Organische Nitrate und experimenteller Diabetes mellitus: Ein Vergleich zwischen Pentaerithrityltetranitrat und Isosorbiddinitrat Organische Nitrate und

Organische Nitrate und experimenteller Diabetes mellitus: Organische Nitrate und experimenteller Diabetes mellitus: Ein Vergleich zwischen Ein Vergleich zwischen

Pentaerithrityltetranitrat und IsosorbiddinitratPentaerithrityltetranitrat und IsosorbiddinitratMatthias Oelze1, Swenja Schuhmacher1, Philip Wenzel2, Christian Hochmuth1,

Sebastian Steven1, Tjebo Heeren1, Eberhard Schulz2, Dirk Stalleicken3,

Thomas Münzel2 und Andreas Daiber1

1Universitätsklinikum Mainz, II. Med. Klinik, Abteilung für Molekulare Kardiologie, Mainz2Universitätsklinikum Mainz, II. Med. Klinik und Poliklinik, Mainz3Actavis Deutschland GmbH, Langenfeld

Mit freundlicher Unterstützung von Actavis Deutschland GmbH

16. ExpertentreffenPentaerrithrityltetranitrat

Magdeburg, 17. Okt. 2009

Hintergrund I:Hintergrund I:PETN induziert keine Nitrat- und cross-ToleranzPETN induziert keine Nitrat- und cross-Toleranz

Wenzel, Oelze et al, . Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007

Hintergrund II:Hintergrund II:PETN vs. ISMN bei chronischer Angiotensin-II BehandlungPETN vs. ISMN bei chronischer Angiotensin-II Behandlung

In verschiedenen Tiermodellen der Hypertonie unterdrückt PETN im Gegensatz zu ISMN kardialen und vaskulären oxidativen Stress und normalisiert teilweise die Gefäßfunktion

PETN potenziert (tendenziell) und ISMN reduziert die HO-1 Expression


Mit

och

on

dri

al R

OS

by

L-0

12 E

CL

[co

un

ts/m

in] N

AD

PH

-oxid

ase activityb

y Lu

cigen

in 5 µ

M E

CL

[co

un

ts/min

]

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

Mitochondrial ROS

NADPH-oxidase activity

*# *# *# *#

*

Heart:

Ctr AT-II AT-II AT-IIDMSO DMSO +PETN +ISMN

0

50

100

150

200

250

300

0

50

100

150

200

250

Lucigenin [5µM] ECL

DHE staining

*# *#*

*

*

DH

E s

tain

ing

IOD

[ar

bit

rary

un

its]

Lu

cigen

in 5 µ

M E

CL

[cou

nts/m

in/m

g]

Aorta:

P < 0,05

* vs. Ctr/DMSO

# vs. AT-II + PETN


0

20

40

60

80

100

-9 -8,5 -8 -7,5 -7 -6,5 -6 -5,5

Ctr/DMSO n= 41Ang-II/DMSO n= 57Ang-II+PETN n= 46Ang-II+ISMN n= 36

ACh-response

% r

ela

xa

tio

n

Log M (ACh)

0

20

40

60

80

100

-9 -8 -7 -6 -5

Ctr/DMSO n= 43Ang-II/DMSO n= 53

Ang-II+PETN n= 50Ang-II+ISMN n= 34

GTN-response

% r

ela

xa

tio

n

Log M (GTN)

% r

ela

xa

tio

n

HO-1

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Ctr/DMSO AT-II/DMSO AT-II+PETN AT-II+ISMN

HO-1

0

50

100

150

200

250

300

Ctr/DMSO

Ang-II/DMSO

Ang-II+PETN

Ang-II+ISMN

% o

f C

tr/D

MS

O

Ctr AT-II AT-I AT-IIDMSO DMSO +PETN +ISMN

**

*#

-Actinin -

HO-1 -

HO-1 ProteinHO-1 mRNA

Ctr AT-II AT-II AT-IIDMSO DMSO +PETN +ISMN

mR

NA

Exp

ress

ion

(Fol

d ch

ange

)

**

#+

P<0.05: * vs. Ctr/DMSO; # vs. AT-II+PETN

Hintergrund III:Hintergrund III:STZ induzierter STZ induzierter Diabetes mellitusDiabetes mellitus Typ 1 im Rattenmodel Typ 1 im Rattenmodel

Deutlich reduzierte Gewichtszunahme

Stark erhöhte Blutzuckerspiegel

Gefäßdysfunktion

Anstieg der NADPH-Oxidase Aktivität

Vaskulärer und kardialer oxidativer Stress


entnommen aus: Wenzel, Schulz et al., entnommen aus: Wenzel, Schulz et al., Free Radic Biol MedFree Radic Biol Med 20082008

Blood glucose level Weigh gain

0

20

40

60

80

100

-9 -8,5 -8 -7,5 -7 -6,5 -6 -5,5

Ctr, n=18

STZ, n=28

ACh-response

% r

elax

atio

n

Log M (ACh)

0

20

40

60

80

100

-9 -8 -7 -6 -5

Ctr, n=18

STZ, n=27

NTG-response

% r

elax

atio

n

Log M (NTG)

ACh response GTN response

Log M (ACh) Log M (GTN)


IOD

(ar

bit

rary

un

its)

Vascular O2-. Prod.

DHE staining

Ctr STZ

Lu

cig

enin

[5

µM

] C

LC

ou

nts

/mg

/min

Cardiac NADPH oxidase activity

Ctr STZ

Cardiac mitochondriaROS detection

L-0

12 [

100

µM

] C

LC

ou

nts

/mg

/min

Ctr STZ

entnommen aus: Wenzel, Schulz et al., entnommen aus: Wenzel, Schulz et al., Free Radic Biol MedFree Radic Biol Med 20082008

FragestellungFragestellung

I. Zeigt eine Therapie mit PETN positive

Effekte in einem Tiermodel eines

Streptozotozin (STZ) induzierten

Diabetes mellitus Typ 1

II. Welche Effekte zeigen sich im

Vergleich dazu bei einer Therapie mit

Isosorbiddinitrat (ISDN)

TiermodelTiermodel

Männliche Wistar Ratten (230-250 g)

Diabetes Induktion über eine einmalige i.v. Injektion

(STZ: 60 mg/kg) 8 Wochen vor Versuchsbeginn

Behandlung mit PETN (15 mg/kg/d) oder ISDN (10

mg/kg/d) über Futterbeimischung 7 Tage nach STZ-

Injektion für 7 Wochen

TiermodelTiermodel







Behandlung mit ISMN (75 mg/kg/d) über Trinkwasser

7 Tage nach STZ-Injektion für 7 Wochen

TiermodelTiermodel







Behandlung mit ISMN (75 mg/kg/d) über Trinkwasser

7 Tage nach STZ-Injektion für 7 Wochen

Insulin (2,5 U/d) über subcutane osmotische

Minipumpen für 14 Tage (Woche 7 u. 8)

Ergebnisse I: STZ+Insulin Ergebnisse I: STZ+Insulin Gewicht und BlutzuckerGewicht und Blutzucker

weight gain

0

50

100

150

200

250

Ctr STZ +Insulin

[g]

Ctr STZ +Ins

*#

*

weigh gain BZ

0

200

400

600

800

1000

Ctr STZ +Insulin

[mg

/dl]

Ctr STZ +Ins

#

*

blood glucose

P<0.05: * vs. Ctr; # vs. STZ

Ergebnisse I: STZ+Insulin Ergebnisse I: STZ+Insulin AortaAorta

0

20

40

60

80

100

-9 -8,5 -8 -7,5 -7 -6,5 -6 -5,5

Ctr n= 40STZ n= 39

STZ+Insulin n= 38

ACh-response

% r

elax

atio

n

Log M (ACh)

0

20

40

60

80

100

-9 -8 -7 -6 -5

Ctr n= 43

STZ n= 40

STZ+Insulin n= 32

GTN-response

% r

ela

xa

tio

nLog M (GTN)

0

20

40

60

80

100

-10 -9 -8 -7 -6 -5

Ctr n= 36

STZ n= 33

STZ+Insulin n= 26

DEANONOate-response

% r

ela

xa

tio

n

Log M (DEANONOate)

% r

elax

atio

n ACh-response GTN-response DEANO-response

Log M (ACh) Log M (GTN) Log M (DEANO)

Ctr STZ +Ins

P<0.05: * vs. Ctr; # vs. STZ

020406080

100120

Ctr STZ +Ins

arbi

trary

uni

ts[IO

D]

*

#

Ctr STZ +Ins

DHE staining of rat aortic rings

arb

itra

ry u

nits

[IO

D]

Ergebnisse I: STZ+InsulinErgebnisse I: STZ+Insulin Herz und BlutserumHerz und Blutserum

0

2000

4000

6000

8000

[co

un

ts/3

0s]

NADPH-oxidase activityby Lucigenin 5 µM ECL in heart

Ctr STZ +Ins

*#

-0,03

-0,025

-0,02

-0,015

-0,01

-0,005

0

Decre

ase in

DP

P R

ad

ical [5

17 n

m]

*

*#

Ctr STZ +Ins

Reduction of DPP-radicalîn blood serum

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

[co

un

ts/3

0s]

Mitochondrial ROSby L-012 ECL in heart

*#

Ctr STZ +Ins

P<0.05: * vs. Ctr; # vs. STZ

Ergebnisse I: STZ+InsulinErgebnisse I: STZ+Insulin Proteine Proteinexpression in Aorta (WB)xpression in Aorta (WB)

0

50

100

150

200

Ctr STZ +Insulin

% o

f C

tr

Nox1

Ctr STZ +Ins-Act.

Nox1

*

#

Nox2

0

50

100

150

200

250

Ctr STZ +Insulin

% o

f C

tr

Nox2

Ctr STZ +Ins-Act.

*

#

0

50

100

150

200

250

Ctr STZ +Insulin

% o

f C

tr

eNOS

Ctr STZ +Ins

-Act.

eNOS

*#

0

50

100

150

Ctr STZ +Insulin

% o

f C

trGCH-1

Ctr STZ +Ins-Act.

GCH-1

*#

0

50

100

150

200

Ctr STZ +Insulin

% o

f C

tr

DHFR

Ctr STZ +Ins-Act.

DHFR

*

#

P<0.05: * vs. Ctr; # vs. STZ

Ergebnisse II: STZ + NitrateErgebnisse II: STZ + Nitrate Gewichtsveränderungen und BlutzuckerGewichtsveränderungen und Blutzucker

P<0.05: * vs. Ctr; # vs. STZ

weight gain

0

50

100

150

200

250

Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN

[g]


**

* *

weigh gain BZ

0

200

400

600

800

1000

1200


[mg

/dl]


*

*#

**

blood glucose

Ergebnisse II: STZ + NitrateErgebnisse II: STZ + Nitrate HerzHerz

NADPH-oxidase activity by Lucigenen 5 µM ECL

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000[c

ou

nts

/30

s]


**+^

# *+

Mitochondrial ROS by L-012 ECL

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

[co

un

ts/3

0s

]

n.d.


#*

*

n.d.


NADPH-oxidase activity by 2-HE HPLC

0

20

40

60

80

100

120

140

160

De

cre

as

e in

DP

P R

ad

ica

l[5

17

nm

]

n.d.

#

**+

n.d.

P<0.05: * vs. Ctr; # vs. STZ; + vs. STZ+PETN; ^ vs. STZ+ISDN

Ergebnisse II: STZ + NitrateErgebnisse II: STZ + Nitrate BlutserumBlutserum

P<0.05: * vs. Ctr; # vs. STZ; + vs. STZ+PETN

Reduction of DPP radical in serum

-0,030

-0,025

-0,020

-0,015

-0,010

-0,005

0,000

De

cre

as

e i

n D

PP

Ra

dic

al

[51

7 n

m]


*+*

*

*#

Xanthine oxidase activity in serum- cytochrome c reduction at 550 nm

0,00

0,01

0,01

0,02

0,02

0,03

n.d.


#

n.d.

*

#

[µM

Sup

erox

id/3

0s]

Ergebnisse II: STZ + NitrateErgebnisse II: STZ + Nitrate AortaAorta

*

0

20

40

60

80

100

120

arb

itra

ry u

nit

s [

IOD

]

*+

*#

*


ROS production: DHE staining of aortic cryosections


0

20

40

60

80

100

-9 -8,5 -8 -7,5 -7 -6,5 -6 -5,5

Ctr n= 57

STZ n= 60

STZ+PETN n= 38

STZ+ISDN n= 50

STZ+ISMN n= 12

ACh-response

% r

ela

xa

tio

n

Log M (ACh)

0

20

40

60

80

100

-9 -8 -7 -6 -5

Ctr n= 77

STZ n= 74

STZ+PETN n= 47STZ+ISDN n= 59

STZ+ISMN n= 10

GTN-response

% r

ela

xa

tio

n

Log M (GTN)

0

20

40

60

80

100

-10 -9 -8 -7 -6 -5

Ctr n= 66

STZ n= 72

STZ+PETN n= 41STZ+ISDN n= 56

STZ+ISMN n= 12

DEANO-response

% r

ela

xa

tio

n

Log M (DEANO)Log M (ACh) Log M (GTN) Log M (DEANO)

Ergebnisse II: STZ + NitrateErgebnisse II: STZ + Nitrate Proteinexpression in Aorta (WB)Proteinexpression in Aorta (WB)



eNOS

0

100

200

300


% o

f C

tr * ***+

eNOS –-Actin -

GCH-1

0

50

100

150


% o

f C

tr


*

# #

-Actin -GCH-1 -

DHFR

0

50

100

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200


% o

f C

tr


* *#+^

*

-Actin -DHFR -

Nox1

0

50

100

150

200

250


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* **

*

Nox1 –-Actin -

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050

100150200250300


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*#

Nox2 –-Actin -

HO-1

0

100

200

300


% o

f C

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* **+

*

-Actin -HO-1 -

ZusammenfassungZusammenfassung

Eine Behandlung mit PETN zeigt im Tiermodell des Diabetes mellitus Typ 1 in der Mehrzahl der gemessenen Parameter positive Effekte auf die Funktion des karidio-vaskulären Systems

Gegenüber einer ISDN-Co-Behandlung sind die antioxidativen Effekte von PETN deutlich ausgeprägter

Für die vaskuläre Funktion konnte für beide Nitrate eine analog positive Wirkung beobachtet werden

In Übereinstimmung mit vorangegangenen Studien zeigte eine Behandlung mit dem Mononitrat ISMN keine protektiven Effekte

Die Verabreichung von Insulin normalisierte alle gemessenen Parameter und identifiziert die kardio-vaskulären Beeinträchtigungen als Folge eines Diabetes mellitus

Vielen Dank für ihre Aufmerksamkeit

Direktor II Med. Klinik:Thomas Münzel2, Prof. Dr. med.

Leiter der Arbeitsgruppe Molekulare Kardiologie: Andreas Daiber1, Prof. Dr. rer. nat. et med. habil.

Wissenschaftler:Swenja Schuhmacher1, Dipl. Biologin

Philip Wenzel2, Dr. med.

Eberhard Schulz2, Dr. med.

Doktoranden:Christian Hochmuth1, Sebastian Steven1, Tjebo Heeren1

1Universitätsklinikum Mainz, II. Med. Klinik, Abteilung für Molekulare Kardiologie, Mainz2Universitätsklinikum Mainz, II. Med. Klinik und Poliklinik, Mainz

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Organische Nitrate und experimenteller Diabetes mellitus: Ein Vergleich zwischen Pentaerithrityltetranitrat und Isosorbiddinitrat Organische Nitrate und