Lehrstuhl für MikrobiologieTU München, WZW

Am Hochanger 4, 85354 Freising

Wolfgang Liebl, Tel. 08161-715450, wliebl@wzw.tum.deg g @

Lehrstuhl für MikrobiologieTU München, WZW

Am Hochanger 4, 85354 Freising

Wolfgang Liebl, Tel. 08161-715450, wliebl@wzw.tum.deg g @

Lehrstuhl für Mikrobiologie der TU München6060°°CC

– Arbeitsgebiete –

Prof. Dr. W. Liebl,  pH4.6pH0 7Dr. A. Ehrenreich, Dr. W. Ludwig, Dr. W. Schwarz, 

Dr. A. Angelov, Dr. N. Lee, Dr. V. ZverlovPicrophilus torridus

pH0.7

Molekulare Mikrobielle Enzymologie, ExtremophileMethoden: (Meta)Genomik, Gentechnologie, FPLC, Biochemie, HPLC, DC

Clostridium thermocellum

Spirochaeta thermophila

1

Diversität und Molekulare PhylogenieMethoden: Metagenomik, rRNA‐Sequenzanalyse, Bioinformatik, FISH/CLSM

2

Mikrobielle Physiologie und Genregulation Bacillus licheniformis

Gluconobacter oxydans

Clostridium acetobutylicum

Corynebacterium glutamicum

3Methoden: Genomic Engineering, DNA‐Microarrays, HPLC, GC/MS, Fermentation

3

Molekulare Enzymatik, Extremophile1Extremophile als Quelle für Gene für

Enzyme für den Lignocellulose‐Abbau können 

Extremophile als Quelle für Gene für interessante neue Enzyme

y gfür diverse biotechnologische Anwendungen eingesetzt werden:

• Herstellung von Zuckern aus Holz oder Stroh (als Rohstoff für die Industrie oder als Substrate für Fermentationsverfahren) methyl- Xylan

Cellulose

LigninFermentationsverfahren)

• Produktion von Biokraftstoffen (Methan, Ethanol, Butanol) aus erneuerbaren Rohstoffen

Glucuronsäure

Acetyl-Xylose Xylose

T.maritima Enzyme des Xylanabbaus Size pHopt ‘Topt’ (10-20min assay)

Xylanase XynA 120 kDa 6.2 92°CC

)

• Bleichhilfe in Zellstoff‐/Papierherstellung

• Lebensmittel‐ und Futtermittelindustrie Xylanase XynB 40 kDa 5.4 105°Cβ-Xylosidase BxlA 4 x 88 kDa 6.4 92°Cα-Arabinofuranosidase ArfA ? x 55 kDa 5.5 93°Cα Glucuronidase AguA 76 kDa 6 0 95°C

Lebensmittel und Futtermittelindustrie

• Textilindustrie / Waschmittel

α-Glucuronidase AguA 76 kDa 6.0 95 CAcetylxylanesterase AxeA 6 x 37 kDa 6.5 ~90°C

Extrem robuste

(A.Angelov, W.Schwarz, V.Zverlov, W.Liebl)

Extrem robuste Biokatalysatoren4

Molekulare Enzymatik, Extremophile1Genomanalyse von

extremely small genome for a non parasitic6060°°CC

yPicrophilus torridus

- extremely small genome for a non-parasitic,free-living organism

- highest coding density among thermoacidophilesthermophile

pH 4.6pH 0.7

thermoacidophiles

genome reduction as part of theevolutionary adaptation strategy

t e op e

acidophile

Beispiele laufender Genomprojekte (Koop. G2L):- Bacillus anthracis (Koop. Robert-Koch-Institut)- Spirochaeta thermophila (thermophiler Celluloseabbauer)

CMC- Spirochaeta thermophila (thermophiler Celluloseabbauer)- Lactobacillus spec. (Koop. Prof. Vogel)- Dictyoglomus spec.

Cl t idi h b t li- Clostridium saccharobutylicum

in Vorbereitung:- Caldibacillus cellulovorans

ß-Glucan

- Caldibacillus cellulovorans- Gordonia polyisoprenivorans

Starch (A.Angelov, A. Ehrenreich, W.Liebl)5

Molekulare Enzymatik Diversität1 2

Di ik bi ll G i h f iDie mikrobiellen Gemeinschaften in der Natur sind großteils unerforscht

Fraktion kultiviert: < 0.1 ‐2%. Geschätzte Zahl von Arten:  6 x 105 – 109

4 6 1030 k ti ll

100% Lediglich ein kleiner Anteil der Mikro‐

4-6 x1030 prokaryotic cells(Schätzung, Whitmann et al., 2000)

%

>106-9 organismen kann mit den heute verfügbaren mikrobiologischen Methoden kultiviert werden

0 1% ~8,000

In machen Phyla keine oder nur wenige kultivierte Vertreter

0.1% ,

Bakterien‐Spezieskultiviert nicht kultiviert

immense Diversität von Mikroorganismen

immense Diversität von Genen, Enzymen, kultiviert       nicht‐kultiviert

Stoffwechselwegen, Verbindungen

Diese natürliche Diversität der Mikroorganismen und gihrer Gene, Enzyme, Stoffwechselwege und biologischen Verbindungen harrt der Erforschung und Nutzung6

Metagenom-Analyse:

Molekulare Enzymatik Diversität1 2Metagenom-Analyse: Erforschung und Nutzung des Potentials unkultivier-

Lehrstuhl fürMikrobiologie

des Potentials unkultivierbarer mikrobieller Diversität

Environmental Sample z.B. neue Cellulasenund Hemicellulasen

DNA Isolation Biocatalysts

Library Construction ß-Glucan CMC

Transformation in Host Organism Bioactive Compounds

Screening, Sequence Analysis16S rRNA,

Other Markers(A.Angelov, W.Liebl)7

Der Wirtsorganismus für Klonierung und Expression ist ein

Molekulare Enzymatik Diversität1 2

Gen 01Gen 02 Gen 02

Der Wirtsorganismus für Klonierung und Expression ist ein limitierender Faktor für die Detektion von Genen mittels funktionellem Screening von(Meta)Genom‐Genbanken

Gen 02Gen 03Gen 04Gen 05

Gen 02Problem: nur ein Teil der Gene wird 

in E. coli exprimiertGen 05Gen 06Gen 07Gen 08

Gen 07Ursache: die Organismen der mikrobiellen Gemein‐

schaften überwiegend unkultivierbar ,unbekannte Physiologie, Genetik

Gen 09Gen 10Gen 11Gen 12

Gen 10

E coliExpression

Gen 12Gen 13Gen 14Gen 15

E. coli??

Gen 15Gen 16Gen 17Gen 18

Etablierung alternativer Wirte für Aktivitäts‐Screening von Genbanken, 

Gen 19Gen 20Gen 21 Gen 21

z.B. Thermus thermophilus (extrem thermophil, Tmax= 85°C, kompetent)

….

8

Diversität, Molekularphylogenie2Bioinformatik: ARB Software und Databanken

Ph logenie der konser ierte

Bioinformatik: ARB Software und Databankenhttp://www.arb-home.de

Phylogenie: der konservierte Kern von Genomen

• Small subunit rRNA• Large subunit rRNA• Elongation – initiation factors• Proton translocating ATPase subunitsProton translocating ATPase subunits• Heat shock proteins• recA• RNA polymerases• DNA gyrases• Aminoacyl tRNA sythetases• Ribosomal proteins

A B

Identifizierung: diagnostische PCR und Sonden DC• rRNA targeted PCR and probesg p

(ARB, FISH, DNA chips)• Strain, pathovar specific PCR and probes

(Subtraction hybridisation, MASH)

(W.Ludwig) 9

Diversität, Molekularphylogenie2

Taxon-spezifische Zell-Anreicherung

FISH: oligo - polynuc. probe

Probe mediated cell immobilisation

Gen-Visualisierung (Recog-nition of INdividual Genes:

BA C

RING-FISH)

EnterobacterEnterobacter

aerogenes:

(W.Ludwig, N.Lee)RING-FISH, AmpC- Species-spezifische FISH; Overlay

Resitenz-Gen; 10

Charakteristische Eigenschaften von Gluconobacter oxydans

3 Mikrobielle Physiologie, Regulation

Gram-negative, obligat aerob, mesophil (30 °C), acidotolerantwächst in konz. Zuckerlösungen bei niedr. pH, geringe Biomasseproduktion

Charakteristische Eigenschaften von Gluconobacter oxydans

unvollständige Oxidation von Substraten im Periplasmastereo- and regioselektive Dehydrogenierungsreaktionen

Oxidation von .....Z k

Biotechnologie von Gluconobacter oxydans

ZuckernZuckersäurenPrim. U. sek. AlkoholeAromatische AlkoholeAromatische AlkoholePolyole und –derivative wie zyklische Polyole

Kann genutzt werden für die Produktion von ....EssigsäureVitamin CMiglitol (antidiabetisch)Dihydroxyaceton (Bräunungsmittel)Gluconat (z.B. Metallbindend)5-Ketogluconat (L-Tartrat)Synthese von Aromen/Gewürzen

11

E i C St ff h l

3 Mikrobielle Physiologie, Regulation

Energie- u. C-Stoffwechsel von Gluconobacter oxydans

MicroGrid Microarrayer von BioRobotics

Rolle von löslichen Dehydrogenasen für denC-Stoffwechsel von Gluconobacter oxydans

Suche nach Funktionen für die membrangebundenen Dehydrogenasen unbekannter Funktion

neue Oxidationsprozesse?neue Oxidationsprozesse? Engineering von G. oxidans Ganzzell-Biokatalysatoren

Ganz-Genom-Microarray von G. oxydans 621H mit97 % aller ORFs > 300 bpverfügbar

(A.Ehrenreich, W.Liebl) 12

3 Mikrobielle Physiologie, Regulation

Bacillus licheniformis das Arbeitspferd der EnzymproduktionBacillus licheniformis , das Arbeitspferd der Enzymproduktion

Lactate

ButanediolPEP Acetolactate Acetoin

Genomic deletions can help to

Pyruvate

Acetyl‐CoA

Citrate

Acetate

Acetyl‐P

Oxaloacetate

Genomic deletions can help to- relieve the cell from unneeded

energy-consuming reactions2‐Oxoglutarate

Malate

Fumarate

Succinate

Acetyl‐CoAIsocitrate

Glyoxylate

energy consuming reactions- relieve the protein biosynthesis apparatus- relieve the secretory apparatus

i th ti t bilit

Succinyl‐CoA

Untersuchung der aktiven Stoffwechselwege mit- increase the genetic stability

Examples of possible deletions:

Stoffwechselwege mit DNA-Microarrays

prophages, insertion elements, transposases, restriction systems…

lean genome, optimized for production13

B t l P d kti it Cl t idi t b t li

3 Mikrobielle Physiologie, Regulation

Butanol Produktion mit Clostridium acetobutylicum -eine Antwort auf die schwindenden Ölreserven

Säuren(Essigsäure, Buttersäure)

Schnelles vegetativesWachstum

( g , )

LösungsmittelVerlangsamung des Wachstums durch: Lösungsmittel

(Aceton, Butanol, Ethanol)des Wachstums durch:- Nährstofflimitierung- Niedriger pH- Sporulationp- Zelldichte

Trotz langjähriger Forschung sind wesentliche Details der molekularen Vorgänge beim U h lt Sä Lö itt lbild d d Z h it dUmschalten von Säure- zu Lösungsmittelbildung und der Zusammenhang mit der Sporenbildung noch unverstanden Schlüssel zur Verfahrensverbesserung

Transkriptomanalyse von Clostridium acetobutylicumin kontinuierlicher Kultur

14

Weiße BiotechnologieWeiße Biotechnologie (= Industrielle Biotechnologie)

Definition:  Verwendung von Mikroorganismen, Zellen oder deren Bestandteile (Enzyme) für die industrielle Produktion

Biotechnologie wird als Innovationsmotor für die chemische Industrie immer wichtiger

Vorteile der biotechnologischen Herstellung von Bulk‐Chemikalien aus nachwachsenden Rohstoffen durch Weiße Biotechnologie, da:

‐ Schwindende Reserven (bei steigendem Bedarf) fossiler Rohstoffe für Petrochemie‐basierte Industrie

‐ künftige Versorgung mit fossilen Rohstoffen politisch unsicher

‐ Zunahme der globalen CO2‐Emmissionen und damit einher gehende Problematikg 2 g

15

Module Mikrobiologie f. Bsc (5.+6. Sem) u. MSc BiologieLehrstuhl für Mikrobiologie – Lehre im Fortgeschrittenenstudium

g ( ) gV Allgemeine Mikrobiologie 2 (Mikrobielle Genetik ) (M) Schr, 60’ ab 5. Sem.

3 SWS, WS - 5 Credits , Dozent: Liebl Molekulare Abläufe bei der Genexpression in Bakterien und Archaeen (Transkription, Translation, posttranslationale Vorgänge,Molekulare Abläufe bei der Genexpression in Bakterien und Archaeen (Transkription, Translation, posttranslationale Vorgänge, Transport und Sekretion), Interaktionen Bakterien-Pflanzen/Tiere, Zell-Zell-Kommunikation, Gentransfer bei Prokaryoten.

V Mikrobielle Diversität und Entwicklung (M/O) Schr, 60’ ab 5. Sem.2 SWS, SS - 3 Credits , Dozenten: Liebl, Ludwig Phylogenie, Diversität und Evolution der Prokaryoten; Genomik/Metagenomik; Biofilme; Zell-Zellkommunikation, Zelldifferenzierungen; zelluläre Mikrobiologie.

V Angewandte Mikrobiologie – Biosyntheseleistungen (M/O) Schr, 60’ ab 5. Sem.2 SWS SS - 3 Credits Dozenten: Liebl Ehrenreich2 SWS, SS 3 Credits , Dozenten: Liebl, Ehrenreich Aerober und anaerober Energiestoffwechsel, Zuckerstoffwechsel, Stickstoffassimilation, mikrobielle Produktion von Alkoholen, organischen Säuren, Aminosäuren, Antibiotika, Biopolymeren.

V Angewandte Mikrobiologie – Abbauleistungen (M/O) Schr, 60’ ab 5. Sem.2 SWS, WS - 3 Credits , Dozenten: Liebl, Schwarz Mikrobiologie, Physiologie und Enzymatik des Abbaus von Naturstoffen (Zucker, Polysaccharide, Proteine, Aromaten, Xenobiotika).

S Proseminar mikrobielle Vielfalt (O) S ab 5 SemS Proseminar – mikrobielle Vielfalt (O) S ab 5. Sem.2 SWS, SS - 2 Credits , Dozent: Liebl Phototrophe, chemoorganotrophe und chemolithotrophe Prokaryoten, Extremophile Prokaryoten, Vielfalt und Energiegewinn, Differenzierung bei Prokaryoten ChemotaxisDifferenzierung bei Prokaryoten, Chemotaxis.

S Proseminar – mikrobielle Wirkstoffe (M/O) S ab 5. Sem.2 SWS, WS - 2 Credits , Dozent: Liebl Bakterielle Toxine, Sekundärstoffwechsel, Antibiotika. , ,

E Exkursion zur Angewandten Mikrobiologie (M/O) Pr ab 5. Sem.Zwei1-tägige Exkursionen im SS oder WS - 2 Credits, Dozenten: Liebl, Seidl, Ehrenreich Besichtigung von Firmen, die mit Mikroorganismen Produkte herstellen oder mikrobiologische Qualitätskontrolle machen.

M d l Mik bi l i f B (5 6 S ) MS Bi l i

Lehrstuhl für Mikrobiologie – Lehre im Fortgeschrittenenstudium

Module Mikrobiologie f. Bsc (5.+6. Sem) u. MSc BiologieP Organismische und Molekulare Mikrobiologie (M/O) Pr,K ab 5. Sem.

10 SWS, Blockpraktikum n.Vb. im WS - 10 Credits , Liebl, Schwarz, Ludwig, Ehrenreich, Lee Mikrobielle Vielfalt, Physiologie und Genetik: Anreicherungs- und Screeningtechniken, Isolierung und Charakterisierung von Bakterien aus verschiedenen Habitaten, anaerobe Kultivierung, molekulare Identifizierungsmethoden, DNA-Isolierung, genetische Charakterisierung, Wachstumsphysiologie. Begleitend dazu: Seminar Methoden der Mikrobiologie. Kapazität: 8 StudierendeKapazität: 8 Studierende

P Forschungspraktikum Molekulare Mikrobielle Enzymatik (M) Pr,K ab 1. Sem. MSc10 SWS im WS/SS - 10 Credits , Dozenten: Liebl, Schwarz Einführung in die experimentelle mikrobiologische Forschung Klonierung und Sequenzanalysen von Bakteriengenen1 Einführung in die experimentelle mikrobiologische Forschung, Klonierung und Sequenzanalysen von Bakteriengenen, Genbanken, Metagenomgenbanken, Enzymreinigung und biochemische Charakterisierung. Voraussetzung: Praktikum Organismische und Molekulare Mikrobiologie (oder vergleichbare Vorkenntnisse)Kapazität: 3 Studierende

1

P Forschungspraktikum Diversität und Molekularphylogenie (M) Pr,K ab 1. Sem. MSc10 SWS im WS/SS - 10 Credits , Dozenten: Liebl, Ludwig, Lee Einführung in die experimentelle mikrobiologische Forschung, Klonierung, Genbanken, Metagenomanalyse, Sequenzanalysen, 2Entwurf von Oligo-und Ploynukleotidsonden, Fluoreszenz in situ Hybridisierungen, Herst. u. Verwendung von DNA-Chips. Voraussetzung: Praktikum Organismische und Molekulare Mikrobiologie (oder vergleichbare Vorkenntnisse) Kapazität: 3 Studierende

P Forschungspraktikum Mikrobielle Physiologie u Genregulation (M/O)Pr K ab 1 Sem MScP Forschungspraktikum Mikrobielle Physiologie u. Genregulation (M/O)Pr,K ab 1. Sem. MSc10 SWS im WS/SS - 10 Credits Dozenten: Liebl, Ehrenreich Einführung in die experimentelle mikrobiologische Forschung, Physiologie und gentechnische Modifizierung biotechnologisch relevanter Bakterien Klonierung oder Fermentation Herst u Verwendung von DNA-Chips genomweite Transkriptomanalyse

3relevanter Bakterien, Klonierung oder Fermentation, Herst. u. Verwendung von DNA Chips, genomweite Transkriptomanalyse. Voraussetzung: Praktikum Organismische und Molekulare Mikrobiologie (oder vergleichbare Vorkenntnisse) Kapazität: 3 Studierende

M d l Mik bi l i (f BS 5 6 S ) MS Bi l i

Lehrstuhl für Mikrobiologie – Lehre im Fortgeschrittenenstudium

Module Mikrobiologie (f. BSc 5.+6. Sem) u. MSc Biologie

Ergänzende Veranstaltungen in Mykologie:g g y g

V Einführung in die Mykologie (O) ab 5. Sem.1 SWS Blockveranstaltung n V in Ferien (Sept ) - 2 Credits Dozent: Seidl1 SWS, Blockveranstaltung n.V. in Ferien (Sept.) - 2 Credits , Dozent: Seidl

in Kombination mitP Mikrobiologisches Praktikum 2 (O) ab 5. Sem.

5 SWS, Blockveranstaltung n.V. in Ferien (Sept.) - 5 Credits , Dozent: Seidl5 SWS, Blockveranstaltung n.V. in Ferien (Sept.) 5 Credits , Dozent: Seidl

V Moderne Methoden mikrobiologischer Diagnostik (M/O) ab 5. Sem.2 SWS, SS - 3 Credits , Dozent: Seidl

V Einführung in die Mykopathologie (O) 2 SWS, WS - 3 Credits , Dozent: Seidl

18

Vorschlag für Organismische u. Molekulare Mikrobiologie im BSc-Studium:Lehrstuhl für Mikrobiologie – Lehre im Fortgeschrittenenstudium

V Allgemeine Mikrobiologie 2 (Mikrobielle Genetik ) (WS) (M) Schr, 60’ ab 5. Sem.3 SWS, WS - 5 Credits , Dozent: Liebl Genomik, Molekularbiologie der Genexpression in Bakterien und Archaeen (Transkription, Translation, posttransl. Vorgänge, g p ( p p g gTransport und Sekretion), Interaktionen Bakterien-Pflanzen/Tiere, Zell-Zell-Kommunikation, Gentransfer bei Prokaryoten.

V Mikrobielle Diversität und Entwicklung (SS) (M/O) Schr, 60’ ab 5. Sem.dM

yk.

oderV Angewandte Mikrobiologie – Biosyntheseleistungen (SS) (M/O) Schr, 60’ ab 5. Sem.

oderV Angewandte Mikrobiologie Abbauleistungen (WS) (M/O) Schr 60’ ab 5 Semau

s 3

o.M

V Angewandte Mikrobiologie – Abbauleistungen (WS) (M/O) Schr, 60’ ab 5. Sem.

S Proseminar – mikrobielle Vielfalt (O) S ab 5. Sem.2 SWS SS 2 C dit D t Li bl

1 a

2 SWS, SS - 2 Credits , Dozent: Liebl Phototrophe, chemoorganotrophe und chemolithotrophe Prokaryoten, Extremophile Prokaryoten, Vielfalt und Energiegewinn, Differenzierung bei Prokaryoten, Chemotaxis.

P Organismische und Molekulare Mikrobiologie (M/O) Pr,K ab 5. Sem.10 SWS, Blockpraktikum n.Vb. im WS - 10 Credits , Liebl, Schwarz, Ludwig, Ehrenreich, Lee Mikrobielle Vielfalt, Physiologie und Genetik: Anreicherungs- und Screeningtechniken, Isolierung und Charakterisierung von Bakterien aus verschiedenen Habitaten, anaerobe Kultivierung, molekulare Identifizierungsmethoden, DNA-Isolierung, genetische Charakterisierung, Wachstumsphysiologie. Begleitend dazu: Seminar Methoden der Mikrobiologie. Kapazität: 8 Studierende

Kombinieren z.B. mit Fächern aus Richtung Biochemie, Genetik19

Lehrstuhl für Mikrobiologie – Lehre im Fortgeschrittenenstudium

P Organismische und Molekulare Mikrobiologie (M/O) Pr,K ab 5. Sem.10 SWS Blockpraktikum n Vb im WS 10 Credits Liebl Schwarz Ludwig Ehrenreich Lee10 SWS, Blockpraktikum n.Vb. im WS - 10 Credits , Liebl, Schwarz, Ludwig, Ehrenreich, Lee Mikrobielle Vielfalt, Physiologie und Genetik: Anreicherungs- und Screeningtechniken, Isolierung und Charakterisierung von Bakterien aus verschiedenen Habitaten, anaerobe Kultivierung, molekulare Identifizierungsmethoden, DNA-Isolierung, genetische Charakterisierung, Wachstumsphysiologie. Begleitend dazu: Seminar Methoden der Mikrobiologie. Kapazität: 8 Studierende

Art: Forschungsnahes Blockpraktikum in 2er-Gruppen

Umfang: 7 Wochen ganztagsg g g

Wann: n.Vb. (vor Beginn des WS, vorauss. ab 1.9.09)

Wo: Lehrstuhl für Mikrobiologie, Am Hochanger 4Wo: Lehrstuhl für Mikrobiologie, Am Hochanger 4

Kapazität: 8 Studierende

Anmeldung: Eintragung in Liste am Lehrstuhl (EG) ab 01 06 bis 15 07 2009;Anmeldung: Eintragung in Liste am Lehrstuhl (EG) ab 01.06. bis 15.07.2009;Bei mehr Interessenten als Plätze Entscheidung über Zulassungbis Ende Juli

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