Folie 1

mRNA-Expressionsprofilierung und Normalisierung: QPCR-Erfahrungen und Ergebnisse einer retrospektiven Studie an 106 primren Prostatakarzinom-Gewebepaaren Meye A 1, Schmidt U 1, Fssel S 1, Koch R 2, Baretton G 3, Lohse A 1, Tomasetti S 1, Frhner 1 M, Wirth MP 1 1 Klinik fr Urologie, 2 Institut fr Medizinische Informatik und Biometrie, 3 Institut fr Pathologie, TU Dresden

Folie 2

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 2 / 20 Agenda Heterogenitt des PCa berblick zu neuen molekularen Marker Design einer SOP-QPCR-Studie erste Resultate zu 9 PCa-assoziierten Genen Arbeitshypothese: Vorhersagbarkeit organbegrenzter PCa anhand von gemeinsam berexprimierten mRNA-Markern Transferierbarkeit der Studien auf Biopsien

Folie 3

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 3 / 20 Relatives berleben (5/10 Jahre) Nach Diagnosezeitraum PCa-Mortalitt in den USA (Land mit hohem PSA-Screeninganteil) LZ in Abhngigkeit vom Stadium

Folie 4

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 4 / 20 Prognostizierte Verbesserung des berlebens im Falle einer Frherkennung (SEER-Daten 1990-99) KarzinomLokalisierte Tumoren bei Detektion (%) 5-JR (%) 5-JR, wenn alle Flle bei Detektion lokalisierte Tumoren wren (%) Kolon-Ca416490 Lungen-Ca191649 Brust-Ca658797 PCa6590100 Suche nach neuen, besseren bzw. PSA-ergnzenden Markern zum PCa-Screening

Folie 5

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 5 / 20 Marker-basiertes PCa-Progressionsmodell [Gonzalgo & Isaacs 2003] EZH2 (E) >100 Genkandidaten fr das PCa postuliert (

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 7 / 20 Patienten & Gewebeproben Gewebepaare von 106 RPEs (Tu >60%, Tf

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 8 / 20 QPCR-Logistik (Ablaufplan) 30-60 Gefrierschnitte (10m) in Lysepuffer Spin Tissue RNA Mini Kit (Invitek, Berlin) 2X RT parallel (je 0,5 g; Superscript II, Invitrogen) cDNA poolen & LC-PCR mit 1:5 Verdnnung (20l Aliquots, bei 4C, nicht wegfrieren!) in 14/106 Fllen RNA-Mengen 30% Abw. 3. Messung) Qualittskriterien: DNA-Standards (10E1-10E7), +/- Kontr.

Folie 9

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 9 / 20 PCR-Bearbeitungsstrategie 11 Gewebepaare pro LC-Lauf gemeinsam extrahierte und umgeschriebene Probenrunden Sammlung von kompletten Wiederholungs- lufen (divergierende Doppelmessung) ohne Wiederholungen 336 PCRs/Gen keine Normalverteilung der relativen Expressionswerte Logarithmierung der Daten

Folie 10

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 10 / 20 Statistische Verfahren receiver-operating characteristic (ROC) Kurven area under curve (AUC) als Ma fr die Rate korrekter Diagnosen Analyse & diagnostische Aussagekraft der Einzelvariablen (individuelle Transkripte) diagnostische Regel nach Multivariatanalyse (via AUC)

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Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 11 / 20 Resultat 1: QPCR-Standardisierung Anstieg Standardkalibrierung 0.984 (GAPDH) - 1.149 (TBP) Korrelationskoeffizient >0,999 % ( 23 PCR-Lufe/Gen) mediane Standardabweichungen 8-14 %

Folie 12

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 12 / 20 alle QPCR-Assays hoch reproduzierbar

Folie 13

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 13 / 20 p=0.038p=0.036p=0.00003p=0.531 GAPDH HPRT PBGD TBP Tf Tu Tf Tu Tf Tu Tf Tu Verwendung von TBP fr relative Normierung der Expressionsdaten (& RNA-Mengen) Resultat 2: Referenzgen-Auswahl

Folie 14

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 14 / 20 Resultat 3A: relative Expressionswerte Tu & Tf EZH2 mit geringstem & PSA mit hchstem Niveau (zmol Gen/ zmol TBP) variable Genexpression (2-5 Log-Stufen/Gen) relativ geringe mRNA-Levels in allen PCa-Zellinien

Folie 15

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 15 / 20 Resultat 3B: log relative Expression Tu & Tf

Folie 16

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 16 / 20 Hchste berexpressionen fr: DD3 (>40-fach im Median) & TrpM8 (>4-fach im Median) Resultat 4: Tu:Tf Ratios

Folie 17

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 17 / 20 p=0.002 p=0.003 p=0.009 Resultat 5A: Subgruppenanalyse OC vs. NOC (vs. Tf) Verwendbarkeit einzelner Marker zur Vorhersage organbegrenzter PCa???

Folie 18

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 18 / 20 Resultat 5B: Subgruppenanalyse lGS vs. hGS (vs. Tf) p=0.102 p=0.099

Folie 19

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 19 / 20 Resultat 5C: Subgruppenanalyse lGS vs. hGS (vs. Tf) p=0.150 p=0.113

Folie 20

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 20 / 20

Folie 21

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 21 / 20 Diagnostische Regel eines Logit-Modells zur PCa-Vorhersage Beispielrechnung fr Patient 1: p=Wahrscheinlichkeit fr ein PCa leitet sich aus folgender Transformation ab: p = exp(logit)/[1+exp(logit)] = exp(2.298)/[1+exp(2.298)] = 0.909 = 99,9% Tf-Expression: Prostein/TBP=2,01, EZH2/TBP=1,17, TRPM8/TBP=1,86, DD3/PCA3/TBP=0,396 p fr Tu =6,9%, d.h. 93,1% (=100%-6,9%) Wahrscheinlichkeit eines TF

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Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 22 / 20 Einzelmarker (DD3) vs. Kombination

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Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 23 / 20 Weitere Schritte Gewebepaare Erweiterung des Patientenkollektivs auf 150 Patienten (cDNA-Bank!) Messung von weiteren PCa-assoziierten Markern, ggf. Integration in das Modell Definition eines relevanten Panels (max. 5 Marker) Vgl. der mRNA-Expressionsmuster mit CGH-Profilen zu definierender Subgruppen (Kooperation Homburg) prospektive Reevaluierung geeigneter Marker (Biopsiestudie)

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Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 24 / 20 Reevaluierung an Biopsiematerial Simulation diagnostischer Stanzen am RPE-Prparat Gefrierkonservierung der Biopsien Schnitte systematisch fr H&E und RNA-Extraktion Verwendung der Biopsien fr QPCR bei primrer Nachweisbarkeit von >50 Moleklen TBP absolut Markerpanel: PSA, Trp-M8, Prostein, EZH2, DD3 cDNA-Menge aus 1/8 bis 1/16 Biopsieteil ausreichend

Folie 25

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 25 / 20 QPCR an Biopsien

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Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 26 / 20 6-Markerbestimmung aus Gesamtbiopsien

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Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 27 / 20 Hypothetisches Modell fr differentiell exprimierte PCa-Transkriptmarker

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Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 28 / 20 Vision - additives molekulares Staging Anwendungsgebiete PCa: Stanzbiopsie, LN-Gewebe Serum-/Blut-, Urinprobe Disseminierte Tumorzellen, Mikrometastasen Identifizierung von Patienten mit niedrigem Progressionsrisiko (watchful waiting) Target-spezifische(re) Therapieoptionen (auf Grundlage einer molekularen Charakterisierung des Individualtumors) 15-20mm, 0,8 mm Routinepathologie & & molekulare Diagnostik

Folie 29

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 29 / 20 Kenntnisstand molekulargenetische PCa-Marker tumorbiologische Heterogenitt basiert auch auf einer extremen genetischen Diversitt dieser Ca-Entitt (kein PCa-Gen) hoffnungsvolle Marker (Prostata- oder/und PCa-spezifisch) mit diagn. & progn. Potential identifiziert (post-PSA-Zeit) einige gleichzeitig mgliche Therapietargets (z.B. Immuntherapie) Testung molekular-basierter, modifizierbarer Therapiestrategien extensive Evaluierung der klinischen Test-Wertigkeiten notwendig klinische Anwendung additiver molekularer Markermuster fr frhzeitige Diagnosemglichkeit (Screening-Marker) individuellere Prognoseabschtzung & Therapieentscheidung Abschtzung eines patientenspezifischen Therapieansprechens

Folie 30

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 30 / 20 Marker 1: DD3 PCA3 (uPM3 TM )-Transkript differential display code 3, 9p21-22 [Bussemaker et al. 1999] Gen mit der bisher hchsten bekannten PCa-Spezifitt (RT-PCR) identifiziert als 10-100-fach berexprimiert (Northern) in 53/56 PCa- Geweben (0/56 korrespondierenden Tf-Prostategeweben) nichtkodierende mRNA der Prostata-Epithelzellen im Median 66-fache E (QPCR, Detektierbarkeit bei 40 Mitarbeiter an Assay-Entwicklung & Validierung bernahme durch 2 Diagnostikfirmen (Genprobe, Bostwick Laboratories)

Folie 31

Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primren PCa-Gewebepaaren Folie 31 / 20 Marker 5: EZH2 (E im HRPC) polycomb group protein enhancer of zeste homolog 2 transkriptioneller Repressor (zellulre Identitt) spezifisch in HRPC berexprimiert (mRNA & Protein) insbesondere in metastatische PCa erhhte Expression PCa mit einer EZH2-E ~ direkt mit geringer LZ (nicht mit GS oder Tumorstadium) unabhngige prognostische Relevanz E-Detektion im Gewebe = negativer Prognoseprdiktor experimentelle EZH2-Blockade (siRNA) in PCa-Zellinien: Viabilitts- & Wachstum (aber keine Apoptose)