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Molekulare PräsentationstechnikenPhage Display
Gentechnik und Genomics WiSe 2007/2008
Kristian M. Müller
Institut für Biologie III
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Pharma-Biotech Umsatz in den USA
Nature Biotechnology2007 25 1097
Wie macht man Antikörper?
• Immunisierung -> Hybridoma -> Humanisierung
• Natürliche humane Bibliotheken -> Selektion -> IgG Klonierung
• Künstliche Bibliotheken -> Selektion -> IgG Klonierung
Der neue Weg zu Antikörpern
immunology today 2000 21 371
Neue Bindemoleküle
Current Opinion in Structural Biology 2007, 17:481
Fab Fn3
AnkyrinZ-Domäne „Affibody“
Lipocalin „Anticalin“
Kamel VH
Künstliche Diversität
Möglichkeiten der verzufallten Synthese
nnktotal 32
vantotal 12
vnntotal 48
vdntoal 36
rnntotal 32
vwntotal 24
dyntotal 24
A = Ala 2 6.25 - 4 - 4 - 4
C = Cys 1 3.13 - - - - - -
D = Asp 1 3.13 2 2 2 2 2 -
E = Glu 1 3.13 2 2 2 2 2 -
F = Phe 1 3.13 - - - - - 2
G = Gly 2 6.25 - 4 4 4 - -
H = His 1 3.13 2 2 2 - 2 -
I = Ile 1 3.13 - 3 3 3 3 3
K = Lys 1 3.13 2 2 2 2 2 -
L = Leu 3 9.38 - 4 4 - 4 2
M = Met 1 3.13 - 1 1 1 1 1
N = Asn 1 3.13 2 2 2 2 2 -
P = Pro 2 6.25 - 4 - - - -
Q = Gln 1 3.13 2 2 2 - 2 -
R = Arg 3 9.38 - 6 6 2 - -
S = Ser 3 9.38 - 2 2 2 - 4
T = Thr 2 6.25 - 4 - 4 - 4
V = Val 2 6.25 - 4 4 4 4 4
W = Trp 1 3.13 - - - - - -
Y= Tyr 1 3.13 - - - - - -
TAG stop 1 3.13 - - - - - -
TCAG
UUU F 21.7 UCU S 9.1 UAU Y 16.2 UGU C 5.1
UUC F 16.7 UCC S 8.9 UAC Y 12.4 UGC C 6.4
UUA L 13.4 UCA S 7.6 UAA * 2 UGA * 0.9
UUG L 13.2 UCG S 8.7 UAG * 0.3 UGG W 14.4
CUU L 11.1 CCU P 7 CAU H 12.6 CGU R 21.1
CUC L 10.7 CCC P 5.3 CAC H 9.8 CGC R 21.5
CUA L 3.9 CCA P 8.4 CAA Q 14.7 CGA R 3.6
CUG L 51.9 CCG P 22.8 CAG Q 29 CGG R 5.5
AUU I 29.8 ACU T 9.4 AAU N 18 AGU S 8.8
AUC I 25.1 ACC T 23.1 AAC N 21.8 AGC S 15.7
AUA I 4.9 ACA T 7.5 AAA K 34.4 AGA R 2.5
AUG M 27.4 ACG T 14 AAG K 11.2 AGG R 1.5
GUU V 19 GCU A 16.1 GAU D 32.1 GGU G 25.3
GUC V 14.9 GCC A 25.2 GAC D 19.5 GGC G 29.2
GUA V 11.2 GCA A 20.4 GAA E 39.9 GGA G 8.3
GUG V 25.8 GCG A 32.8 GAG E 18.4 GGG G 11.0
T
C
A
G
T C A G
R= A/G Y= C/T M= A/C K= G/T S= C/G W= A/T
H= A/C/T B= C/G/T V= A/C/G D= A/G/T
N= A/C/G/T
Trinukleotide
Nucleic Acids Res 1994 22 5600
Künstliche Diversität in einer Antikörperbibliothek
Phage Display
Phagen koppeln in einer leicht zu handhabbaren und stabilen Form Genotyp und Phänotyp
Bevorzugt werden filamentöse Phagen (fd, M13):• die Phagengröße kann sich der Genomgröße
anpassen• die Phagen lysieren die Zellen nicht• der Terminus eines Hüllproteins (genIIIprotein) ist
leicht zugänglich.
Der Lebenszyklus eines filamentösen Phagen
Phage im Elektronenmikroskop
Figure 4
P3 (5 Kopien)
P6P7 (5 Kopien)
P9 (5 Kopien)P8
(ca. 2300 Kopien)
Gene of interest Gene3
Phagen Genom
Peptide of interest
N1
C
C
C N2
N2
N2
N1
N1
Der schematische Aufbau eines Phagen
ca. 1 µm lang (je nach DNA)ca. 7 nm Durchmesser
Das Genom des M13 Phagen
Gene und Proteine des Phagen
Gen3Protein und Phageninfektion
Die Vermehrung eines filamentösen Phagen
ca. 100 bis 200 RF DNA in 15 min
Molecular Cloning Manual
Phage-Display Übersicht
Phagenselektion
Immunoröhrchen
belegen
Phagen
binden
Phagen
waschen
Phagen
eluieren
Phagenproduktion
Plaques / infizierte Zellen
auf Agar-PlatteZellen in
Flüssigkultur PEG/NaCl-Fällung
Titerbestimmung
Zellen
infizieren
Elution
Mirror-Image Phage Display
L-Base
L-Base
• Directed coating of D-peptide via Streptavidin-Biotin.
• Selection of L-peptide library displayed on phage.
Washing stepBinding
Erfinder des Phage DisplayGeorge P. Smith
• Born in Norwalk, Connecticut, 1941. A.B. degree in biology from Haverfored College, 1963
• Year as a high-school teacher and laboratory technician
• Ph.D. in bacteriology and immunology from Harvard University, 1970.
• Postdoctoral fellowship with Oliver Smithies at the University of Wisconsin
• Assistant Professor at the Division of Biological Sciences at the University of Missouri in Columbia, 1975
• Associate and Full Professor
“Filamentous fusion phage: novel expression vectorsthat display cloned antigens on the virion surface.”
Science. 1985 Jun 14;228(4705):1315-7
Phage, Phagemid und Helfer-Phage
• Phagmid ist ein Plasmid mit f1 ori
• Helfer-Phagen sind verpackungsdefiziente Phagen (z.B. M13K07 mit Mutation im genII)
• Infektion mit einem Helfer-Phagen führt zur Herstellung von Einzelstrang-DNA und Verpackung des Phagmids.
Phagenpräsentations-Formen
geneVIII
geneIII
library
Phage Display
mosaicPhage Display
PhagemidDisplay
Helfer Phage
Phagmid Smith & Petrenko Chem. Rev. 1997, 97, 391.
Disulfidbrücken ermöglichen leichte Elution
Bild: Morphosys
weitere Selektionstechniken
5‘Poly(AAA)‘3
5‘Poly(AAA)‘3
5‘Poly(AAA)‘3
5‘Poly(AAA)‘3
In vitrotranscription
In vitro translation
Ligand selection on target
Protein tethered to ribosome via cold shock or chloramphenicol
Immobilized target
Dissociation of ribosomeand release of mRNA
5‘Poly(AAA)‘3
mRNA
Isolation of mRNA
RT-PCR
dsDNA
Mutagenesis by error-prone PCR
Ribosome Display
Protein-Fragment Complementation Assay (PCA)
AmpR
proteinA mDHFR frag1
A-DHFR[1]
CamR
proteinB mDHFR frag2coding
for
codingfor plasmid: B-DHFR[2]plasmid:
proteinA
proteinB
mDHFRfragment1
mDHFRfragment2
cotransformationinto E. coli
Interacting partners Non-interactingpartners
colonies no colonies
Minimal medium, trimethoprim
sequencinggrowth competition
Single-step selection
Pelletier et al. Nature Biotechnol. 1999, Arndt et al. JMB 2000, Arndt et al. Structure 2002
target:c-Jun
peptidelibrary
mDHFRfragment1
mDHFRfragment2
+
A) Targeting c-Jun
Selection for interaction
c-Jun / FosW
target:c-Fospeptide
library
mDHFRfragment1
mDHFRfragment2
+
B) Targeting c-Fos
Selection for interaction
JunW / c-Fos
Finding Interaction Partners for cJun and cFos