Oxidativer Stress und Neurodegeneration in ?· Oxidativer Stress und Neurodegeneration in Drosophila…

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    18-Sep-2018

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  • Oxidativer Stress und Neurodegeneration

    in Drosophila melanogaster

    DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.) DER

    NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTT III BIOLOGIE UND VORKLINISCHE MEDIZIN DER UNIVERSITT REGENSBURG

    vorgelegt von Christoph Grnewald

    aus Vilsbiburg 02/06

  • Das Promotionsgesuch wurde eingereicht am 08.02.2006. Die Arbeit wurde angeleitet von Prof. Dr. Stephan Schneuwly Prfungsausschuss: Prof. Dr. Reinhard Sterner (Vorsitzender) Prof. Dr. Stephan Schneuwly (1.Gutachter) Prof. Dr. Charlotte Frster (2.Gutachter) Prof. Dr. Rosemarie Baumann (3.Prfer)

  • Teile dieser Arbeit wurden bereits verffentlicht: Botella JA, Ulschmid JK, Gruenewald C, Moehle C, Kretzschmar D, Becker K, Schneuwly S. The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration. Curr Biol. 2004 May 4;14(9):782-6.

  • Inhaltsverzeichnis

    1

    1. Zusammenfassung..............................................................................................................7 2. Einleitung ............................................................................................................................10

    2.1. Luft und Sauerstoff.................................................................................................11 2.2. Reaktive Oxygene Spezies (ROS) ...................................................................11 2.3. Zellulre Folgen von oxidativem Stress .............................................................13 2.4. Zellulre Schutzmechanismen gegen oxidativen Stress .................................14 2.5. Free radical theory of aging ...............................................................................15 2.6. Oxidativer Stress und Neurodegeneration.........................................................15 2.6.1. Prionerkrankungen (bertragbare spongiforme Enzephalitis = TSE) ........15 2.6.2. Amyotrophe laterale Sklerose (ALS) ...............................................................16 2.6.3. Huntington (PolyQ-Erkrankungen)...................................................................16 2.6.4. Parkinson .............................................................................................................16 2.6.5. Alzheimer .............................................................................................................17 2.6.6. Lipidspeicherkrankheiten...................................................................................17 2.7. Zielsetzung ..............................................................................................................18

    3. Material und Methoden .....................................................................................................19 3.1. Material ....................................................................................................................20 3.1.2. Oligonukleotide, Vektoren, cDNAs und Antikrper .......................................20 3.1.2.1. Oligonukleotide ................................................................................................20 3.1.2.2. Vektoren............................................................................................................21 3.1.2.3. cDNAs ..............................................................................................................21 3.1.2.4. Antikrper .........................................................................................................22 3.1.3. Mikroorganismen und Fliegenstmme ............................................................22 3.1.3.1. Mikroorganismen .............................................................................................22 3.1.3.2. Fliegenstmme ................................................................................................22 3.1.4. Chemikalien, Enzyme, Verbrauchsmaterialien und Puffer...........................25 3.1.4.1. Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien ....................................25 3.1.4.2. Puffer und Lsungen.......................................................................................25 3.1.4.3. Aufzuchtmedien fr Bakterien .......................................................................25 3.2. Methoden.................................................................................................................26 3.2.1. Histologische Methoden ....................................................................................26 3.2.1.1 Toluidinblau-Frbungen an Semidnnschnitten ..........................................26 3.2.1.2. Ulradnnschnitte..............................................................................................26 3.2.2. Molekulare Methoden (Nukleinsuren) ...........................................................26 3.2.2.1. Allgemeines ......................................................................................................26 3.2.2.2. Ligation und Transformation ..........................................................................27 3.2.2.3. Sequenzierung.................................................................................................28 3.2.2.4. RNA ...................................................................................................................28 3.2.2.5. RNAi Konstrukte ..............................................................................................30 3.2.2.6. UAS-Konstrukte ...............................................................................................30 3.2.2.7. Deletionskartierung .........................................................................................31 3.2.3. Keimbahntransformation ...................................................................................31 3.2.3.1. Injektion .............................................................................................................31 3.2.3.2. Selektion der transformierten Fliegen ..........................................................31 3.2.3.3. Bestimmung des Insertionschromosoms.....................................................31 3.2.3.4. Etablierung stabiler Linien..............................................................................32 3.2.4. Molekulare Methoden (Proteine) ......................................................................32 3.2.4.1. Spektrophotometrische Messung des Carbonylgehalts............................32 3.2.4.2. Carbonylwesternblot .......................................................................................33 3.2.4.3. Anti-4-HNE-Slotblot.........................................................................................34

  • Inhaltsverzeichnis

    2

    3.2.4.4. Antikrperfrbungen an Wholemounts ........................................................35 3.2.4.5. Katalaseaktivittsmessung ............................................................................35 3.2.5. Versuche zur Notwendigkeit des sniffer-Gens fr die Entwicklung ............35 3.2.5.1. Doppelrettungsversuche zu sni2 ...................................................................35 3.2.5.2. Versuche zur Letalitt des sni-RNAi Konstrukts im sni1-Hintergrund .....36 3.2.6. Versuche zu negativer Geotaxis, Sauerstoffstress und Lebenserwartung36 3.2.6.1. Negativer Geotaxis Test.................................................................................36 3.2.6.2. Alterung der Fliegen........................................................................................36 3.2.6.3. Sauerstoffstress...............................................................................................36 3.2.3. Computerprogramme .........................................................................................37 3.2.3.1. Allgemeine Software .......................................................................................37 3.2.3.2. Auswertung der Microarrays..........................................................................37 3.2.3.3. Verwendete Internetdatenbanken.................................................................38

    4. Ergebnisse..........................................................................................................................39 4.1. Sauerstoff-Stress und Neurodegeneration ........................................................40 4.1.1. Hyperoxie ist fr Fliegen toxisch ......................................................................40 4.1.1.1. Sauerstoffstress fhrt zu einer Verkrzung der Lebenserwartung ..........40 4.1.1.2. Hyperoxie fhrt zu Neurodegeneration ........................................................41 4.1.1.3. Neuronen sterben durch Apoptose...............................................................41 4.1.2. Messung von oxidativem Stress.......................................................................43 4.1.2.1. Sauerstoffstress fhrt zu erhhtem Carbonylgehalt ..................................43 4.1.2.2. Sauerstoffstress fhrt zur Akkumulation des Lipid-Peroxidations-Produkts 4-HNE .............................................................................................................44 4.1.2.3. Unvernderte Transkription von Superoxiddismutase und Katalase nach Sauerstoffstress .............................................................................................................45 4.1.2.4. Erhhte Katalase-Aktivitt nach Sauerstoffbegasung ...............................45 4.1.3. berexpression von Superoxiddismutase und Katalase..............................46 4.1.3.1. berexpression von Superoxiddismutase oder Katalase erhht die Lebenserwartung unter Sauerstoffstress nicht .........................................................46 4.1.3.2. Katalase und Superoxiddismutase schtzen dopaminerge Neuronen vor Neurodegeneration ........................................................................................................47 4.2. Die sauerstoffhypersensitive Neurodegenerationsmutante sniffer ................48 4.2.1. Der sni1-Phnotyp...............................................................................................48 4.2.1.1. Sniffer ist fr das berleben unter Sauerstoffstress essentiell ................48 4.2.1.2. Die sni1-Mutation fhrt zu Neurodegeneration ...........................................49 4.2.1.3. Neuronen und Gliazellen sterben durch Apoptose ....................................49 4.2.1.4. Die Gehirne von sniffer-Mutanten enthalten multilamellar bodies, multilamellare Membranen und multivesicular bodies ...........................................51 4.2.1.5. Kontamination mit Wolbachia ........................................................................51 4.2.2. Genetische Analyse der sni1-Mutation ............................................................51 4.2.2.1. Der sni1-Insertionsort ......................................................................................51 4.2.2.2. sni1 ist ein starkes Hypomorph......................................................................52 4.2.3. Weitere sniffer-Allele ..........................................................................................53 4.2.3.1. Die Allele sni2 und sni3....................................................................................53 4.2.3.2. Doppelrettungs-Versuche des Allels sni2 ....................................................53 4.2.4. Sniffer-RNAi-Konstrukte ....................................................................................54 4.2.4.1. Actin-gal4 getriebene Expression eines sniffer-silencing-Konstrukts (UAS-IR-sni) fhrt zur Verkrzung der Lebenserwartung unter Sauerstoffstress54 4.2.4.2. Unterschiedliche Transkriptmengen in den Linien sni1, I.1 und B.1.2 ....55 4.2.4.3. Sniffer ist vermutlich fr die Entwicklung essentiell ...................................55 4.2.5. Lokalisation des Sniffer-Proteins......................................................................57

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    4.2.5.1. Neuronale Lokalisation von Sniffer...............................................................57 4.2.5.2. Sniffer ist vermutlich ein zytosolisches Protein...........................................58 4.2.6. Messungen des oxidativen Stresses in sni1-Fliegen.....................................60 4.2.6.1. Keine Erhhung des Carbonylgehalts in sni1-Fliegen ...............................60 4.2.6.2. Keine Vernderung der 4-HNE-Konzentration in gealterten sni1-Fliegen..........................................................................................................................................61 4.2.6.3. Sniffer-Fliegen weisen eine erhhte Katalase-Aktivitt auf ......................62 4.2.7. berexpression von Katalase oder/und Superoxiddismutase in sni1.........63 4.2.7.1. berexpression von Katalase oder/und Superoxiddismutase-1 kann sni1 nicht vor Sauerstoffhypersensitivitt retten................................................................63 4.3. Microarrayanalysen ...............................................................................................65 4.3.1. Einleitung .............................................................................................................65 4.3.2. Quantitative Vergleiche......................................................................................66 4.3.2.1. Genexpressionsunterschiede in Kpfen von sauerstoffbegasten w1118-Fliegen .............................................................................................................................66 4.3.2.2. Vergleich der beiden Microarrays nach O2-Begasung mit Daten aus der Literatur ...........................................................................................................................66 4.3.2.3. Genexpressionsunterschiede in Kpfen von sni1-Fliegen ........................67 4.3.2.4. Vergleich der sni1 Microarrays mit dem Microarray nach sechs Tagen Sauerstoffstress .............................................................................................................69 4.3.3. Vergleiche ausgesuchter Gengruppen............................................................70 4.3.3.1. Verschiedene nach oxidativem Stress in ihrer Expression vernderte Gengruppen ....................................................................................................................70

    4.3.3.1.1. Zytoskelett .................................................................................................70 4.3.3.1.2. Transport durch Zellmembranen ...........................................................70 4.3.3.1.3. Signalweiterleitung, Transkriptions- und Translationsfaktoren .........71 4.3.3.1.4. Enzyme ......................................................................................................71 4.3.3.1.5. Odorant bindende Proteine und Geruchsrezeptoren .........................71 4.3.3.1.6. Proteasen ..............................................................

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