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Einführung Ribozyme I Ribozyme II Ribozyme III, In vitro Evolution in vitro Evolution neuer Ribozyme SELEX Display-Techniken: In vitro Evolution von Proteinen RNA-basierte Regulation: Riboswitches RNA Interferenz small noncoding RNA Influenza ein RNA-Virus RNA Biochemie 11/1 MSc-Modul RNA-Biochemie

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• Einführung

• Ribozyme I

• Ribozyme II

• Ribozyme III, In vitro Evolution

• in vitro Evolution neuer Ribozyme

• SELEX

• Display-Techniken:

In vitro Evolution von Proteinen

• RNA-basierte Regulation: Riboswitches

• RNA Interferenz

• small noncoding RNA

• Influenza – ein RNA-Virus

RNA Biochemie 11/1

MSc-Modul RNA-Biochemie

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RNA Biochemie 11/2

Influenza

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RNA Biochemie 11/3

Influenza

„I had a little bird, its name was Enza;

I opened up the window and IN-FLU-ENZA!“

Kindervers von 1918 Grippe ≠ grippaler Infekt, Erkältung

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RNA Biochemie 11/4

Das Influenza-Virus

DAS Virus

DER Phage

DER Virus

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RNA Biochemie 11/5

Das Influenza-Virus

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segmentiertes Negativstrang-RNA Virus

• Membran-umhüllt

• RNA-Genom: 13,6 kb

einzelsträngig

negativsträngig

segmentiert

• 10 Strukturproteine

• RNA-abhängige RNA-Polymerase

• Replikation erfolgt im Kern

RNA Biochemie 11/6

Das Influenza-Virus

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RNA Biochemie 11/7

Das Influenza-Virus

Aufbau:

Nucleoprotein NP

Neuraminidase NA

Matrix-Protein M1

Nicht-Struktur-Protein NS2

Hämagglutinin HA

Nicht-Struktur-Protein NS1

Integrales Membran-Protein M2

RNA

PB2

PA

PB1

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RNA Biochemie 11/8

Das Influenza-Virus

Proteine:

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RNA Biochemie 11/9

Das Influenza-Virus

3 Typen:

A, B, C (basierend auf NP und M1)

Oberflächen-Antigene:

Hämagglutinin (H)

Neuraminidase (N)

Nomenklatur: HxNy

viele Influenza A Subtypen:

H3N2 (human)

H7N7 (Vögel, Niederlande, 2003)

H5N2 (Vögel)

H9N2 (human,

Hong Kong, China, 2003)

H5N1 (Vögel)

H1N1 (Schweine)

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Infektionszyklus:

• Attachment mittels

Hämagglutinin

• Endocytose

• Freisetzung aus

Vesikel (Endosom)

RNA Biochemie 11/10

Das Influenza-Virus

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Hämagglutinin: Andocken an Wirtszelle

Sialinsäure-

Bindungstaschen

RNA Biochemie 11/11

Das Influenza-Virus

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Hämagglutinin:

Membranfusion zur Freisetzung des RNA-Genoms

RNA Biochemie 11/12

Das Influenza-Virus

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Hämagglutinin:

pH 5.0(Endosom;

virales M2 Proteinöffnet sich alsIonenkanal)

RNA Biochemie 11/13

Das Influenza-Virus

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Hämagglutinin:

RNA Biochemie 11/14

Das Influenza-Virus

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Fusion und Uncoating:

M2 wird als Ionenkanal geöffnet:

Einstrom vom Protonen

Freisetzen der vRNPs

RNA Biochemie 11/15

Das Influenza-Virus

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M2-Kanal

RNA Biochemie 11/16

M2-Inhibitoren

Amantadin (Symmetrel) Rimantadin (Flumadin)

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Infektionszyklus:

RNA Biochemie 11/17

Das Influenza-Virus

RNPs mit Kernlokalisationssignal

PB1: Polymerase

• Kernimport der vRNPs

• Transkription

• Export der mRNAs

RNPs mit Kernlokalisationssignal

PB1: Polymerase

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Translation:

RNA Biochemie 11/18

Das Influenza-Virus

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RNA Biochemie 11/19

Das Influenza-Virus

Transkription:

Cap Snatching

• Stabilisierung

• mRNA Export

• Translation

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Transkription: Cap Snatching

• virale mRNAs werden translatierbar

• Wirts-mRNAs sind nicht mehr translatierbar

Umschalten der Translation auf Virenproduktion!

RNA Biochemie 11/20

Das Influenza-Virus

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Infektionszyklus:

RNA Biochemie 11/21

Das Influenza-Virus

• Kernimport der viralen Proteine

• Replikation der vRNAs

• Nucleocapsidbildung

• Export der Nucleocapside

• Zusammenbau der Partikel

• Knospung

• Freisetzung

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Neuraminidase:

Tetramer

Monomer mit

gebundener Sialin-Säure

RNA Biochemie 11/22

Das Influenza-Virus

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Neuraminidase:

RNA Biochemie 11/23

Das Influenza-Virus

membranständiges

Glycoprotein

Kern-Saccharid

(NAG, Gal)

NAG

Gal

Sialinsäure

Neuraminidase

Zellmembran

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Neuraminidase:

RNA Biochemie 11/24

Das Influenza-Virus

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RNA Biochemie 11/25

Neuraminidase-Hemmer

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aber:

Punktmutationen im

Neuraminidase-Gen

vermitteln Resistenz!

Sialinsäure

Zanamavir (Relenza)

Oseltamivir (Tamiflu)

Inhibitoren blockieren die Freisetzung

von Viruspartikeln

RNA Biochemie 11/26

Neuraminidase-Hemmer

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RNA Biochemie 11/27

2 Schlüsselproteine

Hämagglutinin

• bindet an Sialinsäure der Wirtszelle zum Virus-Attachment

• initiiert Membranfusion

Neuraminidase

• spaltet Sialinsäure ab und ermöglicht damit Virus Release

Nach den Subtypen dieser Proteine erfolgt die Nomenklatur!

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RNA Biochemie 11/28

Hämagglutinin als Therapie-Target

Influenza B:

Palese, 2017

Attachment

wird verhindert

monoklonaler

chimärer

Antikörper

aus der Maus

humanes

Immunsystem

erkennt Virus

Fc-Teil

aus humanem IgG

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H1 N1

H2 N2

H3 N3

H4 N4

H5 N5

H6 N6

H7 N7

H8 N8

H9 N9

H10

H11

H12

H13

H14

H15

Hämagglutinin Subtyp Neuraminidase Subtyp

RNA Biochemie 11/29

Natürliche Wirtstiere von Influenza-Viren

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RNA Biochemie 11/30

Die Grippe

• Weltweit jährlich 250.000 – 500.000 Tote

• USA:

35.000 Tote

>200.000 Klinikeinlieferungen

37,5 Mrd. US-$ Kosten (Behandlungskosten,

wirtschaftliche Ausfälle)

• BRD:

Grippetote > Verkehrstote

• Weltweite Bedrohung: Pandemie

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RNA Biochemie 11/31

Influenza-Pandemien

1918 1957 1968 1977 1997

1998/9

2003

H1

H1

H3H2

H7H5H5

H9

Spanische

Grippe

H1N1

Asien-

Grippe

H2N2

Russische

Grippe

Vogel-Grippe

Hong-

Kong-

Grippe

H3N2

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RNA Biochemie 11/32

Influenza-Pandemien

1918 Spanische Grippe (H1N1): 40-80 Mio. Tote

1957 Asien-Grippe (H2N2): 1 Mio. Tote

1968 Hong-Kong-Grippe (H3N2): 0,8 Mio. Tote

Kürzestes Intervall: 11 Jahre

Längstes Intervall: 39 Jahre

gegenwärtiges Intervall: 51 Jahre

nächste Pandemie:

weltweite Bevölkerung könnte

um bis zu 30% (~2,3 Mrd.)

reduziert werden!

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Erste Informationen 1918 aus Spanien: 8 Mio. infiziert

3 Wellen:

Frühjahr 1918 (nur gering erhöhte Letalität)

Herbst 1918 (hohe Letalität)

Winter 1919 (hohe Letalität)

Amerikanische Ärzte warnten:„Finden Sie jeden verfügbaren Tischler und Schreiner

und lassen Sie sie Särge herstellen. Dann nehmen Sie

Straßenarbeiter und lassen Sie sie Gräber ausheben.

Nur dann haben Sie eine Chance, dass die Zahl der

Leichen nicht schneller steigt als Sie sie beerdigen

können.“

RNA Biochemie 11/33

Die Spanische Grippe (1918/19)

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National Museum of Health and Medicine (USA):

RNA Biochemie 11/34

Die Spanische Grippe (1918/19)

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RNA Biochemie 11/35

Die Spanische Grippe (1918/19)

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RNA Biochemie 11/36

Die Spanische Grippe (1918/19)

Spezifische Todesrate: (Anzahl der Todesfälle/Gesamtbevölkerung)x100.000

„Cytokine Storm“

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RNA Biochemie 11/37

Die Spanische Grippe (1918/19)

National Museum of Health and Medicine (USA):

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RNA Biochemie 11/38

Die Spanische Grippe (1918/19)

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RNA Biochemie 11/39

Die Spanische Grippe (1918/19)

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RNA Biochemie 11/40

Die Asien-Grippe (1957/58)

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Mitglieder der Roten Garde

in China tragen Mundschutz,

um einer Influenza-Infektion

vorzubeugen.

0,8 Mio. Tote weltweit

30.000 Tote in der BRD

RNA Biochemie 11/41

Die Hong-Kong-Grippe 1968

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RNA Biochemie 11/42

Pandemien

Hämagglutinin, Neuraminidase

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RNA Biochemie 11/43

Definitionen

• Epidemie: lokale Häufung von Erkrankungen

• Pandemie: weltweite Erkrankungen

• Antigene Drift

Veränderungen in Proteinen durch Mutation und Selektion

= Grund für jährliche Aktualisierung des Impfstoffes

• Antigener Shift

Veränderungen in Proteinen durch genetische

Neukombination von verschiedenen RNA Molekülen

Folge: neue Viren, die nicht durch jährlichen Impfstoff

abgedeckt sind.

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RNA Biochemie 11/44

Antigene Drift

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RNA Biochemie 11/45

Antigene Drift

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RNA Biochemie 11/46

Antigener Shift

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RNA Biochemie 11/47

Antigene Drift - Antigener Shift

Antigene Drift:

Antigener Shift:

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RNA Biochemie 11/48

Antigener Shift durch RNA Reassortment

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RNA Biochemie 11/49

Pandemie durch H5N1?

H5N1

z.B.H3N2

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RNA Biochemie 11/50

Pandemie durch H5N1?

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Nature 2005:

„They have constructed a

virus that is perhaps the

most effective bioweapon

known.“

RNA Biochemie 11/51

Spanische Grippe: Ein Vogelvirus!

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RNA Biochemie 11/52

RNA Reassortment

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RNA Biochemie 11/53

Influenza-Pandemien

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RNA Biochemie 11/54

Influenza-Pandemien

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• Einführung

• Ribozyme I

• Ribozyme II

• Ribozyme III, In vitro Evolution

• in vitro Evolution neuer Ribozyme

• SELEX

• Display-Techniken:

In vitro Evolution von Proteinen

• RNA-basierte Regulation: Riboswitches

• RNA Interferenz

• small noncoding RNA

• Influenza – ein RNA-Virus

RNA Biochemie 11/55

MSc-Modul RNA-Biochemie