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Steve K. Alexander / Dennis Strete

Mikrobiologisches Grundpraktikum:

Ein Farbatlas

Deutsche Bearbeitung von Erika Kothe

Aus dem Amerikanischen von Hans W. Kothe und Erika Kothe

3Färbetechniken für Bakterien

Anwendung im Labor: Vorbereitung der Zellen für die Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . 36Ziel .und .Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36Tipps .für .die .Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36Zu .erwartende .Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

Darstellung morphologischer Merkmale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

Anwendung im Labor: Einfachfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37Ziel .und .Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37Tipps .für .die .Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37Zu .erwartende .Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

Anwendung im Labor: Negativkontrastierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38Ziel .und .Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38Tipps .für .die .Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38Zu .erwartende .Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

Differenzierende Färbungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

Anwendung im Labor: Gram-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39Ziel .und .Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39Tipps .für .die .Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40Zu .erwartende .Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

Anwendung im Labor: Säurefestigkeitsfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44Ziel .und .Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44Tipps .für .die .Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45Zu .erwartende .Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

Färbung von Zellstrukturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

Anwendung im Labor: Kapselfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46Ziel .und .Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46Tipps .für .die .Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46Zu .erwartende .Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

Anwendung im Labor: Endosporenfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47Ziel .und .Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47Tipps .für .die .Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48Zu .erwartende .Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

Anwendung im Labor: Geißelfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49Ziel .und .Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49Tipps .für .die .Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49Zu .erwartende .Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

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3 Färbetechniken FÜr bakterien

36

Anwendung im Labor: Vorbereitung der Zellen für die Färbung

Zu erwartende Resultate

Nach .der .Färbung .ähnelt .ein .gutes .Ausstrichpräparat .der .Aufnahme .aus .EAbb. 3.1 . .Da .die .die .Dichte .der .Zellen .am .Rande .normalerweise .etwas .geringer .ist, .beginnt .man .mit .der .mikroskopischen .Untersuchung .am .besten .in .der .Mitte .und .fährt .von .dort .nach .außen, .bis .man .eine .Stelle .gefun­den .hat, .wo .die .Zellen .nicht .mehr .übereinander .liegen .

Werden .Bakterien .vor .der .mikroskopischen .Untersuchung .angefärbt, .erkennt .man .ihre .typischen .Merkmale .zumeist .sehr .viel .besser, .etwa .die .genaue .Größe, .die .Form .und .die .Anordnung .der .Zellen, .aber .oft .auch .bestimmte .chemische .Eigenschaften . oder . andere . Besonderheiten . des . unter­suchten .Bakteriums . .Dadurch .ist .es .dann .in .vielen .Fällen .

sehr .viel .leichter, .die .entsprechenden .Mikroorganismen .zu .bestimmen . .In .diesem .Kapitel .sollen .die .wichtigsten .Fär­bemethoden .für .Bakterien .vorgestellt .werden, .die .man .in .mikrobiologischen .Labors .routinemäßig .zur .Untersuchung .von .Bakterien .verwendet .

Abb. 3.1 Ein hitzfixierter und mit Kristallviolett gefärbter Bakterien­ausstrich auf einem Objektträger. Die Mitte solcher Präparate ist für die Untersuchung zumeist ungeeignet, weil die Zellen dort zu dicht liegen, so dass man sich am besten eine Stelle in den äußeren Berei­chen heraussucht.

Ziel und Vorgehensweise

Sowohl .aus .der .Natur .isolierte .Bakterien .als .auch .bakte­rielle .Krankheitserreger .aus .der .klinischen .Praxis .werden .normalerweise .auf .Agar-Nährböden .oder .auch .in .Flüssig-medien .kultiviert .(siehe .Kapitel .4) . .Um .diese .Organismen .anfärben .zu .können, .muss .man .zunächst .Ausstrichpräpa-rate .anfertigen, .das .heißt, .man .überträgt .Teile .der .Kultur .mit . einer . sterilen . Impföse . auf . einen . Objektträger . . Dazu .müssen .Zellen, .die .von .festen .Nährböden .stammen, .sorg­fältig .in .einen .kleinen .Wassertropfen .auf .dem .Objektträger .gemischt .werden, .bis .die .Flüssigkeit .eine .leicht .milchige .Farbe .angenommen .hat, .während .man .aus .einer .hoch .ge­wachsenen .Flüssigkultur .einfach .einen .Tropfen .Flüssigkeit .entnimmt .und .diesen .auf .den .Objektträger .überführt . .An­schließend .lässt .man .die .Flüssigkeit .an .der .Luft .eintrock­nen .und .zieht .den .Objektträger .dann .mehrmals .durch .die .Flamme .eines .Bunsenbrenners, .um .die .Zellen .fest .auf .dem .Glas .zu .fixieren .(Hitzefixierung) .

Tipps für die Praxis

. . Bringen .Sie .die .Flüssigkeitstropfen .in .der .Mitte .des .Objektträgers .auf, .damit .Sie .die .Objekte .beim .Färben .und .bei .der .mikroskopischen .Untersuchung .leichter .finden .

. . Achten .Sie .darauf, .dass .die .Objekte .auf .einen .kleinen .Bereich . beschränkt . bleiben, . damit . das . Färbemittel .auch .alle .Zellen .erreicht . .

. . Versuchen .Sie .ein .Zusammenklumpen .der .Zellen .zu .vermeiden, .weil .das .Färbemittel .die .Bakterien .im .In­neren .eines .solchen .Haufens .zumeist .nicht .erreicht .

Darstellung morphologischer Merkmale

Darstellung morphologischer Merkmale

Um .morphologische .Merkmale .von .Bakterien .darzustellen, .werden . entweder . die . Zellen . oder . auch . der . Hintergrund .des .Präparates .gefärbt, .weil .man .dadurch .normalerweise .genauere .Informationen .über .Zellgröße .oder .Form .und .An­ordnung .der .Objekte .erhält . .Grundsätzlich .lassen .sich .die .verwendeten . Farbstoffe . in . zwei . Gruppen . unterteilen: . In .basische, .positiv .geladene .und .saure, .negativ .geladene .Fär­bemittel . .Der .Unterschied .besteht .darin, .dass .sich .basische .Farbstoffe .an .negativ .geladene, .also .basophile .(saure) .Kom­ponenten . des . Untersuchungsobjektes . anlagern, . während .

es .bei .sauren .Farbstoffen .die .positiv .geladenen, .also .azi­dophilen . (basischen) . Komponenten . sind . . Daher . gilt . bei .Bakterienfärbungen: .basische .Farbstoffe .färben .die .negativ .geladene .Bakterienzellwand, .während .saure, .negativ .gela­dene .Färbemittel .abgestoßen .werden . .Dadurch .nehmen .die .Zellen . im .erstgenannten .Fall .die .Farbe .des .Färbemittels .an, .während .im .zweiten .Fall .nur .die .Umgebung .der .Zel­le .gefärbt .wird, .was .allerdings .die .Umrisse .der .Bakterien .deutlicher .hervortreten . lässt . (Negativfärbung) . .Typische, .basische .Farbstoffe .sind .Kristallviolett, .Methylenblau .und .Safranin; .zu .den .sauren .Farbstoffen .gehören .Kongorot, .Ni­grosin .und .Eosin .

Anwendung im Labor: Einfachfärbung

Ziel und Vorgehensweise

Im .einfachsten .Fall .werden .Bakterien .mit .nur .einem .Farb­stoff .gefärbt, .um .Größe, .Form .und .Anordnung .der .Zellen .besser .erkennen .zu .können . .Das .Färbemittel .wird .auf .das .hitzefixierte .Präparat .getropft .und .anschließend .mit .Was­ser .wieder .abgespült . .Nach .dem .Trocknen .kann .das .Präpa­rat .dann .im .Mikroskop .untersucht .werden .

Tipps für die Praxis

. . Achten . Sie . darauf, . dass . das . Färbemittel . über . den .gesamten .Ausstrich .verteilt .ist .

. . Drücken . Sie . beim . Spülen . des . Präparats . mit . der .Spritzflasche .nicht .zu .stark, .damit .die .Objekte .nicht .abgewaschen .werden .

. . Spülen .Sie .das .Präparat .so .lange, .bis .sich .keine .Farb­wolken .mehr .lösen .

. . Wischen .Sie .das .Präparat .keinesfalls .ab, .sondern .las­sen .Sie .es .an .der .Luft .trocknen .

Zu erwartende Resultate

Die .EAbb. 3.2 bis 3.4 .zeigen .Bakterien, .die .mit .Kristallviolett .oder .Methylenblau .gefärbt .wurden . .Da .die .Zellen .die .Farbe .des .jeweiligen .Färbmittels .angenommen .haben, .sind .Grö­ße, .Form .und .Anordnung .besser .zu .erkennen .

Abb. 3.2 Mit Kristallviolett gefärbte, kugelförmige Zellen von Sta­phylococcus aureus (x 2.500).

Abb. 3.3 Mit Methylenblau gefärbte, stäbchenförmige Zellen von Escherichia coli (x 2.500).

37

3 Färbetechniken FÜr bakterien

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Anwendung im Labor: Negativkontrastierung

Ziel und Vorgehensweise

Bestimmte . Bakterien, . etwa . Spirillen . oder . Spirochäten, .lassen . sich . mit . basischen . Farbstoffen . nur . sehr . schlecht .anfärben, .so .dass .man .bei .ihnen .normalerweise .eine .Nega­tivfärbung .mit .sauren .Farbstoffen .durchführt . .Dabei .nimmt .die .Umgebung .der .Zellen .die .Farbe .des .Färbemittels .an, .mit .dem .Ergebnis, .dass .die .Größe, .Form .und .Anordnung .der . Bakterien . deutlicher . hervortritt . . Die . Negativkontras­tierungen .haben .aber .noch .einen .weiteren .Vorteil: .Da .bei .ihnen .keine .Hitzefixierung .notwenig .ist .und .zudem .keine .Färbung .der .Zellen .selbst .erfolgt, .ist .die .Veränderung .der .Bakterien .durch .äußere .Einflüsse .deutlich .geringer, .so .dass .sich . die . Form . und . Größe . der . Untersuchungsobjekte . zu­meist .sehr .viel .genauer .bestimmen .lässt . .

Zur .Präparation .werden .die .Bakterien .in .einen .Tropfen .Nigrosin . (oder .eine .andere .saure .Färbelösung) .auf .einen .Objektträger . überführt . . Anschließend . streicht . man . den .Tropfen .mit .einem .zweiten .Objektträger .zu .einem .dünnen .Film .aus .und .lässt .das .Präparat .an .der .Luft .trocknen . .Da­nach .kann .die .mikroskopische .Untersuchung .dann .durch­geführt .werden .

StäbchenKokken

Abb. 3.4 Mit Methylenblau gefärbte Mischkultur von kugelförmigen Staphylococcus aureus­ und stäbchenförmigen Escherichia coli­Zellen (x 2.500).

Tipps für die Praxis

. . Verwenden .Sie .unbedingt .sehr .saubere, .fettfreie .Ob­jektträger . .

. . Überführen .Sie .die .Bakterien .in .einen .möglichst .klei­nen .Tropfen .Nigrosin .

. . Setzen . Sie . die . Kante . des . zweiten . Objektträgers . an .den . Rand . des . Tropfens, . damit . die . Flüssigkeit . sich .kapillar . am . Glas . verteilt, . und . ziehen . sie . ihn . dann .über .den .unteren .Objektträger . .Durch .Schieben .wird .eine .schlechte .Verteilung .erzielt .

. . Führen .Sie .keine .Hitzefixierung .durch, .sondern .las­sen .Sie .das .Präparat . vollständig . an .der .Luft . trock­nen .

Zu erwartende Resultate

Nach . einer . Negativfärbung . erscheint . die . Umgebung . der .Zellen .farbig, .während .die .Zellen .selbst .ungefärbt .bleiben . .Das .Resultat .einer .solchen .Färbung .zeigt .EAbb. 3.5 .

Differenzierende Färbungen

Differenzierende Färbungen

Mit .Hilfe .differenzierender .Färbungen, .zu .denen .die .Gram-Färbung .und .die .Säurefestigkeitsfärbung .gehören, .lassen .sich .Bakterien .anhand .der .unterschiedlichen .Zusammen­setzung .ihrer .Zellwand .einordnen . .Zur .Durchführung .einer .solchen .Färbung .werden .zwei .verschiedene .Färbelösungen .

benötigt, .von .denen .man .die .erste .für .die .Primärfärbung .und . die . zweite . für . die . Gegenfärbung . nimmt; . außerdem .wird . zwischen . den . beiden . Färbungen . ein . Entfärbungs­schritt .durchgeführt . .Abhängig .vom .Zellwandtyp .der .Bak­terien .findet .dabei .eine .Entfärbung .statt .und .es .kann .eine .Gegenfärbung .erfolgen, .oder .die .Primärfärbung .bleibt .trotz .des .Entfärbungsschrittes .erhalten .

Abb. 3.5 Durch die Negativfärbung des Bacillus­Präparates mit Nig­rosin treten die stäbchenförmigen Zellen deutlicher hervor (x 3.600).

Anwendung im Labor: Gram-Färbung

spült .wurde, .mit .einer .Jodlösung .behandelt . .Anschließend .entfärbt .man .die .zu .untersuchende .Probe .mit .96%­igem .Alkohol .und .macht .dann .eine .Gegenfärbung .mit .Safranin . .Die .sichtbaren .Unterschiede .entstehen .dadurch, .dass .die .grampositiven .Bakterien .wegen .der .dicken .Peptidoglykan­schicht .nach .der .Alkoholbehandlung .nicht .mehr .entfärbt .werden .können, .sondern .weiterhin .das .Kristallviolett .des .ersten .Färbungsschrittes .enthalten, .während .das .Färbemit­tel .bei .gramnegativen .Bakterien .durch .den .Alkohol .ausge­waschen .wird, .so .dass .sie .sich .anschließend .durch .Safra­nin .anfärben .lassen . .Durch .eine .Gram­Färbung .enthält .man .aber . nicht . nur . Hinweise . auf . den . Bau . der . Bakterienzell­wand, .sondern .man .kann .die .Größe, .Form .und .Anordnung .der .Zellen .auch .besser .erkennen .

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Ziel und Vorgehensweise

Die .Zellwand .der .meisten .Eubakterien .besteht .aus .Pepti-doglykan, .wobei .grampositive Bakterien .bis .zu .40 .Pepti­doglykanschichten .besitzen, .während .bei gramnegativen Bakterien . nur . eine . dünne . Peptidoglykanschicht, . dafür .aber . zusätzlich . eine . äußere . Membran . mit . Lipopolysac-chariden . vorliegt . . Diese . Unterschiede . lassen . sich . durch .die .Gram­Färbung .sichtbar .machen, .so .dass .man .mit .Hilfe .dieser .Methode .zwei .verschiedene .Gruppen .unterscheiden .kann . .Verwendung .findet .diese .Methode .vor .allem .bei .der .Identifizierung .unbekannter .Isolate .aus .der .Natur .oder .aus .dem .klinischen .Bereich .

Bei . der . Gram­Färbung . wird . der . fixierte . Ausstrich . zu­nächst .mit .Kristallviolett .gefärbt .und .dann, .nachdem .ge­

3 Färbetechniken FÜr bakterien

40

Abb. 3.6 Ein handelsüblicher Objektträger mit einer grampositiven Kontrolle (oben) und einem Gram­negativen Vergleichsorganismus (unten).

Abb. 3.7 24 Stunden alte Kultur von Staphylococcus aureus nach einer Gram­Färbung. Alle Bakterien sind tiefviolett gefärbt, zeigen also eine grampositive Reaktion.

Tipps für die Praxis

. . Beenden .Sie .das .Spülen .mit .Alkohol, .wenn .die .ab­laufende .Flüssigkeit .klar .bleibt .

. . Benutzen .Sie .Präparate .von .bekannten .Stämmen .zum .Vergleich .Ihrer .Färbungen . .Solche .Kontrollpräparate .sind .im .Fachhandel .erhältlich .(EAbb. 3.6); .man .kann .sie .sich .aber .auch .selbst .anfertigen . .

. . Führen .Sie .die .Gram­Färbung .mit .Ansätzen .durch, .die . etwa . 24 . Stunden . gewachsen . sind, . da . man . bei .älteren . Kulturen . häufig . uneinheitliche . Ergebnisse .

erhält . .So .sind .beispielsweise .24 .Stunden .alte .Zellen .von .Staphylococcus aureus .nach .einer .Gram­Färbung .erwartungsgemäß . durchgehend . grampositiv . gefärbt .(EAbb. 3.7), .während .man .in .48 .Stunden .alten .Kul­turen .bereits .einige .Bakterien .findet, .die .die .Gram­Färbung .nicht .aufgenommen .haben .(EAbb. 3.8), .und .nach . 72 . Stunden . hat . dieser . Anteil . noch . deutlich .zugenommen(EAbb. 3.9) . .Auf .der .anderen .Seite .sind .24 .Stunden .alte .Escherichia coli­Zellen .durchgehend .gramnegativ .(EAbb. 3.10), .während .es . in .48 .und .72 .Stunden . gewachsenen . Kulturen . zahlreiche . Zellen .gibt, . die . die . Gegenfärbung . schlecht . angenommen .haben .(EAbb. 3.11 und 3.12) .

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Abb. 3.8 Eine Gram­gefärbte, 48 Stunden alte Kultur der gramposi­tiven Bakterien­Art Staphylococcus aureus. Zwar zeigen die meisten Zellen in diesem Präparat die erwartete violette Färbung, es gibt aber auch eine Reihe von Bakterien, die rötlich aussehen, was einer gram­negativen Reaktion entspricht (x 3.600).

Abb. 3.9 Bei dieser 72 Stunden alten Kultur der grampositiven Bakte­rien­Art Staphylococcus aureus zeigen fast ebenso viele Zellen eine gramnegative wie eine grampositive Reaktion (x 3.600).

Abb. 3.10 Eine Gram­gefärbte, 24 Stunden alte Kultur des gramnega­tiven Bakteriums Escherichia coli. Das Ergebnis ist eindeutig, denn alle Zellen sind stark rötlich gefärbt (x 3.600).

Zu erwartende Resultate

Grampositive .Bakterien .zeigen . im .mikroskopischen .Bild .eine . tiefviolette . Färbung . . Färbt . man . eine . Mischkultur, .dann .lassen .sich .grampositive .und .gramnegative .Bakterien .gut .voneinander .unterscheiden .(EAbb. 3.13), .und .das .gilt .auch .für .klinische .Abstriche .(EAbb. 3.14) . .Neben .der .bereits .mehrfach .erwähnten .Art .Staphylococcus .aureus .gehören .u .a . .Bacillus .cereus .(EAbb. 3.15), .Enterococcus .faecalis .(EAbb. 3.16), .Micrococcus .luteus .(EAbb. 3.17) .und .Staphylococcus .epidermi­dis .(EAbb. 3.18) .zu .den .grampositiven .Bakterien .

Gramnegative .Bakterien .sind .im .mikroskopischen .Bild .rötlich . gefärbt . . Einige . Beispiele . gramnegativer . Bakterien .sind: .Escherichia coli .(EAbb. 3.10), .Alcaligenes .faecalis .(EAbb. 3.19), .Enterobacter .aerogenes .(EAbb. 3.20), .Pseudomonas .aeru­ginosa .(EAbb. 3.21) .und .Serratia .marcescens .(EAbb. 3.22) .

Anwendung im Labor: Gram-Färbung

3 Färbetechniken FÜr bakterien

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Abb. 3.11 Auch in diesem Gram­gefärbten Präparat, das mit einer 48 Stunden alten Escherichia coli­Kultur hergestellt wurde, haben die meisten Zellen eine kräftige, rosa Farbe, aber es gibt eine Reihe von Bakterien, die nur schwach gefärbt sind (x 3.600).

Abb. 3.12 Eine Gram­gefärbte, 72 Stunden alte Kultur von Escheri­chia coli. Es sind nur noch wenige Zellen kräftig rosa gefärbt, wogegen die meisten Bakterien eine untypisch helle Färbung zeigen (x 3.600).

Abb. 3.13 In diesem Präparat wurde eine Mischkultur aus der grampositiven Art Staphylococcus aureus und dem gramnegativen Bakterium Escherichia coli einer Gram­Färbung unterzogen.

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Anwendung im Labor: Gram-Färbung

Epithelzelle grampositiveStäbchen

grampositiveStreptokokken

grampositiveStaphylokokken

Hefe-zellen

Abb. 3.14 Gram­gefärbtes Abstrichpräparat von menschlichen Zähnen. Wie unschwer zu erkennen ist, überwiegen die grampositiven Bakterien (x 3.600).

Tetraden

Abb. 3.15 Gram­Färbung bei Bacillus cereus, einem stäbchenför­migen, grampositiven Bakterium (x 2.500).

Abb. 3.16 Gram­gefärbtes Präparat von Enterococcus faecalis, einem grampositiven Kokkus. Typisch für diese Art ist die Bildung von Zellketten (x 2.500).

Abb. 3.17 Präparat von Micrococcus luteus, einem kugelförmigen, grampositiven Bakterium nach einer Gram­Färbung. Typisch für diese Art ist die Tetradenbildung (x 2.500).

Abb. 3.18 Gram­gefärbtes Präparat von Staphylococcus epidermi­dis, einem kugelförmigen, grampositiven Bakterium. Charakteristisch für die Gruppe der Staphylokokken ist die traubenartige Zusammenla­gerung mehrerer Zellen (x 2.500).

3 Färbetechniken FÜr bakterien

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Anwendung im Labor: Säurefestigkeitsfärbung

denen .der .hohe .Anteil .an .hydrophoben .Substanzen .fehlt, .lassen .sich .dagegen .durch .das .Säure­Ethanol­Gemisch .ent­färben .und .mit .Methylenblau .nachfärben . .Solche .Bakterien .werden .als .nicht säurefest .bezeichnet . .Eingesetzt .wird .di­ese .Form .der .Färbung .vor . allem .zur . Identifizierung .von .säurefesten .Arten .aus .der .Gattung .Mycobacterium, .darunter .Mycobacterium tuberculosis, . des . Erregers . der . Tuberkulose .und .Mycobacterium leprae, .einer .Art, .die .Lepra .verursacht .

Abb. 3.19 Gram­Färbung bei einer Kultur von Alcaligenes faecalis, einer gramnegativen Art, bei der die kurzen Stäbchen alle etwa die gleiche Länge haben (x 2.500).

Abb. 3.21 Gram­gefärbtes Präparat von Pseudomonas aeruginosa, einem gramnegativen Bakterium. Bei dieser Art sind die stäbchenför­migen Zellen etwa 1,5­ bis 2­Mal so lang wie die von Alcaligenes faecalis (Abb. 3.19; x 2.500).

Abb. 3.20 Präparat von Enterobacter aerogenes, einem gramne­gativen Bakterium. Bei dieser Art sind einige der stäbchenförmigen Zellen so kurz, dass man sie leicht für Kokken halten könnte (x 2.500).

Abb. 3.22 Bei einer Kultur von Serratia marcescens durchgeführte Gram­Färbung. Bei dieser Art sind die stäbchenförmigen Zellen eben­falls so kurz, dass man sie leicht mit Kokken verwechseln kann (x 2.500).

Ziel und Vorgehensweise

Mit .Hilfe .der .Säurefestigkeitsfärbung .lassen .sich .eine .Rei­he . von . Bakterien . zuordnen, . die . einen . hohen . Gehalt . an .hydrophoben .Substanzen .(Wachsen) .in .der .Zellwand .auf­weisen .und .daher .auf .eine .herkömmliche .Gram­Färbung .nicht .ansprechen . .Dafür .wird .allerdings .Karbolfuchsin .auf­genommen .und .auch .durch .Waschen .mit .einem .Salzsäu­re­Ethanol­Gemisch .nicht .wieder .freigesetzt, .so .dass .man .solche .Bakterien .als .säurefest .bezeichnet . .Andere .Arten, .

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Anwendung im Labor: Säurefestigkeitsfärbung

Bei .der .Säurefestigkeitsfärbung .nach .Ziehl­Neelsen, .der .am .häufigsten .verwendeten .Form .dieser .Methode, .wird .ein .Ausstrichpräparat . mit . Fließpapier . bedeckt, . das . man . an­schließend .mit .Karbolfuchsinlösung .tränkt . .Danach .wird .der .Objektträger .vorsichtig .über .einem .Wasserbad .erhitzt, .bevor .man .das .Fließpapier .entfernt .und .den .Ausstrich .mit .Wasser . spült . . Schließlich . entfärbt . man . das . Präparat . mit .einem .Salzsäure­Ethanolgemisch .und . führt .zum .Schluss .eine .Gegenfärbung .mit .Methylenblau .durch .

Tipps für die Praxis

. . Wenn .die .zu .untersuchenden .Bakterien .bei .der .Prä­paration . mit . Ovalbumin . vermischt . werden, . haften .sie .besser .am .Objektträger .

. . Während .der .Hitzefixierung .sollte .weiteres .Karbol­fuchsin .zugegeben .werden, .um .ein .völliges .Austrock­nen .des .Präparates .zu .verhindern .

. . Das . Auswaschen . mit . dem . Säure­Ethanolgemisch .kann .beendet .werden, .wenn .die .Flüssigkeit .klar .ab­fließt .

Zu erwartende Resultate

Säurefeste .Bakterien .wie .Mycobacterium .tuberculosis .sehen .unter . dem . Mikroskop . rötlich . aus . (EAbb. 3.23), . während .nicht .säurefeste .Arten .blau .gefärbt .sind .(EAbb. 3.24) .

Säurefeste Stäbchen Nicht säurefeste Stäbchen

Abb. 3.23 Gefärbtes Präparat von Mycobacterium tuberculosis. Die säurefesten, stäbchenförmige Zellen erscheinen im Mikroskop rötlich gefärbt (x 3.600).

Abb. 3.24 Pseudomonas aeruginosa ist eine nicht säurefeste Art. Die stäbchenförmigen Zellen erscheinen im Mikroskop blau gefärbt (x 3.600).

3 Färbetechniken FÜr bakterien

46

Färbung von Zellstrukturen

Einige . Färbungen . lassen . sich . verwenden, . um . spezielle .Zellstrukturen . im . Mikroskop . sichtbar . zu . machen, . etwa .Kapseln, .Endosporen .oder .Geißeln . .Das .ist .insofern .wich­tig, .als .diese .Bestandteile .wichtige .Merkmale .für .die .Be­stimmung .sein .können .

Anwendung im Labor: Kapselfärbung

Ziel und Vorgehensweise

Einige .Bakterien .scheiden .während .Wachstums .Polysac­charide .und .Polypeptide .aus .und .bilden .so .außerhalb .der .Zelle .charakteristische .Schleimkapseln . .Zu .den .Arten .mit .solchen . Kapseln . gehören . auch . einige . Krankheitserreger, .darunter .Klebsiella .pneumoniae .und .Streptococcus .pneumoni­ae, .die .Lungenentzündung .verursachen .können . .Für .diese .Bakterien .spielen .die .Kapseln .eine .wichtige .Rolle, .denn .sie .schützen . die . Zelle . vor . Phagozytose . durch . Makrophagen .im .Wirt .

Da . sich . Bakterienkapseln . nicht . anfärben . lassen, . färbt .man .die .Zelle .und .den .Hintergrund .des .Präparates, .um .die .Kapseln .deutlich .hervortreten .zu .lassen . .Verwendet .wird .dazu .eine .Kombination .aus .Negativ­ .und .Einfachfärbung, .wobei .man .eine .saure .Färbelösung .wie .Kongorot, .Nigrosin .oder .Tusche .(India .Ink) .benutzt, .um .den .Hintergrund .zu .färben, .während .die .Zelle .mit .einem .basischem .Farbstoff .wie .Kristallviolett .oder .Karbolfuchsin .angefärbt .wird .

Tipps für die Praxis

. . Damit . auch . tatsächlich . eine . Kapselbildung . erfolgt, .sollten .Sie .die .entsprechenden .Bakterien .auf .Mager-milch-Agar .wachsen .lassen .

. . Führen . Sie . keine . Hitzefixierung . durch, . weil . die .Bakterien .dabei .leicht .schrumpfen, .so .dass .sich .ein .falsches .Bild .der .Kapsel .ergeben .kann .

. . Spülen .Sie .die .Präparate .sehr .vorsichtig, .damit .die .Zellen .nicht .abgewaschen .werden .

. . Dehnen .Sie .das .Spülen .nicht .unnötig .aus, .denn .das .Kapselmaterial .ist .wasserlöslich .

Zu erwartende Resultate

Im .mikroskopischen .Bild .erscheinen .die .Kapseln .als .helle .Zonen .zwischen .den .aufgrund .der .Einfachfärbung .farbig .erscheinenden .Zellen .und .dem .durch .eine .Negativfärbung .ebenfalls .farbigen .Hintergrund . .EAbb. 3.25 .zeigt .eine .Kap­selfärbung .bei .Klebsiella .pneumoniae .

Stäbchen-förmigeZellenKapseln

Gefärbter Hintergrund

Abb. 3.25 Kapselfärbung bei Klebsiella pneumoniae, einer Bakte­rien­Art mit stäbchenförmigen Zellen.

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Anwendung im Labor: Endosporenfärbung

Ziel und Vorgehensweise

Einige .grampositiven .Bakterien .können .unter .bestimmten .Bedingungen .sehr .widerstandsfähige .Sporen, .so .genannte .Endosporen, .bilden .(EAbb. 3.26) . .Sie .entstehen .durch .ver­gleichsweise . komplexe . Differenzierungsprozesse . in . den .vegetativen .Zellen .der .Bakterien .und .werden .freigesetzt, .wenn .diese .absterben . .Die .freigesetzten .Sporen .sind .außer­ordentlich . robuste .Strukturen, .die .Bedingungen .überste­hen .können, .unter .denen .vegetative .Bakterienzellen .längst .abgestorben .wären . .Verbessern .sich .die .Wachstumsbedin­gungen .für .die .Organismen, .dann .findet .eine .Keimung .der .Endosporen .und .eine .erneute .Bildung .vegetativer .Bakteri­enzellen .statt .

Da .Endosporen .und .ihre .intrazelluläre .Lage .in .der .Mut­terzelle .recht .unterschiedlich .sein .können, .sind .sie .wich­tige .Merkmale . für .die .Vertreter .bestimmter .Bakteriengat­tungen, .vor .allem .Bacillus .und .Clostridium . .So .bildet .Bacillus .anthracis, .der .Erreger .des .Milzbrands, .ovale .Endosporen .in .der .Mitte .der .vegetativen .Zellen, .während .sie .bei .Clostri­dium . botulinum, . einem . der . häufigeren . Botulismus­Verur­sacher, .deutlich .zu .einer .der .Seiten .verschoben .sind . .Bei .Clostridium .tetani, .dem .Tetanuserreger, .sitzen .die .Sporen .an .einem .Ende .der .Zellen . . .

Anwendung im Labor: Endosporenfärbung

Vegetative Zelle

Vegetative Zelle

Endospore

Sporenbildung

Freie Endo-spore

Sporen-keimung

Auskeimende Spore

Endosporen

Wegen .ihres .speziellen .Aufbaus, .aber .auch .aufgrund .ih­rer . chemischen . Zusammensetzung . nehmen . Endosporen .kein .Methylenblau .auf . .Daher .kann .man .die .Sporen .nach .einer .Einfachfärbung .entsprechender .Bakterien . auch .gut .als .ungefärbte, .stark .lichtbrechende .Objekte .innerhalb .der .gefärbten .Zellen .erkennen .(EAbb. 3.27) . .Noch .besser .lassen .sich .Endosporen .aber .durch .eine .spezielle .Sporenfärbung .sichtbar .machen . .

Eine .häufig .verwendete .Methode .zum .Anfärben .von .En­dosporen .ist .die .Sporenfärbung .nach .Schaeffer­Fulton . .Da­zu .bedeckt .man .ein .Ausstrichpräparat .mit .Fließpapier .und .tränkt .dieses .mit .einer .Malachitgrünlösung . .Anschließend .wird . der . Objektträger . vorsichtig . über . einem . Wasserbad .erhitzt, .und .nach .dem .Abkühlen .und .dem .Entfernen .des .Fließpapiers .mit .Wasser .gespült . .Dabei .wird .der .Farbstoff, .der .durch .die .Hitzeeinwirkung .in .die .Endosporen .einge­drungen .ist, .nicht .mit .ausgewaschen, .so .dass .die .Sporen .anschließend .gefärbt .sind . .Zum .Schluss .erfolgt .dann .noch .eine .Gegenfärbung .der .Zellen .mit .Safranin .

Abb. 3.26 Lebenszyklus eines Endosporen bildenden Bakteriums.

Abb. 3.27 Ungefärbte Endosporen in den gefärbten, vegetativen Zellen einer Bacillus­Art (x 3.600).

3 Färbetechniken FÜr bakterien

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Tipps für die Praxis

. . Tropfen . Sie . während . des . Erhitzens . weiteres . Ma­lachitgrün . auf . das . Fließpapier, . damit . das . Präparat .nicht .austrocknet .

. . Spülen .Sie .das .Präparat .nach .der .Malachitgrünfär­bung .sehr .sorgfältig .aus, .weil .die .Zellen .sonst .kein .Safranin .mehr .aufnehmen .

Zu erwartende Resultate

Nach . Durchführung . der . Färbung, . sind . die . runden . oder .ovalen .Sporen .als .grünliche .Objekte .deutlich .zu .erkennen, .so . dass . sich . Endosporen . bildende . Bakterien . mit . dieser .Methode .leicht . identifizieren .lassen .(EAbb. 3.28 bis 3.30) . .Damit . auch . ausreichend . Sporen . vorhanden . sind, . sollte .man .ältere .Kulturen .verwenden, .die .auf .nährstoffarmem .Medium . gezogen . wurden . . Wie . unterschiedlich . die . Zahl .der .Endosporen .in .Abhängigkeit .vom .Alter .der .Kulturen .sein .kann, .zeigen .die .EAbb. 3.28 bis 3.30 . .Bei .einer .Bakte­rienart, .die .keine .Endosporen .ausbilden .kann, .sind .nach .einer . Schaeffer­Fulton­Sporenfärbung . im . Präparat . keine .grünlich . gefärbten . Endosporen . vorhanden, . sondern . nur .rötlich .aussehende, .vegetative .Zellen .(EAbb. 3.31) .

Endospore Vegetative Zellen Vegetative Zellen Freie Sporen

Abb. 3.28 Sporenfärbung bei einer 1­2 Tage alten Kultur von Bacillus cereus, einem Endosporenbildner. Diese junge Kultur enthält viele vegetative Zellen, aber nur wenige Endosporen (x 4.250).

Abb. 3.29 Sporenfärbung bei einer 3­4 Tage alten Kultur von Bacillus cereus. In diesem Präparat sind immer noch viele vegetative Zellen vorhanden, aber auch schon zahlreiche, teilweise frei gewordene Endosporen (x 4.250).

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Vegetative Zellen Freie Sporen

Abb. 3.30 Sporenfärbung bei einer 5­7 Tage alten Kultur von Bacillus cereus. In diesem Präparat sind nur noch wenige vegetative Zellen zu erkennen, dafür aber viele freie Endosporen (x 4.250).

Abb. 3.31 Sporenfärbung bei einer Kultur von Escherichia coli, einem Bakterium, das keine Endosporen bildet. In dem Präparat sind ausschließlich rot gefärbte Stäbchen zu erkennen, aber keine grün­lichen Endosporen (x 4.250).

Anwendung im Labor: Geißelfärbung

Ziel und Vorgehensweise

Einige . Bakterien . besitzen . der . Beweglichkeit . dienende, . .fadenartige .Anhänge, .die .Geißeln oder Flagellen .genannt .werden . .Im .Mikroskop .sind .diese .sehr .feinen .Strukturen .nur .zu .erkennen, .wenn .zuvor .eine .Quellung .und .Beizfär­bung .durchgeführt .wurde . .

Um .bewegliche .Bakterien .präparieren .zu .können, .muss .man .zunächst .eine .bewachsene .Agarplatte .mit .Flüssigme­dium .überschichten, .um .darin .bewegliche .Zellen .aufzufan­gen . .Anschließend .wird .die .Flüssigkeit .abgesaugt .und .mit .niedriger .Geschwindigkeit .zentrifugiert, .bis .ein .deutlicher .Niederschlag .(Pellet) .am .Boden .des .Zentrifugenröhrchens .zu .erkennen .ist . .Dieses .Pellet .nimmt .man .in .10%­igem .For­malin .auf, .und .überträgt .davon .einen .Tropen .auf .einen .Ob­jektträger . .Dieser .wird .anschließend .etwas .geneigt, .damit .der .sich .Tropfen .auf .dem .Glas .verteilen .kann . .Nach .dem .Trocknen .an .der .Luft .überschichtet .man .die .entsprechende .Stelle .dann .mit .einer .Pararosanilinlösung, .und .spült .das .Präparat .mit .Wasser, .sobald .sich .ein .goldfarbener .Film .an .der .Oberfläche .des .Färbemittels .sowie .ein .sichtbarer .Nie­derschlag .gebildet .hat .

Tipps für die Praxis

. . Verwenden .Sie .unbedingt .sehr .saubere .Objektträger .

. . Führen . Sie . die . beschriebenen . Schritte . möglichst .vorsichtig .durch, .denn .Geißeln .sind .außerordentlich .empfindliche .Strukturen, .die .leicht .abbrechen .

. . Suchen .Sie .das .Präparat .im .Mikroskop .sehr .gründ­lich .ab, .da .nicht .alle .Zellen .noch .Geißeln .besitzen .werden . .Vergleichsweise .häufig .findet .man .begeißel­te .Stadien .in .den .Randbereichen . .

Zu erwartende Resultate

Bei .Bakterien .gibt .es .vier .Begeißelungstypen .(EAbb. 3.32), .die . sich . in . vielen . Fällen . zur . Bestimmung . verwenden . .lassen . .

So .besitzt .die .Art .Pseudomonas .aeruginosa .nur .eine .Geißel, .ist .also .monotrich begeißelt .(EAbb. 3.33), .während .Spirillum .volutans . Flagellen . an . beiden . Seiten . aufweist . und . somit .

Anwendung im Labor: Geißelfärbung

3 Färbetechniken FÜr bakterien

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Monotrich

Lophotrich

Amphitrich

Peritrich

(siehe Abb. 3.33)

(siehe Abb. 3.34)

(siehe Abb. 3.35)

(siehe Abb. 3.36)

Abb. 3.32 Begeißelungstypen bei Bakterien. Monotrich begeißelte Arten haben eine einzelne Geißel an einem ihrer Zellpole, beim amphitrichen Begeißelungstyp sitzt an beiden Enden je eine Geißel. Bei Bakterien mit einem lophotrichen Begeißelungstyp sind an einem Ende mehrere Geißeln vorhanden, und bei peritrich begeißelten Arten sitzen die Fortbewegungsorgane überall auf der Zelloberfläche.

Geißeln

Geißeln

Geißeln

Geißel

Abb. 3.33 Monotriche Begeißelung bei Pseudomonas aeruginosa (x 3.600).

Abb. 3.35 Lophotriche Begeißelung bei Pseudomonas marginalis (x 3.600).

Abb. 3.34 Amphitriche Begeißelung bei Spirillum volutans (x 3.600).

Abb. 3.36 Peritriche Begeißelung bei Proteus vulgaris (x 3.600).

amphitrich begeißelt .ist .(EAbb. 3.34) . .Pseudomonas .margi­nalis .hat .mehrere .Flagellen .an .einer .Seite, .weist .also .eine .lophotriche Begeißelung .auf .(EAbb. 3.35), .während .Proteus .vulgaris rundum, .also .peritrich .begeißelt .ist .(EAbb. 3.36) .