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Lipid Rafts und Cavaeolae Vorlesung Zellbiolog ie Huber

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Lipid Rafts und Cavaeolae

Vorlesung Zellbiologie Huber

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Plasma Membran Komposition

• Die Plasma Membran von Säugetierzellen enthält 4 Hauptklassen von Phospholipiden : •Phosphatidylcholin •Phosphatidylethanolamin •Phosphatidylserin•Sphingomyelin•Zusammen mehr als die Hälfte aller Lipide in zellulären Membranen

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Phospholipide bestehen aus zwei langkettigen Fettsäuren, die über eine Esterbindung an eine kleine hydrophile Gruppe gebunden sind

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Phospholipids sind amphipathisch

• Deshalb aggregieren Phospholipide nicht in Tropfenform, sondern orientieren sich spontan zu Membranen, mit den hydrophilen Gruppen nach aussen, zur wässrigen Umgebung.

• Moleküle, die mit einem Ende mit der wässrigen Umgebung interagieren und mit dem anderen Ende hydrophob sind werden als amphipathisch bezeichnet (Griechisch, “tolerant für beides”).

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Plasma Membran Komposition

• Die Phospholipide sind asymmetrisch zwischen dem inneren und äußeren Bi-Layer angeordnet

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Glykolipide

• Zusätzlich zu den Phospholipiden enthalten Membranen von Säugetieren Glykolipide

• Diese Glykolipide findet man hauptsächlich im äußeren Leaflet des Bilayers, mit den Kohlenhydratresten an der Zelloberfläche.

• Sie stellen aber nur einen relative geringen Anteil aller Lipde dar (~2%)

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Struktur von Glykolipiden

• Zwei Kohlenwasserstoff Ketten vereinen sich zu einer polaren Kopfgruppe über ein Serin mit einem Kohlenhydratrest (zB Zucker)

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Cholesterin• Zusätzlich enthalten Zellmembranen von Säugern Cholesterin.

• Cholesterin, ist ein Hauptbestandteil zellulärer Mmebranen und damit in gleichen molaren Mengen wie Pospholipide vertreten.

• Aber: Cholesterin kann nicht spontan Membranen bilden!

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Cholesterin im Bilayer

• Die Cholesterinmoleküle orientieren sich im Bilayer mit ihren Hydroxylgruppen in die unmittelbare Nachbarschaft zu den polaren Kopfgruppen der Phospholipidmoleküle.

• Die starre, plattenförmige Steroidstruktur interagiert und stabilisiert dadurch teilweise jene Abschnitte der Kohlenwasserstoff-ketten, die am nächsten zu den polaren Kopfgruppen liegen.

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Lipid-Zusammensetzung von Membranen

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Cholesterin und Mikroviskosität

• Einflüsse von Cholesterin auf die Viskosität der Membran sind Temperaturabhängig.

• Bei höheren Temperaturen, kann Cholesterin die freie Beweglichkeit der Fettsäurenketten der Phospholipide behindern und somit den äußeren Bilayer steifer/rigider machen.

• Dadurch verändert sich auch die Zellmembran-Permeabilität für kleine Moleküle.

• Jedoch bei niedrigen Temperaturen hat Cholesterin den gegenteiligen Effekt: Durch die Interaktion mit den Fettsäurenketten der Phospholipide, kann Cholesterin Membranen vorm Einfrieren bewahren und deren Beweglichkeit/Mikro-Viskosität bewahren.

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Das “Fluid Mosaic” Modell

• In Biomembranen sind nahezu alle Membranproteine lateral mobil und frei diffundierbar.

• Im“Ffluid Mosaic“ Modell, wird die Membran als zwei-dimensionales Mosaik dargestellt, das von Phospholipiden und Proteinen gebildet wird.

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Lipid Rafts sind Andock- und

Interaktionsplattformen für Proteine

.…... formed by dynamic clustering of sphingolipids and cholesterol and move within the fluid bilayer, e.g. during signal transduction.

From Simons and Ikonen,

Nature 1997, 387: 569-72

raft caveola

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• Sie entstehen und bestehen aus einem dynamischen Zusammenschluss von Cholesterin und Sphyngolipiden im äußeren Leaflet des Bilayers.

• Die gesättigten Kohlenwasserstoffketten der Sphyngolipide erlauben dem Cholesterin sich optimal in der äußeren Hälfte der Membran zu verankern.

• Das innere Leaflet enthält mehr Phospholipide mit gesättigten Fettsäuren und auch Cholesterin.

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Rafts bilden Caveaolae

Caveolae on the plasma membrane of a human fibroblast. (A) Electron micrograph of a fibroblast in cross-section showing caveolae as deep indentations in the plasma membrane. (B) Deep-etch electron micrograph showing numerous caveolae at the cytoplasmic side of the plasma membrane.

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• Caveoline:– 150 AS Membran Proteine

– Sind die Bausteine der Caveolae

– N- und C-Terminus ragen ins Zytoplasma vor = integrales und nicht transmembran Protein

– Oligomerisieren– Hydrophobes Ende steckt in der Membran

– Binden Cholesterin

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Funktionen von Caveolae :

• Endozytose, Transzytose

• Signal Transduktion

• Cholesterin Transport• Pathogen Eintritt in Zellen• Potozytose

– Lipid-verankerte Membran Rezeptoren in Caveolae nehmen kleine Moleküle wie Vitamine und Lipide auf.

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Methoden zur Untersuchung von Raft-

Strukturen?

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Biochemische Anreicherung / Reinigung von Caveolae and Rafts

• Extraktion mit Triton-X 100 auf Eis

• Rafts and damit assoziierte Proteine werden dadurch unlöslich

• Flotation in Zucker / Optiprep Gradienten

• Das detergenz-unlösliche Material flotiert hoch, wegen des Lipidgehaltes.

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Flotation and Visualisierung von Rafts

Oliferenko et al., JCB 1999

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Methoden zur Untersuchung von Raft-

Strukturen?

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Intracelluläres Annexin II wird von Innen an antibody-

crosslinked CD44 Microdomänen rekrutiert

Oliferenko et al., JCB 1999

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Keine “Cluster” wenn Cholesterin aus

Membranen depletiert wird

CD44 annexin II merge

Oliferenko et al., JCB 1999

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Immunogold und Freeze Fracture

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Größere Lipid-Domänen können mittels Single Molecule Microscopy dargestellt werden• G.J. Schütz, G. Kada, V.Ph.

Pastushenko and H. Schindler EMBO J. 19 No.5 (2000) 892-901

DOPE (monounsaturated phosphoethanolamine analogue): frei diffundierbar

DMPE (saturated acyl chains): wird in Mikrodomänen fest gehalten

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Rafts Visualiserung durch Atomic Force

Microscopy• Atomic force microscopy

reveals sphingomyelin rafts (orange) protruding from a dioleoylphosphatidylcholine background (black) in a mica-supported lipid bilayer. Placental alkaline phosphatase (PLAP; yellow peaks), a glycosylphosphatidylinositol-anchored protein, is shown to be almost exclusively raft-associated. Data from:

Saslowsky, D.E., et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 26966-26970

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Oder mit Photonic Force Microscopy

• Kai Simons (Dresden, Germany) has used photonic force microscopy to measure the size of lipid rafts.

• By comparing the drag force of raft proteins (such as a GPI-anchored protein) and non-raft proteins (such as transferrin receptor) in the presence or the absence of cholesterol, he estimated the diameter of a single raft.

• The conclusion is that each raft is very small and contains a very small subset of proteins, leading to the prediction that in order to act as signalling and/or sorting devices, they need to cluster.

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Raft Eigenschaften• Größe: bis zu 25±10 nm • Das entspricht ungefähr 3,500 Sphyngolipid Molekülen

• Protein Anzahl hängt vom Packungsgrad ab, wahrscheinlich gibt es um die 30 Proteine in Rafts

• Cluster mit bis zu 15 identen Molekülen wurden beschrieben

• Statistisch gesehen, können jedoch nur ein relativ kleiner Anteil aller verfügbaren Raft Proteine gleichzeitig in Rafts auch sein.

• Das wiederum könnte wichtige Auswirkung auf die prinzipiellen Mechanismen der Signalweiterleitung in und durch Rafts haben.

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Raft-Typologie: Nomenklatur

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Experimentelle Tools um Rafts zu zerstören:

• Cholesterol sequestration/depletion– Filipin (Antibiotic)– Pore formation (Saponin, Digitonin, Streptolysin O)

– Methyl-beta-cyclodextrin

• Cholesterol biosynthesis– Lovastatin

• Raft Stability– Exogenous Cholesterol– Exogenous Gangliosides

– Exogenous polyunsaturated fatty acids

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Signal Transduktionin Lipid Rafts und

Caveolae• FCRI• T-cell Receptor• B-cell Receptor• CD44• H-ras• Integrins• eNOS

• EGF Receptor• Insulin Receptor• EphrinB1 Receptor

• Neutrophin• GDNF• Hedgehog

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Wie werden Signale in Rafts induziert und

integriert?

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Wie werden Signale in Rafts induziert und

integriert?

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.

CD44

Lipid rafts

Der CD44 Rezeptor ist in Rafts und intergiert mit

dem Zytoskelett

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out-side-in Signaltransduktion in CD44 Rafts nach Ligandenbindung

durch Hyaluronsäure (HA)?

H A

.

CD44

Lipid rafts

H A

H A

H A

?

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.

H A

R ac-G D PR ac-G T P

H A

H A

H A

CD44

Annexin

II

TIAM

Bourguignon et al., 2000

lamellipodia outgrowthCytoskeletal rearrangements

HA

Okamoto et al., 1999

Oliferenko et al., JCB 2000

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Rafts in Fc Rezeptor Signaltransduktion

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Rafts in T-Cell Rezeptor Signaltransduktion

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? Offene Fragen ?

• Wievel Arten von Rafts?• Funktion von Caveolae in Signaltransduction?

• Welche Signalwege brauchen Rafts? • Welche Proteine gehen in Rafts und warum?

• Wie werden Caveolae internalisiert• Rolle des Zytoskelettes?