Nachweis von humanpathogenen Mikroorganismen in ... · Inhaltsverzeichnis 3 von 119 Seiten Forschungsvorhaben “Nachweis von humanpathogenen Mikroorganismen in Lebensmitteln mittels

Forschungsprogramm „Ernährung / Nahrungsmittelsiche rheit“ der Landesstiftung Baden-Württemberg gGmbH

Nachweis von humanpathogenen

Mikroorganismen in Lebensmitteln mittels

moderner molekularbiologischer

Untersuchungsverfahren

Abschlussbericht

Projekt: P-LS-E / MOP A7-7 Zeitraum: 15.01.2003 - 15.01.2005 Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg Bissierstrasse 5 79114 Freiburg Projektleiter: Dr. Klaus Pietsch Durchführende: Annette Wieland

Inhaltsverzeichnis 2 von 119 Seiten

Forschungsvorhaben “Nachweis von humanpathogenen Mikroorganismen in Lebensmitteln mittels moderner molekularbiologischer Untersuchungsverfahren

Abschlussbericht

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ..................................................................................................................................... 6

1.1 Lebensmittelinfektionen und molekularbiologischer Erregernachweis ................................... 6

1.2 Pathogene Keime in Lebensmitteln....................................................................................... 7

1.2.1 Salmonella spp. ............................................................................................................. 7

1.2.2 Campylobacter coli und Campylobacter jejuni................................................................ 7

1.2.3 Enterohämorrhagische E.coli (EHEC) ............................................................................ 8

1.2.4 Listeria monocytogenes ................................................................................................. 8

1.2.5 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis.............................................................. 9

1.3 Ziel des Projekts ................................................................................................................. 10

2 Material und Methoden .............................................................................................................. 11

2.1 Kultivierung von Bakterienstämmen und Nährmedien......................................................... 12

2.1.1 Anzucht von Referenzstämmen ................................................................................... 12

2.1.2 Nährmedien ................................................................................................................. 12

2.2 Methoden zum kulturellen Nachweis von Bakterien ............................................................ 12

2.3 Künstliche Kontamination (Spiking, Dotierung) von Lebensmitteln mit Bakterien ................ 13

2.3.1 Dotierung mit Salmonella Typhimurium........................................................................ 13

2.3.2 Dotierung mit Campylobacter jejuni.............................................................................. 13

2.4 Geräte für die DNA-Analytik ................................................................................................ 14

2.5 Materialien für die DNA-Analytik ......................................................................................... 14

2.5.1 Qualität und Handhabung ............................................................................................ 14

2.6 Reagenzien für die DNA-Analytik ........................................................................................ 15

2.6.1 Wasser ........................................................................................................................ 15

2.6.2 Nucleotid-Mix ............................................................................................................... 15

2.6.3 10 x PCR-Puffer und Polymerasen .............................................................................. 15

2.6.4 Primer und Sonden (Oligonukleotide) .......................................................................... 15

2.6.5 Enzyme........................................................................................................................ 15

2.7 Puffer und Lösungen für die DNA-Analytik .......................................................................... 16

2.7.1 Chemikalien ................................................................................................................. 16

2.7.2 Puffer ........................................................................................................................... 16

2.7.3 Handhabung der Lösungen.......................................................................................... 18

2.8 Agarosegelelektrophorese zur Auftrennung von Nukleinsäuren .......................................... 19

2.8.1 Sicherheitshinweis ....................................................................................................... 19

2.8.2 Reagenzien, Geräte und Hilfsmittel.............................................................................. 19

2.8.3 Durchführung ............................................................................................................... 19

2.8.4 Vorbereitung der Gelkammer....................................................................................... 20



Abschlussbericht

2.8.5 Probenauftrag .............................................................................................................. 20

2.8.6 Elektrophorese............................................................................................................. 20

2.8.7 Fotodokumentation ...................................................................................................... 21

2.9 Methoden zur DNA-Extraktion............................................................................................. 22

2.9.1 CTAB-Methode ............................................................................................................ 22

2.9.2 Qiagen-DNeasy-Kit zur DNA-Extraktion....................................................................... 24

2.9.3 Wizard-Kit (Promega „Wizard DNA Clean-up System“) .............................................. 26

2.9.4 High Pure foodproof II Kit (Roche Diagnostics) ............................................................ 28

2.9.5 DNA-Präparation durch Aufkochen .............................................................................. 28

2.10 Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration ..................................................... 29

2.10.1 DNA-Messung ............................................................................................................. 29

2.11 Polymerasekettenreaktion (PCR) .................................................................................... 30

2.11.1 Kriterien und Vorgehensweise für Primer- und Sonden-Design.................................... 30

2.11.2 Herstellung des Mastermixes ....................................................................................... 31

2.12 PCR zum Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen von Salmonella spp.,

Campylobacter coli und jejuni, Listeria monocytogenes, Mycobacterium avium ssp.

paratuberculosis und enterohämorrhagischen E.coli........................................................ 33

2.12.1 Nachweis von Salmonella spp. mit PCR ...................................................................... 33

2.12.2 Nachweis von Campylobacter coli und Campylobacter jejuni mit PCR......................... 35

2.12.3 Nachweis von Listeria monocytogenes mit PCR .......................................................... 37

2.12.4 Nachweis von enterohämorrhagischen E. coli (EHEC) mit PCR .................................. 39

2.12.5 Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) mit nested-PCR

und Agarosegeldetektion ............................................................................................. 39

2.13 Inhibitionskontrollen in der PCR....................................................................................... 43

2.14 Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen von Salmonella spp., Campylobacter coli

und jejuni, Listeria monocytogenes und enterohämorrhagischer E.coli mittels Real-Time

PCR................................................................................................................................. 44

2.14.1 Theoretische Grundlagen der Real-Time-PCR............................................................. 44

2.14.2 Real-Time PCR mit SYBR-Green ................................................................................ 45

2.14.3 Nachweis von Salmonella spp. mit der Real-Time PCR............................................... 46

2.14.4 Nachweis von Campylobacter coli und Campylobacter jejuni mittels Real-Time PCR.. 48

2.14.5 Nachweis von Listeria monocytogenes mittels Real-Time PCR ................................... 50

2.14.6 Nachweis von enterohämorrhagischem E.coli (EHEC) mit der Real-Time PCR ........... 53

2.15 Inhibitionskontrollen für die Real-Time PCR: .................................................................. 56

2.15.1 Interne Amplifikationskontrolle als Inhibitionskontrolle bei Real-Time PCR .................. 56

2.15.2 Externe Inhibitionskontrolle für die Real-Time PCR...................................................... 56



Abschlussbericht

2.15.3 Nachweis einer internen Positivkontrolle (IPC) als Amplifikationskontrolle der

Real-Time PCR............................................................................................................ 57

2.15.4 Klonierung eines Fragments aus Nicotiana tabacum zur Verwendung als Template

für die Interne Positivkontrolle (IPC) in der Real-Time PCR ......................................... 59

2.16 DNA-Biochip-Analytik zum parallelen Nachweis mehrerer pathogener Keime................. 60

2.16.1 Theoretische Grundlagen der DNA-Biochip-Analytik.................................................... 60

2.16.2 Reagenzien und Materialien......................................................................................... 61

2.16.3 Geräte.......................................................................................................................... 61

2.16.4 Durchführung der Analytik mittels NUTRI-Chip ............................................................ 61

2.16.5 Kontrollen..................................................................................................................... 62

2.16.6 Auswertung.................................................................................................................. 62

2.17 Methode zur Typisierung von Salmonella-Serovaren mittels Pulsfeldgelelektrophorese.. 63

2.17.1 Theoretische Grundlagen zur Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) ................................ 63

2.17.2 Standard-Protokoll für die PFGE.................................................................................. 63

2.17.3 Bio-Rad-Methode......................................................................................................... 66

3 Ergebnisse................................................................................................................................. 67

3.1 DNA-Extraktion ................................................................................................................... 67

3.2 Nachweis von Salmonella spp. ........................................................................................... 68

3.2.1 Polymerasekettenreaktion (PCR) für Salmonella spp................................................... 68

3.2.2 Spezifität der PCR für Salmonella spp. ........................................................................ 68

3.2.3 Sensitivität der PCR für Salmonella spp....................................................................... 69

3.2.4 Real-Time Polymerasekettenreaktion (PCR) für Salmonella spp. ................................ 70

3.2.5 Spezifität der Real-Time PCR für Salmonella spp. ....................................................... 70

3.2.6 Sensitivität der Real-Time PCR für Salmonella spp. .................................................... 71

3.2.7 Relative Spezifität der Real-Time PCR für Salmonella spp. (im Vergleich zum

kulturellen Nachweis) ................................................................................................... 72

3.2.8 Relative Sensitivität der Real-Time PCR für Salmonella spp. im Vergleich zum

kulturellen Nachweis - Dotierungsexperimente ............................................................ 72

3.2.9 Ringversuche zum Nachweis von Salmonella spp. mit Real-Time PCR....................... 75

3.2.10 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) von Salmonella spp. .............................................. 76

3.3 Nachweis von Campylobacter coli und Campylobacter jejuni.............................................. 78

3.3.1 PCR und Real-Time PCR für Campylobacter coli und jejuni ........................................ 78

3.3.2 Entwurf und Optimierung des Primer-Sonden-Systems ............................................... 78

3.3.3 Spezifität der Real-Time PCR für Campylobacter coli und jejuni .................................. 80

3.3.4 Sensitivität der PCR und der Real-Time PCR für Campylobacter coli und jejuni .......... 81



Abschlussbericht

3.3.5 Relative Sensitivität (Sensitivität im Vergleich zum kulturellen Nachweis) der

Real-Time PCR für Campylobacter coli und jejuni........................................................ 82

3.3.6 Relative Spezifität (Vergleich zum kulturellen Nachweis) der Real-Time PCR für

Campylobacter coli und jejuni ...................................................................................... 84

3.3.7 Berechnung der Validierungsparameter der Real-Time PCR für Campylobacter coli

und jejuni ..................................................................................................................... 85

3.4 Nachweis von Listeria monocytogenes mit PCR und Real-Time PCR................................. 88

3.5 Paralleler Nachweis von Salmonella spp., Listeria monocytogenes und thermophilen

Campylobactern mit dem Biochip........................................................................................ 90

3.6 Nachweis von enterohämorrhagischen E. coli (EHEC) mit PCR und Real-Time PCR......... 93

3.7 Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis mit PCR.................................. 95

3.8 Interne Amplifikationskontrollen für die PCR und die Real-Time PCR................................. 96

4 Diskussion ................................................................................................................................. 99

4.1 DNA-Extraktion ................................................................................................................... 99

4.2 Nachweis von Salmonella spp. mit molekularbiologischen Methoden ............................... 100

4.3 Nachweis von Campylobacter coli und Campylobacter jejuni mit PCR und Real-Time

PCR.................................................................................................................................. 104

4.4 Nachweis von Listeria monocytogenes mit PCR ............................................................... 106

4.5 Paralleler Nachweis von Salmonella spp., Listeria monocytogenes und thermophilen

Campylobactern mit dem Biochip...................................................................................... 106

4.6 Nachweis von enterohämorrhagischen E. coli (EHEC)...................................................... 107

4.7 Nachweis von Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) mit PCR ............................ 109

4.8 Interne Amplifikationskontrolle für die PCR und Real-Time PCR....................................... 110

5 Zusammenfassung................................................................................................................... 112

6 Literaturverzeichnis .................................................................................................................. 114

7 Anhang .................................................................................................................................... 118

7.1 Poster und Tagungsbeiträge............................................................................................. 118

7.2 Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................................... 118

Einleitung 6 von 119 Seiten


Abschlussbericht

1 Einleitung

1.1 Lebensmittelinfektionen und molekularbiologisch er Erregernachweis

„Jeder Mensch hat ein Recht auf Zugang zu Lebensmitteln, die den Nährstoffbedarf decken und die

sicher sind”, fordert die Weltgesundheitsorganisation WHO. Nach ihrer Einschätzung erkranken jähr-

lich ca. 30% der Bevölkerung in den Industrienationen an Lebensmittelinfektionen durch Verzehr kon-

taminierter Lebensmittel. In Deutschland liegen die gemeldeten Fälle bei über 200 000 pro Jahr [1],

wobei Salmonella spp. als der häufigste bakterielle Erreger auftritt. Wachsende Zahlen sind in den

letzten Jahren bei Infektionen mit thermophilen Campylobacter coli und Campylobacter jejuni ver-

zeichnet worden. Von großer Bedeutung weltweit sind ebenso pathogene Escherichia coli (z.B. ente-

rohämorrhagische E.coli, EHEC), Listeria monocytogenes und lebensmittelassoziierte Viren (z.B.

Norwalk-like Viren).

Da das Lebensmittelangebot heute immer größer und vielfältiger wird, ist eine konsequente, rasche

und zuverlässige Überwachung der Lebensmittelproduktion und des Handels notwendig.

In der Lebensmitteluntersuchung werden derzeit zum Nachweis von mikrobiellen Kontaminationen

überwiegend kulturelle und biochemische Verfahren verwendet. Daneben werden immer mehr mole-

kularbiologische Nachweise u.a. als schnelle Screeningverfahren etabliert und eingesetzt.

Als Vorteile der molekularbiologischen Verfahren gegenüber den herkömmlichen klassisch mikrobio-

logischen Untersuchungsmethoden sind zum einen die kürzere Untersuchungsdauer, zum anderen

der gezielte Nachweis von entscheidenden Pathogenitätsfaktoren (z.B. Toxine, Oberflächenantigene)

zu nennen. Zudem lassen sich mit molekularbiologischen Verfahren verwandtschaftliche und klonale

Beziehungen zwischen menschlichen Isolaten und entsprechenden Lebensmittelisolaten darstellen.

Somit wird es möglich, Erregerreservoirs aufzudecken und die Verbreitung von Krankheitserregern

sowie deren Übertragungswege zu verfolgen. Gerade zur Prävention von Seuchenausbrüchen bzw.

zur Erlangung verlässlicher epidemiologischer Daten könnten mittels rasch durchführbarer, insbeson-

dere molekularbiologischer Methoden, eine größere Anzahl an Lebensmittelproben gleichzeitig unter-

sucht werden.



Abschlussbericht

1.2 Pathogene Keime in Lebensmitteln

1.2.1 Salmonella spp.

Die Salmonellose ist aus medizinischer, veterinärmedizinischer wie auch ökonomischer Sicht weltweit

eine der bedeutendsten Zoonosen. Salmonella spp. stellt neben Campylobacter in Deutschland den

am meisten verbreiteten bakteriellen Enteritiserreger bei Lebensmittelinfektionen dar. Pro Jahr wer-

den ca. 70 000 Fälle gemeldet. Für Risikogruppen (Kinder, ältere Menschen und immunsupprimierte

Patienten) ist die Letalität mit 5-10% nach wie vor hoch. An der Spitze der Infektionen verursachen-

den Lebensmittel stehen Geflügelfleisch und rohe Eier (bzw. Speisen, die Rohei enthalten). Weitere

Quellen sind rohes, bzw. nicht durchgegartes Fleisch, Wurstprodukte, aber auch z.B. Gewürze oder

Schokolade.

Es handelt sich bei dem Erreger um fakultativ anaerobe, gram-negative, stäbchenförmige Bakterien,

die zu den Enterobacteriaceae gehören. Die Gattung Salmonella umfasst zwei Species, Salmonella

enterica mit sieben Subspecies, und Salmonella bongori. In Europa dominiert das Serovar S. Enteriti-

dis als Ursache für mehr als 60% der gemeldeten Fälle, gefolgt von S. Typhimurium.

Für den Nachweis mittels PCR wird ein Fragment aus dem invA-Gen herangezogen. Das Genprodukt

der inv-Gene (invA, B, C, D) erlaubt es Salmonella in die Darmepithelzellen einzudringen. Für die

rasche und sichere Freigabe salmonellenfreier Lebensmittel bietet die routinemäßige Anwendung von

PCR-Verfahren große Vorteile gegenüber herkömmlichen Verfahren.

1.2.2 Campylobacter coli und Campylobacter jejuni

Seit in den Jahren 1996-2000 die in der EU gemeldeten Fälle um ca. 33% angestiegen sind, gilt

Campylobacter jejuni und Campylobacter coli als einer der häufigsten bakteriellen Durchfallerreger in

Europa und Amerika. Nach Angaben des RKI belaufen sich die in Deutschland gemeldeten Fälle an

lebensmittelbedingten Infektionen mit thermophilen Campylobactern im Jahr 2003 auf über 45 000

[1]. Damit folgt Campylobacter direkt nach Salmonella in der Häufigkeit der Lebensmittelinfektionen.

Obwohl die Symptomatik der akuten Enteritis meist innerhalb von 5-7 Tagen abklingt, können Kom-

plikationen wie das Guillain-Barré-Syndrom oder reaktive Arthritis (1-2% der Fälle) auftreten. Von den

15 beschriebenen Spezies der Bakteriengattung Campylobacter werden vor allem die thermophilen

C. jejuni und C. coli mit Erkrankungen des Menschen assoziiert. Dabei ist für über 80-90% der Infek-

tionen C. jejuni verantwortlich. Thermophile Campylobacter sind mikroaerophile Keime, die bei 42°C

wachsen. Es handelt sich um gram-negative Stäbchen spiral- oder S-förmiger Gestalt, die durch eine

lange Geißel sehr beweglich sind. Die hauptsächlichen Erregerreservoire sind zahlreiche warmblütige

Tiere (Schwein, Geflügel etc.); bei Vögeln findet sich der Erreger als harmloser Darmkommensale.

Hauptinfektionsquellen bilden unzureichend erhitztes oder (re)kontaminiertes Geflügelfleisch und da-

raus hergestellte Erzeugnisse, nicht pasteurisierte Milch, rohes Hackfleisch und kontaminiertes, nicht



Abschlussbericht

gechlortes Trinkwasser. Die Infektionsdosis liegt mit ca. 500 Keimen sehr niedrig und fördert auch,

gerade bei Kindern, eine häufige direkte Übertragung von Mensch zu Mensch.

Für den Nachweis mit der PCR wird ein Fragment aus dem Flagellin-Gen, das für die Bakteriengeißel

codiert, herangezogen. Die Bakteriengeißel spielt bei der Infektion eine Rolle bei der Adhäsion der

Bakterien an die Darm-Epithelzellen.

1.2.3 Enterohämorrhagische E.coli (EHEC)

Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) stellen eine Untergruppe der Shigatoxin- bzw. Vero-

toxinbildenden Escherichia coli (STEC bzw. VTEC) dar, die humanpathogenen Vertreter dieser Grup-

pe. Da noch nicht bekannt ist, welche Eigenschaften einen VTEC (STEC) zum EHEC machen, wer-

den alle VTEC zunächst als potentielle EHEC angesehen. Enterohämorrhagische Escherichia coli

bilden pathogenetisch wichtige Verotoxine, die bei einer Humaninfektion Gastroenteritis, hämorrhagi-

sche Kolitis oder auch ein für Kleinkinder lebensbedrohliches hämolytisch-urämisches Syndrom

(HUS) verursachen können. Da als Reservoir dieser Erreger vor allem landwirtschaftliche Nutztiere

gelten, geschieht die Übertragung in der Regel durch kontaminierte tierische Lebensmittel wie

Fleisch-, Milch- und vor allem Rohmilchprodukte. EHEC wurde von der WHO als Erreger mit der

größten Ausbreitungstendenz eingestuft.

In der Diagnostik ist eine rasche, spezifische Untersuchung der Lebensmittel auf das Verotoxin der

EHEC nötig, um Epidemien zu erkennen und frühzeitig einzugrenzen.

Der Nachweis der Toxingene durch die Anwendung molekularbiologischer Techniken wird als der zur

Zeit sicherste Ansatz beurteilt [2].

1.2.4 Listeria monocytogenes

Innerhalb der gram-positiven Gattung Listeria hat in den vergangenen fünfundzwanzig Jahren Listeria

monocytogenes als humanpathogener Erreger von Infektionen wie Enteritis, Sepsis und Meningitis

Bedeutung erlangt. Listeria monocytogenes sind peritrich begeißelte, bei 20oC gut bewegliche, gram-

positive Stäbchen. Die Fähigkeit dieser Keime, noch bei sehr tiefen Temperaturen zu wachsen (auch

im Kühlschrank), kann zu einer massiven Vermehrung in kontaminierten Lebensmitteln (vorwiegend

tierischer Herkunft, z.B. Rohwürste und Rohmilcherzeugnisse [3]) führen.

Humane Infekte können entstehen, wenn 106 - 109 Erreger mit Nahrungsmitteln in den Gastrointesti-

naltrakt gelangen. Listerien sind klassische Opportunisten. Bedeutsam ist die Möglichkeit, dass auch

bei einer unauffälligen Erkrankung bei Schwangeren eine Infektion des Fötus erfolgen kann, die zu

dessen Erkrankung oder Tod führen kann. Bei massiver Infektion werden Symptome einer Gastroen-

teritis beobachtet. Unter den Listerien verursachen nur Listeria monocytogenes und die sehr seltene

Art Listeria ivanovii Krankheiten des Menschen. Kleine Epidemien, die ihren Ausgang von massiv mit

Listerien kontaminierten Lebensmitteln, wie Milch, Milchprodukten (Käse), Fleischprodukten und wei-

teren Lebensmitteln (z.B. Kohlsalat) nahmen, wurden beschrieben.



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1.2.5 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis

Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) ruft beim Rind die Paratuberkulose oder Johne’sche

Erkrankung als chronisch entzündliche Krankheit des Darmkanals hervor. Da die Symptome dieser

Krankheit bei Wiederkäuern denen des Morbus Crohn beim Menschen ähneln, wurde ein möglicher

Zusammenhang zwischen Mycobacterium paratuberculosis und Morbus Crohn diskutiert [4,5]. Bei

Untersuchungen von Morbus Crohn-Patienten konnte in wenigen Fällen MAP isoliert bzw. DNA-

Sequenzen von MAP gefunden werden. Mögliche Quellen für eine Infektion stellen Trinkwasser,

Milchprodukte und Rohmilch (u.U. auch pasteurisierte Milch) dar [6]. Aufgrund sich z.T. widerspre-

chender Befunde und keiner ausreichenden Datenlage wird der Zusammenhang nach wie vor kontro-

vers diskutiert. Um eine abschließende Risikoabschätzung vornehmen zu können, müsste die Exposi-

tion des Menschen gegenüber dem Erreger genauer erforscht werden, d.h. insbesondere das Vor-

kommen der Mykobakterien in Milch und Milchprodukten.

Mit der Etablierung einer sensitiven und zuverlässigen molekularbiologischen Methode könnte die bis

zu 6 Monate dauernde Anzüchtung von Mycobacterium avium paratuberculosis erheblich beschleu-

nigt und somit als Screening-Methode in der Lebensmitteldiagnostik eingesetzt werden.



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1.3 Ziel des Projekts

Im vorliegenden Forschungsprojekt sollen molekularbiologische Methoden zum Nachweis lebensmit-

telhygienisch relevanter Mikroorganismen entwickelt und in die amtliche Lebensmittelanalytik einge-

führt werden. Unterschiedliche molekularbiologische Methoden sollen für die folgenden, weltweit vor-

kommenden, bedeutenden Erreger lebensmittelassoziierter Infektionen geprüft und etabliert werden:

Salmonella spp. Campylobacter coli und jejuni, enterohämorrhagische E. coli, Listeria monocytoge-

nes und Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis.

Die wichtigsten Vorteile der molekularbiologischen Diagnostik sind:

- sehr kurze Analysezeit

- schnelle Verfügbarkeit (im Gegensatz zu kostspieligen Antiseren oder Phagen)

- spezifischer Nachweis von Virulenzgenen (Bsp. VTEC bzw. EHEC)

- schnelle Typisierung bei Infektionsketten ist möglich

- Nachweis schwer kultivierbarer Mikroorganismen und Viren bzw. „viable but not culturable“-Stadien

von Mikroorganismen

Material und Methoden 11 von 119 Seiten


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2 Material und Methoden

Im folgenden Kapitel werden die verwendeten und erarbeiteten Methoden erläutert. Die Beschreibung

gliedert sich in

• Methoden zur Kultivierung und zum kulturellen Nachweis von Bakterienstämmen

• Geräte und Materialien zur Durchführung der DNA-Analytik und der PCR

• Methoden zur DNA-Extraktion aus Anreicherungskulturen und Reinkulturen von Bakterien

• Methoden zum molekularbiologischen Nachweis von bakterienspezifischen DNA-Sequenzen



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2.1 Kultivierung von Bakterienstämmen und Nährmedie n

2.1.1 Anzucht von Referenzstämmen

Für die Anzucht von Referenz-DNA verschiedener Keime werden sterile 10ml Kunststoffröhrchen

verwendet und mit ca. 5ml des entsprechenden Flüssigmediums befüllt. Die Kultur wird über Nacht

im Brutschrank bei der entsprechenden Temperatur bebrütet. Von der Kultur wird 1ml zur DNA-

Extraktion (CTAB-Methode bzw. Qiagen-DNeasy-Kit) eingesetzt.

2.1.2 Nährmedien

Bei der Durchführung der Dotierungsversuche wurden für die Ermittlung der Koloniezahl folgende

feste Nährmedien verwendet:

Für Salmonella spp.: Plate count Agar

Für Campylobacter coli bzw. jejuni: CCDA-Agar (Campylobacter-Agarbasis, blutfrei),

Campylobacter Selective Agar CB

2.2 Methoden zum kulturellen Nachweis von Bakterien

Zum Nachweis von pathogenen Keimen werden neben der PCR kulturelle Verfahren eingesetzt. Die-

se Verfahren werden nach den entsprechenden Methoden des §35 LMBG [7] durchgeführt.

Salmonella spp.: §35 LMBG Zf. 00.00-20 „Untersuchung von Lebensmitteln - Horizontales Verfahren

für den Nachweis von Salmonellen“

Daneben wird die Impedanztechnik, die in obigem Verfahren mitaufgenommen ist, angewandt.

Campylobacter coli und Campylobacter jejuni: ISO 10272:1995 (E) 1995-10-15 „Microbiology of

food and animal feeding stuffs-horizontal method for detection of thermotolerant Campylobacter“

Listeria monocytogenes: §35 LMBG Zf. 00.00-32 „Horizontales Verfahren für den Nachweis und die

Zählung von Listeria monocytogenes; Teil 1: Nachweisverfahren“



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2.3 Künstliche Kontamination (Spiking, Dotierung) v on Lebensmitteln mit Bakterien

2.3.1 Dotierung mit Salmonella Typhimurium

Für die künstliche Kontamination von Lebensmittelproben wurde Salmonella Typhimurium auf Nähra-

gar ausplattiert und bei 37°C 18-24 h bebrütet. Eine geeignete Verdünnungsstufe in NaCl-Lösung

(0,85%), die anhand von Koloniezählung ermittelt wird, wird eingesetzt, um die Lebensmittelproben

zu inokulieren.

Die Lebensmittelproben werden vor Dotierung auf Abwesenheit von Salmonella spp. getestet und die

Gesamtkeimzahl mesophiler aerober Keime wird bestimmt. Jeweils 25 g des Lebensmittels werden

mit zwei verschiedenen Konzentrationen, 5 cfu und 10 cfu von Salmonella Typhimurium inokuliert.

Eine weitere Probe bleibt als Negativkontrolle unbeimpft. Die tatsächliche Höhe der Konzentration der

Dotierung wird dann anschließend über Plattenkeimzählung ermittelt. Die Proben werden jeweils

nach einer Bebrütungsdauer von 18 h und von 24 h mit Real-Time PCR und mit der kulturellen Analy-

tik [7] untersucht.

2.3.2 Dotierung mit Campylobacter jejuni

Die Lebensmittelproben werden künstlich mit einer niedrigen Konzentration von Campylobacter jejuni

inokuliert und angereichert. Dazu wird Campylobacter jejuni unter mikroaerophilen Bedingungen in

Preston-Medium für 48 h bei 42°C bebrütet. Diese Kult ur wird in NaCl-Lösung (0,85%) als Puffer ver-

dünnt und die Verdünnungsstufen zur Dotierung anhand von Koloniezählung ermittelt; als geeignete

Konzentrationen werden 1 cfu, 5 cfu und 10 cfu pro 25 g gewählt. Zur Dotierung werden je 25 g Le-

bensmittel mit der zehnfachen Menge an Flüssigmedium versetzt, mit den ermittelten Verdünnungs-

stufen inokuliert und 1min gestomachert. Die Bebrütung erfolgt unter mikroaerophilen Bedingungen

für 48 h bei 42°C. Es werden jeweils 5 Ansätze mit e iner Konzentration dotiert, ein zusätzlicher An-

satz bleibt als Negativkontrolle unbeimpft.

Vor Dotierung der Lebensmittelproben werden diese kulturell auf Abwesenheit von Campylobacter

jejuni überprüft. Während dieser Zeit werden die Lebensmittelproben 3 Tage bei 4°C aufbewahrt. Die

Höhe der Hintergrundflora wird mit der Methode der Gesamtkeimzählung bestimmt.



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2.4 Geräte für die DNA-Analytik

• Sterile PCR-Reaktionsgefäße, 0,2 ml

• Sterile Eppendorfgefäße, 0,5 ml oder 1,5 ml und 2 ml; 50-ml Zentrifugenröhrchen (steril)

• variable Kolbenhubpipetten; z.B. 0,5-10 µl, 20-100 µl und 100 -1000 µl (z.B. Finnpipette, Brand

oder Eppendorf)

• sterile Filterspitzen für Pipetten (z.B. Finnigan, Brand oder Biozym Filter-Tips)

• Thermocycler, z.B. Perkin Elmer Gene Amp 2400

• Zentrifuge mit Einsätzen für 0,2, 0,5 und 1,5 ml-Tubes

• Reaktionsgefäß-Schüttelgerät (Vortexer)

• Kühlbare Tischzentrifuge, z.B. Fa. Heraeus, Typ Biofuge 13 R (max. 13800 g)

• Tischzentrifuge, z.B. Eppendorf 5415 C (max. 16000 g)

2.5 Materialien für die DNA-Analytik

2.5.1 Qualität und Handhabung

Es werden geeignete Maßnahmen angeraten, um Kontaminationen der PCR-Reaktion mit DNA, die

zu falsch-positiven Ergebnissen führen könnten, zu vermeiden.

Die Verwendung separater Geräte und Pipetten, sowie die räumliche Trennung der einzelnen Ar-

beitsschritte der PCR minimieren die Wahrscheinlichkeit, dass Kontaminationen durch verunreinigte

Reagenzien bzw. Geräte auftreten können.

Pipettentips und Reaktionsgefäße

• Sterile und DNA-freie Pipettentips und Reaktionsgefäße verwenden

Dekontamination von Flächen und Gegenständen

• mit 0,1 M HCl

Pipetten

• PCR-Arbeitsschritte werden mit separaten Pipetten durchgeführt

Wasser

Für Arbeiten der DNA-Analytik wird nur Wasser folgender Qualität verwendet:

• Bidestilliertes, autoklaviertes Wasser (min. 120°C, 1 bar, 20 min).

• Kommerziell erhältliches steriles Wasser; (z.B. Aqua ad iniectabilia bzw. Wasser aus dem PCR-

Kit)



Abschlussbericht

2.6 Reagenzien für die DNA-Analytik

2.6.1 Wasser

• Zur Herstellung von Lösungen, die anschließend autoklaviert werden, wird bidestilliertes Wasser

verwendet.

2.6.2 Nucleotid-Mix

• Aus käuflichen Fertiglösungen (steril; z.B. Roche Diagnostics) wird ein Mix der Nukleotide in der

jeweils im Prüfverfahren genannten Konzentration hergestellt und aliquotiert.

2.6.3 10 x PCR-Puffer und Polymerasen

• Es werden kommerziell erhältliche Fertigpuffer und Polymerasen verwendet (z.B. Roche Di-

agnostics).

2.6.4 Primer und Sonden (Oligonukleotide)

• Die Oligonukleotide (z.B. Herstellung durch Fa. TIB Molbiol, Berlin) werden als Lyophilisat oder als

konzentrierte Lösung geliefert.

• Aus den gelieferten konzentrierten Lösungen bzw. aus den Lyophilisaten hergestellten Stammlö-

sungen werden geeignete Arbeitslösungen hergestellt.

2.6.5 Enzyme

• Die Enzyme werden nach Vorgaben des Herstellers, i.d.R. bei -20°C, aufbewahrt.

1. Lysozym, 20 mg/ml

200 mg Lysozym (> 20.000 U/mg) in 10 ml Wasser lösen. Aliquotieren. Aufgetaute, nicht ver-

brauchte Lösungen werden verworfen.

2. Proteinase K, 20 mg/ml

40 mg Proteinase K in 2 mI sterilem Wasser lösen. Aliquotieren.

3. RNase A (DNase-frei) (1 mg/ml)

RNase A (aus Rinderpankreas, z.B. von Fluka, 83831) zu 1 mg/ml in TE-Puffer lösen. 15-20 min.

bei 95°C halten. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Aliquotieren.

4. RNase A (10 mg/ml)

RNase A zu 10 mg/ml in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)/ 15mM NaCl lösen. 15-20 min. bei 95°C halten.

Auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Aliquotieren.



Abschlussbericht

2.7 Puffer und Lösungen für die DNA-Analytik

2.7.1 Chemikalien

Es sind analysenreine, für die Molekularbiologie geeignete Chemikalien zu verwenden.

1. Borsäure

2. Bromphenolblau

3. Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)

4. Chloroform

5. Ethanol

6. Ethidiumbromid, wässrige Lösung (0,1 %)

7. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Dinatriumsalz

8. Glycerin

9. Glykogen

10. Guanidin-Hydrochlorid

11. Guanidin-Thiocyanat, z.B. Sigma G 9277

12. Isoamylalkohol

13. Isopropanol

14. Magnesiumchlorid

15. Maleinsäure

16. Natriumchlorid

17. Natriumcitrat (x 3H2O)

18. Natriumdodecylsulfat (SDS)

19. Natriumhydroxid

20. N-Lauroylsarcosin

21. Phenol

22. Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat (Tween 20)

23. Salzsäure

24. Tris-Borat-EDTA-Mischung (TBE, 5 x) (Fertiggemisch, pulverförmig, mit Wasser aufzulösen); z.B.

Fluka

25. Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris)

26. Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Hydrochlorid (Tris-HCl)

27. Triton X 100, z.B. Sigma T 8787

2.7.2 Puffer

• Sind Lösungen zu autoklavieren, so erfolgt dies bei 120°C und 1 bar für 20 min.



Abschlussbericht

1. Chloroform/Isoamylalkohol-Mischung (24 + 1)

Chloroform 32,8 ml

Isoamylalkohol 2,4 ml

in Schraubdeckelflasche mischen

2. CTAB-Puffer, pH 8,0

2% (w/v) CTAB 20,0 g

1,4 M NaCl 82 g

20 mM EDTA (Na-EDTAx2 H20, Titriplex) 7,4 g

100 mM Tris-HCl 16 g

in ca. 800 ml Wasser lösen; mit Natronlauge auf pH 8,0 einstellen. Auf 1000 ml

auffüllen. Autoklavieren (2 x 500 ml).

3. CTAB-Präzipitationslösung, pH 8,0

0,04 M NaCl 0,23 g

5% (w/v) CTAB 0,5 g

in ca. 80 ml Wasser lösen; auf pH 8,0 einstellen. Auf 100 ml auffüllen.

Autoklavieren (2 x 50 ml).

4. Ethanol, 70 %

Ethanol (96% unvergällt) 35 g

Wasser 13 g

5. SDS-Puffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % SDS)

10 mM Tris-HCL 1,6 g

150 mM NaCL 8,8 g

2 mM EDTA (Na- EDTA x 2H20 (Titriplex) 0,74 g

1 %SDS 10,0 g

in ca. 800 ml Wasser lösen; auf pH 8,0 einstellen. Auf 1000 ml auffüllen. Autoklavieren

(2 x 500 ml).

6. 5 M Guanidin-HCl

Guanidin-HCl 2,39 g

mit Wasser auf 5 ml auffüllen, lösen. Aliquotieren. Kühl lagern.

7. Guanidin-Thiocyanat-Puffer

0,1 M Tris/HCl 1,57 g



Abschlussbericht

in ca. 70 ml Wasser lösen, auf pH 6,4 einstellen und auf 100 ml auffüllen

0,5 M EDTA (Na-EDTA x 2H20; Titriplex) 18,6 g

in ca. 70 ml Wasser lösen, auf pH 8,0 einstellen und auf 100 ml auffüllen

Puffer:

Tris/HCl 100 ml

EDTA 8,8 ml

Wasser 13,2 ml

Triton X 100 2,6 g

Guanidinthiocyanat 120 g

Lösen und autoklavieren.

8. Loading-Puffer für Elektrophorese: Anmerkung: Autoklavierte(s) Wasser und Behältnisse nicht

erforderlich.

0,07 % Bromphenolblau in Glycerin (40 % (v/v) in TBE-Puffer

Bromphenolblau 7 mg

Glycerin 4 ml

Einwiegen und mit 1xTBE, pH 8,0 auf 10 ml auffüllen. Bromphenolblau

durch Zugabe von Glycerin-TBE-Mischung auflösen.

9. 1x TBE (Arbeitspuffer Elektrophorese)

Anmerkung: Autoklaviertes Wasser und Behältnisse nicht erforderlich.

5 x TBE 200 ml

Wasser 800 ml

in 1 l Schraubdeckelflasche mischen. Ggf. pH-Wert überprüfen.

10. 0,2x TE (für DNA-Präparation)

TE-Puffer sterilfiltrieren und in Schraubdeckelglas überführen. Mit 4fachem Volumen sterilem

Wasser versetzen. Autoklavieren.

2.7.3 Handhabung der Lösungen

• Eine Entnahme autoklavierter Lösungen erfolgt unter sterilen Bedingungen.

• Bei häufig geöffneten, sterilen Lösungen kann es zweckmäßig sein, das Autoklavieren in regelmä-

ßigen Abständen zu wiederholen bzw. Lösungen frisch herzustellen.

• Sofern keine abweichenden Herstellerangaben vorliegen, werden Lösungen bei Raumtemperatur

gelagert.



Abschlussbericht

2.8 Agarosegelelektrophorese zur Auftrennung von Nuk leinsäuren

Die elektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren mittels Agarosegel-Elektrophorese (Submers-

Verfahren) eignet sich insbesondere für schnelle Auftrennungen mit geringeren Auflösungen (über

10bp) im Bereich von 100-20000 bp.

DNA-haltige Lösungen (PCR-Amplifikate, aufgearbeitete DNA-Lösungen) werden auf Agarosegelen

unterschiedlicher Stärke elektrophoretisch aufgetrennt und die Nukleinsäuren mittels Färbung (z.B.

Ethidiumbromid) am UV-Transilluminator sichtbar gemacht. Die Gele werden mit einer Digitalkamera

dokumentiert.

2.8.1 Sicherheitshinweis

Es sind insbesondere die Sicherheitshinweise beim Arbeiten mit ethidiumbromidhaltigen Lösungen zu

beachten (Ethidiumbromid gilt als mutagen).

2.8.2 Reagenzien, Geräte und Hilfsmittel

1. Agarosekammer (z.B. „Agagel Mini“ oder „Maxi“; Biometra)

2. Spannungsgerät (z.B. Biometra)

3. Gelkämme für Probentaschen (z.B. 40/22 Zähne für „Maxi“; 12/8 Zähne für „Mini“)

4. Geltablett (transparent)

5. Gummi-Endblöcke für Geltablett

6. Abstandhalter zur Höheneinstellung der Gelkämme

7. Transilluminator, Wellenlänge ca. 300 nm (z.B. Biometra TL)

8. Dokumentationssystem (Biometra)

9. Agarose (z.B. Standard-Agarose; Roche Diagnostics oder Serva)

10. TBE-Puffer, 1x, pH 8,0

11. Färbereagenz für DNA; z.B. Ethidiumbromid (Merck), 1:10 verdünnt (1 mg/ml)

12. DNA-Marker, z.B. 50 oder 100 base pair ladder bzw. lambda-DNA-Digest (Pharmacia);

verdünnt auf je ca. 10-50 ng/µl.

13. Loading-Puffer für Elektrophorese

2.8.3 Durchführung

Die Bedienungsanleitungen der Gerätehersteller für die Agarosegelsysteme (z.B. Biometra), das

Netzgerät (z.B. Biometra) sowie das Geräte-Handbuch zum Digitalkamera-Dokumentationssystem

(Biometra) sind zu beachten.

Im Folgenden ist die Durchführung der Agarosegel-Elektrophorese exemplarisch für das Kammer-

System der Fa. Biometra beschrieben. Bei Verwendung anderer Fabrikate ist das Protokoll entspre-

chend zu adaptieren.



Abschlussbericht

2.8.4 Vorbereitung der Gelkammer

• Gummi-Endblöcke auf Geltablett aufstecken und auf horizontale Unterlage stellen.

• Probenkamm aufstellen: Abstand der Zähne vom Minus-Pol mind. 1,5 cm

• Agarose abwiegen (z.B. in 100 oder 250 ml Erlenmeyer):

Größe der Nucleinsäure-

fragmente

Gelkonzentration Einwaage Agarose [g] (10 cm Laufstrecke);

„Agagel“ -

„Mini“ „Maxi“

1000 bp - 50000 bp (DNA) 0,8 % 0,24 0,80

500 -2000 bp 1,2 % 0,36 1,20

250 - 500 bp 1,5 % 0,45 1,50

100 -400 bp 2,0 % 0,60 2,00

hohe Auflösung (100-400 bp) 3,0 0,90 3,00

• 1 x TBE-Puffer zugeben:

− 30 ml (Mini Kammer) bzw.

− 100 ml (Maxi Kammer, 10 cm Laufstrecke);

für dickere Gele bis zu 130 ml einsetzen (Einwaage an Agarose entsprechend anpassen);

auf diese Weise können bis zu 20 µl fassende Probentaschen hergestellt werden

• In Mikrowellenherd zum Kochen bringen

• Kolben schwenken und unter Rühren leicht abkühlen lassen (auf 60 - 70°C)

• Ethidiumbromid (1 mg/ml) zupipettieren: 3 µl (Mini) bzw. 8 µl (Maxi, 10 cm Laufstrecke)

• Gellösung in die vorbereitete Kammer gießen

• mindestens 20 min. abkühlen und erhärten lassen

• Geltablett in Kammer einsetzen

• Gel ca. 1-2 mm hoch mit Puffer überdecken

2.8.5 Probenauftrag

• je 2-3 µl Probenauftragspuffer in Mikrotiterplatte pipettieren;

• 10 µl der DNA-Lösung bzw. des Größenmarkers zupipettieren und durch Aufziehen mit Pipet-

te mischen;

• 10 µl der Mischung in Taschen des Gels pipettieren

2.8.6 Elektrophorese

• bei 5-10 V/cm auftrennen; ca. 45 - 60 min bei 75V („Agagel Mini“) bzw. 95 V („Maxi“, 10 cm

Laufstrecke)



Abschlussbericht

2.8.7 Fotodokumentation

• Gel auf UV-Transilluminator legen

• Bild aufnehmen und ausdrucken (s. Geräte-Handbuch-Video-Dokumentationssystem)

• Entsorgung des Gels über Sondermüllsammlung



Abschlussbericht

2.9 Methoden zur DNA-Extraktion

2.9.1 CTAB-Methode

Mit dieser Methode lässt sich genomische DNA von Bakterien aus der Anreicherungskultur von Le-

bensmittelproben isolieren.

Chemikalien/Materialien

• CTAB-Puffer, pH 8,0

• Rnase A (100mg/ml oder 20mg/ml)

• Proteinase K, 20 mg/ml

• Chloroform

• Lysozym 20 mg/ml

• Natriumchlorid, 1,2 M

• Glycogen, 20 mg/ml

• Isopropylalkohol, tiefgekühlt

• Ethanol, 70 %

• TE-Puffer, 0,2-fach

• steriles Wasser

Geräte/Hilfsmittel

• Kühlbare Tischzentrifuge

• Thermoblock (65°C) mit Schüttelvorrichtung (Eppendorf Thermo-Mixer)

• Vortexer

Durchführung

Bei jeder Aufarbeitungsserie ist ein Aufarbeitungsleerwert mitzuführen:

• Alle verwendeten Reagenzien außer Probenmaterial in der gleichen Weise wie die Proben

behandeln

• Der Aufarbeitungsleeerwert wird bei allen PCRs, die mit den Proben durchzuführen sind, als

Negativkontrolle eingesetzt.

• Bei positiven Befunden im Aufarbeitungsleerwert wird eine Wiederholung der Aufarbeitung in

einem Doppelansatz durchgeführt.

• Jeweils 1ml der Voranreicherungskultur abnehmen und in 2 ml-Eppendorfgefäße überführen

• Bei 5000 g (ca. 12 500 rpm), 5min, RT abzentrifugieren



Abschlussbericht

• Bakterienpellet mit 1 ml CTAB durch Auf- und Abpipettieren mit der Pipette lösen, vortexen;

Zugabe von 25 µl Lysozymlösung (20 mg/ml) und 10 µl RNase A (100 mg/ml; bzw. 50 µl RNa-

se A 20 mg/ml) hinzugeben, vortexen

• 60 min (mindestens) bei 37°C im Heizblock inkubieren (leicht Schütteln); danach sollte die Lö-

sung klar sein und etwas gelartig fließen

• ggf. 20 µl 10%ige SDS-Lösung hinzufügen

• 25 µl Proteinase K (20 mg/ml) zugeben, vortexen

• mindestens 30 min bei 65°C im Heizblock inkubieren (le icht schütteln)

• 1 Volumenteil Chloroform zugeben, 1 min vortexen

• 15 min bei 10 000 g (ca. 14 000 rpm) zentrifugieren (RT)

• Wenn die Interphase noch sehr groß ist, Überstand abnehmen in neues Gefäß und wiederum

1 Volumenteil Chloroform zugeben und letzten Schritt wiederholen (wenn die Interphase gelar-

tig, diffus ist, noch mal 15 min bei 10 000 g zentrifugieren, RT)

• Überstand abnehmen (nicht verwerfen!) und in neues Eppendorfgefäß überführen; Chloro-

formphase in spezielles Abfallgefäß entsorgen

• Mit 1 Volumenteil Isopropanol gut mischen

• Mindestens 30 min bei -20°C fällen

• 15 min bei ca. 10 000 g (ca. 12 500 rpm) zentrifugieren, bei 5°C

• Überstand verwerfen

• 200 µl Ethanol (70%) auf das DNA-Pellet (Pellet muss nicht unbedingt sichtbar sein) geben,

vortexen, 5 min bei ca. 10 000 g (ca. 12 500 rpm), RT

• Überstand verwerfen, mit 200 µl-Pipette (ggf. 10 µl-Pipette) allen Überstand entfernen

• Pellet im Heizblock trocknen; offener Deckel, bei ca. 60°C (oder Vakuumzentrifuge,

DNASpeed-Vac)

• Trockenes Pellet in 100 µl 0,2xTE (steril) aufnehmen (kurz auf- und abpipettieren) und bei -

20°C lagern (wenn die PCR direkt im Anschluss durchgefüh rt wird, im Kühlschrank lagern)

Weiteres Vorgehen

• In manchen Fällen muss die erhaltene DNA mit weiteren Verfahren aufgereinigt werden:

Ggf. kann die DNA mittels Microspin Säulen (Microspin™, Fa. Amersham) weiter aufgereinigt

werden.

• Die DNA wird bei 4°C kurzfristig und bei -20° länger fristig gelagert. Möglichst nicht wiederholt

auftauen und einfrieren



Abschlussbericht

2.9.2 Qiagen-DNeasy-Kit zur DNA-Extraktion

Zweck/Anforderungen



Chemikalien/Materialien/Referenzsubstanzen

• RNase A (100 mg/ml)

• Ethanol (96-100%)

Für das Protokoll zur DNA-Extraktion gram-positiver Bakterien:

• Enzymatischer Lysepuffer aus:

- 20 mM Tris Cl, pH 8,0

- 2 mM EDTA

- 1,2% Triton X-100

Puffer autoklavieren

- 20 mg/ml Lysozym; unmittelbar vor Gebrauch zugeben

Fertige Reagenzien/ Säulen aus dem DNeasy® Tissue Ki t (bei 15-20°C lagern)

• Puffer ATL: Lysepuffer

• Puffer AL: Enthält chaotrope Salze (reizend) und Ethanol zum Einstellen der Bindebedingun-

gen

• Puffer AW1: Waschpuffer, Konzentrat (enthält chaotrope Salze, reizend)

• Puffer AW2: Waschpuffer, Konzentrat (enhält Natriumazid, reizend)

• Puffer AE: Elutionspuffer pH=9

• Proteinase K

• DNeasy spin Säule (weiß), zum Binden der DNA

• 2 ml-Auffanggefäße

Geräte/Hilfsmittel

• Kühlbare Tischzentrifuge

• Thermoblock (65°C) mit Schüttelvorrichtung (Eppendorf Thermo-Mixer)

• Vortexer

Probenvorbereitung

Voranreicherungskulturen, die bei -20°C gelagert ware n, werden rasch aufgetaut; wird die DNA-

Extraktion von Subkulturen auf festen Agarmedien durchgeführt, so werden die Zellen mit Hilfe von



Abschlussbericht

ca. 1 ml steriler NaCl-Lösung (0,9%) abgeschwemmt bzw. mit steriler Impföse abgenommen, in 1ml

NaCl-Lösung (0,9%) suspendiert und für die DNA-Extraktion eingesetzt.

DNA-Isolierung von Gram-negativen Bakterien

Bei jeder Aufarbeitungsserie ist ein Aufarbeitungsleerwert mitzuführen.

• 1ml der Voranreicherungskultur (bzw. Anreicherungskultur oder Pufferlösung mit abgeschwemm-

ten Zellen) 10 min bei 5000 g (ca. 7500 rpm) zentrifugieren. Überstand in ein Abfallgefäß überfüh-

ren

• Pellet (ggf. durch Auf- und Abpipettieren) in 180µl Puffer ATL resuspendieren, vortexen

• 20 µl Proteinase K zugeben, vortexen, unter Schütteln bei 55°C für 1-3 h (oder über Nacht) inku-

bieren

• 4 µl RnaseA (100 mg/ml) zugeben, vortexen, 2 min bei Raumtemperatur inkubieren, vortexen

• 200 µl Puffer AL zugeben, sofort gut mischen (mit Pipette oder Vortexer) und 10 min bei 70°C

inkubieren

• 200 µl Ethanol (96-100%) zugeben und gut vortexen

• Gemisch auf ein DNeasy-spin-column (auf 2 ml Auffanggefäß gesteckt) geben und 1 min bei

6000 g (ca. 8000 rpm) zentrifugieren. Durchfluss und Auffanggefäß verwerfen

• Säule auf neues Auffanggefäß (mitgeliefert) stecken und 500 µl Puffer AW1 zugeben

• 1min bei 6000 g (ca. 8000 rpm) zentrifugieren, Durchfluss verwerfen

• Waschvorgang mit 500 µl AW2 wiederholen, 3 min bei voller Geschwindigkeit (13 000 rpm) zentri-

fugieren, Durchfluss verwerfen

• Säule auf 1,5 ml Eppendorfgefäß (nicht mitgeliefert) setzen

• 100 µl Puffer AE direkt auf DNeasy-Membran geben und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren

• 1 min bei 6000 g (ca. 8000 rpm) zentrifugieren, Gefäß schließen und beschriften

• DNA-Eluat gekühlt aufbewahren (4°C, wenn direkt dana ch Einsatz in PCR erfolgt, -20°C für länge-

re Aufbewahrung

DNA-Isolierung von Gram-positiven Bakterien


• 1 ml der Voranreicherungskultur (bzw. Anreicherungskultur oder Pufferlösung mit abgeschwemm-

ten Zellen) 10 min bei 5000 g (ca. 7500 rpm) zentrifugieren. Überstand in ein Abfallgefäß überfüh-

ren

• Pellet in 180 µl enzymatischem Lysepuffer resuspendieren

• Mindestens 30 min bei 37°C inkubieren (Schütteln)

• 25 µl Proteinase K und 200 µl Puffer AL zugeben, vortexen (Beachte: Proteinase K darf nicht direkt

zu Puffer AL gegeben werden)



Abschlussbericht

• 30 min bei 70°C inkubieren (optional: falls notwendi g 15 min bei 95°C zur Inaktivierung von Patho-

genen inkubieren. Inkubation bei 95°C kann zum Abba u eines Teils der DNA führen)

• 200 µl Ethanol (96-100%) zugeben und gut vortexen

• Gemisch auf ein DNeasy-spin-column (auf 2 ml Auffanggefäß gesteckt) geben und 1 min bei

6000 g (ca. 8000 rpm) zentrifugieren. Durchfluss und Auffanggefäß verwerfen

• Säule auf neues Auffanggefäß stecken und 500 µl Puffer AW1 zugeben

• 1 min bei 6000 g (ca. 8000 rpm) zentrifugieren, Durchfluss verwerfen

• Waschvorgang mit 500 µl AW2 wiederholen, 3 min bei voller Geschwindigkeit (13000 rpm) zentri-

fugieren, Durchfluss verwerfen

• Säule auf 1,5 ml-Eppendorfgefäß (nicht mitgeliefert) setzen

• 100 µl Puffer AE direkt auf DNeasy-Membran geben und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren

• 1 min bei 6000 g (ca. 8000 rpm) zentrifugieren, Gefäß schließen und beschriften


re Aufbewahrung)

2.9.3 Wizard-Kit (Promega „Wizard DNA Clean-up System“)

Zweck/Anforderungen



Chemikalien/Materialien/Referenzsubstanzen

• Extraktionspuffer (= SDS-Puffer), pH 8,0 (10 mM TRIS pH 8,0; 0,15 mM NaCl, 20 mM EDTA,

1% SDS)

• Proteinase K, 20 mg/ml

• 5 M Guanidin-HCl

• RNase A (10 mg/ml)

• Isopropanol, 80%: 40 ml Isopropanol mit 10 ml Wasser versetzen

• Wizard DNA clean-up resin

• Wizard Minicolumns

• Elutionspuffer 0,2xTE; Tris-HCl, pH 9,0

Fertige Reagenzien/ Säulen aus dem Wizard-Kit (Promeg a „Wizard DNA Clean-up System“)

• Wizard DNA clean-up resin

• Wizard Minicolumns



Abschlussbericht

Geräte/Hilfsmittel

• Tischzentrifuge (max. 16000 g)

• Thermoblock (55-65°C) mit Schüttelvorrichtung (Eppendo rf Thermo-Mixer)

• Absaugvorrichtung für Wizard Minicolumns

• Sterile 5ml Einwegspritzen (nur Gehäuse)

Probenvorbereitung

Voranreicherungskulturen, die bei -20°C gelagert ware n, werden rasch aufgetaut; wird die DNA-

Extraktion von Subkulturen auf festen Agarmedien durchgeführt, so werden die Zellen mit Hilfe von

ca. 1ml steriler NaCl-Lösung (0,9%) abgeschwemmt bzw. mit steriler Impföse abgenommen und in

1ml NaCl-Lösung (0,9%) suspendiert und für die DNA-Extraktion eingesetzt

DNA-Isolierung


• 1 ml der Voranreicherungskultur (bzw. Anreicherungskultur oder Pufferlösung mit abgeschwemm-

ten Zellen) 10 min bei 10 000 g zentrifugieren. Überstand in ein Abfallgefäß überführen

• Pellet (ggf. durch Auf- und Abpipettieren) in 860 µl Extraktionspuffer resuspendieren, vortexen

• 100 µl Guanidin-Hydrochlorid-Lösung und 50 µl Proteinase K zugeben, gut vortexen

• unter leichtem Schütteln bei 55°-65°C für mindestens 3 h (oder über Nacht) inkubieren

• 5 µl RnaseA (10 mg/ml) zugeben, vortexen, 5 min bei ca. 60°C inkubieren, vortexen

• 1 ml des Wizard Harzes (Resin) zupipettieren

• Gefäß schließen und mehrmals vorsichtig invertieren

• Gehäuse einer 5 ml Einwegspritze (steril) und Wizard -Minisäule laut Herstellerangaben zusam-

menstecken und auf Sauggerät montieren (Membranpumpenvakuum). Minisäulen beschriften

• Hähne am Sauggerät schließen

• Inhalt des Eppendorfgefäßes zügig in die Spritzengehäuse dekantieren (ggf. pipettieren)

• Flüssigkeit mit Wasserstrahlpumpenvakuum absaugen

• Säule mit insgesamt ca. 2 ml Isopropoanol (80%) portionsweise waschen

• Spritzengehäuse abziehen und Minisäule auf frisches 1,5 ml Gefäß stecken

• 2 min bei ca. 10 000 g zentrifugieren (Restflüssigkeit aus Säule befindet sich danach im Gefäß)

• Säule mindestens 5 min bei Raumtemperatur trocknen

• Frische 1,5 ml-Eppendorfgefäße bereitstellen, Elutionspuffer auf 70°C erhitzen

• Säulchen auf 1,5 ml-Gefäße stecken und die DNA mit 100 µl erwärmtem Elutionspuffer eluieren

• 1 min inkubieren

• 1 min bei ca. 10 000 g zentrifugieren, Gefäße schließen und beschriften

• Minisäulchen verwerfen



Abschlussbericht


re Aufbewahrung)

2.9.4 High Pure foodproof II Kit (Roche Diagnostics )

Zur Extraktion bakterieller DNA aus Anreicherungskulturen von Lebensmitteln für die PCR-Analytik

wird nach dem Manual von Roche Applied Science vorgegangen. Das DNA-Eluat wird gekühlt auf-

bewahrt. (4°C, wenn direkt danach Einsatz in PCR erfol gt, -20°C für längere Aufbewahrung)

2.9.5 DNA-Präparation durch Aufkochen

Die Aufbereitung erfolgt als Doppelansatz. Bei jeder Aufbereitung wird zusätzlich ein Aufarbeitungs-

leerwert als Negativkontrolle mitgeführt.

• zweimal 1 ml Voranreicherung in steriles 1,5 ml-Eppendorfgefäß überführen.

• Bei 13 000 g 5 min zentrifugieren

• Überstand in ein Abfallgefäß verwerfen

• Probe in 1 ml steriler NaCl-Lösung (0,9%) resuspendieren

• Bei 13 000 g 5 min zentrifugieren

• Überstand verwerfen

• Die Zellen im Bodensatz in 200 µl sterilem Aq. dest. resuspendieren

• 10 min bei 95°C im Heizblock erhitzen

• Probe 30 s (13 000 g) abzentrifugieren

• 5 µl des Überstandes direkt in die PCR einsetzen. Wird die PCR nicht direkt angeschlossen, 100 µl

des Überstandes in ein neues Eppendorfgefäß überführen und bis zum Einsatz in die PCR im

Kühlschrank aufbewahren

Bei Reinkulturen auf Platte:

• Bewachsene Platte mit 1 ml steriler NaCl-Lösung (am besten mit steriler Einmal-Pasteurpipette)

abschwemmen

• NaCl-Lösung mit abgeschwemmten Zellen in Eppendorfgefäß überführen

• 10 min bei 95°C im Heizblock erhitzen

• Probe 30 s (13 000g) abzentrifugieren

• 5 µl des Überstandes direkt in die PCR einsetzen. Wird die PCR nicht direkt angeschlossen, 100 µl

des Überstandes in neues Eppendorfgefäß überführen und bis zum Einsatz in die PCR im Kühl-

schrank aufbewahren.



Abschlussbericht

2.10 Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration

Die Konzentration extrahierter DNA-Lösungen wird spektralphotometrisch bestimmt.

Dazu wird die DNA-Lösung bei 260 nm und 280 nm im Photometer gemessen und aus diesen Werten

die DNA-Konzentration in der Lösung errechnet (Bei 320 nm erfolgt die Hintergrundkompensation).

Der Quotient der Messwerte bei 260 nm und 280 nm erlaubte die Abschätzung der Reinheit der DNA.

Reine DNA-Lösungen zeigen Werte von 1,8-2,0.

Bei DNA-Photometern handelt es sich i.d.R. um Einstrahl-Photometer mit Deuteriumlampen als Licht-

quelle. Als Messzelle werden Spezial-Mikroküvetten mit 5 oder 10 mm Schicht-Dicke verwendet.

2.10.1 DNA-Messung

Die Bedienung des DNA-Photometers bezieht sich auf das „BioPhotometer“ der Firma Eppendorf.

Dem Photometer ist ein Drucker angeschlossen. Je nach Einstellung werden aus den Absorptionen

die DNA-Konzentration und verschiedene Quotienten (ratio) berechnet und ausdruckt.

- Gerät einschalten, Drucker einschalten

- „dsDNA“-Methode wählen, der Methodenfaktor beträgt E260 = 50,0 µg/mL

- Verdünnung für die Messung eingeben; bei Eppendorf Uvette-Küvetten: z.B. 10+40, bei

Brand-Küvetten: z.B. 10+60. Die Eingabe erfolgt über „Dilution“. Zahlenwert für die Proben-

DNA (z.B. 10) eingeben, mit „enter“ bestätigen, Zahlenwert der Verdünnungslösung eingeben

(z.B. 40 oder 60) und mit „enter“ bestätigen. Die Verdünnung wird automatisch in die Berech-

nung der Konzentration integriert.

- Leerwert messen: Dafür z.B. 40 µl bzw. 60 µl Verdünnungslösung (i.d.R. 0,2xTE-Puffer) in die

Küvette pipettieren. Küvette in den Küvettenschacht stellen und „BLANK“ drücken.

- Probe messen: Dafür z.B. 10 µl Proben-DNA-Lösung in die Küvette mit der Verdünnungslö-

sung pipettieren und mit der Pipettenspitze die beiden Lösungen gut mischen. Die Küvette

wieder in die gleiche Richtung wie für die BLANK-Messung in den Küvettenschacht stellen.

„SAMPLE“ drücken. Die Absorptionen, berechnete Konzentrationen und Quotienten werden

automatisch ausgedruckt. Falls eine Korrektur über die E320-Absorption für den Messwert

dem Gerät eingegeben wurde, wird diese automatisch berechnet und durch ein Symbol

(�E320) angezeigt. Routinemäßig soll diese automatische Korrektur aktiviert sein.

- Jede Küvette wird nur einmal verwendet.



Abschlussbericht

2.11 Polymerasekettenreaktion (PCR)

2.11.1 Kriterien und Vorgehensweise für Primer- und Sonden-Design

Folgende käufliche und im Internet frei verfügbare Software wurde für Sequenzvergleiche und Primer/

Sonden-Design genutzt (Tab. 1):

Programm Hersteller / Internetadresse

Datenbank zur Sequenzrecherche

GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

BLAST search http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

Alignments/ Sequenzvergleiche

Megalign /Primer Select DNAstar Inc

Clustalw http://www.ebi.ac.uk/clustalw/

Tcoffee http://igs-server.cnrs-mrs.fr/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi

Primer / Tm-Kalkulation / Dimer- und Loopbildung

Primer-Express v 2.0 ABI Perkin Elmer

Primer Select DNAstar Inc

Netprimer * http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html

Primer 3 * http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

Oligo 2002 * http://www.bioinformatics.vg/bioinformatics_tools/oligo2002.shtml

Auswahl von Primer- /Sondensystemen

Primer-Express v 2.0 ABI Perkin Elmer

Primer Select DNAstar Inc

Tab. 1: Datenbanken und Software für das Design von Primern und Sonden für die PCR

* sind über die Linksammlung www.bioinformatics.vg auffindbar

Um Primerkombinationen zu erzielen, die für den gewünschten Targetorganismus spezifisch sind,

werden DNA-Sequenzen des verwendeten Genabschnittes in einem Alignment zusammengefasst

und anhand dieser Daten Primerkombinationen entworfen.

Das Primer-Design orientiert sich an folgenden Kriterien:

- gewählte Primer sollen keine bzw. möglichst wenig selbst- oder paarweise komplementären

Sequenzen enthalten (hairpins, self-dimers, hetero-dimers)

- es sollen in der Nähe der Targetsequenz keine weiteren Primer-Bindungsstellen vorkommen

- in der Regel sollte die Länge eines Primers zwischen ca. 18 und 24 Basen und der GC-Gehalt

zwischen 45% und 55% betragen

- die Schmelztemperatur Tm des forward- und des reverse-Primers sollte ähnlich hoch sein und

möglichst zwischen 55 und 60°C betragen

- Lange PolyA,-T,-G, oder -C Sequenzabschnitte sind zu vermeiden



Abschlussbericht

Um die Parameter der Primersequenzen zu kalkulieren wird die oben genannte Software verwendet.

Das Primer- und Sonden-Design für die Real Time PCR (TaqMan probes) orientiert sich an folgenden

Kriterien:

- der GC-Gehalt sollte zwischen 30% und 80% liegen

- Anhäufungen von Wiederholungen des gleichen Nucleotids (v.a. Guanin) werden vermieden

- es darf kein G am 5’-Ende sitzen

- die letzten 5 Nucleotide am 3’-Ende der Primer dürfen nicht mehr als 2 G oder C enthalten

- Sonden und Primer sollten mehr C als G enthalten

- die Schmelztemperatur Tm sollte bei Sonden bei ca. 68-70°C, bei Primern bei ca.58-60°C lie-

gen

- der Abstand der Primer zur Sonde sollte möglichst gering gewählt werden (nicht über 50 Ba-

sen, aber ohne zu überlappen)

Sowohl die gewählten Primersequenzen als auch die Sondensequenzen werden einer Sequenzsuche

mit dem BLAST-Programm (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) unterworfen, um sie theoretisch auf

ihre Spezifität zu prüfen.

2.11.2 Herstellung des Mastermixes

Alle Reagenzien (außer Wasser) werden während des Ansetzens der PCR kühl gehalten (z.B. „Lab-

Top“ Cooler).

• dNTP-Mix, 10x-PCR-Puffer und Primer-Arbeitsverdünnung, soweit erforderlich, auftauen.

• Aufgetaute Lösungen vortexen und kurz anzentrifugieren. Bei kommerziellen Kits wird entspre-

chend der Herstelleranleitung vorgegangen.

• Reagenzien in z.B. 0,5 ml Reaktionsgefäß pipettiert werden :

Wasser - 10x-PCR-Puffer - dNTP-Mix - Primer-Arbeitsverdünnung - Polymerase - ggf. Sonde

• jeweiliges Pipettiervolumen = Zahl der Proben x Pipettiervolumen pro Ansatz (Ansätze für Wasser-

kontrolle und/oder Aufarbeitungsleerwert berücksichtigen); zusätzlich pro 10 Ansätzen einen An-

satz mehr berechnen (um Verlust durch Pipettierfehler auszugleichen)

• Vortexen und kurz zentrifugieren, um die Lösung am Gefäßboden zu sammeln.

2.11.2.1 Herstellung der PCR-Ansätze

• Den Mastermix auf (Zahl der Proben-, Referenz-, Negativ-Kontrollansätze) PCR-Gefäße verteilen:

jeweiliges Volumen: s. entsprechende Methode (i.d.R. 20 oder 23 µl).

• Proben-/Referenz-DNA vorsichtig vortexen.



Abschlussbericht

• Das jeweils im Prüfverfahren genannte Volumen Proben-/Referenz-/Kontroll-DNA-Lösung direkt in

die Probenansätze pipettieren. PCR-Gefäße jeweils unmittelbar nach DNA-Zugabe verschließen.

DNA sofort wieder kühl stellen (-20°C).

• PCR-Ansätze vorsichtig vortexen und kurz zentrifugieren,

• PCR möglichst unmittelbar nach DNA-Zugabe starten.

2.11.2.2 Starten der PCR

• Thermocycler bzw. Real-Time PCR-Gerät einschalten (Aufheizzeit bzw. benötigte Vorlaufzeit be-

achten)

• PCR-Gefäße in den Thermoblock des Cyclers stellen (ggf. auf „Tablett“-Einsatz)

• das in der jeweiligen Methode genannte Temperatur-Zeitprogramm aufrufen; für die Real-Time

PCR Probenbezeichnungen in Programm eingeben

• Ggf. Programm editieren (z.B. Zyklenzahl), Abweichungen protokollieren

• PCR starten

2.11.2.3 Ende der PCR und Auswertung

• PCR-Gefäße mit Amplifikaten nach der PCR bis zur weiteren Untersuchung in dem Bereich

Elektrophorese aufbewahren (z.B. Kühlschrank) und nur dort öffnen (s.o.).



Abschlussbericht

2.12 PCR zum Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen von S almonella spp., Campylo-

bacter coli und jejuni, Listeria monocytogenes, Myc obacterium avium ssp. para-

tuberculosis und enterohämorrhagischen E.coli

2.12.1 Nachweis von Salmonella spp. mit PCR

Ablauf des Verfahrens

25 g Probenmaterial werden einer Anreicherung unterzogen. Das Anreicherungsmedium wird für die

PCR aufbereitet. In der PCR werden für Salmonella spp. spezifische Primer eingesetzt. Die Amplifika-

te werden nach Auftrennung in der Agarose-Gelelektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung detek-

tiert.

Referenzmaterial:

Salmonella Typhimurium ATTC 14028

Geräte/Hilfsmittel

Zusätzlich zu Materialien, die unter 2.4 (S.14) aufglistet sind:


• automatisches UV-Spektrophotometer Biophotometer (Eppendorf)

Nukleinsäure-Präparation

Die Aufarbeitung der Proben erfolgt jeweils in Doppelbestimmung.

Die Verwendung eines Extraktionskits ist möglich: Qiagen-DNeasy-Tissue-Kit zur DNA-Extraktion

(Protokoll für gram-negative Keime); alternativ dazu DNA-Extraktion nach CTAB-Methode

Polymerasekettenreaktion

Soweit möglich werden bei allen PCR-Ansätzen Positivkontrollen, Aufarbeitungsleerwert und Rea-

genzienleerwert mitgeführt:

Primer: [8]

invA 139 fw 5´- gTg AAA TTA TCg CCA CgT TCg ggC AA - 3´

invA 141 re 5´- TCA TCg CAC CgT CAA Agg AAC C - 3´

Primerkonzentration: 5 pmol/µl

Das Produkt aus diesen Primern ist 284 bp groß.



Abschlussbericht

Reaktionsansatz (25 µl):

z.B. mit HotStarTaq-Mastermix (Qiagen):

µl pro Ansatz

Wasser (steril) 2,5

invA 139 fw (5 pmol/µl) 2,5

invA 141 re (5 pmol/µl) 2,5

Universal Master-Mix (2x) 12,5

20,0

Der Mastermix (Reaktionsansatz) wird gemischt, und ggf. kurz zentrifugiert. Anschließend wird der

Mastermix in Reaktionsgefäße (z.B. 0,2 ml-Tubes) aliquotiert und jeweils 5 µl Template (DNA) zuge-

geben. Der Ansatz wird gemischt und ggf. kurz zentrifugiert.

Temperaturprogramm

Zeit Temperatur [°C]

Initiale Denaturierung 15 min 95

Denaturierung 30 s 95

Annealing 45 s 57

40 Zyklen

Extension 30 s 72

5 min 72

Auswertung

Die Auswertung erfolgt visuell im Agarosegel: Die Probe enthält Salmonellen - DNA, wenn ein PCR-

Produkt mit Fragmentlänge 284 bp im Gel erkennbar ist. Zur Größenabschätzung der Bande wird ein

Größenmarker (Basepairladder) mit auf das Gel aufgetragen. Die Gele werden per Photo oder Video-

ausdruck dokumentiert.

Die Reaktion ist nur auswertbar, wenn Positiv- und Negativkontrollen die erwartete Reaktion zeigen.



Abschlussbericht

2.12.2 Nachweis von Campylobacter coli und Campylob acter jejuni mit PCR


Nach spezifischer Anreicherung von Campylobacter (s. 2.1 S.12) aus dem Untersuchungsmaterial

wird die Nukleinsäure isoliert. In der PCR werden für Campylobacter jejuni / Campylobacter coli spe-

zifische Primer eingesetzt. Die Amplifikate werden nach Auftrennung in der Agarose-

Gelelektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung detektiert.

Referenzstämme:

Campylobacter jejuni DSM 4688

Campylobacter coli DSM 4689

Geräte/Hilfsmittel

Zusätzlich zu Materialien, die unter 2.4 (S.14) aufgelistet sind:






(Protokoll für gram-positive Keime); alternativ dazu DNA-Extraktion nach CTAB-Methode


Bei allen PCR-Ansätzen werden Positivkontrollen, Aufarbeitungsleerwert und Reagenzienleerwert

mitgeführt:

Primer:

flaA AW 50 fw 5´- ATg ggA TTT CgT ATT AAC AC - 3´

flaA AW 5 re 5´- gAT ATA gCT TgA CCT AAA gTA - 3´





Abschlussbericht


z.B. mit HotStarTaq-Mastermix (Qiagen):

µl pro Ansatz

Wasser (steril) 2,5

flaA AW50 fw (5 pmol/µl) 2,5

flaA AW 5 re (5 pmol/µl) 2,5


20,0




Temperaturprogramm für PCR-Cycler:




Annealing 45 s 60

40 Zyklen

Extension 30 s 72

Abschl. Elongation 5 min 72

Auswertung

Die Auswertung erfolgt visuell im Agarosegel: Die Probe enthält Campylobacter - DNA, wenn ein

PCR-Produkt mit Fragmentlänge von 197 bp im Gel erkennbar ist. Zur Größenabschätzung der Ban-

de wird ein Größenmarker (Basepairladder) mit auf das Gel aufgetragen.




Abschlussbericht

2.12.3 Nachweis von Listeria monocytogenes mit PCR


Nach spezifischer Anreicherung von Listerien aus dem Untersuchungsmaterial wird die Nukleinsäure

isoliert. In der PCR werden für Listeria monocytogenes spezifische Primer eingesetzt. Die Amplifikate

werden nach Auftrennung in der Agarose-Gelelektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung detektiert.

Referenzmaterial:

Listeria monocytogenes DSM 20600 bzw. ATCC 15313

Geräte/Hilfsmittel







(Protokoll für gram-positive Keime); alternativ dazu DNA-Extraktion nach CTAB-Methode



mitgeführt.

Primer :

LM1 [9] 5´- gAA AAA gCA TTT gAA gCC AT - 3´

LM2 [9] 5´- gCA ACT TCC ggC TCA gC - 3´

Alternativ:

L01 [10] 5´- Cgg Agg TTC CgC AAA AgA Tg - 3´

L04 [10] 5´- CCT CCA gAg TgA TCg Atg TT - 3´


Das Produkt aus dem Primerpaar L01-L04 ist 234 bp groß.

Das Produkt aus dem Primerpaar LM1-LM2 ist 149 bp groß



Abschlussbericht


z.B. HotStarTaq-Mastermix (Qiagen):

µl pro Ansatz

Wasser (steril) 2,5

L01 bzw. LM1 (5 pmol/µl) 2,5

L04 bzw. LM2 (5 pmol/µl) 2,5


20,0








Annealing 45 s 60

40 Zyklen

Extension 30 s 72


Auswertung

Die Auswertung erfolgt visuell im Agarosegel: Die Probe enthält Listeria monocytogenes - DNA, wenn

ein PCR-Produkt mit Fragmentlänge von 234 bp im Gel erkennbar ist. Zur Größenabschätzung der

Bande wird ein Marker (Basepairladder) mit auf das Gel aufgetragen. Die Reaktion ist nur auswertbar,

wenn Positiv- und Negativkontrollen die erwartete Reaktion zeigen.



Abschlussbericht

2.12.4 Nachweis von enterohämorrhagischen E. coli ( EHEC) mit PCR

Dieser Nachweis wird anhand der beschriebenen PCR-Methode in §35 LMBG geführt: Nachweis,

Isolierung und Charakterisierung Verotoxin-bildender Escherichia coli (VTEC) in Hackfleisch mittels

PCR und DNA-Hybridisierungstechnik L 07.18-1 (2002) [11].

2.12.5 Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratu berculosis (MAP) mit nested-PCR und

Agarosegeldetektion


DNA von Mykobacterien wird aus dem Untersuchungsmaterial (Milch) wird isoliert [12]. In der ersten

PCR werden für Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis spezifische äußere Primer eingesetzt, in

der zweiten, nested PCR wird ein inneres Primerpaar (d.h. innerhalb der Sequenz des äußeren

Amplikons liegend) verwendet [13]. Die Amplifikate werden nach Auftrennung in der Agarose-

Gelelektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung detektiert.

Geräte/Hilfsmittel





Die Aufarbeitung der DNA aus Milch-Proben erfolgt jeweils in Doppelbestimmung.

- 1 ml Milchprobe 10 min auf 100°C erhitzen

- im Eisbad abkühlen

- Zugabe von 50 µl [20mg/ml] Lysozym (Endkonzentration 1 mg/ml)

- Inkubation im Eisbad für 1 h

- Zugabe von 50 µl [20 mg/ml] Proteinase K (Endkonzentration 1 mg/ml)

- Zugabe von SDS zur Endkonzentration 1%

- Zugabe von EDTA zur Endkonzentration 0,1 Molar

- Inkubation bei 55°C über Nacht

- Bei 7000 rpm für 10 min zentrifugieren

- Anschließend Überstand in Wizard-Kit (s. 2.9.3 S. 26) einsetzen

Nach der DNA-Extraktion mit dem Wizard-Kit wird die DNA nochmals mit Microspin™ Säulchen

(Amersham) aufgereinigt



Abschlussbericht



mitgeführt. Die PCR wird als nested PCR, d.h. zuerst mit dem äußerem Primerpaar und dann im

nachfolgenden Ansatz mit dem innerem Primerpaar durchgeführt.

Primer:

Zielregion: IS900 Element, Position 204-766

Äußeres Primerpaar S204 [12] 5´- TgA TCT ggA CAA TgA Cgg TTA Cgg A - 3´

Äußeres Primerpaar S749 [12] 5´- CgC ggC ACg gCT CTT gTT - 3´

Amplikongröße: 563 bp

Inneres Primerpaar S347 [13] 5´- gCC gCg CTg CTg gAg TTg A - 3´

Inneres Primerpaar S535 [13] 5´- AgC gTC TTT ggC gTC ggT CTT g - 3´

Amplikongröße: 210 bp


µl pro Ansatz

Wasser (steril, RNase frei) 24

Primerpaar (je 10 pmol/µl) 1

Master-Mix (2,5x) 20

45

Der Mix wird gemischt, und ggf. kurz zentrifugiert. Anschließend wird der Mix in Reaktionsgefäße

(z.B. 0,2 ml-Tubes) aliquotiert und jeweils 5 µl Template (DNA) zugegeben. Der Ansatz wird gemischt

und ggf. kurz zentrifugiert.




Denaturierung 1 min 94

Annealing 1 min 63

35 Zyklen

Extension 1 min 72




Abschlussbericht

Auswertung

Die Auswertung erfolgt visuell im Agarosegel: Die Probe enthält Mycobacterium avium ssp. paratu-

berculosis - DNA, wenn ein PCR-Produkt mit Fragmentlänge von 210 bp im Gel der zweiten PCR

erkennbar ist, wobei zusätzlich nach der ersten PCR ein Produkt der Länge 563 bp erkennbar sein

sollte. Zur Größenabschätzung der Bande wird ein Marker (Basepairladder) mit auf das Gel aufgetra-

gen. Die Reaktion ist nur auswertbar, wenn Positiv- und Negativkontrollen die erwartete Reaktion

zeigen.

Kontroll-PCR für den Nachweis von amplifizierbarer Rind-Spezifischer DNA

Als Kontrolle für die PCR zum Nachweis von MAP werden die Proben zunächst auf amplifizierbare

DNA von Rind getestet. Soweit möglich werden bei allen PCR-Ansätzen Positivkontrollen, Aufarbei-

tungsleerwert und Reagenzienleerwert mitgeführt:

Primer: [14]

SIM fw 5´- gAC CTC CCA gCT CCA TCA AAC ATC TCA TCT TgA AA - 3´

SIM-Rind 141 re 5´- CTA gAA AAg TgT AAg ACC CgT AAT ATA Ag - 3´




µl pro Ansatz

Wasser (steril) 0,5

SIM fw (5 pmol/µl) 3,0

SIM-Rind 141 re (5 pmol/µl) 3,0

MgCl2-Lösung (25 mM) 1,0


20,0






Abschlussbericht

Temperaturprogramm




Annealing 30 s 60

35 Zyklen

Extension 40 s 72

3 min 72

Auswertung

Die Auswertung erfolgt visuell im Agarosegel: Die Probe enthält Rind-DNA, wenn ein PCR-Produkt

mit Fragmentlänge 274 bp im Gel erkennbar ist. Zur Größenabschätzung der Bande wird ein Grö-

ßenmarker (Basepairladder) mit auf das Gel aufgetragen. Die Gele werden per Photo oder Videoaus-

druck dokumentiert.




Abschlussbericht

2.13 Inhibitionskontrollen in der PCR

Für alle oben genannten PCR-Nachweismethoden können zur Überprüfung von ggf. falsch-negativen

Ergebnissen Inhibitionskontrollen wie folgt durchgeführt werden:

Inhibitionskontrolle

Wenn aus DNA-Extrakten keine Amplifikate erhalten werden (weder in Kontroll-PCR noch im eigentli-

chen Nachweis-System), so kann dies entweder durch Inhibition (Verunreinigungen in der Proben-

DNA-Lösung) oder aufgrund ungeeigneter (z.B. starke Fragmentierung) oder in zu geringen Mengen

vorhandener DNA bedingt sein.

Werden auch nach Verdünnen der Proben-DNA (z. B. 1:5 oder 1:10) keine Amplifikate erhalten, so

kann ein Spiking der Proben-DNA mit Positiv-Kontroll-DNA Aufschluss geben:

Ein zweiter Ansatz der Proben-DNA wird mit Positiv-Kontroll-DNA in solchen Konzentrationen (Ko-

pienzahlen) versetzt, dass sie ohne Inhibition noch sicher nachweisbar wäre.

Wenn auch in diesem Spiking-Ansatz als externe Inhibitionskontrolle keine Amplifikate erhalten wer-

den, liegt sehr wahrscheinlich eine Inhibition der Polymerase durch Verunreinigungen im DNA-Extrakt

vor. In solchen Fällen ist eine weitergehende Aufreinigung der DNA-Lösung bzw. die Verwendung

eines alternativen Extraktionsverfahrens erforderlich.

Tab. 2: Auswertung des PCR-Ergebnisses bei der Verwendung einer Inhibitionskontrolle

Reaktion Doppelansatz mit

Spiking-DNA

Target-Ansatz Wertung

Positivkontrolle - positiv Reaktion auswertbar

Positivkontrolle - negativ Reaktion nicht auswertbar

Negativkontrolle - negativ Reaktion auswertbar

Negativkontrolle - positiv Reaktion nicht auswertbar, vermutlich

Kontamination der Reagenzien

Probe positiv positiv Reaktion auswertbar, Keim

molekularbiologisch nachgewiesen

Probe positiv negativ Reaktion auswertbar, Keim

molekularbiologisch nicht nachgewiesen

Probe negativ negativ Reaktion nicht auswertbar, Inhibition

Tab. 2: Auswertung der PCR bei Kontrolle der Inhibition durch einen Spiking-Ansatz



Abschlussbericht

2.14 Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen von Salmonel la spp., Campylobacter coli

und jejuni, Listeria monocytogenes und enterohämorr hagischer E.coli mittels

Real-Time PCR

2.14.1 Theoretische Grundlagen der Real-Time-PCR

Bei der Real-Time PCR wird wie bei der qualitativen PCR durch eine enzymatische Reaktion im Ver-

lauf von mehreren Zyklen eine Zielsequenz vervielfältigt. Anders als bei der qualitativen PCR, bei der

eine Endpunkt-Detektion erfolgt, wird die Menge des amplifizierten Produktes dadurch quantifiziert,

dass es anhand einer Fluoreszenzmarkierung nachgewiesen wird [15]. Dieser Fluoreszenzfarbstoff

emittiert bei Anregung ein Lichtsignal, dessen Intensität im gleichen Maß zunimmt wie die Menge an

amplifizierter DNA. Dadurch kann die Menge der Target-DNA im Ausgangsmaterial ermittelt werden

(Abb. 1).

Bei der qualitativen PCR erbringt die Auftrennung der Amplifikate in der Elektrophorese nur einen

Nachweis des Fragments anhand seiner Größe und muss daher in einem zusätzlichen Schritt auf die

korrekte Sequenz (z. B. Restriktionsverdau, Hybridisierung, Sequenzierung) überprüft werden. Im

Gegensatz dazu erfolgt bei der Real-Time PCR eine simultane Amplifikation, Detektion und Verifizie-

rung der Amplifikate durch die Verwendung sequenzspezifischer Sonden. Diese Sonde hybridisiert

auf der gesuchten Sequenz zwischen Vorwärts- und Rückwärts-Primer. Bei der Verwendung soge-

nannter Taqman-Probes wird die Oligonucleotid-Sonde mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt,

einem sogenannten Reporter und einem Quencher-Farbstoff. Solange die beiden Farbstoffe der Son-

de in räumlicher Nähe zueinander vorliegen, wird kein Reporter-Farbstoff gemessen. Die 5’-3’-

Exonuclease-Aktivität der Taq-Polymerase bewirkt bei der Verlängerung der Primer auf dem DNA-

Template-Strang ein Abspalten der Sonde, was eine räumliche Trennung der beiden Fluoreszenz-

farbstoffe zur Folge hat. Dadurch kann der Reporter-Farbstoff als Fluoreszenzsignal erfasst werden.

Da sich die Zahl der abgespaltenen Sonden-Moleküle proportional zum PCR-Produkt mit jedem Zyk-

Abb. 1:

Funktionsweise der

Taqman-Sonde in der

Realtime-PCR



Abschlussbericht

lus vergrößert, steigt auch die Intensität des gemessenen Fluoreszenzsignals entsprechend (Abb.1)

[16].

Das Fluoreszenzsignal wird in Form einer Kurve aufgezeichnet, die ein Abbild für die Entstehung und

Menge des PCR-Produkts darstellt. Dadurch erhält man auch Aufschluss darüber, wie hoch die Kon-

zentration der Template-DNA im Ansatz war. Die Anzahl der Zyklen, die benötigt werden, bis das

Fluoreszenzsignal einen definierten Schwellenwert überschreitet, wird als Ct -Wert (threshold cycle)

bezeichnet. Diese experimentell bestimmte Größe ist dabei proportional zum Logarithmus der DNA-

Template-Menge im Reaktionsansatz. Das heißt, aus den Ct -Werten der zu untersuchenden Proben

kann über absolute oder relative Quantifizierung die ursprünglich vorhandene DNA-Menge in der

Probe ermittelt werden.

Vorteilhaft ist Einsatz der Real Time PCR auch ohne Quantifizierung zum Nachweis von Mikroorga-

nismen, da dieses Verfahren auch dann angewendet werden kann, wenn z.B. die phänotypischen

Merkmale des Keims keine sichere Aussage erlauben oder wenn keine eindeutig biochemisch cha-

rakterisierten Referenzstämme zur Verfügung stehen.

2.14.2 Real-Time PCR mit SYBR-Green

Zur Optimierung von Real-Time Methoden wird die Real-Time PCR zunächst ohne spezifische Sonde

durchgeführt. Dabei wird das Fluoreszenzsignal über Doppelstrang-DNA-bindende Fluoreszenzfarb-

stoffe generiert. Der hier verwendete Farbstoff SYBR-Green I bindet sequenzunabhängig in der klei-

nen Furche doppelsträngiger DNA-Moleküle. Gebundener Farbstoff fluoresziert nach Anregung etwa

tausendmal stärker als frei vorliegender Farbstoff und eignet sich daher, die Anreicherung dop-

pelsträngiger PCR-Produkte in der Real-Time PCR sichtbar zu machen.

Folgendes Standardprotokoll wird für die PCR mit SYBR-Green im LightCycler (Roche Diagnostics

Mannheim) verwendet:


z.B. mit LC FastStart DNA Master SybrgreenI (Roche Diagnostics):

µl pro Ansatz

Wasser (steril) 11,4

Primer fw [10 µM] 1,5

Primer re [10 µM] 1,5

MgCl2 [25 mM] 1,6

LC FastStart DNA Master Sybrgreen 2

18,0



Abschlussbericht


Mastermix in die Reaktionsgefäße (Glaskapillaren für LightCycler von Roche Diagnostics, Mannheim)

aliquotiert und jeweils 2 µl Template (DNA) zugegeben. Der Ansatz wird kurz zentrifugiert.

Temperaturprogramm

Zeit Temperatur [°C] Datensammlung

Initiale Denaturierung 10 min 95 nein

Denaturierung 5 s 95 nein

Annealing 10 s 55 nein

Extension 8 s 72

45 Zyklen

ja

Einstellungen: Acquisition mode: single

2.14.3 Nachweis von Salmonella spp. mit der Real-Ti me PCR

25 g Probenmaterial werden einer Anreicherung unterzogen. Das Anreicherungsmedium wird für die

PCR aufbereitet. In der Real-Time PCR werden für Salmonella spp. spezifische Primer und eine Son-

de eingesetzt. Die entstehenden Amplifikate werden nach Anlagerung sequenzspezifischer Sonden

durch Erzeugung eines Fluoreszenz-Signals gemessen.

Referenzmaterial:

Salmonella Typhimurium ATTC 14028

Geräte/Hilfsmittel



• GeneAMP Sequence Detection System (Applied Biosystems ABI) bzw. LightCycler-System (Ro-

che Diagnostics, Mannheim)




Soweit möglich, werden bei allen PCR-Ansätzen Positivkontrollen, Aufarbeitungsleerwert und Rea-

genzienleerwert mitgeführt:



Abschlussbericht

Primer und Sonde:

invA 139 fw [8] 5´- gTg AAA TTA TCg CCA CgT TCg ggC AA - 3´

invA 141 re [8] 5´- TCA TCg CAC CgT CAA Agg AAC C - 3´

Sal invA-SO_1-WH 5´- CTC Tgg ATg gTA TgC CCg gTA AAC A – 3´


Sondenkonzentration: 2 pmol/µl; FAM-TAMRA-Fluoreszenzmarkierung



z.B. mit Taqman Universal PCR Master Mix:

µl pro Ansatz

Wasser (steril) 1,0

invA 139 fw (5 pmol/µl) 2,0

invA 141 re (5 pmol/µl) 2,0

Sal invA-SO_1-WH (2 pmol/µl) 2,5

Taqman Universal PCR Master Mix (2x) 12,5

20,0




Temperaturprogramm

z.B. Perkin Elmer GeneAMP Sequence Detection System

Zeit Temperatur [°C] Daten-

sammlung

UNG-Schritt 2 min 50 nein


Denaturierung 15 s 95 ja

Annealing und Extension 60 s 60

45 Zyklen

Einstellungen: Volumen: 25 µl



Abschlussbericht

Auswertung


Ein Ct -Wert in beiden Ansätzen der Doppelbestimmung von � 40 zeigt sicher positive Resultate an.

Durchschreitet nur einer der beiden Ansätze der Doppelbestimmung den Threshold von � 40, so gilt

die Probe als verdächtig. Bei Ct -Werten zwischen 40 und 45 wird die Probe als verdächtig eingestuft

und weitergehend untersucht.

Die Auswertung erfolgt gemäß Manual von PE Applied Biosystems.

Hinweise:

• Nulllinie in der linearen Darstellung festlegen (in der Regel zwischen dem 5. und 20. Zyklus).

• Wahl eines geeigneten Thresholds in der logarithmischen Darstellung (in der Regel circa 0,03 –

0,05).

• Die Menge vorhandener DNA (Kopienzahl) wird durch den Ct -Wert definiert.

2.14.4 Nachweis von Campylobacter coli und Campylo bacter jejuni mittels Real-Time PCR

Nach spezifischer Anreicherung von Campylobacter aus dem Untersuchungsmaterial wird die Nuk-

leinsäure isoliert. In der Real-Time PCR werden für Campylobacter jejuni / Campylobacter coli spezi-

fische Primer und eine Sonde eingesetzt. Die Amplifikate werden nach Anlagerung sequenzspezifi-

scher Sonden durch Erzeugung eines Fluoreszenz-Signals gemessen.

Referenzmaterial:

Campylobacter jejuni DSM 4688

Campylobacter coli DSM 4689

Geräte/Hilfsmittel









mitgeführt:



Abschlussbericht

Primer und Sonde:

flaA AW 50 fw 5´- ATg ggA TTT CgT ATT AAC AC - 3´

flaA AW 5 re 5´- gAT ATA gCT TgA CCT AAA gTA - 3´

flaA AW SO 5´- CTA TCg CCA TCC CTg Aag CAT CAT CTg – 3´


Sondenkonzentration: 5 pmol/µ; FAM-TAMRA-Fluoreszenzmarkierung




µl pro Ansatz


flaA AW50 fw [10 µM] 2,25

flaA AW 5 re [10 µM] 2,25

flaA AW SO (5 pmol/µl) 0,75

Taqman Universal PCR Master Mix (2x)

12,5

20,0




Temperaturprogramm:



sammlung





45 Zyklen




Abschlussbericht

Auswertung







Die Ergebnisse der Untersuchung und die Daten des Real-Time PCR-Geräts werden in geeigneter

Form dokumentiert

Hinweise:



0,05).

• Die Menge vorhandener DNA (Kopienzahl) wird durch den Ct-Wert definiert.

2.14.5 Nachweis von Listeria monocytogenes mittels Real-Time PCR

Nach spezifischer Anreicherung von Listerien aus dem Untersuchungsmaterial wird die Nukleinsäure

isoliert. In der Real-Time PCR werden für Listeria monocytogenes spezifische Primer und eine Sonde

eingesetzt. Die Amplifikate werden nach Anlagerung sequenzspezifischer Sonden durch Erzeugung

eines Fluoreszenz-Signals gemessen.

Referenzmaterial:

Listeria monocytogenes DSM 20600 bzw. ATCC 15313

Geräte/Hilfsmittel









Abschlussbericht



mitgeführt:

Primer und Sonde:

LM1 [9] 5´- gAA AAA gCA TTT gAA gCC AT - 3´

LM2 [9] 5´- gCA ACT TCC ggC TCA gC - 3´

Sonde LM1-LM2 5´- ggTCAgAGTgAAgCTCATgTgAAAAgTTATgT


Sondenkonzentration: 5 pmol/µl; FAM-TAMRA-Fluoreszenzmarkierung




µl pro Ansatz


LM1 (5 pmol/µl) 2,5

LM2 (5 pmol/µl) 2,5

Sonde LM1-LM2 (5 pmol/µl) 0,75

Taqman Universal PCR Master Mix (2x) 12,5

20,0




Temperaturprogramm:



sammlung





45 Zyklen




Abschlussbericht

Auswertung







Die Ergebnisse der Untersuchung und die Daten des Real-Time PCR-Geräts werden in geeigneter

Form dokumentiert

Hinweise:



0,05).

• Die Menge vorhandener DNA (Kopienzahl) wird durch den Ct -Wert definiert.



Abschlussbericht

2.14.6 Nachweis von enterohämorrhagischem E.coli (E HEC) mit der Real-Time PCR

Dieses Prüfverfahren beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von DNA-Sequenzen von zwei bakteri-

ellen Shigatoxingenen stx 1 und stx 2 mittels Real Time PCR (LightCycler, Roche). Das Verfahren

eignet sich sowohl zum Nachweis mit reiner, isolierter DNA, als auch mit abgetöteten Bakterienzellen.

Nach der Freisetzung der DNA aus den Bakterienzellen werden mittels zwei verschiedener

Amplifikationsprimer ein charakteristisches DNA Fragment für das stx 1 Gen und das stx 2 Gen

mittels Real-Time PCR amplifiziert. Mit zwei Sondensystemen (zwei Sonden pro Sondensystem)

wird das Fragment spezifisch auf für stx 1 und stx 2 charakteristische DNA Sequenzen hybridi-

siert und im LightCycler detektiert.

Chemikalien / Materialien

Primer: stx 1 und stx 2-spezifisch:

STEC-1 [17] 5’-GA(A/G) C(A/G)A AAT AAT TTA TAT GTG-3’

STEC-2 [17] 5’-TGA TGA TG(A/G) CAA TTC AGT AT-3’

Sonden: stx 1-spezifisches Sondensystem:

STEC-I HP-1 [17] 5’-TTT ACG TTT TCG GCA AAT ACA GAG GGG AT-[FL]-3’

STEC-I HP-2 [17] 5’-[Red 640] -TCG TAC AAC ACT GGA TGA TCT CAG TGG G-g-Ph -3’

Sonden: stx 1-spezifisches Sondensystem: STEC-II HP-1 [17] 5’- TCA GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC TGT GTA-[FL] -3’

STEC-II HP-1 [17] 5’- [Red 705 ] TAC AAC ACT GGA TGA TCT CAG TGG G-g-Ph -3’

FL: Fluorescein

Red 640: LC Red 640-N-Hydroxysuccinimidester

g: Guanosin

Ph: Phosphat

Red 705: LC Red 705-Phosphoramidit

Positiv-Kontroll-DNA

aus Referenzstämmen [11]:

E. coli Toxingene

E.coli C 600 -

E.coli C 600 J1 stx 1

E.coli C 600 W34 stx 2

E.coli 162-84 (B2) stx 1,stx 2, eae, hly



Abschlussbericht

Geräte/Hilfsmittel



• LightCycler-System (Roche Diagnostics, Mannheim)



Mastermix für 25 µl-Ansätze:

• Es wird das DNA-Polymerase System „FastStart DNA Master Hybridization Probes“, Roche ver-

wendet.

• Zusammenstellung der Pipettiervolumina je nach Anzahl der Ansätze:

Reagenzien Einzelreagenzien

(z.B. AmpliTaq, Applied

Biosystems) [µl]

steriles H2O 7,6

HYB Mastermix 2

MgCl2 (25 mM) 2,4

Primer STEC-1 (0,5 µM) 1

Primer STEC-2 (0,5 µM) 1

Sonde STEC-I HP-1 (0,2 µM) 1

Sonde STEC-I HP-2 (0,2 µM) 1

Sonde STEC-II HP-1 (0,2 µM) 1

Sonde STEC-II HP-2 (0,2 µM) 1

Verteilung des Mastermixes auf PCR-Tubes: je 18,0 µl

Zugabe von DNA-haltiger Lösung:

• Proben-DNA: je 2 µl zugeben.

Werden größere Volumina an DNA Lösungen zum Mastermix zugegeben, muss das Volumen von

zugegebenem Wasser angepasst werden. Bei Anzeichen auf Inhibition der PCR durch Bestandtei-

le im Probenextrakt, können Verdünnungen von 1:10 bis 1:100 eingesetzt werden.

• Positiv-Kontroll-DNA: 2 µl zugeben.

• Positiv-Kontroll-DNA: 2 µl zugeben



Abschlussbericht

PCR-Temperatur-Zeit-Programm

PCR-Temperatur-Zeit-Programm für Light Cycler, Roche und einem Enzym mit Hotstart-Technik.


Initiale Denaturierung 10min 95

Denaturierung 10 sec 95

Annealing 20 sec 50

Extension 30 sec 72

50 Zyklen

Auswertung

Das Ergebnis der Amplifikation kann in Echtzeit am Real-Time Gerät verfolgt werden. Als positiv gel-

ten Proben, bei denen das Fluoreszenzsignal den Threshold übersteigt.



Abschlussbericht

2.15 Inhibitionskontrollen für die Real-Time PCR:

2.15.1 Interne Amplifikationskontrolle als Inhibiti onskontrolle bei Real-Time PCR

Wird eine interne Amplifikationskontrolle (IPC) im Duplex-Ansatz verwendet und die PCR in einem

Gerät für Mehrfarben-Detektion durchgeführt, so stellt sich die Auswertung folgendermaßen dar (Tab.

3):

Reaktion IPC (VIC-Kanal) Target (FAM-Kanal) Wertung

Positivkontrolle positiv positiv Reaktion auswertbar

Positivkontrolle negativ negativ Reaktion nicht auswertbar

Negativkontrolle positiv negativ Reaktion auswertbar

Negativkontrolle positiv positiv Reaktion nicht auswertbar, vermutlich




Probe positiv negativ Reaktion auswertbar, Keim moleku-

larbiologisch nicht nachgewiesen


2.15.2 Externe Inhibitionskontrolle für die Real-Ti me PCR

Wenn aus DNA-Extrakten keine PCR-Amplifikate erhalten werden (weder in Kontroll-PCR noch im

eigentlichen Nachweis-System), so kann dies entweder durch Inhibition (Verunreinigungen in der

Proben-DNA-Lösung) oder aufgrund ungeeigneter (z.B. starke Fragmentierung) oder in zu geringen

Mengen vorhandener DNA bedingt sein.

Werden auch nach Verdünnen der Proben-DNA (z.B. 1:5 oder 1: 10) keine Amplifikate erhalten, so

kann Spiken der Proben-DNA mit Positiv-Kontroll-DNA Aufschluss geben:

Ein zweiter Ansatz der Proben-DNA wird mit Positiv-Kontroll-DNA in solchen Mengen (Kopienzahlen)

gespikt, dass sie ohne Inhibition noch sicher nachweisbar wäre. Wenn auch in diesem Spiking-Ansatz

als externe Inhibitionskontrolle keine Amplifikate erhalten werden, liegt sehr wahrscheinlich eine Inhi-

bition der Polymerase durch Verunreinigungen im DNA-Extrakt vor. In solchen Fällen ist eine weiter-

gehende Aufreinigung der DNA-Lösung bzw. die Verwendung eines alternativen Extraktionsverfah-

rens erforderlich.

Tab. 3: Auswertung der PCR bei Verwendung einer internen Inhibitionskontrolle



Abschlussbericht

Auswertung bei Verwendung einer externen Inhibition skontrolle

Wird eine externe Amplifikationskontrolle verwendet, so stellt sich die Auswertung der PCR-Resultate

folgendermaßen dar (Tab. 4):

Reaktion Doppelansatz mit

Spiking-DNA

Target (FAM-Kanal) Wertung

Positivkontrolle - positiv Reaktion auswertbar

Positivkontrolle - negativ Reaktion nicht auswertbar

Negativkontrolle - negativ Reaktion auswertbar

Negativkontrolle - positiv Reaktion nicht auswertbar, vermutlich




Probe positiv negativ Reaktion auswertbar, Keim moleku-

larbiologisch nicht nachgewiesen


2.15.3 Nachweis einer internen Positivkontrolle (IP C) als Amplifikationskontrolle der Real-

Time PCR

Es werden ca. 50 Kopien einer klonierten Plasmid-DNA aus einem Fragment von Nicotiana tabacum

als interne Positivkontrolle in die Real-Time PCR eingesetzt. Der Nachweis erfolgt mit einer spezifi-

schen, HEX-TAMRA markierten Sonde. Die entstehenden Amplifikate werden nach Anlagerung se-

quenzspezifischer Sonden durch Erzeugung eines Fluoreszenz-Signals gemessen.

Primer und Sonde:

ntb 2 AW fw 5´- ACCACAATGCCAGAGTGACAAC - 3´

ntb 2 AW re 5´- TACCTGGTCTCCAGCTTTCAGTT - 3´

ntb 2-AW-SO 5´- CACGCGCATGAAGTTAGGGGACCA – 3´


Sondenkonzentration: 2 pmol/µl


Tab. 4: Auswertung der Real-Time PCR bei Verwendung einer externen Inhibitionskontrolle



Abschlussbericht



µl pro Ansatz

ntb 2 AW fw (5 pmol/µl) 2,5

ntb 2 AW re (5 pmol/µl) 2,5

ntb 2-AW-SO (1,5 pmol/µl) 2,5

Universal Taqman-Mix (2x)

Taqman Universal PCR Master Mix (2x)

12,5

19,0

ntb 2-Plasmid-DNA (ca. 50 Kopien/µl) 1,0

20

Der Mastermix (Reaktionsansatz) wird gemischt, und ggf. kurz zentrifugiert. Zu diesem Mastermix

werden je 1 µl ntb2-Plasmid-DNA einer Konzentration von ca. 50 Kopien/µl zugegeben, der Mix ge-

mischt und ggf. kurz anzentrifugiert. Anschließend wird der Mastermix in Reaktionsgefäße (z.B. 0,2

ml-Tubes) aliquotiert und jeweils 5 µl Template (DNA) zugegeben. Der Ansatz wird gemischt und ggf.

kurz zentrifugiert.

Temperaturprogramm



sammlung





45 Zyklen


Auswertung

s. 2.15.1 (S.56)



Abschlussbericht

2.15.4 Klonierung eines Fragments aus Nicotiana tab acum zur Verwendung als Template für

die Interne Positivkontrolle (IPC) in der Real-Time PCR

Als Template für die interne Positivkontrolle (IPC) der Real-Time PCR wurde ein Fragment aus Nico-

tiana tabacum gewählt, und in E.coli kloniert. Die Plasmid-DNA wurde extrahiert, aufgereinigt, zur

Bestätigung sequenziert und in geeigneter Verdünnung als IPC eingesetzt.

Die Klonierung erfolgte mit dem pGEM -T and pGEM -T Easy Vector Systems Cloning Kit (Prome-

ga). Es wurde nach der Anleitung des Kits vorgegangen.



Abschlussbericht

2.16 DNA-Biochip-Analytik zum parallelen Nachweis me hrerer pathogener Keime

2.16.1 Theoretische Grundlagen der DNA-Biochip-Anal ytik

Unter Biochips (in diesem Falle DNA- bzw. Oligonucleotidchips) versteht man einen festen Träger,

auf dessen Oberfläche DNA-Moleküle in definierter Anordnung (Array) immobilisiert sind [18].

Die spezifischen Wechselwirkungen der auf dem Biochip fixierten Sonden mit in Lösung befindlichen

Biomolekülen können gemessen werden. Biochips ermöglichen parallel die spezifische Untersuchung

auf mehrere Zielsequenzen. Bei dem Verfahren handelt es sich um die Kombination einer PCR mit

anschließender Hybridisierung der Amplifikate und Visualisierung anhand von Fluoreszenzsignalen.

Der hier eingesetzten NUTRI-Chip-Methode liegen insgesamt 6 Nachweissysteme zugrunde, die in

einer Multiplex-PCR Reaktionen zusammengefasst werden. Nach Voranreicherung der zu untersu-

chenden Lebensmittelprobe und Extraktion der DNA werden zunächst die gesuchten DNA-

Sequenzabschnitte parallel in einer Multiplex-PCR-Reaktion vervielfältigt. Durch Verwendung von

modifizierten Nukleotiden in der Reaktion werden die PCR-Produkte während der Amplifikation mar-

kiert. Nach dem Exonuklease-Verdau der PCR-Produkte werden die generierten DNA-Einzelstränge

auf dem NUTRI-Chip selektiv an räumlich getrennte Felder mit kovalent gebundenen DNA-Sonden

hybridisiert. Diese Sonden sind für das jeweilige Nachweissystem spezifisch. Nicht gebundene Ein-

zelstränge werden in den anschließenden Waschschritten entfernt. Die modifizierten Nukleotide der

gebundenen DNA-Moleküle werden mit einem Fluoreszenzfarbstoff angefärbt und die jeweiligen

Hybridisierungsereignisse können dann in einem geeigneten Biochip-Lesegerät detektiert werden.

Die Hybridisierungssignale werden als Bilddateien aufgezeichnet und mit Hilfe einer speziellen Analy-

se-Software ausgewertet. Positive Fluoreszenzsignale zeigen an, dass z.B. die für einen pathogenen

Keim spezifischen DNA-Sequenzen amplifiziert wurden und damit nachgewiesen wurden (Abb. 2).

Durch die Mitführung interner Kontrollen wird die Qualität jedes Einzeltests abgesichert [19].

Abb. 2: Prinzip der

Hybridisierung auf dem Biochip



Abschlussbericht

Zum parallelen Nachweis von pathogenen Keimen wurden die von der Firma Genescan Europe AG

entwickelten Biochips und Reagenzien bezogen und die Proben nach der Anleitung des „NUTRI-

Chip-Kit“ analysiert.

2.16.2 Reagenzien und Materialien

• steriles, Aqua dest.

• NUTRI-Chip (Microarray mit gebundenen DNA-Sonden)1

• Mastermix für die Multiplex-PCR (gebrauchsfertiger Mastermix, enthält Hotstart DNA-Polymerase,

PCR-Puffer, dNTPs, Biotin-dUTP, MgCl2, Primergemisch)1

• PCR Kontroll-DNA (für NUTRI-Chip-Mastermix)1

• Exonuklease (50 units/µl) und Exonuklease-Puffer (5x)

• Chip-Hybridisierungslösung (ChipPure)1

• Waschlösung 1 (100 ml Konzentrat, vor Gebrauch mit 900 ml deionisiertem Wasser verdünnen)1

• Waschlösung 2 (202 ml Konzentrat, vor Gebrauch mit 798 ml deionisiertem Wasser verdünnen)1

• Färbelösung (ChipPure)1 1 für die gesamten Reagenzien (Mastermixe etc.) liegen hier keine genauen Angaben vor. Die Reagenzien wurden von der Firma GeneScan Europe AG bezogen.

2.16.3 Geräte

• BioDetect 645 Analysator (bzw. vergleichbares Biochip-Lesegerät)

• Variable Kolbenhubpipetten

• Mikrozentrifuge

• 2 Thermoblöcke (alternativ ist ein Thermocycler verwendbar)

• PCR-Gefäße

• PCR-Thermocycler (GeneAmp 9600 oder 9700, MJ-Research Cycler o. ä.)

• 2 Waschbehälter für Chips (z.B. Färbeküvette nach Hellendahl)

• Druckluft oder Stickstoffdruckgas

• Hybridisierungsbox

• Präparierpinzette (spitz zulaufend)

• Spritzflasche

• Temperierbares Wasserbad (evtl. Heizofen)

2.16.4 Durchführung der Analytik mittels NUTRI-Chip

Nach der Voranreicherung der Lebensmittelprobe wird in einem ersten Schritt die DNA mit der CTAB-

Extraktionsmethode aufgereinigt (s. 2.9.1 S. 22)



Abschlussbericht

Die genaue Beschreibung der anschließenden Analyse erfolgte entsprechend dem ausführlichen Ma-

nual des NUTRI-Chip Kits [20]. Im Überblick umfasste die praktische Ausführung die folgenden

Schritte:

• Ansetzen der Multiplex-PCR-Reaktion

• PCR-Lauf

• Einzelstrang-Verdau der PCR-Amplifikate

• Hybridisierung der einzelsträngigen Amplifikate mit den NUTRI-Chip-Sonden

• Waschen der Chips zum Entfernung überschüssiger od. nichtgebundener Amplifikate

• Färbung der hybridisierten Amplifikate auf dem Chip

2.16.5 Kontrollen

Bei jeder Extraktionsreihe mit Probenmaterialien wird eine Extraktionskontrolle (ohne Probe) mitge-

führt. Diese Lösung wird zur Kontrolle der Extraktion je einmal analysiert. Zur Kontrolle der PCR kann

wird eine „No-Template-Control“ Reaktion (Zugabe von Wasser) mit jeder PCR angesetzt werden.

Die Arbeitschritte der Multiplex-PCR und der Chip-Analyse wurden durch folgenden Reaktionen kon-

trolliert:

• Interne PCR-Kontrolle durch Hybridisierung der Amplifikate, die durch die PCR-Kontrolle entstan-

den, auf dem Chip

• Positive Hybridisierungkontrolle durch ein biotinyliertes anti-sense Oligonukleotid, das im Hybridi-

sierungsmix enthalten ist und durch eine spezifische DNA-Sonde auf dem Chip detektiert wird.

• Negative Hybridisierungskontrolle durch eine Chip-gebundene Sonde, die keine Homologie zu

einer der Ziel-DNA Sequenzen hat.

• Färbekontrolle mit einem biotinylierten Oligonukleotid

2.16.6 Auswertung

Die Messung erfolgte im Analysator Biodetect 645TM. Die Bilddateien wurden in folgendem Format

abgespeichert: Tagged image file format (.tif), 16 Bit Graustufe, 512 x 512 Pixel, Pixelauflösung 30

µm. Die Durchführung der Messung sowie die Auswertung der gespeicherten Bilder mit der Signalyse

NUTRI-Software ist ausführlich in dem Manual beschrieben.

Folgende Auswerteschritte wurden durchgeführt:

• Messung im Biodetect 645TM mit Ausleuchtungskorrektur und Speichern der Bilddatei

• Öffnen der Signalyse NUTRI- Software öffnen

• Bilddatei laden

• Array messen

• NUTRI-Chip auswerten und Ergebnisdateien speichern



Abschlussbericht

2.17 Methode zur Typisierung von Salmonella-Serovare n mittels Pulsfeldgele-

lektrophorese

2.17.1 Theoretische Grundlagen zur Pulsfeldgelelektr ophorese (PFGE)

Die Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) gehört zu den Typisierungsmethoden, mit Hilfe derer zwischen

Stämmen der gleichen Spezies differenziert werden kann. Die Technik ist eine Variation der normalen

Agarosegel-Elektrophorese, bei der nach einem Restriktionsverdau des gesamten Genoms die DNA-

Fragmente als Restriktionsprofil aufgetrennt werden [21]. Die Analyse mit PFGE ist eine komplexe

Methode, bietet aber eine hohe Diskriminationsfähigkeit und erlaubt dadurch die Zuordnung bakteriel-

ler Isolate zu bestimmten Ausbrüchen. Es lassen sich somit epidemiologische Abläufe, wie Infekti-

onsketten und die Verknüpfung von Krankheitsfällen mit den verursachenden Lebensmittelkontamina-

tionen nachvollziehen [22].

Die PFGE stellt eine modifizierte Submarine-Technik dar, es wird mit horizontalen „Submarine“-Gelen

gearbeitet, bei denen das Agarosegel direkt im Puffer liegt. Hochmolekulare DNA-Moleküle über 20kb

können durch konventionelle Elektrophorese nicht mehr aufgetrennt werden, da sie mit gleicher, limi-

tierender Mobilität wandern. Bei der PFGE wird daher statt des konstanten elektrischen Feldes ein

pulsierendes Feld angelegt, das ständig in verschiedene Richtungen wechselt („pulsiert“) [23]. Auf

diese Weise müssen die Moleküle wegen der Richtungsänderung des Feldes ihre Orientierung än-

dern, ihre Helixstruktur wird dabei zuerst gestreckt, bei Änderung des Feldes gestaucht. Die Zeit, die

das DNA-Molekül benötigt, um wieder zu relaxieren und sich bei Änderung des Feldes erneut auszu-

richten ist abhängig von der Molekülgröße. Dadurch bleibt nach Streckung und Umorientierung für

größere Moleküle - in der gegebenen Pulsdauer- weniger Zeit für die eigentliche elektrophoretische

Wanderung übrig. Die resultierende Mobilität ist abhängig von der Pulsationszeit und man kann so

eine Auftrennung nach Molekülgröße bis in die Größenordnung von 10 Megabasen erzielen [24].

Für die Analyse erfolgt die Probenvorbereitung inklusive Zellaufschluss in Agaroseblöckchen, die

dann in vorgeformte Geltaschen eingesetzt werden. Die großen DNA-Moleküle würden sonst beim

Pipettieren durch die Scherkräfte brechen. Die Pulsdauer reicht bei diesen Techniken von 1s-90min,

abhängig von den Längen der zu trennenden DNA-Moleküle. Bei längeren Pulszeiten werden größere

Moleküle besser aufgelöst, bei kürzeren Pulszeiten die kleinern. Die Trennungen können bis zu meh-

reren Tagen dauern. Bei der verwendeten CHEF-Methode (clamped-homogenous electric field) lie-

gen die Elektroden in hexagonaler Anordnung um das Gel vor. Die Gele werden mit Ethidiumbromid

gefärbt und die Banden sind dann unter UV-Licht sichtbar.

2.17.2 Standard-Protokoll für die PFGE

Verwendet wird das von dem „Forschungsnetzwerk Lebensmittelinfektionen in Deutschland“ ( „food-

borne-net“, German PFGE-Netzwerk „German PulseNet“) im Internet veröffentlichte Protokoll [25].



Abschlussbericht

Reagenzien

Zellsuspensionspuffer (CSB):

• 100 mM Tris

• 100 mM EDTA

• pH 8,0

TE Puffer:

• 10 mM Tris

• 1,0 mM EDTA

• pH 8,0

Lysepuffer

• 50 mM Tris

• 50 mM EDTA

• 1% Sarkosyl

• 0,1 mg/ml Proteinase K

• pH 8,0

TBE-Puffer

• 50 mM Tris

• 50 mM Borsäure

• 0,5 mM EDTA

Geräte

• CHEF-DR II Systems oder CHEF-DR III Systems für die PFGE von Bio-Rad

Präparation der Zellen

Es werden Zellen einer Übernachtkultur auf TSA-Agar oder in Flüssigmedium verwendet. Die Zellen

werden entweder von den Agarplatten abgeschwemmt bzw. nach Zentrifugation und Waschen des

Pellets und Resuspendieren in Zellsuspensionpuffer eingesetzt.

Die Zelldichte für die Vorbereitung der Agarose-Plugs sollte ca. 0.38-0.44 bei 450 nm (Mc Farland

Nr.5) betragen.

Herstellung der Agarose-Plugs:

• 1,6% Agarose (InCert) oder 2,0% Agarose (Biorad Chromosomal) in TE Puffer aufkochen

• Auf 50°C abkühlen lassen und 1% SDS (Endkonzentration ) zufügen



Abschlussbericht

• Zu der Zellsuspension 0,5 mg/ml (Endkonzentration) Proteinase K zugeben

• Zellsuspension im Verhältnis 1:1 mit der Agarose mischen

• Gemisch in die Formen für die Agarose-Plugs gießen und fest werden lassen

Lyse der Zellen in den Agarose-Plugs

• Nach dem Festwerden der Plugs, diese in Lysepuffer überführen und 2 h (Minimum) unter Schüt-

teln (Wasserbad) oder 4h ohne Schütteln bei 54°C inkub ieren.

Waschen der Agarose-Plugs

• Die Plugs werden bei 50° Grad unter Schütteln im Wasser bad gewaschen

• Zweimal in mind. 5 ml sterilem Aq. dest. waschen

• Zwei- bis dreimal in mind. 5 ml TE Puffer waschen

Die Plugs können in TE-Puffer bei 4°C mehrere Monate vor der weiteren Verwendung aufbewahrt

werden.

Restriktionsverdau in den Agarose-Plugs

• Plugs auf ca. 3 mm zurechtschneiden, in 50-100 ml Reaktionspuffer geben.

• Zugabe von 0,2-0,8 U/ml XbaI

• 4 h bei 37°C inkubieren

Herstellung des Agarosegels

• 1% Agarosegel (z.B. 100 ml für ein 13 cm x 14 cm Gel; BioRad-Agarose, Pulse Field Cert.) mit

0,5x TBE Puffer herstellen

• Agarose-Plugs in Geltaschen einpassen, verbliebene Lücken mit verflüssigter Agarose schließen

Laufbedingungen

• 2,0 l (für CHEF DR II) bzw. 2,5 l (für CHEF DR III) 0,5x TBE Puffer

• Beispiele für Laufbedingungen:

- 24 h, 6 V/cm (200V), Pulszeit 0,5 s - 60 s, 1% Agarose, Temperatur: 12°C

Auswertung

• Färben des Gels 10 min im Ethidiumbromidbad (Gel kann nicht nachgefärbt werden!)

• Aufnahme und Auswertung mit Bio-Rad-Software



Abschlussbericht

2.17.3 Bio-Rad-Methode

Alle Reagenzien aus Bio-Rad-Kit: CHEF Bacterial Genomic DNA Plug Kit

Vorgehensweise nach Protokoll des Kit

Ergebnisse 67 von 119 Seiten

3 Ergebnisse

3.1 DNA-Extraktion

Die Extraktion von Nukleinsäuren aus Lebensmittelanreicherungen wurde mit mehreren kommerziel-

len Kits und einer laboreigenen Methode ausgetestet. Es wurde jeweils bei den verschiedenen Ver-

fahren 1ml der Anreicherungskultur der Lebensmittelproben zur DNA-Extraktion eingesetzt. Vergli-

chen wurden der DNeasy Tissue Kit (Qiagen), der Wizard-Kit (Promega) und als laboreigenes Verfah-

ren die CTAB-Methode. Je 5µl des DNA-Extraktes wurden dann in die Real-Time PCR eingesetzt und

anschließend die Ergebnisse verglichen. Die mit den verschiedenen Extraktionsverfahren isolierte

DNA zeigte eine unterschiedliche Amplifikationseffizienz in der Real-Time PCR.

Unter den kommerziellen Kits schnitt der DNeasy Tissue Kit am Besten ab. Mit dem Wizard Kit konn-

te in mehreren Fällen, in denen die Anreicherungskultur eine sehr niedrige Konzentration der nach-

zuweisenden Keime enthielt, keine amplifizierbare DNA extrahiert werden. DNA-Extrakte, die mit dem

DNeasy Tissue Kit und auch mit der CTAB-Methode gewonnen wurden, konnten in der Regel amplifi-

ziert werden. Die Qualität der auf diese Weise aufgereinigten DNA ermöglichte eine langfristige Auf-

bewahrung ohne Konzentrationsverluste.

Die CTAB-Methode lieferte in den Versuchen die höchste DNA-Ausbeute, war allerdings im Vergleich

mit den kommerziellen Methoden das arbeits- und zeitaufwändigste Verfahren.

Zusätzlich zu den kommerziellen Methoden und der CTAB-DNA-Extraktion wurde als schnelles und

einfaches Verfahren die DNA-Extraktion durch Aufkochen (nach einem laboreigenen Protokoll) aus-

getestet.

Dies eignete sich vor allem, um DNA von Reinkulturen gram-negativer Keime zu gewinnen, die von

festen Nährmedien abgeschwemmt wurden. Es wird auf diese Weise eine hohe DNA-Ausbeute er-

zielt, allerdings war die gewonnene DNA nicht frei von störenden Begleitstoffen. Wird bloßes Aufko-

chen bei Proben aus Lebensmittelanreicherungen angewandt, verbleiben ohne weitere Aufreini-

gungsschritte oftmals Komponenten in der Lösung, die eine Amplifikation in der PCR stören können

oder ganz inhibieren.

Im Vergleich dazu wurde mit beiden kommerziellen Kits und mit der CTAB-Methode eine für die PCR

ausreichende Reinheit der DNA erzielt; nur in seltenen Fällen wurde bei komplexen Lebensmittelmat-

rices eine Inhibition der PCR festgestellt.



Abschlussbericht

Molekularbiologische Nachweismethoden für pathogene Keime

3.2 Nachweis von Salmonella spp.

3.2.1 Polymerasekettenreaktion (PCR) für Salmonella spp.

Ein molekularbiologischer Nachweis von Salmonellen mit Polymerasekettenreaktion (PCR) ist bereits

als DIN-Verfahren verabschiedet und basiert auf der Publikation von Rahn et al. [8]. Dabei wird ein

Abschnitt des invasionsassoziierten Gens invA amplifiziert und detektiert. Das Genprodukt, das Inva-

sionsprotein, erlaubt es den Bakterienzellen, in das Darmepithel einzudringen. Mit dem Primersystem,

das nach der Literatur [8] eine Spezifität von 99,4% aufweist, werden alle sechs Unterarten von Sal-

monella enterica erfasst.

Die amtliche Methode zum Nachweis von Salmonellen mit der Polymerasekettenreaktion [48] gliedert

sich in vier aufeinanderfolgende Schritte: Kulturelle Anreicherung der Lebensmittelprobe, DNA-

Extraktion, Amplifikation der gesuchten Nukleinsäuresequenz in der PCR und Detektion.

Im Rahmen dieses Projektes wurde die Methode nach Rahn et al. [8] etabliert und als Real-Time

PCR weiterentwickelt. Bei der PCR erfolgt dabei die Detektion der Amplifikate mittels Agarosegel-

elektrophorese.

3.2.2 Spezifität der PCR für Salmonella spp.

Im Rahmen dieses Projektes wurde die in der Literatur von Rahn [8] genannte Spezifität bestätigt.

Dazu wurden 71 Target-Stämme (Salmonella-Stämme) und 44 Nicht-Target-Stämme (Nicht-Sal-

monella-Stämme) in der PCR untersucht (nicht gezeigt). Die Target-Stämme repräsentierten sämtli-

che Subgruppen von Salmonella enterica. Es zeigten sich nur bei den 71 Salmonella-Stämmen Ban-

den der richtigen Größe von 284bp im Agarosegel. Alle Nicht-Target-Stämme ergaben keine bzw. nur

unspezifische Banden.



Abschlussbericht

3.2.3 Sensitivität der PCR für Salmonella spp.

Zur Ermittlung der Sensitivität der PCR wurden jeweils 5fach Replika von DNA-Verdünnungsstufen

eines Referenzstammes in den Konzentrationen von 5 ng bis 5 fg in die PCR-Reaktion eingesetzt. Es

konnte gezeigt werden, dass mit dem verwendeten System ca. 1-10 Kopien (5-50 fg) Salmonella

Typhimurium sicher nachgewiesen werden konnten. In Abb. 3 werden die Ergebnisse der PCR dar-

gestellt.

G 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 G 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 G

284 bp

Abb. 3: Sensitivität der PCR für Salmonella spp. Agarosegel-Aufnahme einer PCR mit genomischer

DNA von Salmonella Typhimurium; je 5 Replikate pro Verdünnungsstufe;

Gezeigte Verdünnungsreihe: 1-5 = 5 pg, 6-10 = 500 fg, 11-15 = 50 fg, 16-20 = 5 fg

Salmonella Typhimurium pro Reaktionsansatz; 21,22 = Negativkontrolle; G = Größenmarker



Abschlussbericht

3.2.4 Real-Time Polymerasekettenreaktion (PCR) für Salmonella spp.

Bei der Real-Time PCR läuft die Amplifikation der gesuchten DNA-Sequenzen und die Detektion mit

einer spezifischen Sonde simultan in einem einzigen Reaktionsansatz ab. Das Amplifikat wird se-

quenzspezifisch über die fluoreszenzmarkierte Sonde detektiert. Für den Salmonella-Nachweis wurde

das Primer-System von Rahn et al [8] mit einer neu entwickelten FAM (6-Carboxyfluorescein) -

TAMRA (6-Carboxytetramethylrhodamin) markierten Sonde kombiniert. Die Real-Time PCR wurde

mit dem GeneAMP 5700, 7500 und 7700 Sequence Detection System durchgeführt.

3.2.5 Spezifität der Real-Time PCR für Salmonella spp.

Die Spezifität der Sonde in Kombination mit den Primern wurde mit 100 Target-Stämmen (Salmonel-

la-Stämmen) (Tab. 6), die aus allen bekannten Subgruppen stammten und mindestens 30 Serotypen

umfassten, und 41 Nicht-Target-Stämmen (Tab. 5) in der PCR untersucht. Es zeigten sich nur bei den

100 Targetstämmen positive Resultate. Alle Nicht-Targetstämme ergaben ein negatives Resultat.

Salmonella Subgruppe Salmonella Subgruppe Nicht-Targets tämme Nicht-TargetstämmeS. Agona I S. Newport I Campylobacter coli Listeria welshimeriS. Anatum I S. Oranienburg I Campylobacter jejuni Moellerella wisconsensis

S. Arizonae IIIa S. Paratyphi I Campylobacter laridis Pantoea agglomeransS. bongori S. Panama I Cedecea davisae Proteus mirabilis

S. Bovismorbificans I S. Pullorum II Citrobacter freundii Proteus vulgaris

S. Brandenburg I S. Salamae I E. coli Providencia stuartii

S. Derby I S. Saint-Paul I Edwardsiella tarda Serratia marcescens

S. Dublin I S. Senftenberg I EHEC Shigella boydii

S. Enterica I S. Typhi I Enterobacter aerogenes Shigella dysenteriae

S. Enteritidis I S. Typhimurium I Enterobacter cloacae Shigella flexneri

S. Hadar I S. Vittzin I Enterobacter tarda Shigella sonnei

S. Heidelberg I S. Virchow I Ewingella americana Staphylococcus aureus

S. Houtenae IV Hafnia alvei Vibrio cholerae

S. Indica VI Klebsiella pneumoniae Vibrio damsella

S. Infantis I Listeria grayi Vibrio mimicus

S. Litchfield I Listeria innocua Vibrio parahaemolyticus

S. Livingstone I Listeria ivanovii Yersinia enterocolitica

S. Manhattan I Listeria monocytogenes Yersinia intermediaS. Montevideo I Listeria seeligeri

Tab. 5: Target-Stämme und Nicht-Target-Stämme, die für den Spezifitätstest des Real-Time PCR Systems

zum Nachweis von Salmonella spp. verwendet wurden.



Abschlussbericht

3.2.6 Sensitivität der Real-Time PCR für Salmonella spp.

Die Sensitivität der Real-Time PCR für Salmonella spp. wurde anhand von DNA-Verdünnungsreihen

aus Reinkulturen von Salmonella Typhimurium ermittelt. Hierbei wurde gezeigt, dass mit diesem Sys-

tem bis zu ca. 10 Kopien (ca. 100 fg) Salmonella-DNA pro Ansatz sicher nachweisbar sind (Abb. 4).

(5/5 Replikate waren positiv; für ca. 1 Kopie (ca.10 fg) waren 2 / 5 Replikaten positiv).

1ng 100pg 10pg 1pg 100fg 10f

1ng

100pg 10pg 1pg

100fg 10fg

Abb. 4: Sensitivität der Real-Time PCR für Salmonella spp.; Verdünnungsreihe

von Salmonella Typhimurium gemessen mit dem GeneAMP 7700;

Gezeigt sind die Amplifikationskurven von Reaktionsansätzen mit 1 ng - 10 fg

DNA pro Reaktion.

X-Achse: Zyklen der Real-Time PCR;

Y-Achse: Höhe des Fluoreszenzsignals als Rn (normalisiertes Reportersignal)

in logarithmischer Darstellung.

Je niedriger die Anfangskonzentration an Template-DNA umso weiter sind die

Kurven nach links verschoben, d.h. umso höher ist der Ct -Wert (Schwellen-

wertzyklus, s. 2.14.1 S. 44, 45).



Abschlussbericht

3.2.7 Relative Spezifität der Real-Time PCR für Salm onella spp. (im Vergleich zum kulturellen

Nachweis)

Zum Vergleich der molekularbiologischen Methode mit der kulturellen Referenzmethode wurden Le-

bensmittelproben aus der Routineanalytik zur Testung herangezogen. Die Proben wurden zunächst

mit der kulturellen Methode nach § 35 LMBG [7,49] (einschließlich Impedanzverfahren) untersucht

und im Anschluß daran mit der Real-Time PCR. Sie entstammten unterschiedlichen Lebensmittelka-

tegorien, wie z.B. Fleisch und Fleischerzeugnisse (Hackfleisch, Schweinefleisch, Rindfleisch, Mett-

wurst), Geflügel, Fisch, Süßwaren und Backwaren (Cremetorte, Schokolade, Tiramisu), Ei, Gewürze

und Tee. Es wurden 166 Lebensmittelproben untersucht, von denen 135 in der kulturellen Analyse

negativ waren und 31 ein Salmonella-positives Ergebnis erzielten. Alle 31 Proben waren auch in der

Real-Time-PCR positiv. Von den negativen Proben stimmen 134 Proben mit dem kulturellen Ergebnis

überein, eine Probe zeigte in der PCR Inhibition und konnte daher kein eindeutiges Ergebnis liefern

(Tab. 6).

3.2.8 Relative Sensitivität der Real-Time PCR für S almonella spp. im Vergleich zum kulturel-

len Nachweis - Dotierungsexperimente

Die Vergleichbarkeit der molekularbiologischen Methode mit der Referenzmethode, dem klassisch-

mikrobiologischen Nachweis von Salmonella spp. (§35-LMBG-Methode [49]), wurde in Zusammenar-

beit mit dem LGL München (Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittel) anhand von

dotierten Lebensmittelproben ermittelt. Folgende Lebensmittel wurden mit definierten Konzentratio-

nen einer Reinkultur von Salmonella Typhimurium dotiert: Hackfleisch, Geflügel, Lachs, Speiseeis,

Schokolade, Tiramisu, gemahlener Pfeffer, Knoblauchgranulat, Grüntee und Schwarztee. Die Proben

wurden jeweils mit einer errechneten Konzentrationen von 5 cfu (nahe der Nachweisgrenze) und 10

cfu pro 25 g Lebensmittel inokuliert. Nach einer Anreicherung von 18 h und von 24 h erfolgte die

DNA-Extraktion (s. 2.9.4 S. 27). Anschließend wurde die Real-Time PCR bzw. der kulturelle Nach-

weis von Salmonella spp. [49] durchgeführt.

Real-Time PCR

positiv negativ inhibiert Referenzmethode positiv 31 0 0 (kultureller negativ 0 134 1 Nachweis) inhibiert 0 0 0

gesamt 166

Tab. 6: Analyse von Lebensmittelproben auf Salmonella spp. mit Real-Time PCR im Vergleich

zum kulturellen Nachweis (Referenzmethode)



Abschlussbericht

Bei den Lebensmitteln Hackfleisch, Geflügel, Lachs, Speiseeis, Schokolade, Pfeffer und Tiramisu

konnte kulturell sowie mit Real-Time PCR in allen dotierten Proben Salmonella spp. nachgewiesen

werden. Das Knoblauchgranulat und der Grüntee zeigten im kulturellen Nachweis und mit der Real-

Time PCR in allen dotierten Proben negative Ergebnisse. Die parallel dazu durchgeführte Inhi-

bitionskontrolle der Real-Time PCR zeigte allerdings ein positives Ergebnis. Dies bedeutet, dass die

PCR-Reaktion dieser Proben nicht inhibiert war. Von den Schwarzteeproben war sowohl von den 18

h- als auch den 24 h -Anreicherungen eine der beiden niedrig dotierten (0-1 cfu / 25 g) Teilproben

kulturell negativ, die zweite Teilprobe und die höher dotierten (2 cfu / 25 g) Teilproben positiv. In der

Real-Time PCR waren alle 18 h-Anreicherungen negativ, von den 24 h-Anreicherungen zeigte jeweils

eine Teilprobe der niedrigeren sowie der höheren Dotierung ein positives Ergebnis. Bei allen negati-

ven Real-Time PCR-Resultaten war auch die Inhibitionskontrolle der PCR negativ, was auf eine Inhi-

bition dieser Reaktionsansätze hinweist (Tab. 7).



Abschlussbericht

Lebensmittel Anreicherung Dotierungszahl Proben- Ergebnis Ergebnis Real-Time PCR

experimentell ermittelt

anzahl kultureller Nachweis

PCR-Ansatz Inhibitions -kontrolle

Lachs 24 h 1 cfu / 25 g 2 + + / + + / + 24 cfu / 25 g 2 + + / + + / + Schokolade 18 h 1 cfu / 25 g 2 + + / + + / + 2 cfu / 25 g 2 + + / + + / + 24 h 1 cfu / 25 g 2 + + / + + / + 2 cfu / 25 g 2 + + / + + / + Tiramisu 24 h 2,5 cfu / 25 g 2 + + / + + / + 8 cfu / 25 g 2 + + / + + / + Knoblauch- 18 h 0-3 cfu / 25 g 2 - - / - + / + granulat 5 cfu / 25 g 2 - - / - + / + 24 h 0-3 cfu / 25 g 2 - - / - + / + 5 cfu / 25 g 2 - - / - + / + Hackfleisch 18 h 1 cfu / 25 g 2 + + / + + / + 5 cfu / 25 g 2 + + / + + / + 24 h 1 cfu / 25 g 2 + + / + + / + 5 cfu / 25 g 2 + + / + + / + Schwarztee 18 h 0-1 cfu / 25 g 2 + / - - / - - / - 2 cfu / 25 g 2 + / + - / - - / - 24 h 0-1 cfu / 25 g 2 + / - + / - + / - 2 cfu / 25 g 2 + / + + / - + / - Speiseeis 18 h 7-11 cfu / 25 g 2 + + / + + / + 6-8 cfu / 25 g 2 + + / + + / + 24 h 7-11 cfu / 25 g 2 + + / + + / + 6-8 cfu / 25 g 2 + + / + + / + schwarzer 18 h 11 cfu / 25 g 2 + + / + + / + Pfeffer 29,5 cfu / 25 g 2 + + / + + / + 24 h 11 cfu / 25 g 2 + + / + - / - 29,5 cfu / 25 g 2 + + / + + / + Geflügel 18 h 4,5 cfu / 25 g 2 + + / + + / + 9 cfu / 25 g 2 + + / + + / + 24 h 4,5 cfu / 25 g 2 + + / + + / + 9 cfu / 25 g 2 + + / + + / + Grüntee 18 h 0-1 cfu / 25 g 2 - - / - + / + 0-1 cfu / 25 g 2 - - / - + / + 24 h 0-1 cfu / 25 g 2 - - / - + / + 0-1 cfu / 25 g 2 - - / - + / +

Tab. 7: Relative Sensitivität der Salmonella-Real-Time PCR anhand künstlich kontaminierter Lebensmittel-

proben. Dargestellt sind die Ergebnisse des kulturellen Nachweises und der Real-Time PCR der unter-

schiedlichen Lebensmitteldotierungen. Die Real-Time PCR wurde im Doppelansatz durchgeführt und für

jeden Ansatz wurde eine Inhibitionskontrolle der PCR ausgeführt.



Abschlussbericht

3.2.9 Ringversuche zum Nachweis von Salmonella spp. mit Real-Time PCR

Die Real-Time PCR zum Nachweis von Salmonella spp. wurde in einem Ringversuch validiert. Ferner

wurden Proben einer Laborvergleichsuntersuchung für den kulturellen Nachweis auch mit der Real-

Time PCR untersucht. Hierbei wurden 15 Milchproben, von denen eine unbekannte Anzahl mit Sal-

monellen dotiert war, untersucht. Nach der Voranreicherung in Peptonwasser wurde die kulturelle

Nachweismethode und parallel dazu die Real-Time PCR durchgeführt. Als kulturelle Nachweismetho-

de wurde das Verfahren nach §35 LMBG [49] und parallel dazu das Impedanzverfahren verwendet.

Bei allen Proben wurden mit der Real-Time PCR die gleichen Ergebnisse wie mit dem kulturellen Ver-

fahren erzielt, 5 der 15 Proben ergaben negative Resultate, in den restlichen 10 Proben wurde Sal-

monella spp. nachgewiesen. Die 15 Proben waren wie folgt inokuliert: Bei Probe 1 - 5 handelte es

sich um nicht dotierte, sterilisierte Milch, Probe 5 - 10 war mit ca. 15 cfu/ml Salmonella Enteritidis do-

tiert und Probe 11 - 15 war mit ca. 51 cfu/ml Salmonella Enteritidis dotiert. In allen Proben, die mit

Salmonella Enteritidis dotiert waren, wurden diese auch mit der Real-Time PCR wiedergefunden.

Der Ringversuch war eine Vergleichsuntersuchung, bei der ausschließlich molekularbiologische Me-

thoden anzuwenden waren. DNA aus lyophilisiertem Probenmaterial unbekannter Herkunft wurde

direkt isoliert und ebenfalls mit der Real-Time-PCR untersucht. Auch dieser Ringversuch konnte er-

folgreich abgeschlossen werden. Zwei der vier Proben waren mit mittleren und höheren Konzen-

trationen an Salmonella spp. dotiert, welche als eindeutig positiv erkannt wurden. Eine Probe war

nicht dotiert und zeigte in der Real-Time PCR wie erwartet ein negatives Ergebnis. Die vierte Probe,

die mit einer grenzwertigen Salmonella-Konzentration dotiert war, zeigte ein fraglich positives Ergeb-

nis. Diese Probe wurde vom Versender des Ringversuchs aus der Endauswertung ausgeschlossen.



Abschlussbericht

3.2.10 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) von Salmone lla spp.

Die Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) gehört zu den Typisierungsmethoden, mit denen zwischen

Stämmen der gleichen Spezies differenziert werden kann. Die Technik ist eine Variation der normalen

Agarosegel-Elektrophorese, bei der nach einem Restriktionsverdau des gesamten Genoms die DNA-

Fragmente als Restriktionsprofil aufgetrennt werden. Mit der Analyse durch PFGE wurde die Typisie-

rung von acht verschiedenen Salmonella-Isolaten aus Lebensmittelproben vorgenommen. Sechs der

acht Isolate waren bereits mittels des Kauffmann-White-Schema [46] serologisch typisiert worden.

Zwei weitere Isolate, die aus einer Salmonella-positiven Fencheltee-Probe stammten, waren unbe-

kannt. Anhand der erzielten Bandenmuster konnten durch Vergleiche mit den bekannten Serovaren

die beiden unbekannten Isolate als Salmonella Agona identifiziert werden (Abb. 5).

LL: Größenstandard

1: Salmonella Infantis

2: Salmonella Schwarzengrund

3: Salmonella Cheester

4: Salmonella Blockley

5: unbekanntes Isolat 1


7: Salmonella Agona

8: Salmonella Hadar

WL: Isolat aus KKH Schwabing

coli: E.coli Stamm

CP: Control Plug Bio-Rad

Abb. 5: Gelbild der PFGE für Salmonella spp. nach BioRad-Methode. Dargestellt sind die Bandenmuster

der 8 Salmonella-Isolate. Das Bandenmuster der unbekannten Proben 5 und 6 ist identisch mit dem Mus-

ter von Salmonella Agona (Spur 7).



Abschlussbericht

Die PFGE wurde nach zwei verschiedenen Protokollen durchgeführt, zum einen nach dem vom For-

schungsnetzwerk „foodborne-net“ (German PFGE-Netzwerk) im Internet veröffentlichten Standard-

Protokoll [25] und zum anderen nach einem zeitlich aufwändigeren Protokoll des Bio-Rad-PFGE-Kit

„CHEF Bacterial Genomic DNA Plug Kit“. Beide Protokolle führten zum gleichen Ergebnis. Die Auf-

nahme nach dem Standard-Protokoll zeigt jedoch ein teils unklares Bandenmuster, das bei mehreren

Banden einen Schmier aufweist und bei zwei Ansätzen fehlende Banden. Die Aufnahme nach dem

Bio-Rad-Protokoll ergibt klare Bandenmuster mit besserer Auflösung, allerdings wurden vier Ansätze

gar nicht aufgetrennt und ergaben kein Bandenmuster (Abb. 6).

Abb. 6: Vergleich der PFGE für Salmonella spp. nach Standard-Protokoll (linke Gel-Aufnahme) und nach

BioRad-Protokoll (rechte Aufnahme).

Gel-Spuren:

LL: Größenstandard

1: Salmonella Infantis

2: Salmonella Schwarzengrund

3: Salmonella Cheester

4: Salmonella Blockley



7: Salmonella Agona

8: Salmonella Hadar

WL: Isolat aus KKH Schwabing

coli: E.coli Stamm

CP: Control Plug Bio-Rad



Abschlussbericht

3.3 Nachweis von Campylobacter coli und Campylobact er jejuni

3.3.1 PCR und Real-Time PCR für Campylobacter coli und jejuni

Ein Verfahren zum Nachweis von Campylobacter jejuni und Campylobacter coli durch Amplifizierung

spezifischer Gensequenzen wurde bereits vor einigen Jahren in Zusammenarbeit mit dem CVUA

Freiburg entwickelt und publiziert [26]. Das Verfahren beruht auf der Amplifikation und Detektion ei-

nes Sequenzabschnitts des Flagellin-Gens von Campylobacter. Das Flagellin-Gen ist am Aufbau der

Geißel beteiligt, die dem Organismus seine aktive Beweglichkeit verleiht.

Ebenso wie beim Salmonellen-Nachweis gliedert sich die Methode in die beschriebenen vier Schritte:

kulturelle Anreicherung, Nukleinsäureextraktion, Amplifikation der gesuchten Sequenz in der PCR

und Detektion. Als Methode zur DNA-Extraktion für die Untersuchung der Voranreicherungen aus

Lebensmittelproben wurde ein kommerzieller Kit (Qiagen-DNeasy-tissue Kit) eingesetzt. Ausgehend

von der veröffentlichten Methode [26] wurde der Sequenzabschnitt des PCR-Nachweissystems modi-

fiziert. Im Rahmen des vorliegenden Projektes wurden das Primer-System verändert und eine eigene

spezifische Real-Time-PCR-Sonde entwickelt. Das Nachweissystem wurde sowohl als PCR (mit Aga-

rosegeldetektion) als auch als Real-Time-PCR etabliert.

3.3.2 Entwurf und Optimierung des Primer-Sonden-Sys tems

In einem Alignment wurden anhand von Genbank-Einträgen [27] bekannte Sequenzen des Flagellin-

Gens von Campylobacter miteinander verglichen. Anhand dieser Aufstellung konnten entsprechend

der in 2.11.1 (S. 30) beschriebenen Kriterien geeignete Primer und Sonden gewählt werden. Zu-

nächst wurden verschiedene Primer-Sonden-Systeme entworfen und ihre jeweiligen Parameter mit

der in 2.11.1 (S. 30) genannten Software kalkuliert. Alle gewählten Primer und Sonden wurden in

einer Datenbank-Recherche auf ihre theoretische Spezifität geprüft. Solche Primer- und Sondense-

quenzen, die den erforderlichen Kriterien entsprachen, wurden in der Real-Time PCR experimentell

ausgetestet.

Dazu wurden zunächst nur die Primer-Systeme mit Hilfe der SYBR-green-Methode auf ihre Eignung

für die Real-Time PCR überprüft und durch Modifikationen der MgCl2 -Konzentration und der Primer-

konzentration optimiert. Das System, das die besten Signalkurven hinsichtlich Signalintensität, Stei-

gung der Kurve und hinsichtlich möglichst niedriger Ct -Werte einer definierten Template-DNA-

Konzentration erbrachte, wurde ausgewählt.

In Abb. 7 ist beispielhaft der Einfluss der Magnesiumionenkonzentration auf die Signalkurven eines

untersuchten Primer-Systems dargestellt. Eine optimale Magnesiumionenkonzentration ist dann er-

reicht, wenn hohe Signalintensitäten und gleichzeitig steile Kurven erzielt werden, d.h. die exponen-

tiellen Phasen möglichst weit nach links verschoben sind. Das weist auf eine hohe Amplifikationseffi-

zienz hin. Je besser die Parameter optimiert sind umso niedriger liegen auch die Ct -Werte für eine

definierte Template-DNA-Konzentration.



Abschlussbericht

Für die MgCl2 -Konzentration lag die optimierte Konzentration bei 3 mM.

Anschließend erfolgte in Kombination mit der Real-Time Sonde eine weitere Optimierung des am

besten geeigneten Systems für die Real-Time PCR. Dabei wurde die Sondenkonzentration und die

Annealingtemperatur variiert. Ausgewählt wurde schließlich die Kombination von Primern und Sonde,

die auf die höchste Amplifikationseffizienz hin optimiert war.

2 mM MgCl2 3 mM MgCl2 4 mM MgCl2 5 mM MgCl2 Negativkontrolle

Abb. 7: Optimierung eines Primer-Systems für Campylobacter coli und jejuni durch Modifikation der

MgCl2 -Konzentration. Eine hohe Signalintensität wird mit 4 mM MgCl2 erreicht, während mit 2 mM

bzw. 3 mM steilere Kurven erzielt werden. Niedrige Ct-Werte bei der vorliegenden Template-

Konzentration werden mit 3 mM - 5 mM MgCl2 erreicht. Eine optimale MgCl2-Konzentration nach die-

sen Ergebnissen könnte bei 3 - 4 mM liegen. Weitere (nicht gezeigte) Daten ergaben eine optimale

MgCl2 -Konzentration bei ca. 3 mM.



Abschlussbericht

3.3.3 Spezifität der Real-Time PCR für Campylobacter coli und jejuni

Die Spezifität des Primer-Systems und der Sonde für Campylobacter coli und jejuni wurde anhand

von 122 Stämmen und Isolaten überprüft. Es wurden 58 DNAs von Campylobacter coli und jejuni

untersucht (Target-Stämme) und als Kontrolle 64 Stämme anderer Spezies (Nicht-Target-Stämme).

Alle getesteten Target-Stämme ergaben ein positives Signal in der Real-Time PCR, während alle

Nicht-Target-Stämme ein negatives Ergebnis erzielten. Die Spezies der untersuchten Nicht-Target-

Stämme sind in der Tab. 9 aufgelistet.

Nicht-Target-Stämme Nicht-Target-Stämme Nicht-Target-Stämme

Campylobacter lari Listeria innocua Salmonella Newport

Campylobacter fetus Listeria monocytogenes Salmonella Paratyphi

Cedecea davisae Listeria ivanovii Salmonella Typhi

Citrobacter freundii Listeria seeligeri Salmonella Typhimurium

Edwardsiella tarda Listeria welshimeri Serratia marcescens

Enterobacter aerogenes Proteus mirabilis Shigella boydii

Enterobacter avium Providencia stuartii Shigella dysenteriae

Enterobacter cloacae Proteus vulgaris Shigella flexneri

Enterobacter tarda Pseudomonas aeruginosa Shigella sonnei

Enterococcus faecium Pseudomonas fluorescens Streptococcus mutans

Enterococcus hirae Pseudomonas putida Vibrio cholerae

E. coli Salmonella Agona Vibrio damsella

E. coli O 157 Salmonella Arizonae Vibrio mimicus

Escherichia hermanii Salmonella Bongori Vibrio parahaemolyticus

Hafnia alvei Salmonella Brandenburg Vibrio proteolyticus

Klebsiella pneumoniae Salmonella Enteritidis Yersinia enterocolitica

Legionella pneumophila Salmonella Hadar Yersinia intermedia

Listeria grayi Salmonella Infantis

Tab. 9: Nicht-Target-Stämme, die für die Ermittlung der Spezifität (Exklusivität) des

PCR-Systems für Campylobacter coli und jejuni verwendet wurden. Alle Nicht-Target-

Stämme waren in der Real-Time PCR negativ.



Abschlussbericht

3.3.4 Sensitivität der PCR und der Real-Time PCR fü r Campylobacter coli und jejuni

Die Sensitivität des gewählten Primer- und Sonden-Systems wurde anhand von DNA-Verdünnungs-

reihen von Reinkulturen von Campylobacter coli und Campylobacter jejuni mit der PCR und der Real-

Time PCR untersucht.

In der PCR mit anschließender Agarosegeldetektion sind bis zu ca. 5 Kopien (ca. 50 fg) Campylobac-

ter jejuni-DNA und ca. 50 Kopien (ca. 500 fg) Campylobacter coli-DNA pro Ansatz sicher nachweis-

bar.

Beim Einsatz von 50 fg pro Reaktionsansatz ergaben jeweils 5 / 5 Replikaten ein positives Ergebnis

(Abb. 8).

G 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 G 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 G

G 22 23 24 25 26 27 G

197 bp

197 bp

Abb. 8: Sensitivität der PCR für Campylobacter.

Agarosegel-Aufnahme einer PCR mit genomischer DNA von

Campylobacter jejuni; je 5 Replikate pro Verdünnungsstufe;

Gezeigte Verdünnungsreihe:

1-5 = 50 pg, 6-10 = 5 pg, 11-15 = 500 fg, 16-20 = 50 fg,

21-26 = 5 fg Campylobacter jejuni pro Reaktionsansatz;

27 = Negativkontrolle, G = Größenmarker



Abschlussbericht

Die experimentell bestimmte Nachweisgrenze für Campylobacter coli und jejuni für die Real-Time

PCR lag bei ca. 5 Kopien (50 fg) (Abb. 9). Die Real-Time PCR ergab mit 10 / 10 Replikaten von C.

jejuni und 6 / 6 Replikaten von C. coli bei ca. 5 Kopien ein positives Signal.

3.3.5 Relative Sensitivität (Sensitivität im Vergle ich zum kulturellen Nachweis) der Real-Time

PCR für Campylobacter coli und jejuni

Die Real-Time PCR für Campylobacter coli und Campylobacter jejuni wurde der Referenzmethode,

dem kulturellen Nachweis thermophiler Campylobacter [28], gegenübergestellt. Dazu wurden beide

Methoden zum Nachweis von Campylobacter jejuni in dotierten Lebensmittelproben eingesetzt und

so die Vergleichbarkeit der molekularbiologischen Methode mit der kulturellen Methode ermittelt. Da-

für wurde pasteurisierte Vollmilch und Schweinehackfleisch mit definierten Konzentrationen einer

Reinkultur von Campylobacter jejuni inokuliert. Je 5 Probenansätze wurden mit einer Suspension

inokuliert, die eine (geschätzte) Konzentration von ca. 1 cfu, 5 cfu und 10 cfu Campylobacter jejuni

pro 25 g Lebensmittel enthielt. Nach einer Anreicherung von 48 h erfolgte die DNA-Extraktion aus den

Anreicherungen und die Real-Time PCR bzw. der kulturelle Nachweis thermophiler Campylobacter.

Die tatsächliche Höhe der Dotierung wurde durch Ausplattieren auf Agarplatten und Koloniezählung

ermittelt. Sie betrug für die drei Dotierungsniveaus für beide Lebensmittel jeweils 0,4 cfu / 25 g; 2 cfu /

25 g und 4 cfu / 25 g (Tab.9).

Beide Lebensmittel wurden vor Dotierung jeweils negativ auf Campylobacter getestet und ca. 72 h bei

+4 - 8°C gelagert, um eine realistische Hintergrundflo ra zu erzielen. Bei allen Proben wurde die Höhe

der Hintergrundflora bestimmt: Bei der Vollmilch lag die mesophile aerobe Gesamtkeimzahl bei über

2 x 106 cfu/g, beim Schweinehackfleisch bei ca. 1,4 x 107 cfu/g. Die weiteren Angaben zur Hinter-

grundflora sind in Tab. 10 angegeben.

1ng 100pg 10pg 1pg 100fg 10fg1ng 100pg 10pg 1pg 100fg 10fg

Abb. 9: Sensitivität der Real-Time

PCR für Campylobacter: Real-

Time PCR mit genomischer DNA

von Campylobacter jejuni mit dem

LightCycler (Roche Diagnostics

Mannheim). Dargestellt sind die

Signalkurven einer Verdünnungs-

reihe von 1 ng - 10 fg C. jejuni -

DNA pro Reaktionsansatz. Bis zu

einer 10-5-fachen Verdünnung

ergeben alle Stufen ein deutlich

positives Signal.



Abschlussbericht

Die Ergebnisse der Real-Time PCR stimmen mit den Ergebnissen der kulturellen Methode überein.

Von dem niedrigsten Dotierungsniveau (0,4 cfu / 25 g) konnten beim Hackfleisch einer von 5 und bei

der Vollmilch 3 von 5 Ansätzen kulturell und mit Real-Time PCR nachgewiesen werden. Von dem

mittleren Dotierungsniveau (2 cfu / 25 g) konnten beim Hackfleisch 3 von 5 Ansätzen und bei der

Milch alle Ansätze mit beiden Nachweismethoden detektiert werden. Bei dem Dotierungsniveau von 4

cfu / 25 g konnten bei beiden Lebensmitteln alle Ansätze mit beiden Methoden nachgewiesen wer-

den. Eine Kontamination von weniger als 5 Keimen pro 25 g Lebensmittel kann somit nach Anreiche-

rung auch in Gegenwart einer hohen Hintergrundflora nachgewiesen werden (Tab. 11).

Lebensmittel Konzentration Proben- positiv mit positiv mit

der Dotierung anzahl kulturellem Nachweis Real-Time PCR

Pasteurisierte 0,4 cfu / 25 g 5 3 3 Vollmilch 2 cfu / 25 g 5 5 5

4 cfu / 25 g 5 5 5 Schweine- 0,4 cfu / 25 g 5 1 1 hackfleisch 2 cfu / 25 g 5 1 1 4 cfu / 25 g 5 3 3

Keimgruppe Vollmilch Schweinehackfleisch

Mesophile aerobe Gesamtkeimzahl > 2,0 x 106 cfu/g 1,4 x 107 cfu/g

Koagulase positive Staphylokokken < 1,0 x 102 cfu/g < 1,0 x 102 cfu/g

Coliforme Keime < 1,0 x 102 cfu/g n.b.

Pseudomonaden 2,0 x 102 cfu/g 5,1 x 106 cfu/g

Hefen < 2,0 x 106 cfu/g 1,0 x 104 cfu/g

Säuretolerante Laktobazillen n.b. 8,0 x 103 cfu/g

Enterobacteriaceae n.b. 1,4 x 104 cfu/g

E. coli n.b. < 1,0 x 102 cfu/g

Salmonella spp n.b. negativ in 10 g

Listeria monocytogenes n.b. negativ in 10 g

E. coli O157 n.b. negativ in 25 g

Campylobacter spp. negativ in 25 g negativ in 25 g

Tab. 10: Hintergrundflora der Lebensmittelproben (Vollmilch und Schweinehackfleisch),

die für die Dotierungsversuche mit Campylobacter jejuni verwendet wurden.

n.b. = nicht bestimmt

Tab. 11: Relative Sensitivität der Real-Time PCR für Campylobacter coli und jejuni. Ergebnisse des Me-

thodenvergleichs mit künstlich kontaminierten Lebensmittelproben. Dargestellt sind die Ergebnisse der

Real-time PCR und des kulturellen Nachweises bei verschiedenen Dotierungsniveaus.



Abschlussbericht

Mehrere Dotierungen des gleichen Lebensmittels mit sehr niedrigen Konzentrationen führen nach

Anreicherung in der Regel zu einem Teil positiver und einem Teil negativer Proben. Die negativen

Ansätze bei den niedrigen Dotierungsniveaus mit beiden Nachweismethoden sind vermutlich keine

falsch-negativen Ergebnisse, sondern rühren wohl daher, dass die inokulierten Zellen sich gar nicht

vermehrten und daher nicht angereichert wurden.

Die Proben wurden anschließend an die Real-Time PCR zusätzlich mit der PCR mit Agarosegel un-

tersucht. Die Ergebnisse der PCR mit der Qiagen-DNA-Extraktion stimmten vollständig mit den Er-

gebnissen der Real-Time PCR und dem kulturellen Nachweis überein.

3.3.6 Relative Spezifität (Vergleich zum kulturellen Nachweis) der Real-Time PCR für Campy-

lobacter coli und jejuni

Mit der Real-Time PCR wurden parallel zur kulturellen Methode [28] 96 Lebensmittelproben unter-

sucht. Es handelte sich dabei um Geflügel (Huhn, Ente, Pute, Gans), Fleisch (Schwein, Rind, Wild)

und Fleischerzeugnisse, Fisch, Meeresfrüchte, Käse, Müsli und Fertigprodukte. Die Ergebnisse des

Vergleichs sind in Tab. 12 dargestellt. Der Nachweis von Campylobacter coli und jejuni ergab mit bei-

den Methoden bei 44 Proben ein positives Resultat. 52 der 96 Proben waren jeweils mit beiden Me-

thoden negativ für Campylobacter coli und jejuni. In einer Probe konnte mit der kulturellen Methode

kein Campylobacter nachgewiesen werden, während die Real-Time PCR ein positives Ergebnis zeig-

te. Bei dieser Probe ergab ein Test mit dem VIDAS -System ebenfalls ein positives Ergebnis.

Tab. 12: Analyse von Lebensmittelproben auf Campylobacter coli und jejuni mit Real-Time PCR

im Vergleich zur Referenzmethode

Real-Time PCR

positiv negativ inhibiert Referenzmethode positiv 44 0 0 (kultureller negativ 0 52 0 Nachweis) inhibiert 0 0 0

gesamt 96



Abschlussbericht

3.3.7 Berechnung der Validierungsparameter der Real -Time PCR für Campylobacter coli und

jejuni

Um Alternativmethoden für die amtliche Untersuchung auf mikrobielle Kontamination in Lebensmitteln

einsetzen zu können, müssen diese mit der Referenzmethode verglichen und validiert werden. Damit

kann sichergestellt werden, dass die Alternativmethode nachweislich zu gleichen Beurteilungen führt

wie die Referenzmethode, in diesem Fall das kulturelle Nachweisverfahren nach §35 LMBG [7]. Eine

Validierung von qualitativen Alternativmethoden durch Methodenvergleich umfasst in der Regel die

folgenden Validierungskriterien [29]:

- Spezifität

- Sensitivität

- (Relative) Richtigkeit

- Wiederholbarkeit (Präzision)

- Vergleichbarkeit (Robustheit)

- Nachweisgrenze

- Falsch-Positiv-Rate

- Falsch-Negativ-Rate

- Statistische Übereinstimmung

Zur Berechnung der Validierungsparameter ergibt sich das folgende Auswerteschema für Laborver-

suche, das von Hübner et al. veröffentlicht wurde [29] (Tab. 13).

zu validierende Methode (Alternativmethode)

positiv negativ Summe

positiv a b a + b Referenzmethode

oder reelle Kontamination negativ c d a + d

Summe a + c b + d

Variablen:

a = Anzahl positiven Analysenergebnisse mit beiden Methoden

b = Anzahl der falsch - negativen Analysenergebnisse

c = Anzahl der falsch - positiven Analysenergebnisse

d = Anzahl negativen Analysenergebnisse mit beiden Methoden

Tab. 13: Auswerteschema für die Berechnung von Validierungsparametern bei Methodenvergleichen von

Referenzmethode und Alternativmethode



Abschlussbericht

Sensitivität (oder Inklusivität) im Vergleich mit d em Referenzverfahren

Sensitivität als a / (a + b) x 100; gibt an, wie viel Prozent aller sicher (mit dem Referenzverfahren)

positiven Proben als positiv erkannt werden. Sensitivität hat in diesem Zusammenhang nichts mit der

Nachweisgrenze zu tun, sondern steht für die Fähigkeit des Verfahrens, den Zielorganismus sicher

nachzuweisen.

Spezifität (oder Exklusivität) im Vergleich zum Refer enzverfahren

Spezifität als d / (c + d) x 100, gibt an, wie viel Prozent aller sicher negativen Proben als negativ er-

kannt werden.

Falsch - Positiv-Rate

Die Falsch -Positiv-Rate, berechnet als c / (c + d) x 100, gibt an, wie viel Prozent der Proben mit dem

alternativen bzw. neuen Prüfverfahren als falsch - positive Befunde gewertet werden

Falsch - Negativ-Rate

Die Falsch - Negativ-Rate, berechnet als b / (a + b) x 100 gibt an, wie viel Prozent der Proben mit

dem alternativen bzw. neuen Prüfverfahren als falsch-negative Befunde gewertet werden.

Statistische Übereinstimmung (Konkordanzindex Kappa )

Der Konkordanzindex Kappa zeigt das Maß der Übereinstimmung zweier Prüfverfahren bezüglich

eines Analyseparameters an und wird wie folgt berechnet:

Kappa = 2 x (a x d - b x c) / ( (a + c) x (c + d) + (a + b) x (b + d) )

Für die Bewertung des Konkordanzindex Kappa wird die Tabelle nach Sachs [30] verwendet (Tab.

14):

Tab. 14: Bewertung des Konkordanz-

index Kappa nach Sachs

Kappa Übereinstimmung

<0,10 keine

0,10-0,40 schwache

0,41-0,60 deutliche

0,61-0,80 starke

0,81-1,0 fast vollständige



Abschlussbericht

Am Beispiel der Methode zum Nachweis von Campylobacter coli und jejuni mit Real-Time PCR wur-

den die erhobenen Daten zu den Validierungsparametern anhand der geschilderten Schemata (Tab.

13 u. 14.) errechnet und ausgewertet. Dabei wurden (unter Verwendung von Tab. 12, S. 84) die fol-

genden Werte erzielt (Tab. 15):

Validierungsparameter beim Vergleich mit Re-ferenzmethode

Untersuchte Proben 96

Spezifität im Vergleich zur Referenzmethode 100 %

Sensitivität im Vergleich zur Referenzmethode 98,1 %

Falsch-Positive Rate 1,88 %

Falsch-Negative Rate 0 %

Statistische Übereinstimmung, Kappa 0,98

fast vollständige Übereinstimmung

Tab. 15: Auswertung der Berechnung der Validierungsparameter für die Nachweismethode von

Campylobacter coli und jejuni mit Real-Time PCR



Abschlussbericht

3.4 Nachweis von Listeria monocytogenes mit PCR und Real-Time PCR

Für den Nachweis von Listeria monocytogenes wurde von Scheu et al. ein PCR-Verfahren entwickelt,

das bereits vom BgVV (jetzt BfR, Bundesanstalt für Risikobewertung) im Rahmen der §35-

Arbeitsgruppe erprobt und in einem Ringversuch validiert wurde [10, 31]. Hierbei wird eine Sequenz

aus dem Metalloprotease-Gen (mpl) nachgewiesen. An die PCR schließt sich eine spezifische Detek-

tion des amplifizierten Fragments über eine Hybridisierungssonde an. Ein weiteres, gleichartiges Ver-

fahren, das auf dem Nachweis des alpha-Hämolysin-Gens (hlyA) beruht, wurde von Furrer et al. [9]

und Niederhauser et al. [32] entwickelt. Dieses Verfahren wurde ebenfalls im Rahmen der §35-

Arbeitsgruppe erprobt und empfohlen [31].

Die Spezifität dieser Methoden wurde bereits anhand von DNAs von Target- und Nicht-Target-

Stämmen ermittelt und ist in der Literatur wie folgt angegeben: Das PCR-System zum Nachweis des

mpl-Gens [10] wurde anhand von 103 Target-Stämmen getestet und gegen 33 Stämme der Vertreter

L.welshimeri, L. seeligeri, L. innocua, L. grayi und L. ivanovii sowie gegen 40 weitere Nicht-Target-

Stämme überprüft. Alle Target-Stämme wurden als positiv und alle Nicht-Targetstämme als negativ

erkannt.

Das PCR-System zum Nachweis des hlyA-Gens wurde anhand von 98 Target-Stämmen und 26

Nicht-Target-Stämmen des Genus Listeria getestet [9, 32]. Auch hier wurden alle Target-Stämme

wurden als positiv und alle Nicht-Targetstämme als negativ erkannt. Sechs weitere Nicht-

Targetstämme anderer Gattungen wurden getestet und alle als negativ erkannt.

Laut Literaturangaben beträgt die Nachweisgrenze für Listeria monocytogenes mit den Primern für

das mpl-Gen ca. 2 - 10 Kopien (10 - 50 fg) [10] und mit den Primern für das hlyA-Gen ca. 103 cfu/ ml

Anreicherungskultur [9, 32].

Mit diesen Verfahren wurden für das vorliegende Projekt mehrere nach selektiver Anreicherung iso-

lierte Subkulturen im Vergleich zur kulturellen, klassisch-mikrobiologischen Methode untersucht. Die

Isolate stammten von einer Lebensmittelprobe mit Verdacht auf Listeria monocytogenes. Als kulturel-

les Nachweisverfahren wurde die Methode aus §35 LMBG [33] verwendet. Die DNA-Extraktion aus

der Anreicherungskultur erfolgte mit dem Qiagen-DNeasy-Tissue-Kit. Daran anschließend wurde mit

den Proben eine qualitative PCR mit dem oben beschriebenen Nachweis von Scheu et al. [10] durch-

geführt. Dieselben Proben wurden ebenfalls mit der Real-Time PCR im LightCycler untersucht, basie-

rend auf dem beschriebenen System das zusätzlich mit einer spezifischen Sonde für die Real-Time

PCR kombiniert wurde. Insgesamt wurden acht Proben aus verschiedenen Subkulturen mit qualitati-

ver PCR und mit Real-Time-PCR getestet. Die Untersuchung ergab übereinstimmend bei allen Pro-

ben negative Ergebnisse für Listeria monocytogenes. Mit diesen Resultaten konnten die Ergebnisse

der kulturellen Analytik bestätigt werden.

Um die Spezifität des Nachweissystems für die Anwendung im Rahmen des Projektes zu bestätigen,

wurde aus Vertretern sämtlicher Listeria-Spezies (L. innocua, L. ivanovii, L. grayi, L. welshimeri und L.



Abschlussbericht

seeligeri) DNA isoliert. Mit diesen Referenz-DNA-Proben wurde eine PCR mit anschließender Agaro-

segeldetektion durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass mit dem verwendeten Nachweissystem Listeria

monocytogenes sicher gegen die anderen Spezies der gleichen Gattung differenziert werden konnte.

Eine weitergehende Entwicklung und Etablierung von molekularbiologischen und immunologischen

Verfahren zum Nachweis von Listeria spp. in Lebensmitteln wird an der Bundesforschungsanstalt für

Ernährung (BfE), Karlsruhe (Prof. Dr. Holzapfel) und am Chemischen und Veterinäruntersuchungs-

amt Karlsruhe (Dr. Lohneis) im Rahmen eines Forschungsprojektes durchgeführt. Daher wurde im

Rahmen des vorliegenden Projektes keine Vertiefung des Themas vorgenommen.



Abschlussbericht

3.5 Paralleler Nachweis von Salmonella spp., Lister ia monocytogenes und ther-

mophilen Campylobactern mit dem Biochip

Mit der Biochip-Technologie können simultan die Nachweise mehrerer verschiedener pathogener

Keime in einer Probe durchgeführt werden. Ein speziell für die Lebensmittelanalytik entwickelter Bio-

chip (NutriChipTM) kann zum parallelen Nachweis von Salmonella spp., Listeria monocytogenes und

Campylobacter coli und jejuni angewendet werden. Der Biochip stellt einen miniaturisierten Träger

dar, auf dem Biomoleküle (in diesem Falle spezifische DNA-Sonden) in hoher Anzahl und in definier-

ter Anordnung (als sog. Microarray) fixiert sind. Zum Nachweis der pathogenen Keime aus einer Le-

bensmittelprobe wird zunächst eine Multiplex-PCR mit mehreren Nachweissystemen in einer Reakti-

on durchgeführt. Anschließend können anhand der spezifischen Sonden, die auf dem Biochip in defi-

nierter Anordnung immobilisiert sind, die verschiedenen PCR-Amplifikate erkannt werden (2.16.1 S.

60). Die PCR-Amplifikate werden durch enzymatischen Verdau einzelsträngig gemacht und auf dem

Biochip hybridisiert. Wenn ein Amplifikat und die dazu passende Sonde auf dem Biochip hybridisie-

ren, so wird nach Färbung des Chips an dieser Stelle ein positives Fluoreszenzsignal erzielt. Dieses

Signal kann mit dem Lesegerät gemessen und sichtbar gemacht werden (Abb. 10 und Abb. 11).

Abb. 10: Aufnahme der Fluoreszenzsignale eines Biochips nach Hybridisierung mit einer Probe, die Listeria

monocytogenes enthielt.

Auf einem Biochip sind 2 gleiche Sondenarrays untereinander angeordnet:

- alle Sonden sind doppelt vertreten: von links nach rechts: Salmonella spp., Campylobacter coli / jejuni,

Listeria monocytogenes I, Listeria monocytogenes II

- in den Ecken befinden sich Positivkontrollen

- Von den zwei mittleren Sondenreihen, stellt die obere Reihe die Target-Sonden dar, während direkt

darunter für jeden Zielorganismus eine Inhibitionskontrolle vorhanden ist. Im Raster befinden sich die

Target- und Kontroll-Sonden für einen Listeria monocytogenes-Nachweis. Die Aufnahme zeigt die posi-

= Positivkontrollen und Färbekontrollen = Inhibitionskontrollen für

jede Targetsonde

= Inhibitionskontrollen für jede Targetsonde

= Trennung zw. oberem und

unterem Sondenarray



Abschlussbericht

tiven Fluoreszenzsignale für Listeria monocytogenes I und Listeria monocytogenes II-Sonden nach er-

folgter Hybridisierung mit einer Lebensmittelprobe, die Listeria m. enthielt.

Abb. 11: Auswertung des Biochips aus Abb.10: Für Salmonella spp und Campylobacter coli bzw. jejuni befindet

sich jeweils ein Sondensystem auf dem Biochip, für Listeria monocytogenes sind es zwei Systeme.

Auf dem gezeigten Auswerteschema werden links zwei Aufnahmen des Biochip dargestellt (Schwarz-Weiß und

Falschfarben-Darstellung) und daneben ein Auswerteschema für die Target- und Kontroll-Sonden der auf dem

Biochip befindlichen Nachweissysteme.

Im Fall einer negativen Probe, ist das Signal der jeweiligen Target-Sonde negativ und die Inhibitions-

Kontrollsonde zeigt ein positives Ergebnis. Ist eine Probe für einen Zielorganismus positiv, so zeigen Target-

Sonde und Kontrollsonde ein positives Signal.

Bei vorliegendem Biochip sind im Auswertesschema keine Signale für die Target-Sonden von Salmonella spp.

und Campylobacter coli bzw. jejuni zu sehen (A), die jeweiligen Kontrollsonden zeigen positive Signale (B).

Dies bedeutet, dass in der vorliegenden Lebensmittelprobe kein Salmonella spp und kein Campylobacter coli

bzw. jejuni nachweisbar sind.

Die Target-Sonden für Listeria monocytogenes I und Listeria monocytogenes II zeigen positive Signale (C) e-

benso wie deren Inhibitions-Kontrollsonden (D). Dies bedeutet ein positives Resultat für Listeria monocytogenes

in der vorliegenden Probe.

Mit dem Biochip wurden DNA-Extrakte aus Anreicherungen von Lebensmittelproben auf Anwesenheit

von Salmonella spp., Listeria monocytogenes und Campylobacter coli bzw. jejuni getestet. Für die

einzelnen Keime wurden folgende Nachweisgrenzen bestätigt: Es konnten für Salmonella spp. und

Listeria monocytogenes bis zu ca. 100 cfu/ml nach Voranreicherung sicher nachgewiesen werden

und für Campylobacter coli bzw. jejuni bis zu ca. 103 cfu/ml.

A B C D



Abschlussbericht

Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind die entsprechenden Biochips aufgrund der Insolvenz der Firma

Genescan Europe AG nicht mehr kommerziell verfügbar. Daher kann momentan keine weitergehende

Validierung der Microarray-Systeme für den Nachweis pathogener Keime in Lebensmitteln durchge-

führt werden.



Abschlussbericht

3.6 Nachweis von enterohämorrhagischen E. coli (EHE C) mit PCR und Real-Time

PCR

Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) sind die humanpathogene Untergruppe der Shigato-

xin- bzw. Verotoxinbildenden (STEC, VTEC) Vertretern der Spezies E.coli. Für den molekularbiologi-

schen Nachweis mit der PCR und der Real-Time PCR werden Sequenzen aus den Toxingenen he-

rangezogen. In der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 [11] wurde eine

Methode publiziert, mit der verotoxinbildende E.coli nachgewiesen werden können. Hierbei werden

mit einer Kombination aus mehreren PCR-Reaktionen und einer Kolonieblothybridisierung sämtliche

VTEC-Serotypen erfasst [11]. Die Methode gliedert sich in die aufeinanderfolgenden Schritte: Anrei-

cherung, DNA-Extraktion, Amplifikation der gesuchten DNA-Sequenzen mittels spezifischer Primer in

der PCR und Detektion der Amplifikate sowie Isolation der VTEC mittels DNA-Hybridisierung und

Bestätigung der Isolate über PCR und enzymatische Restriktion.

Des weiteren wurde von Reischl et al. [17] eine Methode zum Nachweis der Shigatoxin-, Intimin- und

Enterohämolysingene von VTEC mittels Real-Time PCR im LightCycler (Roche Diagnostics, Mann-

heim) publiziert.

Die veröffentlichten PCR-Systeme wurden im vorliegenden Projekt für verschiedene Lebensmittelpro-

ben angewandt und etabliert.

Mit der PCR wurden 18 Proben aus Lebensmittelanreicherungen untersucht. Parallel dazu wurden

die Proben kulturell untersucht, nach der vom § 35 LMBG veröffentlichten Methode [34]. Dieses Ver-

fahren erfasst allerdings ausschließlich EHEC vom Serotyp O157, andere Serogruppen, die ebenfalls

als Lebensmittelkontaminanten auftreten können, bleiben unerkannt.

Auf den Nachweis von E. coli - spezifischer DNA mit PCR folgten bei den untersuchten Proben ver-

schiedene PCR-Ansätze zum Nachweis von VTEC. Dabei wurde zunächst eine PCR zum allgemei-

nen Nachweis der Shigatoxin-Gene durchgeführt und im Anschluss daran vier weitere PCR-

Reaktionen, mit denen die Proben auf folgende Virulenzfaktoren von VTEC geprüft wurden:

- stx-subtyping ( stx 1 und stx 2; Shigatoxin-ähnliche Proteine)

- eae (attaching and effacing -Phänomen; Membranprotein Intimin, wirkt als Adhäsionsfaktor)

- hly (EHEC-Hämolysin)

Alle PCR-Amplifikate wurden mittels Agarosegelelektrophorese detektiert. Die Ergebnisse der einzel-

nen PCR-Reaktionen sind in Tab. 16 aufgeführt. Vier der 18 Proben zeigten ein positives Ergebnis für

den allgemeinen Nachweis der Shigatoxingene und auch für die Virulenzfaktoren stx 1 oder/und stx 2,

eae und hly. Diese Proben wurden im kulturellen Nachweis [34] als EHEC O157 bestätigt.



Abschlussbericht

Die restlichen 14 Proben zeigten ein positives Resultat für die Spezies E. coli, aber negative Resulta-

te für die VTEC-Nachweise; sie waren auch in der kulturellen Untersuchung negativ. Zwei weitere

Proben waren positiv für das eae-Gen, zeigten allerdings gleichzeitig ein negatives Ergebnis für den

allgemeinen VTEC-Nachweis. Dies könnte darauf hinweisen, dass es sich nicht um EHEC handelt,

sondern um Vertreter der Gattung Shigella, bei der diese Virulenzfaktoren auftreten können. Kulturell

waren diese beiden Proben negativ für EHEC (es wurde allerdings nur das Serovar O157 erfasst).

Mit der oben genannten Methode von Reischl et al. [17], mit der mittels Real-Time PCR mehrere Viru-

lenzfaktoren von EHEC nachgewiesen werden können, wurden sieben Proben (von denen die meis-

ten auch mit der PCR geprüft worden waren) untersucht. Dabei wurden die bakteriellen Toxingene

stx 1 (Shigatoxin 1) und stx 2 (Shigatoxin 2), die für EHEC typisch sind, mit spezifischen Sonden im

LightCycler nachgewiesen. Das Ergebnis der Amplifikation kann in Echtzeit am Real-Time Gerät ver-

folgt werden. Zwei der sieben Proben waren positiv für stx 1 sowie stx 2, d.h. das Fluoreszenzsignal

überstieg den Threshhold (Tab. 16).

Lightcycler Proben VTEC -Screening

stx 1 - Nachweis

stx 2 - Nachweis

eae - Nachweis

hly - Nachweis stx 1 stx 2

1 - - - + - n. b n. b 2 - - - - - n. b n. b 3 - - - - - n. b n. b 4 - - - - - n. b n. b 5 - - - - - n. b n. b 6 - - - - - n. b n. b 7 - - - - - n. b n. b 8 + + + + + + + 9 - - - - - - - 10 - - - - - - - 11 + + + + + + + 12 - - - - - - 13 - - - + - - - 14 - - - - - n. b n. b 15 - - - - - n. b n. b 16 - - - - - n. b n. b 17 + + + + n. b. n. b n. b 18 + - + + n. b. n. b n. b

EHEC O 157 + + + - + + + E.coli - - - - - - -

Tab. 16: PCR-Untersuchung von DNA aus Lebensmittelanreicherungen mit PCR auf VTEC allgemein

und auf folgende Toxingene von VTEC: stx 1, stx 2, eae, hly. n.b. = nicht bestimmt;

Nachweis von stx 1 (Shigatoxin 1) und stx 2 (Shigatoxin 2) von EHEC aus Lebensmittelproben mittels

Real-Time PCR im LightCycler.



Abschlussbericht

3.7 Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuber culosis mit PCR

Zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) in Kuhmilchproben wurde die

in-house Methode, die zum Nachweis von MAP in Organ- und Kotproben verwendet wurde auf die

Anwendung für Milchproben adaptiert. An die modifizierte DNA-Extraktion (s. 2.12.5, S. 39), die direkt

aus den Milchproben erfolgte wurde eine weitere Aufreinigung des DNA-Extraktes mit Microspin an-

geschlossen. Zur Überprüfung der Amplifizierbarkeit der extrahierten DNA wurde als Kontrolle eine

spezifische PCR für den Nachweis von Rind-DNA durchgeführt. Mit der Proben-DNA wurde dann

eine nested PCR in Anlehnung an Englund et al. [13] durchgeführt, mit der spezifisch MAP nachge-

wiesen werden kann. Dabei wird durch ein äußeres Primerpaar eine Sequenz aus dem Insertions-

element IS900 amplifiziert und in der nachfolgenden PCR mit einem inneren Primerpaar ein weiteres,

innerhalb liegendes Amplifikat erzielt. Die Detektion der Amplifikate erfolgte durch Agarosegele-

lektrophorese.

Von den 14 eingesetzten Milchproben stammten vier Proben von Kühen, die an Mastitis erkrankt wa-

ren. Alle 14 Milchproben zeigten ein positives PCR-Ergebnis für den Nachweis von Rind-spezifischer

DNA an (Abb. 12), während die nested PCR für den Nachweis von MAP bei allen Proben negativ

ausfiel. (Abb. 13)

G 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 G 11 12 13 14 P P

210 bp

Abb. 13: Nested PCR zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP); G = Größenmarker, Milch-

proben 1-14, P = Positivkontrolle (MAP-DNA); außer in der Positivkontrolle konnte keine MAP-DNA nachgewiesen werden.

G 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 G 13 14 P P P N N G

Abb. 12: Kontroll-PCR zum Nachweis Rind-spezifischer DNA: G= Größenmarker, Milchproben 1-14, P = Positivkontrolle

(Rind) N = Negativkontrolle (Aq. dest.); in allen Milchproben konnte Rind-spezifische DNA nachgewiesen werden.

274 bp



Abschlussbericht

3.8 Interne Amplifikationskontrollen für die PCR un d die Real-Time PCR

Beim Nachweis von Keimen aus Voranreicherungskulturen mit PCR und Real-Time PCR sind Posi-

tivkontrollen für die Amplifikation unerlässlich. Bei Anreicherungen von Lebensmitteln kann es vor-

kommen, dass auch nach DNA-Extraktion Lebensmittelbegleit- und -inhaltsstoffe vorliegen, die auch

schon in geringen Konzentrationen die Amplifikation bei der PCR stören oder ganz inhibieren können.

Dazu zählen z.B. höhere Konzentrationen an Proteinen, deren hemmender Effekt auf die PCR durch

geringe Mengen an Fett verstärkt werden kann [35]. Daher muss einerseits eine geeignete DNA-

Reinigung für die PCR zum Einsatz des DNA-Extaktes in die PCR verwendet werden und anderer-

seits die Amplifikation kontrolliert werden. Zur Vermeidung falsch-negativer Ergebnisse sollten für

jede einzelne Nukleinsäureextraktion geeignete Inhibitionskontrollen mitgeführt werden, um die Ampli-

fizierbarkeit der isolierten DNA zu überprüfen.

Es gibt verschiedene Möglichkeiten zu überprüfen, ob Inhibitoren für das Misslingen einer PCR-

Reaktion verantwortlich sind:

Jede Probe wird zusätzlich zum ersten Reaktionsansatz in einem zweiten Ansatz mit einer geringen,

aber sicher nachweisbaren Konzentration reiner DNA des nachzuweisenden Organismus (z.B. Sal-

monella spp.) versetzt. Somit wird die Amplifizierbarkeit mittels einer externen Kontrolle getestet. Da-

zu wird ein Doppelansatz pro Probe durchgeführt, wobei ein Ansatz dotiert wird und ein Ansatz die zu

überprüfende Probe darstellt. Falls vorhanden, können auch - abhängig vom Probenmaterial- ubiqui-

tär im verwendeten Material vorkommende Zielsequenzen für eine Amplifikationskontrolle verwendet

werden, z.B. bakterielle Zielsequenzen, die universell bei allen Bakterien vorkommen.

Alternativ zu der externen Kontrolle der Amplifikation im Doppelansatz kommt dafür auch eine hetero-

loge Target-Sequenz in Betracht (auf die die Primer des Nachweissystems also nicht ansprechen),

mit der die zu testende Probe versetzt wird. Dabei wird dem Reaktionsgemisch eine natürliche oder

artifizielle DNA hinzugefügt, die parallel zum nachzuweisenden Organismus im selben Reaktionsan-

satz amplifiziert wird. Die effiziente Amplifikation dieser DNA wird durch ein spezifisches Nachweis-

system angezeigt. Bei einem positiven Ergebnis dieser Kontrollreaktion kann davon ausgegangen

werden, dass sich in der untersuchten DNA-Extraktion keine nennenswerten Mengen an PCR-

Inhibitoren befinden bzw. sich auf die Amplifikation hemmend auswirken können.

Ein solches internes Positivkontrollsystem (IPC) wurde basierend auf einem Gen aus Nicotiana taba-

cum entworfen. Dieses System beinhaltet eine spezifische HEX-TAMRA markierte Sonde, die in der

Real-Time-PCR verwendet werden kann. Durch die Fluoreszenzmarkierung mit einem anderen Farb-

stoff als dem der Target-Sonde, kann der Nachweis im gleichen Ansatz mit der nachzuweisenden

Target-Sequenz stattfinden.

Das Fragment, das durch die IPC nachgewiesen wird, wird in möglichst geringer, dennoch stabil

nachzuweisender Menge dem Reaktionsmix zugesetzt. Damit dies in kontrollierter Weise stabil vor-

genommen werden kann, wurde das Fragment in E.coli kloniert. Nach der Klonierung wurde es auf-



Abschlussbericht

gereinigt und mit Hilfe mehrerer Versuchsreihen eine definierte, geeignete Konzentration empirisch

ermittelt.

Da eine hohe Konzentration der IPC im Duplex-Ansatz mit dem Nachweissystem einen Einfluss auf

dessen Sensitivität haben kann, muss die Konzentration der IPC als Inhibitionskontrolle optimiert

werden. Es wird eine möglichst geringe Konzentration gewählt, bei der jedoch noch eine stabile PCR-

Amplifikation stattfindet.

Für das vorliegende Projekt wurden Verdünnungsreihen der klonierten IPC (ntb 2) erstellt und in der

Real-Time PCR alleine und in Kombination mit dem Nachweissystem für Campylobacter coli und je-

juni und dem Nachweis für Salmonella spp. getestet.

Die Real-Time PCR mit Replikaten verschiedener Verdünnungsstufen der IPC zeigte zunächst, dass

der Einsatz von ca. 50 Kopien (Plasmid-DNA) der IPC in Abwesenheit von inhibitorischen Komponen-

ten eine stabile Amplifikation gewährleistet (Abb.14).

In weiteren Ansätzen wurde geprüft, ob der Einsatz von 50 Kopien IPC-Template pro Reaktion einen

Einfluss auf die Sensitivität der Nachweissysteme von Salmonella spp. und Campylobacter coli bzw.

jejuni nimmt. Dafür wurde die Real-Time PCR mit jeweils drei Replikate der einzelnen Stufen einer

Verdünnungsreihe von Salmonella Typhimurium-DNA bzw. Campylobacter coli/jejuni-DNA mit und

ohne Zusatz von 50 Kopien IPC durchgeführt.

Für das Salmonella-Nachweissystem blieb die Nachweisgrenze auch mit IPC bei ca. 10 Kopien (bzw.

100 fg) pro Reaktion.

Dagegen war bei der Real-Time PCR für Campylobacter coli/ jejuni mit 50 Kopien IPC pro Reaktion

eine deutliche Abnahme der Sensitivität zu verzeichnen. Die Nachweisgrenze ohne IPC lag bei ca. 5

Kopien (ca. 50 fg), während sie mit IPC auf ca. 5 x 104 Kopien ansteigt.

50 Kopien

50 Kopien

Abb. 14: Interne Positivkontrolle (IPC): 50 Kopien IPC-Template

pro PCR-Reaktion erzielen eine stabile Amplifikation in der Real-

Time PCR.



Abschlussbericht

Die Interne Positivkontrolle (IPC) wurde im Duplex-Ansatz parallel zum Einzel-PCR-Ansatz mit exter-

ner Positivkontrolle auch beim Nachweis von Campylobacter coli und jejuni-Isolaten aus Lebensmit-

telanreicherungen ausgetestet. Bei der Untersuchung von 35 positiven Isolaten zeigten alle 35 ohne

IPC in der Real-Time PCR ein positives Ergebnis, während bei Verwendung der IPC neun von 35

Proben ein negatives Ergebnis zeigten. Die Verwendung der IPC als interne Amplifikationskontrolle

bei diesem Nachweissystem scheint zwangsläufig zu einer verringerten analytischen Sensitivität der

Methode zu führen.

Diskussion 99 von 119 Seiten


Abschlussbericht

4 Diskussion

4.1 DNA-Extraktion

Bei der Erprobung von verschiedenen Methoden zur DNA-Extraktion aus Anreicherungen von patho-

genen Keimen in Lebensmitteln haben sich zwei Methoden als sensitiv und weitreichend einsetzbar

erwiesen.

Die CTAB-Methode, die an die DNA-Extraktion aus Bakterienzellen adaptiert wurde, eignete sich zur

Gewinnung von DNA von Mikroorganismen aus verschiedensten Lebensmitteln. Mit dieser Methode

wurde eine hohe DNA-Ausbeute erzielt, und gleichzeitig die DNA-Lösung von inhibitorischen Kompo-

nenten befreit. Mit dem DNeasy-Tissue-Kit (Qiagen) kann aus Anreicherungskulturen die DNA gram-

positiver sowie gram-negativer Keime ebenfalls mit hoher Ausbeute isoliert werden. Der Vorteil der

Kit-Methode liegt in der kürzeren Extraktionszeit gegenüber der CTAB-Methode. Der Wizard-Kit

(Promega) zeigte gegenüber den anderen beiden Methoden eine geringere DNA-Ausbeute, was dazu

führte, dass bei sehr niedrigen Bakterienkonzentrationen nicht genug DNA gewonnen wurde und so

die anschließende PCR ein negatives Ergebnis erzielte.

Sowohl die CTAB-Methode, als auch der DNeasy-Tissue-Kit eignen sich für Anreicherungskulturen

der verschiedensten tierischen und pflanzlichen Lebensmittel sowie von Fertigprodukten. Bei sehr

komplex zusammengesetzten und fetthaltigen Lebensmitteln, wie z.B. schokoladenhaltige Produkte,

ist eine Kombination der CTAB-DNA-Extraktion mit einer anschließenden zweiten Aufreinigung der

DNA (z.B. mit dem kommerziellen Microspin-System) empfehlenswert.

Eine weitere Methode, das Aufkochen der Mikroorganismen, eignet sich zur Gewinnung von DNA aus

Reinkulturen, die auf Platte oder in Flüssigmedium angezüchtet wurden. Um auf diese Weise DNA

aus Mikroorganismen in Anreicherungskulturen zu extrahieren, ist Aufkochen alleine allerdings häufig

ungeeignet, da inhibitorische Komponenten nicht entfernt werden.



Abschlussbericht

4.2 Nachweis von Salmonella spp. mit molekularbiolo gischen Methoden

In der vorliegenden Arbeit konnte die Polymerasekettenreaktion zum Nachweis von Salmonella spp.

mit bereits publizierten Primern [8] als spezifische und sensitive Methode etabliert werden. Mit der

Methode konnte experimentell bis zu einer Genomkopie von Salmonella pro Ansatz nachgewiesen

werden (s. Abb. 3, S. 69). Wenn die PCR direkt anschließend an die amtlich vorgeschriebene Voran-

reicherung durchgeführt wird, so kann ein Ergebnis für den Nachweis bereits innerhalb eines Ar-

beitstages nach Voranreicherung erzielt werden. Die Methode eignet sich für ein Screening oder auch

dazu, den kulturellen Nachweis zu bestätigen.

Zum Einsatz in der amtlichen Lebensmitteluntersuchung ist für die PCR mit Agarosegeldetektion eine

zusätzliche Bestätigungsreaktion, z.B. durch Hybridisierung mit einer Sonde, Restriktionsverdau oder

Sequenzierung der amplifizierten Sequenz vorgeschrieben.

Der generelle Vorteil der Real-Time PCR gegenüber der PCR liegt daher in der Verwendung einer

Sonde, die bereits einen sequenzspezifischen Nachweis ermöglicht. Die Bestätigungsreaktion über

die spezifische, fluoreszenzmarkierte Sonde findet simultan zu dem Nachweis über die spezifischen

Primer statt. Bei der Detektion über Agarosegelelektrophorese wird das PCR-Amplifikat hingegen nur

anhand der Größe erkannt.

Die Real-Time PCR erspart zeitaufwendige Post-PCR Arbeitsschritte, die anschließend an die Ampli-

fikation erfolgen müssen. Gleichzeitig verringert sich auch das Risiko einer Laborkontamination, da

der gesamte Prozess der Amplifikation und Detektion in einem Reaktionsgefäß, also im geschlosse-

nen System abläuft.

Die Validierung der Real-Time PCR zum Nachweis von Salmonella spp. zeigte, dass es sich dabei

um ein sehr spezifisches und sensitives Verfahren handelt. Ebenso wie bei der PCR können auch

hier ca. 1 - 10 Genomkopien von Salmonella-DNA pro Ansatz detektiert werden. Die Spezifität der

Primer-Sondenkombination wurde durch Überprüfung von 100 Target-Stämmen durchgeführt, die

mindestens 30 Serovare aus den beiden Salmonella-Spezies bzw. den sechs Salmonella-enterica-

Subspezies-Gruppen einschlossen. Es konnte eine breite Spezifität festgestellt werden, da sämtliche

Target-Stämme positiv erkannt wurden und die Nicht-Targetstämme negativ waren. Diese Ergebnisse

entsprachen den Literaturdaten zur Spezifität des Primer-Systems (dieses wurde ohne Sonde unter-

sucht).

Für die Ermittlung der Sensitivität wurde die molekularbiologische Methode als Alternativverfahren mit

der kulturellen Nachweismethode nach §35 LMBG als Referenzverfahren durchgeführt. Dieser Ver-

gleich verlief für verschiedene Lebensmittelsparten unterschiedlich. Für Hackfleisch, Geflügel, Lachs,

Schokolade, Tiramisu, Speiseeis, Knoblauchgranulat und Grüntee stimmten die Ergebnisse des kultu-

rellen Nachweises zu 100% mit denen der Real-Time PCR überein. Dabei zeigten sich keine Unter-



Abschlussbericht

schiede, ob die Proben 18 oder 24 Stunden angereichert wurde. Daraus folgt, dass bereits die 18 h-

Anreicherung für einen sicheren Nachweis niedriger Kontaminationen ausreichend scheint.

Lebensmittelrechtlich vorgeschrieben dürfen in 25 g Lebensmittel nach Anreicherung keine Salmonel-

len nachzuweisen sein [47]. Sowohl mit der Real-Time PCR als auch mit der kulturellen Methode

konnten bei allen Lebensmitteln niedrige Dotierungskonzentrationen (ca. 1 - 10 cfu / 25 g) detektiert

werden. Eine Ausnahme stellte Knoblauch, Grün- und Schwarztee dar.

Die Dotierung von Knoblauchgranulat sowie von Grüntee ergab bei beiden Verfahren ein negatives

Resultat. Dies könnte damit erklärt werden, dass die Dotierungskonzentrationen (0 - 1 bzw. 0 - 3 cfu/

25 g) sehr niedrig war. Möglicherweise konnten die Salmonellen in der Anreicherung nicht anwach-

sen, da sowohl Knoblauch als auch Grüntee Inhaltsstoffe mit bakteriziden bzw. bakteriostatischen

Eigenschaften aufweisen.

Die dotierten Schwarztee-Proben zeigten unterschiedliche Ergebnisse im kulturellen Nachweis und

der Real-Time PCR. Nach 18-stündiger Anreicherung war die Real-Time PCR von beiden Dotie-

rungskonzentrationen inhibiert. In der Kultur zeigte dagegen die niedrige Dotierungskonzentration ein

positiv/negativ-Ergebnis. Die höhere Dotierung war für beide Ansätze positiv. Nach 24 Stunden An-

reicherung zeigte die Real-Time PCR für beide Dotierungskonzentrationen ein positiv/negativ-

Ergebnis. Die negativen Ansätze waren inhibiert. Kulturell wurde das gleiche Ergebnis wie bei der

kürzeren Anreicherung erzielt.

Daraus folgt, dass eine 18 h-Anreicherung bei Schwarztee weder für die kulturelle Methode noch für

die Real-Time PCR für eine sichere Beurteilung der Probe ausreicht. Auch nach 24 h Anreicherung

ergibt eine kulturelle Untersuchung der niedrigeren Dotierungskonzentration kein eindeutiges Ergeb-

nis. Auch hier könnte möglicherweise, wie bei den Dotierungen von Knoblauch und Grüntee, das

Wachstum der Salmonellen unterdrückt worden sein.

Das negative Real-Time PCR-Ergebnis scheint allerdings nicht unbedingt eine Folge der kurzen An-

reicherungsdauer zu sein, sondern eher auf inhibitorische Komponenten in der DNA-Lösung zurück-

zuführen sein, da die Amplifikationskontrolle ein negatives Ergebnis zeigte. Phenolische Inhaltsstoffe

(z.B. Catechine), wie sie z.T. in Tee vorkommen, sind häufig Ursache für solche Inhibitionen.

Daher müsste in einem weiteren Experiment geklärt werden, ob die DNA-Extraktion für Schwarztee

mit einer anderen Methode durchgeführt werden müsste, oder ob mittels einer weiteren DNA-

Reinigung die Inhibitoren entfernt werden können.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Real-Time PCR bei allen Lebensmittelsparten nach-

weislich zur gleichen Beurteilung der Proben führt wie der kulturelle Nachweis. Im Methodenvergleich

zeigte sich die gleiche Sensitivität bei beiden Methoden. Die Ausnahme bildeten dotierte Schwarztee-

Proben, von denen in der Real-Time PCR eine Inhibition ausging.



Abschlussbericht

Die Spezifität im Methodenvergleich zeigte ebenfalls eine sehr gute Übereinstimmung, da von 166

alle bis auf eine Probe mit der Real-Time PCR genauso beurteilt wurden wie mit der kulturellen Me-

thode. Die abweichende Probe zeigte kulturell ein negatives Ergebnis und war in der PCR inhibiert,

konnte daher mit dieser Methode kein eindeutiges Ergebnis liefern.

Es müsste auch hier geklärt werden, ob mittels einer weiteren DNA-Reinigung die Inhibition aufzuhe-

ben ist.

Die Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) wird in der Epidemiologie erfolgreich als Surveillance-Methode

zur Untersuchung von Ausbrüchen eingesetzt, um epidemiologische Zusammenhänge zu erkennen

und zu verfolgen. Die PFGE kann für verschiedene Erreger von Lebensmittelinfektionen (z.B. Salmo-

nella spp., EHEC) gleichermaßen verwendet werden. Sie hat sich als sehr geeignet erwiesen, um

enge klonale Verwandtschaften zwischen Erregerstämmen festzustellen, die von Patienten isoliert

wurden, welche örtlich weit voneinander getrennt erkrankten [38]. Mit dieser Methode können Stäm-

me, die für bestimmte Ausbrüche verantwortlich sind, erfasst und wiedererkannt werden. Datenban-

ken dieser PFGE-Muster (DNA-Fingerprints), die im Internet veröffentlicht sind, ermöglichen eine lan-

desweite (oder auch weltweite) Vernetzung und einen nationalen bzw. internationalen Vergleich der

PFGE-Ergebnisse, sofern nach dem gleichen Protokoll vorgegangen wird.

Die in diesem Projekt untersuchten Proben wurden nach dem im Internet veröffentlichten Standard-

protokoll für PFGE des „German PulseNET“ (German PFGE Netzwerk) analysiert und zusätzlich mit

einem zweiten Protokoll, das dem verwendeten Analyse-Kit entstammte, untersucht.

Anhand der verwendeten Methoden konnten von sechs Salmonella-Stämmen, die aus verschiedenen

Lebensmitteln isoliert worden waren, DNA-Fingerprint-Daten ermittelt werden. Es war weiterhin mög-

lich zwei Isolate, die vorher nicht serologisch typisiert waren, anhand des Vergleichs mit den ermittel-

ten PFGE-Mustern der sechs bekannten Stämme als Salmonella Agona zu identifizieren.

Für die Routinediagnostik von Salmonella spp. im Rahmen der amtlichen Überwachung stellt die

PFGE allerdings eine sehr zeitaufwändige Methode dar. Ausgehend von der Übernachtkultur der zu

untersuchenden Isolate werden bis zu den ersten Ergebnissen etwa 3 - 4 Arbeitstage benötigt.

Neben der langen Dauer kommt es auch häufiger zu Wiederholungen der Analyse, weil kein eindeuti-

ges Ergebnis erzielt werden konnte. Auch in der vorliegenden Arbeit wurde mit zwei verschiedenen

Protokollen für jeweils 3 - 4 Proben kein klares Ergebnis erhalten. Diese Proben sind daher in einer

weiteren PFGE abzusichern.

Nicht zuletzt ist für eine valide Auswertung eine Datenbank mit PFGE-Mustern von ausreichend Ver-

gleichsstämmen notwendig.

Die Pulsfeldgelelektrophorese bietet die Möglichkeit zu einer genauen Typisierung der Mikroorganis-

men, allerdings zu Lasten einer raschen Analytik. Sie stellt eine sehr geeignete Methode für bestimm-

te epidemiologische Fragestellungen dar, ist aber für die Routine-Diagnostik zu aufwändig.



Abschlussbericht

Zusammenfassend kann die molekularbiologische Methodik zum Nachweis von Salmonella spp. als

valides, sehr sensitives und spezifisches Verfahren angesehen werden, das im Methodenvergleich

mit der kulturellen Referenzmethode die gleiche Sicherheit zur Beurteilung kontaminierter Lebensmit-

tel bietet. Auch die erfolgreich durchgeführten Ringversuche (s.S. 75) bestätigten dieses Ergebnis.

Für einen möglichst raschen und sicheren Nachweis von Salmonellen in Lebensmitteln ist die Real-

Time PCR von Vorteil.



Abschlussbericht

4.3 Nachweis von Campylobacter coli und Campylobact er jejuni mit PCR und Real-

Time PCR

Für den Nachweis der thermophilen Campylobacter-Spezies Campylobacter coli und jejuni wurde

bereits eine Methode publiziert, die auf dem Nachweis einer Sequenz des Flagellin-Gens beruht.

Ausgehend von diesem Nachweis konnte anhand von Sequenzvergleichen mit Hilfe der in 2.11.1 (S.

30) beschriebenen Datenbanken und Software ein modifiziertes Nachweissystem entwickelt werden,

das sich sowohl für die PCR als auch für die Real-Time PCR eignet. Das entworfene Primer- und

Sondensystem konnte durch Optimierung der Konzentrationen von Primer, Sonde, MgCl2-

Konzentration und Temperatur für den LightCycler (Roche Diagnostics, Mannheim) und das Ge-

neAMP Sequence Detection System (Applied Biosystems ABI) optimiert werden.

Bei der Überprüfung mit Target- und Nicht-Target-Stämmen zeigte das Nachweissystem eine hohe

Spezifität. Alle untersuchten Referenz-DNA-Proben von Campylobacter coli bzw. Campylobacter je-

juni-DNAs (insgesamt 58) zeigten in der Real-Time PCR positive Ergebnisse, während sämtliche

Nicht-Target-Stämme nah Verwandter (z.B. Campylobacter fetus) und anderer Spezies (z.B. Salmo-

nella spp., insgesamt 64) kein Fluoreszenzsignal ergaben.

Im vorliegenden Projekt wurde die Real-Time PCR als rasche Alternativmethode zur kulturellen Me-

thode getestet. Die hohe Spezifität der Real-Time PCR zeigte sich auch im Vergleich zum kulturellen

Nachweis. Alle untersuchten Lebensmittelproben verschiedenster Sparten, die kulturell positiv für

Campylobacter coli oder jejuni waren, erzielten auch in der Real-Time PCR positive Resultate. Aus

einer Probe konnten kulturell keine Campylobacter coli bzw. jejuni isoliert werden, während in der

Real-Time PCR ein positives Ergebnis erzielt wurde. Dieselbe Probe war auch mit dem VIDAS -

System (Immunoassay) positiv. Möglicherweise waren in dieser Probe die Campylobacter vorge-

schädigt, so dass sie zwar noch lebten, aber nicht mehr zum Wachstum auf Platte fähig waren („vi-

able but not culturable“). In diesem Fall wäre das Ergebnis der kulturellen Referenzmethode falsch-

negativ.

Mit der Methode war in der PCR und der Real-Time PCR ein sensitiver Nachweis beider Campylo-

bacter Spezies möglich: Es lassen sich mit der PCR im Agarosegel bis zu ca. 5 Kopien von Campylo-

bacter jejuni nachweisen. Da jedoch ca. 80 - 90% aller Infektionen von C. jejuni verursacht werden

fällt die etwas niedrigere Sensitivität für C. coli (ca. 50 Kopien pro Ansatz) nicht so stark ins Gewicht.

Die Real-Time PCR zeigte eine Sensitivität von ca. 5 Kopien für beide Campylobacter Spezies. Durch

Zugabe einer internen Amplifikationskontrolle, die parallel zur Zielsequenz im gleichen Ansatz amplifi-

ziert wird (Duplex-Ansatz), verringert sich die Sensitivität allerdings erheblich. Dies wird an anderer

Stelle ausführlicher diskutiert (s. 4.8, S. 110).

Die hohe Sensitivität in der Real-Time PCR konnte auch im Methodenvergleich mit dem kulturellen

Referenzverfahren bestätigt werden. Der Vergleich wurde mit artifiziell kontaminierten Lebensmittel-

proben durchgeführt. Mit der Real-Time PCR konnte bei allen dotierten Proben, die auch mit der Re-



Abschlussbericht

ferenzmethode ein positives Ergebnis zeigten, Campylobacter jejuni nachgewiesen werden. Generell

lassen sich weniger als 5 cfu / 25 g nach Anreicherung sowohl mit der kulturellen Referenzmethode

als auch mit der Real-Time PCR sicher nachweisen. In einzelnen Fällen gelang auch der Nachweis

von weniger als 2 cfu / 25 g. Dieser Nachweis ist auch in Gegenwart einer hohen Hintergrundflora

erfolgreich.

Um die Eignung der Real-Time PCR als Alternativmethode zu belegen, wurden umfassend verschie-

dene Validierungskriterien (Spezifität, Sensitivität, Nachweisgrenze etc.) geprüft. Die aus den Verglei-

chen der Real-Time PCR und der kulturellen Methode experimentell ermittelten Daten wurden als

Grundlage zur Berechnung der Validierungsparameter [36] verwendet. Eine Bewertung des Ver-

gleichs von Alternativ- und Referenzverfahren kann dann über die Berechnung des Konkordanzindex

Kappa [29] erfolgen. Der Konkordanzindex gibt das Maß der Übereinstimmung zweier Methoden be-

züglich eines Analysenparameters an und wird mit Hilfe der Ergebnisse der Validierungsparameter

berechnet.

Die Berechnung der Validierungsparameter für den Nachweis von Campylobacter coli und jejuni mit

Real-Time PCR ergaben für den Konkordanzindex eine fast vollständige Übereinstimmung von Alter-

nativ- und Referenzmethode (0,98). In der Literatur wird die Übereinstimmung zweier Nachweisme-

thoden als genügend bezeichnet, wenn Kappa grösser gleich 0,81 ist.

Vorteilhaft an der Real-Time PCR ist der rasche Nachweis, da für die Analyse nach Anreicherung nur

etwa vier bis fünf Stunden bis zum Erhalt des Ergebnisses benötigt werden.

Lebensmittelbedingte Infektionen mit thermophilen Campylobactern sind in den letzten Jahren an die

erste Stelle der häufigsten bakteriellen Enteritiserreger gerückt. Die PCR ebenso wie die Real-Time

PCR bieten hier diagnostische Werkzeuge einer hohen Spezifität und Sensitivität, die sichere Ergeb-

nisse gewährleisten und dabei gleichzeitig eine sehr rasche Analytik ermöglichen.



Abschlussbericht

4.4 Nachweis von Listeria monocytogenes mit PCR

Für den Nachweis von Listeria monocytogenes in Lebensmittelanreicherungen wurden zwei in der

Literatur veröffentlichte Methoden [10, 31, 9, 32] für die Polymerasekettenreaktion angewandt. Die

Spezifität der Nachweissysteme wurden im vorliegenden Projekt anhand von Vertretern sämtlicher

Spezies der Gattung Listeria (z.B. Listeria innocua, Listeria ivanovii etc) überprüft. Die Methoden eig-

neten sich zur Bestätigung des Ergebnisses des kulturellen Verfahrens, mit dem mehrere Isolate aus

Listeria monocytogenes verdächtigen Lebensmittelproben untersucht wurden.

Die Durchführung einer Real-Time PCR mit den genannten Proben ergab dieselben Ergebnisse. Da-

zu wurde eine publizierte Methode zum Nachweis eines Metalloprotease-Gens von Listeria monocy-

togenes [10, 31] mit einer spezifischen, fluoreszenzmarkierten Real-Time Sonde kombiniert.

Weitergehende methodische Entwicklungen und Validierungen zum Nachweis von Listeria spp. in

Lebensmitteln wurden an der Bundesforschungsanstalt für Ernährung (BfE), Karlsruhe (Prof. Dr.

Holzapfel) und am Chemischen und Veterinäruntersuchungsamt Karlsruhe (Dr. Lohneis) im Rahmen

eines Forschungsprojektes durchgeführt.

4.5 Paralleler Nachweis von Salmonella spp., Lister ia monocytogenes und ther-

mophilen Campylobactern mit dem Biochip

Der in der vorliegenden Arbeit verwendete Biochip ist ein zur Anwendung in der Lebensmittelanalytik

entwickelter Microarray. Dieser Biochip trägt kovalent gebundene Hybridisierungssonden, die die De-

tektion spezifischer DNA-Abschnitte aus thermophilen Campylobactern (Campylobacter coli, Campy-

lobacter jejuni), aus Listeria monocytogenes und aus Salmonella spp. ermöglichen. Hybridisierungs-

ereignisse von Proben-DNA mit Sonden-DNA auf dem Biochip werden als Fluoreszenzsignale visua-

lisiert und ausgewertet.

Für die Analyse mit dem Biochip wird eine Multiplex-PCR mit einer spezifischen Biochip-

Hybridisierung kombiniert. Dies ermöglicht eine eindeutige, schnelle und sensitive Detektion der Kon-

tamination von Lebensmitteln mit verschiedenen Erregern. Der Zeit- und Arbeitsaufwand liegt zwar

über dem der Real-Time PCR, allerdings besteht mit dem Biochip die Möglichkeit, eine Lebensmittel-

probe parallel auf drei pathogene Keime gleichzeitig zu untersuchen.

Die Stärken des Biochip-Verfahren liegen in der hohen Genauigkeit und der Parallelität mehrerer Un-

tersuchungen in einem Reaktionsansatz. Der Biochip eignet sich auch für die Routineuntersuchung

von Lebensmitteln auf oben genannte pathogene Keime.

Allerdings ist die Verfügbarkeit der verwendeten Biochips momentan stark begrenzt, da die Biochip-

Produktion des bis dahin einzigen Chip-Anbieters für die Lebensmittelanalytik im Zeitraum des For-



Abschlussbericht

schungsprojektes eingestellt wurde. Bis jetzt konnte daher der Biochip nur im Rahmen der Forschung

eingesetzt werden.

Die Einführung von Microarray-Systemen in die Praxis der Lebensmittelüberwachung zum gegenwär-

tigen Zeitpunkt ist momentan nur eingeschränkt möglich, da spezialisierte Anbieter kostengünstiger

Lösungen, die an entsprechende Fragestellungen adaptiert sind, fehlen.

Dennoch bietet die Biochip-Technologie ein enormes Entwicklungspotential auch für die mikrobiologi-

sche Diagnostik und erlaubt durch hohe Parallelisierung einen großen Durchsatz in kurzer Zeit. Es

können gleichzeitig Kontaminationen mit den wichtigsten pathogenen Keimen in Lebensmitteln sensi-

tiv und spezifisch detektiert werden. Für Lebensmittelproben, bei denen eine möglichst schnelle Ana-

lytik im Vordergrund steht, könnte der Einsatz des Chip-Verfahrens in den kommenden Jahren an

Bedeutung gewinnen.

4.6 Nachweis von enterohämorrhagischen E. coli (EHE C)

Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) sind in der Lage, pathogenetisch wichtige Shigatoxi-

ne bzw. Verotoxine zu bilden. Bei einer Humaninfektion, die häufig lebensmittelbedingt ist, verursa-

chen sie Gastroenteritis, hämorrhagische Colitis oder auch ein hämolytisch-urämisches Syndrom.

In der Literatur sind mehrere Virulenzfaktoren beschrieben, darunter die beiden Shigatoxine (stx 1

und stx 2), das Membranprotein Intimin, das als Adhäsionsfaktor wirkt, und das EHEC-Hämolysin.

In einer Studie des Robert-Koch-Instituts [37] konnte gezeigt werden, dass 70 % aller 600 untersuch-

ten VTEC-Stämme stx 1-Gene enthielten und ca. 52 % der Stämme stx 2-Gene, die in der Regel mit

hoher Virulenz einhergehen. In 62% der untersuchten Stämme wurden zudem Intimin-Gene nachge-

wiesen, wobei 96% der Intimin-positiven Stämme ebenfalls Gene für das EHEC-Hämolysin besaßen

(und etwas 65% der Intimin-negativen Stämme).

Für die Untersuchung von E. coli aus Lebensmittelanreicherungen im Rahmen dieses Projektes wur-

de der PCR Nachweis verwendet, der in der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach

§35 LMBG veröffentlicht wurde. Alle in der PCR negativen Proben zeigten auch mit der kulturellen

Nachweismethode ein negatives Ergebnis. Die beiden Proben, die in der Screening-PCR positive

Ergebnisse für VTEC ergaben, waren darüber hinaus positiv für die Shigatoxingene stx 1 und stx 2,

sowie für Intimin und Hämolysin. Im kulturellen Nachweis für EHEC O157:H7 ergaben diese Proben

ebenfalls ein positives Resultat.

Bei den Untersuchungen traten zwei Proben auf, die in der VTEC-Screening-PCR negativ waren,

aber beim eae-Nachweis (Intimin) ein positives Resultat ergaben. Dies könnte ein Hinweis darauf

sein, dass die untersuchte Probe möglicherweise nicht mit EHEC kontaminiert war, sondern mit der

Gattung Shigella. Bei den mit E. coli nah verwandten Shigella-Spezies können diese Virulenzfaktoren

ebenfalls auftreten.



Abschlussbericht

Einige Proben wurden außerdem auch mittels Real-Time PCR getestet. Dabei wurden die beiden

Shigatoxine stx 1 und stx 2 nachgewiesen. Die Ergebnisse stimmten mit denen der PCR und der kul-

turellen Untersuchung auf EHEC O157:H7 überein.

Laut Literatur gehören in Deutschland etwa 69 % aller VTEC zu elf beschriebenen Serotypen [37].

Als häufigste Typen werden seit 1998 O157:H7 an erster Stelle, gefolgt von O26:H11 und O103:H2

genannt [37,39]. 80 % aller VTEC-Isolate, die im Nationalen Referenzzentrum (NRZ Wernigerode)

typisiert werden, gehören jedoch nicht zu den „klassischen“ O157-Stämmen.

Mit dem kulturellen Nachweisverfahren kann nur der Serotyp EHEC O157:H7 nachgewiesen werden.

In den letzten Jahren tritt dieser Serotyp mehr in den Hintergrund, während andere, auch bisher nicht

beschriebene Serotypen vermehrt auftreten [39]. Mit der PCR und auch der Real-Time PCR können

durch den molekularbiologischen Nachweis der Toxingene sämtliche Serotypen sicher erfasst wer-

den.

Hierfür bietet die PCR und auch die Real-Time PCR eine umfassende Lösung, da auf der geneti-

schen Ebene ein Nachweis der verschiedensten Serotypen möglich ist.

Problematisch an den kulturellen Nachweisverfahren ist auch die Schwierigkeit, geeignete Selektiv-

medien zu entwickeln, die eine eindeutige Zuordnung anhand der Morphologie und der Wachstums-

bedingungen ermöglichen. Häufig auftretende atypische EHEC-Stämme erschweren dabei den spezi-

fischen Nachweis [2].

Für eine sichere und umfassende diagnostische Erfassung aller Serotypen shigatoxinbildender E.

coli, bietet sich die PCR und Real-Time PCR an. Die nach §35 LMBG vorgesehene Methode [11]

ermöglicht die Isolierung der EHEC durch DNA-Hybridisierungstechnik (Kolonieblothybridisierung).

Gleichzeitig liegt damit eine spezifische PCR-Methode vor, mit der sämtliche Serotypen erfasst wer-

den.



Abschlussbericht

4.7 Nachweis von Mycobacterium avium paratuberculos is (MAP) mit PCR

Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Paratuberkulose oder Johne’schen

Erkrankung, einer chronisch entzündlichen Krankheit beim Rind. In den letzten Jahren wurde immer

wieder in der Literatur ein möglicher Zusammenhang zwischen dem Erreger der Paratuberkulose und

der Krankheit Morbus Crohn beim Menschen diskutiert [4, 5]. In einigen Fällen konnten bei Morbus-

Crohn-Patienten MAP isoliert bzw. DNA-Sequenzen von MAP gefunden werden. Die Übertragung

von MAP auf den Menschen könnte u.a. über Rohmilch und Milch geschehen [6]. In der vorliegenden

Arbeit wurde zum Nachweis von MAP in Milch eine PCR für MAP aus Kotproben auf die Anwendung

für Milchproben adaptiert [13]. Dazu wurden Milchproben von Rindern, von denen mehrere Tiere an

Mastitis erkrankt waren, mit PCR auf MAP untersucht.

Die untersuchten Rohmilchproben waren im PCR-Nachweis für MAP jedoch alle negativ. Daher konn-

te noch nicht beurteilt werden, ob das verwendete PCR-System sich für diese Anwendung eignet. Mit

dem optimierten DNA-Extraktionsverfahren für Mikroorganismen aus Milchproben konnte aber aus-

reichend DNA für die PCR gewonnen werden, was an der tierartspezifischen Kontroll-PCR (spezifisch

für Rind) deutlich wurde.

In weiteren Versuchen muss die Methode genauer validiert und ihre Eignung auch anhand von positi-

vem Probenmaterial überprüft werden. Mit der Etablierung einer sensitiven und zuverlässigen mole-

kularbiologischen Methode könnte das langwierige kulturelle Verfahren, die bis zu 6 Monate dauernde

Anzucht von Mycobacterium avium paratuberculosis, durch ein schnelles Screening unterstützt wer-

den.



Abschlussbericht

4.8 Interne Amplifikationskontrolle für die PCR und Real-Time PCR

Für einen sicheren Nachweis von DNA aus Mikroorganismen mittels PCR und Real-Time PCR sind

folgende Kontrollen unbedingt erforderlich: eine Positivkontrolle der Reaktion, eine Reagenziennega-

tivkontrolle und eine geeignete Inhibitionskontrolle.

Eine erfolgreiche PCR bzw. Real-Time PCR ist abhängig davon, dass die Amplifikation nicht z.B.

durch störende Begleitsubstanzen aus der Probenmatrix inhibiert wird.

Ein negatives PCR-Ergebnis kann nicht nur an der Abwesenheit von Target-DNA liegen, sondern

unter Umständen auf die Unfähigkeit zurückzuführen sein, die vorhandene Target-DNA zu amplifizie-

ren [41].

Ein solches falsch-negatives Ergebnis, tritt z.B. dann auf, wenn in komplexen Proben Inhaltsstoffe

des Lebensmittels, die Hintergrundflora oder das Nährmedium als Inhibitoren wirken. Dann kann die

DNA-Extraktion gestört werden oder die Funktion der DNA-Polymerase teilweise oder ganz inaktiviert

werden [42, 43]. Diese Inhibition wird nicht durch die Positivkontrolle der PCR erkannt, wie es bei

Ausfällen der PCR durch Fehlfunktionen des PCR-Gerätes, falsche Reagenzien-Mixe oder eine

schlechte Polymerase-Aktivität der Fall ist.

Die Inhibitionskontrolle muss für jede einzelne Probe durchgeführt werden und muss dann ein positi-

ves Signal erzielen, wenn in der Probe keine Target-DNA vorhanden ist, es sich also um ein tatsäch-

lich negatives Ergebnis handelt. Auf diese Weise können negative Ergebnisse als sicher negativ bes-

tätigt werden.

Um eine mögliche Inhibition zu erkennen, können verschiedene Strategien verfolgt werden. Es kann

entweder eine Kontrollreaktion in einem zweiten Ansatz durchgeführt werden oder eine interne Kon-

trolle, basierend auf einer künstlichen oder natürlichen Sequenz, die parallel zum Nachweissystem

amplifiziert wird.

Der Vorteil der internen Positivkontrolle liegt darin, dass die Target-DNA aus der Probe und die Kon-

troll-Sequenz in ein- und derselben Reaktion nachgewiesen werden. Da die interne Positivkontrolle

mit dem Target-System um die verfügbaren PCR-Reagenzien konkurriert, muss sie in möglichst nied-

riger Konzentration eingesetzt werden. Gleichzeitig muss die Menge hoch genug sein, um eine stabile

Amplifikation der Kontrolle zu gewährleisten.

Im vorliegenden Projekt wurde eine interne Positivkontrolle (IPC) entworfen, die mit Hilfe eines zwei-

ten Fluoreszenzfarbstoffes parallel zum Nachweissystem in der Real-Time PCR amplifiziert und de-

tektiert wird. Von dieser IPC konnte die geringste reproduzierbare Konzentration, die in der Real-

Time PCR stabile Signale erzielt, bestimmt werden.

Die IPC ließ sich ohne Schwierigkeiten z.B. mit dem Nachweissystem für Salmonella spp. kombinie-

ren und als Duplex-Ansatz durchführen. Hierbei wurde weder die Spezifität noch die Sensitivität be-

einflusst.



Abschlussbericht

Der Versuch, das gleiche interne Positivkontrollsystem mit dem Nachweis für Campylobacter coli und

jejuni zu kombinieren, ergab jedoch einen deutlichen Verlust der Sensitivität. Auch in der Literatur

wird davon berichtet, dass Duplex-Systeme unter Umständen zu einem hohen Sensitivitätsverlust

führen können [43, 44]. Dabei kann es vorkommen, dass die Sensitivität verschiedener Nachweissys-

teme von der Koamplifikation mit dem Kontrollsystem unterschiedlich stark beeinflusst werden kann

[44]. Die Spezifität bleibt in der Regel unverändert.

Verschiedene Autoren fordern das Mitführen einer Inhibitionskontrolle für jegliche diagnostische PCR

und Real-Time PCR [40, 45]. Die Amplifizierbarkeit der untersuchten DNA muss kontrolliert werden,

da falsch-negative Ergebnisse das hohe Risiko einer nicht erkannten aber tatsächlich vorhandenen

Kontamination bergen.

In den von Hoorfar et al. publizierten Empfehlungen zum Entwurf einer internen Amplifikationskontrol-

le wird die Strategie eines kompetitiven Duplex-Ansatzes von Probe und Kontrolle befürwortet [45].

Im vorliegenden Projekt hat sich der Einsatz der IPC im Duplex-Ansatz für die beiden betrachteten

Nachweissysteme unterschiedlich ausgewirkt. Während für den Nachweis von Salmonella spp. die

entwickelte interne Positivkontrolle als effektive Kontrolle der Inhibition eingesetzt werden kann, emp-

fiehlt sich dagegen für den Real-Time PCR Nachweis von Campylobacter coli und jejuni besser ein

Doppelansatz zur Inhibitionskontrolle. Im kompetitiven Ansatz führt die Verwendung der IPC (auch in

sehr geringer Konzentration) bei diesem Nachweis zu einer verringerten analytischen Sensitivität der

Methode.

Die PCR zum Nachweis pathogener Mikroorganismen in Lebensmitteln muss in jedem Falle eine ad-

äquate Kontrolle der Amplifikation beinhalten. Gleichzeitig sollte eine maximale Sensitivität der Nach-

weismethoden angestrebt werden. Daher müssen im Einzelnen für verschiedene Nachweise gegebe-

nenfalls unterschiedliche Kontrollansätze bevorzugt werden. Eine wirkungsvolle Kontrolle der Inhibiti-

on kann sowohl im Duplex-Ansatz als auch im Doppelansatz mit einer externen Kontrolle erzielt wer-

den.

Zusammenfassung 112 von 119 Seiten


Abschlussbericht

5 Zusammenfassung

Die rasante Zunahme und Ausbreitung an nukleinsäurebasierten Nachweismethoden seit der Erfin-

dung der Polymerasekettenreaktion 1985 und der Entwicklung der Real-Time PCR in den 1990er

Jahren greift auch vermehrt auf die Untersuchung von Lebensmitteln auf Mikroorganismen über. Da-

bei können gleichermaßen erwünschte Mikroorganismen (z.B. Starterkulturen) sowie unbeabsichtig-

ten oder pathogene Kontaminanten (z.B. Enteritis-Erreger) erkannt werden.

Das vorliegende Forschungsprojekt beinhaltet den molekularbiologischen Nachweis mehrerer patho-

gener Keime aus Lebensmitteln. Es wurden sowohl bereits veröffentlichte molekularbiologische Un-

tersuchungsmethoden auf ihre Praktikabilität, Sensitivität und Spezifität geprüft, als auch darauf auf-

bauend neue und optimierte Schnellverfahren vor allem mit der Real-Time PCR entwickelt.

Zunächst wurden für die Extraktion von Nukleinsäuren aus komplexen Matrices verschiedene Verfah-

ren erprobt und an die Bedingungen der Lebensmittelproben angepasst. Für die DNA-basierten Erre-

gernachweise wurden anschließend verschiedene Methoden entwickelt bzw. etabliert.

Der Nachweis von Salmonella spp. wurde basierend auf einer bereits publizierten Methode im Rah-

men dieser Arbeit für den Einsatz in der amtlichen Überwachung etabliert. Zusätzlich wurde als Wei-

terentwicklung dieser Methode eine Real-Time PCR entworfen und validiert. Ein Vergleich mit dem

kulturellen Nachweis wurde anhand artifiziell dotierter Proben und Routineproben gezogen. Die Real-

Time PCR zeigte eine hohe Spezifität und Sensitivität und führte in der Regel zu den gleichen Ergeb-

nissen wie der kulturelle Nachweis. Es konnten damit bis zu ca. 10 Kopien Salmonella-DNA pro An-

satz sicher nachgewiesen werden, bzw. weniger als 5 Keime pro 25 g Lebensmittel nach Anreiche-

rung detektiert werden.

Daneben wurde die Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) zur genauen Typisierung von Salmonella-

Serovaren eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass für einen möglichst raschen und sicheren Nach-

weis die Real-Time PCR am Besten geeignet ist, während die PFGE das passende Werkzeug für

eine differenzierte epidemiologische Untersuchung bietet. So können PCR und Real-Time PCR für

die amtliche Überwachung zum raschen Screening eingesetzt werden, an das sich im positiven Falle

eine mikrobiologische Differenzierung und evtl. eine molekularbiologische Serotypisierung mittels

PFGE anschließen kann.

Der Nachweis von thermophilen Campylobactern wurde mittels PCR etabliert und zudem eine Real-

Time PCR neu entwickelt. Diese Methode wurde anhand künstlich dotierter Proben sowie Routine-

Proben sämtlicher Lebensmittelsparten validiert. Der Vergleich mit der kulturellen Methode zeigte für

die Real-Time PCR eine Spezifität (Exklusivität) von 100% und eine Sensitivität (Inklusivität) von

98,1% und damit statistisch eine fast vollständige Übereinstimmung. Die Nachweisgrenze für die Re-

al-Time PCR betrug ca. 5 DNA-Kopien pro Ansatz; im Vergleich mit der kulturellen Methode konnten

weniger als 5 Keime pro 25 g Lebensmittel nach Anreicherung sicher nachgewiesen werden.

Zusammenfassung 113 von 119 Seiten


Abschlussbericht

Für die beiden Nachweismethoden von Salmonella spp. und Campylobacter coli bzw. jejuni wurde zur

Vermeidung falsch-negativer PCR-Ergebnisse eine Amplifikationskontrolle entwickelt und etabliert.

Damit kann für jede einzelne Nukleinsäureextraktion eine geeignete Inhibitionskontrolle mitgeführt

werden, um die Amplifizierbarkeit und -effizienz der isolierten DNA aus der jeweiligen Probenmatrix

zu überprüfen. Für die verschiedenen Nachweise wurden mit interner Inhibitionskontrolle im Duplex-

Ansatz und externer Inhibitionskontrolle unterschiedliche Strategien verfolgt.

Des weiteren wurden molekularbiologische Erregernachweise für Listeria monocytogenes, enterohä-

morrhagische E. coli (EHEC bzw. VTEC) und Mycobacterium avium paratuberculosis mit PCR bzw.

Real-Time PCR etabliert und mit Lebensmittelproben parallel zum kulturellen Nachweis vergleichend

untersucht. Insbesondere beim Nachweis von EHEC können mit der Polymerasekettenreaktion und

der Real-Time PCR einzelne Virulenzfaktoren spezifisch nachgewiesen werden. Die PCR für

EHEC/VTEC bietet eine sichere und umfassende Detektion aller Serotypen der verotoxinbildenden E.

coli und gleichzeitig eine Differenzierung nach den unterschiedlichen Virulenzfaktoren, welche kultu-

rell derzeit so nicht möglich ist.

Insgesamt gesehen zeigte sich für die verschiedenen Anwendungen der PCR und der Real-Time

PCR eine hohe Spezifität und Sensitivität. Gerade Real-Time PCR basierte Verfahren bieten für die

amtliche Überwachung moderne Möglichkeiten der schnellen und verlässlichen Detektion pathogener

Keime in Lebensmittelproben. Im Rahmen des Projektes wurden mehrere solcher Methoden auf ihre

Praxistauglichkeit überprüft, validiert und in die Überwachung eingeführt. Durch eine rasche, spezifi-

sche und zuverlässige Erkennung von Infektionserregern können Lebensmittel, von denen eine ge-

sundheitliche Gefährdung für den Menschen ausgeht, schnellstmöglich aus dem Verkehr gezogen

werden.

Literaturverzeichnis 114 von 119 Seiten


Abschlussbericht

6 Literaturverzeichnis

[1] Epidemiologisches Bulletin. 2003. Nr 50. Robert-Koch-Institut. www.rki.de

[2] Manafi M. Die Diagnostik enterohämorrhagischer Escherichia coli (EHEC) in Lebensmitteln: Aktu-

eller Stand. Hygiene-Institut, Universität Wien. http://www.univie.ac.at/hygiene-aktuell/

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[4] El-Zaatari FA, Osato MS, Graham DY. 2001. Etiology of Crohn’s disease – the role of Mycobacte-

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[6] Brennpunkt Lebensmittelsicherheit 2004. Behr’s Verlag, Hamburg. 11/04: 20-21

[7] Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §35 LMBG (Lebensmittel- und Bedarfsge-

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[33] LMBG §35. Ziffer 00.00-32 „Horizontales Verfahren für den Nachweis und die Zählung von Liste-

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Abschlussbericht

[34] LMBG §35. Ziffer 00.00-68 „Untersuchung von Lebensmitteln - Horizontales Verfahren für den

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[46] Brandis H, Eggers HJ, Köhler W, Pulverer G. Lehrbuch der medizinischen Mikrobiologie. 7. Auf-

lage 1994. Gustav Fischer Verlag.

[47] Lebensmittelrecht. Loseblatt-Textsammlung. C.H. Beck’sche Verlagsbuchhandlung München:

Eiprodukte-Verordnung (Anlage 1 Kap. II Nr. 4.1.2 zu § 2), Beck Nr. 4520. Milch-Verordnung (Anlage

6 Nr. 3.3.1.1 zu § 6 Abs. 2 Nr. 3), Beck Nr. 4800. Fischhygiene-Verordnung (Anlage 2 Kap. 5 zu § 11

Nr. 4 für lebende Muscheln, § 16 Abs. 1 Nr. 8 für gekochte Krebs- und Weichtiere). Beck Nr. 4170.



Abschlussbericht

Fleischhygiene-Verordnung (Anlage 2a Nr. 9.3 und 9.4 zu § 10a) Beck Nr. 3420.

[48] LMBG §35 Ziffer 00.00-52. Untersuchung von Lebensmitteln - Verfahren zum Nachweis von

Salmonellen.

[49] LMBG §35 Ziffer 00.00-20. Untersuchung von Lebensmitteln - Horizontales Verfahren für den

Nachweis von Salmonellen.

Anhang 118 von 119 Seiten


Abschlussbericht

7 Anhang

7.1 Poster und Tagungsbeiträge

1. Wieland A, Huber, I, Mäde D, Müller-Hohe, E, Geppert J, Pietsch K. Rapid detection of Salmonella

spp. In food by Real-Time PCR. 5. Weltkongress Lebensmittelinfektionen und - intoxikationen. Berlin,

07.06.-11.06.2004.

2. Wieland A, Huber I, Mäde D, Müller-Hohe E, Steegmüller J, Pietsch, K. Schnellverfahren zum

Nachweis von Salmonella spp. in Lebensmitteln mit Real-Time PCR. Symposium „Schnellmethoden

und Automatisierung in der Lebensmittel-Mikrobiologie“ an der Fachhochschule Lippe und Höxter.

Lemgo, 14.07.-16.07.2004.

3. Wieland A, Huber I, Mäde D, Müller-Hohe E, Steegmüller J, Pietsch, K. Nachweis von Campylo-

bacter coli und Campylobacter jejuni in Lebensmitteln mit Real-Time PCR. 45. Arbeitstagung Le-

bensmittelhygiene der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft. Garmisch-Partenkirchen,

28.09.-01.10.2004.

7.2 Abkürzungsverzeichnis

%(v/v) Volumenprozent pro Volumen

% (w/v) Gewichtsprozent pro Volumen

bp Basenpaar(e)

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

ca. circa

cfu colony-forming units

Ct Schwellenwertcyclus (threshold cycle)

DNA Desoxyribonucleinsäure (deoxyribonucleic acid)

ds DNA doppelsträngige DNA

EDTA Ethylendiamintetraacetat, Dinatriumsalz-Dihydrat

EtBr Ethidiumbromid

EtOH Ethanol

f femto

FAM 5,6-Carboxyfluorescein

FRET Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer

g Erdbeschleunigung oder Gramm

ggf. gegebenenfalls

Anhang 119 von 119 Seiten


Abschlussbericht

h Stunde(n)

HEX 5,6-Carboxy-4,7,2’,4’,5’,7’-hexachlorofluorescein

l Liter

m Meter oder milli

M Molar

min Minute

n nano

NaAc Natriumacetat

NCBI National Center for Biotechnology Information

OD Optische Dichte

p pico

PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)

PFGE Pulsfeldgelelektrophorese

rpm Umdrehungen pro Minute

s Sekunden

s. siehe

S. Seite

SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulphate)

t Zeit (time)

T Temperatur

TAMRA Tetramethyl-6-carboxyrhodamin

Taq Thermus aquaticus

TE Tris-HCl-EDTA-Puffer

Tm Schmelztemperatur

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

Tris-HCl Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid

U Aktivitätseinheit für Enzyme (units)

u.a. unter anderem

UV Ultraviolett

µ mikro

v Volumen

V Volt

vgl. vergleiche

W Gewicht (weight)

z.B. zum Beispiel

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Nachweis von humanpathogenen Mikroorganismen in ... · Inhaltsverzeichnis 3 von 119 Seiten Forschungsvorhaben “Nachweis von humanpathogenen Mikroorganismen in Lebensmitteln mittels