LUSCHRlFTEN

a)

Liisen von Cholesterin in Wasser mit Hilfe eines synthetischen Rezeptors ** Blake R. Peterson und Franqois Diederich * Professor Christoph Riichardt Zuni 65. Gehurtstag gewidniet

Bu3Sn SnBu3

!

Cholesterin ist eine essentielle Komponente tierischer Zellen. Dieses in Wasser auBerst schwerlosliche Steroid dient sowohl als Regler der Membranfluiditat als auch als Ausgangsverbindung fur die Produktion von Steroidhormonen und Gallensauren"'. Auf den hydrophoben Eigenschaften von Cholesterin; die diese Verbindung zu einer essentiellen Komponente von Zellmembra- nen machen, beruht zugleich dessen todliche Wirkung, wenn sich Cholesterin an den Arterienwanden ablagert. Diese als Ar- teriosklerose bekannte Ablagerung von Cholesterin-haltiger Plaque in Blutgefa13en[21 ist eine der Haupttodesursachen in den wcstlichen Industrielandern. Wahrend sich gangige Therapien zur medikamentosen Senkung des Cholesterin-Blutspiegels auf die Hemmung von Enzymen der endogenen Cholesterin-Bio- syntheseL3I oder auf die Abreicherung der Gallensauren konzen- trierenr4], wire das selektive Auflosen von Cholesterin-Ablage-

R

3 R = A c

3 5 R = E t

1 R = Et2+ Cl- Schema 1. Synthese des Reaepiors 1. Reagentien und Ausbeuten: a) [Pd(PPh,),], 2,6-Di-ferr-butyl-p-kresol, Dimethylformamid, 110 "C. DruckgcWB, 2 d, 14%; b) LiAlH,, Et,O, 20'C. 12 h. 59%; c) C,H,l, CHCI,, 20°C. 4 d. mit anschlieflen- dem Ionenaustausch an Dowex-Harz (CI-) mll H,O:CH,OH 1 :1 als Eluens, 78%.

[*I Prof. Dr. F. Diederich, B. K. Peterson Laboratonum fur Organische Chemie ETH-Zentrum UnivcrsitHtPtrasse 16. CH-8092 Zurich (Schweiz) Telefax: Int. + 1/261-3524

[**I Diese Arbeit wurde von der ETH Zurich gefordert. Wir dankcn Dr. B. Jaun fur seine Hilk bei der Aufnahme und der Interpretation der 2D-NMR-Spektren der makrotricyclischen Verbindungcn sowie Dr. W. Amrein und Dr. P. Jaincs fur die Aufnahme der Massenspektren.

rungen durch stark bindende, synthetische Rezeptoren eine al- ternative, bisher nicht genutzte Strategie. Natiirlich vorkom- mende Cycl~dextrine[~. 61 konnten in einer derartigen Methode eingesetzt werden, da sie EinschluIjkomplexe mit Cholesterin in Wasser bilden; der Mange1 an Selektivitit schrankt jedoch ihre Verwendbarkeit als spezifische Komplexierungsagentien fur Cholesterin ein. Obwohl schon einige synthetische Cyclophan- Rezeptoren zur Untersuchung der Steroiderkennung eingesetzt wurden" - "1, verlief die Komplexierung von auBerst schwerlos- lichen Steroiden wie Cholesterin in Wasser bisher erfolglos. Wir beschreiben hier die Synthese eines neuen, wasserloslichen, tri- cyclischen Cyclophan-Rezeptors 1, der in Wasser Cholesterin stark und selektiv bindet.

Der Schlusselschritt der Synth'ese von 1 ist die Pdo-katalysier- te Stille-Kupplung['21 von aquimolaren Mengen an Bis(tribu- ty1stannyl)acetylen und Dibromcyclophan 2 (Schema I ) , das in sechs Stufen ausgehend von 2-Brom-6-ethoxynaphthalin in Gramm-Mengen hcrgestellt werden kann" 'I. Diese bemerkens- werte Cyclisierung liefert selektiv den chiralen, D,-symmetri- schen Makrotricyclus 3 in 14% Ausbeute. Das achirale, CZh- symmetrische Isomer 4 wird nicht gebildet. Die Reduktion von

AcNil

4

3 mit LiA1H4 zum Tetrainin 5 sowie die anschlieBende Quarter- nisierung (Ethyliodid) und der Ionenaustausch (C1-) liefert den wasserloslichen Rezeptor 1.

Da13 nur ein Isomer bei der Pdo-katalysierten Makrocyclisie- rung gebildet wird, belegt das Auftreten nur eines Produktflecks im Dunnschichtchromatogramm (R, = 0.15, SO, , CH,Cl,/ CH,OH 20: I) , ebenso tritt nur ein Satz eiitsprechender Signale in den 'H- und I3C-NMR-Spektren auf. 2D-NMR-Spektren von 5 bestiitigen. da13 ausschliefilich das chirale D,-symmetri- sche Isomer 3 entstanden ist. ROESY-Spektren weisen intramo- lekulare aliphatisch-aromatische 'H{ 'H}-Kern-Overhauser-Ei'- fekte (NOES) auf, die nur bei der D,-symmetrischen Verbindung auftreten konnen (Abb. 1). Dariiber hinaus ergaben Molekiil-

H H

OCHz(CHz)2CH,0Ar

\rOCH2(CH2)pCH20 OCH2(CH2)2CH,0Ar

f l \ OMe H H

Abb. 1. Mil ROESY-Spektroskopie an 5 beobachtete aromatisch-aliphatische 'H{'H)-Kern-Overhauser-EfFekte (NOEs) bestatigcn die D,-symmetrische Struk- tur. Strahlt man die Frequenz des aromatischen Signals ein, werden die NOEs fur b ide CH2-Gruppen nahezu in gleichem MalJe verstarkt. Das alternalive C,,,-sym- metrische Isomer kann nicht zn den beobachteten NOE-Verstiirkungen fiihren. Es sind nur die fur die NOE-Diskussion relevanten Teilstrukturen der beidcn Isomere gezeigt. Links ist das D2-. rechts das C,,-symmeirische Isomer dargcstcllt.

1688 Q VCH Verlug~geseNscimfl mhH. D-69451 Wemherm, 1994 0044-R249:94:1515-1688 S 10.00f .2S,Kl Angew. Chem. 1994, 106. N F . i5/16

ZUSCHRIFTEN

I

dynamik-Simulationen mit M a c r ~ M o d e l [ ' ~ ~ (Abb. 2), dan das D,-symmetrische Isomer 3 um 6 kcalmol-' stabiler ist als das C,,-symmetrische 4, was die ausschliel3hche Bildung von 3 er- kllreii wurde.

Der Rezeptor 1 1st sehr gut wasserloslich (6 mgmL-I, 3.0 mM) und aggregiert bei Konzentrationen kleiner 2.5 mM nicht nennenswert, wie 'H-NMR-spektroskopisch mit Verdiin- nungsexperimenten bewiesen wurde. Diese relativ hohe kriti- sche Aggregatioiiskonzentration (CAC) ist Zuni Teil auf das Vorhandenscin von vier peripheren CH,O-Substituenten, wel- che die CAC-Werte auch anderer wasserloslicher Cyclophane erheblich erhohen["I, zuriickzufiihren. Durch die Verknupfung zweier Cyclophane 2 uber zwei Acetylenbrucken nimmt die Tie- fe des Hohlraums von ca. 5 8, in 2 auf ca. 11 8, in 1 zu (Abb. 2),

9 A ArO - OAr

13A ArO - OAr

OH

3\i

Abb. 2. Vergleicb der cnergieminimierten Strukturen von 1 (oben und unten links) und Cholesterin (unten rechts) [13]. Ohen sind dic Dimensionen der Hohlraumoff- nung yon 1 gezeigt (9 x 13 A). Im unteren Teil ist die Tiefe des Hohlraums (11 A) dnrgestellt. die ausreicht, um alle vier Ringe A-D eines axial ausgrrichteten Chole- slerinmolekuls sowie Teile der hydrophoben Scitenkette einzuschliefien.

wodurch eine fur den vollstandigen EinschluD eines hydropho- ben Steroids wie Cholesterin in axialer Richtung nahezu perfek- te Umgebung entsteht sowohl in bezug auf die raumlichen Ver- haltnisse als auch auf die Hydrophobie. Bei einer Hohl- raumoffnung voii 9 x 13 konnen Steroide ohne nennenswerte sterische Hinderung in den Rezeptor eindringen.

Die Komplexierung der beiden in Wasser auDerst schwerlosli- chen Steroide Cholesterin und Testosteron durch 1 in Wasser wurde mit der Fest-Fliissig-Extraktionsmethode[isl untersucht (Tabelle 1). Die Loslichkeit von Cholesterin in reinem Wasser betragt 4.7 x lo-' M [ ' ~ ] . Wird ein UberschuR an festem Chole- sterin mit einer 1.0 mM Losung von 1 in Wasser extrahiert, so kann eine Konzentration von 8.5 x M an geliistem Chole- sterin erreicht werden. Dies entspricht einer durch die Komple- xierung bedingten Erhohung der Loslichkeit um den Faktor 190. Daraus ergibt sich fur den Komplex 1 . Cholesterin in rei-

Tabelle 1. Assoziationskonstanten K , und freie Bindungsenergien AGO dcr Stcroid- komplexe yon 1; bestimrnt durch Fest-Flussig-Extrakton in H,O bei 295 K [a].

~ AGO [b] Loslichkeit Steroid K, [L mol '1 [kcalmol-'1 [M]

Cholesterin 1.1 x 106 8 . 2 4.7 x 10-6 [c] Testosteron 6.8 x lo4 6.5 8.3 x i W S [d]

[a] Siehe Expenme~rtelles. [b] Daten aus Dreifach-Bestimmung. Reproduzier- barkeit der AGO-Werte: k0.4 kcal. [c] Lit. 1161. [d] Lit. [17].

nem Wasser eine Assoziationskonstante von K, = 1 .I x lo6 Lmol-I (295 K). Auch festes Testosteron wird durch Kom- plexbildung mit 1 in Wasser extrahiert; jedoch ist seine Affni- tat zurn Rezcplor bei einer Assoziationskonstante von I(, = 6.8 x 10' Lmol-' wesentlich geringer. Dies kann ohne weiteres dadurch erklart werden, &a[$ das polarere Testosteron eine hoherc Affinitat zur wlifirigen Phase aufweisl, was in seiner gegeniiber Cholesterin hoheren Wasserloslichkeit zurn Aus- druck kommt[l63 17].

Eine detailliertere Untersuchung der Bindungseigenschaften von 1 gegenuber Steroiden wurde anhand von 'H-NMR-Titra- tionen in CD,OD, in dem sowohl die Steroide als auch deren Komplexe mit 1 in den entsprechenden Konzentrationsberei- chen homogene Losungen bilden, durchgefuhrt. Vergleichbar akkurate Messungen in D,O waren aufgrund der langsamen Austauschprozesse und der geringen Loslichkeit der Steroide nicht moglich.

Obwohl der hydrophobe Effekt als Triebkraft fur die Kom- plexierung in CD,OD wesentlich schwacher als in D,O ist["l, bilden Cholesterin und seine Derivate 6a,b sowie Testosteron 7a stabile Komplexe mit 1 im organischen Losungsrnittel (Fa- belle 2 ) . Die relativ hohe StabilitLt des Testosteronkomplexes in CD,OD konnte durch gunstige elektrostatische x-n-Wechsel- wirkungen nwischen der elektronenarmen a,fi-ungesattigten Ke- toneinheit in Ring A und den elektronenreichen Arylether- bausteinen der Hohlraumwande des Rezeptors erklart wer- den" '1. Weitere Untersuchungen ergaben, daD die Komplexe mit anderen Steroiden wesentlich schwacher sind. Der Ver- gleich der Komplexierungen von 6b und 8 [A(AGo)6,,-8 = 0.8 k ~ a l i n o l - ~ ] zeigt, daR die n-Bindung am C(5)-Atom des Ste- roidgerusts wescntlich zur Komplexstabilitat beitragt. Es ist je- doch nicht geklart, ob dieser Effekt eine Folge giinstiger attrak- tiver Wechselwirkungen der polarisierbaren Olefingruppe mit dem Rezeptor ist oder auf unterschiedlichen raumlichen Anfor- derungen der beideii Giste an den Hohlraum beruht. Im Gegen- satz zu anderen Cyclophanen, die vorzugsweise aromatische Steroide bindenIg3 lo], bildet der Rezeptor 1 nur einen schwa- chen Komplex mit 10. Der EinfluR der aliphatischcn Seitenkette auf die Komplexstabilitat ist zwar deutlich erkennbar, aber klein [A(ACo),-, = 0.3 kcalmol-'1. Daraus geht hervor, daD dieser hydrophobe Rest nur teilweise in den Hohlraum von 1 ein- taucht. Je polarer das Steroid ist, desto schneller nimmt die Affnitat zum Rezeptor ab. Ein Vergleich der Komplexbil- dungskonstanten der Sauren 11 a und 11 b deutet darauf hin, dal3 schon eine einzige, stark solvatisierte OH-Gruppe am Steroidring B die Bildung stabiler Komplexe stark beein- trachtigt.

Die Untersuchungen zur Bindung von Steroiden durch 1 zei- gen, daR dieser Rezeptor die notige Affinitlt und Spezifitit auf- weist, urn in bezug auf das Auflosen fester Cholesterin-Ablage- rungen unter biologischen Bedingungen getestet zu werden. Auf diese Weise konnte eine neue, auf dem Einsatz synthetischer Rezeptoren beruhende Therapie gegen Arteriosklerose entwik- kelt werden.

1689 Angekv. Chon. 1994, 106, Nr. 15/16 0 VCH VerIug.~~eselischujt mbH. 0-65451 Weinheim, 1994 0044-8249/54/i5i5-16X5 $10.00+ ,2510

ZUSCHRIFTEN Tabellc 2. Assoziationskonstanten K, und freie Bindungsenergien -AGO, erhalten aus 'H-NMR-Titrationen Cur 1 : I-Sterord-Komplexe des Rezeptors 1 in CD,OD hei 298 K. Ebenfalls gezeigt sind die aus dem Titrationsverlauf abgeschitzten komplexierungshedingten Anderungen der chemiwhen Verschiebnng A&., der CH ,-Protonen (Position 18) bei der SBttigungskonzentration [a].

Steroid X Y Z K - AGO A&,, [Lmol-'1 [kcalmol-'1 CHJ18)

X

0

OH

H3

6a 6 b 6c

7a 7b 7c

8

9

10

I l a 11 b

Cholesterylacetat OCOCH, 5-Cholesten H CholeTterin OH

Testosteron OH Cortison COCH20H Hydrocortison COCH,OH

5-a-Cholestan

5-x-Androstan

8-Ostradiol

Lithocholsiore H Chenodesoxycholsdure OH

4800 3200 1500

H H2 2100 OH 0 1 50 OH wH, a-OH 110

870

500

390

310 40

5.0 1.95 4.8 1.19 4.3 1.70

4.5 1.69 3.0 2.16 2.8 0.60

4.0 1.57

3.7 1.74

3.5 2.04

3.4 0.57 2.2 [b]

~~

[a] Die Assoziationskonstanlen wurden anhand von 500 MHz-'H-NMR-Titrationen durch nichtlineare Kurvenanpassung nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate bestinunt. Die Signale der diastereotopen Methylgruppen CH ?(l8) wurden nicht aufgelost. und die gekgten Assoziationskonstanten stellen einen Mittelwert fur h i d e diastereomere Komplexe dar. Diese Niiherung wird durch das Fehlen nennenswerter differentieller komplexierungsindnzierter Verschicbungen bei den diaskreomeren Komplexen gerechtfertigt. Reproduzierbarkeit der K,-Werte: _+ 10%. [b] Geschatzler oberer Grenrwert.

Experimentelks Bestimmung von K, und AGO: Losungen von l ( 1 - 2 mM) in H,O wurden in Gegen- wart eines Uberschusses an festem Steroid wiihrend 45 min heschallt und anschlie- Bend 2 h zur Gleichgewichtscinstellung bei 295 K ruhen gelassen. Die erhaltene Suspension wurde nach Zentrifugieren uber eine Celluloseacetat-Membrdn mit ei- ner Porengrolje von 0.45 fim filtriert. Nach Entfernen des Wassers im Wasserstrahl- vakuum wnrde CD,OD zugegehen und der Anteil an extrahiertem Steroid durch Integration der 'H-NMR-Signale ermittelt. Zur Berechnung von K, siehc Lit. [is]. Die aufgelisteten Assoziationskonstanten stellen einen Mittelwert fur die beiden diastereomeren Komplexe, die vergleichhare Stabilitat zeigen. dar (siehe Tabelle 2). Analytische Daten von 1: Schmp. 250 252°C (Zers.): 'H-NMR (500MHz, (CD,),SO, 400 K, Nnmerierung der Atome in Formel von 3): 6 =1.22-1,33 (m, 24H, NCH,CH,), 1.92-2.05 ( 2 m. 16I-I, CHJH,), 2.55-2.91 (br., 3m. 16H, NCH,CH,): 3.13 3.52 (br., 5 m, 32H, NCII,CH,, NCH,CH,), 3.88 (s. 12H, OCH,),4.08-4.14(2m, 16H, PhOCH,,NaphOCHJ. 6.87 (br. s. 8H, PhH-C(6), Ph H-C(2)), 7.06 (hr. s, 4H. NaphH-C(S)), 7.14 (br. s, 4H. NaphH-C(B)), 7.21 (br. s. 4H, NaphH-C(3)), 7.39-7.48 (m, 8H, NaphH-C(4), NaphH-C(7)), 7.49-7.63 (m, 4H, NaphH-C(I)); I3C-NMR (125.8 MHz, CD,OD, 300K) 6 =7.27, 7.51, 7.83, 7.90, 26.90. 27.67. 29.82. 30.72.44.61, 52.78, 56.83, 59.04,68.68, 74.05, 91.16, 107.44, 112.88, 119.51. 120.44, 124.32, 125.24. 126.09, 129.01, 130.16, 130.75. 134.61, 141.68 ( 2 x). 148.95, 154.51, 158.58. Matrix-assistierte Laserdesorp- tions-Flugzeitmassenspektrometrie (MALDI-TOF, Sinapinsiure): mlz: 2029 ( M i , Cl,,H,,,N,0,,C14), ber. 2024.98. Korrekte C,H.N-Analyse fur C,,,H,+8N,O,,CI, - 8 H 2 0 (2172.52).

Eingegangen am 6. April 1994 [Z 68291

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