Arch. Mikrobiol. 84, 29--42 (1972) �9 by Springer-Verlag 1972

Mikrobielle Verwertung von Methanol I so l i e rung u n d Cha rak t e r i s i e rung der Here Candida boidinii

HER1VfANN SAtI?~I und FnITZ WAG.~I~

Gesellschaft fiir Molekularbiologische Forschung mbH, St5ckheim bei Braunsehweig

Eingegangen am 10. Februar 1972

Microbial Assimilat ion of Methanol Isolation and Characterization of the Yeast Candida boidinii

Summary. A yeast, Candida boidinii, isolated from soil, capable of growing on a medium containing methanol as the only carbon source is described. Biotin is required in very low concentration as a growth factor.

In a study on the effeet of the methanol concentration on the cell growth under favorable conditions, the cell yield was 2.3 g (dry weight) with 1 ~ (v/v) methanol and 8.3 g with 40/o methanol per 1000 ml of culture medium. However, ~he growth was inhibited by 5~ methanol. The strain assimilated carbohydrate and ethanol faster than methanol or lactate. The enzymes for the methanol metab- olism are probably constitutive.

Optimal conditions for rapid growth and high cell yield from methanol were found to be: 28~ NHI4+ as nitrogen source and pH 5.0.

Tile cell composition was as follows: 42.81 ~ C, 7.23 ~ H and 5.54~ N. Amino acids in the cells were analyzed by ~he amino acid autoanalyzer.

Zusammen/assung. Aus einer Bodenprobe wurde eine Hefe, Candida boidinii, isoliert, welehe auf Methanol als einziger C-Quelle waehsen kann. Als Waehstums- faktor ben6tigt dieser Hefestamm Biotin in sehr geringer Konzentration.

Unter giinstigen Kultnrbedingungen betrggt die Zellausbeute pro 1000 ml Kulturmedium 2,3 g Trockenmasse bei Zugabe yon 1~ (v/v) Methanol, und 8,3 g bei 4 ~ Methanol. Das Wachstum wird bei Zusatz yon 5 ~ Methanol zum Minimal- medium vollst~ndig gehemmt. Der Stamm verwertet Kohlenhydrate und Athanol schneller als Methanol oder Milchs~ure. Die Enzyme fiir den Methanol-Stoffwechsel scheinen jedoch konstitutiv zu sein.

Die optimalen Kulturbedingungen fiir kurze Generationszeiten und hohe Zell- ausbeuten auf Methanol sind: 28~ NI-I4+ als Stickstoffquelle und pH 5,0. Die Elementaranalyse ergab folgende Werte fiir die Zusammensetzung der Hefezellen: 42,81~ C, 7,23~ H nnd 5,540/o N. Die Aminos~uren (in den Zellen) warden mit dem Aminosaure-Analysator quantitativ bestimmt.

I n den le tz ten J ah ren wurden eine Reihe gram-negat iver Bakter ien besehrieben, die obligat oder f akn l t a t iv Methanol und/oder Methan als einzige Kohlenstoff- u n d Energie-Quelle verwer ten k6nnen (Peel u. Quayle, 1961; A n t o n y u. Za tman , 1964; W h i t t e n b u r y et al., 1970). Da- gegen gelang es erst k/irzlieh, eine Hefe, Kloeckera sp. Nr. 2201, zu iso-

30 H. Sahm und F. Wagner:

lieren, welehe auf Methanol als einziger C-Quelle waehsen konnte (Ogata et al., 1969; Ogata et al., 1970). Da es noch v611ig ungekl/~rt ist, auf wel- ehem Wege Methanol bei I te fen bzw. Pilzen assimiliert wird, ersehien es interessant , e inen Hefe-S tamm zu selektionieren, der sieh in e inem ein- faehen, definierten Medium mi t Methanol vermehren kann , u m d a n n an diesem Organismus den Methanol-Stoffweehsel un te rsuehen zu kSnnen.

Wi r ber iehten im folgenden fiber die Isol ierung u n d die Eigenschaften des Hefe-Stammes Candida boidinii, der Methanol als einzige C- und Energie-Quelle verwerten kann.

Material und Methoden

Nghrmedien

Folgende Medien wurden zur Isolierung und Kultivierung des Candida-Stammes verwendet:

a) Komplettmedium. 4 g Yeast Extract, 10 g Malzextrakt, 4 g Glucose, 1000 mI dest. tt20 auf pH 7,0 eingestellt. -- b) Minimalmedium (M2Vl). 1 g KH2P04, 2 g K2HP04, 2 g (NH4)eS04, 2 g NH4N03, 1 g Na2HP0 t • 2 H20, 0,2 g KCI, 0,2 g MgSO~ • 7 H20, 0,5 mg HsBO 8, 0,04 mg CuS04 • 5 H20, 0,i mg KJ, 0,2 Ing FeCl 3 • 6 tteO, 0,4 mg MnSOt • H20, 0,4 mg ZnS04 • 7 H20, 0,2 mg Ammonium- heptamolybdat, 1000 ml dest. I-Ice. Nach dem Autoklavieren, 20 min bei 121~ wurden, wenn nichts anderes angegebcn, 1 ~ (v/v) Methanol als C-Quelle zugcgeben.

S tamm-Isol ie rung

Die Bodenprobcn warden zuniichst in steriler Saline (9 g NAC1/1000 ml dest. HeO) suspendiert, davon wurden dann je 0,1 ml auf Petrisehalen ausgestrichen, die Minimalmedium mit l~ Methanol und 1 g/1 Yeast Extract enthielten. Naeh g Tagen Inkubation bei 30~ wurden die Einzelkolonien isoliert, und dutch Vcr- dtinnungsausstriche tiber 5 Passagen wurde versueht, Reinkulturen zu erhalten. Dutch Zugabe folgendcr Antibiotica einzeln und in Kombination zum Medium sollten spezifisch die Bakterien gehcmmt bzw. abgetStet werden: Penicillin G (120txg/ml), Streptomycin (20txg/ml), Terramycin (125~g/ml), PolymyxinB (5 [xg/ml) und Gentamycin (10 [xg/ml).

Der isolierte IIefestamm wurde veto Centraalbureau veer Sehimmelcultures, Delft, Holland, bestimmt.

Ku l tu rbed ingunge n

Siimtliche Submerskulturen wurden auf einer rotierenden Schtittelmaschine (100 U/rain) in 500 ml-Erlenmeyerkolben mit zwei seitliehen Einstiehen, die je 100 ml medium enthielten, geztichtet. Als Impfmaterial dienten 0,5 ml pro 100 ml Medium einer zweimal in stcriler Saline gewasehenen Hefekultur, welehe 16 Std in Komplettmedium angezogen worden war. Die Inkubationstemperatur betrug 30 ~ C. Das Wachstum wurde dureh Triibungsmessung nach vorherigem Verdtinnen mit dem Eppendorf-Photometcr bei ~ = 546 nm bestimmt.

Quan t i t a t ive Bes t immung des Methanols

Die Abnahme der Methanolkonzentration im Kulturmedium wurde gas- chromatographisch ermittelt. Der prozentuale Fehlcr betr~gt bei 3 Parallel- bestimmungen -4- 6~ .

Methanol-Verwermng durch Candida boidinii 31

Zell-Analysen

Die Elementaranalysen der Zelltroekenmassen wurden yore mikroanalytisehen Laboratorium Beller, G6ttingen, ausgefiihrt.

Zur Ermittlung der Aminos~ure-Zusammensetzung wurden die Hefezellen, die in Minimahnedium mit I % Methanol und 10 ~xg/1 Biotin geziiehtet wurden, ab- zentrifugiert und zweimM mit Saline gewasehen. AnsehlieBend wurden die Zellen gefriergetroeknet und einige Milligramm d~von mit 0,3 ml 6 n }IC1 im Vakmlm bei 106~ 24 SM hydrolysiert. Ansehliel]end wurden die Proben mit 1 n NaOI-I neutralisiert, mit Citratpuffer, pI-I2,2, auf 10 ml aufgefiillt und jeweils 1,0ml davon auf den AminosEure-AnMysator gegeben.

Ergebnisse

Isolierung des I Iefestammes Candida boidinii

Aus einer Bodenprobe vom i~heinufer bei Mannheim wurde durch Verdiinnungsausstriche auf Minimalmedium mit Methanol und 1 g/1 Yeast Ext rac t eine Here selektioniert, die sehr gut Methanol als einzige C- und Energie-Quelle verwerten konnte. Da jedoch trotz wiederholten Isolierens yon Einzclkolonien der Hefes tamm st/indig mit st/~bchenfSrmi- gen unbeweglichen Bakterien verunreinigt war, wurden dem Medium folgende bakteriostatisch bzw. bakterieid wirkende Antibiotiea einzeln und in Kombinat ion zugesetzt: Penicillin-G, Streptomycin und Terra- mycin. Es konnte jedoeh erst dureh die beiden bakterieid wirkenden Antibiotica Gentamyein und Polymyxin B eine Hefe-Reinkultur gewonnen werden.

Es scheint grunds/~tzlich Schwierigkeiten zu bereiten, yon Methan- bzw. Methanol-verwertenden Mikroorganismen Reinkulturen zu erhalten (Vary u. Johnson, 1967; Whit tenbm'y et al., 1970). Deshalb wurde vet- sucht, die physiologisehen Eigenschaften dieses st/~behenfSrmigen Bakteriums zu ermitteln. Durch Zugabe yon Amphoteriein, einem fungi- ziden Antibioticum, zum Minimalmedium, das Glucose ans ta t t Methanol als C-Quelle und 1 g/1 Yeast Ext rac t enthielt, gelang es relativ leieht, das Bakterium yon der Here abzutrennen und in Reinkultur zu erhalten. Wie die Untersuehungen zeigten, ist das Bakterium auxotroph ffir Methionin und gegen 4 ~ Methanol resistent, ohne jedoeh auf Methanol als einziger C-Quelle wachsen zu kSnnen. Da es jedoch in der Mischkultur mit der Here zusammen auch dann wuchs, wenn Methanol als cinzige C-Quelle und kein Methionin im Kul turmedium vorhanden war, scheint der Candida-Stamm in diesem Fall ffir das Bakterium verwertbare C-Sub- strate und Methionin zu liefern. Ferner konnte im Mikroskop beobachtet werden, dab sich die Bakterien zum Tell an die Hefezellen angeheftet haben. Wie im drit ten Abschnitt gezeigt wird, zieht die Here jedoch auch einen Nutzen aus der Anwesenheit des Bakteriums.

32 H. S~hm und F. Wagner:

Abb. 1 a u. b. Mikrophotographie der Itefe Candida boidinii nach 80 Std Wachstum in Minimalmedium mit 10 ~g/l Biotin bei pH 6,8 (a) und bei pH 2,5 (b)

Morphologie des t t e f e - S t a m m e s

Die Here, a]s Candida boidinii bes t immt , b i lde t keine Asko- oder Ar th rosporcn , sie v e r m e h r t sich durch mu] t i l a te ra le Knospung . Die Zellen s ind oval, zum Tell lgng]ich oval und haben im Durchschn i t t eine GrSBe yon 3 ,0- -4 ,5 • 6 ,0- -9 ,0 ~. t tguf ig werden die I tg l f t e his zwe iDr i t t c l

Methanol-u dutch Candida boldinii 33

des Zellvolumens yon einer oder 2 Vacuolen ausgefiillt (Abb. 1 a). Bei einem p H yon 2,0--2,5 bildet der Hefe-Stamm selbst in Sehfittelkulturen Pseudomycelien (Abb. 1 b).

Waehstumsfaktoren

Wi~hrend die Misehkultur, Here mit Bakterium, ein gutes Wachstum auf dem Minimalmedium mit 1 ~ Methanol zeigte, wuchs die Reinkultur des Candida-Stammes auf diesem Medium nicht mehr. Dureh Zugabe yon 1 g/1 Yeast Ex t rac t konnte jedoch erreicht werden, dab das Wachs- turn der Hefe-Reinkultur ~hnlich dem der Mischkultur war. Da das vitaminfreie Cascin-Hydrolysat diesen Effekt nicht zeigte, wurdcn eine Reihe yon Vitaminen einzeln auf ihre wachstumsfSrdernde Wirkung hin untersucht. Es zeigte sich, da~ der Candida boidinii Stature Biotin als Wachstumsfaktor benStigt (Tab. 1).

Wie aus der Abb. 2 zu ersehen ist, besteht eine direktc Proportionali- t~t zwisehen der Biotinkonzentration and der Zellzahl am Ende des Wachstums bei einem Biotingehalt zwischen 0,01 und 1 ~g/1. In den folgenden Versuehen wurden deshalb dem Minimalmedium noch jewefls 10 ~g/1 Biotin zugesetzt.

Die Biotinauxotrophie ist unabh~ngig yon der C-QueUe im Kultur- medium, sie wurde auch dann beobachtet, wean ans ta t t Methanol Glucose, Milchs~ure oder ~ thanol verwendet wurde. I n der Mischkultur bekam die Here anscheinend das erforderliehe Biotin yore Bakterium,

Tabelle 1. Wachstum yon Candida boidinii au] Minimalmedium bei Zugabe yon Yeast Extract, Casein-Hydrolysat oder einzelner Waehstums/aktoren

Zus~tze Endkonzentration Wachstum nach der Zus~tze 4. Tagen im Medium Inkubation (g/l) (Ext.)

- - - - 0,15 Yeast Extract 1 10,8 Casein-]~ydrolysat 1 1,2 Thiamin 10 -2 0,25 Riboflavin 10 -2 0,30 Pyridoxal-HC1 10 -2 0,70 Cobalamin 10 -8 0,15 p-Aminobenzoes~ure 10 -2 0,20 Fols~ure 10 -3 0,55 Lipons~ure 10 -2 0,15 Ca-pantothenat 10 -3 0,35 Inosit 10 -2 0,25 Biotin 10 -6 8,5

3 Arch. Mikrobiol., Bd. 84

34 H. Sahm und F. Wagner:

0,7

O,6 0,5

0,4

03 . q2 0,1

/ _..-o

o, bl (il i lb 10o

Ext

(X.lC

3,o 2,8 2,6 2,4 2,2. 2,0. 1,8.

1,6.

1,4.

1,2

1,0 .

o,8. 0,6. 0,4. 0,2.

Biotin 0 (~g/I o

5

4

3

2

1

6 2 3 4 5 6 7

Abb. 2 Abb. 3 Abb. 2. Abh~ngigkeit des Wachstums yon Candida boidinii yon der Biotinkonzen-

tration im ~inimalmedium nach 4 Tagen Inkubation Abb. 3. Der Einflul3 verschiedener Methanolkonzentrationen auf das Wachs~um yon Candida boidinii. Vor dem Animpfen warden dem Kul~urmedium folgende Methanol-

mengen zugesetzt: 1 0,5~ 2 1%; 3 2~ 4 3~ 5 40]0; 6 5%

t ('[age)

somit konnten die beiden Mikroorganismen nut zusammen im Minimal- medium ohne Biotin und Methionin waehsen.

Methanolverwertung

Bei Zugabe verschiedener Methanolkonzentrationen zum MLnimal- medium zeigte sich, dab dieser Hefe-Stamm sehr unempfindlich gegen- fiber hohem Methanolgehalt ist. W~hrend bei einer Reihe yon Methanol- assimilierenden Bakterien bereits 0,01~ Methanol toxiseh wirken (Whit tenbury et al., 1970), ffihren bei der Candida erst 50/0 zu einer Waehstumshemmung. Wie Abb. 3 zeigt, werden mit steigender Methanol- konzentration im Kul turmedium die lag-Phasen und die Ubergangs- phasen yon den exponentiellen zu den station~ren Wachstumsphasen l~nger, ohne dab sich die Generationszeiten wesentlleh ver~ndern. Ein mSglieher Grund fiir die Verl~ngerung der ]~bergangsphasen kSnnte eine schlechtere Belfiftung mit zunehmender Zelldichte sein.

Die optische Dichte bzw. die Zelltrockenmasse ist am Anfang der station~ren Wachstumsphase linear proportional zur Methanolkonzen- t rat ion im Kul turmedium (Abb.4). Daraus ist zu ersehen, dal~ das Methanol in diesen Konzentrationsbereichen den wachstumsbegrenzen- den Faktor darstellt, was auch experimentell best~$igt werden konnte.

Methanol-Verwertung dutch Candida boidinii

Tabelle 2. Abnahme der Methanolkonzentration im unbeim'T/ten Kulturmedium dutch Verdunstung

35

Ausgangs -Methanolgehalt Methanolkonzentration nach 5 Tagen Inkub~tion bei 30 ~ C

(~ (~

0,5 0,45 1,0 0,95 2,0 1,90 3,0 3,0 5,0 4,85 7,0 6,80

Sobald n~mlich das Waehstum der Kultur in die stationi~re Phase fiber- ging, konnte gaschromatographiseh kein Methanol im Medium mehr nachgewiesen werden. Da bei der Inkubation kein oder nur sehr wenig Methanol dutch Verdunsten verlorengeht, wie aus der Tab. 2 zu ersehen ist, stellen die Kurven in Abb.5 die tatss Methanolverwertung durch die Here Candida boidinii dar.

Optimale Wachstumsbedingungen

Der Hefe-Stamm wi~ehst innerhalb eines groBen pH-Bereichs, n~mlich yon 2,5 bis 8,0, wobei das Optimum bei 5,0 liegt. W~hrend des Wachstums der Kul tur ~ndert sieh der pH im Minimalmedium nur sehr geringffigig, wenn der pH-Wert zu Beginn der Inkubation 6,8 betrug (Abb. 6). Bei einem Anfangs-pH von 4,8 erfolgte jedoch eine betriiehtliche Abnahme des pH-Wertes, welche vermntlich darauf zurfickzuffihren ist, dab in diesem Fall bevorzugt NH4+-Ionen verwertet werden, wKhrend die NOa--Ionen und SOa---Ionen im Medium weitgehend verbleiben. Wie stark der pH dadurch absinken kann, zeigt die Kurve 2 in Abb. 6; bei diesem Versuch war die einzige N-Quelle im Minimalmedium (NH4)~SO a. Aus diesen Versuehsergebnissen ist zu sehlieBen, dai~ die Here selbst keine Siiuren ins Medium ausscheidet und dal~ sie bei p t t 6,8 als N-Quelle sowohl NH4+ als auch NO a- verwertet, wi~hrend bei pH 4,8 bevorzugt NH~ + assimiliert wird.

Das Wachstum ist unabh~ngig davon, ob (NH4)2SO a oder NH4NO a als einzige N-Quelle im Kulturmedium vorhanden ist, dagegen ist bei der Zugabe yon NaNOa als N-Quelle das Wachstum etwas verzSgert und geringer, wie aus Abb.7 zu ersehen ist. W~hrend NaNO 2 kein nennenswertes Wachstum erlaubt, ist bei Harnstoff als N-Quelle die Generationszeit wesentlich grSi~er als bei (NHa)2SO 4. Das beste Waehstum wurde mit Glutamins~ure erreieht, dies kann jedoeh zum groBen Teil

3*

1,5

1

0,5

0

P H

7 .

0 Methanol

36

I0

8

Abb. 4

H. Sahm und F. Wagner:

Abb. 5

M e t h a n o l

(o/o)~

=

5

4

3

2 o

1

1 2 3 4 5 6 7 t

(Tage)

Abb.4. Abh~ngigkeit der optisehen Diehte bzw. der Zelltrockenmasse (Tg) yon der Metl~nolkonzentrafion im Kulturmedium naek 4 Tagen Inkubation

Abb.5. Abnahme der N[ethanolkonzentration im Kulturmedium yon Candlda boidlnii w~hrend der Inkubation. Vor dem Animpfen zugegebene hlethanolmengen:

10,5% ; 21% ; 32% ; 43% ; 5 4 %

Ext (x.to)

1

1,5

1,4 :

1,3.

1,2.

1,1 1,0

O,9 0,8 0,7

o,6 0,5.

o,4 o2 o2 o,i

O. , . t ~ (1"age)

6

3

5

t

Ext (x.lO),

3.5

3.

2,5,

2.

3 .4 3. s {Tam) Abb. 6 Abb. 7

Abb. 6. ~_nderung des pH-Wertes im Kulturmedium wiihrend des Waehstums yon Candida boidinii. 1 Y[inimalmedium mit Ausgangs-pH 6,8; 2 Minimalmedium mit 2,5 g/1 (NH4)~SO 4 als einzige N-Quelle und Ausgangs-pH 6,8; 3 Minimalmedium

mit Ausgangs-pH 4,8 Abb.7. Wachstum yon Candida boidinii auf Minimalmedium mit verschiedenen ~-Quellen; die N-Konzentration betrug im Medium jeweils 0,5 g BT pro Liter. 1 Minimalmedium; 2NH4NO3oder (NH4)~S04; 3NAN03; 4NAN02; 5 Harnstoff;

6 Glutaminsi~ure

~ethanol-Verwertung dureh Candida boidlnii

Tabelle 3. Wachstum yon Candida boidinii au] verschiedenen C-Quellen im Minimalmedium mit 10 #g/l Biotin

37

Zugesetzte C-Quellen Extinktion (Konz. 10 g/l) naeh 5 Tagen

Inkubation

Zugesetzte C-Quellen Extinktion (Konz. 10 g/l) nach 5 Tagen

Inkubation

Methan 0,I Saecharose 0,2 Methanol 8,1 Xylose 9,5 Athanol 14,5 Propanol-1 0,3 Acetat 7,5 Propanol-2 0,2 Citrat 0,1 Butanol-1 0,1 Formiat 0,2

LaeC~t 9,8 Glycerin 3,0 Malat 10,1 Mannit 11,0 Pyruva~ 7,8 Palmitins~ure 0,1 Succinat 11,5

MaisS1 2,9 L-Alanin 0,2 Fructose 6,8 L-Aspartat 0,3 Galaktose 0,1 L-Glutamat 7,0 Glucose 9,0 Glycin 0,1 Maltose 0,2 Mannose 7,1 L-Serin 0,1

d~rauf beruhen, dal~ diese Aminos~ure gleiehzeitig Ms C-Quelle verwertet werden kann (Tab. 3). Candida boidinii zeigt folglich das beste Wachstum auf Amino- oder Ammoninm-Stiekstoff.

Das Temperatur-Optimum dieses Hefestammes liegt bei 28~ inner- halb des Temperaturbereiehs zwisehen 20 ~ und 37~ ist Wachstum mSglich.

Verwertbarkeit weiterer C-Quellen

Die Methan- und Methanol-assimflierenden Bakterien lassen sieh h~ zwei Gruppen einteflen. Die Sti~mme der ersten Gruppe benStigen zum Waehstum Methan oder Methanol, sie kSnnen Kohlenhydrate oder organisehe Ss nieht als einzige C-Quelle verwerten (Dworkin u. Foster, 1956; Whit tenbury et al., 1970). Die zweite Gruppe umfal~t Bakterien, die fakultativ Methan und/oder Methanol umsetzen kSnnen, die jedoeh auch auf anderen C-Quellen waehsen kSnnen (Peel u. Quayle, 1961 ; Ribbons et M., 1970). Da sieh diese beiden Gruppen ferner grund- s~tzlieh darin unterseheiden, wie die C1-Substrate assimiliert werden, war es von gro[]em Interesse zu sehen, ob die t tefe neben Methanol noeh weitere C-Quellen verwerten kann. Wie aus den Ergebnissen in Tab. 3 zu ersehen ist, kann die Hefe auBer auf Methanol aueh sehr gut auf ~thanol waehsen, w&hrend die l~ngerkettigen primi~ren Alkohole nieht verwertet werden kSnnen. Dies ist deswegen fiberrasehend, da fiir die

38 H. Sahm und F. Wagner:

Methanol-Dehydrogenase aus Bakterien nachgewiesen werden konnte, dab dieses Enzym prim/~re Alkohole bis zu einer Kettenl/inge yon Cll umsetzen kann (Anthony u. Zatman, 1965). Die Hefe zeigt ferner ein sehr gutes Waehstum auf einigen Monosacchariden, einigen organisehen S/~uren mid auf Glutamat. Dagegen erfolgte kein Waehstum bei Zugabe yon Formaldehyd als C-Quelle zum Minimalmedium und zwar auch dann nicht, wena wegen der groBen Toxicit/~t nur 0,1 ~ oder 0,01 ~ zugesetzt wurden. Dies ist sehr erstaunlich, da allgemein angenommen wird, dab bei der Methanolverwertung der Alkohol zun~ehst zum Aldehyd oxidiert und dieser dann metabolisiert wird; entsprechende Beobachtungen maehten Peel u. Quayle (1961) und Anthony u. Zatman (1964) bei 2 Methanol-assimilierenden Bakterien-St/immen. Vielleicht kann der Formaldehyd nur bei der Oxidation yon Methanol an die iibertragende Gruppe, die Tetrahydrofols/~ure, gebunden werden.

Die Dauer der lag-Phasen ist bei den einzelnen C-Quellen sehr unter- schiedlich (Abb. 8); sie ist fin Hefe-Komplettmedium oder im Minimal- medium mit Glucose oder Athanol sehr kurz. Bei der Zugabe von Milch- s/~ure oder Methanol als C-Quelle zum Medium betr~gt die Dauer der lag-Phase 16 bzw. 24 Std, bei Glycerin sogar 3--4 Tage. Die groBen Unterschiede zwischen dem Waehstum auf Methanol und Xthanol siad interessant, da bei einem Methanol-assimflierenden Bakterium naeh- gewiesen werden konute, dab das Athanol zum Tell mit den gleiehen Enzymen umgesetzt wird wie das Methanol (Anthony et al., 1971). Ferner variiert mit der C-Quelle im Medium die Generationszeit der Hefe, sie betr/~gt bei Glucose 2,5 Std, bei ~thanol, Methanol un4 Milch- s~ure jewefls 3 Std trod bei Glycerin 8 Std.

Da bei einem Methanol-verwertenden Bakterium naehgewiesen werden konnte, da$ die Enzyme des Methanol-Stoffwechsels dttrch das

Tabelle 4. Wachstum yon Candida boidinii au] Minimalmedium mit Glucose oder Methanol als einziger C-Quelle, wobei die Anzuvht des Imp/materials

au] verschiedenen Medien er/olgte

Medium der Vorkultur

Extinktion der Hauptkultur in Minimalmedium mit Glucose oder Methanol Ms C-Quelle

nach24 Std nach 48 Std nach 72 Std

Glucose Methanol Glucose Methanol Glucose Methanol

Komplettmedium 9,8 Minimalmedium

+ 1 g/1YE -t- 1 o/o Methanol 9,9

Minimalmedium A- 1 ~ Methanol 9,8

0,3 9,7 5,3 9,5 8,6

0,4 9,7 5,0 9,6 8,7

0,3 9,8 4,8 9,6 8,5

~ethanol-Verwerttmg durch Candida boidinii 39

Ext

(x'lC 1 1,5 1,4 3

, _ �9 o ~ 1,1 ~ ~

O,2 0

2 ~} 4.. ,5 ('rage) 0

Abb. 8 Abb. 9 Abb.8. Waehstum yon Candida boidinii in ~inim~lmcdium mit versehiedenen C-Quellen (Anfangs-pH 4,8). 1 Komplettmedium; 2 l0 g/1 Glucose; 3 i ~ Athanol;

4 10 g/l Milchs~ure; 5 1~ Methanol; 6 10 g/1 Glycerin Abb.9. AbhS~ngigkeit der lag-Phasen-Dauer yon den Kulturbedingungen beim Wachstum yon Candida boidinii auf Minimalmedium mit 1 ~ Methanol. 1 Zusatz yon 1 g/l Yeast Extract Anfangs-pH 4,8; 2 Anfangs-pH4,8; 3 vierfaehe Impf-

menge Anfangs-pH 4,8; g Anf~ngs-pH 6,8

Substrat induziert werden (Harder u. Quayle, 1971), wttrde vermutet, dab der Grund far die lange lag-Phase der Here auf Minimalmedium mit Methanol als C-Quelle in einer fiir den Methanol-Abbau nStigen Enzyminduktion liegt. Doch wie aus Tab. 4 zu ersehen ist, ist die Ls der lag-Phase unabh~ngig yon der in der Vorkultur enthaltenen C-Quelle.

Es konnte jedoch gezeigr werden, dal3 dutch Ver&ndermlgen des pH- Wertes im Minimalmedium oder dureh Zugabe yon 1 g/1 Yeast Extrac t die Dauer der lag-Phase stark beeinflul3t werden kalm (Abb.9). Diese Versuehsergebrdsse deuten darauf hin, dal~ in diesem Candida-Stamm die Enzyme fiir die Methanol-Verwertung konstitutiv gebildet werden und dab dutch weitere Optimalisierung der Kulturbedingungen die lag- Phase beim Wachstum auf Methanol weitgehend reduziert werden kann.

Analysen der Zelltrockenmasse

Die relativ hohe Zellausbeute yon Candida boidinii bei der Methanol- Verwertung l~tl~t diese Hefe fiir eine Proteingewinnung interessant erseheinen, deshalb wurden die Zell- und Aminos~urezusammensetzung ermittelt. Eine Elementaranalyse der gut gewachsenen Zelltroekenmasse lieferte folgende Ergebnisse : 42,81 ~ Kohlenstoff, 7,23 ~ Wasserstoff

40 It. Sahm und F. Wagner:

Tabelle 5. Aminosdure-Zusammensetzung der ZeUtrockenmasse yon Candida boidinii

Aminos~uren in g in ~ in g pro lOO g pro 100% pro tOO g Zelltrockenmasse Rohprotein Aminos~uren

AsparaginsKure 3,25 9,45 12,95 Threonin 1,52 4,42 6,05 Serin 1,39 4,03 5,53 Glutaminsgure 3,62 10,45 14,35 Prolin 0,91 2,64 3,61 Glyein 1,28 3,71 5,09 Alanin 1,42 4,12 5,65 Valin 1,58 4,59 6,30 Methionin 0,30 0,86 1,19 Isoleuein 1,37 3,98 5,45 Leucin 1,86 5,39 7,40 Tyrosin 0,85 2,46 3,38 Phenylalanin 1,17 3,39 4,65 ttistidin 0,63 1,85 2,51 Lysin 2,07 6,01 8,24 Arginin 1,95 5,65 7,75

und 5,540/0 Stiekstoff. Bei der Aminos/~ure-Analyse sind die hohen Antefle von Asparagin- und Glutamins/~ure anffallend, naeh Rose u. Harrison (1969) enthalten die Zellwandproteine der Helen diese beiden Aminos/~uren in gr613eren Mengen. Wie bei den Methan-verwertenden Bakterien ist ferner ein relativ hoher Prozentsatz Lysin, aber sehr wenig Methionin in den Candida-Zellen enthalten (Whittenbury, 1969). Insge- saint gesehen ist die Aminos/~ure-Zusammensetzung dieser Hefe sehr /~hnlich der der Futterhefe, Candida tropicalis (ATCC 1369) (Okanishi u. Gregory, 1970).

Diskussion

Es wurde wiederholt fiber groBe Sehwierigkeiten beriehtet, aus Boden- oder Wasserproben Reinkulturen yon Methan- oder Me~hanol-verwerten- den Mikroorganismen zu isolieren (Vary u. Johnson, 1967; Whittenbury, 1969 ; Iqaguib u. Overbeck, 1970). H/~ufig erh/~lt man mit den fibliehen Iso- lierungsmethoden eine Misehkultur aus 2 oder 3 versehiedenen St/~mmen. In dieser Arbeit konnte geze~gt werden, dab in soleh einer Mischkultur das Verh/iltnis dieser verschiedenen Milcroorganismen eher symbiontiseh als kommensal ist. Da die Here und das Bakterium, ffir einen voneinander versehiedenen Metaboliten auxotroph sind, k6nnen sie sieh gegenseitig in den ben6~igten Waehstumsfaktoren erg/~nzen and somit aueh darm waehsen, worm keiner dieser Faktoren im Medium vorhanden ist. Ferner hat die Mischkultur den grol~en Selektionsvortefl, da$ sie eine gr6$ere Vielzahl versehiedener C-Quellen verwerten kann; so kann sie auf Metha- nol waehsen, nieht dagegen das Bakterinm alleine.

Methanol-Verwer~ung duroh Gandida boldinii 41

Die in dieser Arbeit beschriebene Methanol-assimilierende Here, Candida boidinii, hat gewisse Eigensehaften mit der yon 0gata et al. (1969) isolierten, ebenfalls auf Methanol waehsenden Hefe, Kloeckera sp. 2201, gemeinsam. So kSnnen beide St~mme Nitrat als einzige N-Quelle verwerten oder auf ~thanol, Glucose, Fructose, Xylose, Glycerin und Mannit als einziger C-Quelle wachsen. Jedoch zeigt der Kloeckera- Stature im Gegensatz zur Candida keine nennenswerte lag-Phase beim Wachstum auf Methanol, dagegen kann diese Hefe weniger gut auf Kohlenhydraten oder organisehen S~uren waehsen. Ferner benStigt Kloeckera als Wachstumsfaktor nieht Biotin, sondern Thiamin. Die Biotin-Auxotrophie bei Candida boidinii steht vermutlich nieht im Zusammenhang mit der Methanolverwertung, da aueh bei anderen C-Quellen Biotin als Wachstumsfaktor benStigt wird. Auch Anthony u. Zatman (1965) konnten keinen direkten Einitul~ des Biotins auf die Methanol-Dehydrogenase aus einem Bakterium feststellen. Andererseits ist jedoch von einem anderen Methanol-asslmillerenden biotinauxotro- phen Bakterium bekarmt, dal~ es mehr yon diesem Vitamin zum gleiehen Wachstum benStigt, wenn Methanol anstat t Succinat als C-Quelle client (Kaneda u. Roxburgh, 1959). Da bei der Gruppe der fakultativ Methan- bzw. Methanol-verwertenden Bakterien Carboxylierungsreaktionen eine sehr wiehtige Rolle spielen -- wobei das Biotin als prosthetische Gruppe fungiert -- , ist es denkbar, dab beim Wachstum auf Methanol mehr davon nStig ist; entspreehendes kSnnte ffir den Candida-Stamm zu- treffen.

Uber den Methanol-Stoffweehsel gibt es bisher nur bci einigen Bakte- rien detailiertere Untersuchungen. Grunds~tzlieh wird das Methan oder Methanol zuns zum Formaldehyd oxidiert, der darm fiber den Serin- oder Allulose-6-phosphat-Weg assimfliert wird (Large et al., 1962; Kemp u. Quayle, 1967; Lawrence et al., 1970). Da der Allulose-6- phosphat-Weg bisher nut bei den obligaten Methan- und Methanol-oxi- dierenden Bakterien beobachtet wurde (Lawrence u. Quayle, 1970), ist anzunehmen, dab Candida boidinii das Methanol fiber den Serin-Weg assimfllert, falls Eukaryonten nicht andere Wege der C1-Fixierung besitzen, was bei weiteren Untersuehungen festgestellt werden sell.

Frau Dr. R. M. Kula d~nke ieh sehr fiir die Aminos~ure-Analyse, Herrn Dr. Strijewski fiir die gaschromatographische ~ethanolbestimmung, Fraulein NI. Paezold und Fraulein M. Krfigener fiir ihre sorgf~Itige Mitarbeit.

Die diesem Bericht zugrundeliegenden Arbeiten werden mit Mitteln des BMBW im l~ahmen des Technologieprogramms gefSrdert.

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Prof. Dr. F. Wagner Dr. H. Sahm Gesellschaft ffir Molekularbiologische Forschung D-3301 StSekheim fiber Braunschweig Maseheroder Weg 1 Deutschland