PCR (polymerase chain reaction) - genome.tugraz.at (VO2).pdf · PCR-History • Erfunden 1983 von Dr. Kary Mulles • Er erhielt 10 Jahre später den Nobelpreis für Chemie • Seit

Molekulare Diagnostik

1Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Assoc. Prof. Dr. Juliane Bogner-Strauss

PCR(polymerase chain reaction)

Ist ein in vitro Verfahren zur selektiven Anreicherung von Nukleinsäure-Bereichen definierter Länge und definierter Sequenz aus einem Gemisch von Nukleinsäure-Molekülen (genomische DNA, cDNA (c…complementary) …..)



PCR-History• Erfunden 1983 von Dr. Kary Mulles• Er erhielt 10 Jahre später den Nobelpreis für

Chemie• Seit 1992 tausende Zitate in Publikationen • PCR hat extrem viele Anwendungsgebiete

(Vaterschaftstest, Gerichtsmedizin, Krankheitsnachweise…..)



Einsatzmöglichkeiten der PCR• Amplifikation von DNA Bereichen• cDNA-Klonierung und cDNA-Genbanken• DNA-Foot- & Fingerprinting• DNA-Sequenzierung• Gen-Diagnostik (genetische Erkrankungen)• Isolierung von DNA-Fragmenten• Markierung von DNA-Fragmenten• Mutagenisierung von DNA-Fragmenten



Prinzip PCR• Welche Nukleinsäuresequenz soll

amplifiziert werden?• Welche DNA wird als Vorlage-Template

verwendet (Genomische, cDNA…)

• Primer setzen und suchen (Kriterien)• Temperaturprogramm wählen• DNA aus PCR Gemisch isolieren• Weiterverwendung der isolierten DNA



Primer setzen und suchen

• Primer im Randbereich der zu amplifizierenden Sequenz setzen (5´- 3´Amplifikation)

• Komplementär zu je einem Strang• Mit oder ohne Startcodon/Stopcodon• Wie lang sollen die Primer sein

Schmelztemperatur berücksichtigen Verhältnis G:C zu A:T beachten!!

• Sollen neue Schnittstellen kreiert werden?



PCR-Gemisch

• Template DNA (100 ng cDNA, 500 ng genomische DNA)

• Primer (10 µmolar)• DNA-Polymerase Taq (Bakt Thermus aquaticus)

• dNTPs (Nukleosidtriphosphate)• PCR-Puffer• dd H2O• MgCl2 / DMSO (optional)



Temperatur- und Zeitprogramm• Denaturieren zum Einzelstrang (94°C, 30 sec)• Anhybridisieren der Primer (Annealing, 30 sec)

kommt auf die Schmelztemperatur der Primer an umso höher die Temperatur umso spezifischer das PCR-Produkt

• Amplifizieren mittels DNA-Polymersase (72°C, 2-4 min)kommt auf Größe des Produkts an!!mittels hitzestabiler Taq-Polymerase(proof reading oder nicht?)





Kontrolle und Isolierung der DNA aus PCR Gemisch

• Wie groß ist das erwartete PCR-Produkt?• Welches Agarosegel verwendet man (meist 0,7-2%)?• Ist nur ein Produkt sichtbar oder mehrere?

bei vielen Banden muß PCR nochmal und spezifischer gemacht werden

• Ausschneiden der Spezifischen DNA-Bande aus dem Gel

• Isolieren der DNA aus dem Gelstückchen (Kit)• Weiterverarbeitung der DNA (NB, Klonierung, etc)



Laufrichtung DNA auf Agarosegel



Agarosegel zur Auftrennung des PCR-Gemisches



Agarosegel zur Auftrennung des PCR-Gemisches



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