PapilloCheck Instruções para uso - GBO · zung Inhalt ausrei-chend für Tests Gefahr Im Dunkeln lagern Wichtiger Hinweis fr No de lot Date limite de conser- ... Kit de

H P V D N A - C h i p

PapilloCheck®

Instruções para uso

Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais

REF 465 088

Para uso em diagnóstico in vitro somente por profi ssionais de laboratório

Greiner Bio-One GmbHMaybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • AlemanhaTelefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 [email protected] • www.gbo.com

IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C

Revisão: BQ-361-01Março 2016


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C


PapilloCheck® - Instruções de UsoRevisão: BQ-361-01 / Março 2016

2

GLOSSARY OF SYMBOLS

en Batch code

Use by Consult Instruc-tions for Use

Catalog Number

Manufac-turer

In Vitro Diag-nostic Me-dical Device

Tempe-rature limitation

Contents suffi cient for <n> tests

Danger Store in the dark

Important Note

de Chargen-bezeich-nung

Mindes-tens haltbar bis

Vor Gebrauch Anwei-sung lesen

Katalog-nummer

Hersteller In-Vitro- Diagnos-tika Medi-zinprodukt

Tempera-turbegren-zung

Inhalt ausrei-chend für <n> Tests

Gefahr Im Dunkeln lagern

Wichtiger Hinweis

fr No de lot Date limite de conser-vation jusqu’au

Lire les in-structions avant utilisation

Numéro de réfé-rence

Fabricant Produit médi-cal de diagnostic in-vitro

Limite de tempéra-ture

Contenu suffi sant pour <n> tests

Danger À stocker à l‘abri de la lumière

Note im-portante

es Código de lote

A utilizar preferib-lemente antes de

Antes de usar, lea las instruccio-nes

Número de catálo-go

Fabri-cante

Producto medicinal de diagnósti-ca in vitro

Limitación de tempera-tura

Contenido sufi ciente para <n> ensayos

Peligro Conser-var en un lugar oscuro

Nota im-portante

it Codice del lotto

Da utilizzare entro e non oltre

Leggere le istruzi-oni prima dell’uso

Numero catalogo

Produt-tore

Dispositivo medico- diagnosti-co in-vitro

Limitazio-ne tempe-ratura

Contenuto suffi ciente per test <n>

Pericolo Conserva-re al buio

Nota im-portante

pt Código do lote

A utilizar preferí-velmente antes de

Antes de usar, leia as inst-ruções

Número de catálo-go

Fabri-cante

Producto medicinal de diagnósti-ca in vitro

Limitação de tempera-tura

Conteúdo sufi ciente para <n> ensaios

Perigo Conservar num local escuro

Aviso im-portante

nl Lot nummer

Tenminste houdbaar tot

Gebruik-saanwij-zing lezen

Catalo-gusnum-mer

Fabrikant In vitro diag-nostisch medisch product

Tempera-tuurbeper-king

Voldoen-de inhoud voor <n> tests

Gevaar Donker bewaren

Belangri-jke op-merking

da Lotnum-mer

Anvendes senest

Læs brugsan-visningen

Katalog-nummer

Producent In vitro meskdicin doag-nose-apparat

Tempera-turbegra-ensær

Indehol-der nok til <n> test

Fare Opbeva-res mørkt

Vigtig henvis-ning

sv Lot nummer

Sista för-bruknings-dag

Läs bruk-sanvisnin-gen före använd-ning

Katalog-nummer

Tillverkare In vitro- medicinsk doag-nostisk apparatur

Tempe-ratur-be-gränsning

Innehållet räcker till <n> tester

Fara Förvaras mörkt.

Viktigt medde-lande

pl Kod partii Termin zydatności

Przed użyciem przeczytać instrukcję

Numer katalo-gowy

Producent Diag-nostykain vitroProdukt yw

Ograni-czenie tempera-tury

Zawartość wystarcza na <n> testów

NIEBEZPIECZ EŃSTWO

Przechow-ywa ć w ciemności

Ważne

no batch nr. holdbar til Les bruksan-visning før bruk

katalog-nummer

produsent in vitro-di-agnostisk medisinsk utstyr

tempe-raturbe-grensning

Innhold tilstrekke-lig for <n> tester

Fare Oppbeva-res mørkt

Viktig merknad

el κωδικός παρτίδας

το λιγότερο διατηρείται

πριν την χρήση διαβάστε τις οδηγίες

Αριθμός Καταλόγου

Παραγωγός In vitro διαγνωστικά ιατρικά προϊόντα

περιoριoμός θερμοκραο ίας

Περιεχόμενο αροκετό για <n> τεοτ

ΚΊΝΔΥΝΟΣ Αποθηκεύεται στα σκοτεινά

Σημαντική υπόδειξη

tr Parti kodu Son kullanma tarihi:

Kullanma-dan önce talimatı okuyun

Katalog numarası

Üretici fi rma

In vitro diagnostik tıbbi tanı ürünü

Sıcaklık sınırlaması

İçeriği <n> test için yeter-lidir

Tehlikeli Karanlık yerde saklayınız

Önemli Not

!


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



3

ÍNDICE

1. CONTEÚDO DO KIT ...................................................................................................... 5

2. CONSUMÍVEIS, EQUIPAMENTO E MATERIAL NECESSÁRIO .................................. 6

3. TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO ......................................................................... 8

4. INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA .................................................................................. 8

5. DESCARTE DE RESÍDUOS .......................................................................................... 9

6. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 10

6.1 UTILIZAÇÃO PREVISTA ..................................................................................................................106.2 TIPOS DE HPV DETECTÁVEIS COM PAPILLOCHECK® ..............................................................106.3 PRINCÍPIO DE TESTE ..................................................................................................................... 116.4 DESIGN DO CHIP DE DNA PAPILLOCHECK® ...............................................................................13

6.4.1 Disposição do chip PapilloCheck® ......................................................................................136.4.2 Controles no chip .................................................................................................................14

7. INSTRUÇÕES PARA O FLUXO DE TRABALHO DO PAPILLOCHECK® .................. 15

7.1 INSTRUÇÕES GERAIS ....................................................................................................................157.2 SEPARAÇÃO DAS SALAS ..............................................................................................................157.3 AVISOS E PRECAUÇÕES ...............................................................................................................16

7.3.1 Prevenção de contaminação ...............................................................................................167.3.2 Instruções de manuseamento de chips para DNA ...............................................................167.3.3 Precauções gerais ...............................................................................................................167.3.4 Segurança no trabalho .........................................................................................................17

8. PROCEDIMENTO PAPILLOCHECK® .......................................................................... 18

8.1 COLETA DE AMOSTRAS E EXTRAÇÃO DE DNA .........................................................................188.1.1 Coleta de amostras ..............................................................................................................188.1.2 Extração de DNA .................................................................................................................20

8.2 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) ............................................................................218.2.1 Preparação do termociclador ...............................................................................................218.2.2 Tratamento de Uracilo-N-Glicosilase (UNG) .......................................................................228.2.3 Preparação da reação de PCR ............................................................................................23

8.2.3.1 Procedimento de preparação automática de PCR usando o CheckExtractor™ ......................................... 238.2.3.2 Manual do procedimento de preparação de PCR ....................................................................................... 31

8.2.4 Vedação e armazenamento das placas ...............................................................................328.2.4.1 Vedação e armazenamento da placa de eluição ......................................................................................... 328.2.4.2 Vedação da placa de PCR .......................................................................................................................... 328.2.4.3 Fechar novamente a placa de PCR ............................................................................................................ 33

8.3 HIBRIDAÇÃO E LAVAGEM .............................................................................................................348.3.1 Preparação e disposição .....................................................................................................348.3.2 Hibridação ............................................................................................................................368.3.3 Lavagem e secagem ............................................................................................................38

8.4 ESCANEAMENTO E AVALIAÇÃO DO CHIP PAPILLOCHECK®. ...................................................40


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



4

9. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS ...................................................................................... 41

10. ASSISTÊNCIA TÉCNICA ............................................................................................. 42

11. CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO DO PAPILLOCHECK® ............................. 43

11.1 DESEMPENHO ANALÍTICO DO PAPILLOCHECK® .......................................................................4311.1.1 Sensibilidade analítica .........................................................................................................4311.1.2 Especifi cidade analítica – tipos de HPV ..............................................................................4411.1.3 Especifi cidade analítica – Organismos Não-HPV ................................................................44

11.2 REPETIBILIDADE (INTRA-REPRODUTIBILIDADE) ......................................................................4411.3 REPRODUTIBILIDADE (INTER-REPRODUTIBILIDADE) ..............................................................4511.4 ROBUSTEZ ......................................................................................................................................4511.5 DESEMPENHO CLÍNICO DO PAPILLOCHECK® ............................................................................46

12. PROTOCOLO BREVE PAPILLOCHECK® ................................................................... 48

12.1 SALA 2: PREPARAÇÃO DO MASTERMIX FINAL .........................................................................4812.2 CONFIGURAÇÃO DA PCR ..............................................................................................................49

12.2.1 Sala 1: Confi guração Automática de PCR usando o CheckExtractor™ ..............................4912.2.2 Sala 2: Preparação manual de PCR ...................................................................................50

12.3 SALA 3: HIBRIDAÇÃO - PREPARAÇÃO / REAÇÃO DE HIBRIDAÇÃO .......................................5112.4 SALA 3: LAVAGEM E SECAGEM/ ESCANEAMENTO E AVALIAÇÃO ..........................................52


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



5

1. CONTEÚDO DO KIT

Kit de teste1 PapilloCheck® Conteúdo Quantidade

PCR MasterMix 6 x PapilloCheck® PCR MasterMix2 6 x 1.200 µl cada

Preparação MasterMix 6 x frascos para preparação de MasterMix 6 x vazios

Caixa de lâminas, 4 x 12 Arrays 6 x Caixas de lâminas PapilloCheck® com 4 chips3 PapilloCheck® 24 x 12 Arrays

Tampão de Hibridação 12 x PapilloCheck® Tampão de Hibridação 12 x 1,000 µl

TAMP A conc. 1 x Tampão A PapilloCheck® concentrado 1 x 450 ml

TAMP B conc. 1 x Tampão B PapilloCheck® concentrado 1 x 55 ml

1 Um kit de teste PapilloCheck® é sufi ciente para análise de 288 amostras.2 Contém todos os componentes necessários para PCR exceto para a Taq DNA Polimerase e a Uracilo-N-Glicosilase.3 Um chip PapilloCheck® contém 12 microarrays PapilloCheck®.

O conjunto principal contém um frasco de Tampão A e um de Tampão B concentrados e seis caixas pequenas de papelão. Cada uma das caixas menores contém materiais adicionais para 48 análises e portanto: um frasco de MasterMix PCR, um frasco para preparação MasterMix, dois frascos de Tampão de Hibridação e uma Caixa de lâmina com quatro chips PapilloCheck®. Esse conjunto se baseia no fato de que esse kit não foi feito para ser usado no processamento de remessas menores do que 48 amostras.


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



6

2. CONSUMÍVEIS, EQUIPAMENTO E MATERIAL NECESSÁRIO

Recomenda-se a utilização de PapilloCheck® em combinação com os consumíveis, equipamento e material indicados e apenas por pessoal profi ssional.

Consumíveis Greiner Bio-One Cat. Nº Quantidade

PapilloCheck® 465 088 Kit de teste para 288 reações

Kit de teste PapilloCheck® 465 075 50 amostras

Kit de Extração de DNA oCheck®/ Preparação com Uma Coluna 515 040 50 preparações

Kit de extração de DNA oCheck® - CheckExtractor™ 517 070 288 preparações

Pontas de fi ltro de micropipetas sem DNase, esterilizadas1

Pontas com fi ltro de 0,5-10 µl Pontas com fi ltro de 0,5-20 µl Pontas com fi ltro de 10-100 µlPontas com fi ltro de 10-200 µlPontas com fi ltro de 100-1000 µl

765 288774 288772 288739 288750 288

96/96096/96096/96096/96060/600

Ponteiras de pipeta para o CheckExtractor™

Ponteiras de pipeta de 300 µLPonteiras de pipeta de 1000 µL

865 807866 806

57603890

Tubos de ensaio e placas sem DNa-se2

Tubo de reação de 1,5 mlTubo de reação de 0.2 ml28 x tiras de 0,2 ml para PCRTiras com tampa para 8 x tiras de 0,2 ml para PCRPlaca de PCR com código de barras

616 201683 201673 210373 270

652 290-CEX

500/4000500/1000125/1250125/1250

40

Vedação

Vedação PearceVedação Silver

865 804676 090

100100

Tubo de polipropileno de 50 ml3 210 261 25/450

Pipeta de plástico 607 180 ou 607 160760 180 ou 760 160786 180 ou 768 160

1/2001/2001/200

1 Alguns dos tamanhos de pontas mencionados são opcionais dependendo das micropipetas disponíveis.2 Em princípio, recomenda-se a utilização de tiras de 8 tubos para PCR. Os tubos de reação simples (0,2 ml) são opcionais

se as tiras não estiverem disponíveis. Placas de PCR devem ser utilizadas em combinação com o CheckExtractor™.3 Necessário apenas se uma centrífuga de lâminas não estiver disponível.


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



7

Equipamento Greiner Bio-One Cat. Nº Quantidade

CheckScannerTM 862 070 1

Software Básico CheckReportTM 862 080 1

Software CheckReportTM e plugin PapilloCheck® 862 081 1

Computador para CheckScannerTM e Software CheckReportTM 862 900 1

Câmera de Hibridação com suporte de lâmina oCheck® 447 070 1

Cabo para suporte de lâminas 447 001 1

Washbox oCheck®4 447 020 1

CheckExtractor™ 863 080 1

Vedação térmica 865 802 1

Adaptador para vedação térmica 865 803 1

Placa centrífuga 865 805 1

Enzimas necessárias

• Taq Polimerase: Polimerase de DNA 5 U/µl de HotStarTaq® (Qiagen; 203203, 203205, 203207, 203209)• Uracil-N-Glicosilase: 1 U/µl de Uracil-ADN Glicosilase (Fermentas; #EN0361, #EN0362)

Consumíveis adicionais necessários

• Água reagente de PCR• Água destilada ou desionizada• Luvas descartáveis

Equipamento adicional necessário

• Microcentrífuga para tubos de ensaio de 1,5 e 2 ml• Centrífuga para tubos de polipropileno de 50 ml (por ex. BeckmanCoulter; Centrífuga Allegra X-22; Rotor de Ângulo

Fixo C0650) ou centrífuga de laboratório (por ex. Labnet: Slide Spinner; VWR International: Galaxy MiniArray Centrifuge)

• Microcentrífuga para tubos de reação simples de 0,2 ml ou tiras de 8 tubos para PCR (por ex. Labnet: Spectrafuge Mini Centrifuge)5

• Termociclador para PCR: GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems), Termociclador Veriti™ de 96 Poços (Applied Biosystems) ou peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH)• Banho-maria (50 °C)• Micropipetas (diferentes gamas de 1 a 1000 µl) • Multipipeta de 8 canais (gama: 5 - 50 µl), por ex. Brand Transferpette®-8 (Brand)• Pipetador para pipetas de vidro e de plástico• Agitador de vórtice• Racks para diferentes tubos de reação

4 Para o processo de lavagem PapilloCheck® são necessárias três Caixas de lavagem oCheck®.5 Necessário apenas na confi guração manual do PCR. Na confi guração automática da PCR, deve-se usar placas PCR.


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



8

3. TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO

O envio do kit de teste PapilloCheck® é feito à temperatura ambiente. No entanto, o equipamento tem de ser armazenado imediatamente após a recepção a 4-8 °C e deve ser protegido da luz. Sendo conservado corretamente, o kit de teste PapilloCheck® e os seus componentes podem ser utilizados até a data de validade indicada. Além disso, nessas condições, a vida útil não diverge do prazo de validade após a primeira abertura do equipamento e dos seus componentes.

4. INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA

O kit de teste PapilloCheck® é apenas para uso de laboratório, não para medicamento, uso doméstico ou outros propósitos. O produto é destinado apenas para usuários profi ssionais, como técnicos e médicos com treinamento em técnicas de biologia molecular.

! Sempre use um jaleco, luvas descartáveis e óculos de proteção adequados e siga as instruções de segurança fornecidas neste capítulo e no capítulo 7.3.

Informações regulamentares:Em conformidade com o regulamento CE n.º 1272/2008, as embalagens internas devem ser etiquetadas apenas com o(s) símbolo(s) e o identifi cador do produto.

Os seguintes componentes do kit de teste PapilloCheck® contêm substâncias nocivas ou perigosas.

Quantidade de Componentes do kit Conteúdo perigoso

Classifi cação em conformidade com o regulamento (EC) No 1272/2008

Pictograma GHS e palavra sinal

Advertências de perigo e prevenção

PapilloCheck® Tampão de Hibridação, guanidina solução de tiocianato, 25-50 %,CAS Nº 593-84-0

toxicidade aguda - oral (categoria 4),toxicidade aguda, inalação(categoria 4), toxicidade crônicaem ambiente aquático(categoria 3)corrosividade cutânea (categoria 1c)

H302H332H314H412

P273P280

P305+ P351+P338

EUH032

Nocivo se ingerido.Nocivo se inalado.Provoca graves queimaduras na pele e lesões oculares.Nocivo para a vida aquática com efeitos duradouros.

P273 Evitar a libertação para o ambiente.P280 Usar luvas de proteção/vestuário de proteção/proteção ocular/proteção facial.SE ENTRAR EM CONTATO COM OS OLHOS: Lavar cuidadosamente com água durante vários minutos. No caso de uso de lentes de contato, remova-as, se for fácil. Continue enxaguando. Contate um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico

Informações de perigo suplementares (EU):

Em contato com ácidos libera gases muito tóxicos.

Tampão B PapilloCheck®, solução dodecilo sulfato de sódio,10-20 %,CAS Nº 151-21-3

irritação cutânea (categoria 2),lesões oculares graves (categoria 1)

H315H318

P280

P305+ P351+P338

Provoca irritação cutânea.Provoca lesões oculares graves.

Usar luvas de proteção/proteção ocular/proteção facialSE ENTRAR EM CONTATO COM OS OLHOS: Lavar cuidadosamente com água durantevários minutos. No caso de uso de lentes de contato, remova-as, se for fácil. Continue enxaguando.

A versão atual dos dados de segurança desse produto pode ser baixada no site daGreiner Bio-One: www.gbo.com/bioscience/biochips_download

PERIGO

PERIGO


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



9

5. DESCARTE DE RESÍDUOS

Após a lavagem e secagem do chip PapilloCheck® as soluções de lavagem I, II e III podem ser descartadas sem quaisquer precauções especiais. Descarte o chip PapilloCheck® utilizado, os componentes não utilizados do kit e a mistura de hibridação não utilizada com os resíduos químicos do laboratório. Observe todos os regulamentos nacionais, estatais e locais relativos ao descarte.


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



10

6. INTRODUÇÃO

A infeção persistente com um vírus do papiloma humano cancerígeno (HPV) verifi ca-se virtualmente em todos os casos de câncer cervical – o segundo câncer mais comum nas mulheres a nível mundial1. Até a presente data, identifi caram-se mais de 100 tipos de HPV, dos quais cerca de 40 tipos são transmitidos sexualmente e infetam a mucosa genital. Os tipos de HPV cervical estão classifi cados em um grupo de alto risco (HPV de alto risco, HPVar) e de baixo risco (HPV de baixo risco, HPVbr). Enquanto os tipos de HPV de alto risco estão associados a um aumento do risco de desenvolver câncer cervical, os tipos de HPV de baixo risco causam sobretudo verrugas genitais benignas2. Contudo, mesmo dentro do grupo de alto risco, o risco relativo para o desenvolvimento de câncer ou de lesões intraepiteliais cervicais (CIN) depende do tipo3. Por volta de 70% de todos os casos de câncer cervical estão ligados a uma infecção persistente com HPV 16 ou 18. Os tipos de baixo risco mais prevalentes são HPV 6 e 11. Baseado na quase absoluta ligação etiológica entre HPV cancerígeno e câncer cervical, o teste para HPVar está sendo agora considerado como exame primário de câncer cervical4.

6.1 Utilização prevista

O PapilloCheck® é um equipamento para diagnóstico destinado a ser utilizado para a detecção qualitativa e a genotipagem de 24 tipos do papilomavírus humano nas preparações de DNA provenientes de esfregaços cervicais humanos. O equipamento deve ser utilizado apenas por pessoal habilitado.

PapilloCheck® cumpre os requisitos da Diretriz 98/79/CE, relativa aos dispositivos médicos para diagnóstico in vitro, e, portanto, exibe a marca CE de conformidade. Qualquer resultado de diagnóstico gerado, usando o PapilloCheck® deve ser interpretado em conjunto com outros resultados clínicos ou laboratoriais.

É recomendado que o kit de teste PapilloCheck® seja usado junto com o CheckExtractor™ na confi guração automática da PCR. Ele é designado para processar remessas de 48 ou 96 amostras. NÃO é destinado para o processamento de remessas menores do que 48 amostras.

6.2 Tipos de HPV detectáveis com PapilloCheck®

O PapilloCheck® permite a identifi cação de 18 tipos de papilomavírus humano (HPV) de alto risco ( ) e 6 de baixo risco ( ) (Tabela 1).

Tabela 1: Tipos de HPV detectáveis com PapilloCheck®

HPV 16 HPV 45 HPV 59 HPV 6





HPV 39 HPV 58 HPV 82 HPV 44 / HPV 55*

* O PapilloCheck® não permite a diferenciação entre o VPH 44 e o VPH 55.

1 Walboomers, J. et al (1999). Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol. 189(1):12-9.

2 Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer. Clin Microbiol Rev. 2003;16:1–17.3 Bosch F.X. et al. (2008). Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specifi c

implications in cervical neoplasia. Vaccine. 26 Suppl 10:K1-16.4 Meijer, C.J. et al. (2009). Guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer

screening in women 30 years and older. Int J Cancer. 124(3):516-20.


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



11

6.3 Princípio de teste

O PapilloCheck® é um kit de teste baseado em microarray para a detecção e genotipagem de um fragmento do gene E1 do genoma papilomavírus humano (HPV). O procedimento de teste é resumido na Figura 1.

Antes da análise do PapilloCheck®, o DNA tem de ser extraído de uma amostra de esfregaço cervical. A coleta de amostras e a extração de DNA não fazem parte do kit de teste PapilloCheck®. Os produtos dedicados para a coleta de amostras (PapilloCheck® Collection Kit) e Extração de DNA (Kit de Extração de DNA oCheck®) também estão disponíveis na Greiner Bio-One e têm de ser adquiridos à parte (consulte informações sobre encomendas o Capítulo 2).

Após a extração do DNA genômico viral e humano de uma amostra cervical, um fragmento 350 bp do gene viral E1 é amplifi cado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) na presença de um conjunto de iniciadores específi cos do HPV. Na mesma reação, um fragmento do gene humano de cópia simples ADAT1 (adenosina deaminase 1 específi ca de tARN humano) é amplifi cado para monitorar a presença de material de amostra humano na amostra cervical (controle da amostra) e um modelo de controle interno presente no PapilloCheck® PCR MasterMix é amplifi cado para monitorar o desempenho da PCR (controle da PCR). Além disso, o PapilloCheck® PCR MasterMix contém dUTP. Assim, a potencial contaminação cruzada de reações de PCR anteriores pode ser eliminada através da utilização do tratamento com Uracilo-N-Glicosilase (UNG) (consulte o capítulo 8.2.2).

Os produtos para PCR são então hibridados para sondas específi cas de DNA e controles no chip associados à superfície do chip PapilloCheck®. Cada chip contém 12 microarrays de DNA, que permitem a análise simultânea de 12 amostras cervicais. Durante a hibridação, o DNA ligado é etiquetado fl uorescentemente e o DNA não ligado é removido nos passos de lavagem subsequentes. Monitora-se a efi cácia da hibridação (controle da hibridação).

Finalmente, o chip PapilloCheck® é automaticamente escaneado, analisado e avaliado utilizando o CheckScannerTM e o Software CheckReportTM, respetivamente (consulte as informações sobre encomenda no Capítulo 2). O CheckScannerTM é um scanner a laser bicolor (comprimentos de ondas de excitação de 532 nm e 635 nm), que permite a detecção do sinal fl uorescente gerado pela presença dos produtos de amplifi cação específi cos do HPV bem como dos controles (consulte o capítulo 6.4.2). O Software CheckReportTM permite a visualização, análise e avaliação dos resultados e mostra automaticamente os valores correspondentes tanto dos tipos de HPV detectados como dos controles num relatório detalhado.

O relatório indica claramente a presença ou ausência de um ou mais dos 24 tipos de HPV detectáveis e os controles abrangentes no chip tornam a análise altamente confi ável.


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



12

1. Reação da PCR

2. Hibridação

3. Lavagem e secagem

4. Escaneamento e análise

ou

Figura 1: PapilloCheck® procedimento de teste1. Reação de PCR: Após a extração de DNA, um fragmento 350 bp do gene viral E1 e os fragmentos de dois objetos

de controle são amplifi cados através de PCR. Os produtos de amplifi cação são então hibridados para sondas de DNA complementares no chip.

2. Hibridação: Cada tipo de HPV é detectado por uma sonda de DNA específi ca. Durante a hibridação, introduz-se a etiquetagem fl uorescente.

3. Lavagem e secagem: O DNA não ligado é removido nos passos de lavagem subsequentes.4. Escaneamento e análise: O chip PapilloCheck® é escaneado, analisado e avaliado utilizando o CheckScannerTM e o

Software CheckReportTM. É criado um relatório que indica claramente a presença ou ausência de um ou mais dos 24 tipos de HPV detectáveis.


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



13

6.4 Design do chip de DNA PapilloCheck®

6.4.1 Disposição do chip PapilloCheck®

Cada chip PapilloCheck® contém 12 microarrays designados como poço A1 - B6. Cada microarray PapilloCheck® é composto por 28 sondas diferentes e está rodeado por uma borda elevada. Cada sonda é pintada em cinco réplicas. A disposição do microarray PapilloCheck® é ilustrada na Figura 2 e os controles no chip são explicados no Capítulo 6.4.2.

controle da orientação

HPV 31HPV 18HPV 16HPV 11HPV 6


controle da hibridação

HPV 44/55HPV 43

controle da PCR



controle da amostra

HPV 82HPV 73

controle da orientação



controle da hibridação

HPV 44/55HPV 43

controle da PCR



controle da amostra

HPV 82HPV 73

a)

cana

l ver

mel

ho (6

35 n

m)

cana

l ver

de (5

32 n

m)

b)

c)

Figura 2: Design do chip de DNA PapilloCheck®

a) Desenho esquemático do chip PapilloCheck®. b) e c) Imagens exibidas pelo Software CheckReportTM para os dois comprimentos de onda de excitação diferentes usados para escanear (b) canal vermelho: 635 nm; c) canal verde: 532 nm) e desenhos esquemáticos do microarray PapilloCheck®. Indicam-se sondas específi cas para o tipo do HPV e os controles no chip.


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



14

6.4.2 Controles no chip

O design do chip de DNA PapilloCheck® inclui controles abrangentes no chip. Vários sistemas de controle monitoram todos os passos mais importantes tanto do teste como do processamento do chip, incluindo a qualidade das amostras e a extração de DNA (controle da amostra), a qualidade de reação da PCR (controle da PCR), a efi cácia da hibridação (controle da hibridação), bem como a homogeneidade da coloração e a qualidade de impressão (controle da orientação e controle da impressão). Além da presença ou ausência de tipos de HPV, o Software CheckReport™ mostra automaticamente os valores correspondentes tanto dos controles como dos tipos de HPV detectados num relatório detalhado. Para a leitura dos diferentes controles, utilizam-se os dois comprimentos de onda de excitação do CheckScanner™. Para o controle do desempenho do teste (controle da amostra e da PCR), utiliza-se o canal vermelho (comprimento de onda de excitação de 635 nm), enquanto a qualidade da hibridação e do chip (controle da hibridação, da orientação e da impressão) é avaliada no canal verde (comprimento de onda de excitação de 532 nm).

Controle da amostraO PapilloCheck® monitora a qualidade da amostra e/ou da extração de DNA amplifi cando um fragmento do gene humano de cópia simples ADAT1 (adenosina deaminase 1 específi ca de tARN humano). Se DNA humano estiver presente numa quantidade adequada no DNA extraído da amostra cervical, é gerado um sinal fl uorescente nas colorações de controle da amostra.

Se não ocorrer amplifi cação de ADAT1, ou se for insufi ciente, o Software CheckReport™ indica que o controle da amostra “falhou” e tem de se repetir a análise devido à quantidade insufi ciente de células na amostra cervical e/ou desempenho insufi ciente na extração (consulte o Capítulo 9).

Controle da PCRO PapilloCheck® também monitora a qualidade de reação da PCR. A amplifi cação de um modelo de controle interno presente no PapilloCheck® PCR MasterMix gera um sinal nas colorações de controle da PCR no chip PapilloCheck®. A qualidade da reação de amplifi cação também é automaticamente avaliada pelo Software CheckReport™. Se o desempenho da PCR se situar abaixo de um limite predefi nido, o Software CheckReport™ indica que o controle da PCR “falhou” e tem de se repetir a análise (consulte o Capítulo 9).

Se a quantidade de DNA do HPV na amostra for muito elevada, o sinal fl uorescente das colorações de controle da PCR pode ser baixo ou mesmo não estar presente devido à concorrência durante a reação da PCR. Neste caso, o sinal fl uorescente para, pelo menos, uma sonda de DNA específi ca, tem de exceder um limite predefi nido para o teste ser considerado válido.

Controle da hibridaçãoO PapilloCheck® monitora a efi cácia da hibridação através da utilização de uma sonda fl uorescente etiquetada no Tampão de Hibridação PapilloCheck®, que hibrida para sequências específi cas de DNA no chip PapilloCheck®. Uma efi cácia de hibridação adequada resulta em sinais fl uorescentes em cada coloração de array. Os resultados de cinco colorações de controle da hibridação no chip PapilloCheck® também são avaliados pelo Software CheckReportTM.

Controle da orientação e da impressãoAs colorações de controle da orientação do chip PapilloCheck® geram sinais fl uorescentes independentemente da efi cácia do processo de hibridação. Estas colorações são utilizadas no Software CheckReportTM como pontos de orientação para uma detecção correta da coloração, o que é um pré-requisito para a análise correta dos sinais. Além disso, a qualidade do processo de impressão é controlada através da presença de um sinal fl uorescente em cada coloração do chip (controle da impressão).


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



15

7. INSTRUÇÕES PARA O FLUXO DE TRABALHO DO PAPILLOCHECK®

7.1 Instruções gerais

Ao implementar técnicas atuais mais avançadas de biologia molecular em um laboratório, as instruções a seguir devem ser consideradas para garantir o máximo de segurança para a equipe do laboratório e para resultados de alta qualidade.

A execução de técnicas de biologia molecular tais como extração de DNA, amplifi cação e detecção de produtos de amplifi cação exige pessoal qualifi cado. Além disso, um fl uxo de trabalho claro e bem estruturado é obrigatório para impedir resultados equivocados, tais como os que ocorrem devido à degradação do DNA ou contaminação dos produtos de amplifi cação. Para garantir isso, é necessário separar as áreas de extração, amplifi cação e detecção conforme descrito no capítulo 7.2.

Cada área deve ser equipada com equipamentos, consumíveis, jalecos e luvas próprios. Nunca transfi ra os jalecos, luvas ou equipamentos de uma área específi ca para outra.

7.2 Separação das salas

A Figura 3 mostra um exemplo de como um laboratório pode ser separado em três seções distintas.

Sala 1 Sala 2 Sala 3

Figura 3: Separação de salas de laboratório

Uma sala é destinada para a extração de DNA com o CheckExtractor™ e o processamento da respectiva eluição e das placas de PCR. A confi guração da PCR MasterMix deve ser conduzida na sala 2 (preferencialmente sob uma capela de PCR). Na sala 3 é realizada a hibridação, lavagem, secagem e análise do chip processado PapilloCheck® usando o CheckScanner™ e o Software do CheckReport™ é conduzido.Cada sala é usada exclusivamente para a aplicação ou técnica indicada para impedir a contaminação da amostra. O uso de cores pode ser vantajoso para evitar a troca acidental de equipamentos e consumíveis entre as áreas.Para um exemplo mais detalhado de separação de sala usando extração manual de DNA e procedimentos de confi guração de PCR, veja as respetivas Instruções de Uso do kit de teste PapilloCheck® (REF 465 060) e Kit de Extração de DNA oCheck® (REF 515 070).

! Tanto os equipamentos como os consumíveis não devem ser trocados entre as diferentes salas de laboratório e espaços. Portanto, as duplicações de equipamento e consumíveis são uma necessidade e devem ter sido consideradas ao equipar o laboratório.


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



16

7.3 Avisos e precauções

7.3.1 Prevenção de contaminação

• Jalecos devem ser usados durante o procedimento e conjuntos diferentes de jalecos são necessários para cada sala de laboratório.

• As luvas têm de ser usadas durante cada passo da análise e têm de ser mudadas com frequência, especialmente durante a extração de DNA.

• O local de trabalho tem de ser descontaminado com um produto de limpeza apropriado.• Nunca toque no interior da tampa de um tubo de reação. Para evitar contaminação cruzada, abra

somente um tubo de cada vez.• Pontas com fi ltro adequadas para micropipetas com proteção contra aerossóis (sem DNase,

RNase e DNA humano) devem ser utilizadas. As ponteiras da pipeta devem ser sempre trocadas entre as transferências de líquido.

7.3.2 Instruções de manuseamento de chips para DNA

• Os chips para DNA devem ser utilizados em um ambiente sem poeira. Deve evitar-se a deposição de poeiras e de outras partículas na superfície do chip.

• Não toque na zona de hibridação na superfície do chip.• Apenas o lado etiquetado do chip se destina a hibridação.• Não utilize canetas marcadoras para a identifi cação de chips de DNA, pois causam fl uorescência

não específi ca no chip.• Os arrays de DNA só podem ser utilizados uma vez. Os chips hibridados não podem ser

reutilizados.• Guarde os chips não utilizados na caixa original dentro do saco com fecho contendo o dessecante.

7.3.3 Precauções gerais

• Este equipamento destina-se exclusivamente a diagnóstico in vitro e deve ser utilizado apenas por pessoal treinado na prática de laboratório de diagnóstico in vitro.

• Após a chegada do produto, verifi que se os componentes do kit estão danifi cados. Caso um dos componentes esteja danifi cado (por exemplo, os recipientes do tampão), entre em contato com o seu distribuidor Greiner Bio-One local. Não use componentes danifi cados do kit, pois os mesmos podem levar a um baixo desempenho do kit.

• Não utilize o kit de teste PapilloCheck® após o prazo de validade.• Não use reagentes vencidos.• Não misture reagentes de lotes diferentes.• Use somente reagentes/equipamentos fornecidos com o kit e aqueles recomendados pelo

fabricante.• Deve-se fazer uma calibração/manutenção regular nos equipamentos de laboratório, como

micropipetas e banho-maria.• A pipetagem de pequenas quantidades de líquido com a micropipeta pode ser um desafi o.

Portanto, tome cuidado e faça a pipetagem da forma mais precisa possível.• Para evitar contaminação microbiana dos reagentes, tome cuidado ao remover as alíquotas dos

tubos do reagente.• Todos os passos da centrifugação devem ser conduzidos à temperatura ambiente (18-25 °C).


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



17

7.3.4 Segurança no trabalho

• Cuidado ao manusear amostras biológicas contendo materiais humanos potencialmente infecciosos. Manuseie e descarte todas as amostras biológicas como se fossem capazes de transmitir agentes infecciosos.

• Nunca faça a pipetagem de soluções oralmente.• Não coma, beba, fume ou aplique produtos cosméticos nas áreas de trabalho.• Evite o contacto direto com as amostras biológicas, bem como salpicar ou pulverizar nas amostras.• Sempre use o jaleco, as luvas e os óculos de proteção enquanto estiver trabalhando com

amostras humanas.• Lave as mãos cuidadosamente após manusear amostras e reagentes.

18PapilloCheck® - Instruções de UsoRevisão: BQ-361-01 / Março 2016

8. PROCEDIMENTO PAPILLOCHECK®

O capítulo seguinte descreve detalhadamente os diferentes passos de trabalho que finalmente levam à produção de um relatório detalhado, indicando claramente a presença ou ausência de um ou mais dos 24 tipos de HPV detectáveis em cada amostra cervical analisada. A Figura 4 mostra uma visão geral dos diferentes passos necessários. Também indica o subcapítulo correspondente que descreve o passo de teste específico. Os passos têm de ser executados na ordem descrita neste capítulo. Cada passo específico com intervenção é indicado por uma seta azul .

! A coleta de amostras, a extração de DNA e a análise com o Software CheckReportTM não fazem parte do kit de teste PapilloCheck®. Portanto, a descrição desses passos é abreviada neste capítulo. Para mais informações, consulte as Instruções de Uso correspondentes, por exemplo, do PapilloCheck® Collection Kit, do Kit de Extração de DNA oCheck®, do Kit de Extração de DNA oCheck®- CheckExtractor™ e do Software CheckReportTM.

8.1 Coleta de amostras e extração de DNA

8.1.1 Coleta de amostras

A coleta de amostras não faz parte do kit de teste PapilloCheck®. O equipamento de ensaio dedicado a amostras cervicais (PapilloCheck® Collection Kit) também está disponível na Greiner Bio-One (consulte as informações sobre encomendas no Capítulo 2).

DNA preparado com Greiner Bio-One CheckExtractor™, um sistema automatizado de extração de DNA e configuração de PCR, usando o Kit de Extração de DNA oCheck® - CheckExtractor™ (Greiner Bio-One, 517 070) é adequado para a análise PapilloCheck®. Para essa extração automática de DNA, o esfregaço cervical humano deve ter sido coletado com um dos seguintes sistemas ou meios de coleta:

• PapilloCheck® Collection Kit (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha)• PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA, EUA)

PapilloCheck®foi validado utilizando o DNA preparado com o Kit de Extração de DNA oCheck® (Greiner Bio-One, 515 040) proveniente de esfregaços cervicais humanos coletados através de um dos seguintes sistemas ou meios de coleta:

• PapilloCheck® Collection Kit (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha)• PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA, EUA)• Surepath™ (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA)• STMTM (Qiagen, Venlo, Países Baixos)• Easyfix (Labonord, Templemars, França)• Cyt-All (Alphapath, Mauguio, França)

Para mais informações sobre os meios de transporte adequados ou os sistemas de extração de DNA, contate o seu distribuidor local Greiner Bio-One ou consulte o site da Greiner Bio-One: www.gbo.com/bioscience/biochips_download


Capítulo 8.1.2 Extração de DNA

Capítulo 8.3.3 Hibridação

Capítulo 8.4 Escaneamento e avaliação

Capítulo 8.2 PCR

Capítulo 8.3.3 Lavagem e secagem

ou

Figura 4: Visão geral do passo-a-passo do PapilloCheck®

OUoCheck®

Kit de Extração de DNA

CheckExtractor™ oCheck®

Kit de Extração de DNA


8.1.2 Extração de DNA

A extração de DNA não faz parte do kit de teste PapilloCheck®. Extração de DNA anterior à análise PapilloCheck® deve ser feita ou automaticamente usando o Greiner Bio-One CheckExtractor™ junto com o Kit de Extração de DNA oCheck® - CheckExtractor™, ou manualmente, usando o Kit de Extração de DNA Greiner Bio-One oCheck® (consulte informações de encomenda no Capítulo 2).

Recomenda-se usar o kit de teste PapilloCheck® junto com o Greiner Bio-One CheckExtractor™ e o respetivo Kit de Extração de DNA de acordo com a designação para processar remessas de 48 ou 96 amostras. Ele não é destinado para o processamento de remessas menores do que 48 amostras.

Amostras cervicais coletadas com diferentes sistemas ou meios de coleta devem ser tratadas de modo diferente depois da extração de DNA. Adicionalmente, existem diferenças na preparação de amostras usando extração manual ou automática de DNA. Para uma descrição detalhada dos procedimentos de preparação de amostras e extração de DNA, por favor siga corretamente as Instruções de Uso do Kit de Extração de DNA oCheck® - CheckExtractor™ ou Kit de Extração de DNA oCheck®, respetivamente.


8.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR)

A PCR é um método muito sensível que pode detectar quantidades extremamente pequenas de DNA. Devem tomar-se precauções especiais para evitar a contaminação da reação (consulte o Capítulo 7). A Polimerase HotStarTaq® e a Uracilo-N-Glicosilase são necessárias mas não são fornecidas com o kit de teste PapilloCheck® e devem ser adquiridas separadamente (consulte o Capítulo 2).

! O kit de teste PapilloCheck® foi validado utilizando Polimerase HotStarTaq® da Qiagen e Uracilo-N-Glicosilase da Fermentas (consulte as informações sobre encomendas no Capítulo 2). A utilização destas enzimas é obrigatória para se obter o desempenho estabelecido.

8.2.1 Preparação do termociclador

O kit de teste PapilloCheck® foi validado com os termocicladores seguintes: • GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems),• Termociclador Veriti™ de 96 Poços (Applied Biosystems),• peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH).

! É imprescindível utilizar um dos termocicladores mencionados acima para se obter o desempenho estabelecido.

O programa do termociclador de PCR PapilloCheck® encontra-se resumido na Tabela 2.

Tabela 2: Programa do termociclador de PCR PapilloCheck®

Tempo Temp. °C Nº de ciclos

20 min 37 °C 1

15 min 95 °C 1

30 s25 s45 s

95 °C55 °C72 °C

40

30 s45 s

95 °C72 °C 15

Pausa 10 °C

Além disso, têm de se definir os parâmetros de execução seguintes para cada termociclador. Para uma descrição sobre como definir estes parâmetros, consulte as Instruções de Uso do respectivo termociclador.

GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems)Defina o volume de reação para 26 µl, a velocidade de rampa para “9600” e utilize uma temperatura da tampa de 103 °C.

Termociclador Veriti™ de 96 Poços (Applied Biosystems)Utilize a ferramenta Método de Conversão do Termociclador Veriti™ 96-Poços para entrar no programa PCR PapilloCheck® e selecione “9600 Emulation Mode”. Defina o volume de reação para 26 µl e a temperatura da tampa para 103 °C.

peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH)Utilize o programa PCR pré-programado PapilloCheck® “PapilloCheck.js” fornecido com o termociclador. Normalmente o programa pode ser aberto usando o seguinte caminho: local/Scripts/GreinerBioOne/PapilloCheck.js.


8.2.2 Tratamento de Uracilo-N-Glicosilase (UNG)5

O PapilloCheck® PCR MasterMix contém dUTP que se inclui nos produtos de amplificação durante a PCR PapilloCheck®, tornando os produtos da PCR suscetíveis à degradação pela UNG. A UNG divide o produto da PCR em locais onde se incluiu um resíduo de desoxiuridilato. Os produtos divididos da PCR não serão amplificados numa reação posterior. Assim, pode se utilizar um tratamento de UNG para eliminar a potencial contaminação cruzada de reações de PCR anteriores6.

• Dilua a Uracilo-N-Glicosilase 1:200 em água reagente de PCR. Utilize uma diluição fresca de UNG para cada preparação de reação de PCR PapilloCheck® (consulte o Capítulo 8.2.3). Não reutilize a UNG diluída.

• Misture a diluição de UNG cuidadosamente com o agitador vórtex durante 2 segundos, e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes.

A concentração original da Uracilo-N-Glicosilase é de 1 U/µl. Portanto, a concentração da diluição é 0,005 U/µl.

! Validou-se o kit de teste PapilloCheck® utilizando a Uracilo-N-Glicosilase da Fermentas (consulte o Capítulo 2). A utilização desta enzima é obrigatória para se obter o desempenho estabelecido.

Adicione1 µl dessa diluição a cada reação de PCR PapilloCheck® (consulte o Capítulo 8.2.3, Tabela 3).

Esta quantidade é suficiente para eliminar a contaminação cruzada de PCR. Tenha cuidado para não utilizar uma solução de UNG mais concentrada, pois isso poderia ter efeito adverso sobre o desempenho da PCR, resultando numa sensibilidade reduzida do PapilloCheck®.

Geralmente, para o tratamento da UNG, a mistura de reação de PCR é incubada durante 20 minutos a 37 °C. Posteriormente, a UNG é inativada por um passo adicional de incubação durante 15 minutos a 95 °C. Esses dois passos já estão incluídos na PCR PapilloCheck® e correspondem aos dois primeiros passos do programa do termociclador (consulte a Tabela 2). Durante o segundo passo (15 minutos a 95 °C) ocorre tanto a inativação da Uracilo-N-Glicosilase como a ativação da Polimerase HotStarTaq®.

! O sistema UNG incorporado da PCR PapilloCheck® eliminará apenas a contaminação cruzada com produtos da PCR provenientes de reações anteriores da PCR. Não se consegue eliminar outra contaminação, por exemplo que ocorra durante a preparação da amostra, extração de DNA ou adição de modelo de PCR. Portanto, ainda é necessário cumprir as instruções e precauções especiais para evitar a contaminação descrita no Capítulo 7.

5 A aquisição do PapilloCheck® vem acompanhada de uma licença limitada com os Números de Patentes Norte-americanas 5 035 996, 5 683 896, 5 945 313, 6 287 823 e 6 518 026, e as patentes estrangeiras correspondentes.

6 Longo, M.C., et al., Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions, Gene, 93, 125-128, 1990.


8.2.3 Preparação da reação de PCR

8.2.3.1 Procedimento de preparação automática de PCR usando o CheckExtractor™

Com exceção da Polimerase HotStarTaq® e da Uracilo-N-Glicosilase, o PapilloCheck® PCR MasterMix já contém todos os componentes necessários para executar a reação de PCR (tampão de PCR, MgCl2, dNTPs, iniciadores, modelo de controle da PCR). Baseado nisso, o procedimento de preparação da PCR PapilloCheck® pode ser dividido em duas partes: a preparação do mastermix final, adicionando enzimas ao PapilloCheck® PCR MasterMix, e a preparação da reação de PCR final, adicionando o DNA extraído ao modelo. Enquanto a primeira parte é manual, a segunda pode ser feita automaticamente utilizando o Greiner Bio-One CheckExtractor™.

! Validou-se o kit de teste PapilloCheck® utilizando a Polimerase HotStarTaq® da Qiagen (consulte o Capítulo 2). A utilização desta enzima é obrigatória para se obter o desempenho estabelecido.

A preparação da mistura de reação é executada da melhor forma num ambiente protegido, por exemplo, com uma estação de PCR, para evitar a contaminação da reação. Para a preparação, deve ser utilizado o frasco com código de barras para preparação mastermix. Esse frasco pode ser encontrado junto com os frascos do PapilloCheck® PCR MasterMix e do Tampão de hibridação PapilloCheck® com as caixas de papelão menores incluindo material para 48 análises cada.

! Para assegurar a possibilidade de uso do mastermix final para a configuração de PCR com o CheckExtractor™ é obrigatório o uso de frasco com código de barras já que esse código é usado para identificação do reagente enquanto o CheckExtractor™ funciona.

A quantidade necessária de mastermix final depende do número de amostras a serem analisadas e consequentemente do número de reações de PCR a serem preparadas. Para uma preparação de PCR de 48 amostras, é necessário um frasco com código de barras cheio; para uma preparação com 96 amostras, dois frascos são necessários. Se menos de 48 ou 96 amostras forem analisadas, por exemplo, 43 ou 87, a quantidade de mastermix necessária que deve ser preparada é para reações de 48 ou 96. A quantidade final de mastermix necessário pode ser calculada pelo Software CheckExtractor™. Consequentemente, por favor siga as instruções do software enquanto estiver equipando o transportador de tubo. Por favor, saiba que o CheckExtractor™ não vai começar a preparação de PCR se for usado menos mastermix final do que o Software CheckExtractor™ calculou.

Prepare o mastermix final (que consiste em PapilloCheck® PCR MasterMix, Polimerase HotStarTaq® e Uracilo-N-Glicosilase) como descrito na Tabela 3.

Tabela 3: Preparação do mastermix final

Preparação de um frasco suficiente para até 48 reações de PCR

PapilloCheck® PCR MasterMix 1148,4 µl

Polimerase HotStarTaq® (5 U/µl) 11,6 µl

Uracilo-N-Glicosilase (Diluição de 1:200, 0.005 U/µl) 58 µl

Volume total do mastermix final 1218 µl


Na tela inicial, selecione “PCR” para começar um método de preparação de PCR.

Vai aparecer uma tela pedindo informações básicas.

Complete as informações:

Em ”1) Kits”, por favor, escolha PapilloCheck® MasterMix no menu suspenso e coloque seu ID de usuário em “2) Used ID”. Em “3) Amostras”, pressione o botão “Importar” para escolher a placa de eluição a ser processada. Certifique-se de selecionar o arquivo certo conferindo o nome do arquivo, o código de barra e a data exata de emissão. Se a placa de eluição já tiver sido usada em uma preparação de PCR, você deve importar o arquivo com a última data de emissão.

Depois de importar os dados para uma placa de eluição específica, uma lista de amostras vai aparecer. Por pré-definição, o Software CheckExtractor™ vai marcar cada amostra, para cada extração de DNA que foi desempenhada com sucesso, como ativa. A preparação de PCR será desempenhada em todas as amostras ativas. Se a preparação tiver que ser desempenhada em menos amostras, as amostras devem ser desativadas pelo usuário. Novamente, os consumíveis necessários, ponteiras conhecidas emastermix final são calculados pelo Software CheckExtractor™. Por favor siga as instruções do software enquanto estiver equipando os diferentes transportadores.


Em “4) Detalhes do Kit”, coloque o cursor na caixa em branco para “Código de barra”. Escaneie o código de barra do kit PapilloCheck® a ser usado com o scanner portátil fornecido. O software vai automaticamente preencher a caixa em branco com o número de referência do kit e as outras duas caixas com o número de lote e o prazo de validade do kit.

! O código de barras do kit PapilloCheck® pode ser encontrado no canto superior esquerdo da tampa do kit.

Pressione o botão “iniciar” no canto superior esquerdo da tela para começar a preparação de PCR.

Uma tela descrevendo o carregamento de ponteiras vai aparecer.

Equipe o transportador de ponteiras com as ponteiras. Certifique-se de usar as posições corretas do transportador.

Coloque os transportadores de ponteiras na plataforma de carregamento como mostrado, começando com o trilho 1.

Pressione o botão“OK” . O CheckExtractor™ vai carregar os transportadores automaticamente.

! Para se certificar de que o transportador será carregado pelo CheckExtractor™, coloque o transportador na plataforma com e empurre cuidadosamente o transportador no trilho direito até perceber uma leve parada mecânica. Nessa posição, o transportador vai ser automaticamente carregado depois de confirmar com "OK".


O Editor de Ponteiras vai aparecer.

Verifique se a configuração de ponteiras mostrada está correta. Ponteiras ainda disponíveis para o procedimento serão mostradas em marrom. Posições de ponteiras vazias serão mostradas em cinzento.

Se a configuração de ponteiras for mostrada corretamente, pressione o botão “OK”.

Se a configuração de ponteiras tiver que ser ajustada, procure as Instruções de Uso do CheckExtractor™ para uma explicação de como se usa o editor.

Uma tela descrevendo o carregamento de placas vai aparecer.

Equipe o transportador de placas com uma placa vazia com código de barra e a placa de eluição a ser processada. Coloque a placa de PCR na posição 1 no transportador e a placa de eluição na posição 2. Os códigos de barra das duas placas devem ficar voltados para a direita e, portanto, na direção do leitor de códigos de barras.


Para ter um fluxo de trabalho otimizado e evitar ciclos desnecessários de congelamento e degelo, é recomendando que o método de preparação de PCR aconteça diretamente após o fim de uma extração. Nesse caso, a placa de eluição da extração prévia ainda está na posição 2 e apenas uma placa vazia de PCR deve ser adicionada.

Se uma placa mais "velha" de eluição for utilizada no método de preparação de PCR, que tenha sido vedada e armazenada anteriormente, certifique-se de descongelar a placa, centrifuga-la rapidamente em uma centrífuga de placas e remover a vedação antes de colocá-la no transportador de placas (consulte também o capítulo 8.2.4).

Coloque o carregador de placas na plataforma de carregamento nos trilhos 12-17.


! Para se certificar de que o transportador será carregado pelo CheckExtractor™, coloque o transportador na plataforma e empurre cuidadosamente o transportador no trilho direito até perceber uma leve parada mecânica. Nessa posição, o transportador vai ser automaticamente carregado depois de confirmar com "OK".

! O código de barra da placa de eluição usada deve caber na placa escolhida antes na tela de definição “3) Amostras” Se não, uma mensagem de erro vai aparecer.

Uma tela descrevendo o carregamento do mastermix final vai aparecer.

Misture o mastermix final preparado cuidadosamente com o agitador de vórtice durante 2 segundos, e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes.

Equipe o transportador de tubos com os frascos com código de barra para a preparação de mastermix. Certifique-se de que os adaptadores estão colocados corretamente.


Para um preparação de PCR de até 48 amostras, coloque um frasco com código de barras cheio com o mastermix final preparado no adaptador, na posição 23 do transportador. Para uma preparação de PCR de até 96 amostras, coloque dois frascos cheios no transportador de tubos. Use adaptadores nas posições 23 e 24 do carregador. Novamente, certifique-se de que os códigos de barra das duas placas fiquem voltados para a direita e, portanto, na direção do leitor de códigos de barras.

! Se a solução for misturada pelo vórtice e então a tampa inclusa do frasco com código de barra estiver usado, essa tampa deve ser removida antes de colocar o frasco nos adaptadores de tubo.

Coloque o transportador de placas na plataforma de carregamento no trilho 19.


! Para se certificar de que o transportador será carregado pelo CheckExtractor™, coloque o transportador na plataforma com e empurre cuidadosamente o transportador no trilho direito até perceber uma leve parada mecânica. Nessa posição, o transportador vai ser automaticamente carregado depois de confirmar com "OK".

O carregamento está completo. O CheckExtractor™ exibirá o tempo de verificação estimado e solicitará uma confirmação para iniciar a preparação de PCR.

Pressione “OK” para começar a preparação de PCR.


No final da preparação, pressione ”OK” para começar os procedimentos de descarregamento e a limpeza da plataforma.

Depois da confirmação, o CheckExtractor™ vai automaticamente descarregar todos os transportadores. Por favor, remova-os da plataforma de carregamento. Siga as instruções na ordem correta exibida na tela para descarregar com segurança o CheckExtractor™.

Tire a placa de eluição do transportador de placas. Manuseie a placa com cuidado para evitar que ela vaze.

! Para armazenar a placa de eluição para análises ou reanálises futuras, vede a placa de eluição com uma lâmina adesiva (consulte o capítulo 8.2.4) e armazene a -20 °C.

Tire a placa de PCR com a mistura de reação do transportador de placas. Manuseie a placa com cuidado para evitar que ela vaze. Vede a placa de PCR usando vedação térmica, como descrito no capítulo 8.2.4. Transfira a placa vedada para o ciclador de PCR e inicie a reação de PCR utilizando o programa do termociclador descrito no Capítulo 8.2.1 (Tabela 2).

! Após a conclusão da PCR, os produtos de amplificação devem ser utilizados imediatamente para hibridação ou conservados no escuro a -20 °C por até uma semana.


Armazene o transportador de ponteiras completo com as ponteiras de filtro não usadas ainda no mesmo lugar.

Descarte os frascos com código de barra do mastermix.

Descarte as ponteiras usadas nos resíduos sólidos do laboratório.

Limpe todos os transportadores e as ponteiras descartadas com a solução de limpeza recomendada (para maiores informações, consulte as Instruções de Uso do CheckExtractor™).

Use o método da luz UV por 30 minutos para auxiliar na descontaminação de DNA do CheckExtractor™.

Confirme a limpeza completa da plataforma pressionando “OK”. Assim, o percurso de armazenamento dos arquivos do relatório serão mostrados. Para voltar para a tela inicial do Software, pressione“OK”.

A mesma configuração de amostra da placa de PCR resultante está incluída nos arquivos do relatório. Essa é a base para o processo pós-PCR, incluindo hibridação e lavagem. Esteja consciente de que a disposição pode ser diferente de uma das placas de eluição, já que tanto amostras da extração não funcionam como amostras desativadas são puladas. Isso resulta em poços potencialmente não utilizados nas últimas posições da placa de PCR.


8.2.3.2 Manual do procedimento de preparação de PCR

Esse kit PapilloCheck® é destinado apenas para remessas de 48 amostras. Consequentemente, a preparação de mastermix final é conduzida como o descrito no capítulo anterior usando frascos com código de barra para a preparação do mastermix.

! Em contraste com o procedimento automático de configuração de PCR, não é obrigatório usar o frasco com código de barra na preparação do mastermix final. Qualquer tubo de ensaio padrão pode ser usado.

Prepare o mastermix final (que consiste em PapilloCheck® PCR MasterMix, Polimerase HotStarTaq® e Uracilo-N-Glicosilase) como descrito na Tabela 3.

Para a preparação manual da mistura final da reação:

Misture o mastermix final preparado cuidadosamente com o agitador de vórtice durante 2 segundos, e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes.

Aliquote o mastermix final através da pipetagem de 21 µl do mastermix final para cada reação de PCR em um tubo de reação de PCR fino, de 0,2 ml, de uma tira de PCR, ou em um poço de uma placa de PCR.

Efetue a adição do DNA modelo num ambiente de trabalho diferente do da preparação do mastermix final (consulte o Capítulo 7.2).

Adicione 5 µl do DNA extraído a cada tubo de ensaio ou poço e misture com o agitador de vórtice durante 2 segundos, e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes. O volume total da reação de PCR final é 26 µl.

! Recomenda-se incluir um controle negativo para cada remessa de mastermix preparado. Como controlo negativo, pode utilizar-se o tampão de eluição de DNA do equipamento de extração de DNA apropriado ou água de grau PCR.

Feche as tiras de PCR com as tampas adequadas e a placa de PCR usando ou uma tampa de tira ou vedação (consulte o Capítulo 8.2.4). Transfira os tubos de reação ou a placa de PCR para o termociclador e inicie a reação de PCR utilizando o programa do termociclador descrito no Capítulo 8.2.1 (Tabela 2).

! Após a conclusão da PCR, os produtos de amplificação devem ser utilizados imediatamente para hibridação ou conservados no escuro a -20 °C por até uma semana.


8.2.4 Vedação e armazenamento das placas

8.2.4.1 Vedação e armazenamento da placa de eluição

Para armazenamento a uma temperatura -20 °C, a placa de eluição deve ser fechada após o descarregamento do CheckExtractor™.

Feche a placa de eluição após remover o dispositivo colocando um papel alumínio adesivo da Greiner Bio-One (Silver seal, 80.0 / 140 MM, REF 676 090). Pressione-o firmemente sobre a superfície da placa. Armazena a placa a uma temperatura -20 °C.

! Recomenda-se usar a folha metálica adesiva da Greiner Bio-One (Silver seal, REF 676 090) para armazenamento da placa de eluição já que a mesma pode ser facilmente removida da placa se a mesma tiver que ser reutilizada para uma configuração de PCR usando o CheckExtractor™.Mas também é possível usar o procedimento de vedação descrito no capítulo 8.2.4.2 para a placa de PCR para fechar a placa de eluição.

8.2.4.2 Vedação da placa de PCR

Após o procedimento de descarregamento do CheckExtractor™, descrito no capítulo 8.2.3, a placa de PCR deve ser vedada antes de transferi-la para o ciclador de PCR. Para esta finalidade, uma folha metálica de vedação (Pierce Seal, REF 865 804) é soldada sobre a placa de PCR através de um equipamento de vedação térmica (Modelo: 4S3, REF 865 802). Esse procedimento é descrito na Figura 5.

Ligue o equipamento de vedação térmica usando o botão na parte traseira da armação. Ligue-o por volta de 5 minutos antes de usá-lo para garantir que a temperatura de vedação necessária de 170 °C pode ser alcançada.

Verifique a temperatura de vedação programada e a duração do procedimento de vedação apertando a tecla “SET” (1x: a temperatura de vedação é exibida; 2x: a duração do procedimento de vedação é exibida). Para uma vedação correta da placa, uma temperatura de vedação de 170 °C e uma duração de vedação de t2.0 segundos devem ser definidas. Se um desses valores ou ambos não estiverem corretos, ajuste os valores usando as teclas “▲” e “▼”.

! Para ajustar a temperatura de vedação, aperte a tecla "SET" no canto superior esquerdo da parte da frente do dispositivo. A temperatura de vedação definida é exibida na tela e fica piscando. A temperatura exigida pode ser então definida usando as teclas “▲” e “▼”. Ao apertar novamente, a última temperatura de vedação visível é confirmada e a duração atualmente definida para o procedimento de vedação é exibida (também piscando). A duração pode ser então definida usando as teclas “▲” e “▼”. Ao apertar novamente a tecla “SET”, o tempo de duração é confirmado e armazenado no dispositivo.

Aguarde até que o dispositivo tenha alcançado uma temperatura de 170 °C (a temperatura real é constantemente exibida). Além da temperatura ser exibida, também é possível identificá-la através de um aviso sonoro (bipe) que pode ser ouvido quando o dispositivo está pronto para uso.

Abra o dispositivo pressionando a tecla “OPERAR” . A bandeja com enchimento para a placa de PCR abrirá automaticamente.

Remova a estrutura de metal e coloque a placa de PCR sobre o enchimento da bandeja. Depois, coloque a folha metálica de vedação (Pierce Seal, REF 865 804) sobre a placa de PCR. Verifique se a linha azul está virada para cima e se todos os poços estão bem cobertos. Coloque a estrutura de metal na parte de cima da placa.

Feche o dispositivo pressionando novamente a tecla “OPERAR”. A bandeja fechará automaticamente e o procedimento de vedação será iniciado. Após o procedimento de vedação, a bandeja abre novamente automaticamente. Primeiro, remova a estrutura de metal e depois a placa de PCR vedada.


! Após a remoção da placa de PCR, o dispositivo pode ser fechado apertando a tecla “CLOSE” (FECHAR). Para evitar dobrar a estrutura de metal recomenda-se manter a mesma dentro do dispositivo. Quando estiver fechado, o dispositivo pode ser desligado a qualquer momento, usando o interruptor na parte traseira da armação.

Centrifugue brevemente a placa PCR vedada usando uma centrífuga de placas (ver capítulo 8.2.3.1) e transfi ra a placa imediatamente para um ciclador de PCR. Inicie a PCR usando o programa PapilloCheck® (descrito no capítulo 8.2.1, Tabela 2).

170s

Ligue o aparelho de vedação térmica 5 minutos antes de usá-lo.

Use uma temperatura de vedação de 170 °C e um duração de t2.0 segundos.

Aperte “OPERATE” (OPERAR) para abrir o dispositivo.

Remova a estrutura de metal e coloque a placa de PCR sobre o enchimento da bandeja.

Coloque a folha de vedação (Pierce Seal, REF 865 804) sobre a placa de PCR.

Coloque a estrutura de metal na parte de cima da placa.

Aperte “OPERATE” (OPERAR). Remova a placa vedada, aperte "CLOSE"

(FECHAR). Desligue o equipamento de vedação.

170s

Figura 5: Procedimento de vedação usando o equipamento de vedação térmica

8.2.4.3 Fechar novamente a placa de PCR

Após realizar a hibridização (consulte o capítulo 8.3), a placa de PCR pode ser vedada e armazenada novamente a uma temperatura -20 °C.

Feche a placa de PCR fi xando um papel alumínio adesivo da Greiner Bio-One (Silver seal, REF 676 090). Pressione-o fi rmemente sobre a superfície da placa. Armazene a placa a uma temperatura de -20 °C.

! O papel alumínio adesivo é fi xado diretamente sobre o fi lme de vedação. Ao remover o papel alumínio, é possível que a vedação subjacente esteja parcialmente desprendida da placa. Entretanto, isso não é um problema para tirar os produtos da PCR da placa de PCR.


8.3 Hibridação e lavagem

Os passos pós-PCR a seguir, chamados hibridação e lavagem, são descritos apenas para remessas de 48 amostras. O kit de teste PapilloCheck® não é destinado para processar remessas menores. Consequentemente, todos os passos são descritos para o processamento simultâneo de quatro chips PapilloCheck®.

8.3.1 Preparação e disposição

A hibridação deve ser efetuada à temperatura ambiente (20-25 °C). Inicie os preparativos necessários para a hibridação e os passos de lavagem com pelo menos 30 minutos de antecedência antes de começar o processo de hibridação.

Para dissolver os potenciais precipitados na hibridação e nos tampões de lavagem, exponha-os à temperatura ambiente (20-25 °C) durante 30 minutos e misture bem antes de utilizar.

Armazenar o kit de teste PapilloCheck® à 4-8 °C pode resultar em precipitação do SDS no Tampão B. Deixe as soluções equilibrarem à temperatura ambiente e depois agite o tubo no agitador de vórtice ou agite o frasco até qualquer precipitado ficar dissolvido.

Prepare a Câmara de Hibridação oCheck®. coloque uma toalha de papel úmida na Câmara de Hibridação e feche a tampa para criar uma atmosfera saturada de umidade.

Para evitar a evaporação do pequeno volume de mistura de hibridação utilizado no chip, é necessário executar a hibridação numa atmosfera saturada de umidade. Uma Câmara de Hibridação dedicada para a análise PapilloCheck® está disponível na Greiner Bio-One (consulte o Capítulo 2).

Incube quatro chips PapilloCheck® na Câmara de Hibridação preparada à temperatura ambiente (20-25 °C) durante, pelo menos, 10 minutos.

Prepare as soluções de lavagem I, II e III de acordo com as instruções seguintes.

Preparação das soluções de lavagem I, II e III:

Prepare a solução de lavagem para as soluções de lavagem I, II e III como descrito na Tabela 4.

Divida em alíquotas três volumes iguais da mistura da solução de lavagem em três caixas de lavagem oCheck® e identifique-as no rótulo como solução de lavagem I, II e III. Por favor, use uma escala graduada em cada caixa de lavagem oCheck® para preencher a quantidade correta da solução de lavagem para 4 chips.

Pré-aqueça a solução de lavagem II a 50 °C em banho-maria com a temperatura controlada durante, pelo menos, 20 minutos antes de utilizar. Certifique-se de que o nível de enchimento do banho-maria seja igual ao nível de enchimento da solução de lavagem II.


Tabela 4: Preparação da mistura da solução de lavagemOs volumes resumidos nesta tabela são suficientes para os três passos de lavagem (soluções de lavagem I, II e III) para quatro chipsPapilloCheck®.

Componentes

Água destilada ou desionizada 560 ml

Tampão A PapilloCheck® 56 ml

Tampão B PapilloCheck®, 7 ml

Volume total 623 ml

! Nunca reutilize as soluções de lavagem, pois isso pode originar uma acumulação do produto de lavagem da PCR que possivelmente interfere com os resultados do PapilloCheck®. Utilize soluções de lavagem novas para cada ensaio.

A mistura da solução de lavagem preparada pode ser conservada por até uma semana à temperatura ambiente. Verifique se ocorreu precipitação de SDS. Caso tenha ocorrido, aqueça a mistura da solução de lavagem até que o precipitado esteja dissolvido e novamente equilibrado à temperatura ambiente. Em seguida, prepare a experiência de hibridação seguinte.


8.3.2 Hibridação

A hibridação deve ser efetuada à temperatura ambiente (20-25 °C). Os principais passos de trabalho para a hibridação dos produtos da PCR da reação de PCR PapilloCheck® para o chip PapilloCheck®são ilustrados na Figura 6.

Misture os produtos da PCR antes de utilizar. Centrifugue brevemente. Se uma placa de PCR vedada foi usada, use uma centrífuga de placas adequada.

Se os produtos da PCR foram conservados a -20 °C até à hibridação, primeiro descongele os produtos da PCR antes de misturar e, em seguida, continue conforme descrito.

Agite o Tampão de Hibridação no agitador de vórtice antes de utilizar. Centrifugue brevemente.

Transfira 30 µl do Tampão de Hibridação PapilloCheck® em um tubo de ensaio novo com 8x tiras de PCR. Se for mais conveniente, também pode ser usado um novo poço de uma placa de PCR.

Adicione 5 µl dos produtos de PCR no Tampão de Hibridação. Se o Greiner Bio-One CheckExtractor™ foi usado para a preparação de PCR, os produtos de PCR estão presentes na placa vedada de PCR. A lâmina de vedação é perfurável e pode ser perfurada com a ponta de uma pipeta. Para fechar novamente a placa de PCR, consulte o capítulo 8.2.4.3.

Centrifugue brevemente.

Transfira 25 µl da mistura de hibridação para cada poço do chip utilizando os seis canais de uma pipeta multicanal. Evite a formação de bolhas de ar!

Para conseguir o tempo correto da hibridação, é obrigatório processar em paralelo seis amostras usando uma multipipeta de 8 canais (ver Figura 6) Isto aumenta a eficiência de manuseamento, a velocidade, reduzindo, assim, o risco de evaporação.

Se possível, hibride todos os 12 poços de um chip. Caso se processem menos de 12 amostras, deixe vazios os poços não utilizados. Os poços não utilizados num chip processado não podem ser utilizados para amostras no futuro.

! Manuseie o chip cuidadosamente para evitar derramar a mistura de hibridação. O derramamento pode originar contaminação cruzada das amostras e resultados falso positivos.

Incube os chips durante exatamente 15 minutos à temperatura ambiente (20-25 °C) dentro da Câmara de Hibridação preparada numa atmosfera escura saturada de umidade. Tenha cuidado para não mover a Câmara de Hibridação durante a hibridação.

! Nunca altere o tempo ou a temperatura de incubação da reação de hibridação, pois isso pode ocasionar a perda de intensidade do sinal fluorescente ou um aumento da fluorescência não específica.

Não exponha os chips hibridados à luz solar direta.


Prepare um ambiente saturado úmido na Câmara de Hibridação.

Incube quatro chips PapilloCheck® na Câmara de Hibridação à temperatura ambiente (20-25 °C) (consulte o Capítulo 8.3.1).

Misture 30 µl do Tampão de Hibridação PapilloCheck® em um tubo de ensaio de 0.2 ml de uma tira de PCR ou poço com 5 µl do produto de PCR. Misture cuidadosamente.

Transfi ra 25 µl da mistura de hibridação para cada poço do chip PapilloCheck® usando uma pipeta multicanal.

Feche a Câmara de Hibridação e incube o chip PapilloCheck® durante exatamente 15 minutos à temperatura ambiente (20-25 °C).

Figura 6: Passos de trabalho do processo de hibridação


8.3.3 Lavagem e secagem

O equipamento especial fornecido pela Greiner Bio-One permite a lavagem paralela de até quatro chips PapilloCheck®(consulte o Capítulo 2). O equipamento adicional necessário para o processamento dos chips PapilloCheck® inclui três caixas de lavagem oCheck® e uma alça para o suporte magnético da Câmara de Hibridação.

Os diferentes passos são mostrados na Figura 7.

Retire cuidadosamente o suporte magnético de lâminas que contém as lâminas hibridadas da Câmara de Hibridação.

Coloque o suporte de lâminas diretamente na caixa de lavagem oCheck® que contém a solução de lavagem I. Certifique-se de que o lado magnético esteja virado para cima.

Fixe a alça oCheck® ao suporte de lâminas e dê início ao primeiro dos três passos de lavagem.

Lave o chip à temperatura ambiente (20-25 °C) na solução de lavagem I movimentando-a rapidamente para cima e para baixo durante 10 segundos. Os arrays devem permanecer sempre cobertos com solução de lavagem.

Lave os chips durante 60 segundos na solução de lavagem IIa 50 °C movimentando vigorosamente para cima e para baixo o suporte de lâminas.

Lave o chip à temperatura ambiente (20-25 °C) na solução de lavagem III movimentando-a rapidamente para cima e para baixo durante 10 segundos.

Retire imediatamente qualquer líquido da superfície do chip através de centrifugação. Se utilizar uma microcentrífuga especial para microarrays, centrifugue durante 1 minuto. Se utilizar uma microcentrífuga aplicável aos tubos de 50 ml, coloque cada chip PapilloCheck® lavado num tubo de 50 ml e centrifugue à temperatura ambiente durante 3 minutos a 500 g.

O chip PapilloCheck®está, então, pronto para escaneamento e deve ser escaneado imediatamente. Para a limpeza das caixas de lavagem oCheck®, enxagúe várias vezes com água após cada procedimento de lavagem e secagem estar concluído.


Primeiro passo da lavagem Remova cuidadosamente o suporte

magnético de lâminas da Câmara de Hibridação.

Coloque rapidamente o suporte de lâminas na caixa de lavagem oCheck® com solução de lavagem I.

Fixe o cabo oCheck®.

Lave os chips PapilloCheck® na solução de lavagem I à temperatura ambiente durante 10 segundos movendo o suporte de lâminas para cima e para baixo.

CMYK 92-25-16-4

Segundo passo da lavagem

Lave os chips PapilloCheck® na solução de lavagem II em banho-maria à 50 °C durante60 segundos movendo o suporte de lâminas para cima e para baixo.

Terceiro passo da lavagem

Lave os chips PapilloCheck® na solução de lavagem III à temperatura ambiente durante 10 segundos movendo o suporte de lâminas para cima e para baixo.

Secagem

Imediatamente remova qualquer líquido da superfície do chip PapilloCheck® através de centrifugação.

3 minutos500 g

1 minutovelocidade

máxima

ou

Figura 7: Passos do processo de lavagemDiferentes passos de lavagem e processo de secagem antes da análise do chipPapilloCheck® com o CheckScannerTM e com o Software CheckReportTM.


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



40

8.4 Escaneamento e avaliação do chip PapilloCheck®.

Coloque os chips PapilloCheck® noCheckScannerTM e continue com o escaneamento conforme descrito em detalhes no Guia do Usuário do Software CheckReportTM.

Para mais detalhes sobre a instalação do CheckScannerTM e do Software CheckReportTM assim como os requisitos do sistema do computador, consulte as Instruções de Uso do CheckScannerTM e do Software CheckReportTM.

Sempre que analisar dados usando o Software CheckReportTM, certifi que-se de que a versão do software instalada em seu computador corresponde à versão recomendada no kit PapilloCheck® que está sendo utilizado. Se as versões não corresponderem, atualize o Software CheckReportTM. A versão mais recente do Software pode ser baixada no site da Greiner Bio-One:www.gbo.com/bioscience/biochips_download


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



41

9. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS

Se ocorrer uma das mensagens de erro seguintes durante o escaneamento do chip ou se a análise PapilloCheck® falhar devido a controles específi cos no chip, continue conforme descrito abaixo. Não hesite em contatar o seu distribuidor local Greiner Bio-One se tiver dúvidas ou difi culdades durante a utilização do PapilloCheck®. Para solucionar problemas em outros passos do teste, por exemplo, extração de DNA, veja as respetivas Instruções de Uso.

PROBLEMA e causa Comentários e sugestões

MENSAGEM DE ERRO "NÃO FOI POSSÍVEL LER O CÓDIGO DE BARRAS"

Código de barras danifi cado Verifi que se o código de barras está danifi cado. Introduza o código de barras manualmente quando aparecer a janela apropriada.

O chip não foi carregado corretamente

Verifi que a orientação do chip e faça o escaneamento do chip na orientação correta.

MENSAGEM DE ERRO "COLORAÇÕES EM FALTA", CONTROLE DA IMPRESSÃO FALHOU OU CONTROLE DA ORIENTAÇÃO FALHOU

Poeira no chip Repita a hibridação do(s) produto(s) da PCR em outro chip.

Formação de bolhas de ar durante a transferência de líquido no chip

Repita a hibridação do(s) produto(s) da PCR em outro chip. Pipete cuidadosamente para evitar a formação de bolhas.

CONTROLE DE HIBRIDAÇÃO FALHOU

Temperatura incorreta da solução de lavagem II

O segundo passo da lavagem tem de ser realizado a 50 °C. Certifi que-se de que a solução de lavagem II seja aquecida a 50 °C.

Temperatura incorreta do banho-maria

O segundo passo da lavagem tem de ser realizado a 50 °C. Verifi que a temperatura do banho-maria. Certifi que-se de que a temperatura do banho-maria esteja a 50 °C. Se necessário, confi ra a temperatura com um termômetro.

Preparação errada da mistura de hibridação

Repita a preparação da mistura de hibridação com os volumes corretos e hibride os produtos da PCR em outro chip.

CONTROLE DA PCR FALHOU

Sem adição de Polimerase de DNA HotStarTaq® no MasterMix

Repetir análise do PapilloCheck® começando com a preparação da reação da PCR.

Adição de uma Polimerase de DNA HotStarTaq® que não funciona corretamente ao MasterMix


Adição de Uracilo-N-Glicosilase não diluída a MasterMix


Mistura de reação não foi misturada o sufi ciente

Repetir a análise do PapilloCheck® começando com a reação da PCR. Tenha cuidado para misturar cuidadosamente a mistura de reação.

Inibidores da PCR estão presentes na amostra

Repita a extração de DNA e a análise do PapilloCheck®.

Hibridação executada sem adição de produto da PCR

Repita a hibridação.

Mistura de hibridação não foi misturada o sufi ciente

Repita a hibridação.

Problemas com o termociclador

Verifi que o desempenho do termociclador e se a respectiva programação está correta (passos da PCR, rampa de aquecimento, volume).Use apenas termocicladores válidos com o PapilloCheck®.


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



42

PROBLEMA e causa Comentários e sugestões

CONTROLE DA AMOSTRA FALHOU

Não existe adição de DNA da amostra à reação da PCR

Repetir a análise do PapilloCheck® começando com a reação da PCR.

Preparação do DNA falhou Repita a extração do DNA.

Não existe material de amostra o sufi ciente

A coleta da amostra falhou. A amostra é muito clara. Concentre a amostra de acordo com a descrição do Capítulo 9.1 e repita a extração de DNA ou repita a coleta da amostra.

PCR E/OU CONTROLES DA AMOSTRA NÃO FALHARAM, MAS EXIBEM UM VALOR DE RELAÇÃO SINAL/RUÍDO DE 0

Esse resultado é classifi cado como válido se o Software CheckReportTM detectar, pelo menos, um tipo de HPV na amostra com um sinal acima de um limite defi nido. A amostra e/ou o controle da PCR podem então mostrar sinais fl uorescentes baixos ou mesmo ausentes devido a competição durante a PCR.

10. ASSISTÊNCIA TÉCNICA

A Greiner Bio-One dispõe de um departamento de assistência técnica que conta com cientistas experientes, com uma vasta experiência teórica e prática em biologia molecular e nos produtos oCheck®. Se houver quaisquer dúvidas ou difi culdades relativas aos produtos oCheck®, não hesite em contatar o seu distribuidor local Greiner Bio-One.


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



43

11. CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO DO PAPILLOCHECK®

11.1 Desempenho Analítico do PapilloCheck®

11.1.1 Sensibilidade analítica

Para acessar a sensibilidade analítica, o limite de detecção (LoD95 = menor número de cópias do DNA alvo que pode ser detectado em 95% dos casos) foi estabelecido usando como referência plasmídeos para cada tipo de HPV detectável contendo a região E1 visada pelo PapilloCheck®. Para a análise, os plasmídeos genótipo de HPV específi co foram fortifi cados em meio de transporte incluindo células do tipo humana (células HEK) como base. O DNA foi extraído de cada amostra e subsequentemente analisado com o kit PapilloCheck®. O LoD95 foi calculado para cada genótipo de HPV individualmente usando 2 séries de diluições independentes e análise Probit. O LoD95 foi verifi cado com uma terceira série de diluição para cada genótipo de HPV. Os limites de detecção para os diferentes genótipos de HPV estão resumidos na Tabela 5.

Tabela 5: Sensibilidade Analítica do PapilloCheck®

Genótipo do HPV*

Limite de Detecção (LoD95) para

o PapilloCheck®

[cópias/PCR]**

Limite de detecção (LoD95) para

o PapilloCheck®

[cópias/extração]***

HPV 6 30 600

HPV 11 20 400

HPV 16 10 200

HPV 18 320 6400

HPV 31 50 1000

HPV 33 90 1800

HPV 35 190 3800

HPV 39 50 1000

HPV 40 20 400

HPV 42 50 1000

HPV 43 30 600

HPV 44 20 400

HPV 45 90 1800

HPV 51 20 400

HPV 52 70 1400

HPV 53 60 1200

HPV 55 20 400

HPV 56 50 1000

HPV 58 160 3200

HPV 59 290 5800

HPV 66 40 800

HPV 68 30 600

HPV 70 30 600

HPV 73 2250 45000

HPV 82 40 800

* Plasmídio genótipo de HPV específi co com 104 de células humanas HEK como base em PreservCyt™ (Hologic). ** Reação de LoD95 por PCR calculado por LoD95 por extração (consulte ***)*** LoD95 baseado em análises de probabilidade incluindo o sistema recomendado de Extração de DNA oCheck® da Greiner Bio-One


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



44

11.1.2 Especifi cidade analítica – tipos de HPV

O Papillocheck® foi testado em sua especifi cidade analítica usando plasmídeos de referência de genótipo de HPV específi co. Os seguintes genótipos de HPV foram testados com cópias de 105/reações de PCR:

HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 30, HPV 31, HPV 33, HPV 34, HPV 35, HPV 39, HPV 40, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 54, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 61, HPV 66, HPV 67, HPV 68, HPV 69, HPV 70, HPV 71, HPV 73, HPV 81, HPV 82, HPV 84, HPV 85.

Detectaram-se as hibridações cruzadas seguintes:

O HPV 55 dá um sinal na sonda do HPV 44. Como resultado, o Software CheckReport™ exibe um resultado combinado de HPV 44/HPV 55. O HPV 13 pode reagir de forma cruzada com a sonda do HPV 11, mas não resulta num sinal falso positivo pois o HPV 13 não está presente nas amostras cervicais.

11.1.3 Especifi cidade analítica – Organismos Não-HPV

O Papillocheck® foi testado em sua especifi cidade analítica usando os seguintes organismos não-HPV (1ng DNA genômico/reação de PCR):

Bacteroides ureolyticus, Bacteroides uniformis, Bifi dobacterium breve, Bifi dobacterium adolescentis, Chlamydia trachomatis, Clostridium diffi cile, Clostridium perfringens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterobacter faecium, Enterobacter durans, Enterobacter faecalis, Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus micros, Proteus hauseri, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fl uorescens, Pseudomonas putida, Trichomonas vaginalis, Candida albicans

Nenhum sinal não-específi co foi detectado com PapilloCheck®.

11.2 Repetibilidade (Intra-Reprodutibilidade)

A repetibilidade mede a variação de desempenho entre diferentes testes em um laboratório. Para fazer a avaliação de repetibilidade de DNA de 12 amostras, contendo modelos de HPV diferentes (incluindo os genótipos de HPV HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV35, HPV43, HPV44/55, HPV 45, HPV51, HPV52, HPV53) baseado em células humanas foi extraído usando o CheckExtractor™ em combinação com o Kit de Extração de DNA oCheck® -CheckExtractor™ e analisado com o PapilloCheck® Kit. Cada amostra foi analisada em 6 repetições independentes e em 3 testes independentes. Ou seja, 18 repetições de cada amostra e 216 amostras num total foram testadas pela avaliação de repetibilidade. Todas as amostras foram testadas pelo mesmo usuário, com equipamentos e kit do mesmo lote. Além disso, a avaliação de repetibilidade descrita foi executada em 3 locais de teste, então, no total, 648 análises foram conduzidas. Uma concordância de 99,3% em média foi obtida em todos os testes de repetibilidade (consulte Tabela 6). Tabela 6: Resultados dos testes de repetibilidade com PapilloCheck®

Local de teste Concordância

Local de teste 1 98 %



Concordância média: 99,3 %


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



45

11.3 Reprodutibilidade (Inter-Reprodutibilidade)

A reprodutibilidade mede a variação de desempenho entre diferentes testes feitos em diferentes laboratórios. Para fazer a avaliação de repetibilidade de DNA de 12 amostras, contendo modelos de HPV diferentes (incluindo os genótipos de HPV HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV35, HPV43, HPV44/55, HPV 45, HPV51, HPV52, HPV53) baseado em células humanas foi extraído usando o CheckExtractor™ em combinação com o Kit de Extração de DNA oCheck® -CheckExtractor™ e analisado com o PapilloCheck® Kit. O procedimento foi executado paralelamente em 3 locais de teste diferentes. Cada amostra foi analisada em 6 repetições independentes e 3 testes independentes em cada local de teste. Ou seja, 18 repetições de cada amostra e 216 amostras num total foram testadas em cada local de teste. Cada local de testes usou diferentes equipamentos (CheckExtractor™, ciclador de PCR, CheckScanner™) e kits de lotes diferentes. No total, 648 amostras foram testadas. Uma concordância de 99,7% foi obtida com os resultados dos diferentes locais de teste.

11.4 Robustez

Para avaliar a robustez do sistema de testes do PapilloCheck®consideraram-se variações dos parâmetros seguintes:

• Temperatura de Hibridação• Tempo de hibridação• Temperatura de lavagem

Todos os testes foram realizados em 3 repetições com concentrações de modelos altos (cópias de 105/reações de PCR de plasmídeo de referência HPV) e com concentração de modelos perto do limite de detecção (concentração dependendo do genótipo de HPV). Os testes foram executados em cada genótipo de HPV detectável com o PapilloCheck®. Os intervalos dos valores dos parâmetros determinados no qual uma detecção robusta de HPV é possível encontram-se resumidos na Tabela 7.

Tabela 7: Robustez do PapilloCheck®

Parâmetro Intervalo

Temperatura de hibridação 18-25 °C

Tempo de hibridação 13-17 minutos

Temperatura de lavagem 48-52 °C


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



46

11.5 Desempenho Clínico do PapilloCheck®

Para determinar o desempenho clínico do PapilloCheck® e do teste de alto risco PapilloCheck® em termos de sensibilidade e especifi cidade clínicas,realizou-se um estudo comparativo utilizando o PapilloCheck® e o teste GP5+/6+-PCR EIA12. Para este estudo, analisaram-se amostras de 1437 mulheres representativas com citologia normal (grupo de controle) com mais de 40 anos de idade (idade média, 49 anos; faixa etária dos 40 aos 60 anos) e 192 mulheres representativas (idade média, 34 anos; faixa etária dos 30 aos 60 anos) com lesões CIN3+ histologicamente confi rmadas (grupo de casos). Todas as amostras utilizadas neste estudo foram colhidas originalmente durante a fase do estabelecimento da linha de base a partir de mulheres no grupo de intervenção do ensaio de implementação, POBASCAM, aleatório e com controle, baseado na população13.

Após restringir a análise PapilloCheck® aos 14 tipos de HPV de alto risco visados pelo GP5+/6+-PCR-EIA, e pelo novo PapilloCheck® de alto risco, o PapilloCheck® teve uma sensibilidade Em comparação, estes valores foram 96,4 % (185/192; 95 % IC: 93,9-98,9) e 97,7 % (95 % IC: 96,9-98,5), respetivamente, para GP5+6+-PCR-EIA (consulte a Tabela 8 e 9).

Tabela 8: Comparação dos resultados de PapilloCheck® (14 tipos de HPV de alto risco visados pelo PapilloCheck®) e GP5+/6+ PCR-EIA resultados estratifi cados para controles e casos.

PapilloCheck®

(14 tipos de HPV de alto risco)

GP5+/6+-PCR/EIA Total

- + -

Controles -+

total

1.386 (96,5 %)18 (1,3 %)

1.404 (97,7 %)

4 (0,3 %)29 (2,0 %)36 (2,3 %)

1.390 (96,7 %)47 (3,3 %)

1.437

Casos -+

total

4 (2,1 %)3 (1,6 %)7 (3,6 %)

4 (2,1 %)181 (94,3 %)185 (96,4 %)

8 (4,2 %)184 (95,8 %)

192

Tabela 9: Sensibilidade e especifi cidades clínicas de PapilloCheck® e GP5+/6+-PCR-EIA (resultados para um ou mais dos 14 tipos de HPV de alto risco: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, ou 68).

14 HPV de alto risco PapilloCheck® GP5+/6+

Sensibilidade Clínica para ≥ CIN3 95,8 % 96,4 %

Especifi cidade Clínica para ≥ CIN2 96,7 % 97,7 %

12 Comparison of the clinical performance of PapilloCheck® human papillomavirus detection with that of the GP5+/6+-PCR-enzyme immunoassay in population-based cervical screening. Hesselink AT, Heideman DA, Berkhof J, Topal F, PolRP, Meijer CJ, Snijders PJ. J Clin Microbiol. 2010 Mar;48(3):797-801. Epub 2009 Dec 30.

13 Bulkmans, N. W., L. Rozendaal, P. J. Snijders, F. J. Voorhorst, A. J. Boeke, G. R. Zandwijken, F. J. van Kemenade, R.H. Verheijen, K. Groningen, M. E. Boon, H. J. Keuning, M. van Ballegooijen, A. J. van den Brule, and C. J. Meijer. 2004. POBASCAM, a population-based randomized controlled trial for implementation of high-risk HPV testing in cervical screening: design, methods and baseline data of 44,102 women. Int. J. Cancer 110:94–101.


PapilloCheck®



REF 465 088



IVD

Fabr

icad

o na

Áus

tria

4°C

8°C



47

Para acessar o teste de reprodutibilidade do PapilloCheck® com amostras clínicas, um estudo foi conduzido em 2012 nos Países Baixos e na Alemanha. Nesse estudo, foram usadas amostras cervicais obtidas de um painel de 10000 mulheres que participaram de exames regulares de citologia cervical na província de Utrecht nos Países Baixos. Usando um conjunto defi nido de 550 amostras, pré-testadas, o PapilloCheck® mostrou uma concordância de reprodutibilidade intra-laboratório e inter-laboratório de 97,6% e 94%, respetivamente. O conjunto de dados da avaliação de reprodutibilidade está resumido nas Tabelas 10 e 11.

Tabela 10: Reprodutibilidade Intra-Laboratório

PapilloCheck® time 1 pos PapilloCheck® time 1 neg

PapilloCheck® time 2 pos 147 6

PapilloCheck® time 2 neg 7 390

Resultados:Reprodutibilidade [%]: 97,3Menor confi abilidade [%] = 96,3Kappa = 0,941

Tabela 11: Concordância Inter-Laboratório

PapilloCheck® time 1 pos PapilloCheck® time 1 neg

PapilloCheck® time 2 pos 123 2

PapilloCheck® time 2 neg 31 394

Resultados:Reprodutibilidade [%]: 94Menor confi abilidade [%] = 92,1Kappa = 0,842


PROTOCOLO

BREVE

PCR

Sala 2


PROTOCOLO

BREVE

12. PROTOCOLO BREVE PAPILLOCHECK®

12.1 Sala 2: Preparação do mastermix fi nal

Dilua a Uracilo-N-Glicosilase 1:200 em água reagente de PCR. Misture cuidadosamente a diluição da UNG.

Prepare o mastermix fi nal utilizado um frasco com código de barra para preparação de mastermix.

Preparação de um frascosufi ciente para até 48 reações de PCR

PapilloCheck® PCR MasterMix 1148,4 µl

Polimerase HotStarTaq® (5 U/µl) 11,6 µl

Uracilo-N-Glicosilase (Diluição de 1:200, 0.005 U/µl) 58 µl

Volume total do mastermix fi nal 1218 µl

Misture o mastermix fi nal cuidadosamente. Prepare um ou dois frascos de acordo com a quantidade de amostras a serem

analisadas ou calculadas pelo software CheckExtractor™, respetivamente.

OPCIONAL: confi guração manual do PCR

Aliquote o mastermix fi nal: adicione21 µl do mastermix fi nal para cada reação de PCR em um tubo de reação de PCR , de 0,2 ml, de uma tira de PCR, ou em um poço de uma placa de PCR.

Continue com as instruções de adição manual do modelo de DNA (consulte o capítulo 12.2.2).

12.2 Confi guração da PCR

PCR

Sala 1

1 5 10 15 20 25 303030

170s


PROTOCOLO

BREVE

12.2.1 Sala 1: Confi guração Automática de PCR usando o CheckExtractor™

Iniciando a PCR - método de confi guração. Complete as informações: Carregue o transportador de ponteiras com a quantidade necessária. Carregue o transportador de placas com placa de eluição e uma placa de PCR

vazia.

1 5 10 15 20 25 303030

Carregue o frasco de mastermix com código de barras no transportador de tubos.

Carregue o transportador de tubos. Inicie a verifi cação de confi guração de PCR

1 5 10 15 20 25 303030

Depois que a verifi cação de confi guração terminar, vede a placa de PCR usando uma Vedação Pierce e um vedador térmico. Use uma temperatura de vedação de 170 °C e um duração de t2.0 segundos.

Transfi ra a placa vedada para um ciclador de PCR e inicie o termociclador.

Depois que a verifi cação de confi guração de PCR tiver terminado, comece a descarregar e feche a placa de eluição.

Inicie o procedimento de limpeza.

PCR

Sala 2


PROTOCOLO

BREVE

12.2.2 Sala 2: Preparação manual de PCR

OPCIONAL:

Adicione 5 µl do modelo de DNA a cada reação da PCR. Misture cuidadosamente.

Se uma placa de PCR foi utilizada, vede a placa usando uma Vedação Pierce e vedação térmica. Use uma temperatura de vedação de 170 °C e um duração de t2,0 segundos.

170s

Inicie a reação de PCR com o programa do termociclador preparado.

Tempo Temp. °C N.º de ciclos

20 min 37 °C 1

15 min 95 °C 1

30 s25 s45 s

95 °C55 °C72 °C

40

30 s45 s

95 °C72 °C 15

Pausa 10 °C

12.3 Sala 3: Hibridação - Preparação / Reação de hibridação

Hibrid. e Lavagem

Sala 3


PROTOCOLO

BREVE

! Inicie os preparativos pelo menos 30 minutos antes da hibridação.

Dissolva os potenciais precipitados na hibridação e nos tampões de lavagem e misture bem.

Prepare a mistura da solução de lavagem para quatro chips PapilloCheck®.

Componentes

Água destilada ou desionizada 560 ml

Tampão A PapilloCheck® 56 ml

Tampão B PapilloCheck®, 7 ml

Volume total 623 ml

Divida a mistura de solução de lavagem em três caixas de lavagem oCheck®. Pré-aqueça a solução de lavagem II em banho-maria a 50 °C.

Incube os chips PapilloCheck® que vão ser analisados numa Câmara de Hibridação preparada à temperatura ambiente.

Misture os produtos da PCR e centrifugue brevemente. Misture o Tampão de Hibridação e centrifugue brevemente. Misture 30 µl de Tampão de Hibridação PapilloCheck®com 5 µl de produto de

PCR. Misture cuidadosamente e centrifugue brevemente.

Transfi ra 25 µlda mistura de hibridação para cada poço do chip PapilloCheck® usando uma pipeta multicanal.

Evite a formação de bolhas de ar.

Hibrid. e Lavagem

Sala 3

Documents

PapilloCheck Instruções para uso - GBO · zung Inhalt ausrei-chend für Tests Gefahr Im Dunkeln lagern Wichtiger Hinweis fr No de lot Date limite de conser- ... Kit de