Medizinische Fakultät

der

Universität Duisburg-Essen

Aus dem Institut für Physiologische Chemie

Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus des Onkoproteins Bcl-2: Stabilisierung der Calciumhomöostase als Folge des Effektes von Bcl-2 auf

zelluläres Glutathion

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin

durch die Medizinische Fakultät

der Universität Duisburg-Essen

Vorgelegt von

Matthäus Michael Rimpler

aus Tychy/Polen

2003

2

Dekan: Univ.-Prof. Dr. H. Grosse-Wilde

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. H. de Groot

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. T. Möröy

3. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. W.A. Schulz, Düsseldorf

Tag der mündlichen Prüfung: 22. Oktober 2003

3

Ergebnisse dieser Arbeit wurden veröffentlicht in:

Rimpler, M.M., Rauen, U., Schmidt, T., Möröy, T. and H. de Groot. (1999).

„Protection against hydrogen peroxide cytotoxicity in Rat-1 fibroblasts provided

by the oncoprotein Bcl-2: maintenance of calcium homeostasis is secondary to

the effect of Bcl-2 on cellular glutathione“

Biochemical Journal; 340: 291-297

Ergebnisse dieser Arbeit wurden auf folgenden Tagungen zur Fachdiskussion

vorgestellt:

4. Workshop „Mechanismen der Zell- und Gewebeschädigung“,

Giessen/Marburg 27.-29. November 1997

22. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zellbiologie,

Saarbrücken 15.-19. März 1998:

Rimpler, M.M., Rauen, U.,Schmidt, T., Möröy, T. and H. de Groot. (1998).

„Bcl-2 exerts its protective effect against hydrogen peroxide by maintaining

glutathione levels“

European Journal of Cell Biology; 75 (suppl. 48): 41

Diese Arbeit wurde gefördert durch ein Stipendium der medizinischen Fakultät der

Universität Essen (IFORES Programm) und den Fonds der Chemischen Industrie.

4

Inhaltsverzeichnis

Seite

1. Einleitung 8

1.1 Das Onkoprotein Bcl-2 8

1.2 Reaktive Sauerstoffspezies und Apoptose 10

1.3 Der Schutzmechanismus von Bcl-2 11

2. Zielsetzung der Arbeit 12

3. Material und Methoden 13

3.1 Material 13

3.1.1 Chemikalien 13

3.1.2 Materialien zur Sterilisation 14

3.2 Zellen und Zellkultur 14

3.2.1 Herkunft und Eigenschaften der Zelllinien 14

3.2.2 Durchführung der Zellkultur 15

3.2.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen 15

3.2.4 Vorgehen bei Experimenten 16

3.2.5 Lösungen und Reagenzien für die Zellkultur 16

3.3 RNA-Techniken 18

3.3.1 Aufreinigung von RNA 18

3.3.2 Auftrennung von RNA 18

3.3.2.1 Lösungen und Reagenzien für die Auftrennung von RNA 19

3.3.3 Transfer von RNA auf Nylonmembranen: „Northern-Analyse“ 19

3.3.3.1 Kapillartransfer von RNA 19

3.3.3.2 Hybridisierung von RNA auf Nylonmembranen 20

3.4 Protein-Techniken 21

3.4.1 Herstellung von Gesamtzellproteinextrakten 21

3.4.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinen 22

5

3.4.3 SDS-PAGE: Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen 22

3.4.4 „Western“-Analyse 23

3.4.4.1 Proteintransfer 23

3.4.4.2 Immunologischer Nachweis 24

3.4.4.3 Verwendete Antikörper 25

3.5 Vitalitätsbestimmungen 25

3.5.1 LDH-Freisetzung (nach Katrin, 1999) 25

3.5.1.1 Prinzip der Bestimmung 25

3.5.1.2 Lösungen und Reagenzien 26

3.5.2 Aufnahme von Trypanblau 27

3.6 Bestimmung des zellulären ATP-Gehaltes mittels

Kapillarelektrophorese 27

3.6.1 Methode und Durchführung der Messungen 27

3.6.2 Probenaufbereitung 28

3.6.3 Lösungen und Reagenzien 29

3.7 Kinetik des H2O2-Abbaus 29

3.7.1 Prinzip der Messung 29

3.7.2 Versuchsdurchführung 29

3.7.3 Lösungen und Reagenzien 30

3.8 Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der intrazellulären

Ca2+-Konzentration 30

3.8.1 Prinzip der digitalen Fluoreszenzmikroskopie 30

3.8.2 Versuchsdurchführung 32

3.9 Enzymatische Bestimmung von intrazellulärem Glutathion 32

3.9.1 Bestimmung von reduziertem Glutathion 32

3.9.1.1 Prinzip der Messung 32

3.9.1.2 Probenaufbereitung und Versuchsdurchführung 33

3.9.1.3 Lösungen und Reagenzien 33

3.9.2 Bestimmung von oxidiertem Glutathion 34

6

3.9.2.1 Prinzip der Messung 34

3.9.2.2 Probenaufbereitung und Versuchsdurchführung 34

3.9.2.3 Lösungen und Reagenzien 34

3.10 Bestimmung von intrazellulärem Glutathion auf

Einzelzellebene 35

3.10.1 Prinzip der Bestimmung 35

3.10.2 Probenaufbereitung und Versuchsdurchführung 35

3.11 Statistik 35

4. Ergebnisse 36

4.1 Expression von Bcl-2 36

4.2 Effekte von Glucose, Quin-2 und der Überexpression von

Bcl-2 auf den H2O2-induzierten Zelltod 36

4.3 Effekte von H2O2, Glucose und der Überexpression von

Bcl-2 auf den Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration 40

4.4 Kinetik des zellulären H2O2-Abbaus von Rat-1-Fibroblasten 40

4.5 Effekte von H2O2 und Glucose auf den zellulären

ATP-Gehalt von Rat-1-Fibroblasten 46

4.6 Effekte von Bcl-2, H2O2 und Glucose auf den Gehalt

an GSH und GSSG von Rat-1-Fibroblasten 46

4.7 Bestimmung des intrazellulären Glutathion-Gehaltes auf

Einzelzellebene 50

7

4.8 Effekte von N-Acetylcystein auf die Vitalität, den

H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen

Ca2+-Konzentration und den Glutathion-Gehalt

von Rat-1-Fibroblasten 53

4.9 Effekte von BSO auf die Vitalität, den

H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen

Ca2+-Konzentration und den Glutathion-Gehalt

von Rat-1-Fibroblasten 53

4.10 ffekte erhöhter H2O2-Konzentrationen auf die Vitalität

und den H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen

Ca2+-Konzentration von Rat-1/Bcl-2-Zellen 59

5. Diskussion 63

5.1 H2O2, Glutathion und Calciumhomöostase 63

5.2 Der Schutzeffekt von Bcl-2 64

5.3 Bcl-2 und zelluläres Glutathion 65

6. Abkürzungsverzeichnis 69

7. Zusammanfassung 71

8. Literaturverzeichnis 72

8

1. Einleitung

1.1 Das Onkoprotein Bcl-2

Die Bezeichnung des Proto-Onkogens bcl-2 bzw. des von diesem Gen kodierten

Proteins Bcl-2 mit einer molekularen Masse von 26 kDa geht auf seine ursprüngliche

Entdeckung in Non-Hodgkin B-Zell Lymphomen zurück (B-cell lymphoma). In diesen

Tumoren konnte das Gen an den chromosomalen Bruchpunkten gefunden werden,

die der Translokation t(14;18) zugrunde liegen. Dabei wird das bcl-2-Gen von seiner

normalen Position auf 18q21 in die Nähe des Immunglobulin-Locus auf 14q32

transferiert und gerät so unter den Einfluss des starken IgH-Enhancers mit

nachfolgender Überexpression des Bcl-2-Proteins (89). Die onkogene Eigenschaft

von Bcl-2 beruht nicht auf der Steigerung der Zellproliferationsrate, sondern vielmehr

auf der reduzierten Apoptoserate der betroffenen B-Zellen. Mit der Klonierung des

ced-9 Gens von C. elegans konnte bcl-2 überdies als menschliches Homolog dieses

anti-apoptotischen Proteins identifiziert werden. Die artifizielle Überexpression von

Bcl-2 ist in verschiedenen Zellkulturen gelungen und erweist sich als potentes

antiapoptotisches Signal. Das Bcl-2-Protein ist primär an der äußeren

mitochondrialen Membran, dem endoplasmatischen Retikulum und der

Zellkernmembran lokalisiert (47, 67, 87). Bcl-2 ist der Prototyp einer großen und

weiterhin wachsenden Familie von Proteinen, der sogenannten Bcl-2-Familie. Die

Mitglieder dieser Familie zeigen untereinander eine signifikante Homologie, obwohl

einige dieser Proteine proapoptotische Wirkung zeigen, z.B. Bax und Bak (1, 71).

Obwohl Bcl-2 und auch andere Bcl-2-Familienmitglieder als einzelne Proteine wirken

können, wird ihre Aktivität durch Bildung von Homo- und Heterodimeren reguliert (15,

63, 72). Die Homologie zwischen den Familienmitgliedern ist innerhalb vier Domänen

konserviert: BH 1, BH 2, BH 3 und BH 4 (78). Die BH 3 Domäne scheint essentiell für

die Dimerisierung zu sein (Abbildung 1). Sequenzanalysen haben gezeigt, dass Bcl-

2, wie auch viele andere Mitglieder der Bcl-2 Familie, eine hydrophobe

Aminosäurenkette am carboxyterminalen Ende aufweist, welche für die Lokalisation

an den oben genannten intrazellulären Membranen verantwortlich ist (47, 66, 67, 87).

9

Abbildung 1: Struktur des humanen Bcl-2-Proteins

Dargestellt ist die Position der 7 α-helikalen Sequenzen und des Transmembran-

Ankers am C-terminalen Ende. Als BH1-BH4 werden die sogenanten „homology

domains“ bezeichnet, welche als gemeinsame Elemente verschiedener Mitglieder der

Bcl-2-Proteinfamilie gelten.

Abbildung modifiziert nach Nature, Vol. 387: 773-776 (1997)

10

1.2 Reaktive Sauerstoffspezies und Apoptose

In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass reaktive Sauerstoffspezies

eine entscheidende Rolle in vielen Zellschädigungsmodellen einnehmen (Reviews:

(14, 35, 39, 84)). Der Prozess der Apoptose kann durch die exogene Zugabe von

reaktiven Sauerstoffspezies ausgelöst werden, wie z. B. Wasserstoffperoxid (H2O2),

oder durch die Oxidation von endogenen Thiolen wie es für Menadion oder

Diethylmaleat beschrieben wurde. Darüber hinaus ist in vielen Fällen der

apoptotische Prozess selbst mit der Produktion von intrazellulären reaktiven

Sauerstoffspezies assoziiert. Die intrazelluläre Bildung reaktiver Sauerstoffspezies

kann durch unterschiedliche Stimuli initiiert werden, z. B. durch Tumornekrose-

Faktor-α (TNF-α) oder Ceramid (37, 55, 64).

Der molekulare Mechanismus der durch reaktive Sauerstoffspezies induzierten

Zellschädigung ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Grundsätzlich können reaktive

Sauerstoffspezies über die direkte Schädigung von Membranen, Membranproteinen

und Nukleinsäuren zur Nekrose führen (26), in geringeren Dosen aber vor allem zur

spezifischen Initiierung des Apoptose-Programms. Hierbei wurde z. B. die Induktion

der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK, auch als „stress-activated proten kinase, SAPK,

bezeichnet) diskutiert (91), ebenso wie die Aktivierung von p53 (2, 36, 53), beides

Ereignisse, die über die konsekutive Aktivierung von Caspasen zum typischen

morphologischen Bild der Apoptose führen. Reaktive Sauerstoffspezies führen in

einigen Zellschädigungsmodellen zum Anstieg der cytosolischen und nukleären

Ca2+-Konzentration (22). Nach Bindung von Ca2+ an Calmodulin bindet dieses

wiederum an Calcineurin, eine Ca2+-abhängige Phosphatase, welche über die

Aktivierung von Caspasen zur Apotose führen kann (22). Schliesslich können

reaktive Sauerstoffspezies über die Thiol-Oxidation von mitochondrialen Membran-

Proteinen zur Induktion der sogenannten „mitochondrial permeability transition

(MPT)“ führen (16, 26, 46). Hierbei handelt es sich um eine Permeabilitätserhöhung

der inneren mitochondrialen Membran und dem nachfolgenden Zusammenbruch des

Membranpotentials ∆φ. Der Zusammenbruch des mitochondrialen

Membranpotentials gilt als wichtiges Ereignis während der Apoptose.

Aufgrund der Tatsache, dass reaktive Sauerstoffspezies zu

Zellschädigungsprozessen führen können, lag die Vermutung nahe, dass

Antioxidantien diese Prozesse hemmen könnten. Dies wurde für viele

natürlicherweise intrazellulär vorkommende Antioxidantien, wie z. B. intrazelluläres

11

Glutathion oder Thioredoxin, bestätigt (7, 14, 77, 84). Auch exogen zugeführte

Antioxidantien wie z.B. N-Acetylcystein erwiesen sich als potente Inhibitoren von

Zellschädigungsprozessen (58). Der ursprüngliche Vorschlag von Hockenbery et al.

(37), dass auch das Bcl-2-Protein antioxidative Kapazität habe, basierte auf der

Beobachtung, das die durch Menadion oder durch H2O2 induzierte Apoptose in

Zellen mit verstärkter Bcl-2-Expression gehemmt wurde.

1.3 Der Schutzmechanismus von Bcl-2 Es fällt auf, daß Bcl-2 die durch verschiedene Auslöser initiierte Zellschädigung

inhibieren kann. Hierzu zählen die Zellschädigung durch Glucocorticoide, DL-

Buthionin-(S, R)-sulfoximin (BSO), Ca2+-Ionophore, γ-Strahlung, Menadion, reaktive

Sauerstoffspezies oder durch den Entzug von Interleukin-3 (62, 78). Der

Mechanismus der biologischen Wirkung des Bcl-2-Proteins wird seit langem

kontrovers diskutiert.

In einigen der o. g. Schädigungsprozesse scheint die Störung der Ca2+-Homöostase,

hier insbesondere der cytosolische Anstieg der Ca2+-Konzentration eine

entscheidende cytotoxizitätsvermittelnde Rolle zu spielen (59). Dementsprechend

wurden die Effekte von Bcl-2 auf die Ca2+-Homöostase bzw. den Ca2+-vermittelten

Zelltod in einer Vielzahl von Modellen untersucht (6, 11, 18, 19, 33, 56, 65, 79, 99).

Diese Untersuchungen führten jedoch zu teilweise widersprüchlichen Ergebnissen

und ergaben kein klares Bild hinsichtlich der Rolle von Bcl-2 bei Ca2+-vermittelten

Zellschädigungsprozessen. Vor allem blieb unklar, ob Bcl-2 die intrazelluläre Ca2+-

Kompartimentierung direkt durch Beeinflussung der transmembranären Ca2+-Ströme

reguliert oder ob hier vorgeschaltete Ereignisse eine entscheidende Rolle spielen.

In mehreren Studien an unterschiedlichen Zelltypen konnte ein Effekt von Bcl-2 auf

zelluläres Glutathion gezeigt werden. Die beschriebenen Effekte waren vielfältig, so

wurde berichtet über eine Hochregulierung der cytosolischen Glutathionsynthese

oder über die Erhöhung der Apoptoseresistenz durch einen „Shift“ des

Oxidations/Reduktionspotentials hin zu einem mehr reduzierten Zustand (21, 61, 64,

90, 93). In anderen Arbeiten wurde eine Umverteilung des zellulären Glutathions in

den Zellkern mit verbessertem Schutz vor DNA-Fragmentation beschrieben (95).

Leider wurde in diesen Studien über die Zusammenhänge von Bcl-2 und zellulärem

Glutathion nicht der Einfluss auf die Ca2+-Homöostase untersucht, obwohl in

mehreren Zellschädigungsmodellen durchaus Verbindungen zwischen dem

12

zellulären Calcium- und dem Glutathionmetabolismus etabliert werden konnten.

Letzteres trifft vor allem auf das Modell der H2O2-vermittelten Zellschädigung zu, die

über mehrere Jahre intensiv untersucht wurde (25, 34, 68). Im Rahmen dieses

Modells wurde auch eine protektive Wirkung von Bcl-2 im Sinne einer Hemmung des

cytosolischen Ca2+-Anstieges beschrieben (18, 37, 100).

Darüberhinaus wird in mehreren Modellen der Schutzeffekt von Bcl-2 auf die

Hemmung der MPT (s.o.) zurückgeführt, ebenso wie auf die Heterodimerisierung und

Inaktivierung von proapoptotischem Bax (78). Die genauen zugrundeliegenden

Mechanismen blieben jedoch unklar.

2. Zielsetzung der Arbeit Ziel dieser Arbeit ist es, ein Modell zu entwickeln, welches die unterschiedlichen

Effekte von Bcl-2 auf die intrazelluläre Ca2+- und Glutathionhomöostase vereinen

kann. Insbesondere soll in dieser Arbeit geprüft werden, ob in Rat-1-Fibroblasten

nach Schädigung mit H2O2 die Erhöhung der cytosolischen Ca2+-Konzentration

sekundär nach Oxidation des zellulären Glutathion-Pools auftritt und ob die

Aufrechterhaltung der Ca2+-Homöostase durch Bcl-2 nur indirekt über den Effekt auf

zelluläres Glutathion vermittelt wird.

13

3. Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Chemikalien

Folgende Übersicht gibt Auskunft über die Quellen der jeweiligen Chemikalien:

H2O2 Sigma, Deisenhofen

Probenicid Sigma, Deisenhofen

Buthionin-Sulfoximin (BSO) Sigma, Deisenhofen

Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) Sigma, Deisenhofen

N-Acetylcystein Sigma, Deisenhofen

Methylglyoxal Sigma, Deisenhofen

Glyoxalase I Sigma, Deisenhofen

Monochlorobiman Molecular Probes, Eugene, OR, USA

Pluronic F-127 Molecular Probes, Eugene, OR, USA

Quin-2-AM Molecular Probes, Eugene, OR, USA

Fura-2-AM Molecular Probes, Eugene, OR, USA

Peroxidase Boehringer, Mannheim

Glutathion-Reduktase Boehringer, Mannheim

Dulbeccos´s modified eagle medium Gibco, Eggenstein

Fetal calf serum Gibco, Eggenstein

Die im Text näher bezeichneten Antikörper wurden von folgenden Firmen bezogen:

Fa. Santa Cruz, Santa Cruz/Heidelberg

Fa. Dianova, Hamburg

Fa. Biorad, München

Alle anderen Chemikalien stammten von Merck, Darmstadt.

14

3.1.2 Materialien zur Sterilisation

Die Sterilisation der für die Zellkultur verwendeten Materialien erfolgte in einem

Autoklaven der Firma Varioklav (München). Zur Sterilfiltration wurden Rotrand-

Einmalfilter (Schleicher & Schuell, Dassel) verwendet. Größere Volumina wurden

unter Verwendung eines Sartoban-Filters (Sartorius, Göttingen) und eines

Druckbehälters (Sartorius, Göttingen) sterilfiltriert. Zur sterilen Arbeit mit den

Zellkulturen stand eine Sterilbank der Firma Babcock-BSH (Bad Hersfeld) zur

Verfügung.

3.2 Zellen und Zellkultur 3.2.1 Herkunft und Eigenschaften der Zelllinien Die in dieser Arbeit verwendeten Zelllinien stammen aus dem Labor von Dr. G. I.

Evan und Dr. T. Littlewood (Biochemistry of the Cell Nucleus Laboratory, Imperial

Cancer Research Fund, London, U. K.).

Zur Untersuchung der Funktion von Bcl-2 wurden zwei individuelle Zellklone von Rat-

1-Fibroblasten verwendet, welche stabil mit einem retroviralen Vektor transfiziert

wurden, der eine konstitutive Expression von humanem Bcl-2 vermittelt (Rat-1/Bcl-

2#1 und Rat-1/Bcl-2#2). Gemeinsam mit dem Gen für das Bcl-2-Protein befand sich

auf dem retroviralen Vektor ein Puromycin-Resistenzgen, welches die sichere

Selektion von effektiv transfizierten Rat-1-Fibroblasten ermöglicht (24). Als Kontroll-

Zelllinie wurden nicht transfizierte Rat-1-Fibroblasten verwandt, im folgenden als

„Rat-1/Wildtyp“ bezeichnet. Um auszuschliessen, dass allein die Transfektion mit

einem retroviralen Vektor das biologische Verhalten von Rat-1-Fibroblasten

signifikant verändert, wurde als Vektorkontrolle eine Zelllinie von Rat-1-Fibroblasten

eingesetzt, die konstitutiv ein chimäres Protein exprimierten, welches aus einem

kompletten c-Myc Polypeptid, fusioniert an einen Teil eines mutierten, humanen

Östrogenrezeptors, besteht (Rat-1/cMycER). Dieser modifizierte Östrogenrezeptor

kann kein Östrogen binden, zeigt jedoch eine normale Affinität für den synthetischen

Liganden 4-Hydroxy-Tamoxifen (4-OHT). Nur nach Bindung von 4-OHT kommt es zu

einer Aktivierung von c-Myc (38, 51). Auch der hier verwendete retrovirale Vektor

kodierte zusätzlich für ein Puromycin-Resistenzgen. 4-Hydroxy-Tamoxifen war bei

den hier durchgeführten Experimenten grundsätzlich nicht anwesend, c-Myc war

daher inaktiv.

15

3.2.2 Durchführung der Zellkultur

Die Zellkultur erfolgte in Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM, low glucose)

unter Zusatz von 10% (v/v) fetalem, hitzeinaktiviertem Kälberserum (FCS), und

Penicillin/Streptomycin (100 Units/ml bzw. 100 µg/ml). Nach jeweils 5 Passagen

wurden die transfizierten Zellen für jeweils zwei Tage mit 5 µg/ml Puromycin

kultiviert, um eine positive Selektion der effizient transfizierten Zellen zu

gewährleisten. Subkulturen wurden erreicht durch Trypsinierung für 5 min unter

leichtem manuellen Schwenken, mit Beendigung der Reaktion durch Resuspension

in DMEM/10% FCS und anschliessendem Überführen einer geeigneten Zellzahl in

Zellkulturflaschen. Die Subkultivierung erfolgte in 75 cm2 Zellkulturflaschen mit 20 ml

Zellkulturmedium. Für Vitalitätsbestimmungen wurden die Zellen in 6-well

Zellkulturplatten angeimpft und über 24 h in 2,5 ml supplementiertem DMEM

kultiviert. Für die Bestimmung des zellulären ATP-Gehaltes wurden 25 cm2

Zellkulturflaschen verwendet und zur fluoreszenzmikroskopischen Calciummessung

wurden die Zellen auf Glasplättchen mit einem Durchmesser von 28 mm ausplatiert,

welche in 6-well-Zellkulturplatten eingelegt und unter gleichen Bedingungen über 24

h kultiviert wurden. Die Zellen, die für ein Experiment eingesetzt wurden, wurden

jeweils am gleichen Tag subkultiviert. Die Zelldichte betrug 1,0 – 1,2 x 105/cm2 am

Tag des Experimentes.

3.2.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen Für die langfristige Lagerung von Zelllinien wurden die Zellen durch 5-minütige

Zentrifugation bei 900 rpm pelletiert und in 1 ml Einfriermedium resuspendiert. Die

Zellsuspension (5 x 106 Zellen/ml) wurde in Einfrierröhrchen transferiert und in einem

Styroporkästchen bei –80°C gelagert. Nach 48 h konnten die Röhrchen in flüssigen

Stickstoff überführt werden.

Das Auftauen von Zellen erfolgte möglichst schnell in einem Wasserbad bei 37°C.

Anschliessend wurden die Zellen in ein 15-ml-Polypropylen-Röhrchen überführt und

es wurde tropfenweise Zellkulturmedium zugeführt, um eine Schädigung der Zellen

aufgrund des unterschiedlichen osmotischen Wertes von DMSO bzw.

Zellkulturmedium zu vermeiden. Nach Zentrifugation der Zellen und Aufnahme in

frisches Medium konnten diese in das jeweilige Gefäß ausgesät werden.

16

3.2.4 Vorgehen bei Experimenten

Zu Beginn jedes Experimentes wurden die Zellen dreimal mit Hanks´ balanced salt

solution (HBSS) gewaschen und dann mit Krebs-Henseleit-Puffer bedeckt (KH). Die

Inkubation der Zellen erfolgte bei 37°C mit 5% CO2/95% Raumluft. Die Zugabe von

H2O2 erfolgte zu Beginn des Experiments aus einer frisch angesetzten 100 mM

Stammlösung mit 100 µM DTPA. Falls vorgesehen, wurde BSO (0,5 mM) 10 h und

Quin-2-AM (10 µM) oder N-Acetylcystein (40 mM) 1 h vor Beginn des Experimentes

zugegeben.

3.2.5 Lösungen und Reagenzien für die Zellkultur

Hanks´ balanced salt solution (HBSS):

CaCl2 1,3 mM

KCl 5,3 mM

KH2PO4 0,4 mM

MgCl2 x 6 H2O 0,4 mM

MgSO4 x 7 H2O 0,4 mM

NaCl 136,8 mM

NaHCO3 15 mM

Na2HPO4 x 7 H2O 0,3 mM

HEPES 25 mM

pH=7,4

Krebs-Henseleit-Puffer (KH):

NaCl 115 mM

NaHCO3 25 mM

KCl 5,9 mM

MgCl2 1,2 mM

NaH2PO4 1,2 mM

Na2SO4 1,2 mM

CaCl2 2,5 mM

HEPES 20 mM

DTPA 100 µM

pH=7,4

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Trypsinlösung:

Trypsin 0,5%

EDTA 0,2%

5% Trypsin-Stammlösung wurde mit Citrat-Saline im Verhältnis 1:10 verdünnt und

konnte, gelagert bei +4°C, 2-3 Wochen verwendet werden.

Citrat-Saline (10x):

Na-Citrat 150 mM

KCl 1,34 M

pH=7,3

Einfriermedium:

Supplementiertes Zellkulturmedium 50% (v/v)

FCS 40% (v/v)

DMSO 10% (v/v)

Zellkulturmedium:

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Pulver

mit 1000 mg/L D-glucose

mit L-Glutamin

mit 110 mg/L Natrium-Pyruvat

Katalognummer: 31600, Gibco

18

3.3 RNA- Techniken

Beim Arbeiten mit RNA sind zum Schutz vor RNase-Kontaminationen bestimmte

Vorsichtsmaßnahmen notwendig. Dazu gehören das ausschließliche Arbeiten mit

Latex-Einmalhandschuhen, das Behandeln von Lösungen mit Diethylpyrocarbonat

(DEPC) und anschließendem Autoklavieren sowie das Ausbacken von Geräten für 3

h bei 180°C.

3.3.1 Aufreinigung von RNA Die Isolation von Gesamt-RNA aus den konfluent in Zellkulturflaschen gewachsenen

Zelllinien erfolgte unter Anwendung des „RNeasy-Kits“ (Fa. Qiagen, Hilden) nach

dem Protokoll des Herstellers. Nach Aufnahme der Zellen in den Lyse-Puffer wurden

diese in 14-ml-Schnappdeckel-Falcons mit einem Ultra-Turrax (Fa. Janke & Kunkel,

Staufen) homogenisiert. Die Elution erfolgte nach leichter Modifikation des Protokolls

mit 3 x 30 µl DEPC-behandeltem H2O. Die so gewonnene RNA wurde photometrisch

vermessen und bei –80°C zur Lagerung eingefroren oder direkt für die Auftrennung

eingesetzt.

3.3.2 Auftrennung von RNA

Für die elektrophoretische Auftrennung von RNA fanden denaturierende

Formaldehydgele Verwendung (49). Dazu wurden 1,5 g Agarose, 120 ml DEPC-

behandeltes H2O und 1 µl Ethidiumbromidlösung in einem Erlenmeyerkolben

aufgekocht und auf 60°C heruntergekühlt. Danach wurden 26 ml 37%

Formaldehydlösung und 3 ml 50x MOPS hinzugefügt und das Gel in einen

waagerechten Schlitten gegossen. Von der aufzutragenden RNA wurden 10-12 µg

bis zu einem Volumen von unter 6 µl eingedampft, mit 20-30 µl Denaturierungspuffer

versetzt und für 15 min bei 56°C inkubiert. Nach Zugabe einer entsprechenden

Menge 6x Probenpuffer wurden die Proben auf das Gel aufgetragen und bei 100 V

für etwa 6 h in 1x MOPS-Laufpuffer elektrophoretisch aufgetrennt. Über das

gebundene Ethidiumbromid konnte die RNA unter UV-Licht direkt sichtbar gemacht

werden.

19

3.3.2.1 Lösungen und Reagenzien für die Auftrennung von RNA

50x MOPS-Lösung:

MOPS 104,6 g

Na-Acetat 10,3 g

EDTA, 0,5 M, pH 8,0 5 ml

ad 500 ml DEPC-behandeltes H2O

Einstellen des pH mit 10 N NaOH auf 7,0

Denaturierungspuffer:

Formaldehydlösung, 37% 356 µl

Formamid 124 µl

50x MOPS 22 µl

Ethidiumbromidlösung 1 µl

10x SSC:

NaCl 1,5 M

Na-Citrat 0,15 M

pH= 7,5

3.3.3 Transfer von RNA auf Nylonmembranen: „Northern-Analyse“

3.3.3.1 Kapillartransfer von RNA Der Kapillartransfer erfolgte nach der Methode von Thomas et. al (88). Nach der

elektrophoretischen Auftrennung von RNA in einem denaturierenden

Formaldehydgel, wurde dieses für 30 min in 10x SSC-Lösung äquilibriert. Der

Transfer auf die NC-Membran Hybond N+ (Fa. Amersham, London) erfolgte durch

einen Schwerkraft-SSC-Blot (45), der wie folgt aufgebaut wurde: Auf eine Glasplatte

wurde zunächst ein 2-4 cm hoher Stapel aus Whatman 3M-Papier (Fa. Schleicher &

Schuell, Dassel) in gleicher Größe zum Gel gelegt, von denen die letzten beiden

Lagen mit 10x SSC angefeuchtet wurden. Darauf kam die angefeuchtete,

zurechtgeschnittene Membran zu liegen, und auf der wiederum das vorbehandelte

20

Gel. Auf das Gel kamen 2 weitere Lagen angefeuchtetes Whatman 3M-Papier und

hierauf eine angefeuchtete Brücke ebenfalls aus 2 Whatman 3M-Papieren, deren

Enden in eine Plastikwanne mit 10x SSC eintauchten (Transferpuffer). Den Abschluß

bildete wieder eine Glasplatte, die zudem mit einem Gewicht von ca. 500 g

beschwert wurde.

Der Transfer erfolgte durch Schwerkraft und Flüssigkeitsstrom für ca. 16 h, nach

denen der Blot abgebaut und die Membran zur Entfernung von Agarosebestandteilen

kurz in 2x SSC gewaschen wurde. Zur kovalenten Bindung der RNA auf der

Membran wurde diese in einem UV-Stratalinker 2400 (Fa. Stratagene; Amsterdam)

für 30 sec mit 120 mJ/cm2 kreuzvernetzt.

3.3.3.2 Hybridisierung von RNA auf Nylonmembranen

Zur Hybridisierung wurden die Membranen in Polyethylenfolie mit

Hybridisierungslösung luftblasenfrei eingeschweißt und zunächst für mindestens 2 h

bei 65°C inkubiert (sog. Prähybridisierung). Nach dieser Inkubationszeit wurde die

Lösung gegen Hybridisierungslösung ausgetauscht, die eine radioaktiv markierte

Sonde (siehe unten) mit ca. 1x106 counts/ml enthielt. Die Hybridisierung erfolgte für

12 h bei 65°C. Anschließend wurde die Membran mehrmals mit 2x SSC / 0,1 % SDS

gewaschen und autoradiographisch ausgewertet.

Verwendete DNA-Sonde:

Sonde: Beschreibung: Herkunft/Referenz:

bcl-2 0,7 kb HindIII/XbaI murines cDNA-Fragment S. Korsmeyer (70)

Hybridisierungslösung:

SDS 7 % (w/v)

BSA 1% (w/v)

Formamid 15 % (v/v)

Na2HPO4/NaH2PO4 0,2 M, pH= 7,2

EDTA 2 mM

Heringssperma-DNA (10 mg/ml), denaturiert 1 ml

ad 100 ml DEPC-H2O

21

3.4 Protein-Techniken

3.4.1 Herstellung von Gesamtzellproteinextrakten

Das Vorgehen erfolgte in Anlehnung an die Methodensammlung von Sambrook et al.

(81). Zur Isolierung von gesamtzellulären Proteinen wurden Zellen einer konfluent

bewachsenen Zellkulturschale oder Suspensionszellen dreimal mit eiskaltem PBS

gewaschen. Die adhärent wachsenden Zellen wurden anschließend mit Hilfe eines

Gummischabers in 1 ml PBS von der Schale abgelöst. Die Zellen wurden dann

abzentrifugiert (Minifuge, 2 min, 2000 Upm, 4°C) und in 100 µl WCE-Puffer

aufgenommen. Unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation abgetrennt

(Eppendorfzentrifuge, 10 min, 14000 Upm, 4°C). Die im Überstand enthaltenen

Proteine wurden nach einer Proteinbestimmung (vgl. 3.4.2) in Aliquots bei -80°C

gelagert.

WCE-Puffer:

HEPES 50 mM, pH=7,8

NaCl 450 mM

EDTA 0,2 mM

Na-Ortho-Vanadat 1 mM

NaF 20 mM

Glyzerin 25% (v/v)

Der Puffer wurde bei -20 °C gelagert, vor Gebrauch wurden folgende Substanzen

frisch zugegeben:

Aprotinin 50 µg

Leupeptin 50 µg

DTT 1 mM

Phenylmethylsulfonylfluorid 1 mM

NP 40 1% (v/v)

22

3.4.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinen

Die Konzentrationsbestimmung von Proteinen wurde nach der Methode von Bradford

durchgeführt (13). Hierzu wurde ein kommerziell erhältliches Farbreagenz (Bradford-

Reagenz, Fa. Biorad/München) benutzt. 2 µl der jeweiligen Probe (vgl. 2.4.1) wurden

mit 800 µl Wasser und 200 µl Farbreagenz in einer Polystyrol-Einmalküvette

vermischt und für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Aus einem Leerwert und

einer Verdünnungsreihe aus BSA-Standards (2, 4, 6, 8, 10 µg/ml) wurde eine

Eichkurve erstellt. Die Auswertung erfolgte mit einem Photometer bei λ = 595 nm.

3.4.3 SDS-PAGE Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen

Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen fand in diskontinuierlichen,

denaturierenden SDS-PAGE, unter Verwendung der Mini-Proteingelapparaturen der

Fa. Keutz (Reiskirchen), statt (81). Hierzu wurde zuerst zu 4/5 der Gelapparaturhöhe

das Trenngel gegossen und, um eine glatte Oberfläche zu erhalten, mit Isopropanol

überschichtet. Nach vollständiger Polymerisation wurde das Isopropanol entfernt, das

Sammelgel gegossen und anschließend der Probenkamm eingesetzt. Die

aufzutragenden Proteinproben wurden mit dem gleichen Volumen an 2x SDS-

Probenpuffer versetzt, für 5 min bei 95°C denaturiert und kurz abzentrifugiert. Die

Auftrennung erfolgte für 2-3 h bei 30 mA mit 1x SDS-Laufpuffer. Als

Molekulargewichtsstandards dienten 2 µl RainbowTM-Marker (Fa. Amersham,

London).

Trenngel Sammelgel

Trenngelpuffer

Sammelgelpuffer

30% PAA-

Lösung

H2O

10% APS

TEMED

4,25 ml

5,7 ml

6,6 ml

150 µl

8,5 µl

2,25 ml

1,2 ml

5,3 ml

200 µl

15 µl

Tabelle 1: Zusammensetzung der denaturierenden Proteingele

23

Trenngelpuffer:

Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8

SDS 0,4 % (w/v)

Sammelgelpuffer:

Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8

SDS 0,4 % (w/v)

1x SDS-Laufpuffer :

Tris-Base 5,2 mM

Glycin 5,3 mM

SDS 0,01 (w/v) %

2x SDS-Probenpuffer:

Tris-HCl 100 mM, pH 6,8

Glycerin 30 % (v/v)

SDS 3 % (w/v)

β-Mercaptoethanol 5 % (v/v)

Bromphenolblau 0,1 % (w/v)

3.4.4 „Western“-Analyse

3.4.4.1 Proteintransfer Der Proteintransfer erfolgte entsprechend der Methodensammlung von Sambrook et

al. (81). Für die Immobilisierung von Proteinen auf einer Membran wurde das

sogenannte „semi-dry“ Verfahren in einer Transferapparatur (Fa. Keutz, Reiskirchen)

angewandt. Dazu wurde auf der Anode ein Blot in nachstehender Reihenfolge

aufgebaut: 3 Whatman 3M-Papiere mit Anodenpuffer 1 angefeuchtet, 4 Whatman

3M-Papiere mit Anodenpuffer 2 angefeuchtet, eine Nitrocellulosemembran (Fa.

Schleicher & Schuell, Dassel) ebenfalls mit Anodenpuffer 2 angefeuchtet, das

Proteingel und abschließend 5 Whatman 3M-Papiere mit Kathodenpuffer

angefeuchtet. Der Transfer fand für 2 h bei 1,5 mA/cm2 Membran statt. Zur Kontrolle

24

des Transfers wurde die Membran kurz mit Ponceau-Rot angefärbt und mit PBS

wieder entfärbt.

Anodenpuffer 1:

Tris-HCl 25 mM

Methanol 20% (v/v)

pH = 10,4

Anodenpuffer 2 :

Tris-HCl 300 mM

Methanol 20% (v/v)

pH = 10,4

Kathodenpuffer:

Tris-HCl 25 mM

6-Aminohexansäure 40 mM

Methanol 20% (v/v)

pH = 9,4

3.4.4.2 Immunologischer Nachweis

Vor Zugabe des primären Antikörpers wurde zur Absättigung freier unspezifischer

Bindungsstellen die Membran zunächst für 30 min in PBS/0,1% Tween 20/5%

Magermilchpulver (Blotto-Lösung) geschwenkt. Hiernach wurde der erste Antikörper

(siehe unten) in entsprechender Verdünnung in der selben Lösung zugegeben und

für 2 h unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit

PBS/0,1% Tween 20 wurde die Membran für 2 h mit einem zweiten Antikörper (siehe

unten) bei Raumtemperatur inkubiert. Zuletzt wurde nach erneutem mehrmaligem

Waschen mit PBS/0,1% Tween 20 die Membran für 2 h mit einem

Meerrettichperoxidase-gekoppelten Sekundärantikörper (siehe unten) weiter

inkubiert. Der Blot wurde nach wiederholtem Waschen mit PBS/0,1% Tween 20 in

einer luminiszierenden Lösung (ECL-Kit) der Fa. Amersham (London) eingelegt und

anschließend autoradiographisch ausgewertet.

25

3.4.4.3 Verwendete Antikörper

1. Antikörper:

Bezeichnung: Beschreibung: Artikel-Nr./Herkunft:

Bcl-2 (N-19) Goat polyclonal IgG # sc-492

Fa. Santa Cruz

2. Antikörper:

Bezeichnung: Beschreibung: Artikel-Nr./Herkunft:

Anti-Ziege IgG (H+L) Mouse anti-goat # 205-035-108

aus der Maus Fa. Dianova

3. Antikörper:

Bezeichnung: Beschreibung: Artikel-Nr./Herkunft:

Anti-Maus Peroxidase-gekoppelter # 170-6516

Sekundärantikörper gegen Fa. Biorad

primäre monoklonale

Maus-Antikörper des Typs IgG

3.5 Vitalitätsbestimmungen

Vitalitätsbestimmungen von Rat-1-Fibroblasten wurden in dieser Arbeit mit Hilfe des

LDH-Assays sowie mittels Aufnahme von Trypanblau durchgeführt.

3.5.1 LDH-Freisetzung:

3.5.1.1 Prinzip der Bestimmung

Der LDH-Assay beruht auf der Tatsache, daß cytosolische Enzyme im Verlaufe der

Zellschädigung aus dem Cytosol der Zellen in das umgebende Medium austreten.

Dieses geschieht aufgrund des Verlustes der Zellmembranintegrität, welches zwar

ein spätes, aber sehr sicheres Zeichen des Zelltodes darstellt (41).

Im Verlaufe der Vitalitätsversuche wurden zu bestimmten Zeitpunkten Proben von

250 µL aus dem Versuchsmedium entnommen, welche der photometrischen Analyse

zur Bestimmung der LDH-Aktivität zugeführt wurden. Am Versuchsende wurden alle

26

Zellen für 20 min bei 37°C mit dem Detergens Triton X-100 (Endkonzentration 1%)

inkubiert, wodurch es zur Lyse aller noch lebenden Zellen kam. Auf diese Weise war

es möglich, die Gesamt-LDH-Aktivität aller Zellen im Versuchsansatz zu bestimmen.

Durch Bildung des Quotienten

(LDH-Aktivität zum Zeitpunkt t/Gesamt-LDH-Aktivität) * 100

konnte die Zellschädigung in den jeweiligen Zeitpunkten prozentual angegeben

werden. Die Bestimmung der LDH-Aktivität erfolgte photometrisch mit dem ACP

5040 (Eppendorf, Hamburg) nach der Methode von Bergmeyer (10).

Das Prinzip der Messung beruhte auf der Reaktion:

LDH

Pyruvat + NADH + H+ Lactat + NAD+

Hierbei wurde die zeitliche Abnahme des NADH im Probenansatz über die

spezifische Extinktion bei einer Wellenlänge von 334 nm bestimmt. Dabei wurde eine

LDH-Probe aus dem Versuchsansatz mit dem Kalium-Phosphat-Reaktionspuffer

versetzt, die Geschwindigkeit der Abnahme der Extinktion war proportional zur

Aktivität des Enzyms.

3.5.1.2 Lösungen und Reagenzien:

Kalium-Phosphat-Reaktionspuffer:

K2HPO4 50 mM

Na+-Pyruvat 0,6 mM

NADH 0,19 mM

pH = 7,4

27

3.5.2 Aufnahme von Trypanblau:

Diese Methode beruht auf der Eigenschaft von Zellen, den Farbstoff Trypanblau

aufzunehmen, sobald die Integrität der Zellmembran zerstört wird, d.h. sobald der

Zelltod eintritt. Vitale Zellen mit intakter Plasmamembran sind hingegen in der Lage,

die Penetration des Farbstoffes zu verhindern (41), wodurch eine Unterscheidung

vitaler von avitalen Zellen möglich war. Die Zellen wurden mit Hilfe eines inversen

Mikroskops (ID 03, Zeiss, Oberkochen) ausgezählt und der prozentuale Anteil der

avitalen Zellen bestimmt.

3.6 Bestimmung des zellulären ATP-Gehaltes mittels Kapillarelektrophorese

3.6.1 Methode und Durchführung der Messungen

Die Kapillarelektrophorese (CE) ist eine Methode zur qualitativen und quantitativen

Bestimmung von verschiedenen biochemischen Produkten in Lösungen, wie z.B.

Aminosäuren, DNA und ATP, aber auch zur Bestimmung von

Elektrolytkonzentrationen in Zelllysaten (40, 74, 82).

Das Prinzip der Trennung und Detektion von biologischen Proben mit der CE beruht

auf der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit von geladenen Molekülen in

einem elektrischen Feld, wobei eine Pufferlösung als Trägersubstanz und

Spannungsvermittler eingesetzt wird. Das Kernstück der in dieser Arbeit benutzten

CE bildet eine Quarzkapillare der Länge 57 cm und einem Innendurchmesser von 75

µm. Die Kapillare tauchte an beiden Enden in zwei Gefäße mit der Pufferlösung ein,

welche über Platinelektroden mit einer Hochspannungsquelle verbunden waren. Die

Injektion der Proben erfolgte druckgesteuert unmittelbar vor Meßbeginn. Der hier

verwendeten Pufferlösung wurde das Detergens Dodecyltrimethylammoniumbromid

(DTAB) hinzugefügt. Durch die Anlagerung des Detergens entstand an der

ursprünglich negativen Kapillarwand eine positive Ladung, wodurch der

elektroosmotische Fluss und die resultierende Wanderungsgeschwindigkeit der ATP-

Moleküle zum Detektor gerichtet waren (29). Die angelegte Spannung zwischen

Anode und Kathode betrug 12,5 kV, die Temperatur während der Messung wurde

auf 23°C eingestellt.

Die Detektion der aufgetrennten Moleküle erfolgte bei dem hier eingesetzten

Beckmann P/ACE 5000 Kapillarelektrophorese-System (Beckmann, München) über

einen UV-Detektor, welcher die Absorption bei einer Wellenlänge von 254 nm misst.

28

Die Fläche der Peaks im aufgezeichneten Elektrophoresegramm war der

Konzentration der vorbeilaufenden ATP-Moleküle direkt proportional und konnte

direkt über ein angeschlossenes, PC-gesteuertes Datenverarbeitungssystem

bestimmt werden. Der absolute Wert der ATP-Konzentration wurde unter

Verwendung eines ATP-Standards (Konzentration des Standards: 50 µM) bestimmt.

3.6.2 Probenaufbereitung: Für die Bestimmung des ATP-Gehaltes von Rat-1-Fibroblasten wurden

Kulturflaschen mit einer Oberfläche von 25 cm2 verwendet. Die Versuchsansätze

enthielten 6,5 ml Krebs-Henseleit-Puffer mit den im Ergebnisteil angegebenen

Endkonzentrationen an H2O2 bzw. Glucose. Die Versuche wurden nach einer

Zeitdauer von 0 min, 30 min oder 60 min gestoppt durch die Zugabe von 9 M

Perchlorsäure, bei einer Endkonzentration von 1 M im entstandenen Zelllysat. Sofort

danach wurde die Zellkulturflasche in flüssigen Stickstoff getaucht. Nach dem

Antauen des Zellrasens wurde dieser mit einem Gummispatel abgekratzt, in

Eppendorf-Cups überführt und zentrifugiert. Zu dem Überstand wurden 25 µl einer

Methylorange-Stammlösung hinzugefügt (0,5 mg/ml in Aqua dest.). Letztere diente

als pH-Indikator bei der anschließenden Neutralisierung mit einer 5 M

Kaliumcarbonatlösung. Das ausgefallene Kaliumperchlorat wurde abzentrifugiert, der

Überstand 1:10 mit Aqua dest. verdünnt, um die Ionenstärke herabzusetzen.

Anschließend wurden die Proben der Messung in der Kapillarelektrophorese

zugeführt. Um den ATP-Gehalt pro 106 Zellen angeben zu können, wurde die Anzahl

der Zellen in einem Versuchsansatz bestimmt. Dies geschah durch Trypsinierung

des Zellrasens in einer Zellkulturflasche welche gemeinsam mit den

Zellkulturflaschen für das jeweilige Experiment angeimpft wurde. Die trypsinierten

Zellen wurden in ein definiertes Volumen Zellkulturmedium aufgenommen, die

Zählung erfolgte mit der Neubauer-Zählkammer.

29

3.6.3 Lösungen und Reagenzien: Perchlorsäure 9 M

Methylorange-Stammlösung 0,5 mg/ml Aqua dest.

Kaliumcarbonat 5 M

Elektrophoresepuffer:

NaPO4- 50 mM

DTAB 100 mM

EDTA 1 mM

3.7 Kinetik des H2O2-Abbaus

3.7.1 Prinzip der Messung Die Bestimmung der extrazellulären Konzentration von H2O2 erfolgte entsprechend

dem Ansatz von Fossati et al. (27) durch die Peroxidase-katalysierte Konversion von

4-Aminophenazon zu der pinkfarbenen Substanz N-4-Antipyryl-3-Chloro-5-Sulfonat-

ρ-Benzoquinon-Monoimin:

3,5-Dichloro-2-Hydroxybenzensulfonsäure + 4-Aminophenazon + 2 H2O2

Peroxidase

N-4-Antipyryl-3-Chloro-5-Sulfonat-ρ-Benzoquinon-Monoimin.

Das Reaktionsprodukt wurde spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 546

nm gegen den Reagenzienleerwert gemessen. Zur Quantifizierung diente eine

Eichreihe aus H2O2-Standards.

3.7.2 Versuchsdurchführung

Die Bestimmung des Abbaus von H2O2 durch Rat-1-Fibroblasten erfolgte durch

Messung der extrazellulären Konzentrationen von H2O2 im Überstand. Die Versuche

30

zur Kinetik des H2O2-Abbaus wurden in 6-Well-Zellkulturplatten durchgeführt. Zum

Zeitpunkt t=0 wurde H2O2 in einer Endkonzentration von 1 mM zum Krebs-Henseleit-

Puffer hinzugefügt, der verwendete Krebs-Henseleit-Puffer enthielt wie in allen

anderen Versuchsreihen 100 µM DTPA. Hierdurch wurde der eisenkatalysierte

Abbau von H2O2 über die Fenton-Reaktion (5) verhindert.

3.7.3 Lösungen und Reagenzien

MOPS 50 mM

KCl 50 mM

KOH 5 M

3,5-Dichloro-2-Hydroxybenzensulfonsäure 4,2 mM

4-Aminophenazon 33 mM

DTPA 4 mM

Peroxidase aus Meerrettich 2500 U/ml

3.8 Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der intrazellulären

Ca2+-Konzentration

3.8.1 Prinzip der digitalen Fluoreszenzmikroskopie Die digitale Fluoreszenzmikroskopie ist eine Methode zur Bestimmung von

intrazellulären Ionenkonzentrationen und ermöglicht ferner, Veränderungen von

Ionenkonzentrationen über einen längeren Zeitraum zu verfolgen. Das Prinzip

besteht darin, daß vitale Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff beladen werden, der

für ein bestimmtes Ion spezifisch ist und mit dem es eine Komplexbildung eingehen

kann. In dieser Arbeit wurde der Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 verwandt, welcher

spezifisch für das Ca2+-Ion ist (32) Der Farbstoff wurde zur Beladung der Zellen als

membranpermeabler Acetoxymethylester eingesetzt. Intrazellulär werden diese

Esterbindungen durch unspezifische Esterasen hydrolysiert, woraufhin der Farbstoff

die Zellmembran nicht mehr durchdringen kann und daher intrazellulär akkumuliert.

Zusätzlich wurde ein Hemmstoff zellulärer Ionenkanäle, Probenicid

(Endkonzentration im Versuchsansatz 2 mM), eingesetzt, wodurch die Retention des

Farbstoffes in den Zellen verbessert wurde. Die Zugabe von Pluronic F-127 (0,06%

v/v) diente der Lösung des Acetoxymethylesters von Fura-2. Die

31

Fluoreszenzmessungen wurden mit Hilfe eines inversen Mikroskops (IM-35, Zeiss,

Oberkochen) und dem ARGUS-50/CA Imaging System (Hamamatsu Photonics,

Hamamatsu-City, Japan) durchgeführt. In dieser Arbeit wurde das Fluoreszenz-

Ratio-Prinzip angewandt: Hierbei wurden die mit Farbstoff beladenen Zellen kurz

hintereinander mit Licht zweier verschiedener Wellenlängen angeregt, und zwar 340

± 10 nm und 380 ± 10 nm. Die Emission wurde bei Wellenlängen von 500-530 nm

registriert. Bei einer Anregungswellenlänge von 340 ± 10 nm steigt die Emission in

Abhängigkeit von der intrazellulären Ca2+-Konzentration, wohingegen die Emission

nach Anregung mit 380 ± 10 nm sich nur geringfügig verändert. Die intrazellulären

Ca2+-Konzentrationen wurden also nicht über absolute Fluoreszenzintensitäten

bestimmt, sondern über das Verhältnis (Ratio) der Fluoreszenzintensitäten nach

Anregung mit zwei unterschiedlichen Wellenlängen. Diese Meßmethode hatte den

Vorteil, dass die Auswirkung von Störvariablen minimiert wurde, wie z.B. die

unterschiedliche zelluläre Beladung, das Ausbleichen des Farbstoffes während der

Messung sowie die unterschiedliche Dicke der Zellen. Durch Kalibrierung, welche

nach der Methode von Grynkiewicz (32) erfolgte, war es möglich, die intrazellulären

Ca2+-Konzentrationen zu quantifizieren. Es gilt folgender Zusammenhang:

k * (R-Rmin ) * Sf

Ca2+ = ----------------------------

(Rmax – R) * Sb

k: Dissoziationskonstante von Fura-2 bezüglich Ca2+ (bei 37°C: 224 nM)

R: F (340/380 nm) aus Ca2+-Messung

Rmax : F (340/380 nm) bei max. Ca2+-Konzentration, aus Kalibrierung

Rmin : F (340/380 nm) bei min. Ca2+-Konzentration, aus Kalibrierung

Sb: F (380 nm) bei max. Ca2+-Konzentration

Sf: F (380 nm) bei min. Ca2+-Konzentration

32

3.8.2 Versuchsdurchführung

Für die Bestimmung der intrazellulären Ca2+-Konzentration wurden die Rat-1-

Fibroblasten auf Deckgläschen kultiviert. Diese wurden für die Messungen in ein

Pentz-Kammersystem (Werkstatt, Universitätsklinikum Essen) eingespannt. Vor der

Inkubation mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 wurden die Zellen dreimal mit HBSS

gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in Krebs-Henseleit-Puffer bei 37°C in

der Dunkelheit für 30 min inkubiert. Die Endkonzentration des Acetoxymethylesters

von Fura-2 betrug 5 µM. Nach 30-minütiger Inkubation wurden die Zellen erneut

dreimal mit HBSS gewaschen, um die extrazellulären Farbstoffreste zu entfernen.

Unmittelbar danach wurde mit dem Experiment begonnen, welches in Krebs-

Henseleit-Puffer bei 37°C stattfand. Sämtliche Arbeiten mit dem Fluoreszenzfarbstoff

wurden in abgedunkelten Räumen durchgeführt, um das vorzeitige Ausbleichen des

Farbstoffes zu minimieren.

Zu beachten ist, daß der Zelltod in diesen Versuchen früher eintrat als in den

Vitalitätsversuchen oder den Experimenten zur Bestimmung von intrazellulärem

Glutathion. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Zellen hier auf Glasplättchen

kultiviert wurden und sie ferner während der Versuche der Bestrahlung mit UV-Licht

ausgesetzt waren.

3.9 Enzymatische Bestimmung von intrazellulärem Glutathion

3.9.1 Bestimmung von reduziertem Glutathion (GSH) 3.9.1.1 Prinzip der Messung Die Bestimmung der reduzierten Form von Glutathion (GSH) erfolgte entsprechend

dem Ansatz der Methodensammlung von E. Bernt & H.U. Bergmeyer (10).

Reduziertes Glutathion wird mit Methylglyoxal durch Glyoxalase I quantitativ in S-

Lactosyl-GSH überführt:

Glyoxalase I

GSH + Methylglyoxal S-Lactosyl-GSH

Hierbei wird S-Lactosyl-GSH bei 240 nm direkt photometrisch gemessen.

33

3.9.1.2 Probenaufbereitung und Durchführung der Messungen

Für die Bestimmung des GSH-Gehaltes von Rat-1-Fibroblasten wurden

Kulturflaschen mit einer Oberfläche von 25 cm2 verwendet. Die Versuchsansätze

enthielten 6,5 ml KH-Puffer mit den im Ergebnisteil angegebenen

Endkonzentrationen an H2O2 bzw. Glucose. Die Versuche wurden nach einer

Zeitdauer von 0 min, 30 min oder 60 min gestoppt durch die Zugabe von

Perchlorsäure (7% w/v, mit 2 mm EDTA). Sofort danach wurde die Zellkulturflasche

in flüssigen Stickstoff getaucht. Nach dem Antauen des Zellrasens wurde dieser mit

einem Gummispatel abgekratzt, in Eppendorf-Cups überführt und zentrifugiert. Das

Pellet wurde auf den Proteingehalt mit der Methode nach Bradford untersucht (siehe

dort). Zu dem Überstand wurden 25 µl einer Methylorange-Stammlösung hinzugefügt

(0,5 mg/ml in Aqua dest.). Letztere diente als pH-Indikator bei der anschließenden

Neutralisierung (auf pH 7,2) mit einer Lösung aus 2 M KOH mit 0,3 M MOPS. Das

ausgefallene Kaliumperchlorat wurde abzentrifugiert, anschließend wurden die

Proben der spektrophotometrischen Messung zugeführt.

Die Messungen wurden in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,2 durchgeführt. Zu

500 µL Puffer wurden 500 µL Probe und 1,5 µL Glyoxalase I (ca. 1700 U/ml)

pipettiert. Die Messung wurde gestartet durch die Zugabe von 20 µL

Methylglyoxallösung (110 mM). Die Quantifizierung erfolgte mit Hilfe einer Eichung

aus GSH-Standards.

3.9.1.3 Lösungen und Reagenzien

Methylglyoxallösung 110 mM

Glyoxalase I 1700 U/mL

GSH-Standards 10 µM, 50 µM, 100 µM

Dikaliumhydrogenphosphat-Lsg. 0,1 M

Kaliumdihydrogenphosphat-Lsg. 0,1 M

Kaliumhydroxidlösung 2 M mit 0,3 M MOPS

Perchlorsäure 7% w/v mit 2 mM EDTA

Methylorangelösung 0,5 mg/ml

34

3.9.2 Bestimmung von oxidiertem Glutathion (GSSG) 3.9.2.1 Prinzip der Messung

Auch die Bestimmung der oxidierten Form des Glutathion (GSSG) erfolgte

entsprechend der Methodensammlung von E. Bernt & H.U. Bergmeyer (10).

Oxidiertes Glutathion wird durch reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat

(NADPH) mit Glutathion-Reduktase quantitativ zu GSH reduziert:

Glutathion-Reduktase

GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP+

Die Abnahme von NADPH wird anhand der Extinktionsänderung bei 340 nm

gemessen.

3.9.2.2 Probenaufbereitung und Versuchsdurchführung GSSG wurde aus dem gleichen Ansatz wie GSH gemessen. Zu 500 µL Puffer wurde

500 µL Probe und 10 µL NADPH (1 mM) pipettiert. Die Messung wurde nach

vollständiger Umsetzung von GSH in S-Lactosyl-GSH (s.o.) durch die Zugabe von 5

µL Glutathion-Reduktase (120 U/ml) gestartet. Die Quantifizierung erfolgte mit Hilfe

einer Eichreihe aus GSSG-Standards.

3.9.2.3 Lösungen und Reagenzien

Glutathion-Reduktase 120 U/ml

NADPH 1 mM

GSSG-Standards 2,5 µM, 5 µM, 10 µM, 50 µM

Pufferlösungen und Lösungen zur Probenaufbereitung wie bei der Bestimmung von

reduziertem Glutathion (GSH).

35

3.10 Bestimmung von intrazellulärem Glutathion auf Einzelzellebene

3.10.1 Prinzip der Bestimmung

Das Prinzip der intrazellulären Bestimmung von Glutathion beruht auf der

Eigenschaft des Fluorophores Monochlorobiman (MCB) an reduziertes,

intrazelluläres Glutathion (GSH) zu binden. Diese Bindung wird durch das Enzym

Glutathion-S-Transferase (GST) katalysiert. Das entstehende Produkt kann

fluoreszenmikroskopisch nachgewiesen werden (76).

3.10.2 Probenaufbereitung und Versuchsdurchführung

Zur Durchführung der Experimente wurden Rat-1-Fibroblasten auf Deckgläschen

kultiviert. Diese wurden in ein Pentz-Kammersystem (Werkstatt, Universitätsklinikum

Essen) eingespannt. Nach der jeweiligen Inkubationszeit unter experimentellen

Bedingungen wurden die Zellen dreimal mit HBSS gewaschen und für 25 min bei

37°C in Krebs-Henseleit-Puffer mit 50 µM Monochlorobiman inkubiert. Die

intrazelluläre Retention des Reaktionsproduktes wurde durch Zugabe von 2 mM

Probenicid verbessert. Nach der Inkubation wurden die Zellen erneut dreimal mit

HBSS gewaschen und anschliessend erneut mit Krebs-Henseleit-Puffer bedeckt.

Die Fluoreszenzmessungen wurden an einem inversen Mikroskop (Axiovert 135 TV;

Zeiss), ausgestattet mit einem Attofluor Imaging System (Atto Instruments, Rockville,

MD, USA), durchgeführt. Die Anregungswellenlänge war 380 ± 10 nm, die Emission

wurde gemessen bei 460-490 nm.

3.11 Statistik

Alle Versuche wurden in Doppelansätzen durchgeführt und drei- bis fünfmal

wiederholt. Die angegebenen Werte entsprechen dem Mittelwert ±

Standardabweichung. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden mit Student´s

t-Test für ungepaarte Stichproben durchgeführt (3). Ein p-Wert < 0,05 wurde als

signifikant angesehen.

36

4. Ergebnisse

4.1 Expression von Bcl-2

Die Analyse der Genexpression für bcl-2 auf RNA-Ebene („Northern-Blot“-Analyse)

zeigte eine deutliche Überexpression in den Zellklonen, welche mit den für das Bcl-2-

Protein kodierenden Vektoren transfiziert wurden (Rat-1/Bcl-2#1 bzw. Rat-1/Bcl-2#2,

Abbildung 2). Die nicht transfizierten Rat-1-Fibroblasten (Rat-1/Wildtyp) sowie die mit

dem Kontroll-Vektor transfizierten Rat-1-Fibroblasten (Rat-1/cMycER) zeigten

hingegen auf RNA-Ebene keine nennenswerte Expression des bcl-2-Gens

In der „Western-Blot“-Analyse zeigten die Zellklone Rat-1/Bcl-2#1 und Rat-1/Bcl-2#2

eine deutliche Expression des Bcl-2-Proteins. Eine Expression des Bcl-2-Proteins

konnte hingegen in den Zellklonen Rat-1/Wildtyp und Rat-1/cMycER nicht

nachgewiesen werden (Abbildung 3). Da die beiden mit Bcl-2 transfizierten Zellklone

keine signifikanten Unterschiede im biologischen Verhalten zeigten, werden

nachfolgend nur die Ergebnisse gezeigt, die am Zellklon Rat-1/Bcl-2#2 erzielt

wurden. Diese Zellen werden vereinfacht als Rat-1/Bcl-2-Zellen bezeichnet.

4.2 Effekte von Glucose, Quin-2 und der Überexpression von Bcl-2 auf den H2O2-induzierten Zelltod

Bei Inkubation von nicht transfizierten Rat-1-Fibroblasten (Rat-1/Wildtyp) in

substratfreiem Krebs-Henseleit-Puffer und H2O2 in einer Konzentration von 1 mM,

zeigten diese einen Vitalitätsverlust von über 70% innerhalb von 2 Stunden

(Abbildung 4 A). Im Gegensatz dazu wurden die mit Bcl-2 transfizierten Rat-1-

Fibroblasten (Rat-1/Bcl-2) unter gleichen Bedingungen innerhalb von 4 Stunden zu

weniger als 15% geschädigt (Abbildung 4 B). Durch die Zugabe von Glucose (10

mM) konnten die nicht transfizierten Fibroblasten nahezu komplett vor der H2O2-

induzierten Zellschädigung geschützt werden (Abbildung 4 A), während ein solcher

schützender Effekt von Glucose bei den mit Bcl-2 transfizierten Zellen

überraschenderweise nicht beobachtet werden konnte (Abbildung 4 B). Ähnlich wie

bei den nativen Fibroblasten konnte man bei den Vektorkontroll-Zellen (Rat-

1/cMycER) einen schützenden Effekt durch die Zugabe von Glucose beobachten

(Daten nicht gezeigt). In Abwesenheit von H2O2 konnte man bei allen verwendeten

Zellklonen während sechsstündiger Inkubation in Krebs-Henseleit-Puffer keinen

nennenswerten Vitalitätsverlust beobachten (Daten nicht gezeigt).

37

Abbildung 2: „Northern-Blot“-Analyse der Expression von bcl-2. Nach der elektrophoretischen Auftrennung von RNA der jeweiligen Zellklone

erfolgte der Transfer auf eine Nylonmembran. Der Nachweis erfolgte durch

Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten cDNA-Sonde.

38

Abbildung 3: „Western-Blot“-Analyse der Expression von bcl-2. Nach der elektrophoretischen Auftrennung von Gesamtzellproteinextrakten der

jeweiligen Zellklone erfolgte der Transfer auf eine Nitrocellulosemembran. Der

Nachweis erfolgte immunologisch mit einem Antikörper gegen humanes Bcl-2-

Protein. Am linken Bildrand sind schematisch die Molekulargewichtsstandards

dargestellt (kD).

39

Abbildung 4: Effekt von Glucose und der Überexpression von Bcl-2 auf den H2O2-induzierten Zelltod. Rat-1/Wildtyp (A) und Rat-1/Bcl-2-Zellen (B) wurden in Krebs-Henseleit-Puffer mit 1

mM H2O2 inkubiert. Glucose wurde bei einem Teil der Ansätze in einer Konzentration

von 10 mM zugegeben. Die Zellschädigung wurde anhand der Freisetzung

cytosolischer LDH gemessen. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten ±

S.D. aus vier Experimenten.

A) Rat-1/Wildtyp

0102030405060708090

100

0 1 2 3 4 5 6

Inkubationszeit (h)

LDH

-Fre

iset

zung

(%)

1 mM H2O2

ohne Glucose

1 mM H2O2

mit Glucose

B) Rat-1/Bcl-2

0102030405060708090

100

0 1 2 3 4 5 6

Inkubationszeit (h)

LDH

-Fre

iset

zung

(%)

1 mM H2O2

ohne Glucose1 mM H2O2

mit Glucose

40

Die Vorinkubation mit dem intrazellulären Ca2+-Chelator Quin-2 (10 µM) bewirkte

während der Inkubation mit 1 mM H2O2 bei den Wildtyp-Fibroblasten einen

deutlichen Schutz gegen Zellschädigung (Abbildung 5 A). Dieser Schutzeffekt

konnte, wie der Glucose-Effekt, in Bcl-2-transfizierten Zellen nicht beobachtet werden

(Abbildung 5 B).

4.3 Effekte von H2O2, Glucose und der Überexpression von Bcl-2 auf den

Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration In Abwesenheit von H2O2 blieb die cytosolische Ca2+-Konzentration nach 3 Stunden

Inkubation in Krebs-Henseleit-Puffer in allen Zellklonen konstant (Daten nicht

gezeigt).

Bei Inkubation mit 1 mM H2O2 stieg die cytosolische Ca2+-Konzentration in Wildtyp-

Fibroblasten innerhalb von 35 min von 53 ± 16 nM auf 515 ± 32 nM an (Abbildung 6

A). Auch in den Vektorkontroll-Zellen kam es zu einem ähnlichen Anstieg der

cytosolischen Ca2+-Konzentration (Abbildung 6 B). In Rat-1/Bcl-2-Zellen hingegen

überstieg die cytosolische Ca2+-Konzentration nicht 170 nM (Abbildung 6 C) bevor

der Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 aus den Zellen austrat, d.h. bevor die Zellen die

Zellmembranintegrität verloren und somit starben. Ein signifikanter Effekt durch die

Zugabe von Glucose konnte bei Rat-1/Bcl-2-Zellen nicht gezeigt werden. Jedoch

konnte durch die Zugabe von Glucose der H2O2-induzierte Anstieg der cytosolischen

Ca2+-Konzentration sowohl in Wildtyp-Fibroblasten als auch in den Vektorkontroll-

Zellen deutlich verzögert werden (Abbildung 6 A, B). Man kann in erster

Schlußfolgerung daher vermuten, daß das Bcl-2-Protein, ähnlich wie Glucose, gegen

die Ca2+-abhängige Komponente der H2O2-Toxizität zu schützen vermag.

4.4 Kinetik des zellulären H2O2-Abbaus von Rat-1-Fibroblasten Als nächstes galt es, den schützenden Effekt der Glucose in Wildtyp-Fibroblasten

und Vektorkontroll-Zellen näher zu untersuchen, ebenso wie die Tatsache, daß

dieser schützende Effekt in Bcl-2-transfizierten Zellen nicht beobachtet werden

konnte. Daher bedurfte es einer näheren Betrachtung hinsichtlich der Kinetik des

intrazellulären H2O2-Abbaus. Es stellte sich hierbei heraus, daß die Kinetik des H2O2-

Abbaus in allen Zellklonen gleich und bei den eingesetzten Konzentrationen von 1

mM H2O2 unabhängig von der Anwesenheit von Glucose war (Abbildung 7).

41

Abbildung 5: Effekt des Ca2+-Chelators Quin-2 auf den H2O2-induzierten Zelltod. Rat-1/Wildtyp (A) und Rat-1/Bcl-2-Zellen (B) wurden in Krebs-Henseleit-Puffer (ohne

Glucose) mit 1 mM H2O2 inkubiert. Quin-2-AM (10 µM) wurde 1 h vor Beginn des

Experimentes zugegeben. Die Zellschädigung wurde anhand der Freisetzung

cytosolischer LDH gemessen. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten ±

S.D. aus vier Experimenten.

A) Rat-1/Wildtyp

0102030405060708090

100

0 1 2 3 4 5 6

Inkubationszeit (h)

LDH

-Fre

iset

zung

(%)

1 mM H2O2

ohne Quin-2

1 mM H2O2

mit Quin-2

B) Rat-1/Bcl-2

0102030405060708090

100

0 1 2 3 4 5 6

Inkubationszeit (h)

LDH

-Fre

iset

zung

(%)

1 mM H2O2

ohne Quin-2

1 mM H2O2

mit Quin-2

42

A) Rat-1/Wildtyp

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Inkubationszeit (min)

Cyt

osol

isch

eC

a2+-K

onze

ntra

tion

(nM

)

H2O2 1 mM

H2O2 1 mM + Glucose

B) Rat-1/cMycER

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Inkubationszeit (min)

Cyt

osol

isch

eC

a2+-K

onze

ntra

tion

(nM

)

H2O2 1 mM

H2O2 1 mM + Glucose

43

Abbildung 6: Effekte von Glucose auf den H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration. Rat-1/Wildtyp (A), Rat-1/cMycER (B) und Rat-1/Bcl-2 Zellen (C) wurden in Krebs-

Henseleit Puffer (mit oder ohne 10 mM Glucose) mit 1 mM H2O2 inkubiert. Die

cytosolische Ca2+-Konzentration wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie und dem

Ca2+-Indikator Fura-2 bestimmt. Die gezeigten Daten entsprechen den

Mittelwerten ± S.D. aus vier Experimenten.

C) Rat-1/Bcl-2

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Inkubationszeit (min)

Cyt

osol

isch

eC

a2+-K

onze

ntra

tion

(nM

)

H2O2 1 mM

H2O2 1 mM + Glucose

44

A) Rat-1/Wildtyp

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

0 20 40 60 80 100 120

Inkubationszeit (min)

H2O

2-K

onze

ntra

tion

(mM

)

ohne Glucosemit Glucose (10 mM)

B) Rat-1/cMycER

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

0 20 40 60 80 100 120

Inkubationszeit (min)

H2O

2-K

onze

ntra

tion

(mM

)

ohne Glucosemit Glucose (10 mM)

45

Abbildung 7: Kinetik des H2O2-Abbaus. Rat-1/Wildtyp (A), Rat-1/cMycER (B) und Rat-1/Bcl-2-Zellen (C) wurden in Krebs-

Henseleit-Puffer mit oder ohne Glucose (10 mM) in Anwesenheit von 1 mM H2O2

inkubiert. Die Bestimmung der Konzentration von H2O2 im Überstand erfolgte

spektrophotometrisch entsprechend dem Ansatz von Fossati et al. (26). Die

gezeigten Werte entsprechen den Mittelwerten ± S.D. aus vier Experimenten.

C) Rat-1/Bcl-2

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

0 20 40 60 80 100 120

Inkubationszeit (min)

H2O

2-K

onze

ntra

tion

(mM

)

ohne Glucosemit Glucose (10 mM)

46

Daher konnte eine unterschiedliche Kinetik des zellulären H2O2-Abbaus nicht zur

Erklärung hinsichtlich der differierenden Sensitivität gegenüber der H2O2-induzierten

Schädigung der einzelnen Zellklone herangezogen werden.

4.5 Effekte von H2O2 und Glucose auf den zellulären ATP-Gehalt von Rat-1-

Fibroblasten Es mußte weiterhin ausgeschlossen werden, daß der protektive Effekt von Bcl-2 und

Glucose gegenüber H2O2-induzierter Zellschädigung auf eine verbesserte ATP-

Versorgung zurückzuführen ist. In allen untersuchten Zellklonen sank der

intrazelluläre ATP-Spiegel innerhalb von 60 min um ca. 40%. Der ATP-Gehalt und

auch die Kinetik des intrazellulären ATP-Abfalls wurde durch die Anwesenheit von

Glucose nicht signifikant verändert (Abbildung 8).

4.6 Effekte von Bcl-2, H2O2 und Glucose auf den Gehalt an GSH und GSSG von Rat-1-Fibroblasten

Da Glucose nicht die Kinetik des H2O2-Abbaus oder die ATP-Versorgung der Zellen

beeinflusste, könnte eine verbesserte Bereitstellung von NADPH über den

Pentosephosphatweg und die dadurch verbesserte Reduktion von GSSG eine

mögliche Erklärung für den protektiven Effekt von Glucose bieten. Daher galt es als

nächstes zu untersuchen, ob Glucose und/oder Bcl-2 zu veränderten intrazellulären

Glutathion-Spiegeln führten.

Mit Bcl-2 transfizierte Zellen zeigten im Vergleich zu Rat-1/Wildtyp-Fibroblasten und

auch den Vektorkontroll-Zellen (Rat-1/cMycER) 1,6fach höhere Spiegel an

reduziertem Glutathion (Abbildung 9 A). Nach Inkubation mit 1 mM H2O2 kam es zu

einem deutlichen Abfall von Glutathion in Rat-1/Wildtyp- und Rat-1/cMycER-Zellen

(Abbildung 9 A). Dieser deutliche Abfall zeigte sich nicht in Rat-1/Bcl-2-Zellen, hier

war der relative Abfall von GSH deutlich geringer und auch der absolute Abfall schien

weniger ausgeprägt zu sein, obwohl die Differenz in den absoluten Werten keine

Signifikanz erreichte. Darüberhinaus war nach Inkubation mit 1 mM H2O2 der relative

(und auch der absolute) Anstieg von GSSG in Rat-1/Wildtyp und Rat-1/cMycER

Zellen höher als in Rat-1/Bcl-2 Zellen (Abbildung 9 B). Das GSSG/GSH Ratio war

daher in den Rat-1/Bcl-2-Zellen, verglichen mit den Wildtyp-Zellen bzw. den

Vektorkontroll-Zellen wesentlich geringer (Tabelle 2).

47

A) Rat-1/Wildtyp

0

1

2

3

4

5

6

Kontrolle 30 min 30 min 60 min 60 min

ATP

-Geh

alt(

nmol

/106

Zelle

n)

+ Glucose+ Glucose

B) Rat-1/cMycER

0

1

2

3

4

5

6

Kontrolle 30 min 30 min 60 min 60 min

ATP

-Geh

alt(

nmol

/106

Zelle

n)

+ Glucose + Glucose

48

Abbildung 8: Effekte von H2O2 und Glucose auf den zellulären ATP-Gehalt von Rat-1-Fibroblasten Rat-1/Wildtyp (A), Rat-1/cMycER (B) und Rat-1/Bcl-2-Zellen (C) wurden in Krebs-

Henseleit-Puffer in Gegenwart von 1 mM H2O2 mit oder ohne Glucose (10 mM)

inkubiert. Der zelluläre ATP-Gehalt wurde mit Hilfe der Kapillarelektrophorese

bestimmt. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten ± S.D. aus vier

Experimenten

C) Rat-1/Bcl-2

0

1

2

3

4

5

6

Kontrolle 30 min 30 min 60 min 60 min

ATP

-Geh

alt(

nmol

/106

Zelle

n)

+ Glucose + Glucose

49

Abbildung 9: Effekte von Bcl-2, H2O2 und Glucose auf den Gehalt von GSH und GSSG von Rat-1-Fibroblasten. Rat-1/Wildtyp, Rat-1/Bcl-2-Zellen und die Vektorkontroll-Zellen Rat-1/cMycER wurden

in Krebs-Henseleit-Puffer (mit oder ohne 10 mM Glucose) und 1 mM H2O2 inkubiert. Zu

den angegebenen Zeiten wurden die Zellen lysiert und mit Perchlorsäure deproteiniert.

Die Bestimmung von GSH (A) und GSSG (B) erfolgte enzymatisch. Die gezeigten

Daten entsprechen den Mittelwerten ± S.D. aus vier Experimenten.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4

GSH

(nm

ol/m

gPr

otei

n)Rat-1/W ildtypRat-1/cMycERRat-1/Bcl-2

A)

H2O 2 30 m in+ Glucose

H2O2 30 m inKontrolle

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4

GSS

G(n

mol

/mg

Prot

ein)

Rat-1/Wildtyp

Rat-1/cMycER

Rat-1/Bcl-2

B)

Kontrolle H2O2 30 min+ Glucose

H2O2 30 min

50

Rat-1/Wildtyp Rat-1/cMycER Rat-1/Bcl-2

Kontrolle 0,10 ± 0,01 0,11 ± 0,02 0,07 ± 0,01

H2O2 30 min 0,65 ± 0,06 0,67 ± 0,19 0,15 ± 0,04 H2O2 30 min + Glucose 0,16 ± 0,03 0,17 ± 0,04 0,13 ± 0,02

H2O2 60 min 1,46 ± 0,70 1,60 ± 0,51 0,85 ± 0,23 H2O2 60 min + Glucose 0,82 ± 0,09 0,87 ± 0,48 0,68 ± 0,24

Tabelle 2: GSSG/GSH-Ratio bei Inkubation mit H2O2

Rat-1/Wildtyp, Rat-1/cMycER und Rat-1/Bcl-2-Zellen wurden in Krebs-Henseleit-

Puffer mit 1 mM H2O2 mit oder ohne Glucose inkubiert. Die Bestimmung von GSH

und GSSG erfolgte enzymatisch. Die gezeigten Werte entsprechen den Mittelwerten

± S.D aus den jeweiligen Quotienten von GSSG/GSH aus vier Experimenten.

Der Zusatz von Glucose verlangsamte bei Rat-1/Wildtyp-Zellen und in den

Vektorkontroll-Zellen (Rat-1/cMycER) den Abfall von GSH bzw. den Anstieg von

GSSG, dagegen wurde in Bcl-2-transfizierten Zellen kein Einfluß von Glucose auf

den GSH- oder den GSSG-Spiegel festgestellt (Abbildung 9 A, B).

4.7 Bestimmung des intrazellulären Glutathion-Gehaltes auf Einzelzellebene Um eine Aussage darüber zu machen, ob eine Heterogenität des intrazellulären

GSH-Gehaltes zwischen den einzelnen Zellen besteht (z.B. aufgrund

unterschiedlicher Stadien des Zellzyklus) bzw. ob eine Kompartimentierung von GSH

innerhalb der Zellen stattfindet, wurde die Bestimmung von intrazellulärem Glutathion

auch auf Einzelzellebene wiederholt, und zwar unter Einsatz des

Fluoreszenzfarbstoffes Monochlorobiman (MCB). Diese Messungen bestätigten die

Ergebnisse, welche mit der spektrophotometrischen Analyse erzielt wurden, d.h.

auch hier zeigten die mit Bcl-2 transfizierten Zellen einen höheren GSH-Spiegel und

der GSH-Abfall nach Inkubation mit 1 mM H2O2 war auch hier deutlich langsamer als

in den Rat-1/Wildtyp-Zellen bzw. in den Vektorkontroll-Zellen (Abbildung 10). Ferner

konnte gezeigt werden, dass eine Heterogenität im GSH Gehalt ebensowenig wie

eine Kompartimentierung innerhalb der Zellen bestanden hat (Abbildung 11 A und

B).

51

Abbildung 10: Effekte von Bcl-2 und Glucose auf den intrazellulären Glutathiongehalt von Rat-1-Fibroblasten. Bestimmung auf Einzelzellebene. Rat-1/Wildtyp, Rat-1/cMycER und Rat-1/Bcl-2-Zellen wurden in Krebs-Henseleit-

Puffer mit oder ohne Glucose (10 mM) in Anwesenheit von 1 mM H2O2 inkubiert.

Die Bestimmung des intrazellulären Glutathion auf Einzelzellebene erfolgte

fluoreszenzmikroskopisch unter Einsatz des Glutathion-spezifischen Farbstoffes

Monochlorobiman. Die gezeigten Werte entsprechen den Mittelwerten ± S.D. aus

drei Experimenten.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Kontrolle 30 min H2O2 30 min H2O2 +Glucose

Fluo

resz

enzi

nten

sitä

t(ar

bitr

ary

units

)

Rat-1/WildtypRat-1/cMycERRat-1/Bcl-2

H2O2 30 min H2O2 30 min + Glucose

Kontrolle

52

Abbildung 11: Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung von intrazellulärem Glutathion auf Einzelzellebene Rat-1/Wildtyp (A) und Rat-1/Bcl-2-Zellen (B) wurden für 25 min mit

Monochlorobiman (50 µM) inkubiert. Dargestellt sind die

fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen, repräsentativ für 4 Versuche.

Anregungswellenlänge: 380 ± 10 nm, Emissionswellenlänge: 460-490 nm.

A

10 µm

B

10 µm

53

Man kann also die Schlußfolgerung ziehen, daß Glucose und das Bcl-2-Protein ihre

protektive Wirkung möglicherweise über den gleichen Mechanismus entfalten,

nämlich die Verbesserung der Glutathion-abhängigen antioxidativen Kapazität der

Zellen. Diese Hypothese würde auch eine Erklärung dafür liefern, warum Glucose in

Bcl-2-transfizierten Zellen keinen zusätzlichen Schutzeffekt zeigt, da letztere

aufgrund der Wirkung des Bcl-2 Proteins bereits einen hinreichend hohen

Glutathionspiegel aufweisen und damit auch eine verbesserte antioxidative

Kapazität.

4.8 Effekte von N-Acetylcystein auf die Vitalität, den H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration und den Glutathion-Gehalt von

Rat-1-Fibroblasten. Die Glutathionhomöostase schien also eine Schlüsselrolle im Mechanismus der

Wirkung des Bcl-2-Proteins zu spielen, daher war es notwendig, diesen Aspekt näher

zu beleuchten, indem als nächstes die intrazellulären Glutathionspiegel manipuliert

wurden. Durch Vorinkubation von Rat-1/Wildtyp und Rat-1/cMycER-Zellen mit 40 mM

N-Acetylcystein (NAC) wurde der GSH-Abfall bei Inkubation mit 1 mM H2O2 deutlich

verlangsamt (Abbildung 12). Unter diesen Bedingungen konnte ein deutlicher

Schutzeffekt hinsichtlich des Vitalitätsverlustes in Rat-1/Wildtyp und Rat-1/cMycER-

Zellen erzielt werden (Abbildung 13). Ferner wurde durch Vorinkubation mit 40 mM

NAC der Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration bei H2O2-Exposition stark

vermindert (Abbildung 14).

4.9 Effekte von BSO auf die Vitalität, den H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration und den Glutathion-Gehalt von Rat-1-

Fibroblasten. Auf der anderen Seite konnte der intrazelluläre Glutathionspiegel durch zehnstündige

Vorinkubation in Zellkulturmedium mit 0,5 mM BSO deutlich gesenkt werden

(Abbildung 15). BSO bewirkt eine Reduktion des Glutathionspiegels durch Hemmung

der γ-Glutamylcystein-Synthetase, welche das Schlüsselenzym der intrazellulären

Glutathionsynthese darstellt.

Wenn in Bcl-2-transfizierten Zellen auf diese Weise der Glutathionspiegel gesenkt

wurde, zeigten diese einen schnellen und ausgeprägten Anstieg der cytosolischen

Ca2+-Konzentration nach Zugabe von 1 mM H2O2 (Abbildung 16).

54

Abbidung 12: Beeinflussung von zellulärem Glutathion durch Vorinkubation von Rat-1-Fibroblasten mit N-Acetylcystein. Rat-1/Wildtyp (A) und Rat-1/cMycER Zellen (B) wurden für 1 h mit 40 mM N-

Acetylcystein vorinkubiert. Anschliessend erfolgte die Inkubation in Gegenwart von

1 mM H2O2 in Krebs-Henseleit-Puffer. Die Bestimmung von GSH erfolgte

enzymatisch. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten ± S.D. aus drei

Experimenten.

0102030405060708090

100

0 30 60Inkubationszeit (min)

GSH

(nm

ol/m

gPr

otei

n) Vorinkubation mit 40 mM NAC

ohne Vorinkubation

A) Rat-1/Wildtyp

0102030405060708090

100

0 30 60Inkubationszeit (min)

GSH

(nm

ol/m

gPr

otei

n) Vorinkubation mit 40 mM NAC

ohne Vorinkubation

B) Rat-1/cMycER

55

Abbildung 13: Effekt von N-Acetylcystein auf die Vitalität von Rat-1/Wildtyp und Rat-1/cMycER-Zellen. Rat-1/Wildtyp und Rat-1/cMycER-Zellen wurden für 1 h mit 40 mM N-Acetylcystein

vorinkubiert oder nicht vorbehandelt. Anschliessend erfolgte die Inkubation in Krebs-

Henseleit-Puffer mit 1 mM H2O2. Nach 6 h wurde die Zellschädigung anhand der

Freisetzung cytosolischer LDH gemessen. Die gezeigten Daten entsprechen den

Mittelwerten ± S.D. aus drei Experimenten.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rat-1/Wildtyp Rat-1/cMycER

LDH

-Fre

iset

zung

(%)

Vorinkubation mit 40 mM NAC

ohne Vorinkubation

56

Abbildung 14: Effekt von N-Acetylcystein auf den H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration in Rat-1-Fibroblasten. Rat-1/Wildtyp-Zellen wurden in Krebs-Henseleit-Puffer (ohne Glucose) mit 1 mM H2O2

inkubiert. N-Acetylcystein wurde in einer Konzentration von 40 mM 1 h vor Beginn des

Experimentes zugegeben. Die cytosolische Ca2+-Konzentration wurde mittels

Fluoreszenzmikroskopie und dem Ca2+-Indikator Fura-2 bestimmt. Die gezeigten

Daten entsprechen den Mittelwerten ± S.D. aus vier Experimenten.

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Inkubationszeit (min)

Cyt

osol

isch

eC

a2+-K

onze

ntra

tion

(nM

)

1 mM H2O2

ohne N-Acetylcystein

1 mM H2O2

mit N-Acetylcystein

57

Abbildung 15: Effekt von BSO auf den zellulären Gehalt an Glutathion in Rat-1/Bcl-2-Zellen. Rat-1/Bcl-2-Zellen wurden für 10 h in Krebs-Henseleit-Puffer in Gegenwart von

0,5 mM BSO inkubiert oder nicht vorbehandelt. Die Bestimmung von GSH erfolgte

enzymatisch. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten ± S.D. aus drei

Experimenten.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2

GSH

(nm

ol/m

gPr

otei

n)

ohne Vorinkubation

Vorinkubation mit BSO

58

Abbildung 16: Effekt von BSO auf den H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration in Rat-1/Bcl-2-Zellen. Rat-1/Bcl-2-Zellen wurden für 10 h mit 0,5 mM BSO vorinkubiert und in Krebs-

Henseleit-Puffer (ohne Glucose) mit 1 mM H2O2 inkubiert. Die cytosolische Ca2+-

Konzentration wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie und dem Ca2+-Indikator Fura-2

bestimmt. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten ± S.D. aus vier

Experimenten.

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Inkubationszeit (min)

Cyt

osol

isch

eC

a2+- K

onze

ntra

tion

(nM

)

1 mM H2O2

nicht vorbehandelt

1 mM H2O2

vorbehandelt mit BSO

59

Ferner zeigten diese glutathiondepletierten Zellen einen ausgeprägten

Vitalitätsverlust bei Inkubation mit 1 mM H2O2 (Abbildung 17).

Diese Ergebnisse unterstützen demnach die Annahme, daß das Bcl-2-Protein nicht

direkt auf intrazelluläre Ca2+-Ströme wirkt, sondern vielmehr auf einen

vorgeschalteten Mediator, nämlich das intrazelluläre Glutathion. Darüberhinaus kann

man folgern, dass in dem hier gezeigten Zellschädigungsmodell der intrazelluläre

Ca2+-Anstieg stark abhängig ist vom jeweiligen Glutathiongehalt und Redox-Zustand

der Zellen und somit die intrazellulären Ca2+-Verschiebungen über Glutathion-

abhängige Prozesse reguliert werden.

4.10 Effekte erhöhter H2O2-Konzentrationen auf die Vitalität und den H2O2-

induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration von Rat-1/Bcl-2-Zellen.

Wenn hohe initiale Spiegel an zellulärem Glutathion und die verbesserte

Aufrechterhaltung der Glutathion-Redoxbalance in den Bcl-2-transfizierten Zellen der

Grund für die höhere Resistenz dieser Zellen gegenüber einer Schädigung durch

H2O2 sind, und nicht etwa grundsätzliche Unterschiede in der Ca2+-Homöostase der

Zellen, dann sollte es möglich sein, diese erhöhte Resistenz mit dem Einsatz von

höheren H2O2-Konzentrationen zu durchbrechen. Daher wurden als nächstes die

Bcl-2-transfizierten Zellen mit 3 mM H2O2 inkubiert. Bei diesen Konzentrationen

konnte ein schneller Anstieg des cytosolischen Ca2+ beobachtet werden (Abbildung

18). Bei dieser höheren H2O2-Konzentration waren sowohl Quin-2 (10 µM), als auch

Glucose (10 mM) protektiv, obwohl bei Einsatz von 1 mM H2O2 kein Schutzeffekt

durch Quin-2 oder Glucose festgestellt werden konnte (Abbildung 19 A und B). Der

Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration und der darauffolgende Zelluntergang

sind demnach abhängig vom zellulären Glutathionstatus und das Bcl-2-Protein

scheint seinen protektiven Effekt durch Verbesserung des antioxidativen Potentials

auszuüben, ohne einen direkten Effekt auf die Ca2+-Homöostase.

60

Abbildung 17: Effekt von BSO auf den Vitalitätsverlust von Rat-1/Bcl-2-Zellen. Rat-1/Bcl-2-Zellen wurden für 10 h mit 0,5 mM BSO vorinkubiert und

anschliessend in Krebs-Henseleit-Puffer (ohne Glucose) mit 1 mM H2O2 inkubiert.

Die Zellschädigung wurde anhand der Freisetzung cytosolischer LDH gemessen.

Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten ± S.D. aus vier Experimenten.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6

Inkubationszeit (h)

LDH

-Fre

iset

zung

(%)

Vorinkubation mit BSO

ohne Vorinkubation

61

Abbildung 18: Effekt einer erhöhten H2O2-Konzentration auf den H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration in Rat-1/Bcl-2-Zellen. Rat-1/Bcl-2-Zellen wurden in Krebs-Henseleit-Puffer mit 1 mM oder 3 mM H2O2

inkubiert. Die cytosolische Ca2+-Konzentration wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie

und dem Ca2+-Indikator Fura-2 bestimmt. Die gezeigten Daten entsprechen den

Mittelwerten ± S.D. aus vier Experimenten.

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Inkubationszeit (min)

Cyt

osol

isch

eC

a2+-K

onze

ntra

tion

(nM

)

1 mM H2O2

3 mM H2O2

62

Abbildung 19: Effekt einer erhöhten H2O2-Konzentration auf die Zellschädigung von Rat-1/Bcl-2-Zellen. Rat-1/Bcl-2-Zellen wurden in Krebs-Henseleit-Puffer in Gegenwart von 3 mM H2O2

mit oder ohne Quin-2 (10 µM) (A), bzw. mit oder ohne Glucose (10 mM) (B)

inkubiert. Die Zellschädigung wurde anhand der Freisetzung cytosolischer LDH

gemessen. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten ± S.D. aus vier

Experimenten.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6

Inkubationszeit (h)

LDH

-Fre

iset

zung

(%) H2O2 3 mM

ohne Quin-2

H2O2 3 mM mit Quin-2

A)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6

Inkubationszeit (h)

LDH

-Fre

iset

zung

(%)

H2O2 3 mM ohne Glucose

H2O2 3 mM mit Glucose

B)

63

5. Diskussion

5.1 H2O2, Glutathion und Calciumhomöostase

Zwei wohlbekannte Ereignisse im Zusammenhang mit dem durch H2O2 induzierten

Zelltod sind der Zusammenbruch der zellulären Ca2+-Homöostase sowie die

Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern (z. B. dem endoplasmatischen

Retikulum) in das Cytosol (68, 69, 73). Der Anstieg der cytosolischen Ca2+-

Konzentration spielt offensichtlich ebenso eine entscheidende Rolle bei der

cytotoxischen Wirkung von H2O2 auf nicht Bcl-2-transfizierte Rat-1-Fibroblasten:

nach Zugabe von H2O2 konnte ein schneller und deutlicher Anstieg der cytosolischen

Ca2+-Konzentration beobachtet werden (Abbildung 6) wobei der Ca2+-Chelator Quin-

2 effektiv vor dem Zelltod schützte. In dem Ca2+-abhängigen Weg der oxidativen

Zellschädigung spielt der zelluläre Glutathionstatus offenbar eine entscheidende

Rolle hinsichtlich des cytosolischen Ca2+-Anstiegs. Die Ca2+-Homöostase der Zelle

wird aufrechterhalten durch ein komplexes System von Transportproteinen, welche in

den Membranen des endoplasmatischen Retikulums, der Mitochondrien sowie der

Zellkern- und der Plasmamembran der Zelle lokalisiert sind. Glutathion wiederum

spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Redox-Balance von Thiol-

Gruppen dieser Transportproteine (8, 9, 20, 42). An PC 12-Zellen konnte gezeigt

werden, dass eine Abnahme des zellulären Glutathions zu Ca2+-vermitteltem Zelltod

führte (43), ferner beobachteten andere Gruppen nach Glutathiondepletion von

Thymozyten einen Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration und die Auslösung

von Apoptose (54). In der vorliegenden Studie führte die Inkubation von Rat-1-

Fibroblasten (Wildtyp) mit H2O2 zu einem deutlichen Abfall von GSH, bei

gleichzeitigem Anstieg von GSSG (Abbildung 9 A und B). Darüberhinaus konnte

nach Stabilisierung des zellulären GSH-Pools mit N-Acetylcystein ein signifikanter

Schutzeffekt gegenüber dem Anstieg von intrazellulärem Ca2+ und dem H2O2-

vermittelten Zelltod beobachtet werden. Insofern sind diese Ergebnisse gut mit den

oben genannten Arbeiten vereinbar.

In Gegenwart von Glucose war sowohl der H2O2-induzierte Anstieg der cytosolischen

Ca2+-Konzentration als auch die Zellschädigung an sich deutlich verzögert. Wie

bereits für L929-Fibroblasten beschrieben (52), resultiert dieser protektive Effekt von

Glucose aus der Beeinflussung des Glutathion-Redoxzyklus. In diesem Zyklus erfolgt

die Bildung von GSSG durch die katalytische Aktivität der GSH-Peroxidase, welches

64

durch die GSH-Reduktase wieder zu GSH reduziert wird. Das für diese Reaktion

notwendige NADPH wird vornehmlich aus dem Metabolismus von Glucose im

Pentosephosphatweg bereitgestellt. Die hier vorliegenden Ergebnisse passen

insofern gut in das beschriebene Konzept, weil die Zugabe von Glucose einerseits

den Abfall des reduzierten Glutathions verzögerte und andererseits den GSSG/GSH-

Quotienten erniedrigte (Abbildung 9 A und B). Zusammenfassend hemmt Glucose

demnach den Ca2+-abhängigen Weg der H2O2-vermittelten Zellschädigung

wahrscheinlich durch den Effekt auf den Glutathion-Redoxzyklus.

In Säugerzellen sind vor allem zwei antioxidative Mechanismen am Abbau von

intrazellulärem H2O2 beteiligt. Erstens die durch Katalasen vermittelte Konversion

von H2O2 zu molekularem Sauerstoff und Wasser und zweitens das Glutathion-

Peroxidase/Glutathion-Reduktase-System. Wie oben bereits erwähnt, erfolgt hierbei

durch die Glutathion-Peroxidase die Oxidation von GSH zu GSSG unter Verbrauch

von H2O2. Glutathion-Reduktase wiederum regeneriert GSH aus GSSG unter

Verbrauch des Reduktionsäquivalentes NADPH (5).

Der protektive Effekt von Glucose wurde in zurückliegenden Arbeiten auf eine

beschleunigte Degradation von H2O2 durch die Glutathion-Peroxidase zurückgeführt

(50). In der vorliegenden Arbeit war die Degradation von H2O2 unabhängig von der

Anwesenheit von Glucose, was darauf hindeutet, dass der Prozess des H2O2-

Abbaus vor allem durch die Aktivität der Katalase unterhalten wird. Darüber hinaus

waren die ATP-Spiegel unabhängig von der Anwesenheit von Glucose. Daher kann

ein beschleunigter H2O2-Abbau oder eine verbesserte Bereitstellung von

Energieträgern in der Zelle nicht den protektiven Effekt von Glucose erklären.

5.2 Der Schutzeffekt von Bcl-2

Der protektive Effekt des Bcl-2-Proteins gegenüber H2O2-induzierter Zellschädigung

zeigt bemerkenswerte Analogien zum protektiven Effekt von Glucose: In den mit

Bcl-2 transfizierten Zellen trat der Zelluntergang deutlich später ein und der Anstieg

der cytosolischen Ca2+ Konzentration war nur gering ausgeprägt (Abbildung 6).

Passend zu diesem Befund zeigte der Ca2+-Chelator Quin-2 bei diesen Zellen keinen

Schutzeffekt. Darüberhinaus führte die Überexpression des Bcl-2-Proteins zu einer

Erhöhung der Gesamtmenge an Glutathion sowie zu einem geringeren Abfall von

GSH bei H2O2-Exposition (Abbildung 9). Die Folgerung hieraus ist, dass Bcl-2 vor

Zelltod schützt, indem es den Ca2+-abhängigen Weg der H2O2-vermittelten Toxizität

65

hemmt. Dieser Schutzeffekt ist hinreichend erklärbar durch die Aufrechterhaltung der

zellulären Glutathionhomöostase. In der vorliegenden Arbeit ergeben sich jedoch

noch weitere Hinweise auf eine enge physiologische Verknüpfung zwischen der

Ca2+- und der Glutathionhomöostase: Nach Verminderung von zellulärem Glutathion

durch BSO, führte die anschließende Inkubation mit 1 mM H2O2 zu einem

pathologischen Ca2+-Anstieg auch in den Bcl-2-transfizierten Zellen (Abbildung 16).

Ferner war es möglich, die erhöhte antioxidative Kapazität der Bcl-2-Transfektanten

zu durchbrechen, indem die Zellen einem erhöhten oxidativen Stress ausgesetzt

wurden: Bei Inkubation mit 3 mM H2O2 stieg das cytosolische Ca2+ deutlich an

(Abbildung 18) und Quin-2 zeigte in diesen Fällen protektive Effekte.

Die Beobachtung, dass Bcl-2 nicht direkt die intrazelluläre Ca2+-Kompartimentierung

oder die Ca2+-Ströme an intrazellulären Membranen reguliert, sondern die Sensitivität

gegenüber Ca2+-abhängigen Zellschädigungsprozessen indirekt über das zelluläre

Glutathion moduliert, kann dazu beitragen, die widersprüchlichen Ergebnisse in

Bezug auf die Wirkung von Bcl-2 auf die zelluläre Ca2+-Homöostase zu vereinen (6,

11, 18, 19, 33, 56, 65, 79, 99). Entsprechend den Beobachtungen in dieser Arbeit

sollte Bcl-2 nur solche Ca2+-vermittelten Zellschädigungsprozesse beeinflussen,

welche durch Veränderung in der Glutathionhomöostase getriggert werden. Nicht

GSH-abhängige Prozesse sollten hingegen von der Bcl-2-Expression unbeeinflusst

bleiben. Diese Hypothese muss allerdings noch in anderen Zellsystemen überprüft

werden.

5.3 Bcl-2 und zelluläres Glutathion

Effekte von Bcl-2 auf zelluläres Glutathion wurden bereits in verschiedenen Zelltypen

beschrieben, jedoch wurden diese nicht im Zusammenhang mit der zellulären Ca2+-

Homöostase betrachtet. Die beschriebenen Effekte beinhalten u.a. die

Hochregulierung von zellulärem Glutathion, eine erhöhte Resistenz gegenüber einer

Apoptose aufgrund eines reduktiven Shift des zellulären Redox-Gleichgewichtes und

die Umverteilung von GSH in den Zellkern mit konsekutivem Schutz gegenüber DNA-

Fragmentation (21, 61, 64, 90, 93, 95). Trotz der vielen Arbeiten über Bcl-2 und

Glutathion ist noch immer unklar, über welchen Mechanismus Bcl-2 den zellulären

Glutathionmetabolismus verändert. Bei der Diskussion der Zusammenhänge von

Bcl-2 und zellulärem Glutathion ist es sinnvoll, diese in drei Gruppen zu unterteilen:

66

- direkte Effekte von Bcl-2 auf zelluläre Glutathionspiegel, z. B. durch die

Beeinflussung des Importes oder des Effluxes von GSH

- Effekte von Bcl-2 auf andere Parameter als Glutathion, die aber

möglicherweise über Glutathion vermittelt werden, z. B. die mitochondriale

Permeabilitätserhöhung

- Effekte, die auf zelluläres Glutathion rückwirken können, z.B. die

Entkoppelung der Atmungskette oder die transkriptionelle Regulation von

zellulären Enzymen.

Bei den direkten Effekten von Bcl-2 auf zelluläre Glutathionspiegel ist zwischen

Veränderungen der zellulären Basalspiegel von GSH und der Verlangsamung des

GSH-Abfalls unter Stress-Bedingunen zu unterscheiden. Eine erhöhte Aktivität der

cytosolischen GSH-Synthetase, dem Schlüsselenzym der Glutathionsynthese, wurde

bisher nicht konsistent beobachtet. Eine andere Möglichkeit, den intrazellulären

Basalspiegel von GSH zu erhöhen, ist die Erhöhung des Importes. GSH selbst kann

nicht die Zellmembran passieren. Um den Transport von GSH in die Zelle zu

ermöglichen, wird GSH durch γ-Glutamyl-Transferase (GGT) in Glutaminsäure und

Cysteinylglycin hydrolysiert, anschliessend erfolgt die Spaltung in die drei GSH-

bildenden Aminosäuren Glutamat, Cystein und Glycin durch eine membranständige

Dipeptidase. Die freien Aminosäuren können in die Zelle eintreten und zur Bildung

des Glutathion-Pools beitragen (60, 96). DNA-Chip-Analysen zeigen eine signifikante

Erhöhung von GGT in Bcl-2-exprimierenden Zellen (96). Eine Erklärung für den nur

gering ausgeprägten Abfall von GSH könnte die Verhinderung des GSH-Effluxes

über die Zellmembran sein, so wie es für Bcl-2 und Bcl-xL, einem Protein aus der

Bcl-2 Familie, beschrieben wurde (12, 28).

Ein Effekt von Bcl-2, der möglicherweise über Glutathion vermittelt wird ist die

inhibitorische Wirkung auf die Öffnung der sog. „mitochondrial permeability transition

pore“ (MPT-Pore) (31, 48, 57, 92). Diese „MPT-Pore“ entspricht einem

Multiproteinkomplex, dessen zentrale Pore aus dem Adenin-Nukleotid-Translokator

(ANT), einem Transmembranprotein in der inneren mitochondrialen Membran, und

aus einem Protein der äußeren mitochondrialen Membran, namentlich dem „voltage-

dependent anion channel“ (VDAC), gebildet wird. Andere zu diesem Komplex

gehörende Proteine sind der periphere Benzodiazepinrezeptor und Cyclophilin D (30,

67

83, 98). Die MPT kann durch die Oxidation von mitochondrialen Pyridin-Nukleotiden

ausgelöst werden (46, 97). Der Redox-Status von NADPH wiederum ist über das

Glutathion-Reduktase- und das Thioredoxin-Reduktase-System eng assoziiert mit

dem Redox-Status von Glutathion und von Protein-Thiolen. Es konnte gezeigt

werden, dass hohe Spiegel an reduziertem Glutathion eine Hemmung der MPT

bewirken (44), während Glutathion- und nachfolgende Thiol-Oxidation zur Öffnung

der MPT-Pore führen (4, 46, 80). Es wurden zwei experimentell unterscheidbare,

redoxsensitive Stellen innerhalb der MPT-Pore beschrieben. Eine von ihnen befindet

sich im Redoxgleichgewicht mit Pyridinnukeotiden, die andere im

Redoxgleichgewicht mit Glutathion (17, 75). Die Wirkung von Bcl-2 auf zelluläres

Glutathion könnte daher auch eine Erklärung für den bekannten Hemmeffekt von Bcl-

2 auf die MPT liefern.

Über den Effekt auf die mitochondriale Atmungskette oder über die transkriptionelle

Regulation zellulärer Enzyme kann Bcl-2 auf die Glutathionhomöostase rückwirken.

Die mitochondriale Permeabilitätserhöhung kann aufgrund der Entkoppelung der

Atmungskette dazu führen, dass Elektronen, die normalerweise zur Bildung von

Wasser beitragen, stattdessen zu einer erhöhten Bildung von reaktivem Sauerstoff

und zu einer Verarmung an zellulärem Glutathion führen. Durch Hemmung der

mitochondrialen Permeabilitätserhöhung kann Bcl-2 möglicherweise zur

Stabilisierung des zellulären GSH-Pools beitragen, wodurch der deutlich geringere

Abfall des zellulären GSH bzw. der geringere Anstieg des GSSG in Bcl-2-

transfizierten Rat-1-Fibroblasten bei H2O2-Exposition erklärt werden könnte. Diese

positive „Feedbackschleife“ (Oxidation von GSH, Öffnung der MPT-Pore,

Entkoppelung der Atmungskette, Oxidation von GSH) kann möglicherweise durch die

Wirkung von Bcl-2 durchbrochen werden.

Die transkriptionelle Aktivität von diversen Genen wird scheinbar über das zelluläre

Redox-Gleichgewicht reguliert. Viele Transkriptionsfaktoren befinden sich im Cytosol

in ihrer inaktiven Form, wobei Veränderungen des zellulären Redox-Status zu ihrer

Aktivierung und Translokation in den Zellkern führen können. Ein gut untersuchtes

Beispiel für dieses Modell ist der Transkriptionsfaktor NF-κB (85). Der Redox-Status

der Zelle und die subzelluläre Kompartimentierung von GSH erlauben demnach eine

differenzierte Regulation der Transkription. Auch Berichte über eine vermehrte

Translokation von GSH in den Zellkern infolge Überexpression von Bcl-2 lassen

68

vermuten, dass das Bcl-2-Protein an der Modifizierung von transkriptionellen

Programmen beteiligt sein kann (95). Durch transkriptionelle Regulation von

Enzymen könnte Bcl-2 wiederum auf die zelluläre Glutathionhomöostase rückwirken:

DNA-Chip Analysen an Bcl-2-positiven und negativen Zelllinien zeigten interessante

Veränderungen bezüglich der Expression von Genen, die den intrazellulären Redox-

Status regulieren (94). So ist z. B. in Bcl-2-positiven Zelllinien die Expression der

Fructose-1,6-Bisphosphatase hochreguliert. Letzteres ist ein Schlüsselenzym der

Gluconeogenese und katalysiert daher indirekt die Bildung von Glucose-6-Phosphat,

welches wiederum in den Pentosephosphatweg einfliesst und so zur Bildung von

NADPH führt (86). NADPH wiederum trägt zur Reduktion von GSSG durch die

Glutathion-Reduktase bei. Dieses Modell ist in Übereinstimmung mit der in dieser

Arbeit gemachten Beobachtung, dass mit Bcl-2 transfizierte Rat-1-Fibroblasten zu

einer verbesserten Bereitstellung von reduziertem Glutathion fähig sind, vor allem bei

H2O2-Exposition bzw. bei erhöhtem oxidativen Stress. Ferner wurden für Bcl-2-

überexprimierende Zellen erhöhte NADPH-Spiegel beschrieben (23). Dieses Modell

kann auch eine Erklärung dafür liefern, warum die Anwesenheit von Glucose die

Effekte von Bcl-2 in dem hier untersuchten Zellschädigungsmodell nachahmen kann:

Glucose führt ebenfalls zu einer vermehrten Bereitstellung von NADPH über den

Pentosephosphatweg.

Zur Etablierung des hier vorgeschlagenen Modells bedarf es weitergehender

Untersuchungen, jedoch wird aus der vorliegenden Arbeit deutlich, dass in einem

Modell der externen Induktion von oxidativem Stress das Onkoprotein Bcl-2 die

intrazellulären Ca2+-Signale indirekt beeinflusst durch Erhöhung der

glutahionabhängigen antioxidativen Kapazität der Zelle. Diese Beobachtungen sind

vereinbar mit der ursprünglichen Hypothese von Hockenbery et al. (37), der zufolge

Bcl-2 durch Regulation von antioxidativen Signalwegen apoptotische Vorgänge in der

Zelle inhibiert.

69

6. Abkürzungsverzeichnis

ATP Adenosintriphosphat

BSA Bovines Serumalbumin

BSO DL-Buthionin(S,R)-Sulfoximin

cDNA Kopie-DNA (copy-DNA)

CE Kapillarelektrophorese

DEPC Diethylpyrocarbonat

DMEM Dulbecco´s modified Eagles medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DTAB Dodecyltrimethylammoniumbromid

DTT Dithiothreitol

DTPA Diethyltriaminpentaessigsäure

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EOF Elektroosmotischer Fluß

FCS Fötales Kälberserum

GSH Glutathion (reduziert)

GSSG Glutathion (oxidiert)

GST Glutathion-S-Transferase

HBSS Hanks gepufferte Salzlösung

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperanzinyl)ethansulfonsäure

KH Krebs-Henseleit-Puffer

LDH Lactat-Dehydrogenase

MOPS Morpholinopropansulfonsäure

NAC N-Acetylcystein

NAD+ Nicotinamid-Adenindinucleotid (oxidiert)

NADH Nicotinamid-Adenindinucleotid (reduziert)

NADP+ Nicotinamid-Adenindinucleotidphosphat (oxidiert)

NADPH Nicotinamid-Adenindinucleotidphosphat (reduziert)

NC Nitro-Cellulose

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung

RNA Ribonukleinsäure

70

RNase Ribonuklease

S.D. Standardabweichung

SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecylsulfate)

SSC Citrat-gepufferte Kochsalzlösung

TEMED N, N, N´,N´-Tetramethylendiamin

Tris 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol

Tween Polyoxyethylensorbitanmonolaurat

WCE-Puffer whole cell extract-Puffer

71

7. Zusammenfassung

Das Bcl-2-Protein zeigt eine protektive Wirkung gegenüber einer Vielzahl von

apoptotischen Stimuli, jedoch ist der zugrundeliegende molekulare Mechanismus

weitgehend unbekannt.

Bei der Untersuchung der H2O2-induzierten Zellschädigung von Rat-1-Fibroblasten

konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Bcl-2 vor dem Anstieg der cytosolischen

Ca2+-Konzentration schützt. Dieser cytosolische Ca2+-Anstieg ist von großer

Relevanz für den Zellschädigungsprozeß bei Inkubation mit H2O2, da der

Ca2+-Chelator Quin-2 den Zelltod verzögern kann. Die Überexpression von Bcl-2

resultierte in einer Veränderung des zellulären Glutathionstatus: Die Gesamtmenge

an zellulärem Glutathion war um 60% erhöht und das Redoxpotential des zellulären

Glutathion-Pools wurde bei Inkubation mit H2O2 in einem stärker reduzierten Zustand

gehalten. Die vorliegende Arbeit zeigt eine eindeutige Ursache-Wirkungs-Beziehung

zwischen dem Zusammenbruch der zellulären Glutathionhomöostase und der

nachfolgenden Erhöhung der cytosolischen Ca2+-Konzentration auf. Die

Stabilisierung des Glutathion-Pools durch Bcl-2, N-Acetylcystein oder Glucose

verzögerte den cytosolischen Ca2+-Anstieg und den nachfolgenden Zelltod,

umgekehrt führte die Depletion von Glutathion durch DL-Buthionin-(S,R)-Sulfoximin

zu einem beschleunigten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration und zu einem

schnelleren Zelluntergang. Zum ersten Mal in der Literatur wird gezeigt, dass die

Veränderung der Glutathionhomöostase durch Bcl-2 den entscheidenden

Mechanismus darstellt, durch den Bcl-2 in dem vorliegenden Zellschädigungsmodell

eine protektive Wirkung ausübt. Die Wirkung von Bcl-2 auf cytosolisches Ca2+ ist

sekundär, weil der Schutzeffekt durch die Veränderung des zellulären Glutathions

vollständig erklärt werden kann.

72

8. Literaturverzeichnis

1. Adams, J. M., and S. Cory. (1998). The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science 281:1322-6.

2. Amundson, S. A., T. G. Myers, and A. J. Fornace, Jr. (1998). Roles for p53 in growth arrest and apoptosis: putting on the brakes after genotoxic stress. Oncogene 17:3287-99.

3. Armitage, P. 1971. Statistic methods in medical research. Blackwell Scientific Publications, Oxford.

4. Armstrong, J. S., and D. P. Jones. (2002). Glutathione depletion enforces the mitochondrial permeability transition and causes cell death in Bcl-2 overexpressing HL60 cells. FASEB J 16:1263-5.

5. Aruoma, O. I. (1995). Characterization of drugs as antioxidant prohylactics. Free Radical Biology & Medicine 20:675-705.

6. Baffy, G., T. Miyashita, J. R. Williamson, and J. C. Reed. (1993). Apoptosis induced by withdrawal of interleukin-3 (IL-3) from an IL-3- dependent hematopoietic cell line is associated with repartitioning of intracellular calcium and is blocked by enforced Bcl-2 oncoprotein production. J Biol Chem 268:6511-9.

7. Baker, A., C. M. Payne, M. M. Briehl, and G. Powis. (1997). Thioredoxin, a gene found overexpressed in human cancer, inhibits apoptosis in vitro and in vivo. Cancer Res 57:5162-7.

8. Bellomo, G., F. Mirabelli, P. Richelmi, and S. Orrenius. (1983). Critical role of sulfhydryl group(s) in ATP-dependent Ca2+ sequestration by the plasma membrane fraction from rat liver. FEBS Lett 163:136-9.

9. Bellomo, G., and S. Orrenius. (1985). Altered thiol and calcium homeostasis in oxidative hepatocellular injury. Hepatology 5:876-82.

10. Bernt, E., and H. U. Bergmeyer. 1974. Methoden der Enzymatischen Analyse. Verlag Chemie, Weinheim.

11. Bian, X., F. M. Hughes, Jr., Y. Huang, J. A. Cidlowski, and J. W. Putney, Jr. (1997). Roles of cytoplasmic Ca2+ and intracellular Ca2+ stores in induction and suppression of apoptosis in S49 cells. Am J Physiol 272:C1241-9.

12. Bojes, H. K., K. Datta, J. Xu, A. Chin, P. Simonian, G. Nunez, and J. P. Kehrer. (1997). Bcl-xL overexpression attenuates glutathione depletion in FL5.12 cells following interleukin-3 withdrawal. Biochem J 325:315-9.

13. Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-54.

14. Buttke, T. M., and P. A. Sandstrom. (1995). Redox regulation of programmed cell death in lymphocytes. Free Radic Res 22:389-97.

15. Cheng, E. H., B. Levine, L. H. Boise, C. B. Thompson, and J. M. Hardwick. (1996). Bax-independent inhibition of apoptosis by Bcl-XL. Nature 379:554-6.

16. Costantini, P., A. S. Belzacq, H. L. Vieira, N. Larochette, M. A. de Pablo, N. Zamzami, S. A. Susin, C. Brenner, and G. Kroemer. (2000). Oxidation of a critical thiol residue of the adenine nucleotide translocator enforces Bcl-2-independent permeability transition pore opening and apoptosis. Oncogene 19:307-14.

17. Costantini, P., B. V. Chernyak, V. Petronilli, and P. Bernardi. (1996). Modulation of the mitochondrial permeability transition pore by pyridine

73

nucleotides and dithiol oxidation at two separate sites. J Biol Chem 271:6746-51.

18. Distelhorst, C. W., M. Lam, and T. S. McCormick. (1996). Bcl-2 inhibits hydrogen peroxide-induced ER Ca2+ pool depletion. Oncogene 12:2051-5.

19. Distelhorst, C. W., and T. S. McCormick. (1996). Bcl-2 acts subsequent to and independent of Ca2+ fluxes to inhibit apoptosis in thapsigargin- and glucocorticoid-treated mouse lymphoma cells. Cell Calcium 19:473-83.

20. Eager, K. R., L. D. Roden, and A. F. Dulhunty. (1997). Actions of sulfhydryl reagents on single ryanodine receptor Ca(2+)- release channels from sheep myocardium. Am J Physiol 272:C1908-18.

21. Ellerby, L. M., H. M. Ellerby, S. M. Park, A. L. Holleran, A. N. Murphy, G. Fiskum, D. J. Kane, M. P. Testa, C. Kayalar, and D. E. Bredesen. (1996). Shift of the cellular oxidation-reduction potential in neural cells expressing Bcl-2. J Neurochem 67:1259-67.

22. Ermak, G., and K. J. Davies. (2002). Calcium and oxidative stress: from cell signaling to cell death. Mol Immunol 38:713-21.

23. Esposti, M. D., I. Hatzinisiriou, H. McLennan, and S. Ralph. (1999). Bcl-2 and mitochondrial oxygen radicals. New approaches with reactive oxygen species-sensitive probes. J Biol Chem 274:29831-7.

24. Fanidi, A., E. A. Harrington, and G. I. Evan. (1992). Cooperative interaction between c-myc and bcl-2 proto-oncogenes. Nature 359:554-6.

25. Farber, J. L., M. E. Kyle, and J. B. Coleman. (1990). Mechanisms of cell injury by activated oxygen species. Lab Invest 62:670-9.

26. Fleury, C., B. Mignotte, and J. L. Vayssiere. (2002). Mitochondrial reactive oxygen species in cell death signaling. Biochimie 84:131-41.

27. Fossati, P., L. Prencipe, and G. Berti. (1980). Use of 3,5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic acid/4-aminophenazone chromogenic system in direct enzymic assay of uric acid in serum and urine. Clin Chem 26:227-31.

28. Ghibelli, L., C. Fanelli, G. Rotilio, E. Lafavia, S. Coppola, C. Colussi, P. Civitareale, and M. R. Ciriolo. (1998). Rescue of cells from apoptosis by inhibition of active GSH extrusion. FASEB J 12:479-86.

29. Gizewski, E. R., U. Rauen, M. Kirsch, I. Reuters, H. Diederichs, and H. D. Groot. (1997). Rapid decrease in cellular sodium and chloride content during cold incubation of cultured liver endothelial cells and hepatocytes. Biochem J 322:693-9.

30. Green, D. R., and G. I. Evan. (2002). A matter of life and death. Cancer Cell 1:19-30.

31. Gross, A. (2001). BCL-2 proteins: regulators of the mitochondrial apoptotic program. IUBMB Life 52:231-6.

32. Grynkiewicz, G., M. Poenie, and R. Y. Tsien. (1985). A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem 260:3440-50.

33. Guo, Q., B. L. Sopher, K. Furukawa, D. G. Pham, N. Robinson, G. M. Martin, and M. P. Mattson. (1997). Alzheimer's presenilin mutation sensitizes neural cells to apoptosis induced by trophic factor withdrawal and amyloid beta-peptide: involvement of calcium and oxyradicals. J Neurosci 17:4212-22.

34. Halliwell, B., and C. E. Cross. (1994). Oxygen-derived species: their relation to human disease and environmental stress. Environ Health Perspect 102 Suppl 10:5-12.

35. Hampton, M. B., and S. Orrenius. (1998). Redox regulation of apoptotic cell death. Biofactors 8:1-5.

74

36. Hartwell, L. H., and M. B. Kastan. (1994). Cell cycle control and cancer. Science 266:1821-8.

37. Hockenbery, D. M., Z. N. Oltvai, X. M. Yin, C. L. Milliman, and S. J. Korsmeyer. (1993). Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis. Cell 75:241-51.

38. Hueber, A. O., M. Zornig, D. Lyon, T. Suda, S. Nagata, and G. I. Evan. (1997). Requirement for the CD95 receptor-ligand pathway in c-Myc-induced apoptosis. Science 278:1305-9.

39. Jacobson, M. D. (1996). Reactive oxygen species and programmed cell death. Trends Biochem Sci 21:83-6.

40. Jandik, P., and G. Bonn. 1993. Capillary electrophoresis of small molecules and ions, 1 ed. VCH, New York, Weinheim, Cambridge.

41. Jauregui, H. O., N. T. Hayner, J. L. Driscoll, R. Williams-Holland, M. H. Lipsky, and P. M. Galletti. (1981). Trypan blue dye uptake and lactate dehydrogenase in adult rat hepatocytes--freshly isolated cells, cell suspensions, and primary monolayer cultures. In Vitro 17:1100-10.

42. Jones, D. P., H. Thor, M. T. Smith, S. A. Jewell, and S. Orrenius. (1983). Inhibition of ATP-dependent microsomal Ca2+ sequestration during oxidative stress and its prevention by glutathione. J Biol Chem 258:6390-3.

43. Jurma, O. P., D. G. Hom, and J. K. Andersen. (1997). Decreased glutathione results in calcium-mediated cell death in PC12. Free Radic Biol Med 23:1055-66.

44. Kantrow, S. P., L. G. Tatro, and C. A. Piantadosi. (2000). Oxidative stress and adenine nucleotide control of mitochondrial permeability transition. Free Radic Biol Med 28:251-60.

45. Koetsier, P. A., J. Schorr, and W. Doerfler. (1993). A rapid optimized protocol for downward alkaline Southern blotting of DNA. Biotechniques 15:260-2.

46. Kowaltowski, A. J., R. F. Castilho, and A. E. Vercesi. (2001). Mitochondrial permeability transition and oxidative stress. FEBS Lett 495:12-5.

47. Krajewski, S., S. Tanaka, S. Takayama, M. J. Schibler, W. Fenton, and J. C. Reed. (1993). Investigation of the subcellular distribution of the bcl-2 oncoprotein: residence in the nuclear envelope, endoplasmic reticulum, and outer mitochondrial membranes. Cancer Res 53:4701-14.

48. Kroemer, G., B. Dallaporta, and M. Resche-Rigon. (1998). The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annu Rev Physiol 60:619-42.

49. Lehrach, H., D. Diamond, J. M. Wozney, and H. Boedtker. (1977). RNA molecular weight determinations by gel electrophoresis under denaturing conditions, a critical reexamination. Biochemistry 16:4743-51.

50. Link, E. M. (1990). Enzymic pathways involved in cell response to H2O2. Free Radic Res Commun 11:89-97.

51. Littlewood, T. D., D. C. Hancock, P. S. Danielian, M. G. Parker, and G. I. Evan. (1995). A modified oestrogen receptor ligand-binding domain as an improved switch for the regulation of heterologous proteins. Nucleic Acids Res 23:1686-90.

52. Lomonosova, E. E., M. Kirsch, and H. de Groot. (1998). Calcium vs. iron-mediated processes in hydrogen peroxide toxicity to L929 cells: effects of glucose. Free Radic Biol Med 25:493-503.

75

53. Lotem, J., M. Peled-Kamar, Y. Groner, and L. Sachs. (1996). Cellular oxidative stress and the control of apoptosis by wild-type p53, cytotoxic compounds, and cytokines. Proc Natl Acad Sci U S A 93:9166-71.

54. Macho, A., T. Hirsch, I. Marzo, P. Marchetti, B. Dallaporta, S. A. Susin, N. Zamzami, and G. Kroemer. (1997). Glutathione depletion is an early and calcium elevation is a late event of thymocyte apoptosis. J Immunol 158:4612-9.

55. Marchetti, P., D. Decaudin, A. Macho, N. Zamzami, T. Hirsch, S. A. Susin, and G. Kroemer. (1997). Redox regulation of apoptosis: impact of thiol oxidation status on mitochondrial function. Eur J Immunol 27:289-96.

56. Marin, M. C., A. Fernandez, R. J. Bick, S. Brisbay, L. M. Buja, M. Snuggs, D. J. McConkey, A. C. von Eschenbach, M. J. Keating, and T. J. McDonnell. (1996). Apoptosis suppression by bcl-2 is correlated with the regulation of nuclear and cytosolic Ca2+. Oncogene 12:2259-66.

57. Martinou, J. C., and D. R. Green. (2001). Breaking the mitochondrial barrier. Nat Rev Mol Cell Biol 2:63-7.

58. Mayer, M., and M. Noble. (1994). N-acetyl-L-cysteine is a pluripotent protector against cell death and enhancer of trophic factor-mediated cell survival in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 91:7496-500.

59. McConkey, D. J., and S. Orrenius. (1996). The role of calcium in the regulation of apoptosis. J Leukoc Biol 59:775-83.

60. Meister, A. (1995). Glutathione metabolism. Methods Enzymol 251:3-7. 61. Meredith, M. J., C. L. Cusick, S. Soltaninassab, K. S. Sekhar, S. Lu, and

M. L. Freeman. (1998). Expression of Bcl-2 increases intracellular glutathione by inhibiting methionine-dependent GSH efflux. Biochem Biophys Res Commun 248:458-63.

62. Merry, D. E., and S. J. Korsmeyer. (1997). Bcl-2 gene family in the nervous system. Annu Rev Neurosci 20:245-67.

63. Minn, A. J., C. S. Kettlun, H. Liang, A. Kelekar, M. G. Vander Heiden, B. S. Chang, S. W. Fesik, M. Fill, and C. B. Thompson. (1999). Bcl-xL regulates apoptosis by heterodimerization-dependent and - independent mechanisms. EMBO J 18:632-43.

64. Mirkovic, N., D. W. Voehringer, M. D. Story, D. J. McConkey, T. J. McDonnell, and R. E. Meyn. (1997). Resistance to radiation-induced apoptosis in Bcl-2-expressing cells is reversed by depleting cellular thiols. Oncogene 15:1461-70.

65. Murphy, A. N., D. E. Bredesen, G. Cortopassi, E. Wang, and G. Fiskum. (1996). Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A 93:9893-8.

66. Nguyen, M., P. E. Branton, P. A. Walton, Z. N. Oltvai, S. J. Korsmeyer, and G. C. Shore. (1994). Role of membrane anchor domain of Bcl-2 in suppression of apoptosis caused by E1B-defective adenovirus. J Biol Chem 269:16521-4.

67. Nguyen, M., D. G. Millar, V. W. Yong, S. J. Korsmeyer, and G. C. Shore. (1993). Targeting of Bcl-2 to the mitochondrial outer membrane by a COOH- terminal signal anchor sequence. J Biol Chem 268:25265-8.

68. Nicotera, P., G. Bellomo, and S. Orrenius. (1990). The role of Ca2+ in cell killing. Chem Res Toxicol 3:484-94.

69. Nicotera, P., D. McConkey, S. A. Svensson, G. Bellomo, and S. Orrenius. (1988). Correlation between cytosolic Ca2+ concentration and cytotoxicity in hepatocytes exposed to oxidative stress. Toxicology 52:55-63.

76

70. Nunez, G., L. London, D. Hockenbery, M. Alexander, J. P. McKearn, and S. J. Korsmeyer. (1990). Deregulated Bcl-2 gene expression selectively prolongs survival of growth factor-deprived hemopoietic cell lines. J Immunol 144:3602-10.

71. O'Connor, L., A. Strasser, L. A. O'Reilly, G. Hausmann, J. M. Adams, S. Cory, and D. C. Huang. (1998). Bim: a novel member of the Bcl-2 family that promotes apoptosis. EMBO J 17:384-95.

72. Oltvai, Z. N., C. L. Milliman, and S. J. Korsmeyer. (1993). Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell 74:609-19.

73. Orrenius, S., D. J. McConkey, G. Bellomo, and P. Nicotera. (1989). Role of Ca2+ in toxic cell killing. Trends Pharmacol Sci 10:281-5.

74. Pariat, Y. F., J. Berka, D. N. Heiger, T. Schmitt, M. Vilenchik, A. S. Cohen, F. Foret, and B. L. Karger. (1993). Separation of DNA fragments by capillary electrophoresis using replaceable linear polyacrylamide matrices. J Chromatogr A 652:57-66.

75. Petronilli, V., P. Costantini, L. Scorrano, R. Colonna, S. Passamonti, and P. Bernardi. (1994). The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. J Biol Chem 269:16638-42.

76. Poot, M., H. Teubert, P. S. Rabinovitch, and T. J. Kavanagh. (1995). De novo synthesis of glutathione is required for both entry into and progression through the cell cycle. J Cell Physiol 163:555-60.

77. Powis, G., J. R. Gasdaska, P. Y. Gasdaska, M. Berggren, D. L. Kirkpatrick, L. Engman, I. A. Cotgreave, M. Angulo, and A. Baker. (1997). Selenium and the thioredoxin redox system: effects on cell growth and death. Oncol Res 9:303-12.

78. Reed, J. C. (1997). Double identity for proteins of the Bcl-2 family. Nature 387:773-6.

79. Reynolds, J. E., and A. Eastman. (1996). Intracellular calcium stores are not required for Bcl-2-mediated protection from apoptosis. J Biol Chem 271:27739-43.

80. Sakurai, K., D. A. Stoyanovsky, Y. Fujimoto, and A. I. Cederbaum. (2000). Mitochondrial permeability transition induced by 1-hydroxyethyl radical. Free Radic Biol Med 28:273-80.

81. Sambrook, J. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3 ed, vol. 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

82. Schmitt, M., F. Saulnier, L. Malhautier, and G. Linden. (1993). Effect of temperature on the salt balance of milk studied by capillary ion electrophoresis. J Chromatogr 640:419-24.

83. Shimizu, S., M. Narita, and Y. Tsujimoto. (1999). Bcl-2 family proteins regulate the release of apoptogenic cytochrome c by the mitochondrial channel VDAC. Nature 399:483-7.

84. Slater, A. F., C. S. Nobel, and S. Orrenius. (1995). The role of intracellular oxidants in apoptosis. Biochim Biophys Acta 1271:59-62.

85. Staal, F. J., M. Roederer, and L. A. Herzenberg. (1990). Intracellular thiols regulate activation of nuclear factor kappa B and transcription of human immunodeficiency virus. Proc Natl Acad Sci U S A 87:9943-7.

86. Stryer, L. 1999. Biochemistry. W.H. Freeman and Company, New York.

77

87. Tanaka, S., K. Saito, and J. C. Reed. (1993). Structure-function analysis of the Bcl-2 oncoprotein. Addition of a heterologous transmembrane domain to portions of the Bcl-2 beta protein restores function as a regulator of cell survival. J Biol Chem 268:10920-6.

88. Thomas, P. S. (1980). Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose. Proc Natl Acad Sci U S A 77:5201-5.

89. Tsujimoto, Y., J. Cossman, E. Jaffe, and C. M. Croce. (1985). Involvement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma. Science 228:1440-3.

90. Tyurin, V. A., Y. Y. Tyurina, P. J. Quinn, N. F. Schor, R. Balachandran, B. W. Day, and V. E. Kagan. (1998). Glutamate-induced cytotoxicity in PC12 pheochromocytoma cells: role of oxidation of phospholipids, glutathione and protein sulfhydryls revealed by bcl-2 transfection. Brain Res Mol Brain Res 60:270-81.

91. Ueda, S., H. Masutani, H. Nakamura, T. Tanaka, M. Ueno, and J. Yodoi. (2002). Redox control of cell death. Antioxid Redox Signal 4:405-14.

92. Vander Heiden, M. G., and C. B. Thompson. (1999). Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis? Nat Cell Biol 1:E209-16

93. Vlachaki, M. T., and R. E. Meyn. (1998). ASTRO research fellowship: the role of BCL-2 and glutathione in an antioxidant pathway to prevent radiation-induced apoptosis. Int J Radiat Oncol Biol Phys 42:185-90.

94. Voehringer, D. W., D. L. Hirschberg, J. Xiao, Q. Lu, M. Roederer, C. B. Lock, L. A. Herzenberg, and L. Steinman. (2000). Gene microarray identification of redox and mitochondrial elements that control resistance or sensitivity to apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A 97:2680-5.

95. Voehringer, D. W., D. J. McConkey, T. J. McDonnell, S. Brisbay, and R. E. Meyn. (1998). Bcl-2 expression causes redistribution of glutathione to the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A 95:2956-60.

96. Voehringer, D. W., and R. E. Meyn. (2000). Redox aspects of Bcl-2 function. Antioxid Redox Signal 2:537-50.

97. Zago, E. B., R. F. Castilho, and A. E. Vercesi. (2000). The redox state of endogenous pyridine nucleotides can determine both the degree of mitochondrial oxidative stress and the solute selectivity of the permeability transition pore. FEBS Lett 478:29-33.

98. Zamzami, N., and G. Kroemer. (2001). The mitochondrion in apoptosis: how Pandora's box opens. Nat Rev Mol Cell Biol 2:67-71.

99. Zhong, L. T., T. Sarafian, D. J. Kane, A. C. Charles, S. P. Mah, R. H. Edwards, and D. E. Bredesen. (1993). Bcl-2 inhibits death of central neural cells induced by multiple agents. Proc Natl Acad Sci U S A 90:4533-7.

100. Zornig, M., G. Busch, R. Beneke, E. Gulbins, F. Lang, A. Ma, S. Korsmeyer, and T. Moroy. (1995). Survival and death of prelymphomatous B-cells from N-myc/bcl-2 double transgenic mice correlates with the regulation of intracellular Ca2+ fluxes. Oncogene 11:2165-74.

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Diese Dissertation wurde am Institut für Physiologische Chemie und dem Institut für

Zellbiologie der medizinischen Fakultät der Universität Essen erstellt.

Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. Dr. H. de Groot für die Bereitstellung des Themas, die

ständige Diskussionsbereitschaft und die wissenschaftliche Förderung.

Frau PD Dr. U. Rauen danke ich besonders für die exzellente wissenschaftliche

Betreuung und Förderung bei der Erstellung dieser Dissertation sowie ihre

unermüdliche Diskussionsbereitschaft.

Herrn Prof. Dr. Tarik Möröy, Herrn Dr. Thorsten Schmidt und Herrn Dr. Holger

Karsunky vom Institut für Zellbiologie danke ich für die Bereitstellung der Zelllinien,

die engagierte Unterstützung bei der Durchführung der molekularbiologischen

Untersuchungen sowie die kritischen Kommentare bei der Erstellung dieser

Dissertationsschrift.

Allen Mitgliedern des Institutes für Physiologische Chemie und des Institutes für

Zellbiologie danke ich für die gute Zusammenarbeit.