MolBio Skript Grundkurse - helmholtz-muenchen.de · Molekularbiologisches / Gentechnologisches Praktikum für die gymnasiale Oberstufe Meine Oma sagt immer: „So was wie Gene kommen

Molekularbiologisches / Gentechnologisches Praktikum für Grundkurse (Halbtagspraktikum) Skriptum

Skriptversion: 28.06.2005

Name: Datum:

Molekularbiologisches / Gentechnologisches Praktikum für die gymnasiale Oberstufe Meine Oma sagt immer: „So was wie Gene kommen mir nicht ins Essen. Ich kaufe nur genfreie Tomaten!“ Um diese Vorurteile auszumerzen, bietet das Gläserne Labor ein Praktikum zum Thema „Die Gene in Dir!“ an. In einem Gemeinschaftsprojekt mit Schul- und Kultusreferat der Stadt München und Schule und Wissenschaft haben Sie und Ihre Grund- und Leistungskurse Biologie die Möglichkeit, entweder ein halb- oder ganztägiges Praktikum zu gentechnologischen Inhalten zu besuchen. Beim Halbtagespraktikum die Schülerinnen und Schüler einen genetischen Fingerabdruck, ähnlich, wie er auch in der Kriminalistik üblich ist. Darüber hinaus gewinnen sie ihre eigene DNA und konservieren sie in einem Amulett. Im Ganztagespraktikum erstellen die Kollegiatinnen und Kollegiaten eine Analyse ihrer eigenen DNA. Dabei lernen sie wichtige Methoden wie Arbeitsweise von Restriktionsenzymen, PCR, Erstellen und Auswerten einer Gelelektrophorese kennen. Auch der Restriktionsverdau und die Analyse von Lambda–Phagen-DNA und die Füllung eines Amuletts mit der eigenen DNA stehen hier auf dem Programm. Experimente

1. DNA Extraktion und Präzipitation 2. Der genetische Fingerabdruck

Inhalte: Markus Förg, Dirk Stiebler, Melanie Odenigbo, Anne Gallas Copyrights 2005: GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH, Neuherberg Mit freundlicher Unterstützung von BIO-RAD LABORATORIES und SCHULE UND WISSENSCHAFT

Molekularbiologie Versuch 1 – DNA Extraktion und Präzipitation

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DNA Extraktion und Präzipitation „Ein Amulett mit deiner eigenen DNA“

A) Allgemeines Desoxyribonukleinsäure (DNA) ist ein Molekül, das in allen Lebewesen vorkommt, einschließlich Bakterien, Pflanzen und Tieren, sowie in fast allen Zell typen. Die DNA trägt die genetische Information und ist verantwortlich für die Farbe von Haar, Augen und Haut, Größe, Gesichtszüge, Blutgruppe einer Person und für fast alles andere, das eine Person einzigartig macht. Sie trägt auch die Informationen, die die Zellen brauchen, um alle Funktionen ausführen zu können, die allen Mitgliedern einer Spezies oder al len Lebewesen gemein sind und wird so manchmal als biologischer „Plan“ bezeichnet. Ihr persönlicher „Plan“ ist eine Kombination von der Hälfte der DNA der Mutter (aus der Eizelle) und der Hälfte der DNA des Vaters (aus dem Sperma), entstanden während der Empfängnis. Alle Ihre Zellen enthalten dieses komplette Set an Anweisungen.

Jede DNA sieht gleich aus, wenn sie aus den Zellen extrahiert wurde, aber es ist aufregend, seine eigene DNA zu sehen und zu wissen, dass es das ist, was uns einzigartig und lebendig macht. In diesem Laborversuch werden Sie aus Ihren Wangenzellen Ihre eigene DNA extrahieren – eine Substanz, die ihren eigenen „Plan“ enthält. Sie werden dazu eine schnelle und einfache Methode anwenden, die Wissenschaftler routinemäßig einsetzen, um DNA aus verschiedenen Organismen zu extrahieren.

Jeden Tag machen Wissenschaftler neue Entdeckungen beim Studium der in der DNA kodierten Information. Das Verstehen der DNA eröffnet Möglichkeiten, Krankheiten zu kurieren, - die Hoffnung von Mil lionen von Menschen, die an verschiedenen genetischen Abweichungen und Syndromen leiden,- bessere Produkte aus biologischen Quellen herzustel len und sogar möglicherweise den Schlüssel zu längerem Leben zu finden. Wir beginnen nun zu verstehen, wer wir sind und warum wir unser genetisches Material untersuchen.

B) Versuchsprinzip Im Folgenden sollen Sie das Versuchsprinzip für die Extraktion und Präzipitation ihrer eigenen DNA entwerfen. Dazu konstruieren Sie vorerst eine möglichst einfache Methode, um die DNA aus Ihrem Körper zu isolieren! Tipps:

1. Wählen sie einen leicht gewinnbaren Zelltyp! 2. Überlegen sie sich, w ie sie die in den Zellen eingeschlossene DNA mit Alltagschemikalien des

Küchenbereichs isolieren können. 3. Wenn die Zelle lysiert ist, liegt die DNA im Gemisch mit einer Vielzahl von anderen Stoffen, v.a.

Proteinen, vor. Wie können sie diese aus dem Gemisch entfernen? 4. Liegt DNA in einer wässrigen Lösung vor ist sie zunächst noch unsichtbar. Wie kann man dafür

sorgen, dass die DNA aus der Lösung ausfällt? Dies sollte ohne Erhitzen geschehen, da DNA bei Temperaturen über 100°C sich beginnt zu zersetzen.

5. Suchen Sie an schwierigen Stellen das Gespräch mit einem Kursbetreuer!!! Sprechen Sie Ihre schrif tlich f ixierten mit einem Kursbetreuer ab und lassen sie sich die benötigten Chemikalien aushändigen!


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Entw urfsskizzen für den Versuchsablauf:


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D) Fragen Setzen Sie die Ergebnisse links m it den Arbeitsschritten rechts zusammen.

Ernte der Zellen A. Mit einem Wattestäbchen an der Innenseite der Wange schaben

Auflösen der Zellmembranen B. Zugabe von Protease, Inkubat ion bei 50°C

Präzipitieren der DNA C. Mischen mit einer Detergenz Lösung

Zerstören von Proteinen D. Kalter Alkohol w ird über den Zellextrakt geschichtet

Erniedrigen der DNA Löslichkeit E. Zugabe von Salz in Wasser

Molekularbiologie Versuch 2 – Der genetische Fingerabdruck

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Wer war der Täter? Der Genetische Fingerabdruck

A) Allgemeines DNA-Fingerprint ing w ird nun routinemäßig bei der Aufklärung von Verbrechen eingesetzt. In den vergangenen Jahren gab es neue Berichte, w ie mit kleinsten Mengen DNA einerseits Individuen identif iziert w urden, die in Vorfälle verw ickelt w aren, die sogar Jahre zurücklagen, andererseits Unschuldige von Anschuldigungen ent lastet w erden konnten.

DNA-Fingerprint ing w ird eingesetzt, sowohl in medizinischen und forensischen Anwendungen, als auch in Vaterschaftstests, um die genetischen Beziehungen zw ischen Individuen auf molekularer Ebene darzustellen. Dieser Versuch ermöglicht es in die Rolle eines forensischen Wissenschaftlers zu schlüpfen und einen posit iven Nachw eis durchzuführen. Ganz konkret bedeutet das, Sie simulieren einen Fall, wobei Sie echte DNA als Bew eis einsetzen und selbst herausf inden, w er der Täter w ar.

Im Rahmen dieses Versuchs analysieren Sie sechs verschiedene aufbereitete DNA-Proben. Eine dieser Proben von einem hypothet ischen „Tatort“ eines Verbrechens und fünf Proben von „Verdächtigen“ werden mit zw ei Restriktionsenzymen verdaut. Die dabei entstandenen DNA-Fragmente w erden mit einem Agarosegel aufgetrennt und mit der DNA-Färbelösung sichtbar gemacht. Nach Analyse der Muster der Restriktionsverdaus vergleichen Sie die Bew eise und ordnen dann die DNA eines Verdächtigen der am Tatort gefundenen DNA-Probe zu.

B) Versuchsdurchführung

Material: Eppendorf-Röhrchen (farbig sortiert), Styropor-Ständer, Gefäßständer, Microzentrifuge, Wasserbad ( 37°C), Gelelektrophorese-Ausrüstung

Chemi kalien: Ladepuffer, Enz ymmi x (EcoRI/PstI), Agarose, TEA-Puffer (1x), DNA-Färbelös ung

Versuchsablauf Bemerkungen

Schritt 1: Restriktionsverdau In diesem Schritt wird die vom Tatort aufbereitete DNA, sowie die aufbereitete DNA der fünf Verdächtigen mit den Restriktionsenzymen EcoR I und Pst I verdaut, damit unterschiedlich lange DNA-Fragmente entstehen.

1. Belassen Sie das Reaktionsgefäß mit dem Enzymgemisch „ENZ“ auf Eis!

Restriktionsenzyme bleiben auf Eis stehen, damit sie nicht jetzt schon aktiv werden.

2. Beschrif ten Sie neue, farblose Reaktionsgefäße w ie folgt:

CS = Tatort S1 = Verdächtiger 1 S2 = Verdächtiger 2 S3 = Verdächtiger 3 S4 = Verdächtiger 4 S5 = Verdächtiger 5

Setzen Sie die Reaktionsgefäße in den Styroporständer.


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3. Pipett ieren Sie 10 µl jeder DNA-Probe aus den

farbigen Vorratsgefäßen in das entsprechend beschriftete Reaktionsgefäß. Verwenden Sie für jede DNA-Probe eine frische Pipettenspitze. Die Proben sind auf den Boden jedes Reaktionsgefäßes zu übertragen.

Stammlösung: grün CS = Tatort blau S1 = Verdächtiger 1 orange S2 = Verdächtiger 2 violett S3 = Verdächtiger 3 rot S4 = Verdächtiger 4 gelb S5 = Verdächtiger 5

4. Pipett ieren Sie 10 µl des Enzymgemisches (ENZ) auf

den Boden jedes Reaktionsgefäßes. Verwenden Sie für jede ENZ Probe eine frische Pipettenspitze.

Auf diese Weise wird keine DNA von einem Röhrchen ins nächste „verschleppt“.

Die Reakt ionsgefäße mit den DNA-Proben sollten jetzt folgendes enthalten:

DNA-Proben EcoRI/P stI gesamtes (je 10 µl) Enzymm ischung Reaktionsvolumen Tatort (TO) 10 µl 20 µl Tatverdächtiger Nr. 1(V1) 10 µl 20 µl Tatverdächtiger Nr. 2(V2) 10 µl 20 µl Tatverdächtiger Nr. 3(V3) 10 µl 20 µl Tatverdächtiger Nr. 4(V4) 10 µl 20 µl Tatverdächtiger Nr. 5(V5) 10 µl 20 µl

5. Verschließen Sie die Reaktionsgefäße mit ihren

Kappen und mischen Sie die Komponenten mit dem Vortexer. Zentrifugieren Sie alle Proben, damit sich die Flüssigkeit w ieder am Boden des Gefäßes sammelt. (Die Reakt ionsgefäße müssen gegeneinander austariert in den Rotor posit ioniert w erden.)

Kursbetreuer zur Hilfe holen!!!

6. Setzen Sie die Reaktionsgefäße w ieder in den Styroporständer und inkubieren Sie 45 min bei 37°C im Wasserbad.

Die Restriktionsenzyme (EcoRI und PstI) beginnen beim Temperaturoptimum von 37°C jetzt die unterschiedlichen DNA-Moleküle an bestimmten Stellen, den Restriktionsschnittstellen, zu schneiden.

Beginnen Sie in der Zw ischenzeit Versuch 1!


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Schritt 2: Gelelektrophorese

1. Geben Sie 5 µl Ladepuffer „LD“ in jedes Reakt ionsgefäß, wobei Sie für jede Probe eine neue Pipettenspitze verwenden. Verschließen Sie die Reakt ionsgefäße und mischen Sie den Inhalt mit dem Vortexer.

Der Ladepuffer enthält einen Farbstoff, damit die Proben für die Beladung im Gel besser sichtbar werden, und Glycerin, was dazu führt, dass die Probe schwerer als Wasser ist.

2. Zentrifugieren Sie die Flüssigkeit in den Röhrchen ab, damit sich das ganze Volumen am Boden des Gefäßes bef indet.

3. Legen Sie ein Agarose-Gel in die Elektrophoresekammer. Füllen Sie diese mit soviel 1x TA E Puffer, bis das Gel mit mindestens 2mm Flüssigkeit bedeckt ist.

4. Vergew issern Sie sich, dass die Starttaschen des Agarosegels sich in der Nähe der schw arzen (-) Elektrode und der Boden des Gels sich nahe der roten (+) Elektrode bef indet.

An beiden Seiten des Labors befinden sich die Gelelektrophorese-Ausrüstungen. TEA-Puffer sorgt für einen konstanten pH-Wert von 8,0. Bei einem pH 8,0 ist die DNA negativ geladen und bewegt sich bei Anlegen einer Gleichspannung zur Anode (Pluspol).

5. Pipett ieren Sie das jew eils angegebene Volumen von

jeder Probe in der folgenden Reihenfolge in 7 Geltaschen, wobei Sie für jede Probe eine frische Spitze verwenden:

Bahn 1: M, DNA-Größenmarker, 20 µl Bahn 2: SC 20 µl Bahn 3: S1 20 µl Bahn 4: S2 20 µl Bahn 5: S3 20 µl Bahn 6: S4 20 µl Bahn 7: S5 20 µl

Die Pipette hierfür möglichst flach halten und die Pipettenspitze nicht ins Gel einstechen. Die Probe langsam in die Geltasche einfließen lassen. Benutzen Sie dabei beide Hände, eine zum Pipettieren, die andere zum Abstützen!

6. Setzen Sie den Deckel auf die Elektrophoresekammer.

Der Deckel lässt sich nur in einer Orientierung auf die Kammer setzen. Die roten und schw arzen Anschlussbuchsen am Deckel müssen mit den roten und schwarzen Buchsen am Unterteil übereinstimmen. Verbinden Sie die Elektroden mit dem Netzgerät.

7. Sagen Sie dem Kursbetreuer Bescheid, dass Sie mit dem

Beladen des Gels fertig sind. Die Elektrophorese läuft 30 Minuten bei 100 V.


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Durch die angelegte Spannung wandern die DNA-Moleküle entsprechend ihrer Ladung zur Anode (+-Pol) und trennen sich der Größe nach auf (kleine Moleküle w andern leichter und schneller durch das Maschenwerk des Agarose-Gels). 8. Am Ende der Elektrophorese schalten Sie das Netzgerät

ab und entfernen den Deckel der Kammer. Nehmen Sie vorsichtig den Gelträger mit dem Gel heraus. Achtung – das Gel ist sehr rutschig! Lassen Sie das Gel in die Färbeschale gleiten.

Schritt 3: Färbung der DNA Um die unsichtbare DNA, die im Gel bef indet, sichtbar zu machen gibt es ein spezielles Färbeverfahren. 1. Lassen Sie die Gele vom Gelträger in die Färbeschale

gleiten. Gießen Sie 100x Färbelösung in die Färbeschale, bis das Gel komplett bedeckt ist.

Färben Sie das Gel für genau 2 Minuten. Gießen Sie die 100x Lösung mit einem Trichter w ieder zurück in die Aufbew ahrungsf lasche.

Gel festhalten, damit es nicht aus der Färbeschale „flutscht“!

2. Spülen Sie das gefärbte Gel mit heißem Leitungsw asser (40-55°C) für ca. 30 Sekunden.

3. Gießen sie das Wasser ab und füllen Sie die Färbeschale w ieder mit heißem Leitungsw asser. Bew egen Sie die Gele einmal pro Minute leicht im Wasser.

4. Wiederholen Sie Schritt 3.

5. Gießen Sie das Wasser ab und füllen Sie die

Färbeschale w ieder mit heißem Leitungsw asser. Nehmen Sie die Färbeschale mit an Ihren Platz. Nachdem 2. Waschschritt können die DNA- Banden unscharf sein. Sie w erden innerhalb von 5-15 Minuten schärfer, da die Farbstoff-Moleküle in dem Gel dif fundieren und an die DNA binden.

Um einen möglichst großen Kontrast zu bekommen, kann es nötig sein, zusätzliche Waschschritte mit warmen Wasser durchzuführen. Entfärben Sie bis zum gewünschten Ergebnis.

Zur Dokumentation legen Sie das Gel in einer Folientasche auf eine helle Unterlage. Skizzieren Sie die Um risse, die Starttaschen und die Banden des Gels.

Kennzeichnen Sie, welche Probe zu welcher Bahn gehört!


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C) Auswertung: Quantitative Analyse der DNA-Fragmente Wenn Sie sich vor Gericht verantw orten müssten, würden Sie einer Übereinstimmung aufgrund der groben Abschätzung eines Laboranten vertrauen, oder würden Sie auf einer genaueren Meßmethode bestehen? Für einen genauen Vergleich zw ischen der DNA vom Tatort und der DNA des Tatverdächtigen kann man sich nicht nur auf eine Übereinstimmung nach Augenmaß verlassen, sondern man muss die Fragmentgröße quant itat iv (oder numerisch) bestimmen. Dies ist im Folgenden beschrieben: 1. Mit e inem Lineal w ird die Wanderungsstrecke jeder einzelnen Bande ausgemessen. Es w ird die

Strecke (in Millimetern) von der Unterkante der Starttasche bis zur Mitte der entsprechenden DNA-Bande gemessen und in die Tabelle auf der folgenden Seite eingetragen. Die Daten in der Tabelle werden benutzt, um eine Standardkurve zu erstellen, und so die Größen der Restrikt ionsfragmente der DNA vom Tatort und der Tatverdächtigen abzuschätzen.

2. Zur genauen Abschätzung der Fragmentgröße der Tatort-DNA und der DNA der Tatverdächtigen,

wird eine Standardkurve erstellt unter Verw endung der Abstands- (X-Achse) und Fragmentgrößendaten (Y-Achse) der Lambda/HindIII Größenmarker. Tragen Sie für die Banden 2-6 die Abstände in Abhängigkeit von der Größe sow ohl auf Millimeterpapier als auch auf halblogarithmisches Papier auf (s. folgende Seiten!). Verbinden Sie mit Hilfe eines Lineals auf allen Diagrammen die Datenpunkte mit einer Linie. Verlängern Sie die Linie bis zur rechten Seite des Diagramms.

3. Entscheiden Sie, w elches Diagramm, das lineare oder das halblogarithmische zur Abschätzung der DNA-Fragmentgrößen der Tatort-DNA und der Tatverdächtigen-DNA verwendet werden soll. Begründen Sie Ihre Wahl!

4. Zur Abschätzung der Größe eines unbekannten Tatort- oder Tatverdächtigen Fragments, bestimmen Sie die Wanderungsstrecke, die das Fragment zurückgelegt hat. Tragen Sie diesen Punkt auf der X-Achse der Standardkurve ein. Denken Sie sich von diesem Punkt auf der X-Achse eine Senkrechte bis zur Standardkurve und von da eine Waagrechte bis zur Y-Achse. Sie können die entsprechenden Hilfslinien auch mit dünnen Bleistif tstrichen einzeichnen, um sich das Vorgehen zu verdeutlichen. Dort, w o die Waagrechte die Y-Achse schneidet, kann die ungefähre Größe des unbekannten DNA-Fragments abgelesen w erden. Verfahren Sie entsprechend für alle DNA-Fragmente vom Tatort und von den Verdächtigen.

5. Vergleichen Sie die Fragmentgrößen der DNA vom Tatort mit denen der Tatverdächtigen. 6. Stimmen die Fragmentgrößen der DNA irgendeines Tatverdächtigen mit denen der DNA vom Tatort

überein?

7. Wie sicher sind Sie, dass hier eine Übereinstimmung vorliegt?


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Größe ca (Bp)

Verdächtiger 5

*** Abstand (mm)

Größe ca (Bp)

Verdächtiger 4

Abstand (mm)

Größe ca (Bp)

Verdächtiger 3

Abstand (mm)

Größe ca (Bp)

Verdächtiger 2

Abstand (mm)

Größe ca (Bp)

Verdächtiger 1

Abstand (mm)

Größe ca (Bp)

Tatort

Abstand (mm)

Reelle Größe (Bp)

10.000 8.000 6.000 5.000 4.000 3.000 dicke

Bande 2.000 1.500 1000 500

Lambda/HindIII Größenmarker Abstand

(mm)

Bande 1 2 3 4 5 6

7 8 9 10


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DNA Standard Laufstrecken der Banden

Zur Abschätzung der Größe eines Fragments, das von der unbekannten DNA am Tatort oder der eines Tatverdächtigen stammt, muss zunächst die Wanderungsstrecke dieses spezif ischen Fragments bestimmt werden. Tagen Sie diese Strecke auf der X-Achse der Standardkurve ein. Nehmen wir einmal an, die Bande Nr. 2 des Tatv erdächtigen Nr 5 sei 24 mm gewandert (A). Gehen Sie v on der 24 mm Marke auf der X-Achse senkrecht nach oben zur Standardkurve und markieren Sie die Schnittstelle mit der Standardkurve durch einen schraffierten Kreis (B). Zeichnen Sie durch diese Schnittstelle eine Waagrechte bis zur Y -Achse, dieser Wert entspricht der ungefähren Größe des Fragments (C). Bande 2 des Tatv erdächtigen 5 hat demnach ungef ähr die Größe v on 2000 Bp. Wiederholen Sie dieses Verf ahren f ür alle Fragmente der DNA v om Tatort und der Tatv erdächtigen. Tragen Sie die ungef ähren Fragmentgrößen in die Datentabelle ein.


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D) Interpretation der Ergebnisse

Kleben Sie an dieser Stelle die Skizze ihres Gels ein. Kennzeichnen Sie, w elche Probe zu welcher Bahn gehört.

Was soll hier bestimmt w erden? Formulieren Sie noch einmal unsere zentrale Frage.

1. Welche der DNA-Proben sind fragmentiert w orden? Wie w ürde das Gel aussehen, wenn keine Fragmentierung stattgefunden hätte?

2. Wodurch w urde die DNA fragmentiert?

3. Wovon hängt es ab, an w elcher Stelle eine Restriktionsendonuklease ein DNA-Molekül schneidet?


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4. Eine Restriktionsendonuklease „schneidet“ zwei DNA-Moleküle an der gleichen Stelle. Was haben diese beiden Moleküle an dieser Stelle demnach gemeinsam?

5. Sieht es so aus, als hätte die DNA von irgendeinem Tatverdächtigen EcoRI oder PstI

Erkennungsstellen an derselben Stelle auf dem Molekül w ie die DNA vom Tatort?

6. Sieht es aufgrund der obigen DNA-Sequenznalyse so aus, als stamme die DNA von einem der

Tatverdächtigen und die vom Tatort vom gleichen Individuum? Beschreiben Sie die w issenschaftliche Unterlage, auf die sich Ihre Schlußfolgerung stützt.

Hintergrundwissen: Restriktionsenzyme Restriktionsenzyme sitzen auf einem DNA-Molekül und gleiten entlang der Helix, bis sie spezif ische Basenpaarsequenzen erkennen, die dem Enzym signalisieren, anzuhalten. An dieser Stelle, der sogenannten „Restriktionsschnittstelle“, verdauen die Enzy me dann das DNA-Molekül (spalten es chemisch) - sie haben also gewissermaßen die Funktion von molekularen Scheren, die die DNA an bestimmten Basenpaarsequenzen schneiden.

Tritt eine spezif ische Restriktionsschnittstelle mehr als einmal in einem DNA-Molekül auf, so wird das entsprechende Restriktionsenzym an allen diesen Stellen schneiden und es entstehen mehrere Fragmente. Wenn also z.B. ein lineares Stück DNA-Molekül mit einem Restriktionsenzy m v erdaut wird, dessen spezif ischer Erkennungscode an zwei verschiedenen Stellen auf dem DNA-Molekül vorkommt, entstehen drei Fragmente unterschiedlicher Länge. Ist die DNA ringf örmig und wird sie mit einem Restriktionsenzym geschnitten, dessen spezif ische Erkennungsstelle an zwei v erschiedenen Stellen des DNA-Moleküls auftritt, so entstehen zwei Fragmente unterschiedlicher Länge. Die Länge der einzelnen Fragmente hängt dav on ab, wo sich die Restriktionsschnittstellen auf dem DNA-Molekül bef inden.

Werden Restriktionsenzyme dazu benutzt, einzelstränge ringförmiger DNA zu schneiden, (wie in diesem Kit v orgesehen) so entstehen Fragmente unterschiedlicher Größe. Durch Restriktionsenzy me geschnittene DNA kann durch Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt und sichtbar gemacht werden. Der Begriff Elektrophorese steht f ür: Wanderung unter dem Einfluß elektrischer Spannung.

Agarose- Gel-Elektrophorese

Bei der Elektrophorese werden die DNA-Fragmente nach ihrer Größe getrennt. Die DNA-Fragmente werden auf ein Agarose Trenngel geladen, das in eine Kammer gestellt wird, die mit einer elektrisch leitenden Pufferlösung gef üllt ist. Zwischen zwei Drahtelektroden an den beiden Enden der Kammer f ließt Gleichstrom. DNA-Fragmente sind negativ geladen und werden daher in einem elekrischen Feld v om positiven Pol angezogen. Die Matrix des Agarosegels dient dabei als molekulares Sieb, durch das kürzere DNA-Fragmente leichter hindurchwandern können als größere. In einem bestimmten Zeitabschnitt wandern kleinere Fragmente weiter als größere. Fragmente von der gleichen Größe bleiben zusammen und wandern in separaten DNA-„Banden“.


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Alternative DNA-Fingerprinting Szenarien DNA-Ty ping, DNA-Profiling und DNA-Fingerprinting sind alles Namen für ein und dasselbe Verfahren, nämlich ein Verf ahren, bei dem DNA verwendet wird, um eine Verwandtschaft oder Identität v on menschlichen, tierischen oder pf lanzlichen Individuen auf zuzeigen. DNA-Ty ping ist zu einem v iel diskutierten Thema geworden und hat großes Interesse geweckt, weil in gerichtsmedizinischen Analysen in prominenten Strafprozessen, wie dem Fall v on O.-J. Simpson davon Gebrauch gemacht worden ist. DNA-Ty ping f indet jedoch eine v iel breitere Anwendung als nur in der Gerichtsmedizin und hat einen tiefgreifenden Einf luß auf unsere Gesellschaft.

DNA-Ty ping wird in der Gerichtsmedizin, Anthropologie und in der Biologie im Bereich Naturschutz nicht nur dazu benutzt, die Identität eines Individuums zu bestimmen, sondern auch, um Verwandtschaftsbeziehungen nachzuweisen. Diese Methode hat dabei geholf en, unschuldige Tatv erdächtige wieder auf freien Fuß zu setzen, Kinder mit ihren Verwandten zusammenzuführen, gestohlene Tiere zu identif izieren und nachzuweisen, daß anstelle von Fisch Walfleisch zu Sushi v erarbeitet wurde. Sie wird in Kriegszeiten dazu benutzt, sterbliche Überreste von Gefallenen zu identif izieren. Sie wird weiterhin dazu v erwendet, genetische Merkmalskopplungen für v ererbliche Krankheiten zu f inden. Darüber hinaus lernen Wissenschaftler mit Hilfe der DNA-Analyse eine Menge über die Entwicklungsgeschichte des Menschen. Jeder der folgenden Abschnitte beschreibt ein Szenarium, bei dem auf grund einer DNA-Analyse gezeigt werden konnte, daß Individuen miteinander v erwandt sind, oder daß eine Person eine Straftat begangen bzw. nicht begangen hat. Diese Szenarien lief ern einen Kontext f ür die Erläuterung des DNA-Ty ping in den Fächern Molekularbiologie, Naturschutz Biologie und Biotechnologie. Lassen Sie die Schüler sich ein Gebiet aussuchen, das sie interessiert und anschließend ihre Ergebnisse der Klasse vortragen. 1. Identifizierung von Nahrungsmitteln (Identifizierung gefährdeter Arten)

Die Reinheit (oder Unreinheit) v on Rinderhack ist mit Hilf e von DNA-Ty ping nachgewiesen worden. Bei Hamburgern wurde gezeigt, daß sie oft eine Mischung aus Schweinehack und anderen Fleischarten enthalten. Mit Hilfe v on DNA-Ty ping und tragbaren Analysegeräten konnten Aufsichtsbeamte nachweisen, daß als Sushi angebotener Fisch in Wirklichkeit Wal- oder Delphinf leisch war. Oft handelt es sich hier um gefährdete Arten, die durch internationale Gesetze geschützt sind.

2. Angeklagte und verurteilte Verbrecher werden aufgrund von DNA-Typing auf freien Fuß gesetzt.

Ein Mann, der seit 10 Jahren im Gefängnis saß, wurde entlassen, nachdem mit Hilf e von DNA-Analysen, die zum Zeitpunkt der Verurteilung noch nicht zur Verfügung standen, bewiesen werden konnte, daß er die Vergewaltigung nicht begangen haben konnte. Statistiken zeigen, daß etwa ein Drittel aller mutmaßlicher Sittlichkeitsverbrecher aufgrund der DNA-Analyse freigesprochen werden.

3. Identifizierung sterblicher Überreste

Wissenschaftler konnten mit Hilfe von DNA-Typing bestätigen, daß ein Körper im Grab die Person war (oder auch nicht), die dort begraben sein sollte. In Russland wurden Knochen gefunden, von denen angenommen wurde, daß sie von den Romanovs, Rußlands letzter königlichen Familie, stammten. Zar Nikolaus II. und seine Familie wurden v on den Bolschewisten 1918 hingerichtet. Experten aus der ganzen Welt studierten die Knochen, um Schädel, Zähne und andere Merkmale mit Fotografien in Einklang zu bringen. DNA aus den Knochen wird mit der von bekannten Nachkommen der Familie verglichen, um zu bestimmen, ob die Knochen in der Tat v om Zaren und seiner Familie stammen.

4. Bestimmung des Verwandtschaftsgrades zwischen Menschen.

Durch DNA-Ty ping konnte nachgewiesen werden, daß ein 5000 Jahre alter „Eismann“, der in einem schmelzenden Gletscher gef unden wurde, mit modernen Europäern eng verwandt ist. („Iceman gets Real“, Science, Bd. 264, S. 1669, 17. Juni 1994). Die durch das DNA-Ty ping erhaltenen Daten „machen auch Schluß mit allen Gerüchten, daß der Körper ein Schwindel ist – d.h., daß er dort auf das Eis gelegt wurde“, so Sv ante Paabo v on der Univ ersität München (Science. Bd. 264, S. 1775, 17. Juni 1994).

5. Untersuchung des Verwandtschaftsgrades zwischen alten Kulturen.

Bei archäologischen Ausgrabungen im westlichen Montana gef undene DNA wird dazu benutzt, f estzustellen, wie v iele verwandte Menschengruppen (Familien) an einer bestimmten Stelle gelebt haben. (Morell Virginia. „Pulling Hair from the Ground“. Science, Bd. 265, S. 741-745, August 1994).

6. DNA-Untersuchungen der Familienzuigehörigkeit.

DNA-Untersuchungen der Familienzugehörigkeit sind in Argentinien und El Salv ador dazu herangezogen worden, die Kinder v on mindestens 9000 Bürgern dieser Länder, die zwischen 1975 und 1983 v erschwunden, d.h. von Spezialeinheiten des herrschenden Militärs und der Polizei entf ührt wurden, zu identif izieren. Viele leibliche Kinder dieser v erschwundenen Erwachsenen wurden gekidnappt und von militärischen „Eltern“ adoptiert, die v orgaben ihre leiblichen Eltern zu sein. Nachdem durch genetische Untersuchungen der Großfamilie die wahre Identität eines Kindes festgestellt wurde, konnte es


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zu seinen biologischen Verwandten gebracht werden. Es wurde zunächst befürchtet, daß der Transfer eines Kindes v on seinen militärischen „Eltern“, die zwar Kidnapper waren, aber das Kind jahrelang auf gezogen hatten, traumatisch sein könnte. In der Praxis wurden die Kinder mit geringem Trauma in ihre biologischen Familien integriert.

7. Identifizierung von Krankheiten verursachenden Organismen.

Eva Harris, eine Wissenschaftlerin der Univ ersität v on Kalif ornien in San Francisco, hilft Wissenschaftlern in Nicaragua und Ecuador die DNA-Methoden zu erlernen, um damit Tuberkulose entdecken, sowie das Dengue Virus und v erschiedene Leishmania Stämme identifizieren zu können. Auf die Ergebnisse derzeit angewandter Methoden, bei denen die Krankheitserreger kultiviert und dann zur Identifizierung an ausländische Labors geschickt werden, muß wochenlang gewartet werden. (Marcia Barinagra. „A Personal Technology Transf er Effort in DNA Diagnostics“ Science 266, S. 1317-1318, 25. November 1994).

8. Identifizierung der biologischen Eltern (Vaterschaftsbestimmungen)

Als in Florida ein Mädchen an einer Erbkrankheit starb, stellte es sich heraus, daß es mit einem anderen Mädchen bei der Geburt v ertauscht worden war. Die Krankheit kam in ihrer Familie nicht vor, aber es war bekannt, daß sie bei der Familie eines anderen Mädchens, das im selben Krankenhaus zu etwa derselben Zeit geboren worden war, auftrat.

9. Vaterschaftstest

Eine Frau die am 7. Januar 1943, ihrem 18. Geburtstag, v on ihrem Arbeitgeber v ergewaltigt worden war, wurde darauf hin schwanger. Das Kind wußte, wer sein Vater war, aber dieser bestritt die Vaterschaft, solange er lebte. Nach dem Tod des Mannes, wurde mittels DNA-Analyse nachgewiesen, daß sie seine Tochter war und so erbte sie die Hälf te seines Nachlasses. („A Child of Rape Wins Award from Estate of Her Father“. New York Times, 10. Juli 1994).

10. Bestimmung des Erfolgs einer Knochenmarktransplantation.

„DNA-Fingerprinting kann Ärzten helfen, Knochenmarktransplantationen zu überwachen. Leukämie ist ein Knochenmarkkrebs und das kranke Mark muß deshalb entf ernt werden. Das Knochenmark ist aber f ür die Herstellung neuer Blutzellen notwendig. Ohne eine Transplantation v on gesundem Knochenmark müßte ein Leukämiekranker also sterben. Durch DNA-Ty pisierung v on Patient und Spender können Ärzte schnell erkennen, ob eine Transplantation erfolgreich war. Im Erf olgsf all weist ein DNA-Fingerprint vom Blut des Patienten das DNA-Muster des Spenders auf. Wurde aber das krebsbef allene Knochenmark nicht vollständig zerstört, so werden sich die Krebszellen schnell v ermehren und die DNA-Banden des Patienten werden überwiegen“. („Our Ultimate Identity Card in Sickness and in Health.“ In „Inside Science“, New Scientist, 16. Nov. 1991).

11. Nachweis der Verwandtschaft zwischen Einwanderern.

DNA-Fingerprinting ist auch als Vaterschaftsnachweis zu Einwanderungszwecken verwendet worden. 1986 erhielt das Britische Innenministerium 12000 Einwanderungsanträge v on Witwen und Kindern v on Männern aus Bangladesch und Pakistan, die im Vereinigten Königreich lebten. Die Beweislast f ällt dem Antragsteller zu, wobei der Nachweis der Familienzugehörigkeit auf Grund lückenhafter Dokumente schwierig sein kann. Bluttests sind mitunter ohne Beweiskraft, aber Ergebnisse des DNA-Fingerprintings werden als Vaterschaftsnachweis v om Innenministerium akzeptiert. (DNA f ingerprints, source unknown. Based on A.J. Jeffreys et al., „Positiv e Identif ication of an Immigration Test-Case Using Human DNA Fingerprints.“ Nature, 317:818-819, 1985).

12. Bestätigung der Verwandtschaft zwischen Tieren. Wissenschaftler, die DNA aus Haaren v on Schimpansen aus verschiedenen Teilen Afrikas extrahiert haben, erhielten so Hinweise, daß möglicherweise eine dritte Art von Schimpansen existiert. Gleichzeitig haben sie Einsicht in das Verhalten v on Schimpansen und deren Familienbeziehungen gewonnen, die zu theoretisieren früher Jahre gedauert hätte. Sie entdeckten, daß eine in Westafrika lebende Schimpansengruppe sich genetisch von den in anderen Teilen Afrikas lebenden Schimpansen unterscheidet, was v ermuten läßt, daß es sich hierbei um eine gef ährdete Art handeln könnte. Die Wissenschaftler entdeckten, daß die in einem v orgegebenen Bereich lebenden männlichen Schimpansen oft so nahe v erwandt sind wie Halbbrüder und daß viele sogenannte Unterarten in Wirklichkeit zu einer einzigen Art gehören. Der hohe Verwandtschaftsgrad der männlichen Schimpansen kann vielleicht erklären, warum sich, anders als bei Primaten, die männlichen Schimpansen durchaus f reundlich gesonnen sind.

13. DNA-Analyse von Pflanzenmaterial weist nach, daß ein Tatverdächtiger am Tatort war. Zwei kleine Samenschoten auf der Ladef läche eines Kleinlastwagens, bewiesen, daß ein des Mordes Angeklagter am Tatort war. Genetische Tests ergaben, daß die DNA der Samenschote identisch war mit der DNA einer am Tatort gefundenen Pflanze. Der Angeklagte hatte bisher zwar zugegeben, dem Opf er eine Mitf ahrgelegenheit geboten zu haben, aber abgestritten, jemals in der Nähe des Tatorts gewesen zu sein.

Molekularbiologie Notizen

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Fragenkatalog zur Lernausstellung von Schule und Wissenschaft 1. Welche Bedeutung kommt der Gentechnik im 21 Jhd. zu?

2. Seit w ann w ird Gentechnik betrieben?

3. Was versteht man unter geklonten Lebew esen?

4. Was ist in vitro-Fertilisation?

5. Was versteht man unter therapeutischem Klonen?

6. Bei w eichem der Punkte 3-5 ist Gentechnik beteiligt?___________________________ 7. Welche Bedeutung hat Gregor Mendel, w elche Grundlagen schuf er?

8. Wer und durch w elche Experimente zeigte, dass die DNA die Trägerin der Erbinformationen

ist?

9. Durch w elche Fähigkeit kann die DNA ihre Erbinformation w eitergeben?


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10. Welche w ichtigen Synthesen w erden durch die DNA gesteuert und w ie heißen die

wichtigsten Schritte hierbei?

11. Wie ist die Erbinformation in der DNA gespeichert?

12. Was ist ein Gen?

13. Wann ist ein Gen aktiv?

14. Weiche Abschnitte haben Gene und w elche Rolle kommt diesen Abschnitten zu?

15. Zeigen sie den Zusammenhang zw ischen Körpermerkmalen und Genen auf!

Werkzeuge und 'Methoden der Gentechnik. 16. Was ist ein Plasmid

17. Weshalb sind Plasmide in der Gentechnik so w ichtig?


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18. Zeigen Sie die Schritte der Transformation, die E.coli in die Lage versetzt Insulin zu

produzieren, auf!

19. Was ist c-DNA; w oher stammt sie?

20. Wann w ird c-DNA eingesetzt?

21. Was ist für viele Leute am Anbau transgener Pflanzen im-Freiland so bedrohlich?

22. Wodurch könnte man das Problem aus Frage 21 lösen?

23. Eine der w ichtigsten Techniken der Gentechnik ist die Polymerase Kettenreakton. Was ist

der große Vorteil einer PCR?

24. Nennen Sie die Hauptschritte einer PCR!


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25. Welche medizinischen Diagnosen sind heute m.H. von PCR und Gensonden möglich?

Gentechnik und Medizin 26. Nennen Sie drei Heilmittel, die heute mit gentechnischen Methoden hergestellt w erden!

27. Nennen Sie zw ei Tests in der Medizin, die m. H. der Gentechnik möglich sind! Beschreiben

Sie einen davon!

28. Wie funktioniert ein Genchip?

Gentherapie 29. Welche zw ei Bereiche unterscheidet, man beim Einsatz von Gentherapie?


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30. Schildern Sie kurz eines der möglichen Verfahren!

31. Was sind HERVS, w ozu taugen sie?

Der genetische Fingerabdruck 32. Worauf beruht der genetische Fingerabdruck durch RFLP? (kurze Erläuterung!)

Wie w ird er vererbt?______________________________________________________________

Wozu lässt er sich einsetzen?______________________________________________________

33. Was ist STR und w elche Vorteile bietet es?

Das Humangenomprojekt 34. Wie hoch ist der Anteil codierender DNA?_________________________________________ 35. Was w urde beim Humangenomprojekt entschlüsselt?

36. Wie w aren hier die einzelnen Schritte des Vorgehens?


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37. Wie w erden Gene entziffert? Schilderung des Ablaufs in Stichpunkten!


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>Das GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit Die GSF konzentriert ihre Forschungsarbeiten auf eine der wichtigsten Fragen unserer Gesellschaft, die Gesundheit des Menschen in seiner Umwelt. Ziel ist es, Risiken für die menschliche Gesundheit durch Umweltfaktoren zu erkennen, Mechanismen der Krankheitsentstehung zu entschlüsseln sowie Konzepte zu entwickeln, um die Gesundheit des Menschen und seine natürlichen Lebensgrundlagen auch für die Zukunft zu schützen. Als Forschungseinrichtung des Bundes und des Freistaats Bayern mit Sitz in Neuherberg, im Norden Münchens, sind wir Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft, der größten öffentlichen Forschungsorganisation Deutschlands. > Über das Gläserne Labor Das Gläserne Labor wurde speziell für Schülerinnen und Schüler eingerichtet. Hier sollen sie zu bestimmten naturwissenschaftlichen Themen möglichst eigenständig, aber natürlich nach Anleitung, experimentieren und dabei entdecken, wie faszinierend naturwissenschaftliche Phänomene sind und Spaß haben an der Experimentier- und Forschertätigkeit. Zusätzlich sollen die Schülerinnen und Schüler die GSF als Forschungseinrichtung kennen lernen und verstehen, wie Grundlagenforschung funktioniert und warum sie wichtig bzw. nötig ist. Je nach Thema werden aktuelle Forschungsprojekte der GSF vorgestellt. Das GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit übernimmt als Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft Verantwortung für die Qualität der naturwissenschaftlich-technischen Bildung unserer Kinder. Das Gläserne Labor dient als Institution, um dieser Anforderung durch unterrichtsergänzende Angebote gerecht zu werden. Es wurde am GSF – Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit mit großzügiger finanzieller Unterstützung der Helmholtz-Gemeinschaft eingerichtet. > Weitere Informationen Besuchen Sie uns im Internet. Dort finden sie aktuelle Informationen und das Anmeldeformular: www.gsf.de/gsf-lab Bei Fragen stehen wir telefonisch unter 089. 3178 – 2725 zur Verfügung. Auf ein baldiges Wiedersehen freut sich ihr Team vom Gläsernen Labor! Gläsernes Labor Abteilung Öffentlichkeitsarbeit GSF – Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit Ingolstädter Landstrasse 1 85764 Neuherberg

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MolBio Skript Grundkurse - helmholtz-muenchen.de · Molekularbiologisches / Gentechnologisches Praktikum für die gymnasiale Oberstufe Meine Oma sagt immer: „So was wie Gene kommen