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Tetrahedron Letters No. 26, pp. 1761-1766, 1963. Pergamon Press Ltd. Printedin Great Britain. MASSENSPEKTBOMETBISOHEUNTERSUCHUNGEN VON ACYLIERTEN PEPTIDEN IC. Heyne und H. F. Griitzmacher Chemisches Staatsinstitut der Universitiit Hamburg Inatitut fiirOrganische Chemie (Received 2 September 1963) Die Bestimmung der Aminosauresequenz von Peptiden mit Hilfe der Massenspektrometrie war bisher nur auf Um- wegen mijglich, weil wegen der geringen Fltichtigkeit der Peptide ein fur die Aufnahme eines Massenspektrums not- wendiger Partialdruck von lo -2 Torr im EinlaSsystem des Massenspektrometers nicht erreicht werden konnte. Zur Um- wandlung der Peptide in hinreichend fliichtige Derivate ist die Uberfiihrung in N-Trifluoracetyl-peptid-methylester 1) oder Reduktion zu Aminoalkoholen 2) empfohlen worden. Die dazu notwendigen chemischen Umsetzungen sind aber mit kleinen Probemengen nur umstandlich durchzufiihren. Nach Weiterentwicklung 3) der von R. I. Reed 4) vor- geschlagenen Methode des direkten Einlasses der MeSprobe in die Ionenquelle des Massenspektrometers kijnnen such die Massenspektren von kleineren freien Peptiden erhalten wer- den. Es hat sich jedoch gezeigt, da13 diese Massenspektren fiireine Sequenzanalyse der Peptide wenig geeignet sind. 1761

Massenspektrometrische untersuchungen vow acylierten peptiden

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Page 1: Massenspektrometrische untersuchungen vow acylierten peptiden

Tetrahedron Letters No. 26, pp. 1761-1766, 1963. Pergamon Press Ltd. Printed in Great Britain.

MASSENSPEKTBOMETBISOHE UNTERSUCHUNGEN

VON ACYLIERTEN PEPTIDEN

IC. Heyne und H. F. Griitzmacher

Chemisches Staatsinstitut der Universitiit Hamburg

Inatitut fiir Organische Chemie

(Received 2 September 1963)

Die Bestimmung der Aminosauresequenz von Peptiden

mit Hilfe der Massenspektrometrie war bisher nur auf Um-

wegen mijglich, weil wegen der geringen Fltichtigkeit der

Peptide ein fur die Aufnahme eines Massenspektrums not-

wendiger Partialdruck von lo -2 Torr im EinlaSsystem des

Massenspektrometers nicht erreicht werden konnte. Zur Um-

wandlung der Peptide in hinreichend fliichtige Derivate ist

die Uberfiihrung in N-Trifluoracetyl-peptid-methylester 1)

oder Reduktion zu Aminoalkoholen 2) empfohlen worden. Die

dazu notwendigen chemischen Umsetzungen sind aber mit

kleinen Probemengen nur umstandlich durchzufiihren.

Nach Weiterentwicklung 3) der von R. I. Reed 4) vor-

geschlagenen Methode des direkten Einlasses der MeSprobe

in die Ionenquelle des Massenspektrometers kijnnen such die

Massenspektren von kleineren freien Peptiden erhalten wer-

den. Es hat sich jedoch gezeigt, da13 diese Massenspektren

fiir eine Sequenzanalyse der Peptide wenig geeignet sind.

1761

Page 2: Massenspektrometrische untersuchungen vow acylierten peptiden

1762 Massenspektrometrische Untersuchungen No.26

Wie unten gezeigt wird, ist dies jedoch an Hand der Massen-

spektren von acylierten Peptiden moglich.

F. Weygand und Mitarb. 5) berichteten kiirzlich iiber

die mit Hilfe des direkten Probeneinlasses erhaltenen Bassen-

spektrert von B-Trifluoracetyl-peptid-methylestern. Sie konn-

ten auf diese Weise Massenspektren von Pentapeptidderivaten

aufnehmen. Wir haben nach der gleichen EinlaSmethode Massen-

spektrer. von N-Acetyl- und N-Trifluoracetylpeptiden aufge-

nommen 'I. Diese Peptidderivate konnen leicht mit besonders

geringen. Substanzmengen durch Losen der Peptide in einem

Gemisch Essigsaure/Acetanhydrid bzw. Trifluoressigsaure/

Trifluoracetanhydrid und Eindampfen der Losung im Vakuum

erhalten werden. Die Fliichtigkeit dieser Verbindungen

reicht aus, urn Massenspektren von acylierten Pentapeptiden

aufzunehmen. Eine Reduktion dieser Peptidderivate zu den

entsprechenden Aminoalkoholen oder eine Veresterung ist

daher nicht notwendig.

Im Vergleich zu freien Peptiden besitzen acylierte

Peptide neben ihrer grol3eren Fliichtigkeit den Vorteil, da13

ihr N-terminaler Aminosaurerest durch den Acylrest markiert

ist. In ihren Massenspektren tritt daher ein charakteristi-

scher peak bei der MZ *) des "Acylamin "-Ions CH3CO-NHCHR'

bzw. CF3CO-NHCHRG auf. Durch diesen peak wird die N-termi-

nale Aminosaure angezeigt und die Deutung des Massenspek-

trums wesentlich erleichtert.

Als Beispiele sind in FIG. 1 und 2 die Massenspektren

von N-Acetyl-leucyl-valyl-alanin und N-Trifluoracetyl-glycyl-

valyl-leucin angegeben. Die ttAcylamin"-Ionen bei den ;lZ 128

\- ’ ?‘iZ = Xassenzahl *; ;-: = !;olel:ularCewicht

Page 3: Massenspektrometrische untersuchungen vow acylierten peptiden

No.26 Massenspektrometrische Untersuchungen 1763

(OB300-~BO~O-04~9) und 126 (cF~OO-NHOH~~) treten deutlich

hervor. 1'Acetylamin9'-Ionen kiinnen den Acetylrest als Keten

eliminieren und in das fiir die betreffende Aminosaure ty-

pische "Amin"-Ion iibergehen. Auf diese Weise wird der in-

tensive peak bei der I12 86 im Massenspektrum des Acetyl-

leucylpeptids gebildet. II Trifluoracetylamin II - Ionen

zeigen diese Spaltung nicht. Die Ionen der MZ 30 in FIG. 2

besitzen einen anderen Ursprung. Dieser Unterschied der

beiden Acylgruppen ist aus dem Verhalten der Acetyl- und

Trifluoracetyl-aminosauren bei ElektronenstoS bekannt 7).

Auf lbnlichem Wege konnen such die "Amin"-Ionen der iibrigen

Aminosaurereste des Peptids entstehen. Das Massenspektrum

eines N-Acetylpeptids besitzt daher intensive peaks bei

den MZ der "Amin"-1onen aller im Peptid enthaltenen Amino-

sluren. So kljnnen in FIG. 1 die peaks der XZ 44, 72 und 86

dem Alanin, Valin und Leucin zugeordnet werden. Im Massen-

spektrum eines N-Trifluoracetyl-peptids fehlt dagegen das

"Amin"-Ion der N-terminalen Aminosaure; in FIG. 2 beob-

achtet man grolje peaks nur bei den MZ 72 und 86. Die im

Peptid enthaltenen Aminosauren konnen so aus dem Massen-

spektrum seines Acylderivats leicht ermittelt werden.

Die charakteristischen Ionen im oberen Massenbereich

lassen sich durch Spaltungen der Bindungen zu beiden Seiten

der Oarbonylgruppen der Peptidbindungen erklaren, wie es in

den Formeln der FIG. 1 und 2 schematisch angedeutet ist. Die-

se Spaltungen sind aus den Massenspektren der Trifluoracetyl-

peptid-methyl-ester bekannt. Mit ihrer Hilfe kann die Ami-

nosaureseouenz des Peptids bestimmt werden. Zusatzlich kon-

Page 4: Massenspektrometrische untersuchungen vow acylierten peptiden

r- -

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227

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FIG.l. Massenspektrum des N-Acetyl-leucyl-valyl-alanins

bei 70 eV

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Page 5: Massenspektrometrische untersuchungen vow acylierten peptiden

No.26 Massenspektrometrische Untersuchungen 1765

1 z E

Page 6: Massenspektrometrische untersuchungen vow acylierten peptiden

1766 Massenspektrometrische Untersuchungen No.26

nen jedoch Ionen auftreten, deren Entstehung durch Eliminie-

rung der Seitenketten oder Spaltungen in diesen Seitenketten

bedingt wird. Die Bildung analoger, fiir die einzelnen Amino-

sluren typischer Ionen ist aus den Massenspektren der Amino-

slurederivate bekannt 7,8,9,10) . Beispiele fur diese Ionen in

den abgebildeten Massenspektren sind die Ionen M-56 *) und M-74.

Diese fiir Leucin und Isoleucin typischen Ionen entstehen durch

Eliminierung der Seitenkette als Buten und zusatzliche Abspal-

tung eines H20-Molekiils. Analog wird das Ion MZ $99 (FIG.1)

aus dem N-terminalen Acetyl-leucyl-Rest gebildet.

Eine systematische Untersuchung der Massenspektren von

acylierten Peptiden 6) , die wir zur Zeit noch fortfiihren, hat

gezeigt, darj die Bildung solcher Ionen nicht nur von der Art

der einzelnen AminosYurereste abhangt, sondern such von ihrer

Stellung in der Peptidkette. So sind die fgr den einzelnen

Aminosaurerest typischen Spaltreaktionen besonders ausgepragt,

wenn die betreffende Aminosaure C-terminal vorliegt.

Dec1 Bundesminister fiir Wissenschaftliche Forschung danken

wir fur finanzielle Unterstutzung dieser Arbeit.

LITERATUR

l.C.O.Andersson, Acta Chem.Scand., 12, 1353 (1958) E.Stenhagen, Z.anal.Chem., 181, 4bz (1961)

2.K.Bienann,F.Gapp,J.Seibl,J.Amer.chem.Soc.,~,2274 (lq5q)

3.K.Heyns,H.F.Grijtzmacher,kngew.Chern.,74,387-i1962)

4.R.I.Reed,J.Chem.Soc., 1956, 3432

5.P.Wey~:~d,A.-Drox,~J.Kiinig,II.H.Fessel,An~ew.Chem.,75 724 (1963 -’ 6.K.Heyns,H.F.Griitzmacher, Liebigs &n.Chem., im Druck

7.K.Heyns,H.F.Griitzmacher, Liebigs Ann.Chs., im Druck

8.K.Heyns,H.F.Grutzmacher, Z.Naturforsch.,E, 293 (1961)

q.K.Bienann,J .Seibl,F.Gapp,J.Amer.chem.Soc.,8&,3795 (1961)

lo.C.C.tiuldersson,H.Ryhage,E.Stenhagen ,ArXiv.Kemi,s,417 (1962)