Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik

Dr. Felix [email protected]

Loop-mediated isothermal Amplification (LAMP)

Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze

Dr. Felix [email protected] 13.01.2012

Seite 2Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze

Warum überhaupt Gewürze?

• Die Vielseitigkeit der Gewürz-Matrices lässt eine Anpassung der

entwickelten Methoden an andere Fragestellungen in der

Lebensmittelanalytik erwarten.

• Aktuelle Methode „der Wahl“ für

die Differenzierung von Gewürzen:

Mikroskopie �

• Molekularbiologische Methoden

können von nicht speziell geschultem

Personal angewendet werden.



Was sind das für Methoden?

• Nachweis von Organismen über ihre DNA.→ Ähnliche Methoden werden z.B. in der Forensik genutzt.

→ Jeder Organismus enthält seine (spezifische) DNA.

→ Lebensmittel stammen (fast immer) aus Organismen.

• Etablierte Methode: PCR

(Polymerasekettenreaktion)→ Spezifische DNA-Abschnitte

werden kopiert und somit

nachgewiesen

-100

300

700

1100

1500

0 5 10 15 20 25

Zyklus

DN

A M

enge

.

Endpunkt

ExponentiellePhase



500 g Backmischung

2 mg Senf0,1 mg

Kreuzkraut

125 gRucola

Mittels PCR können wenige ppm nachgewiesen werden:



Loop-mediated isothermal Amplification (LAMP)

• Im Jahre 2000 von Notomi et al. zuerst beschrieben.

Kaum Methoden zu Lebensmittelzutaten (-kontaminanten).

• Isothermale Methode zur Amplifikation von DNA.

Reaktion ohne Thermocycler / außerhalb eines Labors.

• Größerer Substratumsatz im Vergleich zur PCR.

Detektion mit bloßem Auge / außerhalb eines Labors.



DNA-Isolierung- Einheitliche Methode zur Isolierung der DNA aus allen betrachteten Gewürzen

Endpunkt PCR- als Gewürz-Nachweis

Real-time PCR- zur quantitativen Bestimmung

Endpunkt LAMP- als Gewürz-Nachweis?

Real-time LAMP- zur quantitativen Bestimmung?- Charakterisierung der LAMP- Ermittlung des Leistungspotentials

Entwicklung, Optimierung und Validierung:



Ergebnis: LAMP als Gewürz-Nachweis (Beispiel: Schwarzer Senf)

M[bp]

1000

500

100

3000

negativ S. alba B. nigra C. carvi

(Agarosegel, 2 %, Ethidiumbromidfärbung)



Quantitative Bestimmung mittels real-time-LAMP?(Beispiel: Kümmel)

• Endpunkt LAMP:

→ Reaktionsansatz ergänzt

um SYBR Green I.

→ Reaktionsbedingungen

optimiert.

→ Fluoreszenz-Messung

im real-time-Cycler.-500

100

700

1300

1900

0 20 40 60 80 100

Zeit [min]

rel.

Flu

ores

zenz

.



-100

300

700

1100

1500

0 5 10 15 20 25

Zyklus

rel.

Flu

ores

zenz

.

-500

100

700

1300

1900

0 20 40 60 80 100

Zeit [min]

rel.

Flu

ores

zenz

.

real-time LAMP

real-time PCR



-500

100

700

1300

1900

0 20 40 60 80 100

Zeit [min]

rel.

Flu

ores

zenz

.

X

Messgröße:→ PCR: Ct-Wert (Schwellenwert-Zyklus).

→ LAMP: Tt-Wert (Schwellenwert-Zeit).



-500

1000

2500

4000

5500

35 55 75 95 115

Zeit [min]

rel.

Flu

ores

zenz

.

.

Korrelation zwischen Tt-Wert und DNA-Gehalt:

Gehalt an Kümmel in einer Backmischung



• Ein Nachweis der Gewürze ist mittels LAMP genauso wie mit der konventionellen PCR möglich.

• Mit Hilfe der real-time LAMP können Gewürzgehalte quantitativ erfasst werden.

• Die Leistungsgrenzen der LAMP liegen in ähnlichen Bereichen wie die der PCR.

• Wo sind die Vorteile der LAMP?

Die Vorteile der LAMP gegenüber der PCR?



Vor-Ort-Analysen mittels LAMP?

UV UV

Calcein

Mg2+

Calcein

Mn2+LAMP

Mg2+

Mg2+

Mg2+

Mg2+

Mg2+

Mg2+

dNTPs

dNTPs Mg2P2O7Mn2P2O7

• Die Amplifikation kann mit Hilfe einer „konstanten“Wärmequelle (ohne Thermocycler) durchgeführt werden.

• Welche Möglichkeiten der Detektion bieten sich neben Agarosegelelektrophorese und real-time Analysen?



Calcein + weißes Licht Calcein + weißes Licht + UV-Licht

Calcein + UV-Licht weißes Licht ohne Calcein

+ +- - + +- -

+ +- - + +- -

Calcein + weißes Licht Calcein + weißes Licht + UV-Licht

Calcein + UV-Licht weißes Licht ohne Calcein

+ +- - + +- -

+ +- - + +- -

Detektion mit Calcein (Beispiel: weißer und schwarzer Senf)



Zusammenfassung - LAMP

• Die LAMP ermöglicht einen qualitativen Nachweis und eine quantitative Bestimmung von Gewürzen in Lebensmittelmatrices.

• Durch isothermale Reaktionsprotokolle und Detektionsverfahren mit dem bloßen Auge ermöglicht die LAMP eine Analytik „vor Ort“.

• Fazit: Die LAMP stellt für die Lebensmittelanalytik eine leistungsfähige Methode mit großem Potential in der Vor-Ort-Analytik als Alternative zur PCR dar.



Zusammenfassung - Überblick

• Methoden zur DNA-Isolierung aus Gewürzen. Anwendbarkeit der

Methoden auf andere Lebensmittelmatrices (z.B. Kaffee) [1].

• MDA-basierte Präamplifikation zur Verbesserung des DNA/Inhibitor-

Verhältnisses für „schwierige“ Matrices (z.B. Nelke, Piment) [1].

• PCR-Nachweise für 18 Gewürze. Erweiterung der Methode z.B. für die

Artendifferenzierung von Kaffee [1].

• Real-time PCR für die quantitative Bestimmung von allergenen Gewürzen

(z.B. Senf und Sellerie). Erweiterung der Methode auf eine aktuelle

Fragestellung (Kreuzkraut in Rucolasalat) [2].

• LAMP-Methoden als Alternative zur PCR [3].

[1] Focke et al. (2011) ”DNA-based identification of spices: DNA isolation, whole genome amplification and polymerase chain reaction“[2] Focke et al. (2011) “Determination of plant contaminants in food using real-time-PCR”[3] Focke et al. (in prep.) “Development of Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Methods as a Tool for Food Analysis”



...für die Aufmerksamkeit!... meinen Diplomanden

→ Christian Schoefinius→ Johanna Schiller→ Dominique Tressat→ Sonja Schüssler→ Qi Chen→ Malte Oetting→ Annika Sötje→ Sandra Lorenz

für die tollen Arbeiten!

...für die Unterstützung

→ Prof. Dr. Markus Fischer→ Dr. Ilka Haase→ Philipp Brüning

Danke...



... den Sponsoren:

Danke...

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