Molekulargenetische Untersuchungen im Kandidatengen HADHA ...darwin.bth.rwth-aachen.de/opus3/volltexte/2009/2582/pdf/Ahillen_Ines.pdf · Das HELLP-Syndrom als schwere Form der Präeklampsie

Molekulargenetische Untersuchungen im Kandidatengen HADHA

bei Patientinnen mit HELLP-Syndrom und deren Kindern

Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen

zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Medizin

genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Ines Ahillen

aus

Haselünne Berichter: Herr Universitätsprofessor Dr. med. Klaus Zerres Herr Universitätsprofessor Dr. med. Werner Rath Tag der mündlichen Prüfung: 13. August 2008 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

Veröffentlichung

Einige Aspekte der Arbeit wurden vorab veröffentlicht:

Mutze S, Ahillen I, Rudnik-Schoeneborn S, Eggermann T, Leeners B, Neumaier-Wagner PM,

Kuse S, Rath W, Zerres K.

Neither maternal nor fetal mutation (E474Q) in the alpha-subunit of the trifunctional protein

is frequent in pregnancies complicated by HELLP syndrome.

J Perinat Med. 2007;35(1):76-8.

Meiner Großmutter H.S.

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis................................................................................................................

I

1. Einleitung.........................................................................................................................

1

2. Allgemeine Grundlagen.................................................................................................. 2

2.1. Hypertensive Schwangerschaftserkrankungen............................................................ 2

2.1.1 Das HELLP-Syndrom.............................................................................................. 4

2.1.2 Pathophysiologie und Konzepte zur Ätiologie der Präeklampsie............................ 9

2.1.2.1 Inadäquate Trophoblastinvasion und maternale Endothelzelldysfunktion......... 9

2.1.2.2 Veränderungen des Lipidstoffwechsels.............................................................. 11

2.1.2.3 Oxidativer Stress………………………………………………………………. 11

2.1.2.4 Immunmaladaptation………………………………………………………….. 12

2.1.2.5 Vasoaktive Substanzen....................................................................................... 13

2.1.2.6 Genetische Aspekte............................................................................................. 13

2.1.3 Pathophysiologie und Konzepte zur Ätiologie des HELLP-Syndroms................... 16

2.2. Angeborene Defekte der mitochondrialen β-Oxidation............................................... 18

2.2.1 Die mitochondrialen β-Oxidation............................................................................ 18

2.2.2 LCHAD-Defekt (MIM143450)/ MTP-Defekt (MIM251890)................................. 21

2.2.2.1 Molekulare Grundlagen...................................................................................... 23

2.2.2.2 Mutationsspektrum.............................................................................................. 24

2.3 Klinische Assoziation von LCHAD-Defekt und HELLP-Syndrom............................. 26

2.4 Fragestellung und Ziele der Arbeit...............................................................................

29

3. Material und Methoden.................................................................................................. 31

3.1 Patientenkollektive und Kontrollgruppen..................................................................... 31

3.1.1 Gesamt-Patientenkollektiv....................................................................................... 31

3.1.1.1 Patientenkollektiv der Restriktionsanalyse zu G1528C...................................... 31

3.1.1.2 Patientenkollektiv der SSCP-Analyse................................................................. 32

3.1.2 Kontrollgruppe......................................................................................................... 33

3.2 Arbeitsmaterialien......................................................................................................... 33

3.2.1 Chemikalien............................................................................................................. 33

3.2.2 Enzyme, Feinchemikalien und Kits......................................................................... 34

Inhaltsverzeichnis

II

3.2.3 Primer....................................................................................................................... 34

3.2.3.1 Primer der SSCP-Analyse und der Sequenzierungen......................................... 34

3.2.3.2 Primer der Restriktionsanalysen......................................................................... 35

3.2.4 Geräte und Arbeitsutensilien.................................................................................... 36

3.3 Methodik....................................................................................................................... 37

3.3.1 Präparation der DNA............................................................................................... 37

3.3.1.1 DNA-Isolierung aus EDTA-Blut........................................................................ 37

3.3.1.1.1 Nicht toxische Aussalzmethode..................................................................... 37

3.3.1.1.2 DNA-Extraktion mittels Filtration................................................................. 39

3.3.1.2 Reinigung der DNA............................................................................................ 39

3.3.1.3 Quantifizierung der DNA mittels Photometer.................................................... 40

3.3.2 Amplifikation der zu analysierenden DNA-Abschnitte........................................... 41

3.3.3 Elektrophoretische Auftrennung der Nukleinsäuren................................................ 43

3.3.3.1 Agarosegelelektrophorese................................................................................... 43

3.3.3.2 Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)........................................................... 44

3.3.3.2.1 Native Polyacrylamidgelelektophorese und Silberfärbung............................ 45

3.3.4 Single-strand conformational polymorphism-Analysis (SSCP-Analyse)................ 47

3.3.5 DNA-Sequenzierung................................................................................................ 49

3.3.6 Restriktionsanalysen................................................................................................ 52

3.3.6.1 Restriktionsanalyse zur Mutation G1528C......................................................... 52

3.3.6.2 Restriktionsanalyse zur Bestimmung von Häufigkeiten

identifizierter Sequenzvarianten in einem Kontrollkollektiv.............................. 54

3.4 Statistik..........................................................................................................................

55

4. Ergebnisse........................................................................................................................ 56

4.1 Ergebnisse der Restriktionsanalyse zu G1528C........................................................... 56

4.2 Ergebnisse der SSCP-Analyse...................................................................................... 56

4.2.1 Exon 1, c.130G>T, 5´-untranslated-region (5´-UTR).......................……………... 58

4.2.2 Fragment zu Exon 12............................................................................................... 59

4.2.3 Fragment zu Exon 16: c.1751-25T>G, Intron 15.................................................... 59

4.2.4 Exon 18, c.2111C>T, L661L….………………………………………………….. 61

4.2.5 Musterunabhängige Varianten................................................................................. 62

4.3 Ergebnisdarstellung in Anbetracht des Häufigkeitsvergleichs..................................... 63

4.3.1 Exon 1, c.130G>T, 5ÚTR..............................................................…………….... 64

Inhaltsverzeichnis

III

4.3.2 Fragment zu Exon 16: c.1751-25T>G, Intron 15………….……………………... 64

4.3.3 Exon 18, c.2111C>T, L661L….………………………………………………….. 65

4.3.4 Restriktionsanalyse zu G1528C...............................................................................

65

5. Diskussion........................................................................................................................ 66

5.1 Diskussion der Konzeption und Analyseverfahren....................................................... 67

5.1.1 Konzeption............................................................................................................... 67

5.1.2 Die SSCP-Analyse: Anmerkungen zur Sensitivität der Methode............................ 68

5.2 Inhaltliche Ergebnisdarstellung..................................................................................... 71

5.3 Einordnung der Ergebnisse in den derzeitigen Forschungsstand..................................

73

6. Zusammenfassung...........................................................................................................

81

7. Literaturverzeichnis........................................................................................................

83

8. Abbildungsverzeichnis....................................................................................................

102

9. Tabellenverzeichnis.........................................................................................................

103

10. Danksagung...................................................................................................................

104

11. Lebenslauf...................................................................................................................... 106

1. Einleitung

1

1. Einleitung

Das HELLP-Syndrom stellt unbehandelt eine lebensbedrohliche Erkrankung der Frau in der

Schwangerschaft dar. Es wird zum Formenkreis der hypertensiven Schwangerschafts-

erkrankungen gerechnet und betrifft bis zu 9 von 1000 Schwangerschaften. Seit Jahrzehnten

wird intensiv nach den Ursachen der hypertensiven Schwangerschaftserkrankungen geforscht,

unter anderem um kausalitätsbezogene Therapiekonzepte entwickeln zu können. Mit Voran-

schreiten der technischen Möglichkeiten rückt die Erforschung genetischer Zusammenhänge

zunehmend in den Vordergrund. Eine familiäre Häufung der Erkrankungen dieses Formen-

kreises ist bereits seit Mitte der 60iger Jahre bekannt.

Seit 1993 wurde vielfach das maternale Auftreten des HELLP-Syndroms bei Vorliegen eines

hereditären Defekts der mitochondrialen β-Oxidation des Fetus in den entsprechenden

Schwangerschaften beschrieben. Die Häufung der Schwangerschaftskomplikationen war den

Pädiatern retrospektiv nach Erstmanifestation der Erkrankung beim Kind aufgefallen. Diese

klinische Assoziation zwischen HELLP-Syndrom und hereditärem β-Oxidations-Defekt legt

eine Kandidatengenanalyse des Gens, welches für den Oxidationsdefekt verantwortlich ist, in

Bezug auf das HELLP-Syndrom nahe. Theoretische Überlegungen, die in den Forschungs-

ergebnissen zur Pathogenese der hypertensiven Schwangerschaftserkrankungen begründet

liegen und in den folgenden Kapiteln näher erläutert werden sollen, untermauern einen

potentiellen Zusammenhang.

In der vorliegenden Arbeit wurde in einem Kollektiv von HELLP-Patientinnen und teilweise

deren Kindern nach einem Kopplungsungleichgewicht zwischen Sequenzveränderungen des

entsprechenden Gens der β-Oxidation, HADHA genannt, und dem HELLP-Syndrom gesucht.

Dabei wurde sowohl auf die bereits bekannte häufigste Mutation im HADHA G1528C

zurückgegriffen als auch HADHA nach noch unbekannten Sequenzvarianten gescreent.

2. Allgemeine Grundlagen

2


2.1. Hypertensive Schwangerschaftserkrankungen

Die hypertensiven Schwangerschaftserkrankungen sind eine Gruppe von Erkrankungen mit

unterschiedlichen epidemiologischen, pathophysiologischen und risikobezogenen

Charakteristika, deren gemeinsames Hauptsymptom die arterielle Hypertonie in der

Schwangerschaft darstellt (142). Sie betreffen nach neueren Schätzungen aus den USA etwa 6

bis 8 % aller Schwangerschaften und sind neben geburtshilflichen Infektionen, Blutungen

oder Embolien eine der Hauptursachen für maternale und fetale Mortalität und Morbidität

(142, 156, 179). In Industriestaaten wie den USA werden 15 % der Müttersterblichkeit auf

diese Erkrankungsklasse zurückgeführt (130).

Die Klassifikation der hypertensiven Schwangerschaftserkrankungen variierte in der

Vergangenheit stark und ist bis heute noch nicht international einheitlich (130). Folgende

Institutionen haben international beachtete Klassifikationen veröffentlicht: World Health

Organisation (WHO), American College of Obstetrics and Gynaecology (ACOG),

International Society for the Study of Hypertension (in Pregnancy) (ISSH(P)) und die U.S.

National Institutes of Health Working Group on Hypertension in Pregnancy (179).

Exemplarisch soll hier die Empfehlung der Expertenkommission der Deutschen Gesellschaft

für Gynäkologie und Geburtshilfe (DGGG) dargestellt werden, welche sich unter anderem an

den Empfehlungen der ISSHP und der Working Group on High Blood Pressure in Pregnancy

orientiert (vgl. AWMF-Leitlinien-Register, Nr. 015/018, Stand 2002 (letzte Aktualisierung))

(65):

Klassifizierung der hypertensiven Erkrankungen in der Schwangerschaft:

Gestationshypertonie Hypertonie ohne Proteinurie, wobei der erhöhte Blutdruck weder vor der 20. SSW bestand noch länger als 12 Wochen nach der Geburt anhält.

Präeklampsie (syn.: Gestose, proteinurische Gestationshypertonie)

Hypertonie (erstmalig nach der 20.SSW) und Proteinurie mit und ohne Ödeme Bei Fehlen einer Proteinurie ist eine Präeklampsie sehr wahrscheinlich, wenn Symptome wie Kopfschmerzen, Augenflimmern, Oberbauchbeschwerden oder pathologische Laborwerte (z.B. Thrombozytopenie, erhöhte Transaminasen, Hyperurikämie) vorliegen. Schwere Verlaufsformen der Präeklampsie: Eklampsie

Def.: zusätzlich tonisch-klonische Krampfanfälle


3

HELLP-Syndrom Def.: (H) hemolysis– Hämolyse, (EL) elevated liver enzymes– erhöhte Leberenzyme, (LP) low platelets– erniedrigte Thrombozytenzahl

Chronische Hypertonie Hypertonie vor Eintritt der Schwangerschaft, zumindest vor der 20. SSW oder Fortbestehen der Hypertonie über 6 Wochen postpartal hinaus. Primäre (essentielle) Hypertonie (95%) Sekundäre Hypertonie

Pfropfgestose (syn.: Pfropfpräeklampsie, engl.: Preeclampsia superimposed upon chronic hypertension)

Auftreten von charakteristischen Gestosesymptomen, meistens einer "neu auftretenden " Proteinurie oder plötzlichem Anstieg von Blutdruck und Eiweißausscheidung im Urin bei Schwangeren mit chronischer Hypertonie

Tabelle 2.1: Empfehlung der Expertenkommission der Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe zur Klassifizierung der hypertensiven Erkrankungen in der Schwangerschaft, modifiziert nach: AWMF online, AWMF-Leitlinien-Register, Nr. 015/018, Stand 2002 (letzte Aktualisierung) (65)

Dabei sind folgende Werte nach Empfehlung der Expertenkommission als pathologisch

anzusehen:

Parameter pathologisch Blutdruckwerte > 140 und/oder > 90 mmHg Proteinurie > 0,3 g/24 h ( 24-Stunden-Sammelurin ) Gewichtszunahme (Ödeme) > 1 kg/Woche während des 3. Trimesters Hämoglobin Hämatokrit Haptoglobin

< 13 g/dl < 38 % Abfall

Thrombozyten < 100.000/µl SGPT Anstieg SGOT Anstieg LDH Anstieg

Jeweils 3-fache Standardabweichung

Bilirubin (indirekt) >1,2 mg/dl Tabelle 2.2: Definition pathologischer Parameter nach der Empfehlung der Expertenkommission der Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe, modifiziert nach: AWMF online, AWMF-Leitlinien-Register, Nr. 015/018, Stand 2002 (letzte Aktualisierung) (65)

Das HELLP-Syndrom als schwere Form der Präeklampsie ist Gegenstand dieser Arbeit.

Die Präeklampsie ist eine schwangerschaftsspezifische Erkrankung, deren milde Formen

subjektiv symptomarm verlaufen können (130). Gefürchtet ist die Entwicklung schwerer

Formen mit diversen Endorgandysfunktionen und erwähnter hoher Mortalität und Morbidität.

Epidemiologische Studien der letzten Jahrzehnte konnten eine Vielzahl von Risikofaktoren

für die Entwicklung einer Präeklampsie ermitteln (30). Da diese Risikofaktoren wichtige

Grundlage bei der Suche nach ätiologischen Konzepten zu Präeklampsie und HELLP-

Syndrom sind, soll an dieser Stelle eine kurze Aufstellung erfolgen (Tabelle 2.3).


4

Risikofaktoren Nulliparität, Primipaternität, Schwangerschaft bei jugendlicher Mutter kurze Spermaexpositionszeit, heterologe Insemination, Eizellspende Oralsex (Risikoreduktion) Partner, der bei anderer Frau bereits Vater einer präeklamptischen Schwangerschaft war anamnestisch stattgehabte Präeklampsie, für zweite Schwangerschaft: zunehmendes Alter,

zunehmendes Intervall zwischen zwei Schwangerschaften positive Familienanamnese Vorerkrankungen:

- chronische Hypertonie oder renale Erkrankungen Pfropfpräeklampsie - Adipositas, Insulinresistenz, Gestationsdiabetes, Diabetes mellitus Typ I - Thrombophilien: APC-Resistenz, Protein S-Defizit, Antiphospholipid-Antikörper, Hyperhomocysteinämie - Sichelzellkrankheit

Rauchen (Risikoreduktion) Stress, hohe berufsbedingte psychosoziale Belastungen Mehrlingsschwangerschaft strukturelle kongenitale Anomalien, Hydrops fetalis, chromosomale Anomalien (Trisomie 13,

Triploidie), Blasenmole Infektion des Harntraktes in der Schwangerschaft

Tabelle 2.3: Risikofaktoren für die Entwicklung einer Präeklampsie, modifiziert nach Dekker 1999 (30)

2.1.1 Das HELLP-Syndrom

Nach heutigem Kenntnisstand gilt das HELLP-Syndrom als eine besondere Form bzw.

Komplikation der schweren Präeklampsie, wenngleich in der Literatur immer wieder die

Frage nach einer eigenen Entität des Syndroms diskutiert wird (27, 45, 82, 134, 157). Diese

These wird unterstützt durch die Beobachtung, dass das HELLP-Syndrom in 15 bis 20 % der

Fälle ohne Nachweis einer bestehenden Präeklampsie auftreten kann (134, 157). Dabei steht

das Akronym HELLP für eine typische Laborparameterkonstellation, die Weinstein 1982

signalwirksam als HELLP-Syndrom zusammenfasste: “H“ steht für „hemolysis“ im Sinne

einer mikroangiopathischen hämolytischen Anämie, „EL“ für „elevated liver enzymes“ bei

Leberfunktionsstörung und „LP“ für „low platelets“ bei Thrombozytopenie (188).

Diese Symptomkonstellation war zumindest partiell zum Definitionszeitpunkt nicht neu und

seit Beginn des 20. Jahrhunderts mehrfach im Rahmen von Veröffentlichungen über

Schwangerschaftskomplikationen beschrieben worden (45, 138, 146, 188). Erste schriftliche

Hinweise auf die Erkrankung sollen bereits im Jahr 1596 durch Gaebelkhouren veröffentlicht

worden sein (25, 82). Weinstein hingegen beschrieb 1982 erstmalig die Klinik an einem

größeren Kollektiv unter der Vorstellung, eine spezielle Patientengruppe im Spektrum der


5

Präeklampsie/Eklampsie-Patientinnen zu definieren, die bei hoher Rate schwerer Komplika-

tionen und gleichzeitig oft verzögerter Diagnosestellung stark gefährdet ist.

Ausgehend von Weinsteins wenig standardisierten Laborkriterien wurde die Symptomtrias

des HELLP-Syndroms von diversen Forschergruppen unterschiedlich spezifiziert und es

wurden damit unterschiedliche Diagnosekriterien erstellt. Dieser Umstand ist

mitverantwortlich für zum Teil widersprüchliche und divergierende Angaben in der Literatur

zu allen Aspekten dieser Erkrankung. Die beiden in der internationalen Literatur

meistzitierten Klassifikationen sind die Diagnosekriterien der Universität von Tennessee,

erarbeitet von einer Forschergruppe um B.M. Sibai (35, 157), und die sogenannte Mississippi-

Trippel-Klassifikation von J.N. Martin und Mitarbeitern (103, 107) (Tab. 1.4).

Universität von Tennessee Universität von Mississippi Hämolyse Abnormaler Blutausstrich

Bilirubin >1,2 mg/dl LDH > 600 U/l

LDH ≥ 600 U/l

Leberaffektion AST > 70 U/l (>3SD) LDH > 600 U/l

AST und/oder ALT ≥ 40 U/l LDH ≥ 600 U/l

Thrombozytopenie < 100 x 10³/mm³ Klasse I: < 50000/µl Klasse II: >50000/µl - <= 100000/µl Klasse III: >100000/µl -<= 150000/µl

Tabelle 2.4: Auswahl verbreiteter Diagnosekriterien des HELLP-Syndroms (35, 103, 107, 157)

Neuere Kriterien involvieren meist das Haptoglobin als sensitiven Hämolysemarker (54)

sowie die Isoenzyme der LDH (82, 134). Die Thematik wurde weiter kompliziert mit der

Einführung des Begriffs des partiellen HELLP-Syndroms mit abhängig vom jeweils

fehlenden Symptom verkürztem Akronym, zum Beispiel ELLP bei fehlender Hämolyse (35).

Je nach verwandten Diagnosesystemen und Institutionen variieren die angegebenen

Inzidenzen für das HELLP-Syndrom zwischen 0,11 und 0,9 % aller Schwangerschaften (27,

82, 119, 134). In Perinatalzentren liegen sie bisweilen deutlich höher (135). Dort muss in bis

zu 20 % aller schweren Präeklampsiefälle mit dieser besonderen Komplikation gerechnet

werden (155). Die betroffenen Frauen sind im Mittel 24 bis 25 Jahre alt (4, 27, 155, 188), zu

52 bis 81 % Primiparae (134) und bei Diagnosestellung im Median in der 32. bis 34. SSW (4,

134, 188). Die Streuung ist allerdings hoch: Das HELLP-Syndrom kann in bis zu einem

Drittel aller Fälle postpartal, dann meist innerhalb der ersten 48 Stunden, und zu etwa einem

Zehntel vor der 27. SSW auftreten (155). Daten über ethnische Variationen des Auftretens des

HELLP-Syndroms weisen auf höhere Inzidenzen bei weißen Patientinnen im Vergleich zu

ihrem Anteil an der Gesamtpopulation des amerikanischen Kontinents hin (155, 191). Ein von


6

den Risikofaktoren für die Entwicklung einer Präeklampsie differenziertes Risikoprofil für

das HELLP-Syndrom ließ sich in der Literatur nicht finden.

Die Klinik, mit der die Frauen den Arzt aufsuchen, ist teilweise irreführend (82). Häufig und

typisch ist der Oberbauchschmerz, epigastrisch oder im rechten oberen Quadranten (65 bis

über 90 % der Fälle) (155, 188). Oft berichten die Patienten auch über ein unspezifisches

Unwohlsein seit ein paar Tagen (über 90 % der Fälle), sowie über Übelkeit oder Erbrechen

(bis 86 %) (134). Gegebenenfalls finden sich Zeichen einer zugrundeliegenden Präeklampsie

wie Kopfschmerzen, Sehstörungen, Ödeme, eventuell eine Hyperreflexie. Seltener sind

Ikterus, Epistaxis, gastrointestinale Blutungen, Gingivablutungen, Hämaturie, Schmerzen in

der rechten Schulter oder Flanke, Diarrhö und andere (82, 134, 146, 155, 157, 188). Eine

Aufstellung äußerst seltener Manifestationen findet sich bei Rath (137).

Die Gefährlichkeit des HELLP-Syndroms spiegelt sich in Rate und Art der Komplikationen

wider, welche sowohl Mutter als auch Fetus treffen können. Die Rate ernster maternaler

Komplikationen wird in der Literatur mit 12,5 bis 60 % angegeben, tendenziell ist sie sinkend

(53, 134, 152). Am häufigsten treten die disseminierte intravasale Gerinnung (DIG), eine

Eklampsie oder eine Abruptio placentae auf. Eine Aufstellung der schweren Komplikationen

findet sich in Tabelle 2.5.

Komplikationen Disseminierte intravasale Gerinnung (DIG) Eklampsie Abruptio placentae Schwerer Aszites Akutes Nierenversagen Lungenödem Pleuraerguss Hirnödem, intracerebrale Blutung Ablatio retinae Larynxödem Leberruptur, Leberinfarkt, subkapsuläres Leberhämatom ARDS Sepsis Schock, Multiorganversagen

Tabelle 2.5: Zusammenstellung schwerer maternaler Komplikationen des HELLP-Syndroms, aus: 4, 27, 35, 45, 53, 82, 134, 146, 155

Aus den Komplikationen ergaben sich je nach Klinik und Kollektiv in den letzten Jahren

maternale Mortalitätsraten von bis zu 4 % (4, 27, 53, 57, 146). Dem gegenüber stehen die

Gefahren für das Kind, welche beim HELLP-Syndrom insbesondere durch Abruptio

placentae, intrauterine Asphyxie bei chronischer Plazentainsuffizienz und durch


7

Frühgeburtlichkeit, meist iatrogen im Rahmen der Therapie, gegeben sind (157). Fetale

Mortalitätsraten schwanken in der Literatur zwischen 0 und 60 % der HELLP-Fälle (27, 35,

57, 82, 134, 152, 157). Mit einer intrauterinen Wachstumsretardierung des Feten (IUGR)

muss in 30 bis 58 % der Fälle gerechnet werden (134, 157).

Das HELLP-Syndrom kann selbst den erfahrenen Kliniker vor differentialdiagnostische

Probleme stellen, die eine schnelle Diagnosefindung verhindern und die Gefahr für Mutter

und Kind potenzieren. Zunächst müssen häufige schwangerschaftsunabhängige Diagnosen,

wie Appendizitis, Ulcuskrankheit, Pankreatitis, Cholecystitis/Choledocholithiasis, Pyelo-

nephritis und andere ausgeschlossen werden (35, 41, 82, 146). Gleiches gilt für die akute

Virushepatitis (41). Des Weiteren sind schwangerschaftsgebundene Lebererkrankungen zu

berücksichtigen. Dazu gehören die schwangerschaftsbedingte intrahepatische Cholestase und

die akute idiopathische Schwangerschaftsfettleber, auch ASFL oder AFLP genannt. Die

AFLP nimmt differentialdiagnostisch eine zentrale Rolle im Rahmen der vorliegenden Arbeit

ein und soll kurz näher erläutert werden:

Stander und Cadden berichteten 1934 erstmalig über diese seltene Schwangerschafts-

erkrankung, deren Inzidenz mit 1:5000 bis 1:16000 angegeben wird (109, 146). Sie tritt meist

zwischen der 34. und 36. Schwangerschaftswoche auf und kündigt sich mit Unwohlsein,

Übelkeit, Erbrechen und Oberbauchschmerz an (19, 109). Die Leberbeteiligung ist

ausgeprägter als beim HELLP-Syndrom (41, 82, 109, 146). Den initialen Symptomen folgt

klassischerweise innerhalb der nächsten zwei Wochen der Ikterus (19). Schreitet die

Erkrankung fort, so zeigen sich zunehmend Zeichen eines progredienten Leberversagens,

welches in Tod von Mutter und Kind münden können (19, 36, 41). Histologisches

Kennzeichen der AFLP ist die mikrovesikuläre Leberzellverfettung, vor allem zentrolobulär.

Sie kann in schweren Fällen das gesamte Leberläppchen befallen oder makrovesikulär sein

(19, 82). Auch Nierentubulus-, Herz- oder Pankreaszellen können Zeichen einer Verfettung

aufweisen (19).

Wegen starker pathophysiologischer Ähnlichkeit zum HELLP-Syndrom bereiten weitere,

jedoch seltenere Erkrankungen aus der Klasse der obstruktiv-thrombotischen Mikroangio-

pathien wie die thrombotisch-thrombozytopenische Purpura (TTP) und das hämolytisch-

urämische Syndrom (HUS) gelegentlich differentialdiagnostische Probleme. Ihre

Differenzierung ist jedoch bei unterschiedlichen therapeutischen Ansätzen und unter korrekter

Therapie deutlich geringerer Mortalität von immenser Bedeutung für Mutter und Kind (36,

41, 82, 146). Auch einige Autoimmunerkrankungen können sich hinter dem gezeigten

klinischen Bild verbergen. Dazu gehören der systemische Lupus erythematodes (SLE), die


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idiopathische-thrombozytopenische Purpura (ITP), das Antiphospholipid-Syndrom (APS) und

das Evans-Syndrom (41, 134).

Das hohe Gefährdungspotential des HELLP-Syndroms für Mutter und Kind erfordert deren

Behandlung in einem Perinatalzentrum. Die Behandlungsoptionen werden seit Jahren

kontrovers diskutiert. Während die schnellstmögliche Entbindung bei einer

Schwangerschaftsdauer oberhalb der 34. SSW allgemein Konsensus ist, konkurrieren bei

Patientinnen vor der 34. SSW aggressives und konservatives Therapiekonzept (8, 103, 134).

Den potentiell lebensbedrohlichen Komplikationen eines abwartenden Regimes für Mutter

und Kind steht die Unreife und iatrogene Frühgeburtlichkeit des Feten bei schneller

Schwangerschaftsbeendigung gegenüber. Hier findet sich eine der Hauptursachen für die hohe

perinatalen Morbidität und Mortalität des Kindes (103). Die Frage nach einer therapeutischen

Wirkung von Kortikosteroiden im Rahmen des HELLP-Syndroms über die Lungen-

reifeinduktion beim Fetus hinaus und der Einsatz weiterer Medikamente sind Gegenstand

intensiver Forschung. Hier sei auf spezielle Literatur verwiesen (12, 40, 42, 54, 108).

Das Wiederholungsrisiko für hypertensive Schwangerschaftserkrankungen in nachfolgenden

Schwangerschaften nach einem HELLP-Syndrom in der Indexschwangerschaft wird mit 27

bis 48 % angegeben (134). Zahlen über das erneute Auftreten speziell des HELLP-Syndroms

in diesen Schwangerschaften liegen weit auseinander. Während Sullivan und Mitarbeiter eine

Wiederholungsrate von 19 % für die Klasse I und II des HELLP-Syndrom nach der

Mississippi-Klassifikation ermittelten, blieben andere Forschergruppen unter 3 bis 4 % (146,

164, 180).

Klassisches histopathologisches Korrelat des HELLP-Syndroms in der Leber sind periportale

oder fokale Parenchymnekrosen und hyaline Ablagerungen eines fibrinartigen Materials in

den Sinusoiden (7). Immunfluoreszenzstudien stellten sinusoidale Fibrinmikrothromben und

Fibrinogenablagerungen im Bereich der Leberzellnekrosen, aber auch in histologisch

unauffälligen Leberarealen dar (7). Des Weiteren wurde eine mikrovesikuläre, teils auch

makrovesikuläre Leberzellverfettung beschrieben (7, 112). Der Grad ihres Ausmaßes ist

allerdings strittig: Während Minakami et al. unter Verwendung spezieller Färbemethoden eine

mikrovesikuläre Verfettung bei allen von ihnen untersuchten HELLP-Patientinnen darstellen

konnten, wurde diese in anderen Untersuchungen in einem weit geringeren Ausmaß oder gar

nicht gefunden (7, 56, 112, 113, 172).


9

2.1.2 Pathophysiologie und Konzepte zur Ätiologie der Präeklampsie

Die Präeklampsie wird in der internationalen Literatur auch als „disease of theories“

bezeichnet, da im Laufe der letzten Jahrzehnte multiple Theorien bezüglich ihrer Ätiologie

entwickelt wurden, von denen noch keine der voranschreitenden Forschung standgehalten hat

(142). Insbesondere die intensive Forschung der letzten 15 Jahre offenbarte die Komplexität

der Präeklampsie, deren pathophysiologische Manifestationen weit über das Hauptsymptom

proteinurische Hypertonie hinausgehen. Die Präeklampsie ist eine komplexe Multisystem-

erkrankung, die nahezu jedes maternale Organsystem involviert, insbesondere aber

Auswirkungen auf das vaskuläre, hepatische, renale, cerebrale sowie das Gerinnungs-System

hat (130, 142). So gehen die meisten Forscher heute nicht mehr davon aus, eine einzelne

Ursache für diese Erkrankung zu finden, sondern vermuten einen multifaktoriellen Ursprung,

an dem viele der nachfolgend dargestellten Aspekte Anteil haben dürften (13, 33, 179).

2.1.2.1 Inadäquate Trophoblastinvasion und maternale Endothelzelldysfunktion

Zwei pathophysiologischen Merkmalen der Präeklampsie wird eine Schlüsselrolle in deren

Pathogenese zugeschrieben: zum einen der sogenannten abnormalen Plazentation bei

inadäquater Trophoblastinvasion in die Spiralarterien des Uterus, zum anderen der generali-

sierten maternalen Endothelzelldysfunktion (29).

In der normalen Schwangerschaft invadieren die Trophoblastzellen in den ersten 18

Schwangerschaftswochen in zwei Phasen in das Endometrium und das innere Drittel des

Myometriums der Gebärmutter, ersetzen in den dortigen Spiralarterien das Endothel,

zerstören weite Teile der Media und modellieren so die muskelstarken Arterien zu dilatierten

Kapazitätsgefäßen um (16, 29). Es resultieren reduzierte vaskuläre Resistenz, erhöhter

Blutfluss zum Fetus und verminderte maternale vasomotorische Kontrollierbarkeit (16, 29,

33, 179). Bei präeklamptischen Patientinnen erfolgen diese physiologischen Veränderungen

in einen weit geringeren Prozentsatz der Arterien, erstrecken sich nicht bis in das Myo-

metrium, sondern sind auf die decidualen Spiralarterienanteile beschränkt und bleiben oft

oberflächlich (29). Folgen sind eine defizitäre uteroplazentare Zirkulation mit plazentarer

Ischämie bei vermindertem Blutfluss (179) und eine unmodifizierte Fähigkeit dieser Gefäße

zur Vasokonstriktion (16). Der plazentaren Ischämie wird eine zentrale pathogenetische Rolle

zugeschrieben (98, 179, 192). Die Forschung zu dem Schlüsselmerkmal inadäquate


10

Trophoblastinvasion beschäftigt sich derzeit unter anderem mit der Rolle der

Adhäsionsmoleküle und des HLA-G. Diese beiden Faktoren sind in der normalen

Plazentation von zentraler Bedeutung (29, 33, 130).

Verschiedene Forschungsergebnisse der letzten Jahre konnten die These einer generalisierten

maternalen Endothelzelldysfunktion in der Pathogenese der Präeklampsie untermauern (142).

Die Glomeruloendotheliose, eine Schwellung der Endothelzellen des renalen Glomerulums,

ist lange als klassische histologische Manifestation der Präeklampsie an der Niere bekannt

(16, 142). Des Weiteren lassen, entgegen initialer Hinweise auf eine toxische Wirkung, in-

vitro-Experimente einen aktivierenden Effekt von Seren präeklamptischer Patientinnen auf

bestimmte Stoffwechselwege der Endothelzellen vermuten (16, 29). Vor allem aber stützen

veränderte serologische Konzentrationen von Markern für eine endotheliale Aktivierung bzw.

Dysfunktion, teilweise Wochen vor der klinischen Manifestation der Präeklampsie messbar,

die These einer Endothelzelldysfunktion (13, 142). Dazu gehören der Nachweis erhöhter Kon-

zentrationen zirkulierender Multimere des Willebrand-Faktors, erhöhte Konzentrationen des

Fibronektins, des Endothelins, des Thrombomodulins und anderer (16, 29). Nicht zuletzt

bietet die generalisierte Endothelzelldysfunktion auch eine adäquate Erklärung für weitere

charakteristische pathophysiologischen Merkmale der manifesten Präeklampsie: Vasokon-

striktion, vermehrte Thrombozytenaggregation und gesteigerte Kapillarpermeabilität (179).

Sensitivere Tests zum Gerinnungsstatus mit der Option auf Entdeckung präklinischer

Gerinnungsstörungen konnten in den letzten Jahren die gesteigerte Plättchenaggregation und

die teilweise bei präeklamptischen Frauen beobachtete Thrombozytopenie in einen größeren

Zusammenhang stellen: Einige Forscher fassen diese, sowie die beobachteten Veränderungen

verschiedener Gerinnungs- und Fibrinolysefaktoren als Ausdruck eines subklinischen,

kompensierten Status einer chronischen DIG auf (13, 16, 130, 136).

Die generalisierte maternale Endothelzelldysfunktion wird heute von vielen Autoren als

gemeinsame Endstrecke multipler pathophysiologischer Mechanismen der Präeklampsie

angesehen (29, 130, 179). Die Suche nach diesen Mechanismen, nach einem verbindenden

Agens zwischen gestörter Trophoblastinvasion und Endothelzelldysfunktion, dem

sogenannten „Faktor X“ (179), und die Frage nach den diesen beiden Schlüsselmerkmalen

zugrunde liegenden Faktoren sind Kernaspekte heutiger Forschungsbemühungen (29, 142,

179, 192).

Derzeit werden mehrere Kandidaten als potentieller Faktor X diskutiert. Ein Kandidat ist die

bei Präeklampsie-Patientinnen beobachtete vermehrte Mikrodeportation von Partikel der


11

Synzytiotrophoblast-Mikrovilli-Membran von der Plazenta in die maternale Zirkulation.

Diesen Partikeln konnten proliferationshemmende und die Kontinuität von Endothelzellagen

störende Effekte nachgewiesen werden (179, 192). Weitere Kandidaten sind der oxidative

Stress mit Bildung freier Sauerstoffradikale sowie Veränderungen im Lipidmetabolismus

(142, 179, 192). Die Diskussion dieser beiden Kandidaten weist Parallelitäten zu Erkennt-

nissen der Arterioskleroseforschung auf (142).

2.1.2.2 Veränderungen des Lipidstoffwechsels

Seit längerem sind ausgeprägte Veränderungen der Plasmalipide bei Präeklampsie-

Patientinnen bekannt, welche über die bereits in der normaler Schwangerschaft bestehenden

physiologischen Anpassungreaktionen des Lipidstoffwechsels an den erhöhten Energiebedarf

der Schwangerschaft hinausgehen (100, 129). Dazu gehören zusätzlich erhöhte Triglyzeride

und erhöhte freie Fettsäuren im Serum, welche bereits vor der 20. SSW bei später

präeklamptischen Patientinnen nachgewiesen werden können (99), sowie veränderte Spiegel

spezieller Lipoproteinsubfraktionen wie erhöhte VLDL1-, LDL III- und erniedrigte HDL2-

Werte (100, 147). In den letzten Jahren wurde zum einen eine direkt toxische Wirkung der

VLDL-Fraktion auf die Endothelzellen bei gleichzeitig durch die erhöhten freien Fettsäuren

verringerten, albumingekoppelten Schutzmechanismen diskutiert (29, 100). Zum anderen

konnten unterschiedliche Wege einer möglichen Wirkung der Dyslipidämie als Kofaktor der

oben genannten potentiellen Kandidaten des Faktor X aufgezeigt werden. Dabei könnte der

LDL III-Subfraktion eine besondere Rolle zukommen (100, 147), insbesondere in Verbindung

mit erhöhtem oxidativen Stress (142, 192). Eine Diskussion diverser Mechanismen findet sich

bei Lorentzen und Henriksen (100).

2.1.2.3 Oxidativer Stress

Es existieren zahlreiche Hinweise darauf, dass präeklamptische Patientinnen im Vergleich zur

physiologischen Schwangerschaft einem erhöhten oxidativen Stress im Sinne eines

Ungleichgewichts zwischen prooxidativen und antioxidativen Mechanismen ausgesetzt sind

(29, 142). Postuliert wird unter anderem die Bildung stabiler Lipidperoxide durch kurzlebige

freie Sauerstoffradikale, wobei beide Molekülgruppen bereits für sich betrachtet


12

endothelzelltoxisch sind (29, 179, 192). Insbesondere aber Lipidperoxide scheinen viele der

pathophysiologischen Merkmale der Präeklampsie hervorrufen zu können, wie etwa die

veränderte Kapillarpermeabilität oder den verminderten Prostacyclinspiegel (29). Dabei

kommen mehrere Quellen der initialen freien Sauerstoffradikale in Betracht (29). Zu diesen

gehört zum einen die minderperfundierte Planzenta, wo die Radikalbildung als Reaktion auf

die Hypoxie interpretiert werden kann (29, 142, 192). Zum anderen dürften aktivierte

Leukozyten eine wichtige Quelle sein, möglicherweise mittels Zytokinproduktion (29). Ein

Hauptaugenmerk liegt hierbei auf der Rolle des TNF-α (29). Die Verzahnung von Aspekten

des oxidativen Stresses mit der im Folgenden erläuterten These der Immunmaladaptation als

Ursache der Präeklampsie ist somit denkbar und wird propagiert (29, 179).

2.1.2.4 Immunmaladaptation

Epidemiologische Beobachtungen legten die Überlegung einer gestörten Immunantwort der

Mutter auf das fetale Gewebe nahe: Die Präeklampsie gilt als eine Erkrankung der

Erstgebärenden mit sinkendem Risiko in Folgeschwangerschaften bei gleichbleibendem

Partner. Bei Partnerwechsel hingegen steigt das Risiko für die Entwicklung einer

Präeklampsie wieder an, ebenso steigt es bei künstlicher Insemination mit Spendersamen,

während die wiederholte Samenexposition eines gleichbleibenden Partners über einen

längeren Zeitraum für die Mutter protektiv zu sein scheint (29, 98, 192). Daher wird eine

Assoziation der Erkrankung mit Primipaternität und möglicherweise fehlerhaften immuno-

logischen Adaptationsvorgängen an paternale Merkmale des Trophoblasten insbesondere in

der Genese der gestörten Trophoblastinvasion vermutet (29, 179, 192). Außerdem konnten

weitere Immunphänomene bei präeklamptischen Patientinnen nachgewiesen werden. Dazu

gehören Antikörper gegen Endothelzellen, vermehrte zirkulierende Immunkomplexe, erhöhte

Spiegel proinflammatorischer Zytokine und diverse andere (192). Vor allem TNF-α und IL1,

sowie aus aktivierten neutrophilen Granulozyten freigesetzte toxische Proteasen wie die

Elastase stellen aufgrund ihrer endothelialen Effekte mögliche Mediatoren zwischen einer

Immunmaladaptation und der Endothelzelldysfunktion dar (29, 131, 192). Eine potentielle

Immunmaladaptation der Mutter an Eigenschaften des Trophoblasten eröffnet somit

Erklärungsansätze auf mehreren pathophysiologischen Ebenen und umfasst Erklärungen für

die gestörte Trophoblastinvasion und Verbindungen zur Endothelzelldysfunktion (29, 179).


13

2.1.2.5 Vasoaktive Substanzen

Das bereits erwähnte zentrale pathophysiologische Merkmal Vasokonstriktion bedingt die

intensive Untersuchung der Rolle körpereigener vasoaktiver Substanzen in der Pathogenese

der Präeklampsie (16, 131). Multiple, aber teilweise kontroverse Forschungsergebnisse

konnten in den letzten Jahren zusammengetragen werden. Die divergierenden Angaben sind

bei häufig methodischen Problemen der Messung dieser zum Teil sehr kurzlebigen

Substanzen oftmals schwer zu interpretieren (16, 29, 131). Vielfach bestätigt wurde aber eine

Imbalance zwischen dem vasodilatatorischen, plättchenaggregationshemmenden Prostacyclin

und dem vasokonstriktorischen, plättchenaggregationsfördernden Thromboxan A2 zu

Ungunsten des Prostacyclins (16, 29, 131). Spekulationen, die Präeklampsie als reinen

Prostacyclin-Mangel zu interpretieren, ließen sich jedoch nicht halten (29). Des Weiteren sind

typische Veränderungen im Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) bekannt (16,

131). Zu den in diesem Kontext ebenfalls untersuchten Substanzen und Systemen gehören:

Stickstoffmonoxid (NO) mit seinen unterschiedlichen Synthetasen (NOS), die Endothelin-

Isoformen, weitere Prostaglandine, ANP, Adrenomedullin, Vasopressin und diverse andere

(13, 16, 131). Die Bewertung der Rolle der vasoaktiven Substanzen in der Pathogenese der

Präeklampsie ist im Fluss (16, 29, 131).

2.1.2.6 Genetische Aspekte

Neben allen oben genannten pathogenetischen Konzepten ist seit Jahrzehnten eine familiäre

Prädisposition für die Entwicklung einer hypertensiven Schwangerschaftserkrankung bekannt

und eine genetische Komponente damit naheliegend (26). Erste systematische Unter-

suchungen der familiären Häufung an größeren Kollektiven fanden 1960 sowohl durch

Chesley, Cosgrove und Annitto (26) als auch durch Humphries (2, 131) statt. Die starke

familiäre Komponente konnte vielfach bestätigt werden (2, 93, 165). So wird beispielsweise

einer erstgradig Verwandten einer Präeklampsie-Patientin ein fünffach erhöhtes Risiko

zugeschrieben, ebenfalls eine Präeklampsie zu entwickeln (117). Seither wurden multiple

Anstrengungen unternommen, den Vererbungsmodus zu ermitteln (Übersicht bei Lachmeijer

et al.) (93). Daten aus Familienstudien konnten jeweils präferentiell mit verschiedenen

Modellen in Einklang gebracht werden: Vererbung über ein (meist maternales) autosomal-

rezessives Gen (165, 192), ein dominantes Gen mit inkompletter Penetranz (2, 192) oder über


14

einen multifaktoriellen Modus (93). Eher ausgeschlossen wurde ein mitochondrialer Erbgang

(93).

Schwierigkeiten bei der Untersuchung der Präeklampsie unter genetischen Gesichtpunkten

ergeben sich aber aus verschiedenen Gründen: Die Präeklampsie ist eine geschlechts-

gebundene Erkrankung, die nur während einer Schwangerschaft manifest wird (93, 141).

Potentiell sind zwei genetisch unterschiedliche Individuen, Mutter und Fetus, an ihrer

Entstehung beteiligt (93, 141) und es existieren einige Hinweise auf einen Einfluss der

fetalen/paternalen Gene: die Assoziation der Präeklampsie mit fetalen Chromosomen-

aberrationen (93, 192) und Molenschwangerschaften (93), sowie auffallende Diskordanzraten

monozygoter Zwillinge in Zwillingsuntersuchungen (48, 93, 141). Außerdem konnten große

epidemiologische Studien aus Norwegen und Utah (USA) weitere Aspekte hinzufügen:

Männer scheinen ein erhöhtes Risiko zu besitzen, Vater einer präeklamptischen

Schwangerschaft zu werden, wenn sie selbst aus einer solchen hervorgegangen sind (93, 192).

Auch ist das Risiko einer Frau für eine präeklamptische Schwangerschaft erhöht, wenn ihr

Partner schon einmal Vater einer derartig komplizierten Schwangerschaft mit einer anderen

Frau war (93). Daher lehnen viele Autoren rein maternale Vererbungmodelle ab (93).

Diskutiert werden in diesem Kontext komplexe genetische Konzepte mit unterschiedlicher

Gewichtung von fetalen und maternalen Genen sowie Interaktionen der Veränderungen beider

Genome (93, 192). Liston und Kilpatrick propagierten zum Beispiel eine bei Mutter und Fetus

identische Homozygotie für ein autosomal-rezessiv vererbtes Allel als Erklärungsansatz

(131). Erkenntnisse aus der genetischen Forschung des letzten Jahrzehntes ermöglichten neue

Konzepte: Haig und Graves sehen viele der gegensätzlichen Daten bezüglich des Vererbungs-

modus der Präeklampsie bei Einbezug der Möglichkeit des sogenannten `genomic imprinting´

erklärt (93). Graves nimmt an, dass die fetale Expression eines paternal ìmprinteten´, also

ausgeschalteten und damit maternal aktiven Gens bei Mutation oder Fehlen desselben zu einer

Präeklampsie führt (48). Als Konsequenz ergibt sich aus dem oben gesagten, dass Unter-

suchungen des fetalen Genoms zusätzlich zu rein maternalen Forschungsansätzen sowie

Untersuchungen zu möglichen Interaktionen erforderlich sind (93, 192).

Weitere Probleme bei genetischen Untersuchungen zur Präeklampsie bereitet vor allem die

genaue Phänotypisierung des Untersuchungskollektivs (93, 117, 192). Ethnische Variabilität

oder die schwierige Festlegung des pathologischen Schwellenwertes eines kontinuierlichen

Parameters wie des Blutdrucks sind in diesem Zusammenhang zu nennen. Die Präeklampsie-

Patientinnen scheinen ein heterogenes Kollektiv mit diversen Subgruppen darzustellen (15,

93, 192): Milde Präeklampsie-Formen folgen anderen Gesetzmäßigkeiten als schwere Formen


15

(165). Eine Erstmanifestation bei einer Primipara ist anders zu interpretieren als bei einer

Multipara. Beispielsweise besitzen Multiparae im Gegensatz zu Primiparae ein deutlich

erhöhtes Risiko, später kardiovaskulär zu erkranken. Dieses lässt eine stärkere Assoziation

mit kardiovaskulär prädisponierenden Faktoren vermuten (15, 142). Aus den Schwierigkeiten

der genauen Phänotypisierung resultiert oftmals eine mangelnde Vergleichbarkeit genetischer

Untersuchungen unterschiedlicher Arbeitsgruppen (192).

In Anbetracht bisheriger kontroverser Erkenntnisse zu den genetischen Grundlagen der

Präeklampsie und in Anbetracht der erläuterten pathophysiologischen Vielschichtigkeit dieser

Erkrankung haben sich Forschungsbemühungen zunehmend von monogenen Konzepten

entfernt und favorisieren multifaktorielle, polygene oder heterogene Ansätze (15, 93, 117,

131, 166, 192). Lachmeijer, Dekker, Arngrimsson et al. erarbeiteten 2002 einen Überblick

derzeitig plausibler Modelle bezüglich des Vererbungsmodus der Präeklampsie (93). Die

Modelle lauteten: 1.) Genetische Heterogenität: Unterschiedliche maternale und fetale Gene

beeinflussen die Expression des Phänotyps bei unterschiedlichen Patientinnen. 2.)

Multifaktorielles Modell: Diverse maternale und fetale prädisponierende Gene mit jeweils

allein nur geringem Effekt beeinflussen in Kombination mit nichtgenetischen Faktoren die

Expression des Phänotyps. 3.) Multifaktorielles Model mit Hauptgenen: Einige wenige

prädisponierende Hauptgene bestimmen das Risiko der Patientin, die Expression des

Phänotyps ist aber von zusätzlichen, weniger stark beeinflussenden Genen und exogenen

Faktoren abhängig. 4.) Kombiniertes Modell: In bestimmten populationsspezifischen

Subgruppen oder Familien bestimmt ein Hauptrisikogen die Expression des Phänotyps

während für die restlichen Patientinnen andere Vererbungsmodelle gelten. Aber auch die

erstgenannten Modelle dürften durch weitere subgruppenspezifische Gesetzmäßigkeiten

zusätzlich kompliziert werden (93).

Die genetische Prädisposition könnte bei allen bisherig erläuterten ätiologischen Konzepten

der Präeklampsie eine Rolle spielen, zum Beispiel bei der gestörten Trophoblastinvasion, im

Rahmen einer Immunmaladaptation oder der Dyslipidämie (192).

In der Forschung zur Präeklampsie wurden bis heute vor allem folgende molekulargenetische

Untersuchungsmethoden angewandt: Assoziationsstudien mit spezifischen Kandidatengenen,

(genomweite) Kopplungsanalysen und meist die Plazenta betreffende Gen-Expressions-

studien (93). Die Kandidatengenuntersuchungen beschränken sich dabei meist auf

vermeintliche maternale Risikogene, also das maternale Genom (192), und orientieren sich

bei der Suche nach potentiellen Kandidaten an Erkenntnissen der Pathophysiologie oder der

Kopplungsanalysen (131). Dementsprechend breit gefächert ist die Liste dieser Kandidaten.


16

Auch sind die Ergebnisse dieser Studien wie bei vielen Untersuchungen dieser Art zu

komplexen Erkrankungen meist widersprüchlich (93). Starke Assoziationen mit dem

Auftreten einer Präeklampsie konnten in einigen Subpopulationen beispielsweise für die

Faktor V-Leiden-Mutation oder die M235T-Variante des Angiotensinogen-Gens nach-

gewiesen werden (131, 192). Die Diskussion der Kandidatengenuntersuchungen ist sehr

komplex, daher sei hier auf einige Übersichtsartikel verwiesen (93, 192). Ein kleiner

Überblick bisher untersuchter Kandidaten mit expliziter Darstellung divergenter Studien

findet sich bei Lachmeijer et al. (93).

Ebenso divergent zeigen sich Ergebnisse der genomweiten Kopplungsanalysen. Eine

Zusammenfassung findet sich ebenfalls bei Lachmeijer et al. (93). Arngrimsson et al. konnten

in einer umfangreichen, genomweiten Untersuchung 1999 die Region 2p13 als einen

potentiellen Locus für Anfälligkeitsgene der Präeklampsie ermitteln (3). Unter der Annahme

einer mäßigen Präzision derartiger Methoden bei komplexen Eigenschaften fanden Moses et

al. diesen Locus in eigenen Forschungergebnissen bestätigt und nannten das vermutete Gen

auf 2p PREG1 (pre-clampsia/eclampsia gene 1) (93, 118). Andere Forschergruppen konnten

diese These wiederum nicht bekräftigen (92).

2.1.3 Pathophysiologie und Konzepte zur Ätiologie des HELLP-Syndroms

In Anbetracht der kontroversen Diskussion bezüglich der Pathophysiologie und Ätiologie der

Präeklampsie wird deutlich, dass derartige Konzepte zum HELLP-Syndrom im Sinne einer

schweren Form der Präeklampsie ähnlich diffizil sein dürften. Die zentrale Rolle einer

Endothelzelldysfunktion in der Pathogenese der Präeklampsie wird beim HELLP-Syndrom

noch evidenter, möglicherweise ist die Schädigung gravierender (27). Fibrinablagerungen auf

dem geschädigten Endothel kleiner Gefäße mit Ausbildung eines Fibrinnetzes dürften die

Ursache der Fragmentation der passierenden Erythrozyten und damit der mikroangio-

pathischen, hämolytischen Anämie sein (8, 35, 103). Fibrinöse Obstruktionen der

Lebersinusoide werden als Ursache des Leberzellschadens und der Oberbauchsymptomatik

des HELLP-Syndrom angesehen (8, 35). Unklar ist allerdings, warum präferentiell die Leber

betroffen ist (82, 103). Die bereits bei unkomplizierter Präeklampsie beobachteten verkürzten

Überlebenszeiten sowie die Aktivierung der Thrombozyten sind beim HELLP-Syndrom noch

stärker ausgeprägt und münden in der syndromobligaten Thrombozytopenie (88, 103).


17

Ätiologische Modelle involvieren die Erkenntnisse der Forschung zur Präeklampsie und

gehen von zusätzlichen Faktoren aus, die die Genese eines HELLP-Syndroms bedingen (82).

Die Suche nach diesen zusätzlichen Faktoren steht in den Anfängen, Ergebnisse sind

erwartungsgemäß kontrovers und das HELLP-Syndrom wahrscheinlich die gemeinsame

Endstrecke verschiedener kausaler Faktoren (82). Diskutiert werden in diesem

Zusammenhang immunologische, das Gerinnungssystem betreffende und genetische Aspekte

(82). Einige Aspekte immunologischer Ansätze sind beispielsweise beobachtete funktionelle

Veränderungen immunologischer Zellen bei HELLP-Patientinnen (82, 103), Thesen über

eine zytokinvermittelte Neutrophilenaktivierung (82) oder Berichte über das Ansprechen des

HELLP-Syndroms auf Glukokortikoide (82). Bezüglich des Gerinnungssystems existieren

Hinweise auf eine stärkere Thrombophilie und eine stärkere Ausprägung der vermuteten

subklinischen chronischen DIG bei HELLP-Patientinnen im Vergleich zu unkomplizierten

Präeklampsie-Patientinnen (27).

Bisher sind genetische Studien, die sich präferentiell nur mit dem HELLP-Syndrom

auseinandersetzen, in der internationalen Literatur selten (103). Fallberichte zeigten

Assoziationen mit fetalen Trisomien oder familiäre Belastungen auf (11, 119, 138). Es

existieren Hinweise auf Assoziation speziell des HELLP-Syndroms mit der Faktor-V-Leiden-

Mutation (93, 150). Die meisten Studien konnten jedoch jeweils keine Assoziation mit

Sequenzveränderungen bzw. Polymorphismen in den untersuchen Genen wie beispielsweise

dem IL-1-Gen, dem IL-1-Rezeptor-Antagonist-Gen (IL1ra) oder der TNF-Region darstellen

(93). In den letzten Jahren mehren sich jedoch die Berichte, die die Annahme einer eigenen

genetischen Grundlage des HELLP-Syndroms protegieren: Kim et al. konnten 2001 eine

signifikante Häufung des Auftretens einer Mutation des Lipoprotein-Lipase-Gens, der

Asn291Ser-Variante, bei einer wenn auch kleinen Gruppe erstgebärender HELLP-Patien-

tinnen darstellen, während sich eine derartige signifikante Assoziation in einem reinen

Präeklampsie-Kollektiv der gleichen Studie nicht gezeigt hatte (87). Lachmeijer et al. fanden

in einer genomweiten Kopplungsanalyse zur Präeklampsie im gleichen Jahr auffallend

unterschiedliche Verteilungen, als sie HELLP-Familien und reine Präeklampsie-Familien

separat analysierten. Sie schlossen auf eine spezifische Assoziation des HELLP-Syndroms

mit einer Region bei 12q und spekulierten über einen unterschiedlichen genetischen

Hintergrund von Präeklampsie und HELLP-Syndrom (92).


18

2.2. Angeborene Defekte der mitochondrialen β-Oxidation

Das in dieser Arbeit untersuchte Gen HADHA kodiert für ein Protein der β-Oxidation. Zum

Verständnis des komplexen Themas sollen der Fettstoffwechsel und seine Defekte, im

Speziellen der LCHAD-Defekt, welcher auf Mutationen im HADHA zurückzuführen ist,

näher erläutert werden.

Angeborene Störungen der β-Oxidation gehören zu der in den letzten Jahren am stärksten

wachsenden Gruppe im Spektrum der neuentdeckten erblichen Stoffwechseldefekte (187).

Weltweit sind mehrere Hundert Fälle veröffentlicht worden (139). Im Gegensatz zu anderen

Stoffwechseldefekten begann ihre Entdeckungsphase erst relativ spät in den Siebziger Jahren

des letzten Jahrhunderts mit der Beschreibung des Carnitine-Palmitoyltransferase (CPT) II-

Defekts 1973 (143, 162). Ursachen dieser späten Entdeckung waren vor allem die bei dieser

Defektklasse im typischen Fall erst unter längerer Nahrungskarenz auftretende Symptomatik

sowie das Fehlen adäquater Messmethoden (162). Parallel zu zunehmenden Erkenntnissen

über die komplexe enzymatische Organisation der mitochondrialen β-Oxidation hat sich

inzwischen die Anzahl der beschriebenen unterschiedlichen Enzym-Defekte der mito-

chondrialen Fettsäure-Oxidation auf über 20 erhöht (49, 181, 182, 187). Zum typischen

klinischen Bild dieser Störungen gehören die akute fasteninduzierte hypoketotische Hypo-

glykämie und Leberfunktionsstörungen, die einem Reye-Syndrom mit Enzephalopathie

ähnlich werden können, sowie Symptome einer chronischen Skelettmuskel- oder Kardio-

myopathie (139, 187). Deutlich wurde in den letzten Jahren aber die klinische Heterogenität

dieser Defekte (159, 181). Schätzungen bezüglich der Inzidenz der angeborenen β-

Oxidations-Störungen gehen von einem Fall auf 8000 bis 15000 Lebendgeburten aus (170).

Neuere Daten aus Deutschland ermittelten kumulative Inzidenzen für Defekte der

Fettsäureoxidation und Defekte anderer organischer Säuren unter symptomatischen Kindern

von 1 zu 14800 (89). Schätzungsweise sollen 5 % aller plötzlichen Kindstode auf nicht

diagnostizierte Defekte der Fettsäureoxidation zurückzuführen sein (62).

2.2.1 Die mitochondrialen β-Oxidation

Fettsäuren sind eine wichtige Energiequelle. Vor allem während einer längeren Nahrungs-

karenz mit konsekutiv verbrauchten Glykogenreserven erfolgt die Energieproduktion

hauptsächlich in Leber, Skelett- und Herzmuskel über den Abbau der Fettsäurereserven des


19

Fettgewebes (143, 170). Das Zentralnervensystem ist zur direkten Nutzung der Fettsäuren

nicht fähig und bei Nahrungskarenz auf die durch die Leber aus Derivaten des Fettsäure-

abbaus gebildeten Ketonkörpern angewiesen (143).

Diverse Abbauwege der Fettsäuren sind bekannt, wie etwa die α-, β- oder die ω-Oxidation,

wobei die mitochondriale β-Oxidation nach heutiger Auffassung den Hauptweg darstellt (61,

187). Insbesondere der Abbau modifizierter, wie etwa ungesättigter oder verzweigtkettiger

Fettsäuren erfordert jedoch eine Vielzahl von zusätzlichen Metabolisierungsstrategien oder

Hilfsenzymen, deren molekulare Charakterisierung weiterhin im Fluss ist (61, 187). Die β-

Oxidation der Fettsäuren findet sowohl im mitochondrialen als auch im peroxisomalen

Zellkompartiment unter Nutzung jeweils eigener, unterschiedlicher, wenn auch verwandter

Enzymsysteme statt (61). Die peroxisomale β-Oxidation unterscheidet sich zusätzlich durch

weitere Charakteristika von der mitochondrialen β-Oxidation, beispielsweise durch eine

andere Substratspezifität (143, 187).

Zur energetischen Nutzung der Fettsäuren mittels mitochondrialer β-Oxidation sind einige

vorbereitende Schritte notwendig: 1.) Aufnahme der Fettsäure in die Zelle 2.) Aktivierung

dieser zu Acyl-CoA mittels der Acyl-CoA-Synthetase und 3.) Einschleusen in das

Mitochondrium, für langkettige Fettsäuren über den sogenannten Carnitinshuttles (133), an

dem vier Enzyme beteiligt sind (Carnitintransporter, CPT I und II, Carnitintranslocase) (143,

170). Fettsäuren mit weniger als 10 Kohlenstoffatomen passieren die beiden Mitochondrien-

membranen ohne Hilfsmittel (143, 170). Der reine β-Oxidations-Zyklus besteht dann aus

einer Sequenz von vier Reaktionsschritten, die jeweils enzymatisch katalysiert werden: Acyl-

CoA-Dehydrogenation, Enoyl-CoA-Hydratation, 3-Hydroxy-Acyl-CoA-Dehydrogenation und

die Ketoacyl-Thiolyse. Dabei ist nicht, wie lange angenommen, ein einzelnes Enzym je

Schritt für alle Fettsäuren zuständig, sondern es besteht eine ausgeprägte Substratspezifität. Je

Einzelschritt existieren mehrere Enzyme, nach heutigem Kenntnisstand je zwei oder drei, mit

jeweils divergierenden Aktivitätsmaxima bei unterschiedlichen Kettenlängen der Fettsäuren.

Die Substratlängenspezifität spiegelt sich im Enzymnamen wider (61, 143, 170, 187).

Obgleich das Aktivitätspektrum für jedes Enzym nicht einfach aus dem Namen übertragbar

ist, gelten als Richtwerte Fettsäuren mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen als kurzkettig (SC), mit 6

bis 10 Kohlenstoffatomen als mittelkettig (MC), mit 12 bis 18 als langkettig (LC) und mit 20

bis 26 Kohlenstoffatomen als sehr langkettig (VLC) (133). Eine schematische Darstellung der

β-Oxidation einer langkettigen Fettsäure gibt Abbildung 2.1 wieder. Jeder β-Oxidations-

Zyklus verkürzt die Fettsäurekette um zwei Kohlenstoffatome und produziert energiereiche

Moleküle für die Atmungskette (FADH2, NADH) sowie Acetyl-CoA, welches im Zitratzylus


20

völlig metabolisiert und damit ebenfalls über die Atmungskette energetisch genutzt oder in

der Leber zur Ketogenese verwendet werden kann. Bei Nahrungskarenz ist die

Ketonkörperproduktion erhöht und die Leber exportiert diese in anderen Geweben energetisch

nutzbaren Moleküle (143). Die verkürzte Fettsäurekette durchläuft den β-Oxidations-Zyklus

je nach Kettenlänge mehrfach.

Abb 2.1: Die mitochondriale β-Oxidation und Ketogenese am Beispiel der Metabolisierung einer langkettigen Fettsäure, aus: 171 Legende: LCFA= long-chain fatty acid, FATP= fatty acid transporting polypeptide, CPT I= carnitine palmitoyl transferase I, CPT II= carnitine palmitoyl transferase II, OCTN2= carnitine transporter, CACT= carnitine acylcarnitine translocase, VLCAD= very long-chain acyl-CoA dehydrogenase, TFP= trifunctional protein, LCEH= long-chain enoyl-CoA hydratase, LCHAD= long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, LCKAT= long-chain ketothiolae, MCAD= medium-chain acyl-CoA dehydrogenase, SCAD= short-chain acyl-CoA dehydrogenase, SCEH= short-chain enoyl-CoA hydratase, SCHAD= short-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, MCKAT= medium-chain ketothiolase, BOB= β-hydroxybutyrate, AcAc= acetoacetat, ETF= electron transport flavoprotein, ETFDH= electron transport flavoprotein dehydrogenase, FAD= flavin adenin dinucleotide, FADH2= reduced flavin adenin dinucleotide, NAD= nicotinamid adenine dinucleotide, NADH= reduced nicotinamid adenine dinucleotide, HMG= 3-hydroxy-3-methylglutaryl

Diverse Defekte der dargestellten, in die β-Oxidation direkt oder indirekt involvierten

Enzyme wurden bis heute ermittelt (22, 143). Eine der häufigsten Störungen der mitochon-

drialen Fettsäureoxidation scheint insbesondere in Nordwesteuropa der MCAD-Defekt zu sein


21

(63, 139, 143). Ebenfalls häufig in dieser Gruppe von Defekten ist der LCHAD-Defekt (139).

In Finnland stellt er die meistdiagnostizierte angeborene β-Oxidations-Störung dar (175).

2.2.2 LCHAD-Defekt (MIM143450)/ MTP-Defekt (MIM251890)

Die ersten biochemisch nachgewiesenen LCHAD-Defekt-Fälle wurden 1989 durch zwei

Forschergruppen veröffentlicht (116, 128, 184, 186). Andere Wissenschaftler waren bereits

vorher oder zeitnah auf entsprechende Konstellationen von Laborwerten gestoßen ohne den

neuen Defekt explizit zu benennen (46, 55, 175). Mit der Entdeckung des mitochondrialen

trifunktionalen Proteins (MTP) 1992, welches die katalytischen Aktivitäten der LCEH,

LCHAD und der LCKAT gemeinsam im Sinne eines Multienzymkomplexes aufwies, konnten

beobachtete kombinierte Defekte der drei letzten Schritte der β-Oxidation langkettiger Fett-

säuren erklärt werden (80, 185). Seither werden isolierte Defekte der LCHAD, auch Typ I-

Defekt genannt, von Defekten aller drei Enzyme, den sogenannten MTP-, TFP- oder Typ II-

Defekten, unterschieden (76, 80, 86, 115, 185). Der isolierte Defekt scheint weitaus häufiger

zu sein als der kombinierte (133, 187).

Den Boer et al. veröffentlichten eine große retrospektive Analyse zur klinischen Präsentation

und Entwicklung von 50 unselektierten Patienten mit isoliertem LCHAD-Defekt aus ganz

Europa (32). Demnach manifestierten sich alle Fälle innerhalb der ersten 26 Lebensmonate,

im Median um den 6. Lebensmonat, 15 % bereits neonatal. Außerdem trat der LCHAD-

Defekt bei nahezu 80 % der Patienten durch eine akute Stoffwechselentgleisung mit hypo-

ketotischer Hypoglykämie in Erscheinung. Weitere mögliche Symptome dieser akuten

Entgleisung waren in absteigender Häufigkeit hepatische Dysfunktion (79 %), Koma,

Krampfanfall, Apnoeanfall, Herzkreislaufstillstand, Arrhythmien oder plötzlicher Tod (9 %).

Prozentuell mehr Patienten als bisher angenommen, knapp über 20 % präsentierten bei Erst-

diagnose chronischen Beschwerden ohne initiale akute Dekompensation. Auch ließen sich

retrospektiv bei über 80 % der Patienten mit akuter Manifestation bereits vorher bestehende,

unspezifische, aber den chronischen vergleichbare Symptome ermitteln (32). Zu den artikel-

übergreifend beschriebenen chronischen Symptomen bei LCHAD-Defekt gehören: Hepato-

megalie und Leberdysfunktion, Cholestase, Kardiomyopathie, muskuläre Hypotonie/

Myopathie, Gedeihstörung, Probleme der Nahrungsaufnahme, Erbrechen und andere un-

spezifische gastrointestinale Symptome, Lethargie, psychomotorische Retardierung, Mikro-

zephalie und seltenere Symptome (32, 116, 128, 175). Für mitochondriale β-Oxidations-


22

Defekte ansonsten unüblich wurden beim LCHAD-Defekt außerdem eine periphere Neuro-

pathie und eine initial das Pigmentepithel betreffende Retinopathie beschrieben. Sie gelten als

relativ spezifisch (143, 175).

Die Klinik des MTP-Defekts unterscheidet sich nach heutigen Kenntnisstand nicht eindeutig

von der des isolierten Defekts der LCHAD (175, 187). Neben vergleichbaren schweren

akuten und frühen klinischen Formen (24, 185, 187) konnten bei insgesamt geringer Gesamt-

fallzahl bislang auch mehrere Fälle benigner adulter Präsentation mit Myalgie, rekurrierender

belastungsinduzierter Rhabdomyolyse und peripherer Neuropathie berichtete werden (115,

149).

In der bereits zitierten Studie von Den Boer et al. war die Mortalitätsrate des isolierten

LCHAD-Defekts nahezu 40 % und die Morbiditätsrate mit rekurrierenden Stoffwechsel-

entgleisungen und anderen chronischen Problemen trotz Therapie hoch (32).

Die Diagnosestellung erfolgt über eine Metabolitenanalyse in Blut oder Urin, Enzym-

(Aktivitäts-) Messungen und über molekulargenetische Analysen (133). Richtungsweisend ist

ein typisches Acylcarnitin-Profil mit erhöhten C16:0-, C16:1-, C18:0- und C18:1-Acylcarnitinen im

Blut bei sekundär niedrigem Gesamt-Serum-Carnitin (175, 187). Insbesondere während der

akuten metabolischen Entgleisung zeigen sich außerdem bei vielen Patienten im Urin 3-

Hydroxy-Dicarboxysäuren der Kettenlänge C6-14 und andere typische Säuren (187).

Anschließende zielgerichtete Enzymanalysen an entnommenen Körperzellen ermitteln bei

isoliertem LCHAD-Defekt den separaten Ausfall dieses Enzyms bei nahezu normalen

Aktivitäten der beiden anderen Enzymkomponenten des MTP-Moleküls. Ein weitest gehender

Ausfall aller drei Enzymaktivitäten und eine mittels Immunoblot nachgewiesene, starke

quantitative Dezimierung der MTP-Untereinheiten belegen einen MTP-Defekt (187).

Molekulargenetische Untersuchungen haben bei unbekannter molekularer Familienanamnese

wegen der potentiellen Vielzahl der Mutationen keinen ausschließenden, sondern lediglich

konfirmativen Charakter (s.u.) (133). Bei bekanntem familiären Mutationsspektrum bieten sie

allerdings eine schnellere und kostengünstigere Diagnosemöglichkeit im Vergleich zu oben

genannten Enzymstudien (49).

Typisches pathologisches Korrelat der mitochondrialen β-Oxidations-Defekte sind

Fettablagerungen in verschiedenen Geweben, insbesondere in der Leber (170, 176). Beim

LCHAD-Defekt wurden typischerweise folgende histopathologischen Befunde beschrieben,

die in ihrer Ausprägung jedoch selbst bei gleichem Mutationsmuster individuell stark

schwanken können (176): makrovesikuläre Leberzellverfettung mit peri- oder panlobulärem

Verteilungsmuster, periportale Leberfibrose oder Leberzirrhose, eher mikrovesikuläre Lipid-


23

ablagerungen in Nierentubuluszellen, Myokardzellen und Skelettmuskelzellen, sowie

Störungen der Mitochondrien-Ultrastruktur (143, 175, 176).

In der akuten klinischen Krise ist therapeutisch die intravenöse Glukosegabe obligat.

Langfristige therapeutische Strategien sind die Vermeidung längerer Fastenperioden durch

regelmäßige Nahrungszufuhr, besonders in Infektsituationen, und die diätetische Einstellung

auf eine kohlenhydratreiche, fettreduzierte Nahrung, ggf. angereichert mit mittelkettigen

Triglyceriden (32, 175).

2.2.2.1 Molekulare Grundlagen

Das mitochondriale trifunktionale Protein (MTP), auch TFP genannt, ist nach heutigem

Kenntnisstand ein Heterooktamer aus vier α- und vier β-Subunits mit einem Gesamtgewicht

von 460 kDa (187). Wie das VLCAD-Molekül ist es an die innere Mitochondrienmembran

gebunden (vgl. Abb. 2.1). Alle anderen bis heute entdeckten Enzyme der vier Reaktionen der

β-Oxidation sind Matrixmoleküle (187). Für die LCHAD-Aktivität war die Membran-

gebundenheit bereits seit ihrer Erstbeschreibung 1982 vermutet worden (37). Die Entdeckung

des MTP als membrangebundenen Multienzymkomplex erfolgte aber erst ab 1992 in

unterschiedlichen Spezies (21, 22, 102, 177). Die α-Subunit des MTP hat ein Molekular-

gewicht von 79 kDa (reifes Protein) und trägt die Enzymaktivitäten der LCEH (N-terminal)

und der LCHAD (C-terminal), die β-Untereinheit mit ihren 47 kDa (reifes Protein) die der

LCKAT (84, 69). Mehrere Forschungsergebnisse stützen die These, dass für die Stabilität und

katalytische Aktivität des MTP-Moleküls beide Untereinheiten obligat sind, da bei Fehlen

oder struktureller Veränderung der einen Untereinheit die jeweils andere, obgleich strukturell

intakt, recht schnell nicht mehr nachweisbar ist (14, 84, 122, 178).

Jede der beiden Untereinheiten wird von einem eigenen nukleären Gen codiert, für die α-

Subunit HADHA und für die β-Subunit HADHB genannt. Dabei sind beide Gene auf dem

kurzen Arm von Chromosom 2 (2p23) lokalisiert (1, 193). Nach neueren Erkenntnissen sind

sie dort in einer sogenannten Head-to-Head-Anordnung organisiert mit jeweils gegenläufigem

Sinnstrang und beiden Genen gemeinsamer, das jeweilige 5`-Ende flankierender Region.

Diese gemeinsame Region umfasst etwa 350 Basenpaare und ihr konnten bidirektionale

Promotoraktivitäten nachgewiesen werden, die durch den Transkriptionsfaktor Sp1 reguliert

werden konnten (1, 124).


24

Die cDNA-Sequenzen der Untereinheiten des humanen MTP wurden 1994 kurz nach denen

anderer Spezies entschlüsselt (84, 85). HADHA (OMIM 600890) codiert beim Menschen ein

Protein mit 763 Aminosäuren (AS), inklusive eines 36 AS umfassenden mitochondrialen

Signalpeptids (84). HADHB (OMIM 143450) codiert ein Protein mit 474 AS inklusive eines

33 AS umfassenden Signalpeptids (84). Die genomische Struktur des HADHA umfasst 20

Exons mit einer Verbindungssequenz zwischen beiden katalytischen Eigenschaften der α-

Subunit im Bereich des Exons 9 (ca. Exon 8 bis 11). Exon 1 und 2 codieren das Signalpeptid.

HADHA umspannt einen Bereich von über 52 kb. HADHB umfasst 16 Exons (69, 71). Eine

strukturelle Übersicht gibt Abbildung 2.2.

Abbildung 2.2: Struktur der cDNA der MTP-Untereinheiten, enzymatische Aktivitätszuordnungen basierend auf Homologiestudien; aus: 71, 163

Bekannt ist außerdem, dass die α-Subunit und das sogenannte Gastrinbindende Protein (GBP)

eine sehr ähnliche cDNA- und Aminosäure-Sequenz aufweisen und daher wahrscheinlich ein

weitestgehend identisches Protein mit vermutlich unterschiedlicher Funktion darstellen (6,

196).

2.2.2.2 Mutationsspektrum

In den letzten Jahren konnten einige kausale Mutationen bei beiden Typen des LCHAD-

Defekts nachgewiesen werden (vgl. auch OMIM).

Beim MTP-Defekt sind sowohl Mutationen der α- als auch der β-Untereinheit beschrieben

worden (14, 69, 123, 163, 178). Wie bereits erläutert, scheint für die Stabilität beider Unter-


25

einheiten die korrekte Formation des MTP wichtig zu sein. Auf diesem Wege lässt sich der

Einfluss von Mutationen des HADHA auf die HADHB-codierte LCKAT-Aktivität erklären

(175, 178).

Zwei Forschergruppen entdeckten 1994 unabhängig voneinander in den USA und den

Niederlanden die erste und bislang häufigste Mutation bei Patienten mit isoliertem LCHAD-

Defekt (Ijlst et al. (77), Sims et al. (160)). Erwähnte Mutation ist der Basenaustausch G1528C

in Exon 15 des HADHA, welcher eine Substitution der Aminosäure Glutaminsäure gegen

Glutamin an Position 474 (reifes Protein) (160) bzw. 510 (inklusive Signalpeptid) (77) der α-

Subunit bewirkt. Expressionsstudien belegen die drastische Reduktion der enzymatischen

Aktivität der LCHAD durch diese Mutation bei fehlender Abnahme der immunologisch

nachweisbaren MTP-Moleküle (74, 160). Sie ermöglicht demnach eine stabile Formation des

MTP (163). Aus Homologieanalysen ist außerdem bekannt, dass die Mutation nahe einer

potentiellen NAD-Bindungssequenz lokalisiert ist und damit im aktiven Zentrum des

LCHAD-Enzyms liegen dürfte (160, 163, 175). Näheres dazu findet sich bei Ibdah et al. (71).

Der Ursprung der Mutation wird in Nordeuropa vermutet (163).

Die Dominanz von G1528C beim isolierten LCHAD-Defekt wurde vielfach belegt:

Untersuchungen aus Finnland zeigten bei allen bis 1999 diagnostizierten 28 Fällen von

LCHAD-Defekt eine Homozygotie für diese Mutation und ermittelten eine Heterozygoten-

frequenz in der finnischen Population von 1:240 (175). Die niederländischen Erstbeschreiber

(77) veröffentlichten mehrere Aktualisierungen ihrer initialen Fallstatistik und ermittelten

Allelfrequenzen der G1528C unter LCHAD-Patienten von 87 % (74) und 90 % (75). Sims et

al. in den USA konnten zunächst in ihrem Patientenkollektiv mit 26 LCHAD-Fällen eine

Allelfrequenz von nur knapp 35 % darstellen und vermuteten eine signifikante Heterogenität

der HADHA-Mutationen in den USA (78). Später revidierten sie ihre Prozentangabe und

beschrieben eine Allelfrequenz unter Patienten mit isoliertem LCHAD-Defekt von 71 %.

Außerdem ermittelte diese Forschergruppe eine Heterozygotenfrequenz in einem kleinen

Kollektiv asymptomatischer US-Amerikaner von 1:176 (66). Sie schlossen daraus auf eine

Häufigkeit des isolierten LCHAD-Defekts in den USA von 1:62000 Schwangerschaften, für

beide MTP-Defekt-Typen kumulativ auf 1:38000 Schwangerschaften (66).

Evident wurde das große phänotypische Spektrum der G1528C. Bei Homozygotie kann weder

auf die Schwere oder Ausprägung der Klinik noch auf histopathologische Merkmale

geschlossen werden (76, 174, 176). Sowohl schwere als auch leichtere sowie atypische

Krankheitsverläufe sind bei homozygotem Status möglich (67, 76, 174).


26

Verschiedene weitere Mutationen des HADHA bei LCHAD-Patienten ohne spezielle

Häufungen und meist familienspezifisch wurden bislang veröffentlicht (32, 66, 73, 75, 160).

Bemerkenswerter Weise beschränken sich die Mutationen beim isolierten LCHAD-Defekt

dabei nicht auf den Bereich, der allein die LCHAD-Aktivität codiert (163).

Spiekerkoetter et al. konnten bei zwei Patienten die Manifestation des MTP-Defekts auf

Grund einer maternalen Isodisomie des Chromosoms 2 nachweisen und erweiterten damit das

Spektrum möglicher genetischer Mechanismen bei dieser Defektart (161).

2.3 Klinische Assoziation von LCHAD-Defekt und HELLP-Syndrom

Bereits parallel zu den ersten Fallbeschreibungen des LCHAD-Defekts mehrten sich die

Beobachtungen über eine klinische Assoziation von LCHAD-Defekt des Kindes und dem

Auftreten von bestimmten Schwangerschaftskomplikationen der Mütter in den betroffenen

Schwangerschaften (55, 79, 151, 160, 168). Wilcken et al. veröffentlichten 1993 sechs Fälle

dieser Assoziation bei fünf verschiedenen Müttern in elf Schwangerschaften, wobei die

Mütter nur in Schwangerschaften mit betroffenem Fetus, nicht aber bei nicht betroffenem

Fetus erkrankten (190). Zu den beschriebenen Schwangerschaftskomplikationen dieser

Artikel gehörten, insbesondere auch rekurrierend, nicht weiter spezifizierte Hepatosen, sowie

die AFLP, das HELLP-Syndrom und die schwere Hyperemesis gravidarum. Später wurde das

Spektrum der möglichen Komplikationen um die Präeklampsie ergänzt (67, 173).

Mehrere Untersuchungen an größeren Kollektiven stützten die Beobachtungen und ermittelten

konkrete Zahlen: Tyni et al. analysierten in Finnland, ausgehend von diagnostizierten

Patienten mit LCHAD-Defekt Typ I, in 18 betroffenen Familien 63 Schwangerschaften. Die

Schwangerschaftskomplikationen HELLP-Syndrom, AFLP und Präeklampsie traten nur in

Schwangerschaften mit betroffenem Fetus und dort mit einer kumulativen Frequenz von 31 %

auf. Dieses entsprach einer statistisch signifikanten Häufung bei betroffenem Fetus. Das

HELLP-Syndrom alleine komplizierte 10 % dieser Schwangerschaften (173).

Ibdah et al. untersuchten 19 Patienten mit isoliertem Defekt der LCHAD und fanden das

HELLP-Syndrom oder die AFLP in diesem Kollektiv bei 79 % der entsprechenden Schwan-

gerschaften. Die Komplikationen traten jedoch nicht auf, wenn die Mütter mit gesunden oder

heterozygoten Geschwistern schwanger waren. Parallel durchgeführte molekulargenetische

Untersuchungen zeigten, dass die häufige G1528C-Mutation bei allen betroffenen Feten, und

damit auch bei allen komplizierten Schwangerschaften, mindestens auf einem Allel


27

vorhanden war, wobei dieses Allel jedoch nur in zwei Drittel der Fälle maternalen Ursprungs

war (66). Bei den in gleicher Studie untersuchten 5 MTP-Defekt-Patienten konnten weder

genannte Schwangerschaftskomplikationen noch ein Vorliegen der G1528C gefunden werden

(66). Daher vermuteten diese Forscher, dass die Schwangerschaftskomplikationen nur beim

isolierten Defekt des LCHAD auftreten und an das fetale Vorliegen der G1528C gebunden

sind (163).

Entgegen diesen Beobachtungen von Ibdah et al. (66, 163) konnte jedoch auch bei einigen der

insgesamt seltenen Fälle eines MTP-Defekts eine Assoziation mit hepatischen Schwanger-

schaftskomplikationen der Mutter beschrieben werden, wobei aber die vorherrschende Mu-

tation G1528C im überwiegenden Teil der Fälle auch hier nicht vorlag (23, 78). Auch wurden

in einigen Fällen Schwangerschaftskomplikationen bei enzymatisch heterozygoten Feten

berichtet, deren Wertigkeit allerdings strittig ist (72, 140, 169).

Zusammenfassend weisen die Studien auf eine deutliche klinische Assoziation von hepa-

tischen Schwangerschaftskomplikationen, insbesondere AFLP und HELLP-Syndrom, mit

dem isolierten LCHAD-Defekt und der G1528C-Mutation des HADHA hin (71, 163).

Basierend auf diesen Befunden stellten sich Fragen zur Rolle dieser Assoziation in der

Pathogenese hepatischer Schwangerschaftskomplikationen und zu eventuell gemeinsamen

pathophysiologischen Mechanismen (5, 9, 11, 67, 71, 82, 140, 151, 163, 168).

Zu Beginn der experimentellen Phase der vorliegenden Arbeit im Februar 2000 existierten nur

wenige Studien über den Anteil von Schwangerschaften mit LCHAD-defektem Fetus bei und

ausgehend von Patientinnen mit Schwangerschaftskomplikationen (163). Die Befunde einer

Studie von Treem et al. aus dem Jahr 1996 an 12 vermeintlich unselektierten AFLP-

Patientinnen ist auf Grund eines Selektionsbias schwer zu bewerten (169). Mansouri et al.

untersuchten im gleichen Jahr prospektiv 14 AFLP-Patientinnen auf die G1528C- und die

C1132T-Mutation des HADHA. Keine der Mutationen konnte in dem Kollektiv nachgewiesen

werden (106).

Auf der anderen Seite stützten mehrere Erkenntnisse und Beobachtungen aus der Forschung

zur Präeklampsie, zum HELLP-Syndrom und zur AFLP die These einer möglichen

pathogenetischen Rolle:

Die histopathologischen Merkmale, die hauptsächlich die Leber betreffen, weisen bei allen

genannten Erkrankungen gewisse Ähnlichkeiten auf: Wie bereits in den jeweiligen Kapiteln

erläutert, ist sowohl für den LCHAD-Defekt als auch für die AFLP, sowie studienabhängig

ebenfalls für das HELLP-Syndrom die makro- oder mikrovesikuläre Verfettung der Hepato-


28

zyten und ggf. weiterer Gewebe ein klassisches histologisches Korrelat (vgl. Kap. 2.1.1,

2.2.2). Eine mikrovesikuläre Verfettung konnte auch bei Präeklampsie-Patientinnen

dargestellt werden, wenngleich mit Einschränkungen (28, 112). Einige Forscher interpretieren

in diesem Zusammenhang Präeklampsie, HELLP-Syndrom und AFLP als unterschiedliche

Stadien im Kontinuum einer einzigen Erkrankungsform (19, 27, 38, 112).

In den letzten Jahren wurden außerdem bei der Erforschung der Pathophysiologie der Prä-

eklampsie, des HELLP-Syndroms sowie der AFLP Störungen im Bereich des Lipidstoff-

wechsels deutlich und deren mögliche Bedeutung im pathogenetischen Gesamtkontext

diskutiert (38, 50, 51, 100, 147, 189). Einerseits sind die Spiegel freier Fettsäuren und der

Gesamt-Triglyzeride bei präeklamptischen Frauen über das schwangerschaftstypische Maß

hinaus erhöht (100, 129, 147, 189). Andererseits findet sich eine bereits in der normalen

Schwangerschaft gestörte β-Oxidation, die mit dem Gestationsalter weiter zunimmt (50, 51)

und möglicherweise bei der Präeklampsie durch Zytokine wie TNF-α oder andere Mechanis-

men weiter beeinträchtigt ist (38, 148). Zusätzliche Störungen der β-Oxidation wie ein

latenter genetischer Defekt könnten in dieser Konstellation demaskiert werden und den

Krankheitsprozess vorantreiben (38, 148).

Unter der Annahme einer geringen Präzision genomweiter Scans (118) und der oben

genannten These eines pathophysiologischen Kontinuums von Präeklampsie, HELLP-

Syndrom und AFLP ist außerdem die gleichzeitige Lage des PREG 1 sowie des HADHA und

HADHB auf dem kurzen Arm von Chromosom 2 eine interessante Beobachtung (vgl. Kap.

2.1.2.6, 2.2.2.1).


29

2.4 Fragestellung und Ziel der Arbeit

Auf Grund der dargestellten Aspekte ist HADHA als ein potentielles Kandidatengen für das

HELLP-Syndrom anzusehen. Eine Analyse des HADHA in einem Kollektiv von HELLP-

Patientinnen sollte die Rolle dieses Gens in der Genese des HELLP-Syndroms beleuchten und

folgende Fragen untersuchen:

Inwieweit lässt sich die beschriebene klinische Assoziation in einem prospektiven

Untersuchungsansatz ausgehend von einem unselektierten HELLP-Patientinnen-Kollektiv auf

molekulargenetischer Ebene darstellen? Eine Mehrzahl der bei Untersuchungsbeginn im

Februar 2000 vorliegenden Studien ging retrospektiv vom erkrankten Kind aus und stellte nur

diese Assoziationsrichtung dar. Die Frage nach der Stärke der Assoziation aus dem

Blickwinkel der Schwangerschaftskomplikation blieb unbeantwortet. Insbesondere ist dabei

die Rolle der häufigen G1528C-Mutation zu untersuchen.

Im nächsten Schritt stellt sich dann die Frage: Handelt es sich bei HADHA um ein maternales

Risikogen? Sollten sich signifikante Häufigkeitsunterschiede bestimmter Sequenzvarianten

des HADHA zwischen HELLP-Patientinnen und Kontrollpersonen feststellen lassen, so

könnten diese Varianten einen prädisponierenden maternalen Faktor darstellen. Die Art und

Stärke des Einflusses der Variante auf die Pathogenese des HELLP-Syndroms müsste in

Folgeuntersuchungen geklärt werden. Ein Einfluss ist insbesondere dann zu vermuten, wenn

sich die Variante bei der Patientin im heterozygoten Zustand findet und beim Fetus der

betroffenen Schwangerschaft nicht darstellen lässt. Sind davon ausgehend eventuell spezielle

Subtypen von HELLP-Patientinnen zu unterscheiden?

Welche Rolle spielt der fetale Genotyp des HADHA? Die Art der dargestellten klinischen

Assoziation lässt erneut eine zentrale Rolle der fetoplazentaren Einheit in der Pathogenese des

HELLP-Syndroms vermuten. Zu untersuchen wäre, inwieweit der fetale Genotyp des HADHA

in die Genese des HELLP-Syndroms involviert ist. Um den Rahmen der Arbeit angemessen

zu halten, sollte dieses nur anhand der häufigen Mutation G1528C geschehen.

Zur Klärung dieser Fragen wurden zwei Untersuchungsansätze auf der Grundlage eines

Kollektivs von HELLP-Patientinnen und deren Kindern gewählt:

Zum einen wurden bei den HELLP-Patientinnen Mutter-Kind-Paarungen oder, wenn dieses

nicht möglich war, Mutter-Vater-Paarungen erstellt und in diesen die Prävalenz der häufigen

G1528C-Mutation mittels Restriktionsanalyse ermittelt. Kind und Vater bezogen sich jeweils

auf die betroffenen Schwangerschaften. Die ermittelten Daten wurden mit denen eines


30

entsprechenden Kontrollkollektivs von Müttern mit unkomplizierten Schwangerschafts-

verläufen verglichen.

Zum anderen wurde das Gen HADHA aller HELLP-Patientinnen durch Screening-Methoden

nach weiteren Mutationen durchsucht. Dieser zweite Untersuchungsansatz war notwendig, da

für den LCHAD-Defekt in einigen Populationen eine signifikante allelische Heterogenität

beschrieben wurde und da in den Assoziationsstudien das maternale Allel in einem Drittel der

Fälle nicht die G1528C trug. Bei Darstellung weiterer Mutationen im Kollektiv sollten auch

diese auf ein Kopplungsungleichgewicht hin untersucht werden.

Aus neuen pathogenetischen Erkenntnissen bezüglich des HELLP-Syndroms erhoffen sich

Kliniker die Entwicklung prädiktiver Marker, um Risikokollektive besser identifizieren zu

können. Schwangerschaften in diesen Kollektiven könnten dann besser überwacht werden,

eventuell wären präventive Maßnahmen etablierbar. Nicht zuletzt könnten sich auch neue,

früher im Krankheitsprozess greifende Therapie-Optionen entwickeln lassen.

Die Klärung obiger Fragen diente aber nicht nur möglichen zukünftigen Verbesserungen der

Behandlungsoptionen, sondern hatte eine aktuelle diagnostische und therapeutische Relevanz

für den Feten: Einige Forscher empfahlen in Anbetracht der starken Assoziation von

hepatischer Schwangerschaftskomplikation und LCHAD-Defekt eine molekulargenetische

Untersuchung von Kindern aus derartig komplizierten Schwangerschaften direkt nach der

Geburt und bis zum Ausschluss eines Defekts eine prophylaktische diätetische Behandlung

des Neugeborenen (163, 170). Die vorliegende Arbeit sollte zur Validierung eines derartigen

Vorgehens beitragen.

3. Material und Methoden

31


3.1 Patientenkollektive und Kontrollgruppen

3.1.1 Gesamt-Patientenkollektiv

Die Rekrutierung des Patientenkollektivs erfolgte nach Zustimmung durch die

Ethikkommission auf den Wochenbettstationen des Universitätsklinikums der RWTH Aachen

sowie der regionalen Krankenhäuser in den Jahren 1999 und 2000. Des Weiteren konnte auf

ein bereits vorhandenes Kollektiv der Frauenklinik der Universität Essen zurückgegriffen

werden (n=75). So konnten 135 Patientinnen mit HELLP-Syndrom ermittelt werden. Zur

Analyse wurde EDTA-Blut entnommen. Sofern eine Zustimmung vorlag, wurde ebenfalls

Nabelschnurblut des Kindes, welches aus der betroffenen Schwangerschaft hervorgegangen

war, oder ggf. EDTA-Blut des entsprechenden Kindsvaters gewonnen.

Die Diagnosekriterien bezüglich des HELLP-Syndroms wurden entsprechend den

Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe (vgl. Kapitel

2.1) folgendermaßen festgelegt:

• Hämolyse: Haptoglobin-Erniedrigung (soweit bestimmt) bzw. LDH-Erhöhung

• Erhöhung der SGOT oder SGPT auf Werte oberhalb der dreifachen

Standardabweichung

• Thrombozytenabfall unter 100000/μl

Als Ausschlusskriterium galten eine Autoimmunerkrankung in der Vorgeschichte sowie

Mehrlingsschwangerschaften.

3.1.1.1 Patientenkollektiv der Restriktionsanalyse zu G1528C

Für die Restriktionsanalyse wurden Mutter-Kind-Paarungen aus dem unter 3.1.1 genannten

Gesamtkollektiv erstellt. War die DNA des Kindes der betreffenden Schwangerschaft nicht

vorhanden, so wurde die DNA des Vaters der durch das HELLP-Syndrom komplizierten

Schwangerschaft verwandt. Durch dieses Verfahren konnten 92 Mutter-Kind-Paarungen und

23 Vater-Kind-Paarungen ermittelt werden, so dass die Gesamtzahl der korrelierten Paare 115

betrug. Außerdem wurden die restlichen vorhandenen HELLP-Patientinnen des Gesamt-

kollektivs, denen kein Kind/Vater-Partner zugeordnet werden konnte, ebenfalls herangezogen,


32

so dass insgesamt 135 Indexpatientinnen untersucht werden sollten und damit auch 20

Patientinnen ohne entsprechenden Restriktions-Partner.

Im Rahmen der Analyse ließen sich dann von 4 Index-Patientinnen keine PCR-Produkte

etablieren und eine weitere Patientin musste retrospektiv aufgrund einer Gemini-

Schwangerschaft ausgeschlossen werden. Von diesen Ausfällen waren 2 Mutter-Kind-

Paarungen und eine Mutter-Vater-Paarung betroffen. Effektiv an der Restriktionsanalyse zur

G1528C-Mutation haben daher folgende Gruppierungen teilgenommen:

130 Indexpatientinnen mit HELLP-Syndrom

von diesen ausgehend

90 Mutter-Kind-Paarungen und

22 Mutter-Vater-Paarungen.

Folglich wurden 18 unkorrelierte HELLP-Patientinnen zusätzlich zu den Paarungen

untersucht.

3.1.1.2 Patientenkollektiv der SSCP-Analyse

Für die SSCP-Analyse war ein Kollektiv von 103 Patientinnen mit HELLP-Syndrom aus dem

unter 3.1.1 genannten Gesamt-Kollektiv von 135 HELLP-Patientinnen vorgesehen. Richt-

größe der mindestens pro Exon analysierten Patientinnen sollte dabei 100 Probanden sein. Die

resultierende Überzahl von 3 Patientinnen sollte vor einem Absinken der untersuchten

Patientenzahlen unter 100 durch retrospektive Ausschlüsse und bei einzelnen, sporadischen

PCR-Ausfällen vor einer aufwendigen Wiederholung eines gesamten SSCP-Durchlaufs mit

seinen 4 Gelen schützen. Auch im SSCP-Kollektiv musste retrospektiv die bereits unter

3.1.1.1 genannte Patientin auf Grund ihrer Gemini-Schwangerschaft ausgeschlossen werden,

so dass letztendlich pro Exon maximal 102 Patientinnen analysiert wurden. In folgenden

Exons wurden diese 102 Patientinnen komplett untersucht: Exon 1, 3 bis 8, 11, 12, 14 und 16

bis 20. In den restlichen Exons, also Exon 2, 9, 10, 13 und 15, variierten die

Untersuchungszahlen zwischen 100 und 101 Patientinnen. Die Ausfälle trafen jeweils

unsystematisch unterschiedliche Patientinnen.


33

3.1.2 Kontrollgruppe

Das gesamte Kontrollkollektiv bestand aus insgesamt 115 gesunden Müttern, die parallel zum

Patientenkollektiv in den Kliniken des Aachener Raums von 1999 bis 2000 rekrutiert wurden.

Auch hier wurde EDTA-Blut gewonnen. Die Frauen mussten mindestens eine unkomplizierte

Schwangerschaft ausgetragen haben, die nicht länger als 5 Jahre zurück lag.

Ausschlusskriterien waren: Hypertensive Schwangerschaftserkrankung in der Anamnese bzw.

Teilsymptome einer solchen wie z.B. Proteinurie, Diabetes mellitus oder Gestationsdiabetes,

Schilddrüsenerkrankungen, Autoimmunerkrankungen oder kardiovaskuläre Erkrankungen.

Für die Restriktionsanalyse zu G1528C wurden aus dem Gesamtkontrollkollektiv nach dem

Zufallsprinzip 103 gesunde Schwangere als Kontrollen gezogen und verwandt.

Im Rahmen der SSCP-Analysen wurden, wenn nötig, ebenfalls zufällig ausgewählte

Kontrollpersonen des Gesamtkollektives (n= 109) genutzt.

3.2 Arbeitsmaterialien

3.2.1 Chemikalien

Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit verwendeten Chemikalien wiesen ausnahmslos die

Qualität „pro analysis“ auf und wurden von nachstehenden Firmen bezogen:

Amresco, Ohio, USA

Bio-Rad, Hercules, USA

Boehringer, Mannheim, D

Gibco BRL, Eggenstein, D

ICN Biomedicals, Ohio, USA

Merck, Darmstadt, D

Riedel-de Haen, Seelze, D

Roth, Karlsruhe, D

Serva, Heidelberg, D

Sigma- Aldrich, Deisenhofen, D


34

3.2.2 Enzyme, Feinchemikalien und Kits

ABI Prism BigDye Terminator

Sequencing Reaction Kit

Perkin Elmer Biosystems, Weiterstadt, D

Längenstandards:

50bp-Leiter (1μg/μl)

100bp-Leiter (1μg/μl)



Nukleotide: dATP, dGTP, dCTP, dTTP Gibco BRL, Eggenstein, D

QIAamp DNA Blood Midi kit QUIAGEN GmbH, Hilden, D

QUIAGEN-PCR-Purifikations-Kit QUIAGEN GmbH, Hilden, D

Restriktionsenzyme Boehringer, Mannheim, D


MBI Fermentas, St. Leon- Rot, D

New England Biolabs, Frankfurt/ Main, D

Eurogentec, Seraing, B

Taq-Polymerase Gibco BRL, Eggenstein, D

3.2.3 Primer

Die Primer wurden den nachstehenden Sequenzvorgaben entsprechend durch die Firma

MWG-Biotech AG Ebersberg, Deutschland, synthetisiert.

3.2.3.1 Primer der SSCP-Analyse und der Sequenzierungen

Für die Amplifikation der 20 Exons des Gens HADHA im Rahmen der SSCP-Analyse wurden

ausschließlich Primer verwendet, die im Intronbereich vor bzw. nach dem jeweiligen Exon

hybridisieren und den Splice-Bereich mit einschließen. Die Sequenzdaten zu den Primern

wurden gemeinsam mit der genomischen Sequenz freundlicher Weise von Dr. Arnold Strauss,

St. Louis, USA zur Verfügung gestellt. Das Primerpaar zu Exon 15 und der reverse Primer für

Exon 7 entstammen eigenen Überlegungen auf der Grundlage der übermittelten genomischen

Sequenz.


35

Exon Forward primer Reverse primer TA (°C)

FG (bp)

1 5áagtcctccgctcggcgcacccgttag3´ 5ágtcccgcaggagttctgcccggaggtctg3´ 57 181 2 5ćagctttgttatatataaaaggtactacag3´ 5ćcaaaaagcaatgtaagcatacacattaaaaag3´ 57 160 3 5´gtgtatgcttacattgctttttggatttatg3´ 5´ggaaatatgggatacatctttcccattcagg3´ 57 229 4 5´tttctgccgataagtatatttcttataatc3´ 5áaccaagataaaaggtgacttcaagtttcc3´ 57 283 5 5´gatgcatgataggataagtgtatagtgaat3´ 5´ggacagtgtctcaataactttagaatatct3´ 57 270 6 5ćttatccatctcaagttgctactaagttac3´ 5áacagatctaaagagggcgtatagcttcac3´ 57 235 7 5´gaccccctatattctcatccttgcttgcc3´ 5ćgtgcctggcctaagaggttaactctttaa3´ 57 218 8 5´ggtctaagcctgatttgcattccagtgttg3´ 5áttaaattctcaggaaagaagctttgcctttg3´ 57 221 9 5ćccaatctaggctctttatagtaaatatct3´ 5átagcagaattaagaaatttagtactcaac3´ 55 286

10 5´tctcgccaatctattcccaacgctgagcaag3´ 5ćagctttatacagaggattggatctttagtt3´ 57 182 (181)

11 5´gactgtgaagttctaccttttctcattccc3´ 5átcttcaaagcctctgtgaactttgcacac3´ 57 224 12 5´tccactttgactgaaatgattaagatcagt3´ 5áaaggacattctaactcttgcaaagagaga3´ 57 239 13 5´gcccatggacattcaataaacgttagtttc3´ 5´tgttcactacactaggattcaagtacaaca3´ 57 283 14 5ćggccagtgtcactcattagcttgctgtgg3´ 5ćaagctgtaagcctttatcagtgaatctga3´ 59 245 15 5ćattctccgatctgttggctt3´ 5ćtgcagctctgttatacagcc3´ 57 206 16 5áaggtagagtgtttcagactcagtcccagc3´ 5ágtggaagatgctgcaaacactcaggagag3´ 64 175

(176)17 5´gatttgggctgcccttcccctgaggtccct3´ 5áactaatggtgctagttatgtttccttgag3´ 57 283 18 5´tccctgagaacaaatagtaacactcccttt3´ 5ágagaaagtcaatttcccagcattagccac3´ 57 204 19 5ćgacttccattctgcatctgcggctctggc3´ 5ággctaaagtgagcttcctttcccaacctg3´ 58 267 20 5´ggttgggaaaggaagctcactttagcctgg3´ 5´tactctgataaatcaagacaccactctgtt3´ 62 314

Tabelle 3.1: Primerdaten mit Annealingtemperatur (TA in °C) und Größe des aus der PCR resultierenden Fragmentes (FG in bp) für die SSCP-Analyse und Sequenzierungen. Die Fragmentgrößen in Klammern beziehen sich auf die aufgrund der Ergebnisse der Sequenzierungen zu vermutenden, tatsächlichen Fragmentgrößen in unserem Kollektiv (vgl. Kapitel 4.4.5).

3.2.3.2 Primer der Restriktionsanalysen

Die Primersequenzen für die Restriktionsanalysen wurden basierend auf der durch Strauss

übermittelten genomische Sequenz konzipiert. Die Primerpaare für Exon 16 und 18 sowie die

reversen Primer der übrigen Exons sind mit denen der SSCP-Analyse identisch. Eine näherer

Erläuterung der Mutageneseprimer erfolgt unter Abschnitt 3.3.6..


36

Exon Primer TA (°C) Fragmentgröße (bp) 1 5´-tctccactgctgtcctcttcagctcC–3´

5´-agtcccgcaggagttctgcccggaggtctg-3´ 57 148

12 5´-tccactttgactgaaatgattaagatcagC-3´ 5´-aaaggacattctaactcttgcaaagagaga-3´

57 239

15 5´-tcccgtggacaagatgcagctgcCg-3´ 5´-ctgcagctctgttatacagcc-3´

65 145

16 5´-aaagtagagtgtttcagactcagtcccagc-3´ 5´-agtggaagatgctgcaaacactcaggagag-3´

64 175 (176)

18 5´-tccctgagaacaaatagtaacactcccttt-3´ 5´-agagaaagtcaatttcccagcattagccac-3´

57 204

Tabelle 3.2: Primerdaten und PCR-Bedingungen der Restriktionsanalysen Mutageneseprimer: Falsche Base fett und groß Die Fragmentgröße in Klammern bezieht sich auf die aufgrund der Ergebnisse der Sequenzierungen zu vermutenden, tatsächlichen Fragmentgröße in unserem Kollektiv (vgl. Kapitel 4.4.5).

3.2.4 Geräte und Arbeitsutensilien

Elektrophoresekammern

Multigel-Long-Gelkammern, Biometra, Göttingen, D

Pharmacia Gel Elekrophoresis Apparatus GNA-200,

Cambridge, GB

Elektrophoresezubehör,

Agarosegel

Gelträger, 20x 20 cm, Pharmacia, Cambridge, GB

22-Zahn-Kämme, Pharmacia, Cambridge, GB

Geltrocknung Geltrockner Modell 583, Bio-Rad, Hercules, USA

Vakuumpumpe Hydrotech, Bio-Rad, Hercules, USA

Heizblock Unitek HBS-130/E, Peqlab, Erlangen, D

Imaging-System Gel Doc 2000, Bio-Rad, Hercules, USA

Magnetrührer Ikamag RCT basic, IKA Labortechnik, Staufen, D

Photometer Gene Quant II, Pharmacia Biotech, Cambridge, GB

Pipetten Gilson, P10, P20, P100, P200, P1000, Villiers-le-Bel, F

Schüttelapparat GFL 3005, Burgwedel, D

Sequenzierer und Zubehör ABI Prism 377, Perkin Elmer Biosystems, Weiterstadt, D

Spannungsgeräte Elektophoresis Power Supply PS 304, Gibco BRL,

Eggenstein, D

Elektophoresis Power Supply EPS 300, Pharmacia,

Cambridge, GB

SSCP-Zubehör Dichtungsgummi, Silikon, 1mm, Biometra, Göttingen, D

Glasplatten, fixer 1mm-Spacer, Biometra, Göttingen, D


37

Glasplatten, ausgeschnitten, gerader Schliff, Biometra,

Göttingen, D

24-Zahn-Kämme, 1mm, Biometra, Göttingen, D

Klammern, Biometra, Göttingen, D

Thermocycler PTC 100, MJ Research, Biozym, Hessisch Oldendorf, D

PTC 200 DNA Engine, MJ Research, Biozym, Hessisch

Oldendorf, D

Biometra Personal Cycler, Göttingen, D

Primus, MWG- Biotech, München, D

Waagen Sartorius AG, Göttingen, D

Wasserbad GFL 1002-1013, Burgwedel, D

Lauda E200 ecoline RE 206, Lauda-Königshofen, D

Whatman-Papier Whatman Gb002, Schleicher und Schüll, Dassel, D

Zentrifugen Centrifuge 5415C, Eppendorf, Hamburg, D

Megafuge 1.0 R, Sorvall Heraeus, Kendro, Osterode, D

3.3 Methodik

3.3.1 Präparation der DNA

3.3.1.1 DNA-Isolierung aus EDTA-Blut

3.3.1.1.1 Nicht toxische Aussalzmethode

Ein Teil der DNA sowohl des Patientenkollektives als auch der Kontrollgruppe wurde mittels

der von Miller et al. 1988 beschriebenen nicht-toxischen Aussalzmethode zur Extraktion von

DNA aus menschlichen kernhaltigen Zellen gewonnen. Bei dieser Methode werden die von

der DNA-Präparationslösung abzutrennenden Proteine durch Fällung in einer gesättigten

Salzlösung präzipitiert und können dann durch Zentrifugation entfernt werden (111). Der

Vorteil dieser Art der Entfernung proteinhaltiger Verunreinigungen bei der Nukleinsäure-

präparation liegt darin, dass das toxische Phenol zur Aufreinigung nicht genutzt werden muss,

gleichzeitig jedoch eine äquivalente DNA-Ausbeute und ein für die meisten Anwendungen

genügender Reinheitsgrad der DNA erreicht wird.


38

Konzentration/Zusammensetzung der verwendeten Lösungen:

SDS 10 %

Pronase 20 mg/ml

NaCl >6 M (gesättigt)

Isopropanol absolut

Ethanol 70 %

TE-4 10 mM Tris, pH 8

0,1 mM EDTA, pH 8

Frischblutlysispuffer 155 mM NH4Cl

10 mM KHCO3

0,1 mM EDTA, pH 7.0

Kernlysispuffer 10 mM TrisHCl, pH 8.0

400 mM NaCl

2 mM EDTA, pH 8.0

Die Isolation der genomischen DNA erfolgte mit einer laborspezifischen Modifikation dieser

oben genannten Methode nach folgendem Protokoll:

1. Überführung von 2 ml EDTA-Blut in ein Zentrifugationsröhrchen

2. Zugabe von 6 ml Frischblutlysispuffer zur Erschließung der Zellmembranen der

Leukozyten

3. Inkubation der Lösung 15 min auf Eis

4. Zentrifugation des Ansatzes in der auf 4 °C vorgekühlten Zentrifuge bei 1500 rpm (mit

Bremse) zur Separierung der Zellkerne

5. Entfernen des Überstandes

6. Zugabe von

2 ml Kernlysispuffer

132 μl 10 % SDS

100 μl Pronase

zur Erschließung der Kernmembran und zur hydrolytischen Spaltung der Proteine

7. Verdau über Nacht bei 37 °C im Wasserbad

8. Zugabe von 0,64 ml gesättigte NaCl-Lösung zur Präzipitation der Proteinfragmente,

kräftiges Schütteln


39

9. Zentrifugation des Ansatzes zweimal 10 min bei 4000 rpm und Raumtemperatur,

dazwischen leichtes Aufschütteln

10. Überführen des Überstandes in ein neues Zentrifugationsröhrchen

11. Zugabe eines dem Überstand entsprechenden Volumens an Isopropanol

12. Langsames Schwenken bis die DNA an der Phasengrenze ausfällt

13. Fischen der DNA mit einer Pasteurpipette

14. Reinigen der DNA in 70 % Ethanol zur Entfernung von Salz- und Isopropanolresten;

kurzes Lufttrocknen zur Verdunstung von Ethanolresten

15. Lösen der DNA in 100 μl TE-4 bei Raumtemperatur über Nacht

Die Volumina der angewandten Lösungen wurden bei verändertem Ausgangsblutvolumen der

eingesetzten Blutmenge proportional angepasst.

3.3.1.1.2 DNA-Extraktion mittels Filtration

Der größere Teil der in dieser Arbeit verwendeten genomischen DNA wurde unter

Verwendung des QIAamp DNA Blood Midi kits aus EDTA-Blut isoliert. Unter bestimmten

Pufferbedingungen wird hierbei die zu extrahierende DNA an eine Filtermembran gebunden

und kann dann durch Veränderung der Pufferbedingungen isoliert eluiert werden. Die Rein-

heit der so gewonnenen DNA ermöglicht den direkten Einsatz in enzymatischen Reaktionen.

Weitere Reinigungsschritte sind nicht erforderlich.

Die Verwendung des Systems erfolgte den Herstellerangaben entsprechend.

3.3.1.2 Reinigung der DNA

Eine zusätzliche Reinigung der so gewonnenen DNA-Stocklösung mittels Phenolextraktion

wurde durchgeführt, wenn bei der Anwendung der DNA in der PCR ein Fehlen des Ampli-

fikats eine noch bestehende Verunreinigung vermuten ließ.


Phenol rein

Chloroform/Isoamylalkohol im Verhältnis 24:1


40

Fällungsmix Ethanol, absolut

NaAcetat, 3 M, pH 5,2

Ethanol/NaAcetat im Verhältnis 23:1

Protokoll der Phenolreinigung:

Der zu reinigenden wässrigen DNA-Lösung wird ein identisches Volumen an Phenol zu-

gegeben und diese Phasengemisch 15 sec geschüttelt. Anschließend folgt zur Trennung der

einzelnen Phasen eine Zentrifugation bei 13000 rpm für 2 min, bei der sich die durch das

Phenol denaturierten Proteine hauptsächlich in der Interphase sammeln. Der wässrige Über-

stand mit der enthaltenen DNA wird in ein neues Zentifugationsröhrchen überführt, die

organische Phase und die Interphase verworfen. Im nächsten Schritt wird dem Überstand ein

halbes Volumen Phenol und ein halbes Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (im Verhältnis

24:1) zugesetzt. Chloroform verringert den Anteil der wässrigen Phase, der sich im Phenol

löst, und erhöht so die DNA-Ausbeute. Isoamylalkohol verhindert ein Schäumen beim

Mischen. Der Ansatz wird wiederum 15 sec geschüttelt, danach 2 min bei 13000 rpm

zentrifugiert und der Überstand in ein neues Röhrchen überführt. Nach Zugabe eines

Volumens des Chloroform/Isoamylalkohol-Gemischs zur Entfernung von Phenolresten in der

wässrigen Phase folgen noch einmal Verschüttelung und Zentrifugation entsprechend dem

vorherigen Schema. Zur Präzipitation der Nukleinsäuren wird der Überstand dann zu zwei

Volumen Fällungsmix gegeben und über Nacht bei -70 °C gefällt. Es folgen zwei Zentrifuga-

tionen bei 13000 rpm für 30 min, zwischen denen das DNA-haltige Pellet mit 70%igem

Ethanol gewaschen wird, bevor es dann nach Trocknen an der Luft in 100 μl TE-4 aufge-

nommen und über Nacht bei Raumtemperatur resuspendiert wird.

3.3.1.3 Quantifizierung der DNA mittels Photometer

Um in den folgenden Arbeitsschritten vergleichbare DNA-Mengen einsetzen zu können, war

eine Konzentrationsbestimmung der zuvor gewonnenen DNA-Stocklösungen notwendig.

Bei der Quantifizierung von Nukleinsäuren mittels des Spektralphotometers macht man sich

die Eigenschaft der Nukleinsäuren zu nutze, ein Absorptionsmaximum für UV-Licht der

Wellenlänge 260 nm zu besitzen, für welches die aromatischen Ringe der Stickstoffbasen

verantwortlich sind. Mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetztes lässt sich die Konzentration

der betreffenden Lösung bestimmen. Heutige Geräte nutzen den OD-Wert, die sogenannte


41

Optische Dichte, für die direkte Angabe der Konzentration. Unter den Bedingungen einer ein

cm dicken Küvette und einer Absorptionsmessung bei 260 nm entspricht ein Absorptionswert

von 1 für eine Lösung mit ausschließlich doppelsträngiger DNA einer Konzentration von 50

μg/ml. Kurz: Ein OD260-Wert von 1 entspricht einer Konzentration doppelsträngiger DNA

von 50 μg/ml (105). Für einzelsträngige DNA oder RNA gelten andere Konzentrationswerte.

Vor der Messung der verwendeten DNA-Proben wurden diese mit Aqua bidest. 1:70 verdünnt

und es wurde der Leerwert der Küvette mit reinem Aqua bidest. bei einer Wellenlänge von

260 nm zur Eichung des Gerätes bestimmt. Unter der Angabe von Verdünnungsgrad, Art der

zu messenden Nukleinsäure und der gewünschten Meßwellenlänge von 260 nm gibt das Gerät

die entsprechende Konzentration in μg/ml an.

3.3.2 Amplifikation der zu analysierenden DNA-Abschnitte

Die selektive Untersuchung einzelner Abschnitte des Gens HADHA erforderte eine

spezifische Vervielfältigung der interessierenden Genabschnitte. Die heutzutage meist-

angewandte Methode zur spezifischen Amplifikation in vitro ist die von Mullis et al. 1983

entwickelte Polymerase-Kettenreaktion, kurz PCR genannt (144). Sie nutzt die Fähigkeit

bestimmter Polymerasen, DNA bei Vorhandensein eines freien 3´-OH-Endes in 5´-3´-

Richtung amplifizieren zu können. In einem ersten Schritt wird die Ziel-DNA durch Tempera-

turerhöhung auf 92 bis 98 °C denaturiert. An die so entstandenen Einzelstränge lagern sich

bei entsprechender Temperatur zwei das gewünschte Fragment flankierende, jeweils einem

der Einzelstränge komplementäre Oligonukleotide, auch Primer genannt, an, wodurch künst-

lich ein freies 3´-OH-Endes für die Polymerase geschaffen wird. Dieser Vorgang nennt sich

auch Annealing, die primertypische Temperatur Annealingtemperatur. In einem dritten Schritt

wird dann die Temperatur dem Temperaturoptimum der verwendeten Polymerase angeglichen

und es erfolgt durch diese die Bildung eines neuen Komplementärstranges (Extension). Diese

Reaktionsfolge wird nun zyklisch wiederholt, wobei bei jedem neuen Zyklus die zuvor neu

gebildeten Komplementärstränge als neue Ziel-DNA zur Verfügung stehen und somit die

Vervielfältigung des DNA-Abschnittes zwischen den beiden Primern exponentiell verläuft.

Seit der Verwendung temperaturstabiler DNA-Polymerasen ist es möglich, die Reaktionen

ohne Unterbrechung in sogenannten Thermocyclern ablaufen zu lassen. In dieser Arbeit

wurde die temperaturstabile Taq-DNA-Polymerase verwendet, die durch ihr Temperatur-

optimum eine Extensionstemperatur von 72 °C vorgibt.


42

Zusammensetzung eines PCR-Reaktionsansatzes:

Reagenz Ausgangskonzentration Endkonzentration im Reaktionsansatz

Primer sense 100 μM 0,4 μM

Primer antisense 100 μM 0,4 μM

Nukleotidmix :

dATP, dTTP,

dCTP, dGTP

jeweils 100 mM

jeweils 200 μM

Taq-DNA-Polymerase 5 Units/ μl 1 Unit/ 25 μl

Puffer der Taq-P. 10x 1x

MgCl2 50 mM 1,5 mM

H2O dest., sterifiltriert ad 25 μl

10x Puffer für die Taq-DNA-Polymerase beinhaltet 200 mM Tris-HCl (pH 8.4) und 500 mM

KCl.

Das Totalvolumen jedes PCR-Reaktionsansatzes betrug 25 μl und es wurden jeweils 20 ng

DNA eingesetzt. Je Reaktionsdurchlauf wurde jeweils ein Cap mit allen genannten

Reagenzien aber ohne Zugabe von DNA mitamplifiziert, um eine Kontamination in einem der

Reagenzienansätze mit Fremd-DNA zu entdecken und die PCR damit als unspezifisch

entlarven zu können.

Die PCR erfolgte nach folgendem Standardprotokoll:

1. 94 °C 5´00´´ Denaturierung der noch hochkomplexen DNA

2. 94 °C 30´´ Denaturierung

3. TA °C 30´´ Annealing, Temperatur primerabhängig

4. 72 °C 1´30´´ Extension

5. Wiederholung Schritt 2, 3 und 4 in 34 weiteren Zyklen

6. 72 °C 10´00´´ Endextension

7. 4 °C 15´00´´ Kühlung

Abweichend von diesem Standardprotokoll wurde die PCR für Exon 2 und 9 jeweils mit einer

auf 1 Minute verlängerten Annealingreaktion und einer auf 2 Minuten verlängerten Extension

durchgeführt.


43

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit fand die PCR Anwendung bei der SSCP- und der

Restriktionsanalyse. Die Primer- und PCR-Daten für die SSCP-Analyse und die folgende

Sequenzierung, sowie die der Restriktionsanalysen finden sich in Abschnitt 3.2.3.

3.3.3 Elektrophoretische Auftrennung der Nukleinsäuren

Nukleinsäuren haben aufgrund der negativ geladenen Phospatgruppen ihres Ribose-Phosphat-

Grundgerüstes die Eigenschaft, im elektrischen Feld bei vorhandenem Laufmedium in

Richtung Anode zu wandern. Geschieht dieses in einer festen Gelmatrix, so wird die Wan-

derungsgeschwindigkeit aufgrund des Gelwiderstands durch die Molekülgröße determiniert.

Auf diese Weise lassen sich unterschiedlich große Moleküle voneinander trennen. In der

Nukleinsäureanalyse werden hauptsächlich zwei Arten von Elektrophoresegelen verwendet:

Agarosegele und Polyacrylamidgele. Während Agarosegele untoxisch und leicht zu hand-

haben sind, zeichnen sich Polyacrylamidgele vor allem durch eine bessere Auftrennung der

DNA in Größenbereichen unter 1000 bp aus. Standardlaufpuffer beider Elektrophoreseformen

ist Tris-Borat-Puffer (TBE-Puffer).

3.3.3.1 Agarosegelelektrophorese

Agarose ist ein Polysaccharid aus roten Meeresalgen, welches sich durch Erhitzen in Wasser

lösen lässt und unter Bildung von Doppelhelices beim Abkühlen geliert. Die Größe dabei

entstehender Poren ist abhängig von der Agarosekonzentration des Gels und beeinflusst

dessen Trenneigenschaften. Je geringer die Agarosekonzentration ist und je größer somit die

Gelporen sind, desto schlechter ist die Trennung kleiner Moleküle. Für die Auftrennung

linearer doppelsträngiger DNA von 200 bis 700 bp Länge liegt die optimale Agarose-

konzentration in einem Bereich von 0,9 bis 1,5 Gewichtsprozent (105).

Im Kontext dieser Arbeit wurden 1%ige Agarosegele zur Kontrolle von PCR-Erfolg und

korrekter Amplifikatgröße eingesetzt.

Zusammensetzung/Konzentration der Reagenzien:

Agarose Rein

1x TBE 1:10 Verdünnung aus 10x TBE


44

10x TBE: 89 mM Tris

89 mM Borsäure

10 mM EDTA

pH 8,0

Ethidiumbromid 10 mg/ml

Agaroseblau-Auftragepuffer 1x TBE

40 Vol.-% einer 20 %igen Ficoll 400-Lösung

0,01 % Bromphenolblau

100 bp-Marker 5 Vol.-% 100 bp-Marker-Stock

95 Vol.-% Auftragepuffer

Für die Herstellung von Horizontalgelen wurden 3 g Agarose in 300 ml 1x TBE unter

Erhitzen in der Mikrowelle gelöst. Mittels Einsatzes eines Magnetrührers wurde die

Temperatur der Lösung dann unter 65 °C gesenkt, bevor 30 μl Ethidiumbromid zupipettiert

wurden. War die Lösung handwarm, so konnte sie in den vorbereiteten Gelträger gegossen

werden, und Kämme zur Erstellung von Geltaschen wurden eingesetzt. Nach der voll-

ständigen Gelierung der Lösung wurde der Gelträger samt Agarosegel in eine Elektrophorese-

kammer mit 1x TBE als Laufpuffer überführt und ein 5 μl-Aliquot des jeweiligen PCR-

Produkts in weiteren 5 μl Agaroseblau-Auftragepuffer jeweils in eine Geltasche pipettiert.

Anschließend erfolgte die Elektrophorese für 45 min bei 120 V. Der im Auftragepuffer

enthaltene Farbstoff visualisiert die Laufmittelfront und damit den Elektrophoresefortschritt,

Ficoll verhindert durch Dichteerhöhung die Diffusion der DNA in den Laufpuffer.

Einer Detektion der so aufgetrennten DNA-Fragmente diente der dem Gel zugesetzte

Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid. Ethidiumbromid kann in DNA interkalieren und

emittiert dann bei Anregung durch UV-Licht verstärkt orange-rotes Licht der Wellenlänge

590 nm. Imaging-Systeme machen diese Informationen dem Benutzer dann zugänglich.

Durch Vergleich mit dem gleichzeitig aufgetragenen 100 bp-Marker als Längenstandard ließ

sich die Fragmentgröße ermitteln.

3.3.3.2 Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)

Polyacrylamidgele (PAA-Gele) werden durch Polymerisation von Acrylamidmonomeren mit

Vernetzermolekülen hergestellt. Die Porengröße des Gels, und damit auch dessen


45

Trenneigenschaften, sind dabei abhängig von dem Mengenverhältnis beider Bestandteile

zueinander und von der jeweils eingesetzten Menge an Acrylamid und Vernetzer. Ausdrücken

lassen sich diese Gelcharakteristika durch die Angabe der Totalacrylamidkonzentration T und

des Vernetzungsgrades C (crosslinking). Steigt z.B. T bei konstantem C, so werden die Poren

kleiner.

Polyacrylamidgele können nativ oder denaturierend eingesetzt werden. Während native PAA-

Gele nach der Molekülgröße auftrennen, ist mit einer denaturierenden PAGE die Auftrennung

einzelsträngiger Nukleinsäuren ausschließlich und sehr genau nach deren Basenpaarlänge

möglich, da das denaturierende Agens Wechselwirkungen zwischen den Basen der Nuklein-

säure und somit Konformationsausbildungen verhindert.

In der vorliegenden Arbeit wurden native PAA-Gele sowohl für die SSCP-Analyse als auch

für die Trennung von Restriktionsfragmenten genutzt. Denaturierende Polyacrylamidgele

fanden im Rahmen der Sequenzierungen Verwendung.

Die Gelkenngrößen T und C waren für alle verwendeten nativen PAA-Gele identisch, die

Gele unterschieden sich lediglich in der Konzentration des zugefügten Glycerols.

3.3.3.2.1 Native Polyacrylamidgelelektophorese und Silberfärbung

Herstellung der nativen Polyacrylamidgele:


Gelstock-Lösung: Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung (49:1) 10 %

TEMED 0,1 %

10x TBE 5 x

Glycerol Absolut

APS (Ammoniumpersulfat) 10 %

Protokoll:

1. Präparation der Platten:

Das Gießen der 1 mm dicken Gele erfolgte zwischen zwei Glasplatten (11 cm x 12 cm), die

direkt vor der Gelherstellung mit 70%igem Ethanol gereinigt wurden. Unter Verwendung von

1 mm starken Dichtungsgummis wurden die sich bereits auf einer der Glasplatten befind-


46

lichen Spacer verstärkt, bevor die Glasplatten zusammengesetzt und mit Klammern

aneinander fixiert wurden.

2. Herstellung der Gele:

Pro Gel wurden 20 ml Gelstocklösung abgefüllt, bei Zugabe von Glycerol entsprechend

weniger. Unter permanenter Durchmischung mittels eines Magnetrührers wurde dann die

Polymerisation durch Zugabe von jeweils 250 μl APS als Radikalbildner pro Gel gestartet

und die Lösung schnellstmöglich zwischen die beiden Glasplatten gegossen. Nach dem

Einfügen eines 24-zinkigen Kammes zur Herstellung der 24 Geltaschen erfolgte die weitere

Polymerisation in halbaufrechter Lagerung der Platten.

3. Fixierung in der Elektrophoresekammer

Nach mindestens einer Stunde Polymerisation konnten die Gele in die Elektrophorese-

kammern unter Entfernung der Dichtungsgummis, Kämme und Klammern eingespannt

werden. Die Elektrophorese der nativen PAA-Gele erfolgte vertikal in 0.5x TBE als Lauf-

puffer.

Zusammenfassender Überblick:

Natives PAA-Gel:

a) ohne Glycerol:

20 ml Gelstocklösung

250 μl APS

T = 10 %

C = 2 %

b) mit Glycerol:

19 ml Gelstocklösung

1 ml Glycerol

250 μl APS

T = 10 %

C = 2 %

Glycerol: 5 %

Detektion der aufgetrennten DNA-Fragmente mittels Silberfärbung:

Neben der oben bereits erwähnten Visualisierung der DNA mittels Fluoreszenzfarbstoffen

wie Ethidiumbromid oder dem Einsatz Isotopenmarkierter Nukleotide besteht eine weitere

Möglichkeit der Detektion von Nukleinsäuren in der Anwendung der Silberfärbung, einer

Methode, die auch in der Proteindiagnostik angewandt wird. Sie zeichnet sich durch ihre hohe

Sensitivität und die fehlende Toxizität aus. Die Methode beruht auf einer Veränderung des

Redoxpotentials in der Nähe von Nukleinsäuren bei entsprechenden Milieubedingungen,

wodurch bei Zugabe eines starken Reduktionsmittels der DNA angelagerte Silberionen


47

schneller zu Silber reduziert werden als in Abwesenheit von Nukleinsäuren (101). Die DNA

wird so indirekt sichtbar gemacht.

Im Rahmen der Arbeit wurde diese Methode zur Färbung der nativen PAA-Gele nach einem

Protokoll von Budowle et al. (18) in laborspezifisch modifizierter Form angewandt. Dabei

wurden die Gele nach erfolgter Elektrophorese folgendem Färbeprotokoll unterworfen:

Lösung Dauer Effekt

1. Ethanol, 10 % mindestens 10´ Fixierung der DNA im Gel

2. HNO3, 1 % 10´ Vorbereitung des Milieus

3. AgNO3, 0,2 % 30´ Anlagerung der Silberionen

4. 3 x H2O, dest. jeweils 45´´ Entfernung überschüssiger Silberionen

5. Na2CO3, 3 %

mit 0,05 %Formaldehyd

Wechsel sobald

Lösung braun

Reduktion der Silberionen

- Wiederholung Schritt 5, dem gewünschten Färbungsgrad entsprechend, 3 bis 4 x -

6. Essigsäure, 10 % 10´ Beendigung der Reduktion

7. H2O, dest. mindestens 10´ Entfernung überschüssiger Essigsäure

Die Färbung erfolgte in einer inerten Färbeschale unter permanenter apparativer Schüttelung.

Die Lösungen wurden jeweils separat zu den Gelen gegeben und anschließend verworfen.

Waren die Nukleinsäurebanden entsprechend deutlich zu sehen, wurde die Färbung durch

Zugabe der Essigsäurelösung zügig gestoppt, um die Hintergrundfärbung so gering wie

möglich zu halten. Nach dem Färbevorgang wurden die Gele auf Whatmannpapier gezogen

und mittels Vakuumtrockner 2 Stunden bei 80 °C getrocknet.

3.3.4 Single-strand conformational polymorphism-Analyse (SSCP-Analyse)

Eine einfache und zugleich schnelle Methode zur indirekten Detektion von Mutationen ist die

von Orita et al. 1989 erstmalig publizierte Single-strand-conformational-polymorphism-

Analyse, kurz SSCP-Analyse (125, 126). Die Technik bedient sich der Eigenschaft

einzelsträngiger DNA, unter geeigneten Bedingungen individuelle Konformationen ausbilden

zu können, die insbesondere von der Sequenz des betreffenden Einzelstranges abhängen.

Diese unterschiedlichen Konformationen zeigen dann in einer nativen PAGE unter

entsprechenden Konditionen ein unterschiedliches Laufverhalten und lassen sich so


48

identifizieren. Entscheidend dabei ist, dass der Austausch einer einzelnen Base diese

Konformationsveränderung bewirken kann, weshalb besonders auch Punktmutationen

detektiert werden können. Da aus einer bekannten Sequenz keine Schlussfolgerung auf ihre

Konformation gezogen werden kann, deren Ausbildung stark von Umgebungsfaktoren wie

Temperatur, Ionenkonzentration und anderen abhängt, ist es notwendig, die Analyse-

bedingungen zu variieren, um die Sensitivität der Methode entsprechend zu erhöhen. Unter

Anwendung von mindestens zwei unterschiedlichen SSCP-Bedingungen lassen sich so

Detektionsraten von über 80 % in Fragmenten mit einer Länge bis 350 bp erreichen (58).

Umgekehrt kann die Sequenz nicht aus der vorliegenden Konformation gefolgert werden, was

eine anschließende direkte Mutationsanalyse mittels Sequenzierung notwendig macht.

Die SSCP-Analyse erfolgte unter vier verschiedenen Bedingungen. Eine Variation der

Temperatur (Raumtemperatur versus 4 °C) wurde kombiniert mit einem unterschiedlichen

Glycerolgehalt der Polyacrylamidgele (5 % Glycerol versus kein Glycerol). Die Durch-

führung der Analyse folgte nachstehendem Protokoll:

1. Amplifikation der exonübergreifenden DNA-Fragmente mittels PCR entsprechend

Abschnitt 3.3.2 und Testung der PCR entsprechend 3.3.3.1

2. Herstellung der nativen PAA-Gele entsprechend 3.3.3.2.1

Je Analysedurchlauf wurden zwei glycerolhaltige und zwei glycerolfreie native

Polyacrylamid-Gele vorbereitet.

3. Probenvorbereitung

Zur Erzeugung einzelsträngiger DNA mussten die doppelsträngigen PCR-Produkte getrennt

werden. Je Gel wurde dazu ein Auftragevolumen von 10 μl, bestehend aus 3-5 μl PCR-

Produkt und 7-5 μl SSCP-Auftragepuffer, für 10 Minuten bei 94 °C im Heizblock denaturiert.

Eine direkt anschließende Lagerung der Proben auf Eis optimierte die Konformationsbildung

der Einzelstränge.

SSCP-Auftragepuffer: 20 Vol.-% Agaroseblau-Auftragepuffer

80 Vol.-% Formamid

Der Formamidanteil im Auftragepuffer verhindert eine Wiederanlagerung der Einzelstränge.


49

4. Elektrophorese in nativen PAA-Gelen

Je Gel erfolgte dann eine Auftragung von 9 μl der so vorbereiteten Proben. Außerdem wurde

jeweils einmal pro Gel in unterschiedliche Geltaschen ein 100bp-Leiter zur Gelkenn-

zeichnung und Referenz aufgetragen. Die Elektrophoresebedingungen lauteten:

Exon 1, 11, 18: 16 Stunden bei Raumtemperatur und 60 V bzw. 4 °C und 70 V

Restliche Exons: 3 Stunden bei Raumtemperatur und 180 V bzw. 4 °C und 200 V

5. Bandendetektion mittels Silberfärbung entsprechend 2.3.3.2.1 und Trocknung der Gele

Wurden bei der anschließenden Auswertung der Gele Bandenunterschiede deutlich, so folgte

eine Sequenzierung der entsprechenden DNA-Proben.

Je Gel konnten neben dem Basenpaarleiter maximal 23 Patientinnen aufgetragen werden. Um

die notwendigen nachfolgenden Gele zu einem bestimmten Exon und deren Muster mit den

vorherigen Gelen des identischen Fragmentes vergleichen zu können, wurde jeweils

mindestens eine der bereits untersuchten Patientinnen des vorherigen Gels als Musterreferenz

noch einmal mit aufgetragen.

3.3.5 DNA-Sequenzierung

Auffällige Proben der SSCP-Analyse wurden einer Sequenzierung zugeführt. Diese erfolgte

unter Verwendung des ABI Prism 377-Sequenzierers. Grundlage einer Sequenzierung mittels

dieses Gerätes ist das von Sanger 1977 vorgestellte Didesoxyverfahren, bei dem modifizierte

Nukleotide (2´,3´Didesoxynukleotide) in die Synthese eines DNA-Stranges eingebracht

werden, die aufgrund ihrer Veränderungen am C3´ des Zuckers eine Anknüpfung weitere

Nukleotide unterbinden und damit einen Kettenabbruch hervorrufen (145). Wenn sich auch

unmodifizierte Nukleotide in dem Reaktionsansatz befinden, so erfolgt der Kettenabbruch

jeweils zu unterschiedlichen Stadien der DNA-Synthese und es entstehen DNA-Fragmente

unterschiedlicher Länge, die sich dann elektrophoretisch auftrennen lassen. Durch die heutige

Verwendung fluoreszenzmarkierter Terminationsnukleotide, die je Basenart mit einem

anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert wurden, ist die Diskriminierung des zum Ketten-

abbruch führenden Nukleotids in einem einzigen Reaktionsansatz möglich. Die elektro-

phoretische Auftrennung der Fragmente erfolgt in denaturierenden PAA-Gelen aus den unter

3.3.3.2 erläuterten Gründen. In dem in dieser Arbeit angewandten Sequenzierer werden die


50

einzelnen Fragmente während der Elektrophorese mittels eines anodennah fixierten

Detektionssystems aus anregendem Laser und Detektor zu dem Zeitpunkt erfasst, zu dem sie

das System passieren. Aus der zeitlichen Latenz ihres Passierens lassen sich dann

Fragmentlänge und damit Sequenz ableiten.

In einem ersten Schritt wurde die interessierende DNA-Probe in einem vierfachen PCR-

Ansatz vervielfältigt (vgl. Kapitel 3.3.2). Es folgte eine Aufreinigung und gleichzeitige

Konzentration der PCR-Probe durch den QIAGEN-PCR-Purifikations-Kit, mit dessen Hilfe

die Sequenzierreaktion störende Kontaminationen entfernt wurden. Um in die nachfolgende

Sequenzierreaktion standardisierte DNA-Mengen einsetzen zu können, war eine erneute

Agarosegel-Elektrophorese notwendig, bei der durch den Vergleich mit einer gleichzeitig

aufgetragenen Verdünnungsreihe die Konzentration des aufgereinigten PCR-Produktes

bestimmt werden konnte. In einem als Cycle-Sequencing bezeichneten Verfahren erfolgten

dann gleichzeitig Sequenzierreaktion und Amplifikation der generierten Fragmente. Da dabei

nur einer der beiden Primer eingesetzt wird, wird auch nur einer der beiden Einzelstränge

samt seiner Kettenabbruch-Fragmente amplifiziert.

Reaktionsansatz zum Cycle-Sequencing:

Aufgereinigtes PCR-Produkt 80 ng

Primer 3,2 pmol

Terminator Ready Reaction Mix 4 μl

H2O, HPLC gereinigt ad 20 μl

Der Terminator Ready Reaction Mix entstammt dem ABI Prism BigDye Terminator

Sequencing Reaction Kit und enthält eine thermostabile DNA-Polymerase, Nukleotide, die

fluoreszenzmarkierten Terminationsnukleotide und geeignete Puffer.

Cycle-Sequencing-Programm:

1. 96 °C 10´´

2. TA-Seq 5´´

3. 60 °C 4´00´´

4. Wiederholung Schritt 1 bis 3 in 24 weiteren Zyklen

5. 4 °C bis Entnahme

Die Annealingtemperatur des Cycle-Sequencings TA-Seq kann bis zu 5 °C von der in der PCR

verwendeten Annealingtemperatur abweichen und wurde jeweils empirisch ermittelt.


51

Um die so erzeugten Fragmente in hochkonzentrierter Form und gereinigt auftragen zu

können, erfolgte eine Fällung des Cycle-Sequencing-Produkts:

Fällungsansatz: 20 μl Cycle-Sequencing-Produkt

80 μl H2O, HPLC gereinigt

10 μl NaAcetat, pH 4,8, 3 M

250 μl Ethanol, absolut

Nach Zentrifugation des Ansatzes für 30 Minuten bei Raumtemperatur und 14000 rpm wurde

der Überstand entfernt und das Pellet mit 250 μl Ethanol (70 %) gewaschen, gefolgt von einer

erneuten Zentrifugation für 10 Minuten bei Raumtemperatur und 14000 rpm. Wieder wurde

der Überstand entfernt. Nach Trocknung des Pellets an der Luft erfolgte die Resuspension in

4 μl Sequenzierpuffer für mindestens 30 Minuten. Anschließend wurde zur Erstellung der

Auftrageverdünnung 1 μl dieser Resuspension in 1 μl Sequenzierpuffer aufgenommen.

Sequenzierpuffer: 20 Vol.-% EDTA, 25 mM

80 Vol.-% Formamid

Die Herstellung des denaturierenden PAA-Gels erforderte eine sorgfältige Vorbereitung der

Platten, da kleinste Verunreinigungen das Fluoreszenzmuster stören können. Die beiden Glas-

platten wurden daher jeweils nacheinander mit Alconox, Aqua dest. und Isopropanol

(5 %) gereinigt. Nach dem Auflegen der separaten Spacer (0,2 mm Stärke) wurden die Platten

dann mit Klammern aneinander befestigt.

Zusammensetzung des denaturierenden PAA-Gels:

Harnstoff 21 g

30 % Acrylamidlösung (29:1) 8,4 ml

10x TBE 6,0 ml

Aqua bidest. 20 ml

TEMED 20 μl

Gelkenngrößen: 7 M Harnstoff, T = 5 %, C = 3,33 %

Vor der Zugabe von 350 μl APS als Reaktionsstarter wurde die so vorbereitete Gellösung

durch Vakuumfiltration von größeren Partikeln befreit, da diese die Elektrophorese in dem

sehr dünnen Gel erheblich stören würden. Nach einer Stunde Polymerisationszeit wurde der

Vorlauf des Gels in 1x TBE als Laufpuffer gestartet, um die gewünschte Geltemperatur für

den Sequenzierlauf zu erreichen. Bei dem anschließenden Sequenzierlauf wurden 1 μl der


52

oben genannten Auftrageverdünnung nach erfolgter zweiminütiger Denaturierung im

Heizblock aufgetragen. Die Elektrophoresebedingungen lauteten: 2500 V, 48 Watt, 8

Stunden, 50 °C (Modul Seq Run 36-1200).

Die Auswertung erfolgte durch die systemeigene ABI Prism TM Collection Software und

durch das Sequencing Analysis Programm.

3.3.6 Restriktionsanalysen

Viele Bakterien exprimieren Endonukleasen, mit denen sie eingedrungene Fremd-DNA, wie

etwa die eines Bakteriophagen, unschädlich machen können. Diese auch Restriktionsenzyme

genannten Nukleasen schneiden die Fremd-DNA an enzymspezifischen Schnittstellen, welche

durch eine spezielle Basenabfolge determiniert werden. Jedes Restriktionsenzym hat eine

eigene Erkennungssequenz und wird nach dem Ursprungsbakterium bezeichnet, aus dem es

gewonnen wurde. In der Nukleinsäureanalytik können diese Nanoscheren unter anderem zur

direkten Detektion von Mutationen eingesetzt werden. Entfällt oder entsteht durch eine

Mutation der Ziel-DNA die dem Enzym typische Erkennungssequenz, so kann es entweder

nicht mehr schneiden oder eine neue Schnittstelle entsteht. Nach erfolgtem Restriktionsverdau

mit dem entsprechenden Enzym und anschließender elektrophoretischer Auftrennung des

Reaktionsansatzes lässt sich dieses dann anhand veränderter Fragmentlängen nachweisen. Die

so detektierte Variante der DNA-Sequenz wird auch als Restriktions-Fragment-Längen-

Polymorphismus, kurz RFLP, bezeichnet.

In dieser Arbeit fand die Methode im Rahmen zweier unterschiedlicher Fragestellungen

Verwendung: Zum einen erfolgte mit ihrer Hilfe die Untersuchung zur Prävalenz der G1528C

in dem unter 3.1 charakterisierten Patienten- und Kontrollkollektiv. Zum anderen wurden die

Häufigkeiten der in SSCP und Sequenzierung identifizierten Sequenzvarianten in dem

Kontrollkollektiv durch einen entsprechenden Restriktionsverdau ermittelt.

3.3.6.1 Restriktionsanalyse zur Mutation G1528C

Führt eine Mutation zur Kreation einer neuen Schnittstelle, so ist bei der Untersuchung noch

unbekannter DNA-Fragmente ohne den gleichzeitigen Einsatz einer Positivkontrolle nicht

sicher auszuschließen, dass ein Ausfall des Enzyms Verursacher einer fehlenden Restriktion


53

ist. Es lässt sich keine sichere Aussage darüber treffen, ob die Mutation vorliegt oder nicht.

Daher konnte die in der Literatur vorgestellte RFLP-Analyse zur Mutation G1528C mittels

des Enzyms PstI (74), welche eine weitere PstI-Schnittstelle im Fragment als interne

Kontrolle nutzt, in unserem Versuchsansatz mit unserem Primerpaar wegen des Wegfalls der

internen Positivkontrolle nicht genutzt werden. Durch den Einsatz eines Mutagenese-Primers

bei der Amplifikation des interessierenden Fragmentes konnte eine Schnittstelle für das

Restriktionsenzym MspI kreiert werden. Da hier nun bei etwaigem Auftreten der erwähnten

Mutation die Schnittstelle verschwindet und das Enzym bei fehlender Mutation immer

schneiden sollte, konnte damit die Problematik eines unentdeckten Enzymausfalls bei nicht

vorhandener Positivkontrolle umgangen werden.

Mutageneseprimer, auch Mismatch-Primer genannt, enthalten eine oder mehrere Basen, die

der Zielsequenz nicht komplementär sind und verursachen damit eine Basenfehlpaarung. Da

der mit diesem Primer generierte Einzelstrang im darauffolgenden Zyklus selbst zur

Zielsequenz wird, werden ab diesem Zeitpunkt alle Kopien des Stranges statt der

ursprünglichen die eigentlich inkorrekten Basen enthalten. Auf diese Weise lassen sich in der

PCR gezielt Mutationen in das Amplifikat einbauen, was in vorliegendem Fall zur Kreation

einer MspI-Schnittstelle genutzt wurde.

Untersuchungsgang:

1. Amplifaktion des interessierenden DNA-Fragmentes und Testung der PCR entsprechend

3.3.2 ff.. Eine zusammenfassende Darstellung der PCR-Bedingungen für die Restriktionen

findet sich in Tabelle 3.2 im Abschnitt 3.2.3.2..

2. Restriktionsanalyse:

Der Restriktionsverdau fand jeweils in einem 15 μl Reaktionsansatz folgender Zusammen-

setzung statt:

PCR-Produkt 10 μl

MspI 10 U

Puffer des MspI 1 x

H2O, dest. ad 15 μl

Ausgangskonzentrationen: MspI

Puffer des MspI

20000 U/ l

10 x


54

Dieser Restriktionsansatz verblieb dann 4 Stunden bei 37 °C im Wasserbad.

3. Elektrophoretische Auftrennung der Fragmente und Silberfärbung

Die elektrophoretische Auftrennung der Fragmente erfolgte in nativen Polyacrylamidgelen

mit 5%igem Glycerolanteil für eine Stunde bei 250 V und Raumtemperatur (vgl. 3.3.3.2.1).

Zur Fragmentgrößenbestimmung wurde pro Gel ein 50 bp-Marker mit aufgetragen. Die

Auftragung von jeweils 5 μl Restriktionsverdau erfolgte in weiteren 5 μl Agaroseblau-

Auftragepuffer.

50 bp-Marker: 5 Vol.-% 50bp-Marker-Stocklösung

95 Vol.-% Agaroseblau-Auftragepuffer

Eine übersichtliche Darstellung der Restriktionsbedingungen und der zu erwartenden

Restriktions-Fragmentlängen findet sich in Tabelle 3.3.

3.3.6.2 Restriktionsanalyse zur Bestimmung von Häufigkeiten identifizierter

Sequenzvarianten in einem Kontrollkollektiv

Waren durch SSCP und Sequenzierung Sequenzvarianten in einzelnen Exons detektiert

worden, so wurden Restriktionsanalysen dieser Varianten etabliert, durch die dann deren

Häufigkeiten in dem Kontrollkollektiv weniger zeitintensiv als mit anderen Methoden

ermittelt werden konnten. Notwendig war dies für Exon 1, 12, 16 und 18. Während sich für

die Varianten in Exon 16 und 18 entsprechende Restriktionsenzyme finden ließen, mussten

für Exon 1 und 12 Mutageneseprimer eingesetzt werden, die eine künstliche Schnittstelle

erzeugen konnten.

Der Untersuchungsgang entsprach dem unter 3.3.6.1 dargestellten. Eine Aufstellung der PCR-

Bedingungen und Primerdaten findet sich in Tabelle 3.2 im Absatz 3.2.3.2.

Dem unter 3.3.6.1 genannten Verfahren identisch erfolgte die Restriktion in einem 15 μl

Reaktionsansatz unter Einsatz von 10 μl PCR-Produkt bei einer Temperatur von 37 °C für 4

Stunden im Wasserbad. Es erfolgte jedoch eine Erniedrigung der Enzymmenge auf 6 U pro

Ansatz und eine Anpassung des verwendeten Puffers an das jeweilige Enzym. Das

Temperaturoptimum aller verwendeten Enzyme war also identisch.

Eine übersichtliche Darstellung der Restriktionsbedingungen und der zu erwartenden

Restriktions-Fragmentlängen findet sich in nachstehender Tabelle 3.3.


55

Exon Restriktionsenzym Erkennungssequenz/Schnittstelle

Fragmentlängen Wildtyp

Fragmentlängen Mutation

1∗ NdeI 5´-CA/TATG-3´ 148 bp 27 bp, 121 bp 12∗ AluI 5´-AG/CT-3´ 29 bp, 210 bp 239 bp 15∗ MspI 122 bp, 23 bp 145 bp 16 ScrFI 5´-CC/NGG-3´ 75 bp,

16 bp, 43 bp, 42 bp39 bp, 36 bp, 16 bp, 43 bp, 42 bp

18 AluI 5´-AG/CT-3´ 140 bp, 64 bp 204 bp Tabelle 3.3: Restriktionsbedingungen ∗ Einsatz eines Mutageneseprimers erforderlich. Die Fragmengrößen für den Verdau zu Exon 16 beziehen sich auf die aufgrund der Ergebnisse der Sequenzierungen zu vermutenden, tatsächlichen Fragmentgrößen in unserem Kollektiv (vgl. Kapitel 3.4.5).

3.4 Statistik

Die statistische Analyse der Unterschiede der Häufigkeitsverteilungen erfolgte unter

Anwendung des Chi-Quadrat-Tests mit Kontinuitätskorrektur. Getestet wurde in allen Fällen

auf ein Signifikantsniveau von α= 5 %. Die Analyse wurde computergestützt mit SPSS für

Windows (Version 12) durchgeführt.

4. Ergebnisse

56

4. Ergebnisse

4.1 Ergebnisse der Restriktionsanalyse zu G1528C

Die Restriktionsanalyse umfasste die unter 3.1.1.1 genannten 112 Paarungen und 18 Einzel-

patientinnen sowie die unter 3.1.2 erläuterte Kontrollgruppe von 103 Personen. Nur in einer

der durchgeführten Restriktionen konnte ein auffälliges Ergebnis ermittelt werden, welches

einen homozygoten Wegfall der Schnittstelle des MspI nahe legte. Bei der betroffenen Probe

handelte es sich um ein Amplifikat der DNA eines Vaters der Mutter-Vater-Paarungen. Eine

daraufhin durchgeführte Sequenzierung des betroffenen Fragments zeigte keine Ver-

änderungen in der Basenabfolge, insbesondere nicht in der Umgebung des Nukleotids G1528.

Bei Verdacht auf eine fehlerhafte Enzymzugabe im ersten Restriktionsdurchlauf wurde die

auffällige Probe nochmalig verdaut und dieser Verdacht aufgrund des nun vollständig

geschnittenen Amplifikats bestätigt.

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass weder bei den 130 Indexpatientinnen, noch bei

den zugehörigen 90 Kindern oder 22 Kindsvätern der betroffenen Schwangerschaften, und

auch bei keiner der 103 Kontrollpersonen die Mutation G1528C des HADHA nachgewiesen

werden konnte. Eine tabellarische Darstellung des Ergebnisses findet sich mit den beschrie-

benen Häufigkeitsverteilungen in Kapitel 4.3.. Einen Ausschnitt aus einem der Restriktions-

gele zeigt Abb. 4.1.

Abb. 4.1: Restriktionsanalyse zu G1528C: Bahn 1: 50bp-Leiter, Bahn 2: unverdautes Fragment als Fragmentlängenkontrolle, Bahn 3: Indexpatientin, ohne Mutation der Schnittsstelle, Bahn 4: zugehöriges Kind, restliche Bahnen: zwei weitere Mutter-Kind-Paarungen

4.2 Ergebnisse der SSCP-Analyse

In der SSCP-Analyse wurden je nach Exon zwischen 100 und 102 Patientinnen mit HELLP-

Syndrom untersucht (vgl. Abschnitt 3.1.1.2). Die jeweilige Kontrollgruppe umfasste 109

4. Ergebnisse

57

Personen (vgl. Abschnitt 3.1.2). Wurden in der SSCP-Analyse der einzelnen Exons auffällige

Banden bei Einzelpersonen oder Musterbildungen innerhalb des gesamten Kollektivs ent-

deckt, so erfolgte die Sequenzierung der betreffenden Einzelfälle bzw. jeweils eines Exempels

der unterschiedlichen Mustertypen. Sequenzierungen wurden in diesem Sinne bei folgenden

Exons durchgeführt: Exon 1, 2, 4, 6 bis 12, 15, 16, 18, 19. Insgesamt wurden je nach Exon bis

zu vier unterschiedliche Patientinnen näher untersucht. Dabei erfolgte die Sequenzierung auch

dann, wenn die SSCP-Varianten nur äußerst diskret und eher als Artefakt der SSCP zu werten

waren. Trotz dieses hohen Maßstabes machten die SSCP-Ergebnisse der nachstehenden

Exons keine weitere Analyse notwendig: Exon 3, 5, 13, 14, 17, 20.

Bei den auf ihre Sequenz weiter untersuchten Fragmenten ließen sich für Exon 2, 4, 6, 7, 8, 9,

15 und 19 auch bei ggf. mehrfachen, das gesamte Fragment vollständig darstellenden Sequen-

zierungen keine die Basenabfolge betreffenden Abweichungen darstellen. Aufgrund dessen

wurden die zumeist leichten Auffälligkeiten der Konformationsanalyse als SSCP-Artefakt

gewertet.

In folgenden Exons bzw. zugehörigen Fragmenten konnten die in der SSCP-Analyse vermute-

ten Sequenzvarianten in der Sequenzierung bestätigt werden: Exon 1, 12, 16 und 18.

Daraufhin wurde im nächsten Schritt eine Restriktionsanalyse der Varianten etabliert. Hierbei

ließ sich die Variante in Exon 12 nicht weiter darstellen, so dass bestätigte Mutationen nur für

Exon 1, 16, und 18 vorlagen. Eine detaillierte Beschreibung der Ergebnisse folgt in den nach-

stehenden Abschnitten 4.2.1 bis 4.2.4.

In drei Fragmenten konnten bei der Sequenzierung der Patientinnen-DNA außerdem SSCP-

Muster-unabhängige Varianten der Intron-Sequenz bei Vergleich mit der von Strauss

übermittelten genomischen Sequenz dargestellt werden. Dieses betraf die Fragmente zu Exon

10, 11 und 16. Die Variationen ließen sich durchgängig auch bei der anschließenden

Sequenzierung von Kontrollpersonen ermitteln und betrafen jeweils nur eine Base. Auch hier

folgt die separierte Darstellung in einem der folgenden Abschnitte.

Um eine Vergleichbarkeit mit weiteren Puplikationen zu ermöglichen, orientieren sich die

Benennungen der Varianten nicht an der o.g. genomischen, nicht veröffentlichten Sequenz

von Strauss, sondern an der mRNA-Sequenz des Klons mit der Accessions-Nummer

NM_000182 (www.ncbi.nlm.nih.gov).

4. Ergebnisse

58

4.2.1 Exon 1, c.130G>T, 5´-untranslated-region (5´-UTR)

Die Untersuchungen zu Exon 1 umfassten insgesamt 102 Patientinnen und wurden unter den

Bedingungen eines 16-Stunden-SSCP-Durchlaufs durchgeführt. Dabei zeigte sich bei einer

Patientin die in Abb. 4.2a dargestellte Auffälligkeit. Alle weiteren Patientinnen wiesen

untereinander identische und damit unauffällige Konformationsmuster auf. Eine zweifach

komplett, das heißt mit völlig neuem PCR-Produkt der Patientin, durchgeführte Sequen-

zierung des auffälligen Fragmentes legte in beiden Versuchsdurchläufen eine Substitution der

Base Guanin durch Thymin eine Stelle vor Beginn des Translation-Startcodons in hetero-

zygotem Zustand nahe. Der relevante Ausschnitt einer der Sequenzierungen ist in Abb. 4.2b

dargestellt. Die folgende Etablierung einer Restriktionsanalyse unter Einsatz des Enzyms

NdeI erforderte die Kreation und Anwendung eines Mutageneseprimers (vgl. Tabelle 3.2).

Der Verdau bestätigte die Ergebnisse der Sequenzierungen, einen Ausschnitt des betreffenden

Gels zeigt Abb. 4.2c. Die anschließende Ermittlung der Frequenz dieser Mutation in einem

Kontrollkollektiv von 109 gesunden Frauen mittels der Restriktionsanalyse konnte diese bei

keiner Kontrollperson darstellen. Die Patientin mit der Mutation diente bei der

Restriktionsanalyse der Kontrollpersonen als Positivkontrolle, um ein Enzymversagen aus-

zuschließen.

a b c

Abb. 4.2: Befunde zu c.130G>T, 5úntranslated region a: SSCP-Analyse: Die auffällige Patientin findet sich in Bahn 4. Bahn 1: 100bp-Leiter, restliche Bahnen: unauffällige Patientinnen. b: Sequenzierungsausschnitt: Da es sich um die Darstellung der Sequenz unter Verwendung des reversen Primers handelt, sind die komplementären Basen der Mutation angegeben und müssen transponiert werden. c: Restriktionsanalyse: Die Mutation stellt sich in der ersten Bahn in heterozygotem Zustand dar. Bahn 8: 50bp- Leiter, restliche Bahnen: homozygot für Fehlen der Schnittstelle, als Wildtyp zu werten.

4. Ergebnisse

59

4.2.2 Fragment zu Exon 12

Exon 12 wurde anhand von 102 Patientinnen analysiert. In den beiden SSCP-Gelen mit

Glycerol der Konditionen Raumtemperatur und 4 °C fiel bei mehreren Patientinnen eine

Zwischenbande auf. Die Patientin mit der deutlichsten Ausprägung der Auffälligkeit wurde

daraufhin wiederholt sequenziert. Diese Sequenzierungen legten mehrfach eine Substitution

der Base Thymin durch Cytosin an der ersten Stelle nach Ende des Forward-Primers in

heterozygotem Zustand nahe. Die Wiederholungen begannen jedoch erst ab der Sequen-

zierungsreaktion (vgl. Kapitel 3.3.5) und waren damit inkomplett. Die genaue Varianten-

Beschreibung lautete: c1216-32T>C, Intron 11. Daraufhin wurde eine Restriktionsanalyse mit

dem Enzym Alu I und einem Mutageneseprimer etabliert (vgl. Kapitel 3.3.6.1). Insgesamt

fünf weitere Patientinnen mit oder ohne Zwischenbande in der SSCP-Analyse wurden

untersucht. Keine der demnach insgesamt sechs untersuchten Patientinnen zeigte in der

Restriktionsanalyse Veränderungen, die auf eine Mutation im Bereich der Schnittstelle, weder

im heterozygoten, noch im homozygoten Zustand, hinwiesen. Die Sequenzveränderungen in

der Sequenzierung wurden daher mit einer frühzyklischen, akzidentiellen Basenfehlpaarung

in der initialen PCR in Verbindung gebracht. Diese Ergebnisse zusammen mit der

Beobachtung einer Inkongruenz der Mustertypen bei identischen Patientinnen und

wiederholtem Auftragen in einem SSCP-Folgegel legten die Wertung der genannten Auf-

fälligkeit als Artefakt nahe. Eine weitere Untersuchung der vermeintlichen Auffälligkeit

wurde daher ausgesetzt.

4.2.3 Fragment zu Exon 16: c.1751-25T>G, Intron 15

Insgesamt wurden 102 Patientinnen der SSCP-Analyse des Fragments zu Exon 16 zugeführt.

Methodisch handelte es sich um 3-Stunden-Gele. Bei genannter Analyse fiel eine durch-

gehende Musterbildung mit drei unterschiedlichen Mustertypen auf. Eine Darstellung dieser

SSCP-Typen findet sich in Abb. 4.3a. Exemplarisch wurde jeweils einer dieser Typen

sequenziert und es zeigte sich, dass die drei Muster jeweils der heterozygoten oder der

homozygoten Form einer Sequenzvariante oder dem Wildtyp an betreffender Stelle

zuzuordnen waren. Bei dieser Sequenzvariante handelte es sich um einen Basenaustausch von

Thymin zu Guanin im Intron vor Exon 16. Wie unter 4.2.5 näher erläutert, fand sich

außerdem in diesem Bereich eine SSCP-musterunabhängige, vermeintliche Insertion eines

4. Ergebnisse

60

Cytosins. Deshalb muss die Zählung und Bezeichnung der genannten musterkongruenten

Sequenzvariante mit Quellverweis erfolgen. Bezieht sich die Bezeichnung auf die von Strauss

übermittelte Sequenz des Introns 15, so lautet diese: c.1751-25T>G, Intron 15. In den

vorliegenden Sequenzierungen unseres Kollektivs war es jedoch die 26. Stelle vor Exon-

Beginn. Die relevanten Ausschnitte der Sequenzierungen sind für den heterozygoten sowie

den homozygoten Basenaustausch an entsprechender Sequenzstelle in Abb. 4.3b dargestellt.

Eine Restriktionsanalyse der Variante erfolgte mittels des Enzyms ScrFI und bestätigte die

Ergebnisse der Sequenzierungen. Neben drei permanenten Schnittstellen innerhalb des

Fragments, die als interne Positivkontrolle der Enzymaktivität dienten, entstand eine zu-

sätzliche Schnittstelle bei genanntem Basenaustausch, und damit zeigten sich in dem Fall fünf

statt nur vier Teilfragmente (vgl. Tabelle 3.3). Die in Tabelle 3.3 angegebenen Fragment-

größen beziehen sich auf die für unser Kollektiv realen Teilfragmentgrößen, das heißt, sie

zählen die Insertion des Cytosin mit (vgl. 4.2.5). In Abb. 4.3c findet sich exemplarisch ein

Ausschnitt aus einem Gel der Restriktionsanalyse zu c.1751-25T>G. Die Untersuchung der

Frequenz dieser Mutation innerhalb des Kontrollkollektives erfolgte aufgrund der guten Dis-

kriminierungseigenschaften der SSCP für diese Sequenzveränderung und der Instabilität des

ScrFI-Verdaus für die meisten Kontrollpersonen durch SSCP- statt durch Restriktionsanalyse.

Die Häufigkeitsverteilung der c.1751-25T>G in den Kollektiven findet sich in Kapitel 4.3.

4. Ergebnisse

61

a

b c

Abb. 4.3: Befunde zu c.1751-25T>G, Intron 15 a: SSCP-Analyse: Bahn 1: 100bp-Leiter, Bahn 2: Wildtyp, Bahn 3: Sequenzvariante in heterozygotem Zustand, Bahn 21: Sequenzvariante in homozygotem Zustand. b: Sequenzierungsausschnitte: links: heterozygoter Zustand; rechts: homozygoter Zustand. Da es sich um die Darstellung der Sequenz unter Verwendung des reversen Primers handelt, sind die komplementären Basen der Variante angegeben und müssen transponiert werden. c: Restriktionsanalyse: Bahn 1: 50bp-Leiter, Bahn 2: unverdautes Fragment, Bahn 3: Wildtyp, Bahn 4: heterozygot, Bahn 5: homozygot für c.1751-25T>G.

4.2.4 Exon 18, c.2111C>T, L661L

Mittels 16-Stunden-Gel wurden in der SSCP-Analyse dieses Fragments alle 102 Patientinnen

des vorgesehenen Kollektivs untersucht. Dabei stellte sich bei einer Patientin die in Abb. 4.4a

gezeigte Auffälligkeit dar. Die folgende Sequenzanalyse des PCR-Fragments der Patientin

legte eine Basensubstitution von Cytosin zu Thymin in Exon 18 des HADHA im hetero-

zygoten Zustand nahe. Bestätigt wurde dieser Befund in einer Restriktionsuntersuchung mit

dem Enzym AluI (vgl. Tabelle 3.3). Insgesamt wurden 15 Patientinnen der SSCP-Analyse,

inklusive der auffälligen Patientin, durch die Restriktionsanalyse nochmalig untersucht. Nur

bei der bereits ermittelten Patientin zeigte sich ein auffälliger Verdau. Ausschnitte aus der

Sequenzierung und dem Restriktionsverdau der betroffenen Patientin finden sich in Abb. 4.4b

bzw. 4.4c. In dem anschließend analysierten Kontrollkollektiv von 109 Probanden fand sich

ebenfalls bei einer Person ein Wegfall der Schnittstelle im heterozygoten Zustand. Da auf-

4. Ergebnisse

62

grund der Form des Verdaus keine direkte Aussage über die Art der Mutation dieser

Schnittstelle zu treffen ist, wurde die DNA der betreffenden Kontrollperson sequenziert. Die

Sequenzanalyse belegte auch hier die c.2111C>T im heterozygoten Zustand. Eine Auf-

stellung der Häufigkeitsverteilung findet sich in Kapitel 4.3.

Die Variante c.2111C>T hat keinen Effekt auf die Aminosäuresequenz der α-subunit des

MTP, da beide potentiellen Basentripletts für die Aminosäure Leucin codieren (L661L,

Zählung inklusive Signalpeptid). Es handelt sich um eine sogenannte Silent-Mutation.

a b c

Abb. 4.4: Befunde zu c.2111C>T, Exon 18 a: SSCP-Analyse: Bahn 1: 100bp-Leiter, Bahn 13: auffällige Patientin, restliche Bahnen: unauffällige Patientinnen b: Sequenzierungsausschnitt: c.2111C>T in heterozygotem Zustand c: Restriktionsanalyse: Bahn 1: 50bp-Leiter, Bahn 2: unverdautes Fragment, Bahn 3, 4, 6 und 7: Wildtyp, Bahn 5: heterozygoter Verlust der Schnittstelle, nach Bestätigung in der Sequenzierung: c.2111C>T.

4.2.5 Musterunabhängige Varianten

Fragment zu Exon 10:

Im Rahmen der Überprüfung auch diskreter Musterbildungen in der SSCP wurden zu Exon 10

drei Patientinnen als Musterprototypen und eine Patientin aufgrund zusätzlicher diskreter

Auffälligkeit in der SSCP-Analyse sequenziert. Alle vier Proben wiesen eine identische

Deletion eines Cytosins an 17. oder 18. Stelle vor dem Begin des Exon 10 auf (c.1049-17/18).

Eine genauere Angabe des deletierten Cytosins ist nicht möglich, da in der genomischen

Sequenz an den Intron-Stellen -17 und -18 vor Exon 10 jeweils ein Cytosin steht. Eine dieser

beiden Basen fehlte also identisch bei allen vier Patientinnen, wohingegen sich eine SSCP-

musterkongruente weitere Auffälligkeit bei keiner dieser Proben darstellen lies. Die

anschließenden Sequenzierungen von zwei zufällig ausgewählten Kontrollpersonen zeigten

ebenfalls jene Deletion.

4. Ergebnisse

63


Die SSCP-Analyse zu Exon 11 zeigte eine wenn auch diskrete Musterbildung im untersuchten

Patientinnenkollektiv, woraufhin je ein Prototyp der beiden möglichen Mustertypen sequen-

ziert wurde. In diesen beiden Sequenzanalysen fand sich eine identische homozygote

Substitution von Guanin zu Thymin eine Stelle vor Beginn der Sequenz des reversen Primers

im Intron nach Exon 11. Die genaue Bezeichnung der Variante lautet: c.1215+41G>T. Auch

bei der folgenden Sequenzierung von zwei zufällig ausgewählten Kontrollpersonen zeigte

sich diese Variante in homozygotem Zustand. Eine die Musterbildung in der SSCP erklärende

Sequenzveränderung konnte bei der Sequenzierung der Patientinnen-DNA nicht gefunden

werden.


Bei der Sequenzierung der drei Beispiele der SSCP-Muster des Fragments zu Exon 16 fiel

neben oben genanntem Polymorphismus bei allen drei Patientinnen identisch eine Insertion

eines Cytosins vor bzw. nach einem bereits an 8. Stelle vor Beginn des Exon 16 gelegenen

Cytosin auf (c.1751-8). Diese Cytosinduplikation ließ sich auch bei zwei anschließend

sequenzierten Kontrollpersonen mit unterschiedlichen Haplotypen bezüglich der polymorphen

Stelle aus Kapitel 4.2.3 darstellen.

Sehr wahrscheinlich handelt es sich bei den drei musterunabhängigen Sequenzveränderungen

um Fehler in der Wildtypsequenz, die uns von Strauss et al. übermittelt wurde.

Bekanntermaßen fördern bestimmte Basensequenzen, die eine Deletion oder Duplikation

identischer Basen ermöglichen, Sequenzierfehler (90). Dieses liegt beispielsweise für Exon 10

und 16 vor. Da sich die Varianten nicht auf den proteincodierenden Bereich konzentrieren

und sowohl bei Patientinnen als auch Kontrollpersonen durchgängig und SSCP-Muster-

unabhängig darstellen ließen, d.h. keinen zwischen den Kollektiven diskriminierenden

Charakter aufweisen, wurden sie im Sinne der Fragestellung dieser Arbeit vernachlässigt.

4.3 Ergebnisdarstellung in Anbetracht des Häufigkeitsvergleichs

Die Fragestellungen der Arbeit erforderten die Untersuchung eines potentiellen

Ungleichgewichts der Allelverteilung zwischen Patientinnen und Kontrollpersonen. Es folgt

hier der statistische Vergleich der Häufigkeitsverteilungen der Sequenzvarianten im Kollektiv

der HELLP-Patientinnen und in dem entsprechenden Kontrollkollektiv.

4. Ergebnisse

64

4.3.1 Exon 1, c.130G>T, 5ÚTR

Folgende Häufigkeitsverteilung konnte bezüglich c.130G>T ermittelt werden:

Genotyp

Häufigkeit unter den Patientinnen

Häufigkeit unter den Kontrollpersonen

Gesamthäufigkeit

GG (WT) 101/102 109/109 210/211 GT 1/102 0/109 1/211 TT 0/102 0/109 0/211 Allele: % % % G 203/204 99,50 218/218 100 421/422 99,76 T 1/204 0,49 0/218 0 1/422 0,24

Tabelle 4.1: Häufigkeitsverteilungen der c.130G>T, 5úntranslated region

Der Unterschied der Häufigkeiten zwischen Patientinnen und Kontrollpersonen bezüglich

Genotyp GT war statistisch nicht signifikant (χ2(1)= ,001; p= ,973). Ebenso fand sich in der

Häufigkeitsverteilung des Wildtyps kein signifikanter Unterschied (χ2(1)= ,001; p= ,973). Eine

Testung des homozygoten Status erübrigte sich bei fehlendem Vorkommen in den

Stichproben.

4.3.2 Fragment zu Exon 16 : c.1751-25T>G, Intron 15

Folgende Häufigkeitsverteilung konnte bezüglich c.1751-25T>G ermittelt werden:

Genotyp



Gesamthäufigkeit

TT(WT) 65/102 63,73 63/109 57,80 128/211 60,66 TG 32/102 31,37 39/109 35,78 71/211 33,65 GG 5/102 4,90 7/109 6,42 12/211 5,69 Allele: % % % T 162/204 79,41 165/218 75,69 327/422 77,49 G 42/204 20,58 53/218 24,31 95/422 22,51

Tabelle 4.2: Häufigkeitsverteilungen der c. 1751-25T>G, Intron 15

Die Häufigkeitsverteilungen der unterschiedlichen Genotypen im Vergleich zwischen

Patientinnen- und Kontrollpersonen-Kollektiv ergaben jeweils keine statistisch signifikanten

Unterschiede. Im Einzelnen wurden folgende Testwerte ermittelt:

Genotyp TT (WT): χ2(1)= ,547; p= ,459

4. Ergebnisse

65

Genotyp TG: χ2(1)= ,282; p= ,595

Genotyp GG: χ2(1)= ,032; p= ,858

4.3.3 Exon 18, c. 2111C>T, L661L

Folgende Häufigkeitsverteilung konnte bezüglich c.2111C>T ermittelt werden:

Genotyp



Gesamthäufigkeit

CC(WT) 101/102 108/109 209/211 CT 1/102 1/109 2/211 TT 0/102 0/109 0/211 Allele: % % % C 203/204 99,50 217/218 99,54 420/422 99,53 T 1/204 0,49 1/218 0,46 2/422 0,47

Tabelle 4.3: Häufigkeitsverteilungen der c.2111C>T, L661L

Der Unterschied der Häufigkeiten zwischen Patientinnen und Kontrollpersonen beim Genotyp

CT war statistisch nicht signifikant (χ2(1)= ,000; p= 1,000). Das gleiche Ergebnis erbrachte

die Testung des Gruppenunterschieds bezüglich des Wildtyps/Genotyp CC (χ2(1)= ,000; p=

1,000). Auch bei dieser Variante erübrigte sich die Testung des homozygoten Status bei

fehlendem Vorkommen in beiden Stichproben.

4.3.4 Restriktionsanalyse zu G1528C

Genotyp

Häufigkeit u.d. Patientinnen

Häufigkeit u.d. Kindern

Häufigkeit u.d. Vätern

Häufigkeit u.d. Kontrollpersonen

Gesamthäufigkeit

GG(WT) 130/130 90/90 22/22 103/103 345/345 GC 0/130 0/90 0/22 0/103 0/345 CC 0/130 0/90 0/22 0/103 0/345

Tabelle 4.4: Häufigkeitsverteilungen der Restriktionsanalyse zu G1528C

In unseren Kollektiven ließ sich die Mutation nicht ein einziges Mal darstellen. Eine Testung

des Häufigkeitsunterschieds bei dieser Datenlage erübrigt sich.

5. Diskussion

66

5. Diskussion

Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der Relevanz von Sequenzvarianten

des Gens HADHA in der Pathogenese des HELLP-Syndroms. Neue genetische Konzepte zur

Pathogenese der Präeklampsie und des HELLP-Syndroms involvieren zunehmend die

mögliche Rolle des fetalen Genotyps (vgl. Kapitel 2.1.2). Daher muss sowohl ein potentieller

Einfluss des Gens auf maternaler Seite wie auch auf fetoplazentarer Seite berücksichtigt

werden. Außerdem ist dieses auch aufgrund der Art der klinischen Assoziation zwischen

HELLP-Syndrom der Mutter und LCHAD-Defekt des Kindes sinnvoll. Diese Aspekte

berücksichtigend wurden zwei unterschiedliche Untersuchungsansätze konzipiert:

Zum einen wurde die Häufigkeit der Mutation G1528C, welche nach heutigem Kenntnisstand

die vorherrschende Mutation bei isoliertem LCHAD-Defekt darstellt, unter 130 HELLP-

Patientinnen und 90 zugeordneten Kindern bzw. 22 zugeordneten Vätern der jeweils

betroffenen Schwangerschaften analysiert. Eine von den erkrankten Müttern ausgehende

Studie zur Häufigkeit der Assoziation von HELLP-Syndrom und LCHAD-Defekt ist bislang

in Deutschland nicht veröffentlicht worden. Sollte sich beim Vergleich der Häufigkeit der

G1528C in den Mutter-Kind- bzw. Mutter-Vater-Paarungen mit der Häufigkeit in einem

entsprechenden Kontrollkollektiv ein signifikanter Unterschied darstellen, so wäre dieses ein

Indiz für eine mögliche pathogenetische Rolle dieser Mutation beim HELLP-Syndrom. Dabei

wäre der Einfluss sowohl über den maternalen als auch über den fetalen Genotyp denkbar.

Zum anderen wurde das gesamte Gen HADHA eines Kollektivs von 102 HELLP-Patientinnen

mittels SSCP-Analyse nach weiteren Sequenzvarianten durchsucht, um einem potentiellen

Einfluss anderer Mutationen auf das HELLP-Syndrom Rechnung zu tragen. Sinnvoll erschien

die Untersuchung weiterer Mutationen, da einerseits eine signifikante allelische Heterogenität

einiger Populationen beim LCHAD-Defekt bekannt ist und andererseits bei den genetisch

untersuchten Assoziationsfällen von Schwangerschaftskomplikation und LCHAD-Defekt die

häufige G1528C zwar meist involviert, aber nicht immer maternalen Ursprungs war (vgl.

Abschnitt 2.3). Auch hier sollten bei den ermittelten Mutationen etwaige Häufigkeits-

unterschiede gegenüber einem Kontrollkollektiv Indizien für eine potentielle pathogenetische

Rolle der Sequenzveränderung beim HELLP-Syndrom liefern.

5. Diskussion

67

5.1 Diskussion der Konzeption und Analyseverfahren

5.1.1 Konzeption

Bereits in Kapitel 2 wurde auf die Problematik der Stichprobenerhebung für genetische

Untersuchungen bezüglich vermutlich multifaktoriell vererbter Merkmale bzw. Erkrankungen

eingegangen (vgl. Kapitel 2.1.2). Ethnische Variabilität, spezielle Subpopulationen oder die

schwierige Festlegung des pathologischen Schwellenwertes eines kontinuierlichen Parameters

wie des Blutdrucks sind nur einige Aspekte. Erschwerend tritt bei der Untersuchung der

hypertensiven Schwangerschaftserkrankungen noch die Klassifikationsproblematik hinzu

(vgl. Kapitel 2.1). Diese behindert eine klare Phänotypisierung zusätzlich (93, 192).

Daher wurde in der vorliegenden Arbeit das HELLP-Syndrom als relativ schmale Entität im

Rahmen der Präeklampsie isoliert untersucht und das Patientinnenkollektiv strikt definiert:

Insbesondere wurden keine Patientinnen mit HELLP-Syndrom der Klasse III nach der

Mississippi-Klassifikation und keine Fälle von partiellem HELLP-Syndrom einbezogen (vgl.

Kapitel 2.1.1).

Um den Umfang der Studie angemessen zu halten, wurden die Promotorregion und andere

regulative Sequenzen, soweit beschrieben, sowie größere Ausschnitte der Intronsequenzen

nicht untersucht, obgleich auch hier Sequenzvarianten mit potentiellem Einfluss denkbar sind.

Bislang aber sind keine Mutationen in regulativen Bereichen des HADHA beschrieben und

insbesondere nicht mit dem LCHAD-Defekt oder der Assoziation mit Schwangerschafts-

komplikationen in Zusammenhang gebracht worden. Gänzlich nicht in Betracht gezogen

wurden Mutationen des HADHB, welches für die β-Untereinheit des MTP codiert. Wie in

Kapitel 2.2.2.1 bereits erläutert, sind für die Stabilität des Protein-Komplexes MTP aber beide

Untereinheiten wichtig. Daher ist ein Einfluss von strukturverändernden Mutationen der

HADHB auf die α-subunit und damit die LCHAD-Enzymfunktion denkbar, zumal die

klinische Assoziation mit Schwangerschaftskomplikationen auch für den MTP-Defekt

beschrieben wurde (78). Da sich diese Defektart aber weitaus seltener als der isolierte

LCHAD-Defekt beschreiben lässt, dürften derartige Sequenzvarianten des HADHB bei dem

dazu relativ häufigen HELLP-Syndrom eine eher untergeordnete Rolle spielen.

Auszuschließen sind sie jedoch nicht.

Eine weitere Einschränkung der Befunde liegt in der Kollektivzusammenstellung zur

Restriktionsanalyse zu G1528C begründet: Bei fehlender DNA-Probe des Kindes wurde

ersatzweise die DNA des Vaters der betroffenen Schwangerschaft untersucht, um über diesen

5. Diskussion

68

Umweg Informationen über den fetalen Genotyp zu erhalten. Bei der Diskussion der

Ergebnisse muss aber beachtet werden, dass nach epidemiologisch-genetischen Forschungen

unter stabilen Paaren in den Industrienationen die Vaterschaft in 5 bis 20 % der Fälle nicht

korrekt angegeben wird. Demnach entspräche im Maximalfall jeder fünfte Vater nicht dem

tatsächlichen Erzeuger (93). In der vorliegenden Arbeit könnten bei Übertragung der Zahlen

zwischen einer und vier Mutter-Vater-Paarungen im Sinne der Fragestellung nicht verwertbar

sein. Bei der verständlichen Schwierigkeit, das gesuchte Erbgut von Säuglingen oder Klein-

kindern zu Forschungszwecken zu erhalten, ist die Untersuchung des väterlichen Genoms

trotz dieses Unsicherheitsfaktors jedoch schlecht vermeidbar.

Wie bereits verdeutlicht, wurde bei der Screeninguntersuchung des HADHA mittels SSCP-

Analyse der fetale Genotyp und damit potentielle fetale Einfluss anderer Sequenzvarianten

des HADHA aus Gründen der Praktikabilität nicht untersucht. Über weitere fetale Mutationen

können daher keine Aussagen getroffen werden.

5.1.2 Die SSCP-Analyse: Anmerkungen zur Sensitivität der Methode

Die SSCP-Analyse ist eine indirekte Methode der Mutationsdarstellung mit in der Literatur

unterschiedlichen Sensitivitätsangaben. Die in der vorliegenden Arbeit relativ geringe Anzahl

detektierter Sequenzvarianten und insbesondere die fehlenden Positivkontrollen für die SSCP-

Analyse machen eine detailliertere Darstellung der Aussagekraft der SSCP als Screening-

methode notwendig:

Die PCR-SSCP-Analyse ist eine in der genetischen Forschung zur Mutationssuche häufig

eingesetzte Methode, deren Vorteile in einer einfachen Anwendung, einer relativ geringen

benötigten technischen Ausstattung und in den im Gegensatz zu vergleichbaren Methoden

weniger toxischen Reagenzien liegen (110, 120). Auch ist sie weniger kosten- und

zeitintensiv (81). Gleichzeitig soll ihre Sensitivität nur geringfügig unter der Sensitivität

anderer Methoden mit ähnlicher Intention wie etwa der DGGE (denaturing gradient gel

electrophoresis) oder der Heteroduplexanalyse liegen (52, 120). Problematisch ist aber, dass

die Detektionsrate der SSCP-Analyse im Einzelfall nur schwer vorherzubestimmen ist (60,

120). Es existiert kein Modell, welches die Konformationsänderungen und die resultierenden

Mobilitätsänderungen in der PAGE bei einer konkreten Mutation vorhersagen könnte (58,

120). Stattdessen ist die SSCP-Ausbildung von vielen Faktoren abhängig, die in ihrer

Gesamtheit das Laufverhalten beeinflussen. Da auf einige dieser Faktoren im Rahmen

5. Diskussion

69

nachfolgender Diskussion Bezug genommen werden soll, erfolgt hier eine Aufzählung der

wichtigsten Einflussfaktoren: Temperatur des Gels bei der PAGE (60, 81), Länge der

untersuchten Fragments (153) und dessen G-C-Anteil (60), Art der die Mutation umgebenden

Sequenz (153), weniger der Mutationstyp selbst oder die Mutationslage im Fragment (60,

114, 153), Kenngrößen T und C des PAA-Gels (47), Geladditiva wie Glycerol (91, 96) oder

geringe Konzentrationen denaturierender Agenzien wie Urea (195), Eigenschaften des PAGE-

Puffers (91), Wattzahlen der Elektrophorese (39) und andere. Nicht zu unterschätzen ist auch

die oftmals schwierige subjektive Interpretation des Bandenmusters mit daraus resultierenden

unterschiedlichen Detektionsraten (39, 60, 120). Aufgrund der Vielzahl an Einflussfaktoren

muss die SSCP-Analyse bei bekannter Mutation zur Erreichung entsprechender Sensitivitäts-

raten meist empirisch optimiert werden. Andererseits ist daher die Sensitivität dieser

Methodik bei der Suche nach noch unbekannten Mutationen im Einzelfall schwer

einzuschätzen (110, 120). Aus diesem Grunde werden in der SSCP-Screeninguntersuchung

mehrere unterschiedliche Bedingungen parallel angewandt, um so die Sensitivität potentiell

zu erhöhen (58, 96, 114). K. Hayashi, Mitbegründer der SSCP-Analyse, sieht aufgrund seiner

Erfahrung in einer Kombination aus einer Elektrophorese bei Raumtemperatur und 4 °C,

sowie mit und ohne 5-10 % Glycerol eine gute Startkonstellation für die Suche nach noch

unbekannten Mutationen (58, 59). Diesen Angaben entspricht die Bedingungskonstellation

der vorliegenden Untersuchung (vgl. Kapitel 3.3.4). Auch wird die SSCP-Analyse nur bis zu

einer maximalen Länge des zu untersuchenden Fragments von 200-300 bp empfohlen (58,

114), obgleich neue Forschungsergebnisse diese Einschränkung unter entsprechenden

Bedingungen hinterfragen (60, 83, 91, 95). In der vorliegenden Arbeit wurden dem

entsprechend Fragmente der Längen 160 bp bis maximal 314 bp untersucht (vgl. Tabelle 3.1).

Aufgrund empirischer Forschungsergebnisse zur Sensitivitätsoptimierung empfahlen Glavac

und Dean bei der SSCP-Analyse mit der PAGE einen hohen T-Wert (8-10 %) und einen

relativ niedrigen C-Wert (1,3-2,6 %) des PAA-Gels (47). Auch dieser Empfehlung folgte die

vorliegende Untersuchung (T=10 %, C=2 %, vgl. Kapitel 3.3.3.2.1). Zusammenfassend

wurden also verschiedene Optimierungsoptionen in das Analysekonzept übernommen.

Diverse Studien haben sich mit der Ermittlung von Sensitivitätsraten der SSCP-Analyse

beschäftigt und zumeist nur einige der Einflussfaktoren untersucht. Oft sind diese Angaben

bei unterschiedlichen Bedingungen nicht direkt vergleichbar. Ein kleiner Überblick soll

dennoch gegeben werden: Nach Hayashi et al. sind unter zwei bis drei unterschiedlichen

Bedingungen bei einer Fragmentlänge von bis zu 200 bp über 90 %, und bei einer Fragment-

länge von 300 bis 350 bp mehr als 80 % der unbekannten Sequenzvarianten mittels SSCP

5. Diskussion

70

detektierbar (58). Liu et al. konnten Detektionsraten von 100 % bei Kombination von

mindestens drei der von ihnen getesteten fünf speziellen SSCP-Konstellationen erreichen

(96). In einer Analyse von Sheffield et al. aus dem Jahr 1993 konnten fragment-

längenabhängig unter drei Bedingungen bis zu 97 % der Mutationen dargestellt werden,

wobei diese Rate aber bei steigender Fragmentlänge massiv abfiel und im Durchschnitt für

alle Fragmente unter 212 bp-Länge bei 79 % lag (153). Michaud et al. ermittelten in einem

prospektiven Ansatz unter drei verschiedenen SSCP-Bedingungen und Fragmenten der Länge

181 bis 336 bp eine Detektionsrate von 79 % (110). Sakar et al. erreichten hingegen bei ihrer

Untersuchung der Hämophilie B nur eine SSCP-Detektionsrate von 35 % (47). Von einigen

Autoren wird dieses als Beispiel für ein durch die SSCP-Analyse nur schlecht zu

untersuchendes Gen gewertet (58). Im überwiegenden Teil der publizierten Berichte konnten

aber unter mehreren Bedingungen hohe Sensitivitätsraten ermittelt werden.

In der SSCP-Analyse zum HADHA zeigte sich kollektivunabhängig eine relativ geringe

Anzahl an neu detektierten Sequenzveränderungen. Theoretisch findet sich genomweit alle

600 Basenpaare ein sogenannter SNP, ein Einzel-Nukleotid-Polymorphismus (127). Die

relativ geringe Rate detektierter Sequenzvarianten kann mehrere Ursachen haben: Trotz der

erläuterten Anwendung mehrerer Optimierungsempfehlungen wäre eine speziell für das Gen

HADHA suboptimale Bedingungskonstellation der SSCP-Analyse als Ursache denkbar. Dann

wären höhere Detektionszahlen bei einer Ausweitung der Bedingungen der SSCP-Analyse

möglich. Ein interessanter Punkt bei Optimierungsbemühungen könnte die Beobachtung sein,

dass zwei der insgesamt nur drei entdeckten Sequenzvarianten mittels 16-Stunden-SSCP-

Analyse dargestellt wurden. Diese zeitintensivere Methodik wurde jedoch nur für drei der

insgesamt 20 unterschiedlichen Fragmente genutzt (vgl. Kapitel 3.3.4). Zur Anwendung

kommen hier geringere elektrische Spannungen als bei 3-Stunden-Durchläufen. Bekannt ist,

dass hohe Wattzahlen bei der Elektrophorese vermutlich über einen Temperaturanstieg im Gel

die Einzelstrangstabilität stören und damit die Sensitivität der SSCP-Analyse verändern

können (39, 47). Optimierungsversuche könnten hier ansetzen und 16-Stunden-Gele

vorziehen.

Auf der anderen Seite ist auch eine stärkere Konservierung des Gens HADHA im Vergleich

zu anderen enzymcodierenden Genen als Ursache der geringen Anzahl detektierter Sequenz-

varianten denkbar. Für diese These spricht die potentielle Schwere der Erkrankung bei

LCHAD-Defekt mit unbehandelt oft letalem Ausgang. Das Gen könnte evolutionsbiologisch

betrachtet eine geringere Toleranzbreite gegenüber Sequenzveränderungen aufweisen. Nicht

nur der direkte enzymatische Effekt, sondern darüber hinaus auch strukturelle MTP-

5. Diskussion

71

Stabilisierungs- und Verankerungsprozesse müssen erhalten bleiben (vgl. Kapitel 2.2.2.1).

Zur Überprüfung der Annahme sind aber weit mehr Informationen zum humanen HADHA

nötig als bislang publiziert.

Inwieweit also die relativ geringe Anzahl entdeckter Sequenzvarianten ein Abbild der Realität

oder ein Problem der Analysetechnik ist, kann im derzeitigen Kontext nicht abschließend

beantwortet werden.

5.2 Inhaltliche Ergebnisdarstellung

Die Restriktionsanalyse zu G1528C in den genannten 112 Mutter-Kind- oder Mutter-Vater-

Paarungen sowie bei den zusätzlichen 18 HELLP-Patientinnen und dem Kontrollkollektiv von

103 Personen konnte die betreffende Mutation weder im heterozygoten, noch im

homozygoten Zustand darstellen. Demnach wies von insgesamt 345 untersuchten Personen

keine die Sequenzvariante auf. Auf die Allelebene übertragen fand sie sich kein einziges Mal

unter 690 Allelen.

In der SSCP-Analyse konnten drei bisher in der Literatur nicht veröffentlichte

Sequenzvarianten des HADHA ermittelt werden. Diese betrafen die PCR-Fragmente zu Exon

1, 16 und 18:

c.130G>T

Die Sequenzvariante c.130G>T des Exon 1, die bei einer einzigen Patientin gefunden wurde,

liegt in der 5úntranslatierten Region des Gens HADHA. Über die 5ÚTR von Genen ist

bekannt, dass sie eine wichtige Rolle bei der Initiation der Translation spielen und zur

Effizienz der Translation beitragen (90). Bei Prokaryonten wurden Stabilisierungsprozesse

des Initiationskomplexes durch Sequenzen in der 5ÚTR beschrieben (90). In der eukaryoten

Translation ist sie nachgewiesener Maßen in regulative Prozesse involviert: Bestimmte

Konformationsausbildungen der mRNA in dieser Region haben Einfluss auf die Effizienz der

Translation, ebenso wie das Vorhandensein der sogenannten Kozak-Sequenz. Es handelt sich

hierbei um eine Art Konsensus-Sequenz vieler mRNAs der Form „CCA/GCCAUGG“. Bei

diesen sind an dritter Stelle vor und an erster Stelle nach dem Startcodon AUG meist die

Basen Adenin oder Guanin bzw. Guanin zu finden und von besonderer Bedeutung.

Veränderungen dieser Basen führen zu Effizienzverlusten der Translation und haben somit

5. Diskussion

72

quantitativen Einfluss auf das Protein (90). Obgleich die in der vorliegenden Arbeit neu

beschriebene c.130G>T nicht die wichtigen Stellen der Kozak-Sequenz betrifft, ist aufgrund

der Lage und bei einer potentiellen Vielzahl weiterer Mechanismen ein Effekt dieser Mutation

auf das Protein nicht auszuschließen (90). Der Fokus der vorliegenden Studie lag jedoch

primär auf der Frage nach einer Häufung bestimmter Allele bei HELLP-Patientinnen.

Dahingehend analysiert ließ sich die genannte Variante des Exon 1 in dem untersuchten

Kontrollkollektiv von 109 Personen kein Mal darstellen. Der statistische Vergleich zwischen

Patienten- und Kontrollkollektiv konnte keinen signifikanten Häufigkeitsunterschied für diese

Sequenzvariante nachweisen.

c.1751-25T>G

In dem Fragment zu Exon 16 konnte die Variante c.1751-25T>G des Intron 15 dargestellt

werden. Die Lokalität der Sequenzvariante schließt einen direkten Effekt auf die

Aminosäuresequenz aus. Ein indirekter Effekt auf die Genexpression beispielsweise durch

Störungen des Splice-Vorgangs oder durch Störung interner (im Intron gelegener)

regulatorischer Sequenzen kann allerdings nur durch weitere Studien sicher ausgeschlossen

werden (20, 127). Schwere Störungen der Proteinbiosynthese und damit der Genfunktion

dürften aber aufgrund der Häufigkeit der Variante in beiden Kollektiven sehr

unwahrscheinlich sein. c.1751-25T>G ist nach den hier ermittelten Häufigkeiten ein

genetischer Polymorphismus des Gens HADHA (Häufigkeit > 1% der Population).

Insgesamt wurden 102 Patientinnen und 109 Kontrollpersonen bezüglich ihres Genotypen

untersucht. Die statistische Analyse ergab jeweils keinen signifikanten Unterschied der

Häufigkeitsverteilungen beim Vergleich beider Kollektive.

c.2111C>T

Die Sequenzvariante c.2111C>T in Exon 18 mit potentiell direktem Effekt auf die

Aminosäuresequenz wurde jeweils nur bei einer Patientin und bei einer Kontrollperson der

untersuchten Kollektive gefunden. Sie bewirkt aber keine Aminosäuresubstitution, da beide

Allele für die Aminosäure Leucin codieren, und ist damit eine Silent-Mutation. Aufgrund der

Häufigkeiten in den untersuchten Kollektiven könnte es sich formal sowohl um einen

Polymorphismus (Häufigkeit > 1% der Population) als auch um eine sogenannte seltene

genetischen Variante (Häufigkeit < 1% der Population) handeln. Die Differenzierung ist

derzeit bei der in Relation zur Gesamtpopulation zu geringen Anzahl untersuchter Probanten

nicht möglich. Die statistische Analyse der Häufigkeitsverteilungen ergab keine signifikanten

5. Diskussion

73

Unterschiede zwischen dem Kollektiv von 102 HELLP-Patientinnen und dem

Kontrollkollektiv mit 109 Probandinnen.

Eine Anmerkung zu Intron-Sequenzvarianten und Silent-Mutationen, wie sie hier vorliegen,

erscheint notwendig:

Bei der Suche nach Anfälligkeitsgenen ist zu berücksichtigen, dass der direkte Effekt einer

Sequenzvariante auf die Aminosäuresequenz nicht das entscheidende Kriterium ist. Die

Einfluss- und Wirkungsmechanismen der Sequenzvarianten können komplexer sein als ein

direkter Aminosäureaustausch. So konnte beispielsweise in der Erforschung des

Angiotensinogen-Gens gezeigt werden, dass der Polymorphismus M235T gehäuft bei

essentieller Hypertonie vorkommt. Dieser befindet sich aber in einem Kopplungs-

ungleichgewicht mit verschiedenen Sequenzvarianten der Promotorregion, welche ihrerseits

für die bei dem Polymorphismus M235T beobachteten, erhöhten Angiotensinogen-Spiegel

verantwortlich gemacht werden (192). Die Darstellung einer Häufung bestimmter Allele bei

einer Erkrankung ist also initial rein deskriptiv zu sehen.

Resümierend ließen sich in der vorliegenden Studie keine signifikanten Unterschiede der

Häufigkeiten bestimmter Allele des HADHA zwischen Patientinnen- und Kontrollkollektiv

darstellen, insbesondere nicht bezüglich der unter Patienten mit LCHAD-Defekt häufigen

G1528C. Auch fand sich letztgenannte Mutation weder unter den Kindern der betroffenen

Schwangerschaften noch unter den Vätern, was im positiven Fall einen fetalen Faktor hätte

protegieren können, und scheint insgesamt selten (0/345 Probanden). Das wiederum spricht

gegen eine starke Assoziation des HELLP-Syndroms und des LCHAD-Defekts, geht man von

einem HELLP-Patientinnen-Kollektiv aus. Auch liefert die Studie keine Indizien dafür, dass

HADHA als fetales oder maternales Risikogen beim HELLP-Syndrom eine Rolle spielen

könnte.

5.3 Einordnung der Ergebnisse in den derzeitigen Forschungsstand

Wie bereits in den allgemeinen Grundlagen erläutert, sprechen einige Beobachtungen und

theoretische Annahmen für HADHA als pathophysiologisch begründetes Kandidatengen des

HELLP-Syndroms: Neben vergleichbarer Organpräferenz und histologischen Ähnlichkeiten

sind vor allem die bei Präeklampsie und HELLP-Syndrom zu verzeichnenden Störungen des

5. Diskussion

74

Fettstoffwechsels in Kombination mit den Berichten über eine klinische Assoziation dieser

Erkrankungsformen mit dem LCHAD-Defekt als Hinweise zu werten. Sattar et al.

formulierten die These, dass bei Präeklampsie, HELLP-Syndrom und AFLP bei bestehender

schwangerschaftsphysiologischer Kombination von erhöhten Spiegeln freier Fettsäuren und

einer in der Spätschwangerschaft beeinträchtigten β-Oxidation der Fettstoffwechsel durch

Faktoren wie Zytokine oder Lipidperoxide weiter gestört ist. Ein latenter genetischer Defekt

der β-Oxidation der Schwangeren könnte hier nun zusätzlich die Fettstoffwechselstörung

verschärfen und bei diesen Patientinnen in einer Lipoproteinkonstellation münden, die die

Endotheldysfunktionen erklären könnte (148).

Außerdem konnte 2003 ein weiteres Mal bei einer genomweiten Kopplungsuntersuchung in

einem finnischen Kollektiv ein potentieller Anfälligkeitslokus für Präeklampsie auf dem

kurzen Arm von Chromosom 2 lokalisiert werden (94). Wie erläutert findet sich auch

HADHA auf 2p. Anzumerken bleibt aber, dass die bislang drei positiven Kopplungsanalysen

zu Chromosom 2p aus Island, Australien/Neuseeland und nun Finnland durchaus

unterschiedliche Loki beschrieben, auch wenn Moses et al. dieses anders werteten und das

vermeintliche Anfälligkeitsgen bereits PREG1 nannten (3, 94, 118).

Ibdah et al. untersuchten anhand eines Mausmodells den Effekt eines α-subunit-Nullallels des

MTP-Proteins und konnten zeigen, dass auch heterozygote Träger des Defekts unter

bestimmten Umständen wie zum Beispiel fettreicher Nahrung an einer Leberverfettung und

erhöhten Leberwerten leiden können. Sie schlossen daraus, dass eine Heterozygotie für MTP-

Mutationen in Kombination mit Faktoren wie oxidativem Stress Einfluss auf die Entwicklung

einer Fettlebererkrankung haben kann (68). Eine Übertragung dieser Befunde zu

heterozygoten Mutationen des HADHA auf hepatische Schwangerschaftskomplikationen ist

möglich (171).

Auf der anderen Seite sprechen diverse Überlegungen gegen einen starken Einfluss des

HADHA-Genotyps beim HELLP-Syndrom und unterstreichen noch einmal die These eines

multifaktoriellen Geschehens:

Die Schwangerschaftskomplikationen, die bei LCHAD-defektem Kind in der betroffenen

Schwangerschaft auftraten, ließen sich bei gleicher und damit heterozygoter Mutter

(Ausnahme: UPD) nicht in den Schwangerschaften nachweisen, denen ein nicht betroffenes

Geschwisterkind zu Grunde lag (66, 173). Die wenigen, enzymatisch belegten Ausnahmen

von dieser Beobachtung sind aufgrund fehlender Genotyp-Bestimmung schwer zu bewerten

(vgl. Abschnitt 2.3). Ein Effekt alleine durch die Heterozygotie der Mutter oder die des Fetus

5. Diskussion

75

im Gen HADHA wird damit unwahrscheinlich. Unter der Annahme, dass nicht der

heterozygote Zustand des Kindes oder der Mutter, sondern eher der vollständige fetale

LCHAD-Defekt einen direkten Effekt vermittelt, erscheint ein Vergleich der geschätzten

Häufigkeiten von isoliertem LCHAD-Defekt und HELLP-Syndrom in der normalen

Population sinnvoll. Es lässt sich aufgrund der Diskrepanz der Häufigkeiten vermuten, dass

allein aus epidemiologischen Überlegungen nicht ein größerer Teil der HELLP-Patientinnen

von einem derartigen Defekt ihres Kindes betroffen sein kann (vgl. Abschnitt 2.1.1, 2.2 und

2.2.2.2). Selbst wenn ein solcher Zusammenhang beider Erkrankungen von Seiten der Mutter

dargestellt werden könnte, spräche die Beobachtung, dass auch bei nachgewiesenem fetalen

isolierten LCHAD-Defekt nicht jede der betroffenen Schwangerschaften von Schwanger-

schaftskomplikationen begleitet wird, für notwendige zusätzliche Faktoren in der Pathogenese

der Komplikation (173). Unterstrichen wird der zwingende Einfluss additiver Faktoren

außerdem durch die Überlegung, dass diverse Charakteristika der assoziierten Schwanger-

schaftskomplikationen wie beispielsweise Tendenz zur Primipara bzw. Primipaternität oder

Häufung bei heterologer Insemination nur durch einen genetischen Effekt nicht zu erklären

wären.

Parallel zum Beginn der experimentellen Phase der vorliegenden Arbeit im Februar 2000 und

in der Folgezeit veröffentlichten verschiedene Forschergruppen Studien, die erstmalig nur von

den Patientinnen mit Schwangerschaftskomplikation ausgingen und anhand dieses Kollektivs

Mutationen des HADHA untersuchten:

In den USA analysierten Ibdah et al. (70, Veröffentlichung 4/2000) 55 HELLP- und 13

AFLP-Patientinnen und deren Kinder oder Partner mittels RFLP- und ggf. SSCP-Analyse.

Während keine der HELLP-Patientinnen oder deren Kinder die häufige G1528C aufwies,

zeigten drei der AFLP-Patientinnen (23 %) diese Mutation. Die Kinder dieser Schwanger-

schaften hatten alle einen isolierten LCHAD-Defekt im compound heterozygoten Zustand mit

weiteren Mutationen in Exon 4, 12 und 15. Da es sich bei der Veröffentlichung nur um ein

Poster handelte, sind keine weiteren Angaben über mögliche andere Sequenzvarianten bei

HELLP-Patientinnen, in etwaigen Kontrollkollektiven oder ähnliche Informationen enthalten.

Zwei weitere Forschergruppen veröffentlichten ihre Studien ebenfalls nur als Poster:

Earl et al., USA (34, Veröffentlichung 1/2000), untersuchten die DNA von 70 HELLP-

Patientinnen und 51 korrelierten Kindern dieser Patientinnen sowie die DNA von 121 Müttern

mit schwerer Präeklampsie mittels PstI-Restriktion auf die häufige G1528C-Mutation. Kein

Proband zeigte die gesuchte Mutation. Ebenfalls in den USA und ebenfalls als reine

5. Diskussion

76

Restriktionsanalyse bezüglich der G1528C untersuchten Livingston et al. (97,

Veröffentlichung 1/2001) 20 Patientinnen mit komplettem und 14 mit partiellem HELLP-

Syndrom, sowie zwei AFLP-Fälle. Zusätzlich wurden 17 fetale Proben mitverdaut, deren

Zugehörigkeit zu den einzelnen Gruppen aufgrund der reduzierten Datenlage aber nicht

nachzuvollziehen ist. Auch hier konnte die Mutation nicht nachgewiesen werden.

In einem kleinen Kollektiv aus Japan wurden 3 Patientinnen mit AFLP oder HELLP-Syndrom

auf G1528C gescreent. Die Mutation konnte bei den Patientinnen nicht dargestellt werden

(43, Veröffentlichung 11/2004).

In diesem Zusammenhang sind bislang zum HELLP-Syndrom nur drei größere und

ausführlichere Studien publiziert: In einer umfangreichen Restriktions-Untersuchung zur

Trägerfrequenz der G1528C in den Niederlanden analysierten Den Boer et al. (31,

Veröffentlichung 8/2000) zum einen ein Kollektiv von 113 HELLP-Patientinnen, definiert

nach der Tennessee-Klassifikation, zum anderen 2047 Guthrie-Karten, die sie anonymisiert

und demographisch-repräsentativ selektiert aus den ganzen Niederlanden bezogen hatten.

Innerhalb des HELLP-Kollektivs konnte die Mutation einmal heterozygot ermittelt werden

(1:113; 95%- Konfidenzintervall: 1:18 bis 1:560). Die repräsentative Stichprobe aus den

ganzen Niederlanden enthielt drei heterozygote und keine homozygoten Träger. Die

Prävalenz der G1528C in den Niederlanden lautet demnach: 1:680 (95%-K.I.: 1:325 bis

1:1400). Der Unterschied zwischen beiden Kollektiven war statistisch nicht signifikant. In der

betreffenden Studie wurden weder die Kinder der HELLP-Patientinnen involviert noch ein

größeres Mutationsscreening im Gen HADHA durchgeführt.

Eine weitere prospektive Studie zur Assoziation zwischen HELLP-Syndrom und LCHAD-

Defekt wurde 11/2002 von Yang et al. veröffentlicht (194): 81 Mütter mit HELLP-Syndrom

und 27 Mütter mit AFLP sowie die jeweils zugehörigen Kinder oder ggf. Väter wurden

mittels SSCP-Analyse auf Mutationen des HADHA durchsucht. Zusätzlich wurde eine

Restriktionsanalyse zur G1528C unternommen. Damit gleicht diese Studie methodisch der

vorliegenden Arbeit. Nur eine der untersuchten HELLP-Patientinnen wies die Mutation

G1528C im heterozygoten Zustand auf (1:81), ihr Kind zeigte keine Mutationen des HADHA.

Auch wurden keine weiteren Sequenzvarianten dieses Kollektivs berichtet. Interessanterweise

fanden sich jedoch bei den 27 AFLP-Patientinnen 5 Fälle von isoliertem LCHAD-Defekt des

korrelierten Kindes (19 %). Drei der Kinder waren homozygot bezüglich der Mutation

G1528C, die zwei anderen Kinder compound heterozygot. Alle Nicht-G1528C-Mutationen

waren paternalen Ursprungs. Die dargestellte Assoziation zwischen AFLP und fetaler

G1528C war statistisch signifikant. Keine der 22 anderen untersuchten AFLP-Patientinnen

5. Diskussion

77

zeigte Mutationen des HADHA. Zu dieser Studie muss folgendes angemerkt werden:

Inwieweit das von Yang et al. untersuchte Kollektiv Teile des bereits erwähnten Kollektivs

von Ibdah et al. (70), Koautor auch dieser Studie, enthält, ist aus den vorliegenden Angaben

nicht erfassbar. Auffällig sind jedoch die identischen Exonangaben bezüglich zusätzlicher

Mutationen.

In der dritten größeren Untersuchung, einer Studie aus Österreich aus dem Jahr 2005, wurden

84 Kinder aus Schwangerschaften mit HELLP-Syndrom und 3 Mütter mit HELLP-Syndrom

bezüglich pathologischer Acylcarnitinprofile im Blut und bezüglich der G1528C untersucht.

Weder die Mutation noch ein pathologisches Acylcarnitinmuster konnte bei den Kindern und

den 3 Müttern dargestellt werden (64).

Wie sich aus der erfolgten Darstellung ergibt, bezieht sich der derzeitige Forschungsstand

zum Zusammenhang zwischen HELLP-Syndrom und HADHA auf Kollektive aus den USA (4

bzw. 3 Studien), den Niederlanden, Österreich und Japan (jeweils 1 Studie). In diesen

Ländern konnten die Forscher keine signifikante Assoziation zwischen HADHA-Mutationen

und HELLP-Syndrom darstellen, wenn sie von unselektierten HELLP-Patientinnen

ausgingen. Insbesondere die statistisch bedeutsame Mutation G1528C trat unter den

Patientinnen und ggf. ihren Kindern nicht signifikant gehäuft auf. Daher stuften die Forscher

den möglichen Einfluss des untersuchten Gens bei der genannten Erkrankung in ihren

Kollektiven als eher gering ein (31, 34, 43, 64, 97). Es muss hierbei aber beachtet werden,

dass die zitierten Studien zumeist nur die G1528C-Variante als häufigste Sequenzveränderung

und nicht das gesamte Gen analysiert haben.

Die derzeitige Einschätzung einer eher geringen Einflussnahme des HADHA-Genotyps der

Mutter oder des Kindes auf das HELLP-Syndrom kann aufgrund der Ergebnisse der

vorliegenden Studie für das untersuchte deutsche HELLP-Patientinnen-Kollektiv geteilt

werden, allerdings unter Vorbehalt der in Kapitel 5.1 und 5.2 diskutierten Aspekte. Dabei ist

diese Untersuchung umfassender als die meisten der zitierten Studien, da das gesamte

maternale Gen auf Mutationen durchsucht wurde. Obgleich in den USA und Finnland weit

höhere Prävalenzen für G1528C angenommen werden (vgl. Kapitel 2.2.2.2), konnte die

Mutation kein einzige Mal unter den 345 Probanden unseres deutschen Kollektivs dargestellt

werden. Dieses Ergebnis steht jedoch mit der von Den Boer repräsentativ ermittelten

Heterozygotenfrequenz in den Niederlanden von 1:680 im Einklang (31). Es ist anzunehmen,

dass die Mutation in Mitteleuropa seltener ist als in Finnland oder den USA. Da das deutsche

Kollektiv allerdings nicht repräsentativ ist, und da die Untersuchung zur Prävalenz in den

5. Diskussion

78

USA nur an einem sehr kleinen Kollektiv durchgeführt wurde, müssten weitere Studien die

Hypothese bestätigen.

So bleibt zu betonen, dass alle Ergebnisse nur unter der genauen Angabe der Population, auf

die sich diese beziehen, interpretiert werden können. Die starke Populationsabhängigkeit ist

bei allen multifaktoriellen Erkrankungen bekannt. Die Mutation G1528C des HADHA scheint

in der finnischen Population relativ häufig zu sein. Die Heterozygotenfrequenz wird mit 1:240

angegeben, alle LCHAD-Defekt-Fälle waren bislang homozygot für diese Mutation

(vergleiche Kapitel 2.2.2.2). Außerdem ist der LCHAD-Defekt in Finnland die

meistdiagnostizierte angeborene β-Oxidations-Störung. In vielen anderen europäischen

Ländern überwiegt der MCAD-Defekt. Daher wäre eine Untersuchung wie die vorliegende

insbesondere in einem finnischen Kollektiv aufschlussreich. Eventuell zeigt hier eine größere

und damit statistisch fassbare Subpopulation der HELLP-Patientinnen Veränderungen des

Gens HADHA.

Interessanterweise wurde in zwei der zitierten Studien von signifikanten Häufungen fetaler

LCHAD-Defekte unter unselektierten AFLP-Patientinnen berichtet (70, 194). Wie bereits

erläutert, könnte es sich aber um teilweise identische Kollektive handeln, so dass nur auf die

ausführlichere Studie von Yang et al. Bezug genommen werden soll: 19 % der insgesamt 27

untersuchten AFLP-Patientinnen waren in der betreffenden Schwangerschaft mit einem

LCHAD-defekten Fetus schwanger. Dieses entspricht einer signifikanten Häufung. Bislang

aber ist dieses die einzige Studie mit positiver Assoziation zwischen Mutationen des HADHA

und der unselektierten AFLP (bei genannter Ausnahme). Andere Autoren konnten keine

solche Häufung darstellen: Die bereits erwähnte französische Studie an 14 AFLP-Patientinnen

aus dem Jahr 1996 von Mansouri et al. (106) konnte ebenso wenig eine Häufung der Mutation

G1528C ermitteln wie eine Analyse von Maitra et al. (USA), die 10 unselektierte AFLP-

Patientinnen mittels Restriktion bezüglich der Mutation G1528C genotypisiert hatten (104).

Tan et al. (Niederlande) hatten im Rahmen eines Fallberichts über die AFLP nicht genetisch,

aber biochemisch-diagnostisch einen β-Oxidationsdefekt des Kindes ausgeschlossen (167).

Livingston et al. (97) (USA) hatten bei zwei AFLP-Patientinnen die Mutation G1528C nicht

darstellen können.

Damit ist der Forschungsstand zur AFLP als divergent anzusehen und weitere Studien zu

dieser Thematik wünschenswert.

5. Diskussion

79

Ungeachtet dieser These einer geringen pathogenetischen Rolle des HADHA beim HELLP-

Syndrom ist die aus dem Blickwinkel des betroffenen Fetus retrospektiv gesehene klinische

Assoziation auch weiterhin evident: Aktuelle Studien bestätigten erneut das gehäufte

Auftreten von HELLP-Syndrom oder AFLP der Mutter bei isoliertem fetalen LCHAD-Defekt

(17, 32, 44, 158). Die pathophysiologischen Grundlagen dieser klinischen Assoziation sind

noch nicht geklärt. Initiale Ansätze gingen von einem Effekt toxischer Metabolite und

Intermediate aus, die im LCHAD-defekten Fetus bei gestörter β-Oxidation aus den nicht

abgebauten langkettigen Fettsäuren entstehen und über die Plazenta in den mütterlichen

Kreislauf gelangen (171). Potentielle toxische Kandidaten mit nachgewiesenen Effekten, die

Verbindungen zu Mechanismen der Pathophysiologie der Präeklampsie zulassen, konnten

identifiziert werden (133, 171). Dazu gehören langkettige 3-Hydroxy-Fettsäuren, langkettige

3-Hydroxy-Acylcarnitine, langkettige 3-Hydroxy-Acyl-CoAs und langkettige 3-Hydroxy-

Dicarboxysäuren (133). Die Untersuchungen beschäftigen sich aber zunehmend mit der Rolle

der Plazenta, da Forschungen der letzten Jahre belegten, dass der Fetus in utero kaum

mitochondriale β-Oxidation betreibt, sondern hauptsächlich Glukose verstoffwechselt (32,

133, 171). Die Plazenta hingegen zeigt deutliche Aktivitäten von Enzymen der

mitochondrialen β-Oxidation, insbesondere auch der LCHAD, und besitzt gleichzeitig zu

einem gewissen Teil den fetalen Genotyp (132, 154). Sie wäre demnach als Quelle der Toxine

denkbar. Eine Diskussion potentieller Mechanismen finden sich bei Rakheja et al. und

Shekhawat et al. (132, 154). Die Rolle einer gestörten β-Oxidation in der Genese der

Schwangerschaftskomplikationen wird zudem durch Berichte unterstützt, die weitere Defekte

der mitochondrialen β-Oxidation mit diesen Erkrankungen der Schwangerschaft in

Verbindung bringen, wie etwa den MCAD-Defekt (121), SCAD-Defekt (183) oder den CPT-

1-Defekt (171). Da es sich hierbei allerdings um weit weniger Fälle handelt als beim

LCHAD-Defekt, ist beim LCHAD-Defekt von zusätzlichen Faktoren, wie etwa speziellen

Toxinen, auszugehen (32, 133, 171).

Die Frage nun, ob ein generelles Neugeborenenscreening bezüglich des LCHAD-Defekts bei

Kindern aus Schwangerschaften mit HELLP-Syndrom oder AFLP indiziert ist, ist

mittlerweile überholt. Die häufigsten Fettsäureoxidationsdefekte sind inzwischen in den Kreis

der von der ständigen Kommission für Neugeborenenscreening der entsprechenden

Fachgesellschaften empfohlenen Zielkrankheiten des nationalen Neugeborenenscreenings

aufgenommen (65).

5. Diskussion

80

In Anbetracht der dargestellten Ergebnisse stellt in Deutschland das Gen HADHA allenfalls in

einer sehr kleinen Subgruppe von HELLP-Patientinnen ein relevantes maternales oder fetales

Risikogen dar.

6. Zusammenfassung

81

6. Zusammenfassung

Hypertensive Schwangerschaftserkrankungen sind eine Gruppe von Erkrankungen mit hohem

Gefährdungspotential für Mutter und Kind. Insbesondere das HELLP-Syndrom, eine Unter-

form dieser Erkrankungsklasse, weißt noch immer Mortalitätsraten von bis zu 4 % für die

Mutter und von bis zu 60 % für den Feten auf. Seit Jahrzehnten bestehen intensive

Forschungsbemühungen, um Einblicke in die pathophysiologischen Zusammenhänge dieser

Erkrankungen zu erhalten und davon ausgehend bessere Früherkennungs- und

Therapiemöglichkeiten zu entwickeln. Insbesondere die Frage nach einer genetischen

Prädisposition nimmt in den letzten Jahren zunehmend Raum ein. Die Suche nach

Risikogenen ist hoch aktuell. Bei hypertensiven Schwangerschaftserkrankungen sind sowohl

maternale als auch fetale Risikogene denkbar.

Aufgrund einer mehrfach beschriebenen klinischen Assoziation von HELLP-Syndrom der

Mutter und einem speziellen Defekt der β-Oxidation des Feten, dem LCHAD-Defekt, gerieten

die für den Defekt verantwortlichen Gene HADHA und HADHB in den Kreis der

Kandidatengene des HELLP-Syndroms. Insbesondere eine Mutation, die G1528C des

HADHA, ließ sich bei erkrankten Kindern überproportional häufig darstellen. Auf dieser

Grundlage konzipierten wir eine Kandidatengenanalyse des HADHA:

Die Häufigkeit der G1528C wurde in einem Kollektiv aus 130 HELLP-Patientinnen, 90

zugehörigen Kindern und (bei fehlender DNA des Kindes) 22 zugehörigen Kindsvätern

untersucht. Weder in diesen Kollektiven noch in einem Kollektiv von 103 Kontrollpersonen,

Mütter ohne Schwangerschaftskomplikationen, konnte die genannte Mutation auch nur ein

einziges Mal dargestellt werden. In einem weiter gefassten Ansatz wurde dann das gesamte

Gen HADHA auf weitere Sequenzabweichungen bei HELLP-Patientinnen durchsucht. Mittels

der Screeningmethode SSCP-Analyse konnten letztendlich drei Sequenzveränderungen

dargestellt werden. Dabei handelte es sich um einen Basenaustausch in der 5ÚTR

(c.130G>T), einen Polymorphismus in Intron 15 (c.1751-25T>G), sowie um eine Silent-

Mutation in Exon 18 (c.2111C>T). Untersucht wurden jeweils mindestens 100 HELLP-

Patientinnen und bei Vorlage einer Sequenzveränderung in diesem Kollektiv 109 Kontroll-

personen, ebenfalls Mütter ohne Schwangerschaftskomplikationen in der Vorgeschichte. Der

statistische Vergleich der Häufigkeitsunterschiede in beiden Kollektiven konnte für keine der

Sequenzvarianten einen signifikanten Unterschied ermitteln.

Anhand der dargestellten Ergebnisse ist davon auszugehen, dass HADHA in Deutschland

allenfalls bei einer sehr kleinen Subpopulation von HELLP-Patientinnen ein maternales

6. Zusammenfassung

82

Risikogen darstellt. Dieses Ergebnis deckt sich mit Beobachtungen aus den Niederlanden, den

USA und Österreich. Interessant wäre eine ähnliche Untersuchung jedoch insbesondere in

Finnland, da dort der LCHAD-Defekt bedeutend häufiger vorkommt als in Mitteleuropa.

Ebenfalls interessant wäre eine Kandidatengenanalyse des HADHA bei AFLP-Patientinnen,

da erste Ergebnisse darauf hindeuten, dass HADHA in einer größeren Subgruppe ein

relevantes maternales Risikogen darstellen könnte. Ein spezielles Screening der

Neugeborenen auf einen Defekt der β-Oxidation wird mittlerweile unabhängig von einem

Vorliegen des HELLP-Syndroms oder einer AFLP der Mutter empfohlen.

7. Literaurverzeichnis

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8. Abbildungsverzeichnis

102

8. Abbildungsverzeichnis

Abb. 2.1: Die mitochondriale β-Oxidation und Ketogenese am Beispiel der

Metabolisierung einer langkettigen Fettsäure

Seite 20

Abb. 2.2: Struktur der cDNA der MTP-Untereinheiten

Seite 24

Abb. 4.1: Restriktionsanalyse zu G1528C

Seite 56

Abb. 4.2: Befunde zu c.130G>T, 5úntranslated region

Seite 58

Abb. 4.3: Befunde zu c.1751-25T>G, Intron 15

Seite 61

Abb. 4.4: Befunde zu c.2111C>T, Exon 18 Seite 62

9.Tabellenverzeichnis

103

9. Tabellenverzeichnis Tab. 2.1: Empfehlung der Expertenkommission der Deutschen Gesellschaft

für Gynäkologie und Geburtshilfe zur Klassifizierung der hypertensiven Erkrankungen in der Schwangerschaft

Seite 2

Tab. 2.2: Definition pathologischer Parameter nach der Empfehlung der Expertenkommission der Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe

Seite 3

Tab. 2.3: Risikofaktoren für die Entwicklung einer Präeklampsie

Seite 4

Tab. 2.4: Auswahl verbreiteter Diagnosekriterien des HELLP-Syndroms

Seite 5

Tab. 2.5: Zusammenstellung schwerer maternaler Komplikationen des HELLP-Syndroms

Seite 6

Tab. 3.1: Primerdaten mit Annealingtemperatur (TA in °C) und Größe des aus der PCR resultierenden Fragmentes (FG in bp) für die SSCP-Analyse und Sequenzierungen

Seite 35

Tab. 3.2: Primerdaten und PCR-Bedingungen der Restriktionsanalysen

Seite 36

Tab. 3.3: Restriktionsbedingungen

Seite 55

Tab. 4.1: Häufigkeitsverteilungen der c.130G>T, 5úntranslated region

Seite 64

Tab. 4.2: Häufigkeitsverteilungen der c.1751-25T>G, Intron 15

Seite 64

Tab. 4.3: Häufigkeitsverteilungen der c.2111C>T, L661L

Seite 65

Tab. 4.4: Häufigkeitsverteilungen der Restriktionsanalyse zu G1528C

Seite 65

10. Danksagung

104

10. Danksagung

Herrn Prof. Dr. med. K. Zerres und Herrn Prof. Dr. med. W. Rath danke ich für die

Bereitstellung des Dissertationsthemas. Herrn Prof. Dr. med. K. Zerres gilt des Weiteren mein

Dank für die Möglichkeit, die Arbeit am Humangenetischen Institut der RWTH Aachen

durchzuführen, und für die mir entgegen gebrachte Geduld in der Phase der schriftlichen

Abfassung der Arbeit.

Herrn PD Dr. rer. nat. T. Eggermann danke ich ausdrücklich für die gute Betreuung während

der experimentellen Phase der Arbeit und für die vielen Hilfestellungen bei der Verfassung

der Dissertationsschrift.

Ein besonderer Dank gilt den Mitarbeitern des Labors des Instituts für Humangenetik der

RWTH Aachen, insbesondere Frau Diplom-Biologin Ch. Schmidt, für die ausgesprochen gute

und freundschaftliche Zusammenarbeit.

Frau Dr. med. P. Neumeier-Wagner danke ich für die inhaltliche Betreuung der Arbeit

während der experimentellen Phase.

Der Arbeitsgemeinschaft Gestose-Frauen e.V. danke ich für die maßgebliche Hilfe bei der

Zusammenstellung eines geeigneten Patientinnenkollektivs.

Wichtige Hinweise gaben mir die Mitarbeiter des Instituts für medizinische Statistik der

RWTH Aachen, auch Ihnen sei mein Dank ausgesprochen.

Herrn Diplom-Psychologen Carsten Terhorst, meinem Freund, danke ich für die

Hilfestellungen bei der statistischen Auswertung der Ergebnisse und für ein offenes Ohr.

Meiner Mutter danke ich ausdrücklich für die finanzielle und emotionale Unterstützung

während der gesamten Phase der Erstellung dieser Arbeit.

Dr. A. Strauss, St. Louis, USA, danke ich für die freundliche Überlassung der Sequenz der

genomischen DNA des Gens HADHA.

10. Danksagung

105

Die Arbeit wurde freundlicherweise im Rahmen des klinikuminternen Förderprogramms

START der RWTH Aachen gefördert.

Zu guter letzt sei allen, die ich aus Eile oder bei fehlender Umsicht vergessen haben sollte und

die mich bei der Erstellung der Dissertation unterstützt haben, mein aufrichtiger Dank

ausgesprochen.

11. Lebenslauf

106

11. Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name: Ines Ahillen Adresse: Küdinghovener Strasse 157

53225 Bonn Geburtsdatum, -ort: 16.02.1977, Haselünne Familienstand: ledig Staatsangehörigkeit: deutsch Konfession: römisch-katholisch

Schulische Ausbildung:

08/1983-07/1987: Paulusschule Haselünne, Grundschule 08/1987-07/1989: Orientierungsstufe Haselünne 08/1989-06/1996: Kreisgymnasium St. Ursula in Haselünne

Abschluss 1996: Abitur

Medizinische Ausbildung:

10/1996-12/2003: Studium der Humanmedizin an der RWTH Aachen

Ärztlichen Vorprüfung: 09/1998 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung: 09/1999 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung: 09/2002 Praktisches Jahr: 1. Tertial: Universitätsklinikum der RWTH Aachen, Innere Medizin 2. Tertial: Kantonsspital Winterthur, Schweiz, Chirurgie 3. Tertial: Luisenhospital Aachen, Anästhesie

10/2002-10/2003

Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung: 21.11.2003

02/2002-03/2002: Besondere Famulatur: Gynäkologie und Geburtshilfe, Klincini Center Ljubljana, Universitätsklinikum, Slowenien

Beruflicher Werdegang:

01.06.2004-31.12.2006: Abteilung für Innere Medizin des Evangelischen Krankenhauses Hamm; Ärztin im Praktikum bis 30.09.2004, dann Assistenzärztin • 01.06.2004-31.03.2006: Abteilung für Hämatologie und

Onkologie, Leitung: Professor Dr. med. L. Balleisen • 01.04.2006-31.12.2006: Rotation in die Abteilung für

Kardiologie, Leitung: initial Dr. U. Mösseler, ab 09/2006 Professor Dr. med. K. Pethig

Ab 01.01.2007 Abteilung für Innere Medizin des Malteser Krankenhauses Bonn-Hardtberg; Chefärzte: Professor Dr.med. M.Göke (Allg. Innere Medizin/ Gastroenterologie), Dr.med. W.Schulte (Pneumologie)

11. Lebenslauf

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Documents

Molekulargenetische Untersuchungen im Kandidatengen HADHA ...darwin.bth.rwth-aachen.de/opus3/volltexte/2009/2582/pdf/Ahillen_Ines.pdf · Das HELLP-Syndrom als schwere Form der Präeklampsie