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1 Fachhochschule Köln, Institut für Anlagen- und Verfahrenstechnik Arbeitskreis Prof. Dr. Astrid Rehorek AK Prozessanalytik, 1. Kolloquium 17.-18.11.2005, MERCK Darmstadt Moderne LC/LC Moderne LC/LC - - MS MS - - Verfahren Verfahren zur Online zur Online - - Analyse Analyse biotechnologischer Prozesse biotechnologischer Prozesse Astrid Rehorek Astrid Rehorek

Moderne LC/LC-MS-Verfahren zur Online-Analyse ... · HPLC-RP-System ˜ polar embedded RP ˜ RP mit TBA+-Ionenpaar Kationen-Suppressor ˜ Suppression von TBA+ ˜ Suppression von Kationen

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Arbeitskreis Prof. Dr. Astrid Rehorek AK Prozessanalytik, 1. Kolloquium 17.-18.11.2005, MERCK Darmstadt

EB312

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gefilterte Luft

FC

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B300

P310

M300

IL300

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TIB315

XTICB311

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B200

ELEKTRISCHEBEGLEITHEIZUNG

Stickstoff

VON VORLAGE-BEHÄLTER

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B100

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M100

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FIAB317

Base

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Säure

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P150

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Säure

ZUR HPLCH10

H20

ZUR HPLC

W100ZUM SAMMELBEHÄLTER

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XIB118

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-

Moderne LC/LCModerne LC/LC--MSMS--VerfahrenVerfahrenzur Onlinezur Online--AnalyseAnalyse

biotechnologischer Prozessebiotechnologischer Prozesse

Astrid RehorekAstrid Rehorek

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InhalteInhalte

1. ProzessanalysentechnikProzessanalysentechnik inin derder BiotechnologieBiotechnologie

2. OnlineOnline--EinzelEinzel-- undund MehrkomponentenanalyseMehrkomponentenanalyse

3.3. OnlineOnline--LC/LCLC/LC--MSMS--BeispieleBeispiele

-- OnlineOnline--Kontrolle eines KläranlagenzulaufsKontrolle eines Kläranlagenzulaufs

-- OnlineOnline--Monitoring in Monitoring in einem anaerobeinem anaerob//aeroben Bioreaktor zur aeroben Bioreaktor zur

ErmittlungErmittlung vonvon optimalenoptimalen ProzessführungsparameternProzessführungsparametern

-- MultiMulti--AnalyserAnalyser BioreaktorsystemBioreaktorsystem

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BioprozessanalysenmesstechnikBioprozessanalysenmesstechnik

UV-VIS Spektrometer (UV-VIS)Insitu- und Online-Monitoring in derflüssigen Phase

Fluoreszens-Spektroskopie Zellkonzentrationsmessung,Zellmetabolismus

Nuklear-Magnetische-Resonaz-Spektroskopie(NMR)

Zellmetabolismus

Fourier-Transformations-Nahinfrarot-Spektrometer(FT IR)

Insitu-Monitoring in komplexen Matrizes,z.B. Fettsäuren in Bioreaktoren

Nah-Infrarot-Spektrometer(NIR)

Gasanalyse

Fourier-Transformations-Mikrowellen-Spektrometer(FT MW)

Gasanalyse (Ozon)

Analysator Einsatz

Biosensoren (Kombination eines Mikroorganismus,Antikörpers, Enzyms, etc. mit einem Messumformer)

In-Situ-Einsatz zellfreier Lösungen,“Realzeit”-signale bei hoherSelektivität

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OnlineOnline messbaremessbare abwasserrelevanteabwasserrelevante SummenparameterSummenparameter

pH-Wert Potentiometrische Methode

TOC/VOC Katalytische Verbrennung mit IR-Detektion (mit VOC-Kanal), Verdünnungund Filterung; UV-VIS

TN Verbrennungs-/Chemilumineszenz-Methode

CSB Oxidierung mit Ozon - Sensorische Sauerstoffmessung in der Gasphase,Elektrochemisch, Spektroskopisch

BSB Erfassung als Kurzzeit-BSB (Respirationsrate)

DOC Reinstwasser DOC (UV-Zersetzung und Leitfähigkeitsmessung)

Messaufgabe Online-Methode

UV-VIS (inline) Xenon Blitzlampe mit DAD, Fiberoptische Spektrometer

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OnlineOnline--AnalytikAnalytik biotechnologischerbiotechnologischer ProzesseProzesse

MultikomponentenanalyseMultikomponentenanalyseSummenparameterSummenparameter

EinzelstoffanalyseEinzelstoffanalyse

ZielZiel:: VordefinierteVordefinierte ProduktqualitätProduktqualität

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ProzessProzess--FlFlüüssigchromatographenssigchromatographen::ModulareModulare HPLCHPLC--BetriebsmessplBetriebsmesspläätzetze oderoder KomplettKomplett--AnalysatorenAnalysatoren

Reaktor

Pumpe

Injektionsventil

HPLC-Pumpe

Eluent

Säule

Detektor

He

Steuerrechner

KommerziellerProzess-LC

Chromatograph

Reaktor

Leitsystem

Regelgröße

Messung

Prozessführung

Stellgröße

Probenahmefilter

Degaser

Ofen

Leitsystem

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KommerzielleKommerzielle LCLC--ProzesschromatographenProzesschromatographen

BayerTechnologyServices

BaychroMAT®

(GC, HPLC, GPC)VerschiedeneDetektoren

Bestimmung derMolmasse inPolymeranlagen,Prozesskontrolle,Nebenkomponentenim ppm-Bereich,Isomerenbestimmung

Dionex DX 800Prozesschromatograph(LC)

UV-, Leitfähigkeits-,und elektrochemischerDetektor

Spurenbest. in Reinstwasser,org. Säuren beiNylonherstellung,Nitrit/NitratKläranlage,Fermenter-Monitoring

Hersteller Bezeichnung Detektoren Anwendungsgebiete

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IonenchromatographischerIonenchromatographischer ProcessProcess--LCLC--AnalysatorAnalysator derder FirmaFirma DIONEXDIONEX

DXDX--800800

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ModulareModulare LC/LCLC/LC--MSMS ProzessanalysentechnikProzessanalysentechnik

AutomatisierteAutomatisierte,, kontinuierlichekontinuierliche OnlineOnline--ProbenahmetechnikenProbenahmetechniken

MikroMikro-- u.u. UltrafiltrationUltrafiltration

MembranextraktionMembranextraktion

Sedimentation/Sedimentation/PorenfiltrationPorenfiltration

AutomatisierteAutomatisierte SPE/ SPMESPE/ SPME

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EB312

PB116

gefilterte Luft

FC

ABLUFT

B300

P310

M300

IL300

PB313

TIB315

XTICB311

PB316

LIAB314

B200

ELEKTRISCHEBEGLEITHEIZUNG

Stickstoff

VON VORLAGE-BEHÄLTER

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B100

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PB113

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FIAB117

FIAB317

Base

P120

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Base

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Säure

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Säure

ZUR HPLCH10

H20

ZUR HPLC

W100ZUM SAMMELBEHÄLTER

FCB310

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XIB118

XIB119

V101 V301

V302

-

OnlineOnline--Kontrolle eines KläranlagenzulaufsKontrolle eines Kläranlagenzulaufs

Etablierung eines automatisierten

Online-Analysensystems,

das die Kläranlage und damit die Umwelt

vor Stoßbelastungen durch

plötzliche, hohe Stoffemissionen

von organischen Einzelkomponenten schützt.

Mit freundlicher Genehmigung der BASF, Dr. Kurz

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Konzeption der BASFKonzeption der BASF-- KläranlagenKläranlagen--OnlineOnline--Überwachung:Überwachung:

ARGUS und HYDRAARGUS und HYDRA

Wasser in Kläranlage OK

Probezeitversetzt

dosieren

GC-MS„ARGUS A“

EDV-Steuerung

AuswertungAlarmsignale

Umwelt-zentrale

Z 75

EDV-Steuerung

AuswertungAlarmsignale

HPLC„HYDRA“

Wasser in Sicherheitsbecken ALARM

GC-MS„ARGUS A“

FiltrationMischprobe

erstellen

bbALängs-

sammler

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Probenvorbereitung für ARGUS und HYDRA Probenvorbereitung für ARGUS und HYDRA

Sandfang Bandfilter Vorlage

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Prinzip von ARGUS / HYDRAPrinzip von ARGUS / HYDRA

ARGUS:• Prinzip: GC/MS-Analyse mit Wasserdirektinjektion• gaschromatographisch erfassbare Stoffe• Messzyklus ca. 40 min (effektiv 20 min; 2 Geräte)• 130 Stoffe kalibriert• Arbeitsbereich: 1-100 mg/L

HYDRA:• Prinzip: Ionenpaarchromatographie mit Dioden-Array-

und Fluoreszenz-Detektion• polare und höhermolekulare Stoffe• Messzyklus: 20 min• ca. 45 Stoffe kalibriert• Arbeitsbereich: 0,1-20 mg/L (sehr stoffspezifisch)

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ARGUSARGUS

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HYDRAHYDRA

1 Probezufuhr

2 Durchflußzelle

3 Injektionsspritze

4 Testlösungen

5 Injektionsventil

6 Laufmittel + Entgaser

7 Pumpe

8 Säulenofen

9 Dioden-Array-Detektor

10 Fluoreszenz-Detektor

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FerndiagnoseFerndiagnose--ToolsTools

a) Fern-Zugriff auf Chromatogramme und Reports über das Internet mit Bereitschaftsdienst-Laptop

b) Fernsteuerung der Geräte

c) Web-Cam zur visuellen Beurteilung von Fehlfunktionen und Anleitung bei Reparaturen

d) Fehlermeldung nach Auswertung der Qualitätskriterien werdenals SMS auf Bereitschaftsdienst-Handy übertragen

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SummarySummary: ARGUS und HYDRA: ARGUS und HYDRA

ARGUS und HYDRA überwachen kontinuierlich den Zulauf der Kläranlage auf ca. 200 organische Einzelstoffeca. 200 organische Einzelstoffe.

Systeme laufen seit mehreren Jahre mit nahezu100%-iger VerfügbarkeitARGUS: seit 1992, ca. 350.000 AnalysenHYDRA: seit 2001, ca. 100.000 Analysen

Zentrale Überwachung ist billiger als Einzelüberwachung in den Betrieben.

Bei mehreren Einleitern werden kumulative Effekte berücksichtigt.

Systeme werden auch zum Abwassermanagement benutzt.

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gefilterte Luft

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TIB315

XTICB311

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ELEKTRISCHEBEGLEITHEIZUNG

Stickstoff

VON VORLAGE-BEHÄLTER

F100

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TICB115

XTICB111

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FIAB117

FIAB317

Base

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Base

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Säure

P200

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Säure

ZUR HPLCH10

H20

ZUR HPLC

W100ZUM SAMMELBEHÄLTER

FCB310

XIB118

XIB118

XIB119

V101 V301

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-

Unerwünschter Farbe auf der Spur Unerwünschter Farbe auf der Spur ––

LCLC--MSMS--MonitoringMonitoring zur Prozessoptimierung zur Prozessoptimierung der biologischen Behandlung von der biologischen Behandlung von

FarbabwasserkonzentratenFarbabwasserkonzentraten

GefGeföördertrdert duchduch

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Entwicklung von anaerob/aeroben BioEntwicklung von anaerob/aeroben Bio--MembranMembran--ReaktorenReaktorenfür die Behandlung von textilen für die Behandlung von textilen AzofarbstoffAzofarbstoff--AbwasserkonzentratenAbwasserkonzentraten

1998-1999

3-Liter anaerob/aerobe BMR

(ungekoppelt)

Offline-UV/VIS Spektroskopie

Offline pH -Messung

2000-2001

10-Liter gekoppeltes

anaerob/aerobes BMR-System

Online-UF-LC-DAD-Monitoring

Online-RI-Monitoring

Offline pH-&

Redoxmessung

2002-2005

40-Liter anaerob/aerob BMR-System

Automat. Messdatenerfassung

+Steuerung

Online-MF-HPLC-DAD-Spektroskopie

Prof. Dr. A. Rehorek

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Chromatographische Auftrennung von Realproben

FeedFeed

Retentionszeit

We

lle

nlä

ng

e

AnaeroberAnaeroberReaktorReaktor

FarbloseFarblose

IntermediateIntermediate

FarbigeFarbige IntermediateIntermediate

AeroberAeroberReaktorReaktor

HydrolysatHydrolysat

RückverfärbungsprodukteRückverfärbungsprodukte

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SetSet--up und Methodenentwicklung des massenspektroskopischen Verfahrenup und Methodenentwicklung des massenspektroskopischen Verfahrens:s:OnlineOnline--MFMF--HPLCHPLC--DADDAD--ICIC--ESIESI--MS²MS²-- AnalysenverfahrenAnalysenverfahren

AB Qtrap Hybrid-MSESI - negativ Modus

Triple-Quadrupole-Modus:

� Selektive und empfindliche

Quantifizierung mit MRM

IonTrap-Modus:

� Enhanced (E) MS-Scans:

EMS, EPI, EMC, MS3 für

die Strukturanalyse

Kontinuierliche Probenahme mitInline-Mikrofiltrationssonde

75m 1/16“ PEEKI.D. 0,5mm

HPLC-RP-System� polar embedded RP� RP mit TBA+-Ionenpaar

Kationen-Suppressor� Suppression von TBA+

� Suppression von Kationen

DAD

� Monitoring farbigerVerbindungen

� MatrixeffektfreieQuantifizierung

1. Etage

Labor

Textilabwasser

BehandeltesBehandeltes

AbwasserAbwasser

Zweistufiger anaerob/aerober Bioreaktor (2 x 40L)

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StrukturaufklärungStrukturaufklärung vonvon AzofarbstoffintermediatenAzofarbstoffintermediatenmittelsmittels OnlineOnline--LCLC--MS²MS² ausaus RealmatrixRealmatrix

Charakterisierung von primären und sekundären Verbindungen hydrolysierter

Reaktiver Farbstoffe im FeedFeed (Reaktorzulauf aus Realmatrixabwasser)

Identifizierung von primären Abbauprodukten der anaeroben und aeroben

biologischen Behandlung mittels Online-LC-MS2 im KlärschlammKlärschlamm

Strukturaufklärung durch Interpretation von Fragmentierungsmustern

erzeugt aus negativen und positiven Ionen

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Identifizierung von Farbabbau-Intermediaten aus Realmatrix durch Online-LC-MS

Beispiel:Beispiel:

Unbekannte Verbindung, Unbekannte Verbindung,

die im UVdie im UV--Bereich absorbiertBereich absorbiert

TIC of -EMS: from Sample 1 (040901_BMR_AE_EMS_002) of 040903_BM... Max. 4.7e8 cps.

2 4 6 8 10 12Time, min

0.0

5.0e7

1.0e8

1.5e8

2.0e8

2.5e8

3.0e8

3.5e8

4.0e8

4.5e8

7.2

8.9 9.4

9.710.2

7.8

8.1 10.7

11.311.6 12.4

6.5

3.70.61.3 5.2

MassenspektrumMassenspektrum

TotalionenchromatogrammTotalionenchromatogramm

ESI(-)-MS-Scan 50-1700 amu

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XIC of -EMS: 307.9 to 308.4 amu from Sample 1 (040901_BMR_AN_EMS_... Max. 1.4e6 cps.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Time, min

0.0

1.0e5

2.0e5

3.0e5

4.0e5

5.0e5

6.0e5

7.0e5

8.0e5

9.0e5

1.0e6

1.1e6

1.2e6

1.3e6

1.4e6

6.2

9.8 10.23.16.1

-EMS: 6.335 to 6.568 min from Sample 1 (040901_BMR_AE_EMS_002) of... Max. 2.7e6cps.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000m/z, amu

2.0e5

4.0e5

6.0e5

8.0e5

1.0e6

1.2e6

1.4e6

1.6e6

1.8e6

2.0e6

2.2e6

2.4e6

2.6e6

137.2

308.2

264.1

87.1

80.0182.3

97.1

81.0212.3

67.2529.2171.1 225.2278.2 617.3187.3 336.4113.0 770.5663.2397.2 858.5 972.0955.1

Extrahiertes IonenExtrahiertes Ionen--

chromatogrammchromatogramm derder

MassenspurMassenspur

m/zm/z 308308

MassenspektrumMassenspektrum enthältenthält

einen besonders einen besonders

charakteristischencharakteristischen

PeakPeak

Aufnahme einesAufnahme eines

ProduktProdukt-- IonenIonen--

Spektrums der Masse Spektrums der Masse

m/zm/z 308308

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-EPI (308.00) CE (-35): Exp 1, 5.114min from Sample 2 (040504_BMR_A... Max. 3.9e5 cps.

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400m/z, amu

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%125.0

308.3

156.195.0

107.080.0

94.2 170.274.468.8 123.2 151.2 182.2 310.7

NH-SHO O

C6H6NO2S-

Mol. Wt.: 156.18

-26

C10H14NO6S2-

Mol. Wt.: 308.35

NH-SO

O

-126

C8H8NO2S-

Mol. Wt.: 182.22

NH-SO

O-138

C7H8NO2S-

Mol. Wt.: 170.21

OH

C2H5O4S-

Mol. Wt.: 125.12

-183SO3-

C2H3O3S-

Mol. Wt.: 107.11

-18-O3S

NH2

S

O

O

O

SO3-

[M-H]-

ProductProduct ionion chromatogramchromatogram

Identifizierung eines Identifizierung eines IntermediatsIntermediats aus Realmatrix durch Onlineaus Realmatrix durch Online--LCLC--MSMS

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26

Fachhochschule Köln, Institut für Anlagen- und Verfahrenstechnik

Arbeitskreis Prof. Dr. Astrid Rehorek AK Prozessanalytik, 1. Kolloquium 17.-18.11.2005, MERCK Darmstadt

InformationInformation DependentDependent AquisitionAquisition -- IDAIDA

Total Ionen Chromatogram

MS-Scan

m/z, das durch Signalintensität

ein Produkt-Ionen-Scan auslöst

MS-Spektrum

von m/z 373.1

Massenspur von

m/z 373.1

Liste von Ionen

mit m/z,

Retentionszeit

und Kollisions-

energie von

denen

automatisch

ein Produkt-

Ionen-Scan

aufgenommen

wurde.

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27

Fachhochschule Köln, Institut für Anlagen- und Verfahrenstechnik

Arbeitskreis Prof. Dr. Astrid Rehorek AK Prozessanalytik, 1. Kolloquium 17.-18.11.2005, MERCK Darmstadt

HochselektivesHochselektives MonitoringMonitoring vonvon IntermediatenIntermediaten im MRMim MRM--ModusModus

XIC of -MRM (26 pairs): 237.9/80.1amu from Sample 1 (040901_BMR_A... Max. 3380.0 cps.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time, min

0.0

5.0e4

1.0e5

1.5e5

2.0e5

2.5e5

3.0e5

3.5e5

3.7e5

7.6 9.1 10.08.7 10.48.1 11.2 12.35.1 7.45.7 6.00.0

MRM-Scan (50ms)

26 Transienten

XIC of -MRM (26 pairs): 307.9/124.9 amu from Sample 1 (040901_BMR_A... Max. 3.7e5 cps.

1 2 3 4 5 6 7 8 9Time, min

0.0

5.0e4

1.0e5

1.5e5

2.0e5

2.5e5

3.0e5

3.5e5

3.7e56.1

S/N = 476.3

Peak Int.(Subt.) = 372157.8

! !-Noise-

m/z 308

TIC of -EMS: from Sample 1 (040901_BMR_AE_EMS_002) of 040903_BM... Max. 4.7e8 cps.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Time, min

0.0

5.0e7

1.0e8

1.5e8

2.0e8

2.5e8

3.0e8

3.5e8

4.0e8

4.5e8

7.2

8.99.4

9.7 10.213.6

7.8

8.1 10.7

11.312.4

14.16.5

3.70.61.3 5.2

MS-Scan

50-1000 amu

XIC of -EMS: 307.9 to 308.4 amu from Sample1 (040901_BMR_AE_EMS_... Max. 2.3e7 cps.

1 2 3 4 5 6 7 8 9Time, min

0.0

2.0e6

4.0e6

6.0e6

8.0e6

1.0e7

1.2e7

1.4e7

1.6e7

1.8e7

2.0e7

2.2e76.4

6.2

S/N = 146

Peak Int.(Subt.) = 22462077.8

! !-Noise-

3,3 mal besseres S/N

m/z 308

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28

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Arbeitskreis Prof. Dr. Astrid Rehorek AK Prozessanalytik, 1. Kolloquium 17.-18.11.2005, MERCK Darmstadt

Methodenvalidierung mittels simulierter Farbabwässer in Salzlösung

c = µM, n=5 PB Metanilsäure RO107-H TAHNDSDP2 H-Säure RB-OH RB5-HMW 201 173 442 348 319 532 743

RT (min) 2.2 5.4 7.1 7.3 7.5 7.8 8.0Q1 (amu) 200 171.8 441 346.9 317.8 264.6 370.5

Q3 (amu) 107.9 80 186.1 187.1 237.8 80 370.6DP (V) -56 -51 -81 -61 -151 -31 -41

EP (V) -10 -10 -7 -9.5 -7.5 -8.5 -7CEP (V) -13.52 -12 -22 -18 -16 -14 -18

CE (V) -28 -34 -66 -44 -36 -48 -8

CXP (V) 0 0 -4 -4 -4 0 -4LOD (MRM) ***n.b. 0.59 0.001 0.001 0.010 0.003 0.012

LLOD (MRM) - 4.88 0.610 0.153 0.122 4.88 1.22ULOD (MRM) - 78.1 625 78 7.81 313 313

r² *,** - *0.9953 *0.9977 *0.9985 *0.9927 *0.9989 *0.9982RSD (%) - 7.8 6.1 7.0 6.8 6.2 4.7

Wellenlänge (nm) 270 n.b. n.b. 585 300 500 585

LOD (UVVIS) 1.33 - - 0.33 0.26 0.26 0.15LLOD (UVVIS) 9.77 - - 4.88 15.6 2.44 0.61

ULOD (UVVIS) 2500 - - 625 500 625 625r²*,** *0.9997 - - *0.9996 *0.9997 *0.9993 *0.9991

RSD (%) 3.1 - - 3.6 8 4.1 7.0

*quadratische Regression und x-1-Wichtung **lineare Regression und x-1-Wichtung ***n.b. - nicht be

Lineare Mess-

bereiche über

drei Dekaden,

hohe Linearität

MS

MS

DA

D

NWG (abs.) im

pg-Bereich

RSD <10%

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29

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HO3S

SO3H

SO3HHO3S

HO3S

HO3S HO3S

HO3S

SO3H

SO3HS

S

OO

N

N

OH

NH2

N

NO O

O

O S

S

OO

N

N

OH

NH2

N

NOO

O

S

SOO

N

N

OH

NH2

N

NO O

S

SOO

N

N

OH

NH2

N

NO O

OH

RB5

[M-H]- m/z=902,8

RB5 (-H2SO4)

[M-H]- m/z=804,8

(2 Isomere)

RB5-V

[M-H]- m/z=706,7RB5-HV

[M-H]- m/z=724,8

(2 Isomere)

HO3S

HO3S

S

SOO

N

N

OH

NH2

N

NO O

OH

RB5-H

[M-H]- m/z=742,8

OH

SO3H

R SO

OOH

R

SO O

R

SOO

O

R SO

O

R = -NH2 oder -N=N-RB5-H

HO3S

HO3S SO

O

N

N

OH

NH2

N

N

OH NH2

SO

O

SOO

O RB5-H+DPBEm/z = 926

(2 Isomere)

HO3S

HO3SSO3H

S

S

OO

N

N

OH

NH2

N

NO O

OH

O

RB5 (-SO3)

[M-H]- m/z 822,8

R=NH2: DPBE m/z 383

Etherbildung

Hydrolyse in Farbstoffsynthese oder Färbprozess

Hydrolyse-

nebenreaktion

MSMS--Identifizierung von HauptIdentifizierung von Haupt-- und Nebenkomponenten und Nebenkomponenten imim FeedFeed (RB5)(RB5)

S

SO

O

N

N

O

NH2

N

HN

O

O

OH

SO3H

O3S-

SO3H

RB5-H+SO2[M-H]- m/z 806

Nebenreaktionsprodukt aus Synthese oder Hydrolyse

sowie weitere, noch nicht identifizierte Verbindungen (UNKs)

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30

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IdentifizierungIdentifizierung farbigerfarbiger IntermediateIntermediate mit Onlinemit Online--LCLC--DADDAD--MSMSMSMS

HO3S

SO3H SO3HHO3S HO3S

HO3S

SO

O

NH2

N

NH2

OH

NNH NH2

NHHOOH NH

NH HO

RB5-H -PB

[M-H]- m/z=545,5

TAHNDSDP1

[M-H]- m/z=346,3

Strukturvorschlag

TAHNDSDP2

[M-H]- m/z=347,3

HO3S

HO3S

S

S

OO

N

N

OH

NH2

N

N

OO

OH

RB5-HV

[M-H]- m/z=724,8

HO3S

HO3S

S

S

OO

N

N

OH

NH2

N

N

O O

OH

RB5-H

[M-H]- m/z=742,8

OHHO3S

HO3S S

OO

NH2

N

OH

NH2

N

RB5-H -PB +DPBE

[M-H]- m/z=728,8

SO

O

NH2

O

SO3HHO3S

NH2NH2

HO HO

TAHNDSDP3

[M-H]- m/z=349,3

Strukturvorschlag

1. Stufe der anaeroben Reduktion

2.Stufe der anaerobenReduktion

Autoxidation

HO3S

HO3S

SO

O

NH2

N

NH2

OH

N OH

RB5-HV -PB

[M-H]- m/z=527,5 OH

SO3HHO3S

NH

OHO

TAHNDSDP4

[M-H]- m/z=348,3

Strukturvorschlag

S

SO O

N

N

NH2

OH

N

NO O

OH

O

O3S-

SO3H

S OO

NH2

RB5-H+PB

[M-H]- m/z=926

Neu identifizierte farbige Intermediate in Feed & Anaerob- & Aerob-Bioreaktor

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Arbeitskreis Prof. Dr. Astrid Rehorek AK Prozessanalytik, 1. Kolloquium 17.-18.11.2005, MERCK Darmstadt

Blaues Abwasser nach der Anaerobstufe - Reste von blauem Farbstoff ?

200

240

280

320

360

400

440

480

520

560

600

640

680

720

760

nm

rel.

Inte

nsitä

t

m/z 346 TAHNDS DP1

m/z 347 TAHNDS DP2

m/z 545 RB5-H -PB

m/z 706 RB5-V

m/z 725 RB5-HV

m/z 742 RB5-H

m/z 804 RB5 -H2SO4

m/z 968 RB5

Verbindungen, die nachReduktion Rück-verfärbung verursachen

Teilreduzierter Farbstoff

Reaktivfarbstoff als: Teilhydrolysat

Vinyl-Form

Hydrolysat

Ester-Vinyl-Form

Esterfrom

Zunahme

der UV-Absorption

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Identifizierung nicht-farbiger Intermediate mit Online-LC-DAD-MSMS

H2N SO

OOH

NH2

SO O

NH2

SOO

O

p-Base (PB)

[M-H]- m/z=201,2

Di-p-Base-Ether (DPBE)

[M-H]- m/z=383,5

H2N SO

O

vinyl-p-Base (VPB)

[M-H]- m/z=183,2

NH SO

OOH

O

N-Acetamid-p-Base (NAPB)

[M-H]- m/z=243,2

NH

SO

O

S

OH

HO

OO

2-{4-[4-(2-Hydroxy-ethanesulfonyl)-phenyl-amino]-benzenesulfonyl}-ethanol

NH2S

OO

HO

SO3H

NH2S

OO

HO3S

NH2SO

O

OHO3S

2-(4-Amino-benzenesulfonyl)-ethanesulfonic acid

2-Amino-5-(2-hydroxy-ethanesulfonyl)-benzenesulfonic acid

2-[2-(4-Amino-benzenesulfonyl)-ethoxy]-ethanesulfonic acid

Abbauprodukte, die bei der Reduktion

von Reaktivfarbstoffen freigesetzt werden

Neu identifizierte Abbauprodukte,

die als Nebenkomponenten im

Feed vorliegen oder bei der

Reduktion von

Farbstoffnebenkomponenten

freigesetzt werden

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Arbeitskreis Prof. Dr. Astrid Rehorek AK Prozessanalytik, 1. Kolloquium 17.-18.11.2005, MERCK Darmstadt

Stoffspezifische Anteile an spektraler Extinktion im VIS-Bereich

XWC of DAD Spectral Data: 585.0 nm from Sample 3 (040901_BMR_AE... Max. 151.5 mAU.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Time, min

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

15010.1

7.7

9.3

13.6 14.08.9

12.9

XWC of DADSpectral Data: 585.0 nmfrom Sample3 (040901_BMR_AN_... Max. 74.9 mAU.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Time, min

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

757.7

7.913.5

10.09.5

1.0 8.63.02.8 3.3 13.23.81.9 6.54.9 11.55.8 6.7

63% TAHNDSDP2

9%TAHNDSDP1

2%TAHNDSDP3

5%UNK349/465

15%TAHNDSDP4

/UNK373

VIS - 585nm ANAEROB

12% TAHNDSDP2

65% TAHNDSDP42% TAHNDSDP3

12% UNK349/465

VIS - 585nm AEROB

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Stoffspezifische Anteile an spektraler Extinktion im UV-Bereich

XWC of DADSpectral Data: 270.0nm from Sample 3 (040901_BMR_AE... Max. 715.8mAU.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Time, min

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

70010.2

9.37.7

8.8

6.3 7.513.6 14.7

XWC of DADSpectral Data: 270.0 nm from Sample 3 (040901_BMR_AN... Max. 331.0 mAU.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Time, min

0

50

100

150

200

250

300

3312.4

7.7

6.55.9

10.05.5 7.9 9.38.8

7.3 13.60.1 12.1 14.55.13.3 11.73.9

54% p-Base

7%

ABESA/ABSEESA

4%

DPBE

3%

Sulfanil-

säure

9%

TAHNDSDP2

10%

TAHNDSDP4

77% TAHNDSDP4

1% ABESA/ABSEESA

6% TAHNDSDP2

6% UNK349/465

6% UNK343

UV - 270nm AEROBUV - 270nm ANAEROB

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Anaerobe/Aerobe Abbaubarkeit von Anaerobe/Aerobe Abbaubarkeit von FeedFeed--HauptHaupt-- und Nebenkomponentenund Nebenkomponenten

Farbige

Verbidungen

Nicht

abbaubar

Verbindung RT m/z Q1 m/z Q3 Feed AN AEAnaerobe

AbbaubarkeitAerobe

Abbaubarkeit

NAPB 4,0 241,9 132,9 + + + - +UNK384 5,5 384,2 275,2 + + + - +PBSE 6,1 280,2 171,2 + + + - +UNK145 7,0 145,1 65,0 + + + + +RB-OH 8,5 264,5 79,9 + + + + +RB5-H 8,8 370,5 370,5 + + + + -RB5-H+DPBE 8,9 925,2 861,2 + + - + -RB-NH2 9,2 530,0 316,9 + + - + -RB5-H-H2O 9,2 723,9 660,0 + + - + -

RB5-H+SO2 9,4 806,0 236,0 + + - + -

Di-RB5-H 9,7 1467,4 927,4 + - - + -UNK733 9,9 733,0 236,0 + + - + -

RB5-H-2H2O 10 705,9 642,0 + + - + -

ABSEESA 6,4 307,9 124,9 + + + - -ABSESA 6,6 264,2 81,2 + + + - ~

+ vorhanden/

gut abbaubar

- nicht gefunden/

schlecht abbaubar

~ Schwankende

Abbaubarkeit

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Anaerob/aerobe Abbaubarkeit vonAnaerob/aerobe Abbaubarkeit von IntermediatenIntermediaten

Nicht

abbaubar

Compound RT m/z Q1 m/z Q3 Feed AN AE

anaerobicdegradability

aerobicdegradability

p-Base 2,4 200 - + + - +DPBE 4,5 383,0 383 - + + - +Sulfanilsäure 5,2 171,8 79,9 - + + - +VPB 5,2 183,0 183 - + - - +HABSA 6,4 188,2 96,2 - + + - +RB5-H-PB 6,5 545,0 264,0 - + + + +UNK371 7,9 371,2 183,2 - + + - +UNK584 9,1 584,2 424,2 - + - - +UNK661 9,4 661,0 501,0 - + + - +UNK373 10,1 373,2 293,2 - + + ~ +

TAHNDSDP3 8,1 347,9 188,1 + + - - ~

RB5-H-PB 8,3 545,0 264,0 - + + + ~

TAHNDSDP3 8,9 347,9 188,1 - + + ~ ~

UNK386 7,8 358,0 278,0 - + + ~ ~

TAHNDSDP2 7,9 346,9 187,1 - + + - -

TANHDSDP1 8,1 345,9 186,1 - + - - -

UNK543 8,4 543,1 463,1 - + + - -

TAHNDSDP4 10,4 348,9 189,1 - + + - -

+ vorhanden/gut abbaubar

- nicht vorhanden/abbaubar

~ schwankende

Abbaubarkeit

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Arbeitskreis Prof. Dr. Astrid Rehorek AK Prozessanalytik, 1. Kolloquium 17.-18.11.2005, MERCK Darmstadt

PrimärePrimäre VerursacherVerursacher vonvon RückverfärbungenRückverfärbungen nachnach aeroberaerober BehandlungBehandlung

SO3HHO3S

HO NH

NH HO

TAHNDSDP2

SO3HHO3S

NH2NH2

HO HO

TAHNDSDP3

Strukturvorschlag

NH2S

O

OO

HO3S

ABSEESA

Meist hochsubstituierte aromatische Verbindungen (Naphthalinderivate)

Anionisch durch ein bis mehrere Sulfonsäuregruppen

Nebenkomponenten aus Farbstoff und auch Abbauprodukte der Farbstoffe

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2 3 4 5 6

-500

-400

-300

-200

-100

0

100

[mV

]

PB

RB5-H

TAHNDSDP2 DAD

RB5-H-PB

TAHNDSDP1

E0

E0 ~ -100mVRB5-H-PB

E0 > -100mVRB5-H-PB

TAHNDSDP1

TAHNDSDP2

RB5-H

E0 < -100mV

RB5-H-PBTAHNDSDP1

TAHNDSDP2

RB5-H

Einfluss des Einfluss des RedoxpotenzialsRedoxpotenzials auf die anaerobe Reduktionauf die anaerobe Reduktion

100%

90%

80%

70%

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%Zeit [d]-2 -1 0 1 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

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Einfluss des Einfluss des RedoxpotentialsRedoxpotentials auf den Abbau von C. I. auf den Abbau von C. I. ReactiveReactive Black 5 im anaeroben ReaktorBlack 5 im anaeroben Reaktor

SchwellenwertSchwellenwert --225 mV225 mV

Farbstoffe und ihre Nebenverbindungen

Abbauprodukte und Intermediate

Partial Least Square (PLS-1), The Unscrambler® v9.2

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Einfluss des Einfluss des RedoxpotentialsRedoxpotentials auf den Abbau von auf den Abbau von NavyNavy Blue im anaeroben ReaktorBlue im anaeroben Reaktor

Schwellenwert:Schwellenwert: ––255 mV (255 mV (TrichromieTrichromie--Versuch)Versuch)

Farbstoffe und ihre Nebenverbindungen

Abbauprodukte und Intermediate

Partial Least Square (PLS-1), The Unscrambler® v9.2

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Abhängigkeit des Abhängigkeit des RedoxpotenzialsRedoxpotenzials von Ethanolgabenvon Ethanolgaben

BMR AN Redox/ AN AE CSB/ Y/ EtOH

-600

-500

-400

-300

-200

-100

0

100

200

-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Zeit [d]

E0

[mV

]

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

CS

B [

gL

-1],

Y [

mM

L-1

d-1

],E

tOH

[m

L]

AN E0 CSB AN CSB AE Y EtOH

Kreislaufbetrieb

Stickstoffspülung

des Reaktors

(HRT 2-4 d)

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ErgebnisseErgebnisse Monitoring und Monitoring und OptimierungOptimierung derder BetriebsparameterBetriebsparameter

Die anaerobe Reduktion korreliert mit dem Redoxpotenzial – steuern!

Unvollständige Reduktion von Diazo-Farbstoffen

bei Redoxpotenzialen > -100mV

Autoxidation von Intermediat TAHNDSDP1 zu TAHNDSDP2/DP3/DP4

Raumbelastungen von 0,5-1,5 mML-1d-1 werden bei E0 < -100 mV

ausreichend reduziert, 1,5 - 5 mM -1d-1 benötigen E0 < -250 mV

Beurteilung des stoffspezifische Abbauverhaltens über Online-LC-DAD-

MS Monitoring und Identifizierung der Verursacher von Restfarbtigkeit

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Online monitoring of a bioprocess based on a multiOnline monitoring of a bioprocess based on a multi--analyser system analyser system and multivariate statistical process modellingand multivariate statistical process modelling

ChristianChristian CimanderCimander

Linköping University,Sweden

CarlCarl--FredericFrederic MandeniusMandeniusNovozymes Biopharma AB, Sweden

J. Chem. J. Chem. TechnolTechnol.. BiotechnolBiotechnol..

77, 115777, 1157--1168, 20021168, 2002

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Arbeitskreis Chemische VerfahrensArbeitskreis Chemische Verfahrens-- undund

Prozessanalysentechnik an der FH KölnProzessanalysentechnik an der FH Köln

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