462 Bericht: Spezielle analytische Methoden.

Na2CO3-LSsung yon Chloriden befreit, mit Wasser ausgewaschen und feueht auf- bewahrt. Der alkalische Puffer besteht am besten aus 200 g wasserfreiem Na2CO 3 nnd 57 g l~atriumeitrat 2H20 in 1 1 Wasser, und mu] in einem Poly/~thylenbehilter aufbewahrt werden; vor Gebraueh sind Trfibungen dureh Filtrieren zu entfernen. - - Zur Bestimmung nimmt man 1 ml heparinisiertes Blut und 10 ml 0,9%ige lqaC1- LSsung, zentrifugiert den l~iedersehlag ab, saugt das ~berstehende soweit wie mSglich ab und fiillt mit Wasser auf 1,0 ml auf. Dann setzt man 0,5 ml Glutathion, ungefihr 25 mg Natriumdithionit und 5 ml Wasser zu und f/~llt das EiweiB durch 0 ,5ml 35%ige Trichloressigsiure. Das klare Zentrffugat wird mit 15ml ge- waschenem Chloroform gesehfittelt, die Chloroforml0hase und einige feste Bestand- ~eile werden abgetrennt, die w/~Brige Schicht mit ungefihr 4 ml (etwa 2,4 g) des feuchten I-I~rzbreies vermiseht und 10 rain gesehiittelt. Man filtriert ab, entnimmt 3 ml Filtrat, gibt 0,5 ml alkalisehen Puffer und 0,5 ml diazotierte Sulfanils/~ure zu, setzt 45 see in ein Eisbad, fiigt dann 1 ml 19 n lqatronlauge schnell zu und miBt bei 540 m# gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert. Die Eichkurve wird mit reinen ErgothioneinlSsungen angelegt. D~ nur 8/7 des ursprfingliehen Blut- volumens verwendet werden, werden die Ergebnisse mit 7/3 multipliziert. Zusatz- versuehe bei Mensehen- und Tierblut in Mengen yon 1 ,7 -96 #g Ergothionein ergaben sehr gute Ausbeuten. Die beschriebenen Werte deeken sich fast mit denen yon HU~TER. Bei normalen l~Iensehen werden Werte zwisehen 1,7--4,2 #g gefunden. Ein Vorteil der 1Kethode soll die grSl]ere Empfindlichkeit sein. K. HI~S~EI~G.

N-Methyl-2-Pyridon-5-earbonamid (MPC) und n-Methylnieotinamid (M~A) sind die wesentlichsten Stoffweohselprodukte der Nieotins/~ure. Nieotinamid kommt nur in Spuren vor und andero Abb~uprodukte normalerweise gar nicht. Von W. I. M. H o L ~ i ~ 1 wird ein Verfahren entwickelt, um MPC und MI~A zu bestimmen, welches auf dem HoF~iie~sehen Abbau yon Siureamiden durch Hypobromit beruht. Zur quantitativen Auswertung ist es notwendig, einen lJ-bersehuB yon Bromlauge zu "r durch Zusatz yon Phenol. Die Broml6sung besteht aus 12,5 g I~atrium- bromid und 4 ml Brom in 100 ml W~sser. Das Pyridonreagens besteht aus 4 ml 2,5 n l~atronlauge, etwa 45 ml Wasser und 2 ml BromlSsung ~ufgeffillt mit Wasser auf 50 ml. Zum M_NA-Reagens verwendet man 6 ml 2,5 n Natronlauge. Die Phenol- 15sung ist 0,45% ig. Zur Bestimmung verwendet man LSsungen yon PH 7--9 mit 0--50 #g n-Nicotin~mid, iKNA odor MPC, verdiinnt auf 4 ml, gibt unter Lichtaus- schlul~ 1 ml HypobromitlSsung und 4 rain spi ter 1 ml PhenollSsung zu, versehlieBt mit einem Stopfen, der durch einen SchraubverschluB festgehalten wird und er- hitzt 10 rain in einem koehenden Wasserbad. Nach dem Abkfihlen setzt man 0,5 nil 2,4 n S~lzs/~ure und 0,5 in] 0,1%ige NaNO~-LSsung zu, nach weiteren 4 rain 0 ,5ml 0,5%ige Ammoniumsulf~minatl6sung und naeh weiteren 4ra in 0 ,5ml 0,1%ige N-(1-Naphthyl)-/~thylendiamindihydroehloridl6sung. Die Proben wer- den mit aufgesetztem Stopfen gesehfittelt und die Extinktion gegen eine Blind- probe bei 500 und 590 m/~ gemessen. Der Azofarbstoff ffir Nicotinamid und MNA absorbiert bei 500 m#, f/it MPC bei 590 re,u, ohne da~] eine gegenseitige St6rung stattfindet. - - Fiir die Untersuehung yon Urin muB man das iKNA abtrennen. Dies gelingt mit Deealso bei pg 7, welches MNA quanti tat iv zurfickhilt, wihrend lqico- tinamid und MPC durehliuft. MI~A wird mit 25% iger KC1-LSsung eluiert und wie oben besehrieben bestimmt. Die Ausbeuten betragen 88--96%. Besser ist dieVerwen- dung yon LLOYDS Reagens oder die Fallung mit Bleihydroxydbei PH 9,2. Mank~nn aueh eine unspezifisehe Farbe dadurch eolorimetrisch ausschalten, dab man den I{arn zuerst mit Phenol und dann mit dem auf d~s doppelte verd/innten I-Iypobromit- reagens versetzt. Zur schnellen Bestimmung yon MPC wird empfohlen, aus einer 24st~ndigen t{arnmenge den Tell, der der Urinsekretion entspricht, mit 2 ml 1 m

i Bioohemic. J. 56, 513--520 (1954). Univ. Cambridge (England).

4. Auf Physiologie und Pathologie beziigliche. 463

Bleinitratl6sung und soviel 2,5 n Natronlauge zu fallen, bis der p~-Wert 9,2 ist (Indicatorpapier, Vergleieh 0,1 n BoraxlSsung). Es wird auf 10 ml aufgeffillt, zen- trifugiert, filtriert und 2 mal 1 ml Filtrat entnommen, wobei der eine Wert als Leer- wert verwendet wird. Die Bestimmung erfolgt wie oben, die Messung bei 590 m/~. - - Allgemein anwendbar ist folgendes Verfahren. Der in 2 rain ausgeschiedene H a m wird mit 0,5 ml 3~ Essigs/~ure anges/~uer~, auf 10 ml aufgeffillt und 0,5 ml 2 n Salzs~ure und 0,2 g LLOYDS Reagens zugegeben. Man sehiittelt 10 rain, zentri- fugiert, wi~scht den Nriederschlag mit 5 ml 0,1 n Salzs~ure, extrahiert mit 4 ml 0,2 n 2~'atronlauge, zentrifugiert wieder, entnimmt 3 ml der fiberstehenden Fliissigkeit und f~llt diese mit 2 ml 1 m Bleinitratl6sung, indem mit 2,5 n Natron- lauge auf PH 9,2 eingestellt wird. Nach dem Zentrifugieren werden 2 Proben zu je 3 ml analysiert. Zur Bestimmung yon MNA wird mit 10 ml Eisessig konserviert, man verwendet eine 4 rain Exkretionsperiode und setzt gleiehzeitig einen Wert an, dem 50---100 pg M_NA zngesetzt werden. Zu beiden G1/isern gibt man 15 ml Phos- phatpuffer p~ 7, Wasser bis auf 30 ml End filtriert fiber eine S/iule mit 2 g aktivier- tern Deealso. Man w/~seht 3 mal mit 5 ml Wasser aus, eluiert mit heiBer 25%iger KC1-LSsung, neutralisiert mit Natronlauge und stellt die Farbreaktion wie oben besehrieben an. Die Stoffweehselprodukte k6nnen aueh ehromatographiseh iden- tifiziert werden. Hierzu wird der I tarn im Vakuum auf das 10faehe konzentriert, davon 0,01 ml auf Papier aufgetragen und mit 80% igem Propano] entwiekelt. Wenn alles L6sungsmittel verfliiehtigt ist, wird mit ItypobromitlSsung besprfiht, ansehlieBend bei 100~ getrocknet und dann mit einer LSsung, die aus Nitrit, Sulfaminat und N-Naphthylendiamin besteht, behandelt. Unter diesen Bedingungen finder man ftir MNA einen I~-Wert yon 0,24, ffir MPC yon 0,6 und ffir Nicotinamid yon 0,72. Noeh 1 # g i s t naehweisbar. Naeh Verffitterung yon Nicotinamid steigen MPC und MNA im H a m sprungartig innerhalb yon 2 Tagen an, w/~hrend naeh Ver- f/itterung yon Chinolin keine Mehrausscheidung beobachtet wird. K. HI~SB~.RG.

Die eolorimetrlsche l lest immung yon UronsSuren, besonders yon Glueurons/~ure, mit Naphthoresorein (NR) wird yon A. G~EgE~ und C. NEUBERG 1 einer kritisehen Betraehtung unterzogen. Bei Anwendung des Verfahrens yon C. NEUBERG und M. t(OBEL 2, bei welehem Salzs/~ure dureh Sehwefels/~ure ersetzt wird, f~llt das Pigment ohne Verharzung aus und ist dann in organisehen LSsungsmitteln glatt 15slieh. Die Farbe ist rotviolett in alkoholfreiem )~ther, Athylaeetat, Benzol, Toluol und Xyloh Auf Zusatz yon Alkoholen erh/~lt man eine tiefblaue F/~rbung; dieselbe Wirkung haben aueh Trichlor/~thanol, Triehlorbutanol, Borneol, Menthol, Cholesterin, Phenol und substituierte Phenole und Cateehine, wenn man sie ent- weder lest oder gelSst in Benzol oder Ather zu der rotvioletten LSsung zugibt. Der Farbstoff ist der Konstitution nach ein Oxydinaphthylfnrfurylmethan. Bei der quantitativen Auswertung ist zu beaehten, dab der Farbstoff sehr leieht adsorbiert werden kann, dab bei unvollst~ndiger Kondensation harz/ihnliehe Produkte ent- stehen und dab bei Mengen yon mehr als 0,88 mg Urons/~ure/ml der ausgef/~llte Farbstoff in Benzol nur noeh sehwer 15slich ist. Polyoxys/~uren geben entgegen anderen Mitteilungen keine Farbreaktion. Dies wurde besonders mit reiner Sehleim- s~ure naehgeprfift. Aueh Arabinose gibt die Farbreaktion nieht. K. HINSBERG.

Zur eholesterinbestimmung im Blutsermn empfehlen ]~.IV~ERTENS und C.A~BE~s a eine Modifikation der Bestimmung naeh R. S C ~ 5 ~ I ~ E R und W. M. S r E ~ u 4.

1 Anal. ehim. Acta (Amsterdam) 8, 422--425 (1953). New York Med. Coll. und ~adison Found. f. Biochem. t~es., New York.

Bioehem. Z. 243, 435 (193i) Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 2911, 24~-253 (1953). Marienkrankenhaus,

Hamburg. J. bio]. Chemistry 106, 745 (1934).