen.

Durchführung: a) Abhängigkeit der Quellung vom pH-Wert

In Bechergläsern werden Lösungen von jeweils 50 ml verschiedener pH-Stufen unter Ver-wendung von Acetatpuffern hergestellt. Dazu sind für jede pH-Stufe 0,1 M Essigsäure und 0,1 M Natriumacetatlösung entsprechend den Angaben der nachstehenden Tabelle zu mischen: pH-Wert 0,1 M Essigsäure (ml) 0,1 M Na-Acetat (ml)

3,8 44,5 5,5

4,2 33,5 16,5

4,7 25,0 25,0

5,2 10,0 40,0

5,6 5,5 44,5

Mit Hilfe eines pH-Meters ist der aktuelle pH-Wert zu kontrollieren und gegebenenfalls durch Zugabe von NaOH bzw. Essigsäure zu korrigieren.

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Für jede pH-Stufe 5 Quellkörper abwiegen und in die Lösung geben. Nach 1 - 2 Stunden die Quellkörper den Lösungen entnehmen, sorgfältig trocken tupfen und erneut wiegen.

Auswertung: Aus den Ausgangs- und Endgewichten ist die prozentuale Gewichtszunahme der Quellkörper in jeder Lösung zu ermitteln. Stellen Sie die Ergebnisse tabellarisch und grafisch dar. Der pH-Wert, bei dem die geringste Quellung erfolgt, gibt den isoelektrischen Punkt an. Geben Sie eine Definition für diesen Begriff.

b) Wirkung von K+ und Ca2+ auf die Quellung Je ein Becherglas mit 50 ml 1 M KNO3- bzw. 0.7 M Ca(NO3)2-Lösung bzw. Reinstwasser füllen, dreimal 5 Quellkörper abwiegen und in die Lösungen geben. Nach 1 - 2 Stunden die Quellkörper den Lösungen entnehmen, sorgfältig trocken tupfen und erneut wiegen.

Auswertung: Aus den Ausgangs- und Endgewichten ist die prozentuale Gewichtszunahme der Quellkörper in jeder Lösung zu ermitteln. Um die Quellung in den Salzlösungen mit der in Reinstwasser vergleichen zu können, wird die Quellung in Reinstwasser = 100 % gesetzt und die Quellung in den Salzlösungen darauf bezogen.

Versuchsdauer: ca. 1 Stunde

Hinweis: Versuch 2 und auszugsweise Versuch 5 sind für Schülerversuche gut geeignet.

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4. KURS: WACHSTUM UND ENTWICKLUNG 25.11.2020 4.1 Krümmung der Sproßachse und Bildung von Adventivwurzeln und Verhinderung des Blattabfalls 4.2 Einfluss von Licht auf das Wachstum (Biostatistik) 4.3 Zwergmutanten der Erbse und ihre Normalisierung durch Gibberellinsäure 4.4 Einfluss von Antibiotika auf Keimung und Wachstum ------------------------------------------------------------------------------------------------------

4.1 Bildung von Adventivwurzeln und Verhinderung des Blattabfalls

Allgemeines: In diesem Versuch wird die Wirkung des Phytohormons Indolylessigsäure (IAA = Auxin) auf weitere physiologische Prozesse untersucht.

Literatur: Schopfer & Brennicke; Kutschera, Schopfer.

Materialien: 3 Coleus-Topfpflanzen für jede Gruppe

Chemikalien: keine

Geräte: keine

Fertig angesetzte „Lösungen“: 1.Wuchsstoffpaste (IAA) 2.Wasserpaste (Kontrolle) Zum Ansetzen löst man die erforderliche Menge IAA in etwas 96 %igem Alkohol und verdünnt mit H2O (0,5 % IAA). 5 g Wollfett (Lanolin, wasserfrei) wird dann mit 5 ml Lösung im Mörser so lange gerieben, bis das Fett die Lösung aufgenommen hat. Für die Wasserpaste wird statt Wuchsstofflösung Wasser verwendet. Aufbewahrung im Kühlschrank.

Durchführung: Der Wuchsstoff IAA wird wie unter Teil a und Teil b beschrieben als Paste appliziert.

a) Junge Internodien einer Coleus-Pflanze werden einseitig mit Wuchsstoffpaste bzw. Wasserpaste bestrichen (d. h. 2 Pflanzen: IAA und Kontrolle).

Versuchzeit: etwa 10 min

Auswertung: Die beiden Pflanzen werden im Gewächshaus weiterkultiviert und nach 3 Wochen (16.12.) das Ergebnis protokolliert.

b) An einer weiteren Topfpflanze von Coleus werden die Blätter wie folgt behandelt: - Abtrennung einer ganzen Blattspreite - Abschneiden einer Blattspreite zu 4/5 (d.h. nur 1/5 bleibt stehen) - Abschneiden einer ganzen Blattspreite und zusätzlich Auftragen der Wuchsstoff-

paste auf die Schnittfläche des Blattstieles. - Ein Kontrollblatt gegenüber wird mit Wasserpaste bestrichen.

Versuchzeit: etwa 15 min

Auswertung: Die Pflanze wird im Gewächshaus weiter kultiviert, nach einer Woche (02.12.) die Ergebnisse protokolliert.

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4.2 Einfluss von Licht auf das Wachstum von Keimlingen

Allgemeines: Mit diesem Versuch sollen Sie einen Zugang zur Lichtwirkung in der Keimlingsentwicklung erhalten. Dieser Versuch ist nach Möglichkeit von allen Gruppen durchzuführen. Fragen zur Vorbereitung: Was ist Skotomorphogenese, was ist Photomorphogenese? Welche Photorezeptoren sind für die Photomorphogenese von Bedeutung?

Literatur: Schopfer: Experimentelle Pflanzenphysiologie. Band I; Band II; Kutschera.

Materialien:

- etiolierte, grüne, und im Dunkelrot-Licht angezoge-ne 4 Tage alte Keimpflanzen von Kresse

- 5 15 cm großes Millimeterpapier - Pinzette

Chemikalien: keine

Geräte: keine Fertig angesetzte Lösungen: keine

Durchführung: Jede Gruppe untersucht das Wachstum einer Schale grüner, etiolierter und im dunkelrot Licht angezogener Keimlinge. Dazu werden 140 zufällig gewählte Keimlinge (man nimmt sich dafür ein Quadrat der Schale vor und vermisst alles, was dort wächst) vorsichtig vom Keimpapier abgenommen und auf 0,5 mm genau vermessen (z.B. 7,5 mm). Man hält da-bei den Keimling mit einer Hand auf der Messplatte fest, greift die Kotyledonen mit einer Pinzette und zieht den Hypokotylhaken gerade (ohne ihn abzubrechen).

Auswertung: Die Messwerte werden untereinander in die Spalte einer Tabelle eingetragen (oder direkt in Excel). Diese Messwerte müssen im Protokoll angegeben werden. Als erstes werden Häufigkeiten der einzelnen Messwerte (z.B. 20 x, 6 x) über die Hypokotyllängen (z.B. 7,5 mm; 8,0 mm) grafisch dargestellt (als Punktdiagramm). Gleicht die Verteilung einer Nor-malverteilung (Glockenkurve)? Lassen Sie sich nun die Werte einer Gruppe geben, die eine andere Keimlingsart unter-sucht hat. Geben Sie die Mittelwerte und die Standardabweichung der Mittelwerte an! Finden Sie heraus, ob die Hypokotyllängen zwischen den zwei Keimlingsarten aus den zwei Lichtbedingungen signifikant verschieden sind. Nutzen Sie hierfür den t-Test (mit Excel)! Zeichnen sie je drei Pflanzen aus jeder Lichtbedingung! Beschreiben Sie, welchen Einfluss die verschiedenen Lichtbedingungen auf a) die Hypoko-tyllänge, b) die Öffnung des Hypokotylhakens, c) die Farbe der Keimlinge haben! Begrün-den Sie ihre Beobachtungen!

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4.3 Zwergmutanten der Erbse und ihre Normalisierung durch Gibberellinsäure

Allgemeines: In diesem Versuch wird eine Hauptwirkung des Phytohormons Gibberellin (Gibberellin-säure, GA3) untersucht.

Literatur: Kutschera (beide Bücher), für echte Spezis: Taiz/ Zeiger

Materialien: Keimlinge von Pisum sativum "Zwerg-Markerbsen" Sorte "Wunder von Kelvedon", 2 Wochen im Ge-wächshaus vorkultiviert. Pro Gruppe 3 Töpfe mit jeweils ca. 10 Pflanzen.

Chemikalien: keine

Geräte: Standzylinder und Plastikbecher zum Herstellen der GA3-Verdünnungen. Sprüher für GA3-Lösung.

Fertig angesetzte Lösungen: Wässrige Tween 20-Lösung (0.1 %) 200 ml, GA3-Stammlösung (2 mM) Die GA3-Lösung ist im Kühlschrank aufzubewahren und wird im Praktikum verdünnt.

Durchführung: Zunächst müssen folgende Lösungen zur Behandlung der Pflanzen aus der Stammlösung hergestellt werden: a) 0.2 mM GA3, mit 0.1%iger Tween 20 für den Teil (i), b) 0.2 mM GA3, ohne Tween 20 für die Teile (ii) und (iii).

Die vorkultivierten Erbsen werden am Praktikumstag (i) mit ca. 10 ml GA3 Lösung besprüht, (ii) Kontrolle mit 0,1% Tween sprühen (iii) mit ca. 10 ml GA3 gegossen bzw. (iv) nicht behandelt (Kontrolle), mit Wasser gießen.

Bei Materialmangel können verschiedene Gruppen Kontrollpflanzen gemeinsam verwen-den.

Alle Töpfe sind im Gewächshaus aufzubewahren und hinreichend während der Woche zu wässern.

Versuchzeit: etwa 20 min Auswertung: erfolgt nach einer Woche (02.12.). Die Länge der Sprosse bis zur Apikalknos-pe und die Anzahl der Internodien ist von allen 10 Pflanzen pro Topf zu bestimmen. Mit-telwerte und Standardfehler (nicht Standardabweichung!) sind zu berechnen.

Hinweis: Pro Topf werden nach Möglichkeit 10 Pflanzen benötigt (Statistik). Entfernen Sie bei Versuchsbeginn alle Pflanzen aus den Töpfen, die Sie nicht benötigen.

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4.4 Einfluss von Antibiotika auf Keimung und Wachstum

Allgemeines: Chloramphenicol blockiert die prokaryotische Proteinbiosynthese, also in Chloroplasten und Mitochondrien. Die Wirkung soll auf Keimung und Keimlingsentwick-lung beobachtet werden.

Materialien: - Kresse - Handschuhe - autoklaviertes Wasser - Falcon Tubes - 2 Petrischalen (Plastik) pro Gruppe - Filterpapier (autoklavieren!) - Parafilm - Schere

- 10 ml-Standzylinder

Chemikalien:-

Geräte:-

Fertig angesetzte Lösungen: - 0.025% (w/v) Chloramphenicol- Lösung,

200 ml - Autoclaviertes Wasser

Durchführung: Je 50 Kressesamen werden auf Filterpapier (2 Lagen) in Petrischalen mit 8 ml Wasser bzw. 8 ml einer Chloramphenicol-Lösung zur Keimung ausgelegt. Ober- und Unterseiten der Petrischalen werden außen sparsam mit Parafilm verbunden.


Auswertung: Nach 7 Tagen (02.12.20) werden die Keimprozente und die durchschnittli-chen Koleoptillängen ermittelt sowie der Durchbruch des Primärblattes durch die Koleop-tile registriert.

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5. KURS: MINERALSTOFFWECHSEL 02.12.2020

5.1 Mangelkulturen als Beispiel für Biotests 5.2 Nachweis von Nitrat 5.3 Nachweis von Eisen 5.4 4-Farbversuch (Wassertransport in der Pflanze) --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

5.1 Mangelkulturen als Beispiel für Biotests

Allgemeines: Dieser Versuch hat eine über die mineralische Ernährung weit hinausge-hende Bedeutung. Die Versuchpflanzen (Wasserlinsengewächse = Lemnaceae, besonders Lemna minor) werden als Biotestsysteme zur Routineüberprüfung von Wasserqualität eingesetzt (vgl. www.lemnatec.de (überprüft 31. 08. 2012) oder http://www.mobot.org/jwcross/duckweed/duckweed-charms.htm (überprüft 17.09.2015)). Diese durch eine ISO-Vorschrift festgelegten Biotests sollten eigentlich un-ter axenischen Bedingungen durchgeführt werden, was aber in diesem Praktikum nicht möglich ist. Der Versuch sollte von allen Gruppen durchgeführt werden. Versuche dieser Art sind ausgezeichnet als Schülerversuche geeignet, auch zum Test gifti-ger Substanzen aller Art oder von Haushaltschemikalien.

Literatur: Schopfer & Brennicke

Materialien: - Pipetten - beschriftete Standzylinder - beschriftete Plastikbecher (100 ml) - Erlenmeyerkolben (100 ml), 3 Stück pro Gruppe, sterilisiert! - Wattestopfen - Wasserlinsengewächse, z.B.

Spirodela polyrhiza oder eine Lemna-Art (minor, gibba, aequinoctialis) - Glasstab - Kanister für Reinstwasser (Vorrat)

Chemikalien: - Spiritus für den Brenner

Geräte: - pH-Messgerät - Spiritus-Brenner - Impfösen

Fertig angesetzte Lösungen: Stammlösungen: - 100 mM KH2PO4 - 0.2 M Ca(NO3)2 - 1.6 M KNO3 - 0.2 M MgSO4 - 1 mM H3BO3; 2.6 mM MnCl2; 80 µM Na2MoO4 - 5 mM Fe(III)EDTA - 1.6 M KCl - 0.2 M CaCl2

- 1 M MgCl2 - 0.15 M NaH2PO4 - 1 M NaNO3 - 0.2 M Na2SO4 - 5 mM Na2EDTA

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Der Versuch stellt Grundanforderungen an Ihre Kenntnisse zu Stöchiometrie und Sta-tistik (Fehlerrechnung, t-Test).

Durchführung: Pipettier-Schema für das Vollmedium und Mangelvarianten (Angaben in ml; Gesamt-volumen 500 ml): M a n g e l m e d i e n

Vollmedium Mangelmedien

NO3- PO4

3- SO42- K+ Mg2+ Fe3+ Ca2+

Nr. Stammlösungen

1 100 mM KH2PO4 2,5 2,5 - 2,5 - 2,5 2,5 2,5

2 0.2 M Ca(NO3)2 2,5 - 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 -

3 1.6 M KNO3 2,5 - 2,5 2,5 - 2,5 2,5 2,5

4 0.2 M MgSO4 2,5 2,5 2,5 - 2,5 - 2,5 2,5

5 1 mM H3BO3; 2.6 mM MnCl2; 80 µM Na2MoO4

2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

6 5 mM Fe(III)EDTA 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 - 2,5 Ersatzlösungen 7 1.6 M KCl - ? ? - - - - -

8 0.2 M CaCl2 - ? - - - - - -

9 1 M MgCl2 - - - 0,5 - - - -

10 0.15 M NaH2PO4 - - - - ? - - -

11 1 M NaNO3 - - - - ? - - ?

12 0.2 M Na2SO4 - - - - - ? - -

13 5 mM Na2EDTA - - - - - - ? -

In der obigen Tabelle finden Sie in den Spalten die notwendigen Volumina für die Herstel-lung der acht verschiedenen Medien. Bitte legen Sie für jedes Medium zunächst ca. 450 ml Reinstwasser in einem Plastikzylinder vor und pipettieren Sie in der angegebenen Rei-henfolge die 6 Lösungen, für welche Sie in der Tabelle Volumenangaben finden. Nach Zu-gabe der Komponenten bitte mit einem Glasstab umrühren, am Schluss auf 500 ml mit Reinstwasser auffüllen.

Zur Vorbereitung auf das Praktikum berechnen Sie bitte die „?“ in der Tabelle. Bitte geben Sie im Protokoll an, was Sie für „?“ ausgerechnet haben. Dies soll Ihnen helfen Ihre Kenntnisse in Stöchiometrie zu prüfen. Die Konzentrationen der Lösungen [1M = 1mol/l] sind ihnen in der Tabelle angegeben und das Volumen, welches Sie an Stammlösung ein-gesetzt hätten, beträgt immer 2,5ml.

Beispiel: Zur Herstellung eines Sulfat-Mangelmediums werden die Stammlösungen 1, 2, 3, 5 und 6 zu je 2,5ml pipettiert. Um die Stammlösung 4 (diese enthält Sulfat) zu ersetzen, verwendet man die Ersatzlösung 9. In Lösung 4 und 9 sind Magnesium-Ionen enthalten. Da nicht gleichzeitig auch auf Magnesiummangel getestet werden soll, sondern der allei-nige Effekt von fehlendem Phosphat beobachtet werden soll, müssen die Magnesium-Ionen in der gleichen Stoffmenge (Teilchenanzahl) zugeführt werden.

0.2 M MgSO4 soll durch 1 M MgCl2 ersetzt werden. Da die Stoffmenge an Magnesium in der Stammlösung 4 genau so groß wie in der Ersatzlösung 9 sein soll, gilt n (Stammlösung 4) = n (Ersatzlösung 9). Damit lässt sich aufgrund n = c*V folgende Rechnung für das benö-tige Volumen der Lösung 9 aufstellen:

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=

Jede Gruppe sollte eine Mangelvariante plus die Kontrolle ansetzen. Hier ist eine Hilfe für Sie zur Aufteilung auf die Gruppen:

Gruppe Vollmedium -N -P -S -K -Mg -Fe -Ca

1 X X

2 X X

3 X X

4 X X

5 X X

6 X X

7 X X

8 X

9 X

10 X

Überführen Sie von jedem Ansatz 3 x 75 ml in 100 ml Erlenmeyerkolben. Der zweite Teil der Nährlösung kann von einer anderen Gruppe verwendet werden. Am gleichen Tag wird noch jeweils ein Triplett von Spirodela polyrhiza (oder eine andere Wasserlinse) eingeimpft. Da wir nicht axenisch arbeiten, kann dies im Praktikumsraum ohne Sicherheitswerkbank erfolgen. Die Pflanzen werden (im Hörsaalvorbereitungsraum oder im Gewächshaus) 5 Wochen kultiviert.

Zum Ansetzen des Versuches: Nach dem Überimpfen wird die Anzahl der Sprosse be-stimmt, da es meist nur schwer möglich ist, genau ein Triplett einzuimpfen (Übrigens: Was sind Turionen?). Ausgangs-pH-Wert in einem der Kolben messen (pH-Elektrode).

Versuchszeit: 1.0 – 1.5 Stunden

Zur Auswertung während des Praktikums: Bitte beobachten Sie die Entwicklung Ihrer Pflanzen. Die Sprosszahl ist wöchentlich (09.12.; 16.12.; 06.01.) zu bestimmen – solange die Zahl nicht soweit ansteigt, dass eine Bestimmung ohne Öffnen des Kolbens nicht mehr möglich ist (in einigen Varianten vielleicht nach 3 Wochen?). Bitte diskutieren Sie mit dem Versuchsbetreuer bevor Sie eine Messung entfallen lassen.

Zur Auswertung nach 5 Wochen: Es sind erneut der pH-Wert, letztmalig die Sprosszahl pro Kolben (genau!), sowie zum Abschluss das Frischgewicht zu messen. Zum Zählen ist es vermutlich günstig, den Kolbeninhalt in eine Glasschale zu schütten. Sollten sich Turionen gebildet haben, so ist die Zahl zu bestimmen. Ebenfalls soll eine Bonitierung (lat. Bonitas = gute Beschaffenheit, Güte) stattfinden, wobei besonders der Chlorophyllgehalt und der Anthozyangehalt einzuschätzen sind.

Kolonie von Lemna minor, bestehend aus Mutterspross (M) und zwei Toch-tersprossen (D1 und D2).

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Zur schriftlichen Auswertung: Alle numerischen Daten sowie die Bonitierungsergebnisse sind anzugeben (Originaldaten). Mittelwerte und Fehler (mittlerer Fehler des Mittelwer-tes) sind zu berechnen. Aus den Sprosszahlen (Z1, Z2) über die Zeit (t1, t2) werden die Wachstumsraten (WR) und die Verdoppelungszeit (Td) nach folgenden Formeln berech-net: WR = (lnZ2 – lnZ1)/(t2 - t1) Td = ln2/WR (Dimension Tage, falls t1 und t2 in Tagen verwendet wurden). Mittels t-Test ist zu entscheiden, ob die Wachstumsraten oder die Verdoppelungszeiten der Mangelvarianten signifikant von den Kontrollen verschieden sind. Bitte verwenden Sie dazu nicht die Sprosszahlen. Warum sind diese nicht akzeptabel?

Hinweis: Die Betreuer des Versuches sollten am Schluß die Zusammenfassung der Daten aller Gruppen organisieren, damit eine Übersicht erhalten wird.

5.2 Nachweis von Nitrat

Allgemeines: In diesem Versuch soll der Nitratgehalt im Pflanzensaft nachgewiesen werden.

Literatur: Schopfer/Brennicke

Materialien: - Objektträger - Tropfpipette - Zea mays, auf Vermiculit angezogen (des-halb N-Mangel) und auf Boden angezogen. Brennnesseln, Hirtentäschelkraut.

Chemikalien: -

Geräte: - Stereomikroskop

Fertig angesetzte Lösungen: Diphenylamin-Schwefelsäure

Durchführung: a. Von basalen Stengelteilen einer Ruderalpflanze (z. B. Urtica dioica, auch andere

Pflanzen sind verwendbar: Capsella bursa-pastoris, Lamium album, Chenopodium bonus-henricus bzw. Ch. album, Solanum nigrum) fertigt man einen Querschnitt an, legt ihn auf einen Objektträger und betropft ihn mit Diphenylamin-Schwefelsäure. Beobachtung mit einem Auflichtmikroskop: Blaufärbung der Ge-webe gilt als NO3

--Nachweis. Als Kontrolle dient Pflanzenmaterial mit geringem NO3

--Gehalt (Zea mays vergleichsweise auf Vermiculit und Boden angezogen).


b. Von einer Ruderalpflanze (s.o.) wird etwas Pflanzensaft auf einen Objektträger ge-geben und mit 2 Tropfen Diphenylamin-Schwefelsäure versetzt. Bei Anwesenheit von Nitrat entsteht eine tiefblaue bis violette Färbung.


Auswertung: Bedeutung des Stickstoffs für die Pflanze (aber bitte nicht ins Protokoll).

Hinweis: Herstellung von Diphenylamin-Schwefelsäure durch die studentische Hilfskraft: 0.2 g Diphenylamin in 4 ml Reinstwasser suspendieren und darauf vorsichtig 20 ml kon-zentrierte Schwefelsäure geben!! Starke Säure!!

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5.3 Nachweis von Eisen

Allgemeines: Ziel des Versuchs ist der Nachweis von Eisen im Prokambium des Senfemb-ryos. Siehe auch Hinweise auf Seite 64.

Literatur: Schopfer & Brennicke

Materialien: - Senfsamen (24 Stunden in 1%iger

K4[Fe(CN)6] vorgequollen) Versuchsbetreuer!

Chemikalien: ------

Geräte: - Stereomikroskop - Präparationsbesteck, von den Studenten mitzu-bringen (Pinzette, Skalpell, Messer)

Fertig angesetzte Lösungen: - 1% K4[Fe(CN)6] - 5% Salzsäure

Durchführung: Die Samenschale wird entfernt und der Embryo mit 5%iger Salzsäure versetzt. Unter dem Mikroskop beobachtet man die Blaufärbung der Prokambiumstränge (Berliner Blau-Reaktion).


Auswertung: Skizze.

5.4 4-Farbversuch (Wassertransport in der Pflanze)

Allgemeines: Die Transportgewebe bilden ein komplexes, dreidimensionales Netzwerk, das den Spross durchzieht: die Stele. Der Bau der Stele variiert bei verschiedenen Pflan-zenfamilien. Zur Anbindung der Blätter an die Knoten (Nodi) der Sprossachse münden Leitbündel in die Blattstiele ein, die als Blattspuren bezeichnet werden.

Materialien: Vicia faba Pflanzen

Chemikalien: -verschiedene Farblösungen

Geräte: - Flaches Wasserbecken - Küvetten

Fertig angesetzte Lösungen:

Durchführung: Füllen Sie die verschiedenen Farblösungen in die vorgesehenen Küvetten. Ein Vicia-Spross wird abgeschnitten, sofort in Wasser gelegt und nochmals unter Wasser geschnitten um zu verhindern, dass Luft in die Gefäße eindringt. Der vierkantige Spross wird dann kreuzweise von den Seiten her ca. 3cm eingeschnitten. Danach werden die 4 Sprossteile etwas nach außen gebogen, in je eine der Farblösungen gestellt und senkrecht an der Halterung befestigt. Wir verfolgen die Wanderung der Farblösungen in den ver-schiedenen Sprossteilen und Blättern.

Versuchszeit: ca. 1-2 h

Auswertung: Beobachten und dokumentieren Sie die Wanderung und Verteilung der Farbstoffe in Sprossachse und Blätter. Interpretieren Sie die Verteilung der Farbstoffe in Sprossachse und Blättern und versuchen Sie Rückschlüsse auf den Bau der Stele und den Anschluss der Blattspuren bei Vicia faba zu ziehen.

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6. KURS: KEIMUNG 09.12.2020

6.1 Einfluss von Abscisinsäure (ABA) auf die Samenkeimung 6.2 Keimfähigkeitsprüfung (Schnelltest) 6.3 Einfluss des Umweltfaktors Wasser auf die Entwicklung von Keimpflanzen 6.4 Einfluss endogener Abscisinsäure auf Keimung 6.6 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

6.1 Einfluss von Abscisinsäure (ABA) auf die Samenkeimung

Allgemeines: Ziel des Versuchs ist es, das Keimverhalten von Samen in Abhängigkeit von verschiedenen Abscisinsäure-Konzentrationen zu ermitteln.


Materialien: - Kresse Samen - Petrischalen autoklaviert - Rundfilterpapier autoklaviert - 10 ml-Standzylinder (4 Stück) - Tomatensaft

Chemikalien: ------

Geräte: ------

Fertig angesetzte Lösungen: - Lösungen von ABA: 10-3 M, 10-4 M 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, jeweils 100 ml -Pufferlösung (MES) mit Tomatensaft pH

Durchführung: Die Petrischalen werden mit 3 Lagen Filterpapier belegt und jeweils mit 25 Samen be-schickt. 5 ml der verschiedenen ABA-Lösungen, Tomatensaft bzw. Pufferlösung/Wasser (Kontrollen) werden vorsichtig eingefüllt, sodass die Samen nicht weggespült werden. Die Petrischalen werden mit einem Oberteil verschlossen und im Gewächshaus aufgestellt. Zum Verschließen sollte Parafilm verwendet werden.


Auswertung: Die Auswertung erfolgt nach 7 Tagen (16.12.). Tragen Sie die Anzahl gekeim-ter und ungekeimter Samen in die unten stehende Tabelle ein. Die Keimprozente sind zu bestimmen und gegen die Konzentration von ABA halb-logarithmisch aufzutragen Das bedeutet: x-Achse log-Darstellung, y-Achse lineare Darstellung.

H2O Tomatensaft Puffer Tomaten saft

ABA 10-3

ABA 10-4

ABA 10-5

ABA 10-6

ABA 10-7

Kresse

Informieren Sie sich über die Wirkung von ABA (aber bitte nicht ins Protokoll schreiben).

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6.2 Keimfähigkeitsprüfung (Schnelltest)

Allgemeines: Wenn ein Landwirt Mais-Saatgut einkauft, möchte er gerne wissen, ob die Karyopsen keimfähig sind. Dazu wurde schon frühzeitig ein Schnelltest entwickelt.


Materialien: - Mais, 2 Tage vorgequollen - Apfelsamen - Plastik-Petrischalen

Chemikalien: ------

Geräte: - Präparierbesteck (Studenten sollten das mitbringen) - Reagenzglas -Holzklammer -Streichhölzer

Fertig angesetzte Lösun-gen: -0.1% (w/v) 2.3.5-Triphenyltetrazoliumchlorid-Lösung = TTC (im Kühlschrank dunkel einige Tage haltbar)

Durchführung: 3 vorgequollene Mais-Karyopsen werden längs gespalten. Die Schnittrichtung ist dabei wichtig, der Embryo muss angeschnitten werden. Aus 3 weiteren Karyopsen werden die Embryonen isoliert. Nun übertragen Sie das Testmaterial in eine flache Schicht einer Lö-sung von TTC und lassen die Petrischale bei Zimmertemperatur im Dunkeln stehen. Die Schnittflächen müssen in der Lösung sein.

Erweiterung: Mindestens eine Gruppe sollte diesen Versuch mit Apfelsamen ausprobieren. Wer kann einen Apfel zur Verfügung stellen? Auch vorgequollene Erbsen oder Bohnen können für diesen Versuch erfolgreich verwendet werden.


Auswertung: Nach ca. 1 h sind Spross und Wurzelanlage gerötet, wenn der Same keim-fähig ist. Skizze und Diskussion des TTC-Effektes.

Erweiterung: Die vorgequollenen Samen werden kurz vor Praktikumsbeginn oder im Prak-tikum gekocht. Was erwarten Sie als Versuchsergebnis?

6.3 Einfluss des Umweltfaktors Wasser auf die Entwicklung von Keimpflanzen

Allgemeines: Mit diesem Versuch soll demonstriert werden, welche Rolle Wasser für die Keimung von Samen besitzt.

Literatur: Schopfer/Brennicke, Kutschera

Materialien: - 4 Petrischalen pro Gruppe - Rundfilter - 10 ml-Standzylinder - Lepidium sativum-Samen - Parafilm - Schere

Chemikalien: keine

Geräte: keine


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Durchführung: Die 4 Petrischalen werden mit je 1-3 Rundfiltern (je nach Papierart) ausgelegt, welche mit unterschiedlichen Wassermengen zu befeuchten sind: 1. Schale 1 ml Wasser 2. Schale 2 ml Wasser 3. Schale 6 ml Wasser 4. Schale 18 ml Wasser In jede Schale werden 12 Samen von Lepidium ausgelegt. Die Petrischalen werden mit Parafilm (bitte aus finanziellen Gründen sparsam damit umgehen) verschlossen, um ein Austrocknen zu vermeiden. Nach einwöchigem Wachstum (16.12.) unter physiologischen Bedingungen (Temperatur und Lichtverhältnisse beachten!) erfolgt die Auswertung. Die Petrischalen sollen im Gewächshaus oder im Fenster des Hörsaalvorbereitungsraumes aufgestellt werden.


Auswertung: für das Protokoll: - Messung von Spross- und Wurzellänge (quantitativ) - Wurzelhaarbildung (qualitativ) - Keimungsrate (quantitativ) - Ausbildung der Keimblätter (qualitativ)

6.4 Einfluss endogener Abscisinsäure auf Keimung

Vorbemerkung: Es soll der Hypothese nachgegangen werden, dass das Endosperm von Apfelsamen Abscisinsäure enthält und deshalb die Keimung frisch isolierter „Apfelkerne“ gehemmt ist. Wir bitten die Studenten einige nicht zu alte Apfel- oder Birnenkerne mitzubringen.

Materialien:

- 3 Petrischalen pro Gruppe - Filterpapier - Parafilm - Schere

- 10 ml-Standzylinder - Präparationsbesteck - Unterlage aus Glas

Chemikalien: keine

Geräte:


keine

Durchführung: Wir bitten möglichst alle Gruppen eine Birne oder einen Apfel mitzubringen. Wir brau-chen im Praktikum nur den Samen (15 pro Gruppe). Von jeweils 5 Samen werden - Testa entfernt - Testa und Endosperm entfernt - komplette Samen (Kontrolle)

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verwendet. Die Samen bzw. –teile werden auf feuchtem Filterpapier in Petrischalen ge-legt (siehe andere Versuchsanleitungen) und mit Parafilm verschlossen. Die drei Schalen werden ins Gewächshaus gestellt und nach einer Woche (16.12.) ausgewertet.

Versuchszeit: ca. 15 min.

Auswertung: Geben Sie die Keimprozente an und erklären Sie das Ergebnis. 6.5 Chemiewaffen im Pflanzenreich (Allelopathie)?

Allgemeines: Die Blätter des Walnussbaums enthalten u.a. folgende lnhaltsstoffe: Juglon, α- und β-Hydrojuglon, Juglandin, Quercetin, Quercetrin, Sakuranetin, Gerbstoffe, Seroto-nin und Inosit. In diesem Versuch soll der Einfluss von Extrakten aus Walnussblättern auf (1.) die Keimung und (2.) das Wachstum von Kresse untersucht werden.

Materialien: - 5 g Walnussblätter - ca. 60 Kressesamen - Schere - Handschuhe - Wägschälchen, Spatel - Mörser und Pistill - Trichter und Rundfilter, Petrischalen - 250 ml Becherglas

- 2 500 Bechergläser - 6 Lagen Filterpapier

Chemikalien: - Quarzsand

Geräte: keine


Durchführung: Zur Gewinnung des Walnussbaum-Blattextraktes werden ca. 5 g Fiederblätter ohne deren Mittelrippe so fein wie möglich mit der Schere zerkleinert und anschließend im Mörser unter Zusatz einer Spatelspitze Quarzsand homogenisiert. Bitte Handschuhe tragen. Dazu kommen 25 ml Leitungswasser. Mit der erhaltenen graugrünen Suspension kann das ei-gentliche Experiment beginnen. In jedes der beiden 1000 (oder 500) ml Bechergläser werden je nach Papierdicke 2 – 3 Lagen Filterpapier gelegt. In das erste Glas wird Leitungswasser gegeben, sodass sich et-was Wasser ansammelt, wenn man das Glas schräg hält. Das andere Glas wird dement-sprechend mit dem Blattextrakt behandelt. Nun werden in jedes Glas etwa 30 Kressesa-men gelegt. Die Gläser werden verschlossen und ins Gewächshaus gebracht.

Auswertung: Die Keimungsrate der Kresse, d. h. gekeimte Samen in Bezug zur Gesamtan-zahl an Samen, wird nach 24 h bestimmt und in Prozent angegeben. Die Längen von Wur-zeln und Sprossen werden nach 7 Tagen (16.12.2020), also in der folgenden Praktikums-woche, gemessen. Die Ergebnisse sind grafisch darzustellen. Die Spross- und Wurzellän-gen sind als Mittelwerte mit Standardfehlern auszuwerten. Die Wurzelhaarbildung ist zu vergleichen.

Versuchsdauer: ca. 60 min, davon 30 min Vorbereitung und 30 min Auswertung

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7. KURS: BODEN UND PFLANZE 16.12.2020

7.1 Mykorrhiza 7.2 Bestimmung der Bodenazidität 7.3 Bestimmung des Kalkgehaltes 7.4 Adsorption saurer und basischer Farbstoffe durch Bodenkolloide --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

7.1 Mykorrhiza

Allgemeines: Der Wald ist voller Pilze. Sehr viele gehen als Mykorrhizapilze eine Symbiose mit Bäumen ein. Sie erleichtern den Bäumen die Nährsalz- und Wasseraufnahme und schützen ihren Symbiosepartner vor Pathogenen. Dafür erhalten die Pilze von ihrem pflanzlichen Partner Zucker.

Mit Hilfe der Lactophenol-Baumwollblau Färbung werden cyanophile* Pilzbestandteile blau bis blauviolett und acyanophile* Bestandteile nicht gefärbt.

Mit dem Farbstoff Brilliantkresylblau oder Neutralrot können lebende Zellen gefärbt wer-den, durch Methylenblau werden tote Zellen angefärbt.

Materialien: Boden- und Wurzelprobe aus dem Wald Objektträger und Deckgläschen Pipetten Wägeschalen Spatel Pinzette

Chemikalien: Baumwollblau Milchsäure Aqua dest

Geräte: Gaskocher Mikroskop Waage

Fertig hergestellte Lösungen: Neutralrot Baumwollblau zur Hyphenfärbung Brilliantkresylblau Methylenblau

Durchführung: a) Sporenfärbung

Stellen Sie die Färbelösung aus 0,17 g Baumwollblau und 100 ml Milchsäure her. 2 Objektträger werden mit entweder etwas Waldboden oder einem Stück Wurzel bestückt und gut mit Färbelösung bedeckt. Die Präparate werden vorsichtig (Schutzbrille tragen) mit einer Pinzette über die Flamme eines Gaskochers gehal-ten und bis zum Aufkochen erhitzt. Anschließend wird ein Tropfen Wasser auf das Präparat getropft und mit einem Deckgläschen abgedeckt, bevor es mikroskopiert werden kann.

b) Hyphenfärbung Gehen Sie für die Färbung der Hyphen nach der Beschreibung wie unter a) vor, nutzen Sie die fertig hergestellte Bauwollblaulösung.

c) Lebend-/Tot-Färbung

Auch hierfür werden die Objektträger mit entweder Waldboden oder Wurzel be-stückt. Zu den Objekten werden entweder Neutralrot- und Methylenblau oder

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Brilliantkresylblau hinzugegeben. Bitte beachten Sie, dass Methylenblau nur kurz einwirken darf, da sonst auch lebende Zellen angefärbt werden.

Versuchszeit: ca. 1h.

*cyanophil = blau liebend *acyanophil = blau meidend

7.2 Bestimmung der Bodenazidität

Allgemeines: Die Bodenazidität bzw. der pH-Wert des Bodens bestimmt u. a. die Nähr-stoffverfügbarkeit, das Schadstoffbindevermögen, den Ablauf von Redoxreaktionen, die biologische Aktivität, die Verwitterung und Mineralisierung. Die pH-Werte in Böden liegen meist zwischen 3 und 8.

Materialien: - Humusboden - kalkhaltiger Boden - Torfboden - Pikiererde - Sieb - 2 Wägeschälchen und Spatel - 4 Erlenmeyerkolben - 50 ml Messzylinder - 2 Trichter mit Rundfiltern - Unitestpapier oder Stuphanpapier (Roth) Hinweis an den Betreuer: die Bodenproben müssen zuvor gesiebt werden.

Chemikalien: -

Geräte: - Glas-Pipette (5 ml) - Waage - pH-Meter

Fertig angesetzte Lösungen: 100 ml 400 mM CaCl2

Durchführung: Jede Gruppe soll 2 verschiedene Bodenarten untersuchen. Es kann auch selbst Boden mitgebracht werden. Es werden 80 g des jeweiligen Bodens abgewogen und in einem Er-lenmeyer-Kolben mit 200 ml H2O sorgfältig aufgeschlämmt. Dazu werden 5 ml der 400 mM CaCl2-Lösung gegeben und geschüttelt (Eine Gruppe sollte versuchsweise CaCl2 weg-lassen und sehen, ob das einen Einfluss hat). Nach 5 min wird die Bodenlösung zunächst zur Entfernung grober Partikel gesiebt und danach in einen neuen Erlenmeyerkolben fil-triert. Der pH-Wert mit Hilfe von Unitestpapier und eines pH-Meters bestimmt. Beide Werte sollen miteinander verglichen werden. Das Filtrat wird beschriftet und weiteren Gruppen zur Verfügung gestellt.

Auswertung: Tabellarische Darstellung

Versuchsdauer: ca. 30 min

7.3 Bestimmung des Kalkgehaltes

In diesem Versuch wird innerhalb des Praktikums mit einer Eichkurve gearbeitet. Zu Ihrer Vorbereitung: Wie stellt man eine Eichkurve her und wie geht man mit ihr um? Wie be-rechnet man eine Ausgleichsgerade? Was versteht man unter linearer Regression? Siehe auch Versuchstag 1!

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Allgemeines: Der Kalkgehalt steht in engem Zusammenhang mit dem pH-Wert und dem Puffergeschehen im Boden. In diesem Versuch reagiert im Boden enthaltenes Calci-umcarbonat mit zugesetzter Salzsäure zu Calciumchlorid, Kohlendioxid und Wasser.

CaCO3 + 2 HCl → CaCl2 + CO2 + H2O Das entweichende Kohlendioxid lässt sich durch sichtbares und/oder hörbares Aufbrau-sen ermitteln. Eine einfache Methode (Feldversuch) zur Kalkbestimmung von Böden fin-den Sie im Versuchsteil A. Zur genauen Bestimmung des Kalkgehaltes wird eine definierte Bodenmenge mit einem Überschuss an Salzsäure versetzt und das entweichende Kohlen-dioxid gasvolumetrisch bestimmt (Versuchsteil B).

Materialien: - verschieden Böden - 4 Petrischalen - 1 Tropfpipette aus Plastik - 4 Wägschälchen, Spatel - 10 ml Messzylinder - 1 U-Rohr-Apparatur - 1l Rundkolben - Säureabfall mit Trichter - 2 Klemmen - Parafilm - Blu tack oder ähnliches - Handschuhe

Chemikalien: - CaCO3

Geräte: - keine

Fertig angesetzte Lösungen: - 10 % (v/v) HCl

Durchführung: Versuchsteil A: Die verschiedenen Bodenproben werden in Petrischalen gefüllt und mit einigen Tropfen 10 % (v/v) HCl versetzt. Die Dauer und Stärke des Aufschäumens ist ein Maß für den im Boden vorliegenden Kalkgehalt. Reaktion Kalk

kein sichtbares und hörbares Aufbrausen kein Kalk

kein sichtbares Aufbrausen, aber hörbares Zischen unter 1 % Kalk

schwaches, nicht anhaltendes Aufbrausen 1 % - 2 % Kalk

deutliches, nicht anhaltendes Aufbrausen 2 % - 4 % Kalk

starkes, lang anhaltendes Aufbrausen über 5 % Kalk

Auswertung: Tabellarische Darstellung der Beobachtungen


Durchführung: Versuchsteil B: Jeweils 500 mg lufttrockener Boden (von kalkarmen Böden, wie z. B. Sand: 1 g und von kalkreichen Böden, wie Muschelkalk entsprechend weniger: 100 mg) werden in eine 1 l-Rundkolben gefüllt. Anschließend wird ein Reagenzglas mit 10 ml der 10 % (v/v) HCl vor-sichtig eingesetzt und der Boden mit einem Stopfen verschlossen. Jetzt wird der 0-Wert angezeichnet. Beim Kippen der Flasche treibt die ausgeflossene HCl das CO2 des Bodens heraus, das mit Hilfe des U-Rohrs (mit H2O gefüllt) volumetrisch bestimmt werden kann. Vor der Messung wird eine Eichung mit 20, 50, 100 und 150 mg CaCO3 vorgenommen, die

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Menge des entweichenden CO2 am U-Rohr mit einem Stift markiert und in mm abgemes-sen.

Auswertung: Grafische Darstellung der Messungen und der Eichkurve.


7.4 Adsorption saurer und basischer Farbstoffe durch Bodenkolloide

Allgemeines: Bodenkolloide sind Bodenpartikel mit einem Teilchendurchmesser < 2 µm. Die wichtigsten Bodenkolloide sind Schichtsilikate, amorphe Minerale, Huminstoffe und Fe-, Mn- und Al-Oxide (bzw. Hydroxide). Wegen ihrer geringen Größe haben die Boden-kolloide im Verhältnis zu ihrer Masse eine große Oberfläche. Diese Oberflächen tragen meist negative Ladungen, Ausnahmen sind jedoch möglich. Die Ladungen können mit chemischen Stoffen nachgewiesen werden.

Materialien: - feuchte gesiebte Pikiererde - angefeuchteter Quarzsand - Vermiculit

Chemikalien: keine

Geräte: - Reagenzglasständer und 4 Reagenzgläser - 4 Trichter und Rundfilter - 2 Pasteurpipetten - Spatel

Fertig angesetzte Lösungen: - 0,01 % (w/v) Methylenblau - 0,01 % (w/v) Eosin

Durchführung: Die mit Filterpapier ausgelegten Trichter werden zur Hälfte mit den jeweiligen Bodenpro-ben (mit Wasser angefeuchtet) gefüllt. Es werden zwei Trichter (d.h. zwei Ansätze) pro Bodenprobe vorbereitet. Der erste Ansatz wird mit etwa einem Volumen der basischen, positiv geladenen Methylenblau-Lösung versetzt und der andere Ansatz mit etwa einem Volumen der sauren, negativ geladenen Eosin-Lösung. Die Filtrate werden in Reagenzglä-sern aufgefangen. Die Farbtiefe des Bodenfiltrates ist ein Maß für die Adsorption des je-weiligen Farbstoffes. Ist der Durchlauf ungefärbt, hat eine vollständige Adsorption des Farbstoffes stattgefunden.

Auswertung: Diskutieren Sie die Bedeutung kolloidaler Bodenteile für die Pflanze.


Eosin Methylenblau

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8. KURS: CHLOROPLASTENPIGMENTE 06.01.2021

8.1 Vorversuch: Extraktion der Pigmente 8.2 Bestimmung des Chlorophyllgehaltes 8.3 Die Wirkung eines Herbizids - SAN 9789 (Norflurazon) 8.4 Dünnschichtchromatographische Trennung von Chloroplastenpigmenten --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

8.1 Vorversuch: Extraktion der Pigmente

Alle Gruppen stellen mit diesem Versuch die Pigmentlösung für die Versuche 2 – 5 her. Die Organisation erfolgt durch den Kursleiter.

Allgemeines: Photosynthesepigmente (Chlorophyll a, b, Carotinoide) sind wasserunlöslich und lassen sich mit Hilfe von organischen Lösungsmitteln leicht extrahieren.

Literatur: Schopfer: Experimentelle Pflanzenphysiologie. Band 2.

Materialien: - Blattmaterial aus dem Gewächshaus - Eisbad - Coleus oder Brennnessel

Chemikalien: - Quarzsand - CaCO3 - Acetongemisch (eisgekühlt)

Geräte: - Waage, Wägschälchen und Spatel - Mörser und Pistill - Trichter und Rundfilterpapier - 10 ml Messzylinder - skaliertes Reagenzröhrchen - Eisbad


Durchführung: Etwa 1g Blattmaterial (Frischgewicht genau protokollieren) werden abgewogen und im Mörser nach Zugabe einer Spatelspitze Quarzsand homogenisiert. Die Extraktion der Chlo-roplastenpigmente erfolgt mit gepuffertem Aceton, d.h. es wird eine Spatelspitze CaCO3 zugesetzt. Dazu werden 7 ml des Lösungsmittels schrittweise dem Homogenat zugegeben. Der Extrakt ist durch Filterpapier in ein skaliertes Reagenzröhrchen zu filtrieren und mit 2 ml Aceton nachzuspülen. Danach wird entweder auf 10 ml aufgefüllt oder das vorhande-ne Volumen genau abgelesen. Möglichst alle Schritte auf Eis, schnell und abgedunkelt durchführen, damit die Chlorophylle nicht abgebaut werden.


8.2 Bestimmung des Chlorophyllgehaltes

Allgemeines: Bei höheren Pflanzen bildet Chlorophyll a das Hauptphotosynthesepigment und Chlorophyll b ist nur zu etwa 1/3 der Konzentration des Chlorophylls a vorhanden. Da sich die Absorptionsspektren beider Chlorophylle unterscheiden ist eine quantitative Be-stimmung möglich.

Literatur: Schopfer: Experimentelle Pflanzenphysiologie. Band 2.

Materialien: - Pigmentextrakt aus Versuch 1

Chemikalien: - Extraktionsmittel (siehe Versuch1)

Geräte: - Spektrometer und 1cm Plastikküvetten


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- Pipette (1000 µl, 500 µl, 200 µl)

Durchführung: Die Extinktion von 2 ml der Chlorophylllösung aus Versuch 1 wird am Spektrometer bei 663 nm und 647 nm gemessen (Bezugsküvette: Extraktionsmittel). Die Extinktionswerte müssen zwischen 0,2 und 0,8 liegen. Dabei ist der Verdünnungsfaktor zu protokollieren und bei der Berechnung des Chlorophyllgehaltes zu berücksichtigen.

Auswertung: Die Berechnung des Chlorophyllgehaltes bei Verwendung dieses Extrakti-onsmittels (Ergebnisse in µg/ml) erfolgt nach folgender Beziehung: (Lichtenthaler, 1948)

Chlorophyll a: Chla = 12.25 E663nm – 2.79 E647nm

Chlorophyll b: Chlb = 21.5 E647nm – 5.1 E663nm

Die Ergebnisse sind im Protokoll jedoch als Chlorophyllgehalt pro g Frischgewicht anzuge-ben, da physiologische Fragestellungen nur so sinnvoll beantwortet werden können.


8.3 Die Wirkung eines Herbizids - SAN 9789 (Norflurazon)

Allgemeines: Einige „Bleichherbizide“ (z. B. Norflurazon) wirken hemmend auf die Bildung von Carotinoiden. In diesem Versuch soll die Bedeutung von Carotinoiden getestet wer-den.

Literatur: Schopfer oder Kutschera; Schopfer & Brennicke, Strasburger; Richter.

Materialien: - 14 d alte, autotroph vorkultivierte

Sprosse von Lemna gibba

- autoclavierte Kolben

Chemikalien: - keine

Geräte: - Impfnadel

Fertig angesetzte Lösungen: Pro Gruppe - Autotrophe Nährlösung für Lemnaceen

(„N“), 50 ml in 100 ml-Erlenmeyerkölbchen - Autotrophe Nährlösung, die 5 μM des

Herbizids Norflurazon (Sandoz, Basel) enthält, 50 ml in 100 ml-Erlenmeyerkölbchen.

Durchführung: In einen 100 ml-Erlenmeyerkolben mit autotropher Nährlösung wird eine definierte Zahl von Lemna-Sprossen mit einer Impfnadel übertragen (Kontrolle). Die Sicherheitswerkbank ist für diese Arbeiten nicht erforderlich, da in Abwesenheit von Zucker die Sterilitätsan-forderungen während einer Woche Kultivierungszeit gering sind (warum?). Eine gleiche Zahl von Sprossen wird in einen Erlenmeyerkolben mit ansonsten identischer Nährlösung übertragen, die jedoch 5 μM des Herbizids Norflurazon enthält. Die Kulturen werden im Gewächshaus weiter kultiviert und die Entwicklung der Sprosse beobachtet. Achtung: mit der Impfnadel kein Norflurazon in das Kontrollmedium verschleppen! Der Versuch ist nach vier Wochen abzubrechen und auszuwerten (03.02.). Bei Interesse kann der Versuch erweitert werden und z.B. die Norflurazon-Konzentration oder Lichtintensität variiert werden.


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Die Norflurazonabfälle werden gesondert gesammelt und entsorgt. Auswertung: Interpretation der beobachteten Ergebnisse mit Literaturhilfe.

8.4 Dünnschichtchromatographische Trennung von Chloroplastenpigmenten

Allgemeines: Die Dünnschichtchromatographie („TLC“) ist eine Adsorptionschromatogra-phie. Die Pigmente reichern sich entsprechend ihrer Affinität zum Adsorbens (Kieselgel) in räumlich getrennten Bereichen der Platte an. Bei der Dünnschichtchromatographie wird die unterschiedliche Polarität der Pigmente zu ihrer Auftrennung ausgenutzt. Materialien: - Pigmentextrakt aus Versuch 1 - Pigmentextrakt aus Versuch 3 (Ansatz 1 und 2) - Dünnschichtkieselgelplatten, auf 10x10 cm schnei-den - weicher Bleistift und Lineal

Chemikalien: keine

Geräte: - Chromatographiekammer mit Glasdeckel - Kapillaren (10µl) - UV-Lampe und Schutzbrille

Fertig angesetzte Lösungen: - Laufmittel: Benzin (100 - 140oC) : Aceton : Chloroform = 50 : 50 : 40

Durchführung: Das Laufmittel wird ca. 1 cm hoch in die Trennkammer eingefüllt, verschlossen und im Kühlschrank mindestens 30 min vorgekühlt und äquilibriert. Mit einem weichen Bleistift wird eine Startlinie 2 cm oberhalb des unteren Randes der Kieselgelplatte markiert. Dabei darf die Trägerschicht nicht beschädigt werden. Entlang dieser Linie werden im Abstand von 2 cm 3 Auftragszonen markiert. Tropfenweise werden 100 µl der Pigmentlösungen aus den Versuchen 1 und 3 mit einer 100 µl Glaspipette langsam auf jede der Auftragszo-nen aufgetragen. Das Lösungsmittel der vorausgegangenen Auftragung muss gut einge-trocknet sein, bevor neuer Extrakt aufgetropft werden kann (Ventilator betätigen). Dabei soll die Pipettenspitze möglichst nicht in unmittelbaren Kontakt mit dem Kieselgel gelan-gen, um die Trägerschicht nicht zu verletzen. Die Proben aus dem Versuch 1 müssen in deutlichem Abstand von denen aus dem Ver-such 3 aufgetragen werden, da die Essigsäure sonst das Laufverhalten der anderen Pro-ben beeinflusst.

Norflurazon (SAN 9789)

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Die getrocknete Dünnschichtplatte wird senkrecht in die Chromatographiekammer ge-stellt. Die Startlinie muss oberhalb des Laufmittels liegen. Wenn die Laufmittelfront ca. 2 cm vom oberen Rand der Platte angelangt ist (nach ca. 20 min) wird die Platte aus der Kammer genommen und die Laufmittelfront sofort mit einem Bleistift markiert. Bei der noch feuchten Platte werden unter dem Abzug die Banden mit einem Bleistift um-fahren. Die Platte wird anschließend unter der UV Lampe betrachtet.

Auswertung: Die Farbe der Banden und ihre Fluoreszenz werden protokolliert. Die Entfer-nung der Banden und der Laufmittelfront wird gemessen und die entsprechenden Rf-Werte berechnet.

Mit Hilfe der folgenden Tabelle können die einzelnen Banden identifiziert werden. Pigment Farbe Fluoreszenz

Front

-Caroten orange -

Phaeophytin a grau bitte prüfen

Phaeophytin b grüngrau bitte prüfen

Chlorophyll a blaugrün rot

Chlorophyll b gelbgrün rot

Lutein gelb -

Violaxanthin gelb -

Neoxanthin gelb -

Start Chlorophyllid/in grün rot

Hinweis: Im Schulversuch kann Tafelkreide als Trägerschicht verwendet werden. Zur Vor-bereitung wird die Kreide mehrmals ca. 0,5 cm in Methanol getaucht und zur Aufkonzent-rierung zwischendurch getrocknet. Als Laufmittel dient dann Ethanol. Wir bitten eine Gruppe sich besonders diesem Teil zu widmen und das Protokoll so aus-zuarbeiten, dass es als Erweiterung in das Pflanzenphysiologische Praktikum als Schulver-such aufgenommen werden kann.


8.5 Nachweis von Sekundärcarotenoiden

Allgemeines: Carotenoide werden den sekundären Pflanzenwirkstoffen zugerechnet und kommen in vielen Pflanzen vor. Charakteristisch für die Carotenoide sind zahlreiche kon-jugierte Doppelbindungen, die den Verbindungen eine gelbe – rote Farbe verleihen. Zu

den Carotinoiden zählen z. B. das -Caroten (oranger Farbstoff der Möhre) oder Lycopin (roter Farbstoff der Tomate). Sie sind aber auch in Spinat, Broccoli, Salat, Bohnen oder Orangen anzutreffen. Die Färbung von reifem Paprika basiert auf einem Carotenoid-Gemisch, in dem neben Crypto- u. Zeaxanthin, Lutein u. Capsorubin bis zu 35% Capsanthin enthalten sind.

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Carotenoide lassen sich aus biologischem Material durch Extraktion mit unpolaren Lö-sungsmitteln gewinnen. Die Wellenlänge der Absorptionsmaxima hängt von der Länge der absorbierenden Chromophoren, d. h. der Anzahl der konjugierten Doppelbindungen ab.

Materialien: - Reaktionsgefäße („Epis“) - verschieden gefärbte Paprika - Dünnschichtkieselgelplatten - weicher Bleistift und Lineal

Chemikalien: - Quarzsand - Chloroform zur Extraktion

Geräte: - Messer - Wägschälchen - Mörser und Pistill - Kühlschrank - 10 ml Messzylinder - Trichter und Rundfilter -Reagenzröhrchenständer und Reagenzröhrchen - Pipetten (1000 µl, 50 µl); Kapillarröhrchen - Chromatographiekammer mit Glasdeckel - Chromatographieplaten, 10x10 cm - 20 ml Becherglas

Fertig angesetzte Lösungen: - Laufmittel: Aceton : Benzin (100-140oC) : Chloroform = 50:50:40

Durchführung: 10 g Paprika werden mit einem Messer in kleine Stücke geteilt und im Mörser unter Zuga-be einer Spatelspitze Quarzsand homogenisiert (auf Eis). Die Extraktion der Carotenoide erfolgt mit 10 ml Chloroform. Dazu wird das Lösungsmittel schrittweise zum Homogenat gegeben und der Extrakt durch Filterpapier in ein Reagenzröhrchen filtriert Wir verwenden probeweise einmal beide Laufmittel in diesem Praktikum. Das Laufmit-tel wird ca. 1 cm hoch in die Trennkammer eingefüllt, verschlossen und für mindestens 30 min äquilibriert. Mit einem weichen Bleistift wird eine Startlinie 2 cm oberhalb des unte-ren Randes der Kieselgelplatte markiert. Dabei darf die Trägerschicht nicht beschädigt werden. Entlang dieser Linie werden tropfenweise nebeneinander die Extrakte verschie-dener Paprika aufgetragen. Die Kapillarröhrchen sollten beim Auftragen die Trägerschicht nicht zu verletzen. Die getrocknete Dünnschichtplatte wird senkrecht in die Chromatographiekammer ge-stellt. Die Startlinie muss oberhalb des Laufmittels liegen.

Auswertung: Geben Sie den Rf-Wert (vgl. Versuch 8.5. Dünnschichtchromatographie von Chloroplastenpigmenten) und die Absorptionskurve eines der Hauptcarotinoide an.

Versuchsdauer: ca. 50 min: 30 min Extraktion und Messung und 20 min Chromatographie. Hinweis: Die Versuche 1, 4 und 5 (modifiziert durch Filterpapier bzw. weiße Strassenkrei-de) sind als Schulversuch geeignet.

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9. KURS: PHOTOSYNTHESE 13.01.2021

9.1 Nachweis der O2-Abgabe (Glimmspanversuch) 9.2 C3- und C4-Pflanzen 9.3 Regulation der Stomata 9.4 Nachweis von Assimilationsstärke

9.1 Nachweis der O2 Abgabe (Glimmspanversuch)

Allgemeines: Ziel des Versuchs ist es, die Sauerstoffproduktion von grünen Pflanzen im Licht und im Dunkeln zu ermitteln. Dazu muss zügig gearbeitet werden.

Literatur: Kutschera, Schopfer/Brennicke, Richter

Materialien: - Wasserpest oder Laubmoos (Leptodictyum riparium) oder Wasserlinsen, z.B. Wolfia arrhiza oder Lemna trisulca. Die Pflanzen soll-ten einige Stunden in Dunkelheit stehen, be-vor sie verwendet werden. - Glasgefäße -Streichholz

Chemikalien:

Geräte: - starke Lichtquelle (Fluoreszenzröhren oder Tageslicht) - etwas zum Dunkelstellen


Durchführung: Man überträgt je einen möglichst großen Spross Wasserpest oÄ in ein Glasgefäß und stellt es ins Dunkle, das andere ins möglichst starke Licht (Weißlicht). Nach ca 1-2 Stunden wird das Glas vorsichtig angehoben und ein frisch ausgeblasenes Streichholz hineingehalten.

Versuchszeit: ca. 1 – 2 Stunden

Auswertung: Was passiert mit dem glühenden Streichholz bei den verschieden gelagerten Pflanzen?

9.2 C3- und C4-Pflanzen

Allgemeines: In diesem Versuch wird der Stoffwechsel der C3- und C4-Pflanzen beobach-tet. Der Versuch wird nach 2 Stunden eigenverantwortlich ausgewertet.

Fragen zu Ihrer Vorbereitung (bitte nicht ins Protokoll): 1. Was ist unter dem Kohlendioxid-Kompensationspunkt zu verstehen? 2. Vergleichen Sie C3-und C4-Pflanzen in struktureller Hinsicht! 3. Vergleichen Sie die Energiebilanz beider Stoffwechseltypen!

Literatur: Schopfer II, Schopfer & Brennicke

Materialien: Aussaat drei Wochen vor Versuch, Empfehlung: Zea mays und Phaseolus vulgaris. Pasteurpipette, Folie zum Abwiegen, Spatel, 2 x 500-ml-Bechergläser, Glasstab, 500-ml- Messzy-linder, „Dunkel-Kisten“

Chemikalien: -

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Pro Gruppe: - 4 x gut verschließbare Einweckgläser - 4 x kleine Plastikbecher (100 ml)

Geräte: Waage starke Lichtquelle (Halter mit Fluoreszenzröhren)

Fertig angesetzte Lösungen: Cresolrot-Indikatorlösung (50 mg in 1 ml Ethanol vorlösen und ad 50 ml mit Wasser). Stammlösungen 1 M KCl und 10 mM NaHCO3

Durchführung: Folgende Lösungen werden vor Versuchsbeginn durch Mischen der beiden Stammlösun-gen frisch hergestellt: 0,1 mM NaHCO3-Lösung in 0,1 M KCl.

Teil a) Das Becherglas wird zu 4/5 mit Leitungswasser gefüllt und auf den Boden des Einweckgla-ses gestellt. In das Einweckglas wird soviel der NaHCO3-Lösung (mit einigen Tropfen Indi-katorlösung versetzt bis Farbe deutlich ist) gegeben, dass die Lösung etwa 1 cm hoch-steht. In das Becherglas wird eine der beiden Pflanzen gestellt und entweder in starkes Licht übertragen oder in Dunkelheit 2 h aufbewahrt. Daraus ergeben sich vier Varianten: (i) Mais-Pflanze, Dunkelheit, (ii) Mais-Pflanze, Licht, (iii) Bohnenpflanze, Dunkelheit, (iv) Bohnenpflanze, Licht. Das Einwegglas muss gut verschlossen werden.

Teil b) Theoretischer Teil Was würden Sie erwarten, wenn folgender Versuch ausgeführt würde: Zwei Bechergläser werden in ein Einweckglas gestellt und mit einer Mais-Pflanze und mit einer Bohnenpflanze bestückt. Das gut verschlossene Einweckglas wird ins Tageslicht ge-stellt und nach einer Woche ausgewertet

Versuchszeit: ca. ½ Stunde (ohne Wartezeit) + 15 min für Auswertung

Auswertung: Teil a) Beobachtung des Farbumschlages in der NaHCO3-Lösung unmittelbar nach Beendigung des Versuchs nach 2 h (praktisch bedeutet das: möglichst lange) starker Belichtung bzw. in Dunkelheit. Teil b) Begutachtung der Pflanzen nach einer Woche. Welche Pflanzenart ist danach in einem besseren Zustand? Warum?

9.3 Regulation der Stomata

Allgemeines: Stomata bestehen aus zwei chloroplastenführenden Schließzellen, die Idio-blasten darstellen, d.h. sie sind in das Epidermisgewebe eingestreute Zellen mit abwei-chendem morphologischen und physiologischen Charakter. Die wichtigsten Reize, auf die Stomata reagieren, sind das Licht, die CO2 Konzentration im Blattgewebe, sowie die Was-serversorgung der Pflanze. Trockenstress führt zur Bildung des Phytohormones ABA in Wurzeln und Blättern. ABA wird über das Xylem in die Schließzellen transportiert und in-duziert in wenigen Minuten den Spaltenschluss.

Materialien: - Blätter von Vicia faba Pflanzen

Chemikalien: -

Geräte: Evtl. Pflanzenlampe Eppis Karton Rasierklinge

Fertig angesetzte Lösungen: ABA-Lösung 10-3 M pH5-6!

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Knetmasse

Durchführung: Ein Teil der Versuchspflanzen wird für mehrere Stunden unter eine Pflanzenlampe gestellt („Lichtpflanzen“), der andere Teil wird unter dem Karton für mehrere Stunden im Dunkeln gehalten („Dunkelpflanzen“). Diese Vorbereitungen des Versuchs wurde von den Betreu-ern durchgeführt. Tauchen Sie nun ein Blatt von einer intakten „Lichtpflanze“ in eine Schale mit Wasser und schneiden Sie den Blattstiel unter Wasser mit einer Rasierklinge ab. Stellen Sie den Blattstiel des abgetrennten Blattes dann sofort in ein Eppi, das mit ei-ner ABA-Lösung gefüllt ist und befestigen Sie die Eppis mit Knetmasse auf dem Tisch unter der Pflanzenlampe („ABA-Lichtblatt“). Achten Sie darauf, dass die Schnittfläche des Blatt-stiels stets Kontakt zur ABA-Lösung behält und füllen Sie ggf. Lösung nach. Nach ca. 1,5h wird der Versuch ausgewertet. Dazu werden nacheinander a) ein Blatt einer „Lichtpflan-ze“, b) ein Blatt einer „Dunkelpflanze“ und c) das ABA-Lichtblatt“ als Totalpräparat mikro-skopiert.

Auswertung: Beobachten Sie in jedem der 3 untersuchten Blätter etwa 20 Stomata. Beur-teilen Sie deren Öffnungszustand indem Sie ihn als "offen“, „halb geöffnet“ oder „ge-schlossen“ klassifizieren. Tragen Sie die Werte in die Tabelle ein. Erfragen Sie für das Pro-tokoll auch der Werte der anderen Gruppen.

„Lichtpflanze“ „Dunkelpflanze“ „ABA-Lichtblatt“

Offen Halb-offen

Geschlossen Offen Halb-offen

Geschlossen Offen Halb-offen

geschlossen

Anzahl Stomata (n=20)

Anzahl Stomata (n=ca 80; Kurs)

Prozentsatz

Welche Reize bewirken im Versuch ein Öffnen und welche einen Verschluss der Stomata? Wie könnte man sich ein CO2-Mangel im Blatt auf die Stomata auswirken und wodurch könnte dieser Mangel hervorgerufen werden? Mutmaßen Sie aufgrund der Versuchser-gebnisse, welcher Reiz den Öffnungsgrad der Stomata stärker beeinflusst: das Lichtange-bot oder Wassermangel?

Versuchszeit: ca.2h, davon 1,5h Inkubationszeit.

9.4 Nachweis von Assimilationsstärke

Allgemeines: Stärkenachweise in grünen Blättern lassen sich mit verschiedenen nicht zu derben Blättern, z.B. Buchenblätter oder die Blätter der Zimmerlinde, gut durchführen. Die Pflanzen müssen vorher ausreichend assimiliert haben. Führt man die Versuche am Nachmittag durch reicht in der Regel das Sonnenlicht; bei Durchführung am Morgen ist eine künstliche Beleuchtung z.B. mit einer Schreibtischlampe über vier Stunden zu emp-fehlen.

Literatur: Kutschera, Schopfer/Brennicke, Richter

Materialien: Chemikalien:

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- verschiedene grüne Blätter -Wasserpest

- Alkohol

Geräte: - starke Lichtquelle (Fluoreszenzröhren oder Tageslicht) - etwas zum Dunkelstellen

- Wasserbad

- Pinzetten - Petrischalen - Gläser

Fertig angesetzte Lösungen: - Lugol‘sche Lösung

Durchführung: A Die Blätter werden zunächst kurz in einem Wasserbad gekocht und einige Minuten stehen gelassen. Dadurch werden die Zellen aufgeschlossen, so dass die folgende Chloro-phyllextraktion mit Alkohol zuverlässiger klappt. Ein Glas wird mit Alkohol soweit gefüllt, dass ein Blatt gut darin untertaucht. Das Glas wird fest zugeschraubt und in einem Was-serbad bei ca 80°C einige Minuten getaucht. Nach dem Alkoholbad sollte man das dann etwas spröde Blatt nochmals kurz in Wasser aufkochen. In einer Petrischale wird das Blatt mit Lugol’scher Lösung beträufelt. B Ein Blatt der Wasserpest wird abgerissen und direkt in Lugol’scher Lösung mikro-skopiert. Beobachten Sie genau die Abrisskante des Blattes.

Versuchszeit: ca. 1 – 2 Stunden

Auswertung: Beobachten Sie die entstehende Färbung.

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10. KURS: ENZYMOLOGIE 20.01.2021

10.1 Meerrettich-Peroxidase 10.2 Nachweis von α- und ß-Amylase-Aktivität 10.3 In-vivo-Bestimmung der Nitratreduktase-Aktivität 10.4 Kartoffel-Katalase-Versuch 10.5 Urease aus Sojabohnen -----------------------------------------------------------

10.1 Die kinetische Charakterisierung des Enzyms Meerrettich-Peroxidase

Literatur: Experimentelle Pflanzenphysiologie: Band 2 Einführung in die Anwendungen von Peter Schopfer. Besonders bei diesem Versuch sollten Sie den entsprechenden Abschnitt vor Versuchbe-ginn gelesen haben. Allgemeines:

Die Geschwindigkeit einer enzymkatalysierten Reaktion hängt von einer Vielzahl von Fak-toren ab. Im folgenden Experiment soll der Einfluss der Konzentrationen der Substrate am Beispiel der Peroxidase gemessen werden. Die Peroxidase dient der Entgiftung von Was-serstoffperoxid. Ihre Aktivität kann über die Oxidation und anschließende Kondensation von Guajakol bestimmt werden, wobei ein brauner Farbstoff entsteht. Guajakol ist ein in Guajak-Bäumen vorkommender sekundärer Pflanzenstoff, der sich strukturell vom Anisol und vom Phenol ableitet. Guajakol ist einer der Aromastoffe von Whisky und Kaffee. Man macht auch Vanillin daraus.

Die Reaktion verläuft in mehreren Teilschritten, von denen wir nur die zwei langsamsten betrachten (die Entstehung von Komplex I und die Reaktion von Komplex II mit Guajakol zum farbigen Tetraguajakol):

Durch die Wahl der Konzentrationen von H2O2 und GH kann entweder Teilreaktion 1 oder 2 zum langsamsten und damit geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Gesamtreakti-on gemacht werden.

https://de.wikipedia.org/wiki/Guajak

https://de.wikipedia.org/wiki/Sekund%C3%A4re_Pflanzenstoffe

https://de.wikipedia.org/wiki/Anisol

https://de.wikipedia.org/wiki/Phenol

https://de.wikipedia.org/wiki/Aromastoffe

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Materialien: - Meerrettichwurzel (im Kühlschrank

aufbewahren)

Chemikalien: - Wasserstoffperoxid, 1 mM und 4 mM frisch

verdünnen (die Ausgangslösung enthält 30

Gew.-% = 9,8 M) - Guajakol (Lösung: 20 mM = 220 μl in 100 ml

Reinstwasser, frisch ansetzen)

Geräte: - Spektrophotometer (436 nm, 25°C)

- Tischzentrifuge - Messer, Mörser, Schneidbrettchen

- Eisbad, Eppis 1,5 ml - Küvetten (1 cm)

- Uhr - Glaspipetten, Peleusbälle

- Schutzhandschuhe, Schutzbrille - Reagenzgläser (kurz)

- Nitrilhandschuhe (blau) - Bechergläser 100 ml

- Messzylinder 100 ml

Fertig angesetzte Lösungen: - Phosphatpuffer (50 mM, pH = 7,0)

Sicherheitshinweis: Wasserstoffperoxid wirkt stark oxidierend, auch auf menschlicher Haut! Bitte Schutzhandschuhe und Schutzbrille beim Verdünnen tragen. Unverdünntes Guajacol sollte im Abzug gehandhabt werden. Es reizt Haut und Augen.

Durchführung: Herstellung des Enzymextraktes: 0,250 g fein zerschnittene Stückchen Meerrettich mit 1 ml Puffer und einer Prise Sand in einem Mörser auf Eis homogenisieren. Wenn keine Partikel mehr erkennbar sind, Suspen-sion in Zentrifugenröhrchen (im Eisbad) gießen. Mörser mit 3 ml Puffer ausspülen, eben-falls in das Röhrchen geben. 2 x 1,5 ml der Suspension in ein Reaktionsgefäß („Eppi“) zum Zentrifugieren füllen. Danach Zentrifugation: Tischzentrifuge 10 min, 13.000 rpm (= U min-

1). Vom Überstand 1 ml abnehmen und mit 3 ml Puffer verdünnen (1+3-Verdünnung). Dies ist der Enzymextrakt. Hinweis: Die enzymatische Reaktion verläuft über verschiedene Teilreaktionen. Testansatz unter Verwendung von Teilreaktion 1: 0,4 ml Puffer + 1 ml Guajakol-Lösung + 0,05 ml Enzymextrakt in Küvette mischen (dann auf Raumtemperatur einstellen lassen). Leerwert messen. 0,05 ml H2O2-Lösung (1 mM) zugeben, mischen und Stoppuhr starten. Messung alle 10 s über 2 min. Testansatz unter Verwendung von Teilreaktion 2: Ebenfalls in eine Küvette pipettiert werden 1,4 ml Puffer, 0,025 ml Guajakol-Lösung, 0,05 ml Enzymextrakt. Die Reaktion wird mit 0,05 ml H2O2-Lösung (4 mM) gestartet und wie oben verfahren.

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Hinweis: Testansatz 1 sollte eine höhere Anfangsgeschwindigkeit haben als Testansatz 2. Warum ist das so? Die beiden vorverdünnten Wasserstoffperoxid-Lösungen (1 mM, 4 mM) sollten beim Ein-satz nicht älter als 10 min sein. Wenn die Küvette durch Bildung eines Farbstoffes von innen beschlägt, dann bitte zwi-schen 2 Messreihen mit Aceton reinigen und mit Reinstwasser nachspülen.


Auswertung: Bestimmen Sie die Anfangsgeschwindigkeiten der beiden Enzymreaktionen und vergleichen Sie die Geschwindigkeiten miteinander (siehe Schopfer Bd. II).

Die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion v0 wird nach dem Lambert-Beerschen Gesetz bestimmt.

Der molare Extinktionskoeffizient ԑ für Tetraguajakol ist 25,5 ∙ 103 l ∙ mol-1 ∙ cm -1. Es muss noch ein Verdünnungsfaktor einbezogen werden.

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10.2 Nachweis von α- und β-Amylase-Aktivität

Allgemeines: Amylasen werden z. B. zur Mobilisierung von gespeicherter Stärke benö-tigt, um nach erfolgter Keimung den Keimling mit Kohlenhydraten zu versorgen bevor die Photosynthese einsetzt. Ein klassischer Fall besteht in der Untersuchung der Stär-kemobilisierung bei der Karyopsenkeimung der Cerealien. Der Versuch ist nach einem Tag auszuwerten.

Literatur: Schopfer/Brennicke; Schopfer II, S. 53 + 59, S. 246-251

Materialien: - Gerstenkaryopsen oder Weizenkaryopsen

- am Vortag einquellen - trockene Karyopsen - Stärkeagar, ca. 30 Petrischalen pro Kurs - kleines Messer oder Rasierklinge - Pinzette - Parafilm

Chemikalien: keine

Geräte: keine

Fertig angesetzte Lösungen: Lugolsche Lösung (Iod-Iodkaliumlösung), 1:10 verdünnt zur Anwendung Lugolsche Lösung: 1 g Kaliumiodid in 5 ml Wasser lösen, dann 1 g Iod zugeben und danach mit Was-ser auf 300 ml auffüllen. Stärkeagar: 1% Agar und 0,2% lösliche Stärke, in Reinstwasser aufgekocht, in Petrischalen gegos-sen.

Durchführung: Eine Petrischale wird mit lufttrockenen, die andere Schale mit vorgequollenen Gerstenka-ryopsen folgendermaßen beschickt: die Karyopsen werden längs durchgeschnitten und mit der Schnittfläche auf den Agar gelegt (4 Hälften pro Schale). Nach 2-tägiger Aufbe-wahrung bei Zimmertemperatur (nicht länger!) entfernt man die Karyopsen und übergießt die Platte mit 1+4 (d.h. 1:5) verdünnter Lugolscher Lösung (22.01.). Beim Anschauen ge-gen Licht halten.


Auswertung: Die unterschiedlichen Reaktionen auf der Agarplatte sind zu charakterisieren (Skizze) und den Amylasen zuzuordnen.

10.3 In-vivo-Bestimmung der Nitratreduktaseaktivität

Allgemeines: Pflanzen benötigen für viele wichtige Stoffwechselprozesse u.a. Stickstoff. Dieses Makronährelement wird von den Pflanzen über die Wurzeln in maximal oxidierter Form (NO3

-) aufgenommen. Für die weitere Verwendung im Stoffwechsel müssen diese Nährelemente in ihre maximal reduzierte Form umgewandelt werden. Die Reduktion er-folgt in mehreren Schritten (siehe Lehrbücher). In diesem Versuch soll die Reduktion von Nitrat - als Maß für die Enzymaktivität - gemes-sen werden. Information: Der Zusatz von 1-Propanol stört die Intaktheit der Zellmembran und macht sie teilweise für niedermolekulare Stoffe durchlässig. Wofür ist diese Information wichtig?

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Vorbereitung durch den Versuchsbetreuer: Pro Gruppe werden etwa 2 g Frischsubstanz von Lemna gibba oder Lemna aequinocti-alis mindestens 30 min vor Versuchsbeginn in ca. 50 ml nitratfreie Nährlösung über-tragen, um überschüssiges Nitrat von den Pflanzen zu entfernen.

Literatur: Strasburger; Schopfer/Brennicke, Richter, Taiz / Zeiger

Materialien: - Lemna gibba oder Lemna aequinoctialis, nicht L. minor - Wägschälchen und Pinzette - 10 ml Messzylinder - 2 Reagenzgläser - 1 Becherglas - 2 x 25 ml Erlenmeyerkolben - Pipetten/Glaspipetten Siehe auch unter Hinweise!

Chemikalien: keine

Geräte: - Waage, - Spektrometer mit 1 cm Glas-Küvetten

Fertig angesetzte Lösungen: Nitritstammlösung 200 µM, 250 ml Nitratfreie N-Nährlösung, 1 L Reaktionsmedium (mit Nitrat): - 0,1 m Phosphatpuffer pH 7,5 - 0,02 m KNO3 - 5 % 1-Propanol (= n-Propanol) Kontrollmedium (ohne Nitrat): - 0,1 m Phosphatpuffer pH 7,5 - 5 % 1-Propanol Nachweisreagenz: - 1 % (w/v) Sulfanilamid in 1.5 M HCl

(SA) - 0,02 % (w/v) α-Naphthylethylendiamin-hydrochlorid in Wasser (NED) Vor Versuchsbeginn 1 + 1 gemischt (= SA-NED-Nachweisreagenz). Versuchsbetreuer

Durchführung:

1. Erstellen einer Eichkurve Ein oder zwei Gruppen sollten zunächst eine Standardkurve erstellen: Ausgehend von der Nitrit-Stammlösung (200 µM) werden durch Verdünnung die folgenden Konzentrationen hergestellt: 200 µM, 160 µM, 120 µM, 80 µM, 40 µM und Kontrolle (0 µM). Von diesen Konzentrationen werden jeweils 1.6 ml entnommen und 2.4 ml SA-NED-Nachweisreagenz zugegeben. Nach frühestens 10 min, nicht später als nach 1 h, wird die Extinktion im Spektro-photometer bei 540 nm vermessen. Die Extinktion (x-Achse) ist gegen die Konzentration (y-Achse) aufzutragen und der Anstieg ist zu berechnen (lineare Ausgleichrechnung), was zu einer linearen Glei-chung der Gestalt: [Nitrit, µM] = a x Ext(540nm) führt. Das Glied a stellt dabei den Anstieg im Diagramm dar und sollte im Bereich von 0.05 liegen.

2. Untersuchung des Pflanzenmaterials Nach Abtropfen des Pflanzenmaterials werden jeweils 1 g in 25 ml Erlenmeyerkol-ben mit 5 ml Reaktionsmedium bzw. 5 ml Kontrollmedium (ohne KNO3) gegeben

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und 30-60 min stehen gelassen (Zeit genau notieren!). Anschließend werden die Proben durch leichtes Schwenken durchmischt. Schließlich werden vom Medium jeweils 1,6 ml entnommen und mit 2,4 ml SA-NED-Nachweisreagenz versetzt. Nach 10 min wird der rote Farbkomplex bei 540 nm am Spektrometer (1 cm-Küvetten) gegen Reinstwasser gemessen. Die Messung der Blindprobe (Kontrolle) erfolgt ebenfalls gegen Reinstwasser. Die erhaltenen Werte werden voneinander subtrahiert (Extinktion Probe – Extinktion Blindwert).

Die Extinktionswerte werden anhand der Eichkurve zunächst in Konzentrationsangaben (µM gebildetes Nitrit) umgewandelt und danach in nmol NO2/g Frischsubstanz * Stunde umgerechnet. Das Ergebnis ist ein Maß für die Nitratreduktaseaktivität in den lebenden Zellen und wird daher als in vivo-Aktivität bezeichnet. Hinweis: Nitrit bildet in Verbindung mit Sulfanilamid (SA) und N-Naphthyl-(1)-ethylendiammoniumdichlorid (NED; vgl. Naphthylamin) einen roten Azofarbstoff, der als Maß für die gebildete Menge Nitrit quantitativ im Spektrometer bei 540 nm vermessen werden kann.

Versuchszeit: etwa 90 min

Auswertung: Berechnung der Enzymaktivität pro Gramm Frischgewicht.

10.4 Kartoffel-Katalase-Versuch

Allgemeines: Das Enzym Katalase kann das Zellgift Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff spalten. Es hat eine sehr hohe Wechselzahl. Auch Kartoffeln enthalten Kata-lase. Wenn man die Kartoffeln mit einer Reibe zerkleinert und die Masse auspresst und filtriert, erhält man einen Katalase-Rohextrakt. Die Reaktionsgeschwindigkeit des Wasserstoffperoxid-Abbaus kann anhand der in einer bestimmten Zeitspanne erzeug-ten Sauerstoffmenge gemessen werden. Eine elegante Lösung für einen Schülerver-such ist das Messen der Auftauchgeschwindigkeit von in Katalaselösung getauchten Filterpapierstückchen durch anhaftende Sauerstoffbläschen. Dazu bringt man die Fil-terpapierstückchen in ein Gefäß mit einer H2O2-Lösung.

Materialien: - Filterpapier - Trichter - Locher

Chemikalien: - H2O2-Lösung 30% (Achtung, ätzend und blei-chend, Kittel und Handschuhe tragen!) - steriles Wasser

NED

SA

Naphthylamin

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- Kartoffelreibe, Schälmesser - großes Plaste-Becherglas für Kartoffelmasse - 2xBecherglas 250 ml - Messzylinder - 12 Bechergläser 100 ml - 6 Messzylinder 25 ml - 6 Messzylinder 50 ml - Pipetten und Spitzen - Pinzette - Stoppuhr

- Katalase Lösung

Geräte: keine


Durchführung:

Erzeugen Sie mithilfe eines Lochers 60 Filterpapierblättchen.

Herstellung der Katalase-Lösung:

Reiben sie eine Kartoffel (geschält) in einen Messbecher. Schlämmen Sie die Masse mit etwas Wasser (25 ml) auf. Filtrieren Sie die Kartoffelmasse (hierzu eignet sich auch ein Kaffeefilter).

a) Einfluss der Enzymkonzentration auf die Reaktionsgeschwindigkeit

Stellen Sie folgende Verdünnungen der Katalaselösung in 6 Messzylindern her (Anga-ben in ml):

Messzylinder Nr. 1 2 3 4 5 6

ml Katalaseextrakt 20 12 6 3 1 0

ml dest. Wasser 0 8 14 17 19 20

Füllen Sie je 50 ml 1%-ige H2O2-Lösung in die sechs Bechergläser. Tauchen Sie mit der Pin-zette ein Filterpapierblättchen kurz (1 s) in Messzylinder 1, um es mit Katalaselösung zu benetzen. Lassen Sie es in das erste Becherglas fallen. Messen Sie die Zeitspanne vom Eintauchen bis zum Auftauchen des Blättchens. Wiederholen Sie das Vorgehen für jede Konzentration fünfmal. Spülen Sie die Pinzette vor der nächsten Konzentration kurz in Wasser ab!

Stellen Sie die Mittelwerte der Ergebnisse in einem Liniendiagramm dar! Erläutern Sie den Zusammenhang zwischen der Enzymkonzentration und der Reaktionsgeschwindigkeit anhand der Versuchsergebnisse!

b) Einfluss der Substratkonzentration auf die Reaktionsgeschwindigkeit

Stellen Sie sechs H2O2-Konzentrationen her und befüllen Sie sechs Bechergläser! Be-rechnen Sie die erhaltenen Konzentrationen!

Messzylinder Nr. 7 8 9 10 11 12

ml 30% H2O2-Lösung 8 5 3 2 1 0

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ml dest. Wasser 42 45 47 48 49 50

H2O2-Konzentration in %

Verwenden Sie eine der Enzymkonzentrationen aus Versuch a). Wiederholen Sie das Vorgehen aus dem vorigen Versuch für jede H2O2-Konzentration fünfmal.

Stellen Sie die Mittelwerte der Ergebnisse in einem Liniendiagramm dar! Erläutern Sie den Zusammenhang zwischen der Substratkonzentration und der Reaktionsgeschwin-digkeit anhand der Versuchsergebnisse!

Als Hemmstoff kann man CuSO4 ausprobieren!

Versuchszeit: ca. 1 h

10.5 Urease aus Sojabohnen

Allgemeines: Urease katalysiert die Hydrolyse von Harnstoff in Kohlendioxid und Ammo-niak. Sie kommt hauptsächlich in Samenkörnern, Mikroorganismen und Wirbellosen vor. In Pflanzen ist Urease ein Hexamer – sie besteht aus sechs gleichen Ketten – und befindet sich im Zytoplasma. Die Urease hydrolysiert den Harnstoff aber nur zum Teil: Es bildet sich primär die Carbamidsäure (auch "Carbaminsäure" genannt), die spontan zerfällt. Die Carbamidsäure ist übrigens die einfachste Aminosäure!

Die von der Urease katalysierte Reaktion:

Materialien: - Pasteurpipetten oder ein Plastikstrohhalm, um die Lösungen umzufüllen - 6 Reagenzgläser und ein Reagenzglasständer - Rotkohl -Sojabohnen

Chemikalien: - 20 ml 10%ige Harnstoffdünger-Lösung (Harn-stoffdünger: ein festes Düngemittel aus reinem Harnstoff) - 5 ml 10%ige Zitronensäure (oder andere Lösung mit niedrigem pH-Wert) - 5 ml 10%ige Natriumbikarbonat-Lösung (NaHCO3) (oder andere Lösung mit hohem pH-Wert) - 40 ml Rotkohlindikator, wie unten beschrieben vorbereitet - 10 ml destilliertes Wasser

Geräte: Stabmixer

Fertig angesetzte Lösungen: - 10 ml Sojabohnenauszug, wie unten beschrieben

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Kaffeefilter Trichter Bechergläser

vorbereitet (aus 1g getrocknete Sojabohnen)

Vorbereitung:

Herstellung des Rotkohlindikators

1. Zwei große Rotkohlblätter in Streifen schneiden und in einen hitzbeständigen Behälter geben, zum Beispiel ein Becherglas. 200 ml kochendes Wasser dar-über gießen, so dass alle Blätter vollständig bedeckt sind.

2. Die Flüssigkeit nach 5 Min. umfüllen und abkühlen lassen.

3. Die Blätter wegwerfen.

Herstellung des Sojabohnenauszugs (enthält die Urease und wird von den Hiwis vorbe-reitet)

1. Die Sojabohnen 1 h lang (besser über Nacht) in Wasser einweichen.

2. Die eingeweichten Bohnen zusammen mit etwa 10 ml Wasser pro Gramm tro-ckener Sojabohnen (das Einweichwasser kann hierzu verwendet werden) etwa 5 Min. lang mit dem Stabmixer pürieren, bis eine glatte Mischung entsteht.

3. Das Sojabohnenpüree filtern, dafür einen Kaffeefilter im Trichter verwenden.

4. Das Filtrat auffangen und aufheben, es enthält Urease.

Durchführung:

Die unten angegebenen Volumina sind für Standard-Reagenzgläser (≈10 ml) vorgese-hen.

Zunächst soll untersucht, wie der pH-Wert die Farbe des Rotkohlauszugs beeinflusst:

1. 3 ml Rotkohlindikator in je drei Reagenzgläser füllen.

2. Zwei Tropfen Zitronensäure-Lösung in das erste Reagenzglas geben. Mischen und die Farbänderung beobachten. Nach dem Hinzufügen jeder Komponente die Pipette mit Wasser spülen.

3. Zwei Tropfen Natriumbikarbonat-Lösung in das zweite Reagenzglas geben. Mi-schen und die Farbänderung beobachten.

4. Zwei Tropfen destilliertes Wasser in das dritte Reagenzglas geben. Mischen und die Farbänderung beobachten.

5. Die Farben aller drei Reagenzgläser vergleichen. Die Gläser als Referenz zur Sei-te stellen.

Nun wird die Wirkung von Sojabohnen-Urease auf Harnstoff untersucht.

1. Je 2 ml Rotkohlindikator in drei weitere Reagenzgläser füllen.

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2. In zwei dieser Reagenzgläser je 2 ml Harnstoff zugeben. Die Farbe beobachten.

3. Jeweils 2 ml der Soja-Suspension in eins der beiden Gläser mit Harnstoff und in das dritte Glas ohne Harnstoff geben.

4. Die Farben und Gerüche der Mischungen in allen Reagenzgläsern vergleichen. Diese Beobachtungen nach 3 min wiederholen.

Auswertung:

Dokumentation der Ergebnisse mit Fotos.

Welcher Farbstoff ist im Rotkohl enthalten? Wozu dient dieser Farbstoff bei „norma-len“ Pflanzen (die nicht speziell auf seine Anreicherung gezüchtet wurden)?

Erklären Sie die Reaktion des Rotkohlindikators auf die Referenzlösungen und auf Harnstoff mithilfe der allgemeinen Strukturformel dieser Farbstoffklasse (Abb. unten). Vergleichen Sie die dargestellten Moleküle und geben Sie an, welche Veränderung bei der jeweiligen Versuchslösung zur Farbänderung führt und warum (was passiert mit dem Molekül, wenn man Citronensäure usw. zugibt und warum).

Versuchszeit: ca. 1 h

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11. KURS: ATMUNG UND GÄRUNG 27.01.2021

11.1 Entwicklung von CO2 bei der Atmung und Temperaturabhängigkeit der Atmung 11.2 Vergärung verschiedener Kohlenhydrate 11.3 Baumannscher Versuch (Eisen-katalysierte Elektronenübertragung; Demoversuch) -----------------------------------------------------------------------------------------------------

11.1 Entwicklung von CO2 bei der Atmung und Temperaturabhängigkeit der Atmung

Allgemeines: In diesem Versuch wird die Temperaturabhängigkeit der Atmung bei ein-gequollenen Samen beobachtet.

Literatur: Schopfer & Brennicke (zu den Prinzipien)

Materialien: Samen von Lepidium sativum oder Linum werden etwa 15 Stunden bei Zimmertemperatur einge-quollen(Vorabend). Versuchsbetreuer.

- pro Gruppe 4 x 50 ml Erlenmeyerkolben mit passenden Gummistopfen (Weithals)

- Filterpapier und Trichter - 4 - 6 Büretten - 4 - 6 250 ml Bechergläser - 4 - 6 x 10 ml Glaspipetten - Mull, Schere - 4 - 6 Pasteur-Pipetten

Chemikalien: keine

Geräte: Trockenschrank Kühlschrank

Fertig angesetzte Lösungen: 50 mM Ba(OH)2 filtriert 100 mM Oxalsäure Phenolphthalein-Lösung (0,1% in 70%igem Etha-nol)

Durchführung: Je zwei aus Mull gefertigte Beutel mit jeweils 10 g eingequollenen Samen werden in Er-lenmeyerkolben gehängt, die mit 10 ml Ba(OH)2 beschickt sind. Die Samen dürfen nicht in die Lösung eintauchen. Gleichzeitig werden zwei Kolben ohne Samen als Blindproben vor-bereitet. Die mit Gummistopfen gut geschlossenen Gefäße, jeweils mit und ohne Samen, werden 1 Stunde bei verschiedenen Temperaturen aufgestellt (Kühlschrank und 30°C Tro-ckenschrank). Nach Abschluss des Versuches wird das Ba(OH)2 mit 1 – 2 Tropfen Phenolphthalein-Lösung versetzt und bis zur Entfärbung mit eingestellter Oxalsäure titriert. An gleichzeitig angesetzten Blindproben ermitteln wir den ursprünglichen Titer der Lauge; aus der Ab-nahme der Laugenmenge berechnen wir die Menge des gebundenen CO2. Vielleicht kön-nen sich mehrere Gruppen absprechen.

Versuchszeit: ca. 2 Stunden

Auswertung: Grafische Darstellung (Verhältnis zwischen der Atmung, ausgedrückt als Menge an CO2, und der Temperatur), Interpretation.

Frage zum Nachdenken: Warum wird bei der Rücktitration Oxalsäure und nicht ganz einfach Salzsäure verwendet?

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11.2 Vergärung verschiedener Kohlenhydrate

Materialien: 2 ml-Pipetten 10 ml-Pipetten 250 ml-Plastikbecher Kl Bechergläser Gärgefäße mit Skala, 7 pro Gruppe Bäckerhefe guter Qualität

Chemikalien: keine

Geräte: Wärmeschrank (30oC) oder Raumtemperatur

Fertig angesetzte Lösungen: je 10%ige Lösungen von Glucose, Fructose, Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Arabinose, +H2O Blindprobe

Bei diesem Versuch sollten ausnahmsweise immer zwei Gruppen zusammenarbeiten.

Durchführung: Ein Stück Presshefe (nur beste Qualität wird akzeptiert) wird zunächst in Wasser (Endvo-lumen 200 ml) suspendiert. Von dieser Suspension werden je 2 ml in Gärgefäße gefüllt. Die Gärgefäße werden danach mit 10 %igen (w/v) Lösungen folgender Zucker beschickt: Glucose, Fructose, Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Arabinose. Zur Füllhöhe: nur bis unterhalb des Bauches der Gärröhrchen! Die Gärgefäße werden entweder im Wärme-schrank bei 30oC und bei Raumtemperatur aufgestellt. Die Ablesung der entwickelten CO2-Mengen erfolgt nach 30 min und nach einer Stunde.

Versuchszeit: etwa 2 Stunden Beobachtung

Auswertung:- Tabellarische Darstellung und Diskussion; ordnen der Zucker (Einfach, Zwei-fach…und Bestandteile)

11.3 Baumannscher Versuch (Eisen-katalysierte Elektronenübertragung)

Literatur: Schopfer II.

Materialien: keine

Chemikalien: Cystein Eisen(III)sulfat Fe2(SO4)3 EDTA-Na2

NaHCO3

Geräte: Messzylinder

Fertig angesetzte Lösungen: 0.1 M Acetatpuffer pH 6.6, pro Gruppe 50 ml

Durchführung Eine Cysteinlösung wird frisch hergestellt: 1 g in 50 ml 2,1g NaHCO3. Zu dieser Lösung werden 0.05g Fe2(SO)3 gegeben und durch Schütteln gelöst. Die Farbreaktion beim Schüt-teln und beim nachfolgenden Stehen wird beobachtet. Nach Zugabe einer Spatelspitze EDTA-Na2 verändert sich die Farbreaktion. Anstelle des EDTA-Na2 könnte eine Spatelspit-ze KCN zum gleichen Zweck verwendet werden – was wir aus Sicherheitsgründen aber besser bleiben lassen.

Versuchszeit: 20 min

Auswertung: Beobachten und interpretieren Sie die Farbänderungen! Stellen Sie eine Re-aktionsgleichung unter Einbeziehung von Cystein, Fe3+/Fe2+ und Acetat auf.

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12. KURS: SÄUREN, SEKUNDÄRE PFLANZENSTOFFE+MOLEKULARBIOLOGIE 22.01.2020

12.1 Bestimmung der Azidität in Wein 12.2 Nachweis von Ascorbinsäure in pflanzlichen Produkten 12.3 Nachweis von Aesculin und Fraxin (Demoversuch) 12.4 DNA-Isolierung 12.1 Bestimmung der Azidität in Wein

Allgemeines: Es werden potentielle Azidität und aktuelle Azidität in Wein und in Trauben-saft bestimmt. Die Ergebnisse sollen interpretiert und zur Qualitätscharakterisierung her-angezogen werden. Wiederholen Sie den Schulstoff über pH-Werte.

Literatur: Schopfer & Brennicke (bezüglich Prinzipien)

Materialien: - Apfelwein; Apfelsaft - Traubensaft, weiß; Weißwein - kl Gläser - 4 Büretten, Trichter und Ständer - 1 x 250 ml Becherglas pro Gruppe - 2 x 250 ml weithals Erlenmeyerkolben pro Grup-pe - Pasteur-Pipetten - 2 - 4 x 25 ml- Messzylinder - pH-Indikator (Unitest-Papier), Pinzette

Chemikalien: keine

Geräte: pH-Messgerät

Fertig angesetzte Lösungen: - 0,33 M NaOH - Bromthymolblau

Durchführung: a) Potentielle Azidität (Titrationsazidität) Wein und Saft werden mit 0,33 M NaOH titriert. Dazu werden 20 ml Saft oder Wein 1 + 4 mit 80ml Wasser verdünnt ( bei der Berechnung berücksichtigen!), 25 ml davon in Erlen-meyerkolben eingefüllt und 2 bis 3 Tropfen Bromthymolblau dazu gegeben. Die Bürette wird bis zu einem Eichstrich mit NaOH gefüllt. Die NaOH-Lösung wird tropfenweise in den Saft/ den Wein gegeben, bis der Farbumschlag von rot-violett nach grün erfolgt. Die An-zahl der ml verbrauchter NaOH x 5 gibt die titrierbare Gesamtsäure in g Weinsäure/ l an. b) Aktuelle Azidität In Saft bzw. Wein wird mit pH-Indikator (z. B. Unitest-Papier) und vergleichsweise elekt-rometrisch die aktuelle Azidität (d. h. der pH-Wert) ermittelt.

Versuchszeit: 1a: 30 min; 1b: 10 min

Auswertung: Interpretation der Befunde

Hinweise: 1. Wenn man 0,1 M NaOH statt 0,33 M NaOH verwendet, so muss entsprechend umge-rechnet werden. 2. Richtwerte Azidität: 4,5-6,7g/l normal <5g/l gering >7,5g/l stark

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12.2 Nachweis der Ascorbinsäure in pflanzlichen Produkten

Allgemeines: In diesem Versuch werden die Presssäfte verschiedener Früchte aufgrund ihres Vitamin C-Gehalts verglichen. Jede Gruppe sollte mindestens eine Frucht mitbrin-gen, an der Interesse besteht. Auch Fruchtsaftgetränke sind möglich.

Literatur: Schopfer & Brennicke (Prinzipien)

Materialien: - verschiedene Früchte, keine Kiwi - Nachweispapier (Tillman´s Reagenz) - Pasteur-Pipetten (4 - 6) - 9 Reagenzgläser mit Ständer - 3 x 1 ml Glaspipette

- 3 x 10 ml Glaspipette

Chemikalien: keine

Geräte: - Eppi-Ständer - Eppis - Zitronenpresse

Fertig angesetzte Lösungen: Ascorbinsäure-Stammlösung

Durchführung: Die Presssäfte verschiedener Früchte (auch Paprika aus Versuch 12.3 kann verwendet werden) werden in einer Tischzentrifuge in einem Reaktionsgefäß (1.5 ml) über 1 min bei 13.000 U min-1 abzentrifugiert. Der Überstand wird tropfenweise (kleine Tropfen und möglichst gleiche Mengen) auf das Nachweispapier aufgebracht. Bei Vorhandensein von Ascorbinsäure bilden sich Entfärbungszonen. Ist hingegen die Probe lediglich sauer, so entstehen rosa Flecke. Zur Abschätzung der Ascorbinsäure-Konzentration können gleich große Tropfen einer As-corbinsäure-Konzentrationsreihe (1:10, 1:100) auf das Indikatorpapier gebracht werden.

Versuchszeit: 30 min

Hinweise: 1. Der Nachweis erfolgt mit dem blauem Farbstoff 2,6-Dichlorphenol-Indophenol, das zur (gelben) Leukoform reduziert wird (Tillman´s Reagenz). Zur Herstellung desselben werden 5 mg 2,6-Dichlorphenol-Indophenol in 5 ml Reinstwasser unter Erwärmen gelöst. Mit die-sem Reagenz werden dann Streifen von Chromatographie-Papier getränkt, die nach dem Trocknen kühl, trocken und dunkel aufzubewahren sind. 2. Die Ascorbinsäure-Stammlösung hat folgende Zusammensetzung: 50 mg Ascorbinsäure werden in 10 ml einer 2%igen Phosphorsäure gelöst, sodass 1 ml 5 mg (5000 µg) enthält. 12.3 Nachweis von Aesculin und Fraxin Allgemeines: Cumarin-Derivate zeigen eine starke Fluoreszenz. Solche Verbindungen, die auch „Schillerstoffe“ genannt wurden, kommen beispielsweise in der Rinde der Rosskas-tanie (Aesculus hippocastanum) und der Esche (Fraxinus excelsior) vor. Aesculin ist das Glykosid aus Aesculetin und Glucose. Es fluoresziert blau. Fraxin, das vor allem in der Esche vorkommt, besitzt einen ähnlichen Aufbau, fluoresziert aber grünlich. Aesculin

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Literatur: Tausch & Paterkiewicz: "Fluoreszenz und Phosphoreszenz"; Praxis der Naturwissenschaften (Chemie), 39 (1988)

Materialien: - Rindenstücke (kleine Äste gehen auch) der Esche und Rosskastanie (Ahorn geht nicht!)

Chemikalien: keine

Geräte: - 2 x 250 ml Bechergläser - UV-Lampe und Schutzbrille


Durchführung: In jeweils mit Leitungswasser gefüllte Bechergläser werden Rindenstücke von der Esche und ein frisch geschnittener Rosskastanienzweig gebracht und mit UV-Licht bestrahlt.

Auswertung: Bei diesem Versuch ist kein schriftliches Protokoll erforderlich.


12.4 DNA-Isolierung

Allgemeines:

Materialien: - 1,5 ml Eppendorf Tubes

- Eis

Chemikalien: - Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol

- Isopropanol

- 80% Ethanol

- dest H2O

Geräte: - Homogenisator

- Zentrifuge

- Inkubator klein für Eppis

-Photometer

Fertig angesetzte Lösungen: - Lysispuffer (wird von den Hiwis vorbereitet)

Vorbereitung: Ansatz DNA-Lysispuffer für 500 ml: 7 M Harnstoff 210,21 g 0,3 M NaCl 8,77 g 5 mM Tris pH 8,0 3,03 g 1% Lauroylsarcosin 5,00 g 20 mM EDTA pH 8,0 3,72 g

Durchführung:

http://de.wikipedia.org/wiki/Bild:Esculin.svg

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1. je 3-4 Blätter in 1,5 ml Tubes in 500 µl Lysispuffer homogenisieren 2. 5 min bei 37°C inkubieren 3. unter Abzug arbeiten 4. 500 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol zugeben, sorgfältig und kräftig schütteln 5. 5 min bei 20°C max. Drehzahl zentrifugieren (bei Raumtemperatur) 6. Überstand (2 x 200 µl) sehr sorgfältig abnehmen in ein neues 1,5 ml Tube überführen (es darf auf keinen Fall etwas von der unteren Phase mit übernommen werden) 7. gleiches Volumen Isopropanol zugeben und 5 min bei RT fällen 8. 5 min bei RT und max. Drehzahl zentrifugieren 9. Überstand verwerfen 10. Präzipitat 2 x 10 min mit 500 µl 80% Ethanol waschen, danach jeweils kurz anzentrifu-gieren und Ethanol sorgfältig abnehmen 11. Pellet 10 min unter Laminarbox trocknen lassen (gegebenfalls länger, bis Flüssigkeit vollständig verdunstet ist) 12. In 50µl H2O lösen 13. 30 min auf Eis 14. 10 min bei 50°C inkubieren

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Eisennachweis im Senfembryo mit Berliner Blau Die Berliner-Blau-Reaktion ist ein histochemisches Verfahren zum Nachweis von Eisen im

Gewebe, das auch bei tierischen Geweben verwendet wird. Eisen(III)-Ionen lassen sich im

sauren Milieu mit gelbem Blutlaugensalz [= Kaliumhexacyanoferrat (II)] nachweisen, wo-

bei ein Eisen(III)-Eisen(II)-Komplex entsteht, der tiefblau gefärbt ist.

Die Senfsamen wurden für 24 h in eine Lösung aus Kaliumhexacyanoferrat eingelegt. Im

Praktikum wird die Samenschale entfernt, und Salzsäure (5%) wird auf den nun freiliegen-

den Embryo getropft. Das Eisen im Embryo wird durch die Salzsäure ionisiert. Es hat nun

eine hohe Affinität zum Ferrocyanid und verdrängt das Kalium. Es bildet sich Ferriferrocy-

anid, das als Berliner Blau (Englisch: prussian blue) bezeichnet wird.

4Fe3+ + 3 K4[FeII(CN)6 (aq) FeIII4[FeII(CN)6]3 + 12 K+

Eisen(III)-Ionen reagieren mit Kaliumhexacyanoferrat(II) zu einem Eisenhexacyanoferratkomplex

und Kaliumionen.

Eisen wird im Arabidopsis-Embryo in der Endodermis gespeichert (Roschzttardtz et al.

2009, Plant Phys. 151:1329–1338; Grillet et al. 2014, Front. Plant Sci. 4:535; siehe Abbil-

dung unten). Senf (Sinapis alba) gehört zur gleichen Pflanzenfamilie wie Arabidopsis. Wel-

che Strukturen werden hier durch die Färbung sichtbar? Was können wir daraus schlie-

ßen?

A: Im Reiskorn findet man die höchste Konzentration von Fe in der Aleuronschicht, dem Inte-gument und dem Scutellum. Im stärkereichen Endosperm ist der Eisengehalt niedrig. B: In Arabidopsissamen findet man Eisen hauptsächlich in den Vakuolen der Endodermiszellen um die provaskulären Gewebe. Quelle: Grillet et al. 2014: Iron in seeds – loading pathways and subcellular localization. Front. Plant Sci. 4:535.

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Liste einiger im Pflanzenphysiologischen Praktikum verwende-

ter Pflanzen

Aesculus hippocastanum . Gemeine Ross-Kastanie

Avena sativa .......... Saat-Hafer

Bellis perennis .......... Maßliebchen, Gänseblümchen

Chenopodium album........ Weißer Gänsefuß

Coleus blumeii .......... Buntnessel, Ziernessel

Cyclamen persicum. ......... Alpenveilchen

Fraxinus excelsior .......... Esche

Hedera helix .......... Gemeiner Efeu

Helianthus annuus .......... Gemeine Sonnenblume

Hordeum vulgare .......... Mehrzeilige Gerste

Lactuca sativa, var. capitata, cv. Grand rapid Grüner Salat

Lamium album .......... Weiße Taubnessel

Lemna gibba .......... Bucklige Wasserlinse

Lemna minor .......... Kleine Wasserlinse

Lemna trisulca .......... Dreifurchige Wasserlinse

Lepidium sativum .......... Garten-Kresse

Lycopersicum esculentum Tomate

Ocimum basilicum .......... Basilikum

Phaseolus vulgaris .......... Garten-Bohne

Pisum sativum .......... Garten-Erbse

Prunus domestica .......... Pflaume

Tradescantia spathacea ... Zweifarbige Rhoeo

Secale sereale .......... Saat-Roggen

Sinapis alba .......... Weißer Senf

Solanum lycopersicum ..... Tomate

Solanum tuberosum......... Kartoffel

Spinacia oleracea .......... Gemüse-Spinat

Spirodela polyrhiza .......... Vielwurzelige Teichlinse

Syringia vulgaris .......... Gemeiner Flieder

Taxus baccata .......... Beeren-Eibe

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Tradescantia Andersoniana-Hybriden Dreimasterblume

Trifolium album .......... Weißer Klee

Triticum aestivum .......... Saat-Weizen

Urtica dioica .......... Große Brennnessel

Vicia faba .......... Acker-, Sau-, Pferde-, Puffbohne

Wolffia arrhiza .......... Wurzellose Wasserlinse

Zea mays .......... Getreide-Mais

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Pflanzenphysiologisches Praktikum: Chemisches Rechnen Physikalische Größen:

Größe Erklärung Einheit

N Teilchenzahl ohne

m Masse g

m Atommasse Vielfaches einer Standardmasse (des zwölften Teils der Masse eines Atoms des Kohlenstoff-Isotops 12C) ca. 1,67 · 10−27 kg

u; in der Bio-chemie Da (Dalton)

1 Da = 1g/mol, 1 kDa = 1 kg/mol

n Stoffmenge Vielfaches einer standardisierten Teil-chenzahl (der des Kohlenstoffisotops 12C in 12 g) 1 mol = 6,022 ⋅ 1023 Teilchen

mol

V Volumen l, cm3

M molare Masse M=m/n

Wieviel wiegt ein mol einer Substanz? (steht auf Chemikalienflasche)

g/mol

ρ (rho) Dichte ρ = m/V

Wieviel wiegt ein Liter einer Substanz? g/l

Konzentrationen Gehaltsangabe von Flüssigkeiten

c Molarität c = n/V

Stoffmenge der gelösten Substanz pro Volumen der Lösung

mol/l, M („molar“)

β (beta) (Zeichen wird selten verwen-det)

Massenkonzentration β = m/V β = c ⋅ M

Masse des der gelösten Substanz pro Vo-lumen der Lösung

g/l

Einheitenvorsätze: milli (m): 1/1.000 = 1/103 mikro (µ): 1/1.000.000 = 1/106 nano (n): 1/1.000.000.000 = 1/109

pico (p): 1/1012 Lösungen herstellen: Die Angabe „molar“ [M] oder „millimolar“ [mM] findet ihr oft in Lösungsrezepten. Das bedeutet mol/l bzw. mmol/l. Eine „fünf-millimolare“ Lösung enthält also 5 mmol/l o-der 0,5 mmol/100 ml. Beispiel: Wir wollen 100 ml einer 5 mM Lösung von Substanz A herstellen. Die molare Masse der zu lösenden Substanz ist 40 g/mol (steht auf der Flasche). Die Einwaage für 100 ml entspricht also der Massenkonzentration β. 5 mM = 0,005 mol/l ......... β = c ⋅ M 0,005 mol/l ⋅ 40 g/mol = 0,2 g/1 l = 0,02 g/ 100 ml 0,02 g werden eingewogen und auf 100 ml aufgefüllt. Verdünnen:

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Formel zum Berechnen der Konzentration: c1 ⋅ V1 = c2 ⋅ V2

c2 = c1 ⋅ V1 /V2

Die Stoffmenge bleibt konstant (1 mol ist hier durch einen Kreis symbolisiert). 5 mol/l ⋅ 1 l = 2.5 mol/l ⋅ 2 l = 5 mol ohne Formel: 1,6 M auf 100 mM (= 0,1 M) verdünnen: 1,6 : 0,1 = 16 Verdünnung ist 1:16, also ein Teil Ausgangslösung, 15 Teile Wasser Verdünnungsreihe: Will man eine Lösung für eine Eichkurve mehrmals verdünnen, stellt man eine Ver-dünnungsreihe her. Man nimmt z.B. 10 ml der Ausgangslösung und füllt diese auf 100 ml auf. Hat die Aus-gangslösung eine Konzentration von c = 1 mol/l, so hat die erste Verdünnung eine Konzentration von c = 0,1 mol/l. Beim nächsten Schritt entnimmt man der ersten Verdünnung 10 ml und füllt diese wiederum auf 100 ml auf. Die zweite Verdünnung hat dann eine Konzentration von c = 0,01 mol/l. Dies kann man beliebig weiterführen. Pro Schritt wird die Konzentration um eine Zeh-nerpotenz kleiner.

c1 = 5 mol/V1 = 5 mol/1 l= 5 M

c2 = 5 mol/2 l = 2,5 M

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Kursplan Praktikum PflanzenphysiologieBotanik/... · 6.1 Einfluss von Abscisinsäure (ABA) auf die Samenkeimung 6.2 Keimfähigkeitsprüfung (Schnelltest) 6.3 Phytochrom-Einfluss auf