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PEGylierte Sterole zur Funktionalisierung
liposomaler Oberflächen
Inaugural-
Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
vorgelegt von
Thomas Steenpaß
aus Bocholt
2004
Ich danke allen meinen Kollegen, die mich bei meiner Arbeit unterstützt haben.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. R. Schubert, der stets für Anregungen,
Diskussionen und Unterstützung bereit war und mir viel Freiraum für eigene Ideen und
Konzepte gelassen hat. In guter Erinnerung wird mir die familiäre Atmosphäre des AK
Schubert bleiben, die Prof. Schubert durch die Organisation gemütlicher gemeinsamer Feiern
und menschliches Miteinander pflegte.
Des weiteren danke ich Frau PD Dr. R. Peschka-Süss für ausführliche Diskussionen rund um
das Thema Octreotid-modifizierte Liposomen.
Meiner Laborkollegin Frau Dr. A. Kimpfler danke ich für die Aufnahme der Cryo-TEM
Bilder und die angenehme Zusammenarbeit.
Herr Prof. Dr. J. Seelig und Herr PD Dr. H. Heerklotz haben mir die ITC-Anlage zur
Verfügung gestellt und mich in Theorie und Praxis der mikrokalorimetrischen Messung
eingeführt. Auch hierfür möchte ich mich herzlich bedanken.
Die praktischen Arbeiten zur Erstellung dieser Dissertationsschrift wurden im Zeitraum von
Juli 2000 bis April 2004 am Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie des Institutes für
Pharmazeutische Wissenschaften der Albert-Ludwigs-Universität in Freiburg im Breisgau
durchgeführt.
Dekan: Prof. Dr. K. Bucher
Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. G. E. Schulz
Referent: Prof. Dr. R. Schubert
Korreferentin: PD Dr. R. Peschka-Süss
Tag der Bekanntgabe des Prüfungsergebnisses: 11.11.2004
Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht:
Kimpfler, A., Steenpaß, T., Falk, U., Gerber, C., Bruchelt, G., Schubert, R. Aufnahme von Glucose-Oxidase-Liposomen in Phagozyten – Einfluss von Lipidzusammensetzung und Oberflächenmodifikation, (Poster) DPhG-Tagung, Oktober 2001, Halle
Steenpaß, T., Lung, A., Schubert, R.
Tresyl-activated ethoxylated soy sterols for coupling of proteins to liposomes (Poster) 10th International Conference on Pharmaceutical Technology, April Florenz 2002
Steenpaß, T.
Tresylated sterol-PEG anchors for coupling of proteins to liposomes, (Vortrag) The 15th Mountain / Sea Liposome Workshop Oberjoch / Allgäu, März 2002
Steenpaß, T.
Octreotide coupled to the liposomal surface (Vortrag) The 2nd Dutch Oberjoch Liposome Workshop on the Isle of Ameland, September 2003
Steenpaß, T. Drug-Targeting durch Funktionalisierung von Liposomen (Vortrag)
FAF-Meeting, Januar 2004, Freiburg
Manuskript fertig gestellt: Steenpaß, T., Lung, A., Schubert, R.
Tresylated PEG-sterols for subsequent attachment of proteins to preformed liposomes einzureichen in Biochim Biophys Acta, 2005
Inhaltsverzeichnis I
1 ALLGEMEINER TEIL 1
1.1 Liposomen 1 1.1.1 Definition, Aufbau und Klassifizierung 1 1.1.2 Herstellungsmethoden 6
1.1.2.1 Filmmethode 6 1.1.2.2 Extrusion 7 1.1.2.3 Ultrabeschallung 8 1.1.2.4 Detergenzentfernung 8
1.1.3 Charakterisierung von Liposomen 10 1.1.4 Nicht therapeutische Anwendungsgebiete von Liposomen 12 1.1.5 Therapeutische Anwendungsgebiete von Liposomen, Liposomen als Drug-Delivery-Systeme 12
1.1.5.1 Passives liposomales Targeting, der EPR-Effekt 13 1.1.5.2 Aktives liposomales Targeting 17
1.2 Modifikation liposomaler Oberflächen 20 1.2.1 Hydrophile Polymere zur sterischen Stabilisierung liposomaler Drug-Carrier-Systeme 20
1.2.1.1 Modifizierung mit PEG-Phospholipiden 21 1.2.1.2 Modifizierung mit PEG-Sterolen 23
1.2.2 Ligand-modifizierte liposomale Oberflächen 24 1.2.2.1 Ligand-modifizierte Liposomen: Arten und Methoden zu ihrer Herstellung 24 1.2.2.2 Kopplungsmethoden zur Präparation Ligand-modifizierter Oberflächen 28
1.2.2.2.1 Nicht kovalente Methoden 28 1.2.2.2.2 Kovalente Methoden 30
1.2.2.2.2.1 Aminoreaktive, direkte Kopplung 30 1.2.2.2.2.2 Thiolaktive, direkte Kopplung 34 1.2.2.2.2.3 Aminoaktive distale Kopplung an PEG-Ketten 40 1.2.2.2.2.4 Thiolaktive, distale Kopplungen 41
1.2.3 Zusammenfassung der Kopplungsprinzipien 43
1.3 Isotherme Titrationskalorimetrie zur Untersuchung der Interaktionen von Detergenzien mit
Phospholipidvesikeln 45 1.3.1 Geräteaufbau und Messprinzip 45 1.3.2 Untersuchungsgegenstände der isothermen Titrationskalorimetrie in Membran-Detergenz-Systemen
47
2 AUFGABENSTELLUNG UND ZIELSETZUNG 49
3 MATERIAL UND GERÄTE 50
II Inhaltsverzeichnis
3.1 Lipide und Membrankomponenten 50
3.2 Chemikalien 50
3.3 Verbrauchsmaterialien 54
3.4 Geräte 55
4 METHODEN 57
4.1 Synthesen 57 4.1.1 Aufreinigung von BPS-30 57 4.1.2 Synthese von tresyliertem BPS 58 4.1.3 Synthese von N-Hydroxysuccinimid-aktiviertem BPS 59 4.1.4 Synthese von p-Maleimidophenylisocyanat-aktiviertem BPS 60
4.2 CMC- Bestimmungen 61
4.3 Liposomenherstellung 61 4.3.1 Lipidkompositionen 62 4.3.2 Herstellung durch Extrusion 62
4.4 Charakterisierung der Liposomendispersionen 63 4.4.1 Messung der Größenverteilung durch PCS 63 4.4.2 Bestimmung des Phosphatgehalts nach Bartlett 64 4.4.3 Cryo-TEM 65
4.5 Einlagerungsverhalten von ethoxylierten Sojasterolen in vorgefertigte Liposomen 67 4.5.1 Überprüfung der Separation von Mizellen und Liposomen mittels Dünnschichtchromatographie 67 4.5.2 Einlagerungskinetik und Transfer Raten 67 4.5.3 Isotherme Titrationskalorimetrie zur Untersuchung der Interaktionen von PEGylierten Sterolen mit
Liposomen 69 4.5.3.1 Demizellisierungsexperiment 70 4.5.3.2 Verteilungsexperiment 70 4.5.3.3 Solubilisierungsexperiment 73
4.5.4 Membran-Leakage während der BPS-30 Einlagerung 73 4.5.4.1 Freisetzung unterhalb der CMC 73 4.5.4.2 Freisetzung oberhalb der CMC 76
4.6 Oberflächenmodifikation präformulierter Liposomen mit BSA-BPS-Derivaten 78 4.6.1 Das Standardkopplungsprotokoll 78 4.6.2 Ermittlung der Kopplungseffizienz 80
4.6.2.1 Iodierung des Liganden 80
Inhaltsverzeichnis III
4.6.2.2 Quantifizierung des gebundenen Anteils über GPC 80 4.6.3 Kopplungsversuche unter Verwendung von tresyliertem Generol 81
4.6.3.1 Überprüfung der Eignung von GET zur Kopplung von BSA an Liposomen 82 4.6.3.2 Kontrolle des pH-Optimums bei Verwendung tresylierter Sojasterole zur Kopplung von BSA
83 4.6.3.3 Abhängigkeit der Kopplungseffizienz von pH-Wert und Stoffmenge des eingesetzten GET 83 4.6.3.4 Untersuchungen zur Dauer des ersten Inkubationsschritts 84
4.6.4 Kopplungsversuche unter Verwendung von BPS-TRE 85 4.6.4.1 Versuche zur Dauer des zweiten Inkubationsschritts 85 4.6.4.2 Free-Flow Elektrophorese als Werkzeug zum Nachweis der Oberflächenmodifikation von
Liposomen 85 4.6.4.3 Kopplungseffizienz in Abhängigkeit von Lipidzusammensetzung und BSA-Konzentration 87 4.6.4.4 Untersuchung der Größenentwicklung während des zweiten Inkubationsschrittes 88 4.6.4.5 Stabilität der Verankerung in Anwesenheit von humanem Serum 89
4.6.5 Versuche unter Verwendung BPS-NHS 90 4.6.5.1 Überprüfung der Eignung von BPS-NHS zur Kopplung von BSA an Liposomen 90 4.6.5.2 Vergleich der Kopplung unter Verwendung verschiedener aktivierter Lipide in Abhängigkeit
der Temperatur des zweiten Inkubationsschritts 90
4.7 Abschätzung der Ligandenzahl pro Liposom 91
5 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 93
5.1 Interpretation der 1H NMR Spektren 93 5.1.1 Tresyliertes BPS 93 5.1.2 N-Hydroxysuccinimid aktiviertes BPS 94
5.2 CMC der PEG-Lipide 96
5.3 Einlagerungsverhalten von PEG-Lipiden in präformulierte Liposomen 97 5.3.1 Trennung von mizellarem und liposomal assoziiertem PEG-Lipid über GPC 98 5.3.2 Einlagerungsgeschwindigkeit und Transferraten der PEG-Lipide 99 5.3.3 Ergebnisse der mikrokalorimetrischen Untersuchungen (ITC) 105
5.3.3.1 Demizellisierungsexperiment 105 5.3.3.2 Verteilungsexperiment 107 5.3.3.3 Solubilisierungsexperimente 108 5.3.3.4 Zusammenfassung der ITC-Experimente 111
5.3.4 Freisetzung von liposomal verkapseltem Calcein während der Einlagerung von BPS in
präformulierte Liposomen 111 5.3.4.1 Freisetzung unterhalb der CMC 111 5.3.4.2 Freisetzung oberhalb der CMC 116
IV Inhaltsverzeichnis
5.4 Oberflächenmodifikation von präformulierten Liposomen mit BSA als Modellprotein 119 5.4.1 Versuche unter Verwendung von tresyliertem Generol E-25 119
5.4.1.1 Grundsätzliche Eignung tresylierter Sojasterole zur Kopplung von BSA an Liposomen 121 5.4.1.2 pH-Abhängigkeit der Kopplung mittels tresyliertem Generol 122 5.4.1.3 Abhängigkeit der Kopplungseffizienz von pH-Wert und Ankerkonzentration 123 5.4.1.4 Reaktionsgeschwindigkeit des ersten Inkubationsschrittes 125
5.4.2 Versuche unter Verwendung von tresyliertem BPS-30 126 5.4.2.1 Geschwindigkeit der Einlagerung des BSA-Sterol-PEG Konjugats 127 5.4.2.2 Kontrolle auf Koelution durch Formation von Proteinaggregaten 128 5.4.2.3 Kopplungseffizienz in Abhängigkeit von Lipidkomposition und Proteinkonzentration 130 5.4.2.4 Calcein-Freisetzung bei Einlagerung des BSA-BPS-Komplexes 135 5.4.2.5 Stabilität des Liposom-BSA-Komplexes in humanem Serum 136 5.4.2.6 Größenentwicklung der BSA-modifizierten Liposomen 139
5.4.3 Versuche unter Verwendung von BPS-NHS 145 5.4.3.1 Grundsätzliche Eignung von BPS-NHS zur Kopplung von BSA an Liposomen 146 5.4.3.2 Vergleich der Kopplungseffizienz unter Verwendung verschiedener aktivierter PEG-Lipide
147
6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 150
7 LITERATURVERZEICHNIS 157
Abkürzungsverzeichnis V
In dieser Arbeit verwendete Abkürzungen:
(Allgemein übliche Abkürzungen, sowie gebräuchliche SI- und von ihnen abgeleitete
Einheiten werden nicht mit angeführt)
Ab antibody; Antikörper
ACS - Qualität American Chemical Society, Qualitätsstandard der Amerikanischen Chemischen Gesellschaft
BPS-30 ethoxyliertes Sojasterolgemisch mit einer durchschnittlichen PEG - Kettenlänge von 30 Etylenoxid-Einheiten
BPS-NHS N-Hydroxysuccinimid aktiviertes BPS-30
BPS-TRE Tresylat aktiviertes BPS-30
BSA bovines Serum Albumin
Bq Becquerel, Aktivität eines radioaktiven Materials [s-1]
CHEMS Cholesterylhemisuccinat
Chol Cholesterol
CMC critical micelle concentration, kritische Mizell(bildungs)konzentration
cpm counts per minute, Zählimpulse pro Minute
cps countes per second, Zählimpulse pro Sekunde
Cryo-TEM Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie
DAB Deutsches Arzneibuch
DPH Diphenylhexatrien
DR Dragendorff Reagenz R
DSC N,N’-Disuccinimidylcarbonat
DSPC 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospatidylcholin
DSS N,N’-Disuccinimidylsuberat
DTT Dithiothreitol
EDC 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz
EMCS N-(-maleimidocaproyloxy)succinimid
EO Ethylenoxid
EPC Eiphosphatidylcholin
EPR enhanced permeability and retention, gesteigerte Aufnahme und Rückhaltung
VI Abkürzungsverzeichnis
EtOH Ethanol
Fab’ Antigen bindendes Antikörper Fragment
FFE Free-Flow Elektophorese, kontinuierliche Free-Flow Zonenelektophorese ohne stationäre Phase
FDA Food and Drug Administration; Amerikanische Aufsichtsbehörde für Lebens- und Arzneimittel
GET tresyliertes Generol E-25
GL Gesamtlipid 1H NMR hydrogen nuclear magnetic resonance-spectroscopy, Wasserstoff
Kernspinresonanz-Spektroskopie
HSPC hydriertes Sojaphosphatidylcholin
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure
ITC isothermal titration calorimetry, Isotherme Titrationskalorimetrie
LSC liquid scintillation counting; Flüssigszintillationszählung
LtL Ligand-targetierte-Liposomen
LUV large unilamellar vesicle, großes unilamellares Vesikel
MALDI-MS matrix assisted laser desorption ionisation mass spectroscopy; Matrix assistierte Laserdesorptionsionisation Massenspektroskopie
MAL-PEG-DSPE Polyethylenglykol--distearoylphosphatidyl-
ethanolamin--maleimid
MeOH Methanol
MLV multilamellar vesicle, multilamellares Vesikel
MPEG2000-DSPE 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy-poly(ethylenglycol)-2000]
MPEG2000-DPPE 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy-poly(ethylenglycol)-2000]
MPS mononukläres Phagozytensystem
M-Wasser mit der Millipore® Simplicity185 Wasseraufbereitungsanlage aufbereitetes Wasser
MWCO molecular weight cut-off; Ausschluss - Molekularmasse einer Dialysemembran
NaC Natriumcholat
NaCl Natriumchlorid
NGPE N-Glutarylphosphatidylethanolamin
NHSIA N-Hydroxysuccinimidyliodoacetat
Abkürzungsverzeichnis VII
NHS-PEG-DSPE Polyethylenglykol--distearoylphosphatidyl-
ethanolamin--N-hydroxysuccinimidester
N-MPB-PE 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamin-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramid]
N-PDP-PE 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamin-N-[3-(2-pyridyldithio)propionat]
NR Ninhydrin Reagenz R
OG n-Octyl--D-glucopyranosid
OLV oligolamellar vesicle, oligolamellares Vesikel
OSCl O-Succinylcardiolipin
PCS photon correlation spectroscopy, Photonenkorrelationsspektroskopie
PE Phosphatidylethanolamin
PEG Polyethylenglykol
PEG-PE-Lipide PEG-Phosphatidylethanolamine
Ph.Eur. Pharmacopoea Europaea; Europäisches Arzneibuch
PI Phosphatidylinositol
PI Polydisperitätsindex, Maß für die Breite der Partikelgrößenverteilung auf Basis der PCS (Gerätespezifikationen vgl. 3.4)
PIT Post-Insertion-Technique; Strategie zur nachträglichen Einlagerung von PEG-PE-Derivaten in PL-Bilayer
PL Phospholipid
PMPI p- Maleimidophenylisocyanat
PP Polypropylen
ppm parts per million; Teile pro Millionen
RES retikuloendotheliales System
rpm rotation per minute, Umdrehungen pro Minute
RT Raumtemperatur
SMCC Succinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate
SEC size exclusion chromatography, Größenausschlusschromatographie
SMPB N-Succinimidyl[4-(p-maleimidophenyl)]butyrat
SPDP N-Succinimidyldithiopropionat
STL Standardlaufmittel
Sulfo-NHS N-Hydroxysulfosuccinimid
SUV small unilamellar vesicle, kleines unilamellares Vesikel
VIII Abkürzungsverzeichnis
Tc Phasenübergangstemperatur
TEA Triethylamin
THF Tetrahydrofuran
tSIE transformed Spectral Index of the External standard, transformierter spektraler Index des externen Standards; Packard spezifischer Parameter zur Beschreibung des Quenchverhaltens einer Probe über die eingebaute Bariumquelle des Geräts
z-Av z-Average, durchschnittlicher hydrodynamischer Partikelgrößendurchmesser auf Basis der PCS nach Malvern
Allgemeiner Teil 1
1 Allgemeiner Teil
1.1 Liposomen
1.1.1 Definition, Aufbau und Klassifizierung
Nach heutiger Definition werden unter Liposomen sphärische Vesikel im grob- bis
kolloiddispersen Bereich verstanden, die durch konzentrisch angeordnete hydrophobe
Lipiddoppelschichten (Bilayer), einen wässrigen intravesikulären Raum von einem ebenfalls
wässrigen Außenmedium abtrennen (Abb. 1-1).
Die Entdeckung der Liposomen geht auf Beobachtungen des Verhaltens von Phospholipiden
(PL) in wässrigen Medien durch Bangham und Mitarbeiter in den 60er Jahren zurück
(Bangham 1963; Bangham et al. 1964; Papahadjopoulos & Bangham 1966). Der amphiphile
Charakter der PL führt bei Hydratisierung zur Quellung der im trockenen Zustand in planaren
Doppelschichten vorliegenden Lipide und resultiert in der spontanen Formation von stabilen,
sphärischen Vesikeln. Die Stabilität liegt im Entropiegewinn begründet, der aus der
Selbstorganisation der amphiphilen Phospholipide resultiert.
Theorien zur Vesikelbildung verbinden Einflüsse der freien Wechselwirkungsenergie,
Molekülgeometrie und Entropie (Helfrich 1973; Israelachvili et al. 1977). Letztlich kann die
Bildung von Vesikeln als Minimierung des energetisch ungünstigen Kontaktes der
hydrophoben Fettsäureketten an den Endigungen der zunächst planaren Strukturen mit der
wässrigen Umgebung aufgefasst werden. Dementsprechend schirmen die polaren
Kopfgruppen der Amphiphile einen in sich geschlossen hydrophoben Raum nach innen wie
nach außen vor der Interaktion mit dem hydrophilen Umgebungsmedium ab.
hydrophobe Lipidmembran
hydrophiler intravesikulärer Raum
Abb. 1-1: Schematische Darstellung des Schnitts durch ein Liposom
2 Allgemeiner Teil
N+
O
O
O
O-O
O
PH
OO
Die meisten Amphiphile mit selbstassoziierendem Charakter weisen
Mizellbildungskonzentrationen (CMCs) unterhalb des nanomolaren Bereichs auf, ohne die die
Stabilität bei großer Verdünnung nicht möglich wäre und aus denen die im Vergleich zu
anderen oberflächenaktiven Verbindungen geringe Aggressivität der PL resultiert. Analog zu
natürlichen Membranen bilden PL die Hauptkomponenten in Liposomenmembranen.
Tabelle 1-1: Struktur und Eigenschaften einiger wichtiger synthetischer Phospholipide mit membranbildenden Eigenschaften, R = 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphatidylrest (nach http1)
Gemäß ihrem amphiphilen Charakter lassen sie sich in zwei, in ihrer Polarität
unterschiedliche Strukturen unterteilen: eine polare Kopfgruppe, die durch einen
Phosphorsäurediester zu einem Glycerol und einem weiteren kurzkettigen Molekülteil
ausgebildet wird (einem Ethanolamin, Cholin, einem weiteren Glycerol, Inositol oder einem
Serin), sowie einen lipophilen Teil, bestehend aus zwei Fettsäureresten, die zumeist über
einen Ester mit den verbleibenden zwei Hydroxylgruppen des zentralen Glycerols verknüpft
sind.
hydrophile Kopfgruppe lipophiler Fettsäurerest
Bezeichnung Struktur Fettsäurerest Kürzel Tc (°C) Ladung pH 7,4
2 x C16 (Palmitinsäure) DPPC 41 0
2 x C18 (Stearinsäure) DSPC 55 0
Phosphatidyl-
Cholin
(PC) CH3
CH3
CH3N
+ R
2 x C18:1 (Ölsäure) DOPC -20 0
2 x C14 (Myristinsäure) DMPE 50 0
2 x C18 (Palmitinsäure) DPPE 63 0 Phosphatidyl-
Ethanolamin (PE) H
H
HN
+R
2 x C18:1 (Ölsäure) DOPE -16 0
2 x C14 (Myristinsäure) DMPG 23 -1
2 x C18 (Palmitinsäure) DPPG 41 -1
Phosphatidyl-
Glycerol
(PG) OH
OH
R
2 x C18:1 (Ölsäure) DOPG -18 -1
2 x C14 (Myristinsäure) DMPS 35 -1
2 x C18 (Palmitinäure) DPPS 54 -1
Phosphatidyl-
Serin
(PS)
HNH3+
O
O-
R
2 x C18:1 (Ölsäure) DOPS -11 -1
DSPC
Allgemeiner Teil 3
Tabelle 1-1 führt die Strukturen und Bezeichnungen einiger wichtiger membranbildender
Phospholipide auf (Phosphoinositole (PI) und mono-Phosphorsäurederivate (PA) wurden der
Übersichtlichkeit halber außer Acht gelassen).
Neben den symmetrischen Diacylphospholipiden, die synthetischer Natur sind, spielen
unsymmetrische PL, die in Position sn-1 und sn-2 des Glycerols unterschiedliche
Fettsäurereste tragen, für die Herstellung von Liposomen eine zentrale Rolle.
Die Lecithine natürlichen Ursprungs sind in der Regel unsymmetrisch aufgebaut (d.h. sie
tragen zwei unterschiedliche Fettsäurereste) und zeichnen sich durch einen hohen Anteil an
(mehrfach) ungesättigten Fettsäuren aus. Die Länge der Fettsäuren, die in bis zu vierfach
ungesättigter Form auftreten, liegt zwischen 12 und 24 C-Atomen.
Gängige Quellen zur Gewinnung von Lecithinen sind Sojabohnen und Eigelb, wobei
Phosphatidylcholine die Hauptkomponenten der vorkommenden Lecithine darstellen. Da die
Zusammensetzung dieser PL naturgemäß sehr komplex und chargenabhängig differieren
kann, kommen in der biophysikalischen Grundlagenforschung eher definierte synthetische PL
zum Einsatz, während Liposomen - nicht zuletzt aus Kostengründen - in der Regel aus
natürlichen PL hergestellt werden. Häufig wird die hydrierte Form der nativen PL der
ungesättigten vorgezogen, da die Elimination der Doppelbindungen mit einer erhöhten
Stabilität gegenüber oxidativer Degeneration der Zubereitung und einer geringeren
Permeabilität der Liposomenmembran bei Raumtemperatur (RT) verbunden ist.
Als Funktion der Temperatur, der Kettenlänge der Fettsäuren, dessen Grad der Ungesättigtheit
sowie der hydrophilen Kopfgruppe (siehe Tabelle 1-1) der zu ihrem Aufbau verwendeten PL
können liposomale Membranen in flüssig kristalliner (L) Form oder im Gelzustand (L)
vorliegen (Chapman 1975; Melchior & Steim 1976; Lee 1977).
Mit steigender Temperatur gehen Phospholipidmembranen vom Gelzustand, in dem die PL in
einem quasikristallinen Gitter fixiert sind, in den flüssigkristallinen Zustand über, der dem
einzelnen Lipidmolekül die laterale Diffusion innerhalb des Bilayers (Lee et al. 1995) und
eine Eigenrotation längs und senkrecht zur Membran erlaubt (Knowles & Marsh 1991).
Die Phasenübergangstemperatur Tc charakterisiert die Temperatur, bei der eine Koexistenz
beider polymorphen Phasen gegeben ist. Aufgrund der uneinheitlichen Zusammensetzung von
PC aus Soja oder Eigelb werden für diese natürlichen Phospholipide
Phasenübergangstemperaturen zwischen -15 und - 7 °C abgegeben (New 1989), für ihre
hydrierten Pendants liegen die Werte zwischen 55 und 65 °C.
4 Allgemeiner Teil
Neben der Tc hat auch die Ladung die ein PL in die Liposomenmembran einbringt
maßgeblichen Einfluss auf die Stabilität und die fusogenen Eigenschaften einer
Liposomenpräparation.
Gegenüber einer ungeladenen Membran führt die permanente Ladung durch Einbringen eines
PG oder PS Anteils in den Bilayer zu einer elektrostatischen Abstoßung der Vesikel
untereinander, wodurch das Fusionieren der einzelnen Liposomen erschwert wird.
Eine weitere wichtige Komponente für den Aufbau von Liposomenmembranen ist
Cholesterol, das entscheidenden Einfluss auf deren Eigenschaften hat. Wird Cholesterol in
eine PL-Mischung eingebracht, die in L Modifikation vorliegt, führt die Interaktion der
3-OH Funktion mit dem Phosphorsäurerest der PL zu einer Verfestigung der
Membranstrukturen und damit zu einer reduzierten Permeabilität. Unterhalb der Tc erfährt
eine Phospholipidmembran durch einen Cholesterolanteil eine Verflüssigung und daraus
resultierend eine Erhöhung der Permeabilität (Demel & De Kruyff 1976). Die Funktion von
Cholesterol als “Fluiditätsmodifikator“ basiert auf der parallelen Anordnung des
Sterolgerüstes zu den Fettsäureketten der PL was eingeschränkte Beweglichkeit derselben zur
Folge hat (Jain et al. 1980).
Wird einer Phospholipidmischung Cholesterol im molaren Überschuss zugesetzt, ist dessen
Kristallisation unvermeidbar, so dass in Liposomen in der Regel nicht mehr als 45 mol%
Cholesterol eingearbeitet werden.
Interessanterweise ermöglicht der Einsatz von äquimolaren Mengen an Cholesterol die
Vesikelbildung aus Lysophosphatiden, die sonst durch ihre fusogene Wirkung die Ausbildung
lamellarer Strukturen stören (Kitagawa et al. 1976a; Kitagawa et al. 1976b).
Eine gebräuchliche Klassifizierung der verschiedenen Liposomenspezies (Papahadjopoulos &
New York Academy of Sciences. 1978; New 1989) wird über die Partikelgröße und die
Lamellarität der Vesikel vorgenommen. Dabei werden unterschieden:
▪ Small unilamellar vesicles (SUV) sind kleine unilamellare Vesikel mit einem
Durchmesser von bis zu 50 nm. Die Membran ist aufgrund der geringen Größe der
Liposomen hier stark gekrümmt und somit energetisch ungünstig. Durch eine
gegenüber der inneren Membran erhöhten Anzahl an Lipidmolekülen im äußeren
Layer wird ein Teil der Membranspannung kompensiert, so dass stabile Vesikel
entstehen, die sich jedoch durch eine hohe Fusogenität auszeichnen. Die
Desintegration von MLV (siehe unten) durch Ultrabeschallung (~ 20 kHz)
Allgemeiner Teil 5
repräsentiert die gängigste Art der Gewinnung von SUV. Trotz ihres geringen
Einschlussvolumens von 0,2-1,5 l/mol Lipid und ihrer daher schlechten
Einschlusseffizienz für hydrophile Substanzen, hat man aufgrund ihrer
vergleichsweise langen Bluthalbwertszeit eine Vielzahl bioaktiver Substanzen in SUV
eingeschlossen. Werden SUV unterhalb der Tc gelagert kommt es zur spontanen
Fusion der Vesikel, da der starre Gelzustand die starke Kurvatur der Membranen nicht
zulässt.
▪ Large unilamellar vesicles (LUV) besitzen als große einschichtige Vesikel mit einem
Durchmesser von mehr als 50 nm ebenfalls nur einen Bilayer, der bei diesem
Vesikeltyp nicht mehr sehr stark gekrümmt ist. LUV liegen praktisch spannungsfrei
vor und sind bedeutend lagerstabiler als die SUV. Die Größe erlaubt hier auch die
Einlagerung von RNA oder Enzymen.
▪ Oligolamellar/multilamellar vesicles (OLV/MLV) sind oligo- bzw. multilamellare
Vesikel mit einem Durchmesser zwischen 0,3 µm sowie einigen µm. Sie besitzen
mehrere (OLV) bzw. viele (MLV) Bilayer. Diese Klasse von PL-Vesikeln stellen die
thermodynamische stabilste Form des Systems Phospholipid/Wasser dar und bilden
sich bei deren Hydratisierung oberhalb der Tc spontan. Nachteile der MLV sind ihre
stark schwankende Partikelgröße und großen Durchmesser. Durch kurze Beschallung,
Verwendung geladener Lipide oder die Anwendung der French-Press Methode
(Hamilton et al. 1980) lassen sich OLV mit geringer und definierterer Partikelgröße
gewinnen. Da die Darstellung dieser Vesikel sehr schonend verläuft eignet sich eine
MLV Herstellung zur Verarbeitung von empfindlichen Substanzen wie Enzymen,
Nukleinsäuren und Proteinen, insbesondere Membranproteinen.
6 Allgemeiner Teil
1.1.2 Herstellungsmethoden
In der Literatur sind zahlreiche Methoden zur Herstellung der verschiedenen Vesikelarten
angeführt. Die folgende Tabelle stellt den verschiedenen Liposomenspezies
Herstellungsmethoden gegenüber, die zu ihrer Gewinnung genutzt werden können. Im
Anschluss folgt eine kurze Erläuterung der wichtigsten Verfahrenstechniken zur Herstellung
liposomaler Dispersionen.
Tabelle 1-2: Auswahl der Methoden zur Herstellung von Liposomen
1.1.2.1 Filmmethode
Die Herstellung von Liposomendispersionen nach der Filmmethode beruht auf der
Entdeckung der Selbstassoziation von PL in wässrigen System durch Bangham (Bangham et
al. 1965). In einem Rundkolben werden die Membrankomponenten sowie (wenn erwünscht)
hydrophobe Wirkstoffe in einem organischen Lösungsmittel(gemisch) gelöst und unter
reduziertem Druck bei Temperaturen um 40 °C zur Trockene eingeengt. Zu Entfernung von
Lösungsmittelresten wird im Hochvakuum nachgetrocknet.
Liposomenart Herstellungsmethode Partikelgröße (nm)
MLV Filmmethode (Bangham et al. 1965)
(Hydratisieren eines Lipidfilms)
300-10000
LUV/OLV
Extrusion (Olson et al. 1979; Mayer et al. 1986)
Hochdruckextrusion (Berger et al. 2001)
Freeze-Thaw Methode (Mayer et al. 1985)
30-800
100-1000
SUV/LUV
Detergenzentfernung (Schubert 2003)
- BioBeads (Philippot et al. 1985)
- Gelpermeationsmethode (Brunner et al. 1976)
- Membrandialyse (Milsmann et al. 1978)
- Tangentialfiltration (Peschka et al. 1998)
40-180
SUV
Hochdruckhomogenisation - French Press (Hamilton et al. 1980)
- Gaulin Micron Lab 40 (Brandl et al. 1990)
- Microfluidizer (Mayhew et al. 1984)
Ultrabeschallung (Huang 1969)
Ethanol-/ Etherinjektionsverfahren (Batzri & Korn 1973)
20-40
30-60
25-125
Allgemeiner Teil 7
Der im Kolben zurückbleibende transparente, homogene Lipidfilm wird anschließend in
(wirkstoffhaltigem) Puffer aufgenommen, wobei sich spontan MLV bilden. Dabei muss
oberhalb der Tc gearbeitet werden, um einen homogen zusammengesetzten Bilayer zu
erhalten.
Die durch die Filmmethode hergestellten Rohdispersionen können anschließend in weiteren
Verfahrensschritten (wie Extrusion, Hochdruckhomogenisation, Ultrabeschallung) zu
Vesikeln geringerer Größe, definierterer Membrananzahl und Partikelgrößenverteilung
weiterverarbeitet werden.
Um eine Vorhomogenisierung zu erreichen ist mehrmaliges Einfrieren in flüssigem Stickstoff
und Auftauen der MLV Dispersion sinnvoll. Die Entstehung von Eiskristallen führt zur
Ruptur der Strukturen und anschließender Reorganisation von Vesikeln mit geringerer Anzahl
von Bilayern. Durch die wiederholten Frier-Tau-Zyklen lassen sich außerdem bessere
Einschlusseffizienzen erzielen.
1.1.2.2 Extrusion
Die Extrusion (Olson et al. 1979; Berger et al. 2001) ist eine wiederholte Passage einer durch
die Filmmethode gewonnen MLV Dispersion durch eine Membran mit definierter
Porengröße.
Üblich sind Polycarbonatmembranen mit einem Porendurchmesser von 50-800 nm. Die
Vesikel der Rohdispersion müssen Poren passieren, die einen weit geringeren Querschnitt
aufweisen als sie selbst. Durch “Abscheren“ äußerer Monolayer und Kavitationseffekte
kommt es zur Bildung von kleineren Bilayerstrukturen, die durch Ausbildung neuer Vesikel
in eine energetisch günstigere Form übergehen.
Die wiederholte Extrusion führt zu homogenen Vesikelpopulationen einer geringen
Partikelgrößenverteilung mit einem bis zwei Bilayern (Schubert et al. 1991). Die Größe der
Liposomen befindet sich im Bereich der Porenweite der Membranen. Häufig ist durch die
elastische Verformung der Vesikel bei Passage der Pore ein leicht über dem
Porendurchmesser liegender durchschnittlicher Partikeldurchmesser zu verzeichnen. Die
Extrusion von MLV ist nur möglich wenn sich die Membran der Vesikel im
flüssigkristallinen Zustand befindet. Liegt die Tc der Rohdispersion oberhalb der RT muss die
MLV zur Extrusion erhitzt werden.
8 Allgemeiner Teil
1.1.2.3 Ultrabeschallung
Auch die Ultrabeschallung (Huang 1969) kann von einer durch die Filmmethode gewonnenen
MLV Dispersion ausgehen. Gebräuchlich ist die Verwendung von Ultraschallspitzen oder
Ultraschallbädern zur Gewinnung von SUV Dispersionen. Auch in diesem Fall sollte
oberhalb der Tc gearbeitet werden.
Der Energieeintrag durch Ultrabeschallung führt zur Ruptur der bestehenden Strukturen, die
Revesikulierung der entstandenen Bruchstücke zur Formation kleiner unilamellarer Vesikel.
1.1.2.4 Detergenzentfernung
Eine Methode, die zu sehr einheitlichen und unilamellaren Vesikeln führt, ist die
Detergenzentfernung (Brunner et al. 1976; Milsmann et al. 1978; Philippot et al. 1985;
Peschka et al. 1998; Basu & Basu 2002; Schubert 2003). Auch in diesem Fall eignet sich die
Filmmethode zur Herstellung liposomaler Systeme. Der Film setzt sich jedoch nicht
ausschließlich aus den eigentlichen Membrankomponenten zusammen, sondern enthält einen
molaren Überschuss eines geeigneten Detergenz, das vor der Filmbildung zusammen mit den
anderen Bestandteilen in organische Lösung gebracht wird. Resultiert aus direktem Mischen
des Puffersystems mit dem Lipid und dem Detergenz eine klare assoziationskolloidale Lösung
kann sogar vollständig vom Einsatz organischer Lösungsmittel abgesehen werden.
Entsprechend der erwünschten Größe der Vesikel finden Gallensalze (z.B. Natriumcholat,
NaC) oder n-Alkyl-Saccharide (z. B. n-Octyl--D-glucopyranosid, OG) Anwendung.
Aufgrund der Anwesenheit der oberflächenaktiven Substanzen bei der Hydratisierung des
Lipidfilms ist die Ausbildung von membranösen Strukturen unmöglich. Vielmehr entstehen
zunächst Mischmizellen, die je nach Art des verwendeten Detergenz strukturell
unterschiedlich aufgebaut sein können.
Da monomeres Detergenz im dynamischen Gleichgewicht mit dem in den Mischmizellen
vorliegenden Detergenz steht, wird durch Entfernung des freien Monomers ständig neue
Gleichgewichtseinstellung erzwungen, die mit einer Verarmung der Mischmizellen an
Detergenz einhergeht. Aufgrund der geringen Monomerenlöslichkeit der PL liegen diese
praktisch ausschließlich im mizellaren Verband vor und unterliegen damit keiner
Gleichgewichtseinstellung mit dem Außenmedium. Die Strukturen, die auf dem Weg zum
Vesikel durch kontinuierliche Entfernung des Detergenz aus dem System durchlaufen werden,
sollen im Folgenden - exemplarisch für die Verwendung von Gallensalzen - erläutert werden.
Bei hohem molaren Überschuss an Gallensalzen wird eine Solubilisierung eines PL-Dimers
Allgemeiner Teil 9
mit 16-20 Gallensalzmolekülen angenommen (Schubert 2003), wobei die Fettsäurereste der
PL einander zugewandt sind. Bei geringeren Gallensalzkonzentrationen existieren so
genannte “Wurmmizellen“, zylindrische PL-Detergenz-Formationen, deren Aufbau von einer
Vielzahl von Parametern abhängig ist.
Weitere Entfernung des freien Monomers aus den zueinander im Gleichgewicht befindlichen
Strukturen hat die Bildung von Scheibenmizellen zur Folge (Abb. 1-2). Die hydrophoben
Außenkanten der Mizellen sind von einem sie umfassenden Ring von Gallensalzen vor der
Interaktion mit dem hydrophilen Außenmedium abschirmt. Die sukzessive Entfernung
weiterer freier Monomere ist von einer Vergrößerung der Scheibenmizellen, der Krümmung
derselben und endlich der Vesikulierung begleitet.
Die Vesikel treten zunächst in Koexistenz mit Scheibenmizellen auf (Gallensalz/Lipid
zwischen 1:1 und 1:0,3 mol/mol). Unterhalb dieses Verhältnisses weisen die Liposomen
aufgrund des Restanteils an Detergenz zunächst noch Membranschäden auf und neigen zur
Fusion unter Ausbildung multilamellarer Strukturen. Erst unterhalb eines Detergenzgehaltes
von 10 mol% liegen die Liposomen defektfrei vor.
Koexistenz von Mischmizellen und Vesikeln
zwischen GSbound / Lipid
1/1 und 0.3/1 (mol/mol)
Wurm-Mizellen
Strukturen im Gleichgewicht
Strukturen während dynamischer Entfernung von Detergenz
viel Detergenz
wenigerDetergenz
Stäbchen
Scheiben-Mizellen
Dialyse, Filtration,Verdünnung,Adsorption
Koexistenz von Mischmizellen und Vesikeln
zwischen GSbound / Lipid
1/1 und 0.3/1 (mol/mol)
Wurm-Mizellen
Strukturen im Gleichgewicht
Strukturen während dynamischer Entfernung von Detergenz
viel Detergenz
wenigerDetergenz
Stäbchen
Scheiben-Mizellen
Dialyse, Filtration,Verdünnung,Adsorption
Abb. 1-2: Gallensalz-PL Strukturen bei der Herstellung von Liposomen über
Detergenzdialyse nach Schubert (2003)
10 Allgemeiner Teil
Die Größe der durch die Detergenzentfernung hergestellten Vesikel ist von einer Reihe von
Parametern abhängig. Eine wichtige Rolle spielen die Art des verwendeten
Detergenz(gemisches), die molaren Verhältnisse von Lipid zu Detergenz, Ionenstärke und
pH-Wert des Mediums, Gesamtkonzentration von Lipid und Detergenz sowie die
Geschwindigkeit der Detergenzentfernung.
Die häufig verwendeten Detergenzien NaC und OG werden bei einer 20mM
Lipidkonzentration in der Regel in einem molaren Lipid/Detergenz Verhältnis von 1:2 bzw.
1:5 eingesetzt. Die Größe der Vesikel bei der Dialyse gegen Wasser liegt dann im Bereich
von 40 nm für die mittels NaC und 140 nm für die durch OG hergestellten Vesikel und lässt
sich durch Ionenstärke, Temperatur u.a. beeinflussen (Rhoden & Goldin 1979; Schwendener
et al. 1981; Zumbuehl & Weder 1981; Schurtenberger et al. 1998).
1.1.3 Charakterisierung von Liposomen
Es bieten sich eine Reihe von Parametern an, die zur Charakterisierung von Liposomen
herangezogen werden können. Einige wichtige Größen und Methoden zu deren Bestimmung
sind:
▪ Fluidität Anisotropiemessungen
▪ Lamellarität Cryo-TEM, NMR
▪ Oberflächenladung -Potentialbestimmung
▪ Permeabilität Fluoreszenz-Dequenching
▪ Partikelgröße(nverteilung) Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS)
▪ PL-Konzentration Bartlett-Phosphatassay
Da die Photonenkorrelationsspektroskopie als Routineverfahren im Laboralltag zur Erstellung
dieser Arbeit einen besonderen Stellenwert einnahm, soll das Funktionsprinzip im Folgenden
kurz erläutert werden. Weitere verwendete Verfahren werden im entsprechenden Abschnitt
des Methodenteils näher erläutert.
Die PCS gestattet die quantitative Analyse der Partikelgrößenverteilung kolloiddisperser
Systeme und hat auch für die Charakterisierung liposomaler Zubereitungen breite Anwendung
gefunden (Goll et al. 1982; Beney et al. 1998; Ingebrigtsen & Brandl 2002). Liposomen, wie
auch andere dispergierte Teilchen in deren Größenordnung, unterliegen aufgrund der
Allgemeiner Teil 11
Brown’schen Molekularbewegung der freien Diffusion. Die Geschwindigkeit der Diffusion
korreliert mit dem Diffusionskoeffizienten D, der nach der Stokes-Einstein-Beziehung
r6TkD
Gleichung 1-1
abhängig ist von der Temperatur T, der dynamischen Viskosität des Mediums sowie dem
hydrodynamischen Partikeldurchmesser r. Bei bekannter Temperatur und gegebener
Viskosität des Mediums lässt sich bei Kenntnis des Diffusionskoeffizienten der
hydrodynamische Durchmesser eines Teilchens bestimmen.
Wird eine Probe in einen Lichtstrahl (bei der PCS einen Laserstrahl) gebracht, resultiert
Streulicht, das mit Hilfe eines Photomultipliers in ein messbares elektrisches Signal
umgewandelt werden kann.
Die Fluktuation in der Intensität und die absolute Intensität des vermessenen Streulichtes ist
eine Funktion der Größe der im Laserstrahl befindlichen Teilchen. Da kleine Teilchen
aufgrund ihrer schnelleren Diffusion ihre Lage zueinander rascher verändern als große
Teilchen, resultieren Streulichtmuster, die bei diesen Partikeln in ihrer Intensität schneller
schwanken als bei großen Teilchen. Hingegen ist die Intensität der einzelnen Signale großer
Partikel im Regelfall wesentlich größer als die kleiner Partikel. Im Messwinkel von 90° ist die
Signalintensität aufgrund ihrer Winkelabhängigkeit relativ partikelgrößenunabhängig.
Die vom Photomultiplier amplifizierten Streulichtsignale werden an einen Korrelator
Abb.1-3: Schematischer Aufbau eines PCS Gerätes
Laser
Probe
Photomultiplier Korrelator
Rechner
12 Allgemeiner Teil
weitergegeben, mit dem aus dem vielschichtigen Streulichmuster eine
Autokorrelationsfunktion erstellt werden kann, die die Ermittlung des Diffusionskoeffizienten
D erlaubt. Auf Grundlage der Autokorrelationsfunktion lässt sich so durch mathematische
Algorithmen der mittlere hydrodynamische Durchmesser (z-Average, z-Av) sowie ein Maß für
die Partikelgrößenverteilung (Polydipersitätsindex, PI) berechnen.
1.1.4 Nicht therapeutische Anwendungsgebiete von Liposomen
Das Anwendungsgebiet von Liposomen ist groß. Neben den folgenden Erläuterungen zu der
für diese Arbeit maßgeblichen Verwendung von Liposomen im therapeutischen Bereich sei
erwähnt, dass Liposomen auch in zahlreiche nicht therapeutische (Forschungs)Disziplinen
Einzug gehalten haben (Lasic & Barenholz 1996).
Allgemein bekannt sind ihre topische Applikation im Bereich der Kosmetika, sowie ihre
Verwendung als Membranmodelle (Sessa & Weissmann 1968; Bangham 1972; Masserini et
al. 2002; Stauch et al. 2002).
Untersucht wird u.a. das Assoziations-, Einlagerungs-, Umlagerungs-, Verteilungs- und
Permeationsverhalten von Arzneistoffen (Ahmed et al. 1981; Hellwich & Schubert 1995;
Takegami et al. 2003; Matos et al. 2004), Tensiden (Schubert et al. 1983; Scholmerich et al.
1984; Schubert et al. 1986; Schubert & Schmidt 1988), Proteinen und Peptiden
(Beschiaschvili & Seelig 1992).
1.1.5 Therapeutische Anwendungsgebiete von Liposomen, Liposomen als Drug-Delivery-Systeme
Um sich auf die Verwendung von Liposomen als Arzneistoffträger zu beschränken wird für
einen Überblick über die gesamte Breite medizinisch pharmazeutischer Anwendungen von
Liposomen an dieser Stelle auf das Werk “Medical Applications of Liposomes“ (Lasic 1998)
verwiesen.
Eine große Herausforderung im Bereich der pharmazeutischen Forschung stellt die
Entwicklung zielgerichteter Drug-Delivery-Systeme dar. Dahinter verbirgt sich die Idee,
einen Wirkstoff direkt an das pathologisch veränderte Gewebe zu bringen, um durch
Vermeidung des Kontakts mit gesundem Gewebe die häufigste Ursache für unerwünschte
Wirkungen auszuschalten. Ein ideales Vesikel für den systemischen Arzneistofftransport
erfüllt nach Willis & Forssen (1998) folgende Kriterien:
Es garantiert einen exklusiven Wirkstofftransport zum Wirkort und gewährleistet so minimale
Allgemeiner Teil 13
Nebenwirkungen, ist physiologisch und pharmakologisch indifferent, metabolisierbar und
nach Erfüllung seiner Transportfunktion aus der Zirkulation entfernt.
Die Tatsache, dass die Hauptkomponenten liposomaler Zubereitungen - Phospholipide und
Cholesterol - natürliche Bestandteile der Säugertierzellmembran darstellen, bedingt eine
geringe Toxizität, gute biologische Abbaubarkeit, geringe Immunogenität, Biokompatibilität
und eine physiologische Metabolite. Aufgrund der strukturellen Besonderheiten von
Liposomen sowohl der Einschluss hydrophiler Arzneistoffe im Vesikelinnenraum als auch die
Anreicherung lipophiler Arzneistoffe in den Membranen der Liposomen möglich womit das
Liposom einen universell einsetzbaren Transporter darstellt. Gleichzeitig gewährt die
liposomale Verpackung dem Wirkstoff Separation und damit Stabilisierung vor
enzymatischem Abbau sowie einen gewissen Schutz vor hydrolytischen und oxidativen
Zersetzungsreaktionen. Diese besonderen Eigenschaften führten dazu, dass schon in den 70er
Jahren das therapeutische Potential der Liposomen als Drug-Carrier-System erkannt wurde
(Gregoriadis 1976a; Gregoriadis 1976b).
Das Targeting der Liposomen kann durch zwei verschiedene Mechanismen sichergestellt
werden. Während sich der erste Weg die physiologischen bzw. morphologischen Eigenarten
des Zielgewebes zu Nutze macht und damit passiver Natur ist, wird mit der Kopplung von
Zielvektoren an die Oberfläche von Liposomen eine aktive Ansteuerung eines pathologisch
veränderten Gewebes angestrebt. Die folgenden Abschnitte erläutern das Prinzip dieser
unterschiedlichen Ansätze.
1.1.5.1 Passives liposomales Targeting, der EPR-Effekt
Bei Applikation von Liposomen in die systemische Zirkulation lässt sich innerhalb kürzester
Zeit eine nahezu vollständige Elimination der Vesikel aus der Blutbahn beobachten.
Verantwortlich für die rasche Absenkung des Plasmaspiegels ist die Aufnahme der Vesikel
durch das retikuloendotheliale System (RES), das mononukläre Phagozytensystem in
verschiedenen Geweben wie Milz, Knochenmark und vor allem Leber.(Kaye & Richardson
1979; Richardson et al. 1979).
(häufig synonym verwendet: mononukläres Phagozytensystem, MPS und
retikuloendotheliales System, RES; Definition laut Roche Lexikon Medizin:
“Funktionseinheit aus Zellen, die zu Phagozytose und Speicherung von Stoffen/Partikeln
befähigt sind. Besteht aus Retikulumzellen des retikulären Bindegewebes, aus Blut- u.
Lymphgefäßendothelien und den die Blut- u. Lymphsinus endothelartig auskleidenden Zellen
14 Allgemeiner Teil
(Retikuloendothel), aus Fibrozyten (gewöhnliche Bindegewebszellen) und aus eigenständigen
Histiozyten (wie die Makrophagen aus Monozyten hervorgehend); dient wesentlich der
Beseitigung von Abfall- u. Fremdstoffen einschließlich eingedrungener Mikroorganismen,
wobei Antikörper (Immunglobuline der Klasse G = IgG) und das Komplement C'3 eine
Hilfsfunktion haben (Monozyten u. Makrophagen besitzen für beide Stoffklassen spezifische
Rezeptoren, die Granulozyten nur für C'3, werden aber durch ihre Anwesenheit aktiviert.)“)
Aus heutiger Sicht führt die Anheftung von Plasmaproteinen, so genannter Opsonine, auf der
Oberfläche der Liposomen zu ihrer raschen Phagozytose durch Makrophagen, die ihrerseits
für einen Abtransport der Vesikel in Leber und Milz sorgen (Abb. 1-4 links). Zunächst
bedeutet dies eine empfindliche Einschränkung der Verwendbarkeit von Liposomen, da mit
der Entfernung aus der Blutbahn eine Interaktion mit oder Anreicherung in Geweben
außerhalb des retikuloendothelialen Systems unmöglich erscheint.
Dieses Phänomen lässt sich jedoch auch therapeutisch nutzen, wenn eben diese Organe von
schweren Infektionen betroffen sind (Alving 1983; Gilbreath et al. 1985). Beispiele hierfür
sind die Therapie systemischer Mykosen mit liposomalem Amphothericin B, die
Anreicherung von Anti-Leishmanose-Wirkstoffen in Zellen des MPS (Minodier et al. 2003),
sowie die Aktivierung von Makrophagen zur Behandlung von Immundefizienzen (Gerber et
al. 2001), Immunmodulation (Dasgupta et al. 2000) oder in der Tumortherapie (Whitworth et
al. 1990).
Eine andere Möglichkeit des passiven Targeting ergibt sich durch die morphologischen
Besonderheiten einiger solider Tumoren und wird unter dem Stichwort EPR-Effekt (Park
2002a) (enhanced permeability and retention effect) zusammengefasst. Bedingt durch das
rasche Wachstum und schnelle Neovaskulierung des tumoralen Gewebes sowie das Fehlen
von Muskelgewebe und Basalmembran entstehen lückenhafte vaskuläre Endothelien (Roberts
& Palade 1997; Roberts et al. 1998) (fenestrae mit einem Durchmesser bis zu 400 nm) mit
gesteigerter Permeabilität, in denen sich Liposomen aufgrund ihrer Größe durch Extravasation
anreichern können (Dvorak et al. 1988; Maruyama et al. 1997; Wu et al. 1997; Laverman et
al. 2001b).
Da Tumoren i. d. R. keine Lymphgefäße ausbilden kommt es zusätzlich zur im Vergleich zum
gesunden Gewebe verlängerten Retention der Liposomen im Tumor. Es entsteht ein
intratumorales Drug-Depot das durch enzymatische Degradation und phagozytotischen
Angriff seinen Wirkstoff zur Diffusion in das Gewebe freigibt (Abb. 1-4 rechts). Um dieses
Allgemeiner Teil 15
Phänomen therapeutisch nutzen zu können, ist die Umgehung der Elimination des liposomal
formulierten Arzneistoffs jedoch eine Grundvoraussetzung, da nur auf diese Weise eine
Zirkulationszeit erreicht werden kann, die die Akkumulation im Tumorgewebe erlaubt.
Mechanismen, die eine effektive Verlängerung der Bluthalbwertszeit liposomaler
Zubereitungen erlauben, werden im Kapitel 1.2 ausgeführt.
Die onkologisch bedeutende Gruppe der Anthracycline, die sich durch “Ionen-Fallen-
Systeme“ besonders effizient mit Liposomen assoziieren lassen, befindet sich in drei
verschiedenen liposomalen Formulierungen auf dem Markt. Allen ist die gegenüber dem
freien Wirkstoff entscheidend veränderte Pharmakokinetik und Biodistribution mit
verringertem Verteilungsvolumen sowie ein verbesserter therapeutischer Index (Maß für die
Sicherheit eines Medikaments, das die Spanne zwischen therapeutischer und toxischer Dosis
angibt), auf Grundlage des EPR-Effekts gemeinsam (Theodoulou & Hudis 2004).
▪ Myocet™ ist ein drei Vial System (1. Citronensäure Puffer; 2. EPC/Chol (7/3
mol/mol; ~ 190 nm) Liposomen; 3. lyophilisiertes Doxorubicin) das vor Ort gemischt
wird und Doxorubicin hocheffizient (> 99%) liposomal verkapselt. Es gewährleistet
eine moderat verlängerte Bluthalbwertszeit des Wirkstoffs, verändert seine
Biodistribution und reduziert auf diese Weise die Häufigkeit des Auftretens von
Kardiotoxizität und Neutropenien (Batist et al. 2001; Park 2002a).
Abb. 1-4: Passives Targeting liposomaler Drug-Carrier Systeme
gesundesGewebe
Lymphbahnen
Tumorgewebe
Endothelzelle
Makrophage
OpsoninekonventionellesLiposom
Sterisch stabilisiertesLiposom
Beispiel:Doxil®
gesundesGewebe
Lymphbahnen
TumorgewebegesundesGewebe
Lymphbahnen
gesundesGewebe
Lymphbahnen
Tumorgewebe
Endothelzelle
MakrophageMakrophage
OpsoninekonventionellesLiposom
Sterisch stabilisiertesLiposom
Beispiel:Doxil®
16 Allgemeiner Teil
▪ DaunoXome® (DSPC/Chol, (2/1 mol/mol); ~45 nm) garantiert aufgrund der geringen
Liposomengröße und der hohen Rigidität der Membranen eine verringerte Aufnahme
durch das MPS und hat Wirksamkeit bei HIV-assoziierten Kaposi Sarkomen und
anderen Tumoren bewiesen (Gill et al. 1996).
▪ Doxil®/Caelyx® ist eine liposomale Zubereitung von Doxorubicin
(HSPC/Chol/MPEG2000-DSPE (2/1/0,16 mol/mol/mol); ~100 nm), die die bisher
deutlichste Verlängerung der Bluthalbwertszeit ermöglicht und so im Tumorgewebe
akkumuliert (Gabizon 1992; Symon et al. 1999; Gabizon et al. 2003).
Im Hinblick auf die Kardiotoxizität von Doxorubicin lassen sich durch liposomale
Darreichungsformen besondere Fortschritte erzielen.
Von Herzmuskelzellen ist bekannt, dass sie eine niedrige Katalaseaktivität aufweisen und ein
geringes antioxidatives Potential (Kang et al. 1996) besitzen. Da die pharmakologische
Wirksamkeit der Anthracyklinderivaten u.a. auf oxidativen Prozessen basiert, wird die
besondere Beeinträchtigung des Herzens auf die oxidative Wirkkomponente dieser
Substanzen zurückgeführt. Durch die liposomale Verpackung des Wirkstoffes werden die
Herzmuskelzellen mit einer geringeren Menge an freiem Doxorubicin konfrontiert, das Herz
erfährt in der Folge eine deutlich geringere Belastung durch reaktive Sauerstoffspezies und ist
somit durch eine liposomale Therapie weniger in Mitleidenschaft gezogen als bei
konventionellem Einsatz von Doxorubicin.
Durch die geringere toxische Belastung des Knochenmarks lässt sich die Minimierung des
Neutropenierisikos erreichen. Weiterhin lässt sich die Inzidenz der bei der Applikation des
freien Wirkstoffs auftretenden Toxizitätserscheinungen wie Alopezie, Übelkeit und Erbrechen
verringern. Auf der anderen Seite tritt gehäuft eine bei Applikation von freiem Doxorubicin
selten beobachtete toxische Hauterscheinung an Händen und Füßen auf (hand-foot-syndrom,
PPES palmar-plantares Erythrodysästhesie Syndrom: eine schmerzhafte, schälende
Dermatitis) (Lotem et al. 2000).
Allgemeiner Teil 17
1.1.5.2 Aktives liposomales Targeting
Ein aktives oder direktes Targeting von Liposomen setzt eine Funktionalisierung, d. h. eine
Kopplung eines Vektors an der Oberfläche des Vesikels voraus, der mit hoher Spezifität und
Selektivität mit Strukturen des Zielgewebe interagiert. Für den Erfolg ist außerdem die
Präsenz einer in Art oder zumindest Quantität besonderen Oberflächenstruktur im Zielgewebe
erforderlich, die in ausreichendem Maße und möglichst nur in pathologisch verändertem
Gewebe zu finden sein sollte.
Im Gegensatz zu einfachen Antikörper-Wirkstoffkonjugaten, die lediglich eine geringe
Anzahl von Wirkstoffmolekülen an das Zielgewebe bringen können, bietet die Targetierung
des Mikroreservoirs Liposom neben dem günstigeren Vektor/Drug Verhältnis zusätzlich den
Vorteil der multivalenten Bindung an das Zielkompartiment, die durch die laterale
Beweglichkeit des Zielvektors in der Liposomenmembran unterstützt wird.
Bereits in den 70er Jahren wurde der erste erfolgreiche liposomale Targeting Versuch
publiziert (Gregoriadis & Neerunjun 1975). Heute finden sich in der Literatur zahlreiche
Beispiele für die Kopplung von Liganden an die Oberfläche von Liposomen (Drummond et
al. 2000; Maruyama 2000; Torchilin 2000; Bendas 2001; Maruyama 2002; Park 2002b; Sapra
& Allen 2003), wobei beide Komponenten verschiedenster Natur sein können.
Ein Forschungsschwerpunkt ist die Anwendung von zielgerichteten Liposomen für die
antitumorale Therapie. Außer den wohl am häufigsten zur Kopplung verwendeten Vektoren,
den Antikörpern (Ab) oder Antikörper-Fragmenten, wurden unter anderem
Kohlenhydratstrukturen (z. B. Sialyl-Lewisx-Tetrasaccharid (Murohara et al. 1995; Stahn et
al. 2001), Peptide (z.B. RGD (Oku et al. 1996; Janssen et al. 2003; Schiffelers et al. 2003),
Transferrin (Kakudo et al. 2004), Folat (Sudimack & Lee 2000; Saul et al. 2003) und Lectine
(Abu-Dahab et al. 2001) zum aktiven Targeting genutzt. Dabei konnte in vivo und in vitro
eine deutliche Überlegenheit der zielgerichteten Liposomen gezeigt werden (Lopes de
Menezes et al. 1998; Maruyama 2000).
Die Probleme, die für deren erfolgreichen Einsatz überwunden werden müssen, sind
vielschichtiger Natur.
Wie bereits unter 1.1.5.1 erwähnt, ist die Applikation vesikulärer Systeme durch körpereigene
Abwehrmechanismen (RES, MPS, Opsonisierung) in seiner Effektivität stark eingeschränkt,
wenn keine entsprechenden Gegenmaßnahmen getroffen werden (siehe hierzu 1.2.1). Vektor-
18 Allgemeiner Teil
modifizierte Liposomen sind davon in deutlich stärkerem Ausmaß betroffen als
konventionelle PEGylierte (siehe hierzu 1.2.1) Liposomen, da die Präsentation des Liganden,
besonders im Falle von Antikörpern und Proteinen, mit einer gesteigerten Antigenität des
gesamten Komplexes verbunden ist (Harding et al. 1997; Kamps et al. 2000).
Es wurde gezeigt, dass bei steigender Antikörperdichte auf der Oberfläche der Liposomen die
Zirkulationszeit deutlich sinkt (Allen et al. 1995). Antikörperlasten oberhalb von 70 µg/µmol
Lipid führen zu einem rapiden Abfall der Bluthalbwertszeiten. Als guter Kompromiss
zwischen Targetierungspotential und systemischer Halbwertszeit wird eine Antikörperdichte
von 30-50 µg/µmol Lipid angesehen (Allen et al. 1995).
In diesem Zusammenhang ist auch zu erwähnen, dass gerade die Kopplung von Ab
problematisch ist. Die in den Anfängen der Immunoliposomen zur Anwendung gekommenen
Antikörpergemische und auch die in den 90er Jahren verwendeten monoklonalen Ab
(Gewinnung aus Hybridomzellen: Verschmelzung von Myelom- und Milzzelle einer
immunisierten Maus), durch die zwar aufgrund ihrer Homogenität eine geringere
Antikörperlast eingestellt werden konnte, werden aufgrund ihrer exponierten Fc-Teile von
Makrophagen schnell als körperfremd erkannt.
Es gab daher Versuche, die Aufnahme von Immunoliposomen durch Einsatz von Ab gegen
die Fc-Rezeptoren der Makrophagen zu hemmen (Aragnol & Leserman 1986; Koning et al.
2002; Koning et al. 2003). Die durch Mehrfachapplikation hervorgerufene Sensibilisierung
des Organismus mit einhergehender Bildung von Anti-Maus-Antikörpern stellt ein weiteres
Problem dar.
Durch die Entwicklung von Fab’-Fragmenten, chimären Antikörpern und humanisierten
Antikörpern und deren Einsatz zum liposomalen Targeting (Cao & Suresh 2000; Park et al.
2001; Park et al. 2002; Zhang et al. 2002; Lee et al. 2003; Rait et al. 2003) wurden bereits
gute Erfolge erzielt, so dass die anfänglichen Probleme in der Immunoliposomentherapie
heute lösbar erscheinen. Es konnte gezeigt werden, dass die Bluthalbwertszeit eines
Immunoliposoms bei Verwendung des Fab’-Teils statt des vollständigen Antikörpers (ca. 50
Stück/Liposom) trotz 10fach höherer Beladung des Liposoms (ca. 520 Stück/Liposom) um
das sechsfache verlängert werden kann (Maruyama et al. 1997).
Die Akkumulation des Ligand-modifizierten Liposoms am angesteuerten Wirkort ist zwar
eine Vorraussetzung, jedoch keine Garantie für die Wirksamkeit des Systems, da außerdem
die Verfügbarkeit des Wirkstoffs sichergestellt werden muss. Hierfür stehen im Prinzip
Allgemeiner Teil 19
mehrere Wege zur Verfügung:
Erstens besteht die Möglichkeit der extrazellulären Freisetzung des Wirkstoffs mit Aufnahme
in die Zielzelle, zweitens die Endozytose des Zellmembran-Rezeptor-gebundenen
Immunoliposoms und Freisetzung des Arzneistoffs in der Zelle und drittens die Fusion der
Vesikelmembran mit der Zell- oder der Endosomenmembran.
Die extrazelluläre Freisetzung des Wirkstoffs aus dem Arzneistoffträger kann durch
verschiedene Konzepte forciert werden. Die Konstruktion von pH-sensitiven Liposomen
(Huang et al. 1987; Wang & Huang 1987; Skalko et al. 1998; Skalko-Basnet et al. 2002; Roux
et al. 2004), die bei extrazellulär erniedrigtem pH in Tumoren und Entzündungsgebieten
eingesetzt werden können, thermosensitiven (Kong & Dewhirst 1999; Ishida et al. 2000;
Gaber 2002) oder photosensitiven Liposomenmembranen (Morgan et al. 1992; Bisby et al.
1999; Bisby et al. 2000) stellen einige mögliche Ansatzpunkte dar. Diese Formulierungen
bieten den Vorteil, dass auch nicht direkt angesteuerte Zellen vom Arzneistoff erreicht werden
können. Jedoch ist die Stabilität des Vesikels in der Blutbahn einerseits bei gleichzeitiger
Notwendigkeit der Destabilisierung vor Ort andererseits erforderlich, so dass ein externer
Anstoß zur Wirkstofffreisetzung mit der speziellen Konstruktion des Vesikels gepaart werden
muss. Zuletzt seien die target-sensitiven Liposomen (Pinnaduwage & Huang 1992; Ng et al.
2000) erwähnt, die durch ihre besondere Konstruktion durch Destabilisierung der Membran
am Wirkort ihren Wirkstoff freigeben.
Die Aufnahme von (Zelloberflächen)Rezeptor-Ligand-Komplexen in die Zelle zum Zwecke
der Down-Regulation oder dem Recycling der Rezeptoren ist ein häufig zu findender
Mechanismus. Für eine Reihe von Rezeptoren (epidermal growth factor receptor, Transferrin
Rezeptor, Folat Rezeptor) konnte gezeigt werden, dass Liposomen auf diesem Wege in die
Zelle eingeschleust werden können (Ishii et al. 1989; Sarti et al. 1996; Huwyler et al. 1997;
Park et al. 2001). Vesikel, die über die rezeptorvermittelte Endozytose aufgenommen werden,
durchlaufen auf ihrem Weg der intrazellulären Prozessierung auch das Lysosom. Die
enzymatischen Bedingungen und/oder der pH-Stress in diesem Zellkompartiment können die
Unwirksamkeit des Wirkstoffes zur Folge haben. Um dies zu vermeiden wird eine Fusion des
Liposoms mit der Endosomenmembran angestrebt, die insbesondere im Zusammenhang mit
den obenan erwähnten pH-sensitiven Lipidkompositionen diskutiert wird (Schubert &
Peschka-Suess 2003).
Synthetische (Nir et al. 1999; Nir & Nieva 2000; Kakudo et al. 2004) und virale Peptide ( z.
B. TAT, GALA (Torchilin et al. 2001b; Torchilin 2002; Tseng et al. 2002; Levchenko et al.
20 Allgemeiner Teil
2003; Torchilin & Levchenko 2003)) vermitteln die Fusion von Liposomen- und
Plasmamembranen und können so die cytosolische Wirkstoffbereitstellung sicherstellen. Sie
agieren als plasmamembran-destabilisierende und porenbildende Bestandteile eines
modifizierten Liposoms, das zudem über einen weiteren Liganden eine Zielausrichtung
erfahren kann.
Auch im Hinblick auf die in vivo Stabilität stellen Ab-modifizierte Liposomen einen
Sonderfall dar. Zwar sind konventionelle Vesikel ebenso den Attacken des humoralen
Abwehrsystems, der Interaktion mit Plasmakomponenten (Immunoglobuline,
Gerinnungsfaktoren, C-reaktives Protein) (Schenkman et al. 1981; Jones & Nicholas 1991)
sowie der Extraktion von PL durch Serumlipoproteine ausgesetzt, also Wechselwirkungen,
die zum einem Leckschlagen (leakage) der Membranen führen kann (Scherphof et al. 1978),
doch erhöht die Fähigkeit der Ab Komplementfaktoren zu binden zusätzlich das Risiko einer
komplementinduzierten Lyse des Bilayers (Strejan et al. 1981; Szebeni et al. 1996).
1.2 Modifikation liposomaler Oberflächen
Wie in Kapitel 1.1.5.2 ausgeführt sind die Plasmastabilität von Liposomen sowie die
Umgehung des RES in den meisten Fällen notwendige Bedingungen zum sinnvollen Einsatz
von Liposomen als Drug-Carrier-Systeme. Beiden Anforderungen wird heute durch die
Implementierung hydrophiler Polymere in den Bilayer erfolgreich begegnet. Substanzen, die
zu diesem Zweck zum Einsatz kommen, sind Teil des nächsten Abschnittes.
1.2.1 Hydrophile Polymere zur sterischen Stabilisierung liposomaler Drug-Carrier-Systeme
Die rasche Erkennung und in der Folge die schnelle Entfernung der Liposomen aus dem
Blutkreislauf durch die Zellen des MPS (Ishida et al. 2002a), vornehmlich durch
Gewebsmakrophagen der Leber (Kupfferzellen) und Milz (Scherphof et al. 1985; Derksen et
al. 1988) war wohl die größte Hürde, die es bei der Anwendung von Liposomen als Drug-
Carrier-System zu überwinden galt. Die aus diesen physiologischen (Abwehr)Reaktionen
resultierenden kurzen Bluthalbwertszeiten erlauben kein Erreichen ausreichender
Wirkstoffspiegel am Zielort.
Die ersten Strategien, die Liposomen vor diesem Schicksal zu bewahren, umfassten die
Absättigung der Aufnahmekapazität der Makrophagen mit wirkstofffreien Liposomen vor der
Applikation des eigentlichen Wirkstoffträgers, bzw. die Prädisposition des Organismus mit
Allgemeiner Teil 21
Dextransulfat zum selben Zweck (Patel et al. 1983). Andere Methoden die Bluthalbwertszeit
zu verlängern waren die Inkorporation von Polyvinylpyrrolidonpolyacrylamidlipiden
(Torchilin et al. 1994b), Glucoronsäurelipiden (Namba et al. 1990) in die Bilayer, die
Verwendung von Lipiden mit einer hohen Tc (Forssen et al. 1992) und die Herstellung
kleiner, rigider Cholesterol-reicher Vesikel (Kirby & Gregoriadis 1983). Auch die Versuche
der Oberflächenmodifikation von Liposomen mit Proteinen, Polysacchariden und
Glycolipiden aus Erythrozyten sind in diesem Zusammenhang zu nennen (Voinea &
Simionescu 2002).
1.2.1.1 Modifizierung mit PEG-Phospholipiden
1987 entdeckten Allen und Mitarbeiter, dass der Einbau von Gangliosid GM1 in
Liposomenmembranen einen deutlich zirkulationsverlängernden Effekt aufwies (Allen &
Chonn 1987; Allen et al. 1989). Als Ursache für ihre Beobachtungen sahen sie eine
Verringerung der Opsoninanlagerung durch das große Volumen, die Hydrophilie und
Flexibilität der Zuckerkopfgruppe an. Anfang der 90er Jahre nutzten Blume und Cevc
erstmals Polyethylenglykol (PEG)-Kopfgruppen für den gleichen Effekt und eliminierten
damit die Limitierung, die von der Bioinkompatibilität der Ganglioside ausging
(Halbwertszeitverlängerung nur in der Maus, nicht in Ratte oder Kaninchen, da diese
AnitGM1-Antikörper entwickeln (Liu et al. 1995)). Zudem ließen sich mit den neuen PEG-
Lipiden deutlich längere Halbwertszeiten einstellen (Blume & Cevc 1990). Für die
langzirkulierenden Liposomen wurde der kommerzielle Name “Stealth®-Liposomen“
eingeführt.
Die Länge der PEG-Kette hat einen entscheidenden Einfluss auf die Halbwertszeit in vivo.
Maruyama und Mitarbeiter ermittelten (Maruyama et al. 1991), dass sich für DSPC/Chol
Liposomen, die mit 6 mol% DSPE-PEG modifiziert waren (Molekularmasse der PEG-Kette
zwischen 1 und 12 kDa), maximale Zirkulationszeit einstellen ließ. Heute haben sich PEG-
Lipide mit einer Molekularmasse von 1 - 5 kDa durchgesetzt (Woodle & Lasic 1992; Woodle
et al. 1994), wobei die eingesetzte Menge an PEG-Lipid von der Kettenlänge des PEG-Restes
abhängt und für die am häufigsten verwendeten Derivate mit einer PEG-Kettenlänge von 2
kDa (entsprechend 45 Ethylenoxid (EO)-Einheiten) mit 5 mol% angegeben wird. Am
weitesten verbreitet ist die Verwendung von PEG-Derivaten gesättigter
Phosphatidylethanolamine (PEG-PE) wie MPEG2000-5000-DSPE und MPEG2000-5000-DPPE
(Abb. 1-5).
22 Allgemeiner Teil
Die Derivate besitzen aus einem hydrophilen PEG-Anteil, der für die Entstehung einer
flexiblen, hydrophilen Corona um das Liposom verantwortlich ist. Die Fettsäurereste der
Moleküle verankern diese in der Lipidmembran. Die Methoxygruppe am distalen Ende der
PEG-Kette hat ihren Ursprung in der Synthese der Derivate. Hier werden monofunktionelle
PEG-Derivate eingesetzt, um die Bildung von Lipid-PEG-Lipiden (Dimeren) zu vermeiden.
Mussten in den Anfängen der Liposomen-Pegylierung die PEG-Lipide noch selbst
synthetisiert werden, befinden sich diese Derivate mittlerweile im Handel. Doxil® ist das erste
zugelassene Präparat, indem MPEG2000-DSPE eingesetzt wird.
Obwohl der genaue Mechanismus, der hinter dem Effekt der MPS-Vermeidung steckt nach
wie nicht eindeutig geklärt ist (Price et al. 2001), wird in der Literatur im Allgemeinen davon
ausgegangen, dass die Formation des hoch hydratisierten PEG-Polymerschilds um das
Liposom, welches sowohl elektrostatische als auch hydrophobe Interaktionen sterisch
unterbindet, für eine Vermeidung der Anlagerung von Plasmakomponenten verantwortlich ist
(Lasic et al. 1991; Woodle & Lasic 1992; Torchilin et al. 1994a; Papisov 1998; Ishida et al.
2002a). Daher werden PEG-modifizierte Liposomen auch als sterisch stabilisierte Liposomen
bezeichnet. Auch die Stabilität der Liposomen während der Lagerung wird durch den Einsatz
von PEGylierten Lipiden günstig beeinflusst. Die sterische Abschirmung der liposomalen
Oberfläche trägt entscheidend zur Reduktion von Aggregation und Fusion (Needham et al.
1992) bei und steigert die Stabilität der Vesikel gegenüber chemischem und enzymatischem
Abbau.
Kritisch anzumerken ist, dass in der Literatur seit dem Jahr 2000 das so genannte ABC-
(accelerated blood clearance) Phänomen (teils kontrovers) diskutiert wird (Dams et al. 2000;
Laverman et al. 2001a; Ishida et al. 2002b; Bendas et al. 2003; Ishida et al. 2003a; Ishida et al.
2003b; Ishida et al. 2004). Während die sterische Stabilisierung der Liposomen bei der
O
O
O
CH2O
CH2
O
PO
O-
O
NH
O
OO
CH3
CH3
CH3
12-18
12-18
20-50
Abb. 1-5: Allgemeine Struktur häufig verwendeter PEG-Lipide zum Zweck der sterischen Stabilisierung liposomaler Drug-Carrier-Systeme
Allgemeiner Teil 23
primären Injektion die aus der Literatur bekannte Verlängerung der Bluthalbwertszeit
garantiert, erfolgt bei wiederholter Injektion in Maus, Ratte und Rhesusaffe eine dramatische
Verkürzung der Zirkulationszeit mit einer Anreicherung der Liposomen in der Leber, ohne
dass diese eine pathologische Veränderung zeigt. Der gleiche Effekt zeigt sich auch bei
konventionellen Liposomen und kann durch die Pegylierung der Liposomen nicht
unterbunden, wohl aber abgeschwächt werden. Trotz PEGylierung ist die mehrfache
Applikation von mit sterisch stabilisierten Liposomen also nicht unproblematisch.
1.2.1.2 Modifizierung mit PEG-Sterolen
Neben den in der Anwendung etablierten PEG-PE-Derivaten bieten sich PEG-Sterole zur
sterischen Stabilisierung von Liposomen an. Eine Reihe von Arbeiten beschäftigt sich mit der
Modifikation liposomaler Oberflächen durch Sterol-PEG-Derivate.
Es konnte gezeigt werden, dass die Implementierung von Cholesterol-PEG mit verschiedenen
Kettenlängen eine signifikante, wenn auch weniger ausgeprägte Verlängerung der
Bluthalbwertszeit in vivo sicherstellen kann (Allen et al. 1991; Ishiwata et al. 1995; Yuda et
al. 1996) und zur sterischen Stabilisierung von Liposomen beiträgt (Beugin et al. 1998).
Zudem wurde herausgearbeitet, dass der Einbau von PEG-Chol in liposomale Membranen mit
einer im Vergleich zur Verwendung von PE-PEG Derivaten verringerten Freisetzung von
Calcein (Modellsubstanz für hydrophile Arzneistoffe) verbunden ist (Ishiwata et al. 1995;
Sriwongsitanont & Ueno 2002).
Weiter wurde gezeigt, dass PEG-Chol durch eine Hemmung der Komplement-induzierten
Opsonisierung zur Verlängerung der Bluthalbwertszeit beiträgt (Bradley et al. 1998), die
Aufnahme von Liposomen mittels Clathrin unabhängiger Phagozytose blockiert (Ishiwata et
al. 1997; Ishiwata et al. 1998) und die Anlagerung von Serumproteinen deutlich reduziert
(Carrion et al. 2001). Auch wenn der wichtigste Parameter für die Anwendung von PEG-
Lipiden zur sterischen Stabilisierung, die Verlängerung der Bluthalbwertszeit, klar für die
Verwendung von PEG-PE-Lipiden spricht, bieten sich PEG-Sterole - auch wegen ihrer
leichten und kostengünstigen Herstellung im industriellen Maßstab - zur
Oberflächenmodifikation von Liposomen an.
Die Präparation sterisch stabilisierter Liposomen erfolgt üblicherweise über die Filmmethode
(vgl. 1.1.2.1), indem die PEG-Lipide den übrigen Membrankomponenten vor der Herstellung
der organischen Lösung zugemischt werden. Damit resultieren Liposomen, die sowohl nach
außen wie nach innen PEG-Ketten präsentieren. Dies ist mit einer empfindlichen
24 Allgemeiner Teil
Verminderung des zur Verfügung stehen liposomalen Innenraums verbunden, so dass die
Beladungskapazität der sterisch stabilisierten Liposomen deutlich geringer ist, als die
konventioneller Liposomen (Nicholas et al. 2000). Will man diesen Effekt vermeiden, ist man
entweder auf eine umständliche chemische Derivatisierung vorgefertigter Liposomen mittels
aktivierter Polyethylenglykole angewiesen, oder versucht PEG-Lipide in einem
nachgeschalteten Schritt in die Liposomenmembran einzubauen.
Die Literatur beschreibt, dass dieses aufgrund der langsamen Einlagerungskinetik von PEG-
PE-Lipiden nur unter erhöhten Temperaturen und/oder langen Inkubationszeiten möglich ist
(Uster et al. 1996; Sou et al. 2000).
Im Verlaufe dieser Arbeit wird diskutiert, inwiefern der Einsatz PEGylierter Sterole die
Oberflächenmodifikation vorgefertigter Liposomen erlaubt.
1.2.2 Ligand-modifizierte liposomale Oberflächen
Mit der PEGylierung liposomaler Oberflächen wurde die Nutzung des EPR-Effektes, also das
passive Targeting mit Liposomen ermöglicht. Die aktive Zielausrichtung bedarf einer
weiteren Modifikation der Vesikeloberfläche. Das Anbringen von Liganden, verschiedenster
Natur (siehe 1.1.5.2), denen gemein ist, dass sie spezifisch mit einem Zielgewebe
interagieren, macht die Konstruktion eines intelligenten Drug-Carrier-Systems möglich. In
diesem Abschnitt wird ein Überblick über die Strategien gegeben, die bei der Kopplung von
Vektoren an Liposomen verfolgt werden können.
1.2.2.1 Ligand-modifizierte Liposomen: Arten und Methoden zu ihrer Herstellung
Es können zwei Hauptstrategien zur Kopplung von Liganden an Liposomen unterschieden
werden: Die erste umfasst Methoden, mit welchen der Ligand unmittelbar an der Oberfläche
des Liposoms angebracht wird. Die zweite solche, bei denen der Vektor mit der terminalen
Hydroxylgruppe einer im Bilayer verankerten PEG-Kette verbunden ist. Abb. 1-6 stellt die
unterschiedlichen Typen von Liposomen dar, die auf ihre Eignung zum aktiven Drug-
Targeting untersucht wurden.
Beim so genannten Typ A funktionalisierter Liposomen ist der Vektor direkt an der
Oberfläche eines konventionellen Liposoms gebunden. Besonders bei Antikörpern als
Zielvektoren bedingt die offene Exposition auf der Vesikeloberfläche eine rasche Enfernung
aus der Zirkulation (Fc-Rezeptor vermittelte Phagozytose (Aragnol & Leserman 1986;
Allgemeiner Teil 25
Derksen et al. 1988)). Der Typ B vereint die Vorteile einer PEGylierung liposomaler Vesikel
mit der oberflächengebundenen Funktionalisierung. Problematisch ist hier die sterische
Interferenz der PEG-Ketten und des Vektors, wodurch die Interaktion des Liganden mit der
Oberflächendeterminante des Zielgewebes erschwert wird. Außerdem reduziert die
PEGylierung die Effizienz der Kopplung durch die schlechte Zugänglichkeit der in der
Lipidmatrix befindlichen Kopplungskomponenten.
Typ C steht am Ende der Entwicklung Ligand-modifizierter Liposomen und zeichnet sich
durch die Kopplung des Vektors an den PEG-Terminus aus. Die freie Präsentation und die
flexible PEG-Kette erlauben eine gute Interaktion von Ligand und Zielstruktur bei
gleichzeitiger langer Zirkulationszeit. Im Hinblick auf den Zusammenhang zwischen
Zirkulationszeit und Ligandenlast sei auf 1.1.5.2 und die Literatur (Allen et al. 1995;
Maruyama et al. 1995; Huwyler et al. 1997) verwiesen.
Die Kopplungsmethoden, die seit Beginn der 70er Jahre entwickelt wurden, basieren letztlich
alle auf der hydrophoben Verankerung des Liganden in der Lipidmatrix. Als hydrophober
Membrananker werden hierzu entweder Sterol- (Benzinger et al. 2000; Carrion et al. 2001;
Fleiner et al. 2001), jedoch zumeist PE-Derivate verwendet (Torchilin & Weissig 2003). Je
nach Art der gewünschten Vesikel (Typ A, B, C) sind die hydrophoben Membrananker
entsprechend direkt, oder am Terminus eines Spacers (i.d.R. PEG) zur Kopplung eines
Liganden vorbereitet. Die Konjugation von Liposom und Vektor kann auf drei verschiedene
Arten zustande kommen.
(1) Das aktivierte (PEG)Lipid wird zunächst mizellar angeboten. Es erfolgt die (PEG)Lipid-
Modifizierung des zu koppelnden Liganden und abschließend eine Vesikulierung durch
Abb. 1-6: Schematische Darstellung der verschiedenen Vektor-modifizierten Liposomen
Typ A Typ B Typ C
26 Allgemeiner Teil
Dialyse (Holmberg et al. 1989; Laukkanen et al. 1994). Auf diese Weise entstehen
Liposomen, bei denen der Vektor zu beiden Seiten des Bilayers, zum Vesikelinneren und zum
Umgebungsmedium hin, orientiert ist. Damit ist das Interaktionspotential der auf diese Weise
präparierten Liposomen im Vergleich zu Methoden, die ausschließlich extravesikulär
orientierte Vektoren garantieren, bei gleicher Kopplungseffizienz nur halb so groß. Aus
diesem Grund und aufgrund des erhöhten Arbeitsaufwands im Vergleich zu anderen
Methoden, wird die Dialyse selten zur Herstellung von Vektorliposomen angewandt und ist
ehr als Exot zu betrachten.
(2) Das aktivierte (PEG-)Lipid wird mit den übrigen Membranbestandteilen gemischt und
somit während der Präparation der Vesikel in den Bilayer eingearbeitet. Wird das Liposom
nun mit dem zu koppelnden Liganden konjugiert, kann dieser, ist er nicht membrangängig,
nur auf der Mediumseite der Membran lokalisiert sein. Das Interaktionspotential ist bei
gleicher Anzahl an angebrachten Zielvektoren im Vergleich zur Dialysemethode doppelt so
groß. Die hier geschilderte Methode ist das Standardverfahren zur Kopplung von Liganden
und wurde mit verschiedensten aktivierten (PEG-)Lipiden und Liganden erprobt (Maruyama
2000; Torchilin 2000; Bendas 2001; Maruyama 2002; Sapra & Allen 2003; Torchilin &
Weissig 2003). Probleme können durch Interaktionen des aktivierten (PEG-)Lipids mit
anderen Membrankomponenten oder mit dem Arzneistoff zustande kommen. Da Reaktionen,
die zur Inaktivierung von Wirkstoff oder aktiviertem Lipid führen können vermieden werden
müssen, ist die Methode nicht universell einsetzbar. Werden aktivierte PEG-Lipide
verwendet, sind die PEG-Ketten, durch den geschilderten Herstellungsprozess der
Liposomen, statistisch über inneren und äußeren Monolayer verteilt. Daraus ergibt sich - wie
unter 1.2.1 erwähnt - ein verringertes Aufnahmevermögen für hydrophile Wirkstoffe im
wässrigen Innenraum (Nicholas et al. 2000). Zudem bleiben die nach innen zeigenden
aktivierten (PEG-)Lipide ungenutzt, so dass störende Nebenreaktionen befürchtet werden
müssen. Ist diese die Kopplung des Liganden an der Oberfläche des Liposoms vorgesehen
(Typ B), ist nicht nur mit der sterischen Hinderung von Interaktion des an der Oberfläche
gekoppelten Vektors und der Zielstruktur sondern auch mit erschwerter Konjugation selbst zu
rechnen.
(3) Das aktivierte PEG-Lipid wird in einem vorgeschalteten Schritt mit dem Liganden
umgesetzt. Auch hier wird es in mizellarer Phase angeboten, so dass (nach den heutigen
Vorstellungen in der Literatur) zunächst “Immunomizellen“ entstehen. Das hydrophobisierte
Ligand-PEG-Lipid-Konjugat wird in einem zweiten Schritt mit vorgefertigten Liposomen
Allgemeiner Teil 27
zusammengebracht und lagert sich aus mizellarer Phase über das Monomer in die Membran
ein. In der Literatur ist diese Kopplungstechnik unter dem Namen Post-Insertion-Technique
(PIT) bekannt und wurde 1999 von Allen und Mitarbeitern unter diesem Namen eingeführt
(Uster et al. 1996; Zalipsky et al. 1997; Ishida et al. 1999; Iden & Allen 2001; Allen et al.
2002a; Allen et al. 2002b; Moreira et al. 2002), jedoch vom Prinzip her bereits 1997 von
Zalipsky et al. beschrieben und genutzt.
Ein großer Vorteil dieser Methode liegt in der Vermeidung von Interaktionen zwischen
aktiviertem PEG-Lipid mit anderen Membrankomponenten und/oder Wirkstoff. Zudem
erlaubt dieser Ansatz theoretisch die Modifikation bereits auf dem Markt befindlicher
liposomaler Formulierungen, die so auf einfache und schnelle Weise den experimentellen
oder therapeutischen Vorraussetzungen angepasst werden können. Die Methode erlaubt den
exklusiven Einbau von Liganden in den äußeren Layer, umgeht somit die Probleme der
Minimierung des Einschlusspotentials und nutzt gleichzeitig die eingesetzte Menge des
Liganden optimal (Nicholas et al. 2000).
Die Modifizierung bereits PEGylierter Liposomen hat sich jedoch als schwierig erwiesen und
wird in der Literatur zum Teil widersprüchlich beschrieben. Ist der zu koppelnde Ligand ein
AB und bereits mehr als 3 mol% MPEG2000-DSPE in der Membran implementiert (z.B. bei
Doxil®), sind die Transferraten aus der Immunomizelle selbst bei 37 °C so niedrig, dass die
auf der liposomalen Oberfläche einstellbare Ligandendichte ein effizientes aktives Targeting
kaum mehr erlaubt (Ishida et al. 1999). Zalipsky et al. (1997) hingegen beobachteten, dass
trotz 2-3 mol% PEG-Lipid in der Membran die Einlagerung von 1,2 -1,5 mol% DSPE-PEG-
Ligand nahezu vollständig von statten geht (Zalipsky et al. 1997). Der Ligand war in diesem
Falle allerdings ein Folsäurederivat - also ein vergleichsweise kleines Molekül.
Die PIT ist bislang nur für PE-PEG-Derivate beschrieben und beruht auf der spontanen
Einlagerung PEGylierter PE-Derivate in PL-Bilayer (Uster et al. 1996; Sou et al. 2000). Die
Einlagerungskinetik ist bei RT langsam, so dass die Inkubation der Immunomizellen mit den
Vesikeln i.d.R. bei 60 °C durchgeführt wird, um einen ausreichenden Transfer in praktikabler
Zeit zu gewährleisten. Ist ein thermolabiler Wirkstoff und/oder Ligand vorgesehen, stößt die
Anwendbarkeit der PIT an ihre Grenzen. In Abhängigkeit der Menge und Art des Liganden
kann die PIT auch zu einem massiven Leckschlagen der Membran führen. So wird
beschrieben, dass die Anwendung der PIT zur Kopplung von IgG nur eine vernachlässigbare
Freisetzung von Doxorubicin zur Folge hatte (Ishida et al. 1999) während die Kopplung von
Agonist G je nach Menge des in der Membran eingesetzten MPEG2000-DSPE 60-90% des
28 Allgemeiner Teil
Wirkstoffes freisetzte (Moreira et al. 2002). Die Umsetzung des Vektors mit dem Lipid muss
jedoch nicht zwangsläufig aus wässriger Phase erfolgen. Soll die Targetierung über ein
Peptid, Vitamin oder Saccharid erfolgen, das in organischer Lösung stabil ist, bietet sich eine
Synthese zur Herstellung eines Vektor-Lipid-Konjugats an. Diese Derivate können
aufgereinigt und charakterisiert (HPLC, NMR, MALDI-MS) werden, bevor sie auf eine der
drei oben beschriebenen Methoden in die Liposomenmembran eingebaut werden (Wong et al.
1997; Gabizon et al. 1999).
1.2.2.2 Kopplungsmethoden zur Präparation Ligand-modifizierter Oberflächen
Eine ideale Kopplungstechnik sollte folgenden Anforderungen genügen:
Sie sollte in möglichst wenigen, einfachen Schritten mit geringem präparativen Aufwand eine
ausreichend hohe Ligandendichte auf der Oberfläche des Vesikels gewährleisten, ohne dabei
die Funktionalität des Vektors oder die Integrität des Liposoms negativ zu beeinflussen.
Seit den späten 70er Jahren wurde eine Reihe von Kopplungsmethoden entwickelt, die die
Funktionalisierung liposomaler Oberflächen erlauben. Diese können unterschieden werden in
solche, die die Verknüpfung zwischen Liposom und Ligand über kovalente oder nicht
kovalente Bindung vermitteln. Im Prinzip lassen sich beide Arten der Bindung für die
Herstellung der Ligand-modifizierten Liposomentypen A-C (Abb. 1-6) nutzen.
1.2.2.2.1 Nicht kovalente Methoden
Die nicht kovalenten oder “Sandwich-Methoden“ beruhen entweder auf der Biotin-Avidin
Bindung (Rivnay et al. 1987), oder auf der so genannten Protein A Methode (Urdal &
Hakomori 1980; Leserman et al. 1981).
Die Biotin-Avidin Bindung ist mit einer Dissoziationskonstante von 10-15 M nahezu
irreversibel und findet breite Anwendung in der Immunohistochemie. Je nach Herkunft des
Proteins unterscheidet man zwischen Avidin (gewonnen aus dem Hühnereiweiß, 67 kDa,
Glykoprotein) und Streptavidin (Herkunft Streptomyces Arten, 60 kDa, kein Zuckerrest).
Jedes Avidin Tetramer besitzt vier hochaffine Bindungsstellen für Biotin. Die Kopplung über
die Biotin-Avidin Methode geht von biotinylierten Proteinen oder Peptiden und biotinyliertem
Lipid (Abb. 1-8) aus, wobei das Avidin mit seinen vier Bindungsstellen als Linker zwischen
Ligand und Liposom fungiert (Abb. 1-7(1)) (Vermette et al. 2002; Xiao et al. 2002).
Allgemeiner Teil 29
Alternativ kann das Avidin mittels kovalenter Bindung direkt an das Liposom angebracht
(Abb. 1-7 (2)) werden (Urdal & Hakomori 1980). Die dritte, selten gebrauchte Möglichkeit
sieht die Kopplung eines Avidin-Ligand Konjugats (Schnyder et al. 2004) an ein biotinyliertes
Lipid in der Lipidmatrix vor (Abb. 1-7 (3)).
Da die Biotinylierung von Peptiden und Proteinen durch im Handel befindliche Kits relativ
einfach und kostengünstig geworden ist, ist durch die Herstellung eines Liposoms mit
ankonjugiertem Avidin ein recht universell einsetzbares Werkzeug gewonnen, an das sich
auch verschiedene Proteine gleichzeitig einfach anbringen lassen. Ein weiterer Vorteil ist,
dass die nicht kovalente Bindung die Bioaktivität des Liganden sicherstellt, sofern die
Bindung an das Avidin keine für die Rezeptorwechselwirkung essentielle Domäne des
Liganden sterisch abschirmt.
Die Protein A Methode nutzt die Interaktion von IgG mit einem Staphylokokkenprotein (Abb.
Abb. 1-8: Biotinyliertes DOPE-Derivat zur Biotin-Avidin Kopplung
Biotinyl-PE
O N H
H S
H H
N H
O O
H N O
O - P
O O
H O
O O
Abb. 1-7: “Sandwich-Methoden“ zur Kopplung von Liganden an liposomale Oberflächen
(2)
(1)
(3)
(4)
30 Allgemeiner Teil
1-7 (4)) aus. Protein A ist ein an der Zellwand von Staphylokokken gebundenes Protein, das
bei Kopplung an Liposomen die Möglichkeit eröffnet, IgG über den Fc-Terminus des
Antikörpers an der Oberfläche der Liposomen anzubringen. Auf diese Weise ist mit einer
besseren Interaktion von targetiertem Liposom und Zielgewebe zu rechnen.
Als für beide “Sandwich-Methoden“ kritischer Punkt ist jedoch die Immunogenität der für
Tier und Mensch körperfremden Proteine anzusehen (Li et al. 2002).
1.2.2.2.2 Kovalente Methoden
Die Literatur zur Kopplung von Liganden an liposomale Oberflächen ist aufgrund der
Vielzahl der publizierten chemischen Methoden, der breiten Palette unterschiedlicher Abläufe
und nicht zuletzt aufgrund der uneinheitlichen Nomenklatur für die einzelnen Techniken, sehr
unübersichtlich. In diesem Abschnitt wird versucht, die wichtigsten Methoden, ohne
Anspruch auf Vollständigkeit, zusammenzufassen.
Im Allgemeinen nutzen die etablierten Methoden zur Kopplung eines Liganden direkt an die
liposomale Oberfläche (Typ A, B) oder an das Ende eines PEG-Spacers (Typ C Abb. 1-6)
entweder freie Amine oder Thiole des Liganden um die Bindung zum Liposom herzustellen.
Einen Sonderfall stellt die Hydrazonkopplung über die Kohlenhydratstrukturen am Fc-Teil
eines Antikörpers dar, die an späterer Stelle genauer vorgestellt wird.
Ist in der Struktur eines Liganden keine Thiolfunktion vorhanden, eine aminoaktive Kopplung
jedoch (aufgrund einer aminhaltigen Membrankomponente oder der möglichen Reaktion mit
dem Wirkstoff) nicht möglich, kann mit Hilfe von Thiolierungsreagenzien, Thiol-Disulfid-
Austauschreaktionen sowie Reduktion von vorhandenen Disulfidbrücken dennoch eine
Kopplung über eine Thiolfunktion ermöglicht werden.
1.2.2.2.2.1 Aminoreaktive, direkte Kopplung
Zunächst sollen Kopplungsmethoden für die direkte Bindung an die PL-Vesikel ausgeführt
werden, die Aminofunktionen des Liganden zu dessen Bindung nutzen.
Für diesen Zweck haben sich Carboxyacyl-Derivate (Kung & Redemann 1986) des PE bzw.
des Cardiolipins durchgesetzt (Niedermann et al. 1991) (Abb. 1-9).
Allgemeiner Teil 31
Während die Carboxyacylderivate von Phoshatidylethanolaminen (z.B. N-Glutaryl-Dioleyl-
Phosphatidylethanolamin; NGPE) im Handel sind, müssen Derivate der Cardiolipine selbst
synthetisiert werden. Eine solche Synthese lohnt sich immer dann, wenn eine geringe Anzahl
von Aminofunktionen derivatisiert werden soll, um die biologische Aktivität des Liganden
nicht zu gefährden und dennoch eine stabile Verankerung in der Membran gewährleistet sein
soll (Weissig et al. 1986; Niedermann et al. 1991).
Die zu koppelnden Liganden werden zunächst mit den Carboxyacylderivaten umgesetzt,
wodurch es zu einer Hydrophobisierung der Liganden kommt. Wird diese Reaktion in
Anwesenheit eines Detergenz durchgeführt, entstehen Ligand-modifizierte Mischmizellen, die
anschließend mit einer Mischmizelldispersion der Membranlipide zusammengegeben und der
Detergenzdialyse (1.1.2.4) unterzogen werden können (Gregoriadis 1983). Ein anderes
Protokoll (Bogdanov et al. 1988) sieht die Herstellung NGPE-haltiger Liposomen vor, die
nach dessen Aktivierung mit dem Liganden umgesetzt werden.
Abb. 1-10 stellt die Reaktionsbedingungen und Abläufe schematisch dar. Die
Kopplungsreaktion beruht auf der Aktivierung des Carboxyacyl-Lipids mit einem
wasserlöslichen Carbodiimid (1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid; EDC) in
Gegenwart von N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS), durch dessen Anwesenheit
Nebenreaktionen vermieden (Holmberg et al. 1989) und höhere Kopplungsausbeuten erzielt
werden können. Als Nebenprodukt entsteht ein untoxisches Harnstoffderivat. Dieses sowie
nicht gebundenes Protein kann über eine GPC Säule abgetrennt werden.
Succinyl Cardiolipin (OSCl)
N - Glutaryl - PE (NGPE)
O - -
O O
H O
O O N H
O O - P O
O H O O
O
O
O
O
H
O
O
H
O
O
O O - O P
O - O
O P
O O
O
O O H O
Abb. 1-9: Strukturformeln der zur direkten aminoaktiven Ligandenkopplung eingesetzten Lipide
32 Allgemeiner Teil
NGPE wird normalerweise 10 mol%ig in Bezug auf das Gesamtlipid eingesetzt und führt in
dieser Menge zu ausreichenden Kopplungsausbeuten. Der Vektor ist über eine stabile
Amidbindung direkt am Liposom gebunden.
Eine weitere Methode zur direkten Kopplung über Aminfunktionen ist in Abb. 1-11
dargestellt. Genutzt wird die Bildung von Amidbindungen bei der Inkubation von primären
Aminen mit succinimidylaktivierten Carbonsäuren im wässrigen Medium bei neutralen pH-
Werten.
PE wird zunächst in organischem Lösungsmittel mit dem bifunktionellen DSS
(Disuccinimidylsuberat) - das hier als Beispiel für alle auf dem gleichen Prinzip beruhenden
Crosslinker aufgeführt wird - umgesetzt und das aktivierte Lipid während der Herstellung der
Vesikel in die Liposomenmembranen eingearbeitet, bevor das Protein mit den aktivierten
Liposomen inkubiert wird (Haga et al. 1990; Nakano et al. 1999; Uchida 2003).
O
OHNGPE
O
ONGPE
NH
N R1
R2
N C N N
N
SO
O
O-O
O
OH
O
ONGPE
N
SO
O
O-O
O
O
NHNHR2R1
NH2 Ligand
O
NHNGPE
Ligand
(1) Umsetzen mit EDC
pH 5,5; RT; 5 min
(2) Umsetzen mit Sulfo-NHS
pH 5,5; RT; 5 min
(3) Umsetzen mit Ligand
pH 7,5; 4 °C; über Nacht
EDC
Sulfo-NHS
Harnstoffderivat
R2 R1
Abb. 1-10: Reaktionsabläufe und Bedingungen bei der Kopplung von Liganden mit Carboxyacylderivaten
Allgemeiner Teil 33
Die letzte wichtige Konjugationsmethode beruht auf der Umsetzung von Aldehyden mit
primären Aminen zur Schiffschen Base (Imin).
Die Aldehydfunktion kann entweder durch die milde Oxidation glykolipidhaltiger Liposomen
mit Periodat (Urdal & Hakomori 1980; Heath et al. 1981; Bogdanov et al. 1984) (Abb. 1-12
(1)), die Verwendung von bifunktionellen Aldehyden (i.d.R. Glutaraldehyd) (Nakano et al.
1999; Uchida 2003) (Abb. 1-12 (2)), oder den direkten Einbau von Glutaraldehydlipiden in
die Liposomenmembran (Haga et al. 1990) (Abb. 1-12 (3)), zur Verfügung gestellt werden.
Das praktische Vorgehen sei für das Beispiel der Verwendung von Glykolipiden näher
ausgeführt:
Die bei der Oxidation von vincinalen Hydroxylgruppen mit Periodat (IO4-) (Abb. 1-12 (1))
entstehenden Aldehyde reagieren mit primären Aminen zu einem reaktiven Imin weiter, das
abschließend, zusammen mit überschüssigem Aldehyd, nach erfolgter Kopplung durch
Cyanoborhydrid in unreaktive funktionelle Gruppen (sekundäres Amin, Alkohol) überführt
wird. Die Oxidation der Liposomen erfolgt in schwach basischem pH-Bereich (pH 8,4) bei
RT für 30 min, das überschüssige Periodat wird abgetrennt (Dialyse,
Gelpermeationschromatographie (GPC)), bevor der zu koppelnde Ligand bei 4 °C über Nacht
FS
O
OH FS
O
OO
NH2O
O-P ONO
O
OO
N O (CH2)6
O
OO
O
N O (CH2)6
O
OO
NH
Lipid
O
(CH2)6
O
NH
LipidNH
Ligand
NH2Ligand
Disuccinimidylsuberat
(DSS) TEA
pH 7,4; RT; 6 h
Phosphatidylethanolamin
(PE)
Abb. 1-11: Konjugationsschema unter Verwendung von DSS
34 Allgemeiner Teil
in Gegenwart von Cyanoborhydrid mit den oxidierten Liposomen inkubiert wird. Unter
optimalen Bedingungen (hohe Proteinkonzentration; z.B.: IgG 30-60 mg/ml und 20 mol%
Galactocerebrosid) lassen sich 20% des eingesetzten Proteins an die Oberfläche der
Liposomen binden.
1.2.2.2.2.2 Thiolaktive, direkte Kopplung
Die zwei bedeutendsten thiolaktiven Kopplungen beruhen auf der Reaktion der beiden
käuflichen, reaktiven PL 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphatidylethanolamin-N-[4-(p-
maleimidophenyl)butyramid] (N-MPB-DPPE) und 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-
Phosphatidylethanolamin-N-[3-(2-pyridyldithio)propionat] (N-PDP-DPPE) (Abb. 1-13),
wobei die Fettsäurereste variabel sein können (daher wird im Folgenden auf die nähere
Spezifikation des Fettsäurerestes verzichtet und verallgemeinernd von PE gesprochen). Bei
der Kopplung mittels N-PDP-PE handelt es sich um einen Disulfidbrückenaustausch, bei dem
die instabile aromatische Pyridylthiolgruppe gespalten und durch eine neue Disulfidbrücke
Abb. 1-12: Kopplungen von Liganden über Bildung einer Schiff’schen Base mit anschließender Reduktion des Imins
Glycolipid
OH OH
O
H
O
H
NH2 Ligand
IO4-
N
H
Ligand
NH
H
Ligand
H
NaBH3CN
NH2 LigandNH2Lipid
CHO-(CH2)3-CHO
Lipid-NH-CH2-(CH2)3-CH2-NH-Ligand
NH2 LigandLipid-CHO
Lipid-CH2-NH-Ligand
(2)(1)
(3)
Allgemeiner Teil 35
zum Liganden ausgetauscht wird (Abb. 1-13).Die entstehende Brücke ist also reversibel und
kann in Gegenwart von Thiolen (z.B.: Glutathion, das in vivo ubiquitär in höheren
Konzentrationen vorhanden ist, Cystein, Dithiothreitol) leicht gespalten werden.
Im Gegensatz dazu resultiert aus der Umsetzung von N-MPB-PE mit der durch den Vektor
offerierten SH-Gruppe eine stabile Thioetherstruktur (Abb. 1-13). Bei der Kopplung über
maleimidaktiviertes PE ist der im Vergleich zur SPDP Aktivierung wesentlich kleinere pH-
Toleranzbereich zu beachten.
Außer den angeführten heterobifunktionellen Aktivierungsreagenzien SPDP und SMPB
werden auch Succinimidyl-Maleimidderivate mit alternativen Spacern (z.B. N-(-
maleimidocaproyloxy)succinimid (EMCS) (Nakano et al. 1999; Uchida 2003), oder SMCC
(Succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate) verwendet.
Der Vollständigkeit halber sei die Aktivierung von PE-Lipiden mit N-
Abb. 1-13: Darstellung thiolaktiver Lipide und deren Umsetzungsbedingungen mit Sulfhydrylgruppen tragenden Liganden
O
HN
LipidS
SN
O
O
N
O
HN
Lipid
O
O
N
O
ON
O
OO
OSSN N
O
O
FS
O
OH FS
O
OO
NH2O
O-P O
SH Ligand
O
HN
LipidS
SLigand
O
O
N
O
HN
Lipid
SLigand
N-Succinimidylpyridyldithiopropionat
(SPDP)
N-Succinimidyl (4-(p-maleimidophenyl))
butyrat (SMPB)
TEA, CH3Cl3, N2 TEA, CH3Cl3, N2
Phosphatidylethanolamin
N-PDP-PEN-MPB-PE
12h, RT, pH 6-812h-16h, RT,
pH 6,5 -6,8
36 Allgemeiner Teil
Hydroxysuccinimidyliodacetat (NHSIA) erwähnt, die jedoch, vermutlich aufgrund sterischer
Hinderungen, nur zu schlechten Kopplungsausbeuten führt (Abb. 1-14).
Die thiolaktiven Lipide können als normaler Bestandteil der Liposomenmembran während der
Herstellung der Liposomen eingebaut werden, was eine intra- und extravesikuläre
Lokalisation der reaktiven Funktionen mit den daraus entstehenden Problemen der
Interaktionen mit weiteren Systemkomponenten zur Folge hat. Ebenso ist eine Umsetzung
PE-haltiger Liposomen mit SPDP oder SMPB möglich, indem die Reagenzien in organischer
Lösung (Ethanol, Dimethylformamid, Dioxane; bis zu 5%iger (v/v) Zusatz an organischem
Lösungsmittel möglich, abhängig vom Chol-Anteil der Membran) oder als Feststoff zugesetzt
werden (PE:Reagenz ~ 1:10-20 (Torchilin & Weissig 2003)), so dass ausschließlich die
äußere Membran aktiviert wird. In diesem Fall ist auf eine ausreichende Pufferkapazität zu
achten, um ein Absinken des pH-Werts und die daraus folgende Entstehung der freien Säure
der Derivate durch Hydrolyse zu vermeiden.
Den thiolreaktiven Konjugationsmechanismen, abgesehen von der NHSIA-Methode, ist eine
hohe Kopplungsausbeute gemeinsam. Ein offensichtlicher Nachteil der N-PDP-PE Methode
ist die zu erwartende Spaltung der Disulfidbrücke in vivo. Für den relativ großen Maleimido-
Benzoyl-Rest, der durch die N-MPB-Methode eingebracht wird, wird, insbesondere bei der
Kopplung kleiner Proteine und Peptide, eine immunogene oder auch sterisch hindernde
Eigenschaft diskutiert (Torchilin & Weissig 2003).
O
O
O
N
ON
O
O
O
O
NO
ON
O
O
O
ON
O
OCH2I
NH2Lipid
O
NH
CH2ILipid
SH Ligand
O
NH
LipidS Ligand
SMCC
EMCS
NHSIA
Abb. 1-14: Strukturen alternativer heterobifunktioneller thiolaktiver Kopplungskomponenten sowie Ablauf der Konjugation über NHSIA
Allgemeiner Teil 37
Der entscheidende Nachteil der thiolaktiven Kopplungen ist jedoch die Tatsache, dass das
Vorkommen von freien Thiolen in Proteinen, Peptiden und anderen möglichen Liganden
selten ist, so dass häufig eine Aktivierung des Liganden notwendig wird, um die Konjugation
zu ermöglichen. Diese Aktivierung kann entweder durch direktes Einführen von
Thiolgruppen, das Umsetzen des Liganden mit SMPB oder SPDP, oder - in besonderen Fällen
- durch die Reduktion endogener Disulfidbrücken des Liganden erzielt werden. Abb.1-16 gibt
einen Überblick über die Methoden zur Thiolierung aminhaltiger Vektoren, sowie über die
weitere Prozessierung zur Umsetzung mit den thiolaktiven Lipiden N-PDP-PE und N-MPB-
PE.
Der erste Weg (Abb.1-16 (1)) zur Kopplung des Liganden führt über das bereits vorgestellte
SPDP. Dieses reagiert unter milden Bedingungen (5% EtOH (v/v); RT; pH 7,5; 30 min) zum
Dithiopyridyl-modifizierten Liganden ab. Wird dieses Konjugat im schwach Sauren (pH 5,5;
RT, 30 min) mit Dithiothreitol (DTT, Strukturformel Abb. 1-15) reduziert, wurden
Aminofunktionen des Liganden in Thiolfunktion überführt. Diese kann nun, wie im Schaubild
illustriert, mit in der Liposomenmembran befindlichem N-PDP-PE, oder alternativ N-MPB-
PE (nicht dargestellt), unter Ausbildung einer Disulfidbrücke bzw. eines Thioethers zur
Konjugation des Liganden genutzt werden.
Eine zweite Möglichkeit (Abb.1-16 (2)) einen Vektor zur thiolaktiven Kopplung an ein
Liposom vorzubereiten besteht in dessen Derivatisierung mit SMPB. Parallel zur
Derivatisierung des Liganden wird eine Liposomendispersion mit 1-10 mol% N-PDP-PE
präpariert, die anschließend mit DTT reduziert wird. An der Oberfläche der Liposomen
entstehen freie Thiole, die eine Thioetherbrücke zum aktivierten Protein ausbilden können.
Pepsin-S-S-
-S-S-
IgG
F(ab')2
DTT-SH HS-
2Fab'SHOH
SH OH
Abb. 1-15: Aktivierung endogener Thiole mit Dithiothreitol
38 Allgemeiner Teil
Abb.1-16: R
eaktionsschema zur Thiolierung von Liganden zur K
onjugation mit thiolaktiven L
ipiden.
Ligand
O
Ligand
NH
2
SP
DP
SM
PB
NS
-S-Ligand
OO
Ligand
DTT
Ligand-S-H
NS
-S-Lipid
Lipid-S-S
-Ligand
SLipid
Ligand
OO
Lipid-S-HDTT
NO
OO
SO
SA
TA
NH
SLigand
O
O
NH
2 OHNH
SH
LigandO
N-P
DP
-PE
NS
-S-Lipid
N-P
DP
-PE
OO
Lipid
S
Lipid
OO
NH
O
N-M
PB-PE
SN + H
H Cl -
NH
SH
N +H
H
Ligand
Cl -
Trauts Reagenz
NH
SN
H
LigandS
Lipid
(1)(2)
(4)(3)
Allgemeiner Teil 39
Das Reagenz SATA (Succinimidyl-S-acetyl-thioactat) kann verwendet werden, um die
Anzahl der Reinigungsschritte zu reduzieren (Abtrennung von überschüssigen Reagenz,
Entfernung des DTT, Abtrennen von freiem Ligand), die bei der Aktivierung mittels SPDP
oder SMPB nötig sind. Außerdem wird der aus der Aufarbeitung resultierende analytische
Aufwand sowie Ligandenverlust durch Säulen minimiert. SATA (Abb.1-16 (3)) führt das
Schwefelatom in Form eines Thioester in die Struktur des Liganden ein. Dieser wird durch
Zugabe von Hydroxylamin leicht in ein freies Thiol überführt. Dieses kann wiederum - wie
gezeigt - mit N-MPB-PE oder N-PDP-PE enthaltenden Liposomen zu Liposom-Vektor-
Komplexen weiterverarbeitet werden. Da das Hydroxylamin den letzten Schritt nicht stört,
muss nur ein Reinigungsschritt zur Entfernung des nicht abreagierten SATA’s vorgenommen
werden.
Ein weiteres Reagenz ist Iminothiolan (Trauts Reagenz Abb.1-16 (4)), das ohne den Einsatz
von Hydroxylamin auskommt, da die Umsetzung des Liganden mit dem Reagenz unter
Ringöffnung ein freies Thiol in die Struktur einführt, das wie gewohnt weiter prozessiert
werden kann.
Eine sehr elegante Methode ist die Reduktion endogener Disulfidbrücken (Abb. 1-15). Ein
Antikörper kann nach Pepsin-Verdau und Gewinnung der F(ab’)2 Stücke durch Reduktion mit
DTT in ein Fab’ Fragment gespalten werden, das nun ein freies Thiol bietet.
Bei allen thiolaktiven Kopplungen ist die leichte Oxidierbarkeit des freien Thiols im Auge zu
behalten. In Anwesenheit von Sauerstoff und katalytischen Mengen von Schwermetallen kann
die (mühsam) gewonnene Sulfhydrylgruppe schnell oxidiert werden. Daher sollten alle Puffer
mit Stickstoff gespült, soweit wie es ein vernünftiger Arbeitsaufwand zulässt unter
Stickstoffatmosphäre gearbeitet und auf die Komplexierung von Schwermetallen mit EDTA
geachtet werden.
Die bis hierher aufgeführten Verfahren sind zum großen Teil zu Beginn der Forschung mit
zielgerichteten Liposomen entwickelt worden. Mit der Einführung der Stealth® Liposomen
wurde es nötig, um die Vorzüge beider Techniken, der PEGylierung und Funktionalisierung
von Liposomen, in einer Präparation nutzen zu können, die bei oberflächenfixierten Vektoren
auftretende sterische Hinderung der Interaktion mit der Zieldeterminate dadurch zu umgehen,
dass der Zielvektor am distalen Ende des zur sterischen Stabilisierung verwendeten PEG
angebracht wurde. Da die Chemie der zu koppelnden Liganden, die heute, wie auch in den
Anfängen der Immunoliposomen, größtenteils Proteine und Peptide sind, die Art der
Kopplung bestimmen, sind die chemischen Methoden, mit denen heute Vektoren an terminale
40 Allgemeiner Teil
Hydroxylfunktionen liposomaler Zubereitungen gekoppelt werden, prinzipiell die gleichen,
die auch schon zu ihrer Fixierung an der Vesikeloberfläche genutzt wurden und werden.
1.2.2.2.2.3 Aminoaktive distale Kopplung an PEG-Ketten
Bei der Kopplung von Liganden an die terminale Hydroxylfunktion von PEG-Ketten wird fast
immer von einem Molekül der Grundstruktur
R-PEG45-115-Diacylphosphatidylethanolamin
ausgegangen, in der R eine Funktion darstellt, die zu Kopplung eines Liganden genutzt
werden kann. War die Synthese dieser Lipide zunächst noch aufwendig, ist diese durch die
breite Palette an kommerziellen heterobifunktionellen PEG Derivaten (z.B. Biotin-PEG-
Succinimidylcarbonat, Mal-PEG-Succinimidylcarbonat) sehr einfach geworden.
In der neueren Literatur wird größtenteils eine PEG-Kette aus 45 EO-Einheiten in
Kombination mit DOPE, DPPE oder DSPE eingesetzt, da eine Reihe von aktivierten
Derivaten dieser Strukturen im Handel ist.
Abgesehen vom ersten in Tabelle 1-3 aufgeführten Derivat sind die vorgestellten aktivierten
PEG-Lipide Eigensynthesen. Alle liefern nach Kopplung des Liganden in vivo stabile
Brücken zum Liganden. Die Aktivierung des PEG-Restes mittels Cyanursäure und para-
Nitrophenylcarbonat sind zwei neuere Ansätze für die Kopplung von Liganden an
Liposomen, die nicht auf den zur direkten Kopplung genutzten Strategien beruhen.
Ursprünglich wurden sie zur PEGylierung zum Zwecke der Modifikation
pharmakokinetischer Eigenschaften von Proteinen untersucht.
Das Succinimidylcarbonatderivat befindet sich seit Ende der 90er Jahre im Handel und ist
wohl aufgrund seiner Esterbindung zum PEG-Teil des Moleküls, die eine schnelle Abspaltung
des Liganden in vivo oder Anwesenheit von Serum erwarten lässt, bisher nur selten zum
Einsatz gekommen.
Der Vorteil gegenüber den thiolaktiven Derivaten, die bei der Kopplung an PEG-Termini die
bedeutendste Rolle spielen, liegt darin, dass auf die Aktivierung des Liganden verzichtet
werden kann.
Allgemeiner Teil 41
O
HN
O
FS
O
FSO
O-O
OP
HOO
OR(OCH2CH2)n
N O O
OO
O
PEG-Lipid NH
O
O
PEG-LipidLigand
O O
O
PEG-LipidN+
O-
ONH
O
O
PEG-LipidLigand
O
OHPEG-Lipid N
H
O
Ligand PEG-Lipid
N
N
N
O-PEG-Lipid
Cl
Cl
N
N
N
O
Cl
PEG-LipidNHLigand
Allgemeine Struktur
Struktur Rest R Bindung zum Ligand Kommentar Literatur
Succinimidylcarbonat Urethan (Carbamat)
Derivat des DSPE im Handel, Ester zum PEG, RT, pH 7-8 empfohlen
Shearwater Polymers Inc, Produktkatalog
Nitrophenylcarbonat Urethan (Carbamat)
PE-Derivat in Liposomen einbauen (pH 5); zur Kopplung pH auf 8,5 erhöhen
(Torchilin et al. 2001a; Torchilin et al. 2001b)
Carboxylat Amid
Aktivierung mit EDC, siehe Abb. 1-10
(Blume et al. 1993; Maruyama et al. 1995; Ishida et al. 2001)
Cyanursäurederivat Cyanursäurebrücke
Bindung zu PE-Rest hier auch über Cyanursäure
Einbau des Derivates in die Liposomen, Kopplung bei RT, 16 h, pH 8.8
(Bendas et al. 1999)
Tabelle 1-3: Aminoaktive Lipidderivate zur distalen Kopplung von Liganden an PEG-Liposomen
1.2.2.2.2.4 Thiolaktive, distale Kopplungen
Die Möglichkeiten der Kopplungen über Thiole wurden bereits bei den direkten
Kopplungsmethoden besprochen (Abb. 1-13). Die dort angeführten Bedingungen und
Protokolle gelten genauso für die Kopplung von Liganden an aktivierte PEG-Ketten. In der
Zwischenzeit befindet sich Mal-PEG-DSPE, ein Maleimid aktiviertes DSPE-PEG-Derivat, im
Handel. Die PDP-Aktivierung von PEG-Lipidderivaten muss allerdings nach wie vor in
Eigensynthese geschehen.
Auch bei der distalen Kopplung von Liganden über Thiole bleibt die Aktivierung des Vektors
in den meisten Fällen ein Muss. Die zur Verfügung stehenden Reagenzien, sowie die
verschiedenen Kombinationsmöglichkeiten wurden in Abb.1-16 vorgestellt.
42 Allgemeiner Teil
O
HN
O
FS
O
FSO
O-O
OP
HOO
OR(OCH2CH2)n
N
O
O
SpacerO
NH PEG-Lipid
N
O
O
SLigand
PEG-Lipid
N
SS
PEG-Lipid
LigandS
SPEG-Lipid
Allgemeine Struktur
Struktur Rest R Bindung zum Ligand Kommentar Literatur
Maleimidgruppe Thioether
Das Standardverfahren; Bedingungen:
Abb. 1-13
(Shahinian & Silvius 1995; Kirpotin et al. 1997)
Pyridyldithiogruppe Disulfidbrücke
Erzeugung von HS-PEG-DSPE, Kopplung von Bromacetyl und Maleimid-Liganden
(Allen et al. 1995; Zalipsky et al. 1997; Sapra & Allen 2004)
Tabelle 1-4: Thiolaktive Lipidderivate zur distalen Kopplung von Liganden an PEG-Liposomen
Die letzte Methode, die hier besprochen wird, basiert auf der Oxidation der
Kohlenhydratstrukturen am Fc-Teil von Ab, die 1984 von Chua et al. eingeführt und
weiterentwickelt wurde (Chua et al. 1984; Zalipsky 1993). Die Oxidation von
Zuckerstrukturen mit Periodat, die auch bei dieser Kopplungsmethode Anwendung findet,
wurde bereits vorgestellt (Abb. 1-12). In diesem Fall wird jedoch keine Bindung über ein
Imin mit anschließender Reduktion zur Fixierung des Liganden genutzt. Die Konjugation des
Vektors erfolgt vielmehr durch ein hydrazinhaltiges PEG-PE-Derivat, das mit dem durch die
Periodat entstandene Aldehydfunktion des Antikörpers unter Formation eines Hydrazones
abreagiert.
Ein Vorteil der Methode liegt in der gerichteten Kopplung des Antikörpers. Im Gegensatz zu
allen anderen vorgestellten Methoden (mit Ausnahme der Nutzung endogener Thiole durch
Spaltung von F(ab’)2 Teilen), die den Liganden in rein statistischer Weise gebunden haben,
wird mit der Hydrazonkopplung sichergestellt, dass die zur Interaktion mit der Zielstruktur
notwendige Domäne durch den Kopplungsprozess nicht beeinträchtigt wird.
Allgemeiner Teil 43
NH
NH2 NHO
O
O PEG-LipidAntikörperH
O+
Antikörper NNH
NH
O PEG-LipidO
O
pH 5,5; über Nacht, Kühlschrank
Abb. 1-17: Kopplung von Antikörpern über hydrazidaktivierte PEG-Lipide
Ein weiterer Vorteil ist die schwere Zugänglichkeit des Fc Teils für Makrophagen (Aragnol &
Leserman 1986) und die damit zu erwartende verlängerte Bluthalbwertszeit (1.1.5.2).
Allerdings wird in vivo dieser Effekt teilweise durch den Scavenger Rezeptor der
Makrophagen aufgehoben. Dieser Rezeptor scheint, in Analogie zur Aufnahme von ox-LDL,
für die schnelle Entfernung der mit oxidativ geschädigten Antikörpern modifizierten
Liposomen verantwortlich zu sein (Krieger & Herz 1994).
1.2.3 Zusammenfassung der Kopplungsprinzipien
Zusammengefasst stellt sich die Situation der Kopplung von Liganden an liposomale
Oberflächen wie folgt dar:
▪ Zur Fixierung des Liganden an der Oberfläche werden i.d.R. gesättigte PL-Derivate
verwendet. Cholesterol-PEG Derivate spielen eine untergeordnete Rolle, sind jedoch
in vitro bereits erfolgreich eingesetzt worden (Benzinger et al. 2000).
▪ Der Einbau der Derivate in die Liposomenmembran erfolgt zumeist auf direkte Weise
während der Herstellung der Vesikel.
▪ Am vielversprechendsten stellt sich die Präparation der Typ C Ligand-targetierten-
Liposomen (LtL) dar. Er verbindet, bei richtiger Ligandenlast, die Vorzüge der
Stealth®-Liposomen mit der aktiven Zielausrichtung.
▪ Die Verwendung von aminoaktiven Lipiden spielt eine untergeordnete Rolle obwohl
keine zusätzliche Aktivierung des Liganden nötig ist, da die aminoaktiven Lipide mit
zahlreichen Wirkstoffen (darunter das liposomal am häufigsten verwendete
Aminoglykosidderivat Doxorubicin), Membrankomponenten (PE) und aminhaltigen
Puffern interagieren.
44 Allgemeiner Teil
▪ Die Post-Insertion-Technique (PIT) ist ein hoffnungsvoller Ansatz, der eine optimale
Nutzung des eingesetzten Liganden erlaubt, da dieser exklusiv in den externen Layer
eingebaut wird. Damit ist zusätzlich eine gegenüber der konventionellen direkten
Einbauvariante des aktivierten PEG-Lipids eine optimale Beladungskapazität des
Innenraums sichergestellt.
▪ Die Datenlage, die sich aus der Literatur zur PIT ergibt, spricht für eine Abhängigkeit
der Einlagerungseffizienz von der Struktur (PEG-Lipid-Anteil, rigide oder fluide
Membranen) der zu modifizierenden Liposomen (Zalipsky et al. 1997; Ishida et al.
1999) und eventuell der Größe und Art des einzulagernden Liganden sowie der
Stabilität der Mizellen, die mit den Vesikeln co-inkubiert werden.
▪ Ein zuverlässiger nachträglicher Einbau größerer Liganden (Antikörper, Fab’-Teile,
Proteine), der die spätere Interaktion der Vesikel mit der Zielstruktur garantiert, ist nur
bei erhöhter Temperatur (60 °C) sicher gezeigt (Ishida et al. 1999).
▪ Standardverfahren zur Kopplung bleibt der direkte Einbau der teuren oder in mehreren
Schritten zu synthetisierenden, thiolaktiven PEG-Lipide mit der daraus resultierenden
notwendigen Aktivierung des Liganden und dem insgesamt langwierigen
Herstellungsprozess von LtL.
Allgemeiner Teil 45
1.3 Isotherme Titrationskalorimetrie zur Untersuchung der
Interaktionen von Detergenzien mit Phospholipidvesikeln
Sowohl chemische als auch physikalische Vorgänge (z.B. nicht kovalente Bindungsvorgänge)
können von der Auf- oder Abgabe von Wärme begleitet sein. Die isotherme
Titrationskalorimetrie (ITC) misst die Wärmen, die bei der Mischung zweier Lösungen
unterschiedlicher Zusammensetzung durch physikalische oder chemische Vorgänge
entstehen.
1.3.1 Geräteaufbau und Messprinzip
Abb. 1-18 zeigt die schematische Darstellung eines Titrationskalorimeters. Es besteht im
wesentlichen aus zwei Zellen, einer Probenzelle und einer Referenzzelle (Volumen ca. 1 ml),
die die gleiche Lösung enthalten und sich in einem beheizbaren Mantel befinden.
In die Messzelle wird eine computergesteuerte Spritze eingeführt, deren Spritzenkopf zu
einem Spiralrührer abgeflacht ist, der während Basislinieneinstellung und während der
Messung mit definierter Drehzahl rotiert (300-400 rpm). Das Untersuchungsmaterial wird in
kleinen Aliquots (i.d.R. 5-20 µl) injiziert und die entstandene oder konsumierte Wärme in
Abhängigkeit der Zeit aufgezeichnet.
Das Gerät ist als adiabatisches System konzipiert, das im Leistungskompensationsmodus
arbeitet. D. h., dass die durch die Injektion des Reaktanden hervorgerufenen Wärmeeffekte
Spritze
Referenzzelle Probenzelle
adiabatisches
Schild
Rührer
Heizungen
Abb. 1-18: Schematische Darstellung eines Titrationskalorimeters
46 Allgemeiner Teil
aktiv durch das Rückkopplungssystem des Kalorimeters ausgeglichen werden, um Proben-
und Referenzzelle auf einer konstanten, sehr geringen Temperaturdifferenz zu halten.
Realisiert wird dies durch eine sehr präzise Messung der Temperaturdifferenz zwischen den
beiden Zellen. Die Referenzzelle wird kontinuierlich mit sehr geringer Leistung
(20 µW) beheizt. Da der dadurch bedingte Temperaturanstieg der Referenzzelle mit
30-60 mK/h sehr gering ist, kann innerhalb von einem Injektions- und Reaktionszyklus von
“isothermen“ Bedingungen ausgegangen werden.
Die Reaktionszelle ist ebenfalls mit einer Heizung versehen, deren Heizleistung über einen
Rückkopplungsmechanismus kontrolliert wird. Dieser stellt sicher, dass Proben- und
Referenzelle auf der konstanten Temperaturdifferenz gehalten werden. Aufgrund der sehr
genauen Anpassung der Zellgrößen und des gleichen Inhaltes der beiden Zellen ist die
Heizleistung der Probenheizung solange nahezu gleich der der Referenzheizung, wie kein
Reaktand in die Messzelle eingebracht wird. Bei Injektion der Probe und dadurch bedingter
Wärmeentstehung oder Konsumierung ist eine Regulation der Heizleistung an der Probenzelle
nötig, um die ursprünglichen Temperaturverhältnisse wiederherzustellen. Die angezeigten
Signale einer Messreihe sind eine Serie von Pulsen, die die Heizrate an der Probenzelle als
eine Funktion der Zeit darstellen (vgl. Abb. 1-19). Dabei werden endotherme Vorgänge mit
positivem (Hochfahren der Heizleistung), exotherme Vorgänge mit negativem Vorzeichen
(Herunterfahren der Heizleistung) versehen. Die Integration dieser Signale liefert die Wärme
der Reaktion.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
µcal
/sec
Zeit [min]
0 20 40 60 80 100 120 140
-0,7
-0,6
-0,5
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
Zeit [min]
(A) (B)
Abb. 1-19: Rohdaten zweier ITC-Messungen, A endotherme Vorgänge, B exotherme Vorgänge
Allgemeiner Teil 47
Das dritte Heizsystem, das im Gerätemantel integriert ist, wird durch einen weiteren
Kompensationsmechanismus reguliert. Dieser sorgt dafür, dass die Temperatur des Mantels
exakt auf der der Referenzzelle gehalten wird. Dieses adiabatische Schild garantiert, dass kein
Wärmeaustausch mit der Umgebung stattfinden kann.
1.3.2 Untersuchungsgegenstände der isothermen Titrationskalorimetrie in Membran-Detergenz-Systemen
Die ITC hat sich zur Untersuchung von Detergenz-Membran-Interaktionen als nützlich
erwiesen. Eine Reihe von Enthalpien sind direkt zugänglich und können über spezielle
experimentelle Setups ermittelt werden (Heerklotz & Seelig 2000).
Im Allgemeinen werden drei Arten von Experimenten unterschieden:
▪ Bei Experimenten zur Bestimmung der CMC (Demizellisierungsexperiment)
(Olofsson 1985) kann gleichzeitig die molare Enthalpie (△H) des Transfers des
Detergenz-Monomers (D) aus der Mizelle (mi) in Wasser (w) ermittelt werden.
bimiDΔH
Experimentell wird die CMC als reverser Prozess der Mizellisierung durch Injektion
einer mizellaren Lösung des Detergenz in Puffer bestimmt.
Mizelle Monomer
Verteilungs-experiment
Solubilisierungs-experiment
Bilayer
bimiDΔH biw
DΔH
Demizellisierungs-experiment
wmiDΔH
Abb. 1-20: Schema zu den mittels ITC zugänglichen Verteilungsenthalpien
48 Allgemeiner Teil
▪ Die Untersuchung des Verteilungsgleichgewichts zwischen monomerem und
membrangebundenem Detergenz (Verteilungsexperiment) (Heerklotz & Seelig 2000)
liefert die molare Enthalpie des Transfers des freien Monomers aus Wasser (w) in den
Bilayer (bi)
biwDΔH
und den Verteilungskoeffizienten K nach Schurtenberger (Schurtenberger et al. 1985).
Bei diesen Experimenten wird eine submizellar konzentrierte Lösung des Detergenz in
Puffer mit Vesikeln titriert.
▪ Ein Membransolubilisierungsexperiment bei hohen Detergenzkonzentrationen
(Solubilisierungsexperiment) (Keller et al. 1997) basiert auf der Injektion von
Detergenz oberhalb der CMC in eine Vesikelsuspension. Auf diese Weise lassen sich
Phasendiagramme und Phasengrenzen von Lipid-Detergenz-Systemen sowie die
Wärme des Detergenztransfers
bimiDΔH
aus der Mizelle (mi) in den Bilayer (bi) ermitteln.
Ein weiteres Experiment stellt die Umkehrung des Verteilungsexperimentes
(Releaseexperiment) dar, bei dem mit Detergenzanteil hergestellte Vesikel in Puffer injiziert
werden. Auch die Umkehrung der Membransolubilisierung (Formation von gemischten
Bilayern durch Titration von Mizellen mit Vesikeln) wurde experimentell mit der ITC
verfolgt (Heerklotz et al. 1998).
In dieser Arbeit wurde die ITC verwendet um die Einlagerung vom PEG-Lipiden in
Liposomen thermodynamisch zu untersuchen. Dabei wurden alle drei oben aufgeführten
Experimente durchgeführt (vgl. 4.5.3 und 5.3.3).
Zielsetzung 49
2 Aufgabenstellung und Zielsetzung
Die Entwicklung intelligenter Arnzeistoffträgersysteme, die in der Lage sind Wirkstoffe
gezielt an den Wirkort zu transportieren, ist ein Ausgangspunkt auf dem Weg zu effizienteren
und verträglicheren Therapieformen. Eine Möglichkeit, diesem Ziel näher zu kommen, stellt
die Oberflächenmodifikation liposomaler Zubereitungen mit spezifisch auf eine
Zieldeterminante ausgerichteten Vektoren dar.
Die Substanzen, die derzeit für die Kopplung von Liganden an liposomale Oberflächen zur
Verfügung stehen, bedingen aufwendige und nicht universell einsetzbare
Kopplungsprozeduren. Im Rahmen dieser Arbeit sollte herausgearbeitet werden, ob
ethoxylierte Sterole eine Alternative zu den konventionellen Membranankern sind, die heute
zur Funktionalisierung liposomaler Zubereitungen genutzt werden.
Gegenstände der Arbeit waren daher:
▪ Die Untersuchung der Einlagerung der PEG-Sterole in Phospholipid-
vesikel in Abhängigkeit der Membranzusammensetzung bei Raumtemperatur.
Schwerpunkte sollten auf die Ermittlung der Insertionsrate und -geschwindigkeit
sowie auf die Prüfung auf Entstehung von Membrandefekten gelegt werden.
▪ Die Entwicklung und Charakterisierung von chemisch aktivierten PEGylierten
Sterolen. Hier galt es, die Synthese von tresylierten und N-Hydroxysuccinimid
aktivierten Sojasterolen zu entwickeln, zu optimieren und das Kopplungspotential der
Substanzen zu untersuchen.
▪ Die Herausarbeitung und Optimierung eines Protokolls zur Funktionalisierung
liposomaler Oberflächen. Anhand des Modellproteins Rinderserumalbumin (BSA)
sollte eine Methode erarbeitet werden, die eine möglichst einfache, effiziente und
schonende Funktionalisierung von Liposomen verschiedenster Zusammensetzung
erlaubt. Der Einfluss des pH-Wertes, der Proteinkonzentration, der Menge des
eingesetzten aktivierten Lipids, der Lipidzusammensetzung der Membran und der
Reaktionszeit der Kopplungsreaktion sollte im Hinblick auf Kopplungseffizienz,
Größenentwicklung und Membranintegrität näher betrachtet werden.
50 Material und Geräte
3 Material und Geräte
3.1 Lipide und Membrankomponenten
Tabelle 3-1: Lipide und weitere Membrankomponenten
Bezeichnung Qualität Mr
[g/mol]
Abkürzung Bezugsquelle
Cholesterol Ph.Eur. 386,7 Chol Caelo, Hilden
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy-poly(ethylenglycol)-2000]
Potency HPLC
104 %
2805 MPEG2000-DSPE Genzyme Pharmaceuticals, Liestal, CH
Polyethylenglykol--distearolylphosphatidyl-ethanolamin N-hydroxy-succinimidester
0,8 % NHS (m/m) Anteil
3440 DSPE-PEG-NHS Shearwater Polymers Inc., Birmingham, USA
Ei-Phosphatidylcholin > 98 % 780 EPC Lipoid GmbH, Ludwigshafen
ethoxylierte Sojasterole (BPS-30)
GPC gereinigt 1735 BPS
(Handelsname) Nikko Chemicals, Tokio, Japan
ethoxylierte Sojasterole (BPS-20)
GPC gereinigt 1295 BPS
(Handelsname) Nikko Chemicals, Tokio, Japan
hydriertes Soja-Phospatidylcholin
> 98 % 790 HSPC Lipoid GmbH, Ludwigshafen
3.2 Chemikalien
Tabelle 3-2: Chemikalien zur Synthese
Bezeichnung Qualität Mr
[g/mol]
Abkürzung/
Summenformel
Bezugsquelle
ethoxylierte Sojasterole (BPS-30)
GPC gereinigt
1735 BPS Nikko Chemicals, Tokio, Japan
ethoxylierte Sojasterole (Generol E 25)
1515 Generol Cognis, Düsseldorf
p-Maleimidophenyl-isocyanat
> 98% 214,18 PMPI Pierce, Rockford, USA
N,N’-Disuccinimidylcarbonat
> 97% 256,17 DSC Fluka, Buchs, CH
Material und Geräte 51
Bezeichnung Qualität Mr
[g/mol]
Abkürzung/
Summenformel
Bezugsquelle
Polyethylenglykol--distearoylphosphatidyl-ethanolamin N-hydroxy-succinimidester
0,8 % NHS (m/m) Anteil
3440 DSPE-PEG-NHS Shearwater Polymers Inc., Birmingham, USA
Triethylamin HPLC 101,19 TEA Fluka, Buchs, CH
Trifluoressigsäure p. A. TFA Merck, Darmstadt
2,2,2-Trifluorethansulfonsäure-chlorid (Tresylchlorid)
> 97% 182,55 Tresylat Fluka, Buchs, CH
Tabelle 3-3: Verbrauchschemikalien
Bezeichnung Reinheit Mr
[g/mol]
Abkürzung/
Summenformel
Bezugsquelle
Ammoniumheptamolybdat Tetrahydrat
p.a. 1235,9 (NH4)6Mo7O24 x 4 H2O
Merck, Darmstadt
Borsäure > 99,5 % 61,83 H3BO3 Sigma, St. Louis, USA
bovines Serum Albumin
Fraktion V
für die Biochemie
67 kDa BSA Merck, Darmstadt
Calcein p.a. 622,55 C30H26N2O13 Sigma, St. Louis, USA
1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien
> 98 % 232,32 C18H16 Fluka, Buchs, CH
2,2-Dihydroxyhydrinen-1,3-dion (Ninhydrin)
Ph. Eur. 178,15 C9H6O4 Merck, Darmstadt
Dinatriumhydrogen-
phosphat Dihydrat
> 99,5 % 177,96 Na2HPO4 x 2H2O Fluka, Buchs, CH
Ethylendiamintetraessig-säure Dihydrat, Dinatrium Salz
Ph. Eur. 372,2 C10H14N2Na2O8 ·
x 2 H2O
EDTA
Merck, Darmstadt
Fiske-Subbarow-Reducer Fluka, Buchs, CH
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure
> 99,5 % 238,31 C8H18N2O4S
HEPES
C. Roth, Karlsruhe
52 Material und Geräte
Bezeichnung Reinheit Mr
[g/mol]
Abkürzung/
Summenformel Bezugsquelle
L-Hisitidin-HCl Monohydrat
Ph.Eur. 209,63 C6H10ClN3O2· H2O
Histidin-HCl
Merck, Darmstadt
Kaliumdihydrogen-phosphat
> 99 % 136,09 KH2PO4 Fluka, Buchs, CH
Kaliumjodid p.a. 166,01 KJ Merck, Darmstadt
Natriumhydroxid Rotuli p.a. 40,00 NaOH Merck, Darmstadt
Natrium-125Iodid 149,89 Na125I Hartmann Analytik, Braunschweig
Triton® X-100 für Molekular-biologie
576,6 C30H32N4O8 Sigma, St. Louis, USA
Wasserstoffperoxidlösung 30% (m/m)
ACS Qualität
H2O2 Sigma, St. Louis, USA
Tabelle 3-4: Lösungsmittel
Bezeichnung Qualität Bezugsquelle
Chloroform Ph. Eur. C. Roth, Karlsruhe
Dichlormethan p. A.., wasserfrei Fluka, Buchs, Schweiz
Diethylether HPLC, Rotisolv C. Roth, Karlsruhe
Ethanol HPLC, Rotisolv C. Roth, Karlsruhe
Methanol HPLC, Rotisolv C. Roth, Karlsruhe
Tetrahydrofuran p. A, wasserfrei Fluka, Buchs, Schweiz
Wasser (M-Wasser) Elix-Sytem Millipore Simplicity 185 Milli Anlage
Tabelle 3-5: Puffer und wässrige Lösungen
Bezeichnung Abkürzung Bestandteile Zusammensetzung
pH-Wert
Borat Puffer 100 mM BBS 100 Borsäure
NaOH (1N)
6,18 g/l
ad pH 8,4
Borat Puffer 650 mM BBS 650 Borsäure
NaOH Rotuli
40,2 g/l
ad pH 8,0 -9,0
Material und Geräte 53
Bezeichnung Abkürzung Bestandteile Zusammensetzung
pH-Wert
Calcein Lösung 50 mM Calcein
NaOH (1N)
HBS E
311 mg
bis gelöst
ad 10 ml
Puffer für die Free-Flow Elektrophorese
Trennpuffer
Stabilisierungspuffer
Elektrodenpuffer
Na2HPO4 x 2 H2O
KH2PO4
NaOH (1N)
Na2HPO4 x 2 H2O
KH2PO4
NaOH (1N)
Na2HPO4 x 2 H2O
KH2PO4
NaOH (1N)
0,54 g/l
0,27 g/l
ad pH 7,0
5,34 g/l
2,72 g/l
ad pH 7,0
13,5 g/l
6,8 g/l
ad pH 7,0
HEPES Puffer 20 mM HBS HEPES
NaCl
NaOH (1N)
4,76 g/l (20 mM)
7,6 g/l (130 mM)
ad pH 7,4
HEPES Puffer EDTA-haltig HBS E HBS
EDTA
NaOH (1N)
1 l
1,86 g/l
ad pH 7,4
Sörensen Phosphatpuffer
pH 7,4
PBS Kaliumdihydrogen
-phosphat
Dinatriumhydrogen-phosphat Dihydrat
dem. Wasser
KH2PO4 9,08 g/l
(Lösung A)
Na2HPO4 x 2H2O 11,88 g/l
(Lösung B)
808 ml Lösung B
ad 1 l Lösung A
Triton X-100 Lösung Triton X-100 Triton X-100
M-Wasser
10 g
ad 100 ml
54 Material und Geräte
Tabelle 3-6: Organische Lösungen und Detektionsmittel
Bezeichnung Abkürzung Bestandteile Zusammensetzung
Dragendorff Reagenz R DR Basisches Bismutnitrat
Eisessig
KJ-Lösung
dem. Wasser
0,85 g
10 ml
20 ml (400 g/l)
40 ml
Ninhydrin Reagenz R1 NR Eisessig
Ethanol
Ninhydrin
10 ml
50 ml
1g
Schwefelsäure, verdünnte R Schwefelsäure 98%
dem. Wasser
5,5 ml
ad 100 ml
Standardlaufmittel STL Chloroform
Methanol
85 Teile (Volumen)
15 Teile (Volumen)
3.3 Verbrauchsmaterialien
Tabelle 3-7: Verbrauchsmaterialien
Bezeichnung Bezugsquelle
DC-Platten, Kieselgel 60 F254 Merck, Darmstadt
Dialysemembranen, 10 kDa MWCO, high permeability
Diachema, München
Falcon-Röhrchen,
PP-Röhrchen, steril, 15 ml , 50 ml
Greiner-Bio One GmbH,
Frickenhausen
Filter, Minisart 0,22 µm
Celluloseacetatfilter 0,22µm
Sartorius, Göttingen
Iodo-Beads Pierce Rockford, USA
Kieselgel 60 (0,04-0,063 mm) Merck, Darmstadt
LSC Cocktail High Ionic Fluor Packard Bioscience, Groningen, NL
Polycarbonatmembranen, 200 nm, 80 nm Nuclepore GmbH, Tuttlingen
Quantifoil® Carbon Grids Structure Probe, Inc. / SPI Supplies, West Chester, USA
Sephadex G-25 Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden
Material und Geräte 55
Bezeichnung Bezugsquelle
Sepharose CL-4B Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden
Szintillationsmessröhrchen, Mini Vial B C. Roth, Karlsruhe
3.4 Geräte
Tabelle 3-8: Geräte
Bezeichnung Typ Hersteller
Analysenwaage Sartorius Research R180 D-*D1
ACS 211 S
Sartorius AG, Göttingen
Cryotransfer-Einheit Oxford Oxford, GB
Evaporationszentrifuge Concentrator 5301, Eppendorf Eppendorf Netheler Hinz GmbH, Hamburg
Fraktionssammler Retriever 500 (Synthesen)
Frac-100, 200 Fraction Collector
ISCO, Lincoln, USA
Pharmacia Biotech, Uppsala, SUI
Flüssigszintillationszähler Tri-Carb Liquid Scintillation Analyzer 1900 TR
Packard Instrument Company, Meriden, USA
Entgasungsapparatur ThermoVac MicroCal™ Incorporated, Northampton, USA
Gelchromatographiesäulen diverse Gelbettvolumina Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Gefriertrockner Lyovac GT 2
sowie
alpha 2-4 Christ
Finn-Aqua, Santasalo-Sohlberg
GmbH, Hürth
Martin Christ GmbH, Osterode
GPC-Pumpe Persitaltik Pump P1 Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden
Handextruder LiposoFast Avestin Inc. Ottawa, CAN
Heizblock Liebisch SON/D A Gebr. Liebisch, Bielefeld
Laborschüttler Vibramax 100, Heidolph Instruments, Schwabach
Lumineszenzphotometer LS 50B Perkin Elmer, Überlingen
NMR-Spektrometer Varian U-300 Varian, Palo Alto, USA
56 Material und Geräte
Bezeichnung Typ Hersteller
pH-Meter pH Delta 320 Mettler-Toledo, Steinbach
Photonenkorrelations-spektroskop
Zetasizer S
Sofware: Version 1.4.1
Malvern Instruments, Malvern, GB
Titrationskalorimeter VP-ITC 2000 MicroCal™ Incorporated, Northampton, USA
Pipetten Research-Serie
Multipette plus
sowie
Pipetman® P-Serie
Eppendorf AG, Hamburg
Gilson , Middleton, USA
Tischzentrifugen Hermle Z 382K
Biofuge pico
Hermle Labortechnik, Wehingen
Heraeus, Osterode
Transmissionselektronen-mikroskop
Leo 912 Omega
Zeiss, Oberkochem
Ultraschallbäder Sonorex Super RK 255 H Sonorex RK 106 S
Bandelin, Berlin
UV/Vis Spektralphotometer Uvikon 933 A Kroton Instruments, Mailand, I
Wasserbäder WB14
Haake N2
Memmert, Schwabach
Thermo Haake, Hannover
Wasserfiltersystem Simplicity185Milli Millipore, Eschborn
Methoden 57
4 Methoden
4.1 Synthesen
4.1.1 Aufreinigung von BPS-30
Um Nebenreaktionen zu vermeiden und den Reaktionsansatz von Anfang an möglichst
definiert zu gestalten wurden die als Gratisproben bezogenen PEGylierten Sterole vor der
chemischen Aktivierung einem Reinigungsschritt unterzogen.
BPS-30 ist ein auf der Basis von natürlichen Sojasterolen gewonnenes Produkt und daher von
inhomogener Zusammensetzung. Nach Herstellerangaben besteht der Sterolteil aus Sitosterol,
Campesterol und Sigmasterol im Molverhältnis 2:1:1. Die durchschnittliche Kettenlänge des
PEG umfasst 30-EO Einheiten.
Die Zusammensetzung des Generol E 25 entspricht der des BPS-30. Lediglich die Länge der
PEG-Kette variiert und wird vom Hersteller mit durchschnittlich 25 EO-Einheiten angegben.
Neben diesen Hauptkomponenten sind laut Hersteller ca. 2-3 Gewichtsprozent freies PEG
enthalten. Dieses und weitere Verunreinigungen wurden sehr effizient durch mizellare
Abb. 4-1: Zusammensetzung des BPS-30
n=30O
OH
17
17
17
Stigmasterol
Campesterol
Sitosterol
58 Methoden
Chromatographie abgetrennt. Zu diesem Zweck wurde eine Sepharose CL-4B Säule (3 x 10
cm) mit Wasser equilibriert, welches zuvor unter Verwendung der Millipore Simplicity 185
Milli Anlage (M-Wasser) aufbereitet wurde.
5 ml einer BPS-30 Lösung (Konzentration: 100 mg/ml) wurden auf die Säule aufgebracht.
Nach einem Vorlauf von 20-25 ml wurden 2,5 - 5 ml Fraktionen gesammelt. Mittels
Dünnschichtchromatographie (Fließmittel: Chloroform/MeOH 85/15, (V/V); Standard-
laufmittel (STL)), Detektion: Dragendorffs Reagenz (DR)) erfolgte die Untersuchung der
einzelnen Fraktionen auf freies PEG .
Da BPS-30 in größerer Menge kostenfrei zur Verfügung stand, wurde auf eine Optimierung
der Trennung verzichtet. Die gewählte Auftragsmenge erlaubte keine saubere Trennung von
freiem PEG und den PEGylierten Sterolen. Daher enthielten einige Fraktionen neben den
PEG-Sterolen freies PEG. Die Fraktionen, die ausschließlich PEG-Sterole beinhalteten
wurden vereinigt, je 10 - 15 ml in einen Rundkolben eingebracht und nach Einfrieren in
flüssigem Stickstoff gefriergetrocknet.
Die Ausbeute lag bei 200-300 mg an reinem Sojasterol pro Säulengang.
4.1.2 Synthese von tresyliertem BPS
Die Synthese von tresyliertem BPS-30 (BPS-TRE) erfolgte in modifizierter Form nach
Delgado et al (1990): Zu einer Lösung von 520 mg (0,3 mmol) des gereinigten BPS-30 in
10 ml Tetrahydrofuran (THF) wurden 120 µl (0,9 mmol) Triethylamin (TEA) hinzugefügt.
Vor der tropfenweisen Zugabe von 64 µl (0,6 mmol) Tresylchlorid in 5 ml THF unter
Stickstoffatmosphäre wurde die Lösung mittels Eisbad auf 0 °C abgekühlt. Nach der Zugabe
des Tresylchlorids wurde der Ansatz bei RT 4 h gerührt, das ausgefallene
Triethylammoniumchlorid abfiltriert und das Filtrat am Rotationsverdampfer zur Trockene
eingeengt. Der Rückstand wurde in 10 ml Diethylether aufgenommen und über Nacht bei
-27 °C gelagert. Das ausgeflockte Produkt wurde bei -10 °C durch Zentrifugation vom
Überstand getrennt, in Methanol (MeOH) aufgenommen, am Rotationsverdampfer getrocknet
und wiederum in 2-3 ml Chloroform aufgenommen. Die Lösung wurde abschließend über
eine Kieselgel 60 Säule (3,5x10 cm, mobile Phase: Standardlaufmittel (STL)) fraktioniert und
die Produkt-enthaltenden Fraktionen (DC, Dragendorff-Kontrolle) gesammelt. Die
vereinigten Fraktionen wurden am Rotationsverdampfer bei 35 °C eingedampft und über
Nacht am Hochvakuum getrocknet. Das Produkt war ein elfenbeinfarbendes amorphes
Wachs.
Methoden 59
Durch Lösen in einer kleinen Menge MeOH und Abkühlen der zähen Masse bei -75 °C im
Trockeneis/Isopropanol-Gemisch kann es am Hochvakuum mit zwischengeschalteter
Trockenfalle in ein weißes, gut zu handhabendes Pulver überführt werden. Die Ausbeute liegt
bei ~ 300 mg pro Ansatz (~ 60%).
theoretische mittlere Molekularmasse: ~ 1880 g/mol
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5,55 (s, 1H,-C=CH- Sterol), 4,52 (m, 2H, CH2OSO2), 4,22 (q,
2H, 3JH,F = 9.0 Hz, CH2CF3); 3,52-3,58 (m, EO-CH2), 0,68 - 2,5 (m, Sterol-CH)
4.1.3 Synthese von N-Hydroxysuccinimid-aktiviertem BPS
Die Synthese von mit Succinimidylcarbonat aktiviertem BPS-30 (BPS-NHS) erfolgte in
modifizierter Form nach Boden (1998): Zu einer gerührten Lösung von 520 mg (0,3 mmol)
des gereinigten BPS-30 in 15 ml wasserfreiem Dichlormethan wurden 120 µl (0,9 mmol)
TEA und 154 mg (0,6 mmol) N,N’-Disuccinimidylcarbonat (DSC) hinzugefügt. Der Ansatz
wurde 6 h bei RT unter Stickstoff gerührt und eine Umsatzkontrolle durch DC vorgenommen.
Als Fließmittel diente das STL. Die Detektion erfolgte parallel über DR und Ninhydrin
Reagenz (NR). War knapp unterhalb des Ninhydrin positiven Produktflecks noch ein
deutlicher Ninhydrin-negativer, Dragendorff-positiver Fleck erkennbar, wird die Lösung zur
Trockene eingedampft, in MeOH aufgenommen und über Nacht bei -27 °C gelagert. Das
ausgeflockte Rohprodukt wurde durch Zentrifugation in der Kälte vom Überstand getrennt, in
wenigen Millilitern MeOH gelöst, eingedampft und abermals in Dichlormethan
aufgenommen. Die Umsetzung wurde unter gleichen Bedingungen wiederholt. Waren alle
Reagenzien einwandfrei (wasserfreies Dichlormethan, frisches DSC) war die Reaktion nun
quantitativ abgelaufen.
Zur Aufarbeitung des Produktes erfolgte eine zweimalige Präzipitation: Zunächst aus MeOH,
dann aus Diethylether bei -27 °C über Nacht. Anschließend wurde das Rohprodukt wie unter
4.1.2 geschildert mittels Kieselgelchromatographie aufgereinigt und getrocknet. Die Ausbeute
lag bei ~ 300 mg pro Ansatz (~60%).
theoretische mittlere Molekularmasse: 1875 g/mol
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5,55 (s, 1H,-C=CH- Sterol), 4,45 (t, 2H, COOCH2), 3,75-3,78
(m, 4H, COOCH2CH2); 3,52-3,58 (m, EO-CH2), 3,52-3,58 (m, EO-CH2), 2,82 (s, 4H,
succinimidyl), 0,68 - 2,5 (m, Sterol-CH)
60 Methoden
4.1.4 Synthese von p-Maleimidophenylisocyanat-aktiviertem BPS
Die Synthese von p-Maleimidophenylisocyanat aktiviertem BPS-30 (BPS-PMPI) erfolgte in
modifizierter Form nach Annunziato et al. (1993): Zu einer gerührten Lösung von 130 mg
(0,07 mmol) des gereinigten BPS-30 in 5 ml wasserfreiem THF wurden 50 mg (0,23 mmol)
p-Maleimidophenylisocyanat (PMPI) hinzugefügt. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT unter
Stickstoff gerührt und der Fortschritt der Reaktion mittels DC (Fließmittel: STL) sowie UV
Löschung und DR verfolgt.
Da es sich bei BPS-PMPI lediglich um einen ersten Versuchsansatz zur Überprüfung der
Eignung des BPS-PMPI zur Ligandenkopplung handelte, erfolgte die Aufreinigung unter
Verzicht auf die Säulenchromatographie.
Die Reinigung des Rohproduktes war durch Präzipitation aus MeOH und einer weiteren aus
Diethylether jeweils bei -27 °C über Nacht möglich.
theoretische mittlere Molekularmasse: 1935 g/mol
Methoden 61
4.2 CMC- Bestimmungen
Zur Bestimmung der CMC der verschiedenen PEG-Lipide wurden ca. 25 mg
Diphenylhextrien (DPH) in 10 ml THF gelöst und 1ml dieser Stammlösung zu 50 ml
methanolischer Lösung verdünnt. 30 µl dieser Lösung wurden mit einer Glasspritze in
Polystyrol-Halbmikroküvetten eingebracht. Die Küvetten wurden in einen evakuierbaren
Exsikkator überführt und das organische Lösungsmittel zunächst bei 100 mbar (10 min) und
anschließend für am Hochvakuum (1 h) entfernt.
Parallel erfolgte die Herstellung von 10 - 15 Dispersionen der PEG-Lipide in 20 mM HEPES
Puffer pH 7,4 (HBS) im Konzentrationsbereich von 0,05 - 50 µM. Je 2 ml dieser Lösungen
wurden in die vorbereiteten Küvetten pipettiert und die entstandene Dispersion durch
mehrmaliges Aufziehen der Pipette gut durchmischt. Die Dispersionen wurden über Nacht im
Dunklen gelagert und am nächsten Morgen am Fluoreszenzspektrometer (LS 50B, Perkin
Elmer, exc: 370 nm, em: 430 nm, Spaltbreiten je 10 nm) gegen die jeweiligen PEG-Lipid-
Dispersionen ohne DPH vermessen. Als CMC wurde der Schnittpunkt der in
halblogarithmischer Auftragung eingezeichneten Graden zur Beschreibung des Graphen
definiert.
4.3 Liposomenherstellung
Je nach Volumen und Molarität der zu präparierenden Liposomen wurden entweder
Direkteinwaagen der Lipide vorgenommen oder mit Lipidstammlösungen gearbeitet. Um
durch Wägefehler bedingte Diskontinuitäten der einzelnen Präparationen zu vermeiden,
wurden Einwaagen unter 5 mg möglichst vermieden.
Bei der Präparation HSPC-haltiger Lipidkompositionen diente ein Gemisch von
Chloroform/Methanol im Verhältnis von 3:1 (V/V) als Lösungsmittel, ansonsten wurden rein
ethanolische Lösungen verwendet. Für die Verwendbarkeit der Lipidstammlösungen wurden
Lagerungszeiten von ca. einer Woche bei 4 °C, ca. einem Monat bei - 27 °C und bis zu sechs
Monaten bei - 80 °C als vertretbar angesehen.
Hergestellte Liposomendispersionen wurden bei 4 - 7 °C gelagert und innerhalb von einer
Woche verbraucht.
62 Methoden
4.3.1 Lipidkompositionen
Im Rahmen dieser Arbeit wurden hauptsächlich Liposomen mit vier verschiedenen Standard-
Lipidzusammensetzungen gearbeitet. In der folgenden Tabelle sind die Einwaagen für 5 ml
einer 25 mM Liposomendispersion aufgeführt. Sofern bei den entsprechenden Versuchsteilen
nicht anders deklariert, sind die in der Tabelle aufgelisteten Einwaagen und Molverhältnisse
zu Grunde zu legen.
Komposition EPC (mg) HSPC (mg) MPEG (mg) Chol (mg) Verhältnis
PL/Chol(/MPEG)
mol/mol(/mol)
EPC/Chol 4/1 78 9,67 4/1
EPC/Chol 7/3 68,2 14,5 7/3
HSPC/Chol 65,8 16,1 2/1
HSPC/Chol/MPEG 62,5 17,5 15,3 2/1/0,16
Tabelle 4-1: Standardmolverhältnisse und Einwaagen der verschiedenen Liposomenpräparationen (5 ml, 25 mM)
4.3.2 Herstellung durch Extrusion
Die Liposomenherstellung erfolgte, solange nicht anders beschrieben, mittels Filmmethode
und anschließender Handextrusion (1.1.2.2).
Hierzu wurden die Membrankomponenten entweder direkt in einen 100 ml Rundkolben
eingewogen oder als Stammlösung mit einer Glasspritze in den Kolben eingebracht. Die
Lösungen wurden im Wasserbad auf 40 - 45 °C erwärmt und unter reduziertem Druck und
beständiger Rotation bis zur Trockene eingeengt. Der im Rundkolben entstandene Lipidfilm
wurde anschließend mindestens 4 h am Hochvakuum (p < 0,5 mbar) nachgetrocknet, um
Restmengen an Lösungsmittel zu entfernen. Lipidmengen von 5 - 10 µmol wurden
mindestens 30 min nachgetrocknet.
Der vorbereitete Lipidfilm wurde unter Verwendung mehrerer Glaskügelchen durch
kontinuierliches Schwenken oder Rotation am Rotationsverdampfer bei Normaldruck,
suspendiert. Das Volumen des Puffers wurde so gewählt, dass eine MLV-Dispersion der
gewünschten Lipidkonzentration entstand. Bei Präparation HSPC-haltiger Liposomen wurde
Methoden 63
der Puffer während der Herstellung der MLV Dispersion auf 60 - 65° C erhitzt (> Tc HSPC).
Durch wiederholte Extrusion durch Polycarbonatmembranen mit einer Porengröße von 80
oder 200 nm wurde die inhomogene MLV-Dispersion in eine homogene, nahezu unilamellare
Liposomenpopulation überführt. In der Regel wurden 21 Extrusionsschritte durchgeführt. Die
hohe Anzahl an Membranpassagen gewährleistet eine effiziente Reduktion der Lamellenzahl
der Vesikel, die ungerade Anzahl garantiert, dass der gesamte Ansatz die Membran passiert
hat.
Die Extrusion von auf HSPC basierenden Liposomen wurde bei 65 °C im Wasserbad
vorgenommen. Als Kriterium für eine ausreichende Anzahl an Extrusionszyklen wurde der
Polydipersitätsindex (PI) auf Basis der Partikelgrößenbestimmung mittels PCS (vgl. 4.4.1)
herangezogen.
4.4 Charakterisierung der Liposomendispersionen
4.4.1 Messung der Größenverteilung durch PCS
Zur Bestimmung der durchschnittlichen Partikelgröße und zur Ermittlung eines Parameters
zur Beschreibung der Güte der Partikelgrößenverteilung wurden PCS Messungen (vgl. 4.4.1)
mit dem Malvern Zetamaster S durchgeführt. Das Gerät arbeitet mit einem Diodenlaser mit
einer Wellenlänge von 670 nm und misst die Fluktuationen des Streulichtes in einem fixen
Winkel von 90°. Als Maß für den durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser der
Liposomen wurde der von der Software unter Standardeinstellungen ermittelte z-Average (z-
Av) als Qualitätsparameter für die Größenverteilung unter gleichen Bedingungen der PI
herangezogen.
Der Hersteller gibt an, dass bei einem PI von < 0,1 von einer monomodalen Probe gesprochen
werden kann, während PI-Werte von > 0,3 Kennzeichen einer sehr breit verteilten,
inhomogenen Probe sind. Daher wurde bei der routinemäßigen Kontrolle der
Liposomendispersionen ein PI von < 0,2 als Minimum für eine weitere Verwendung der
Liposomen festgelegt. Zur Bestimmung von PI und z-Av wurde die zu analysierende Probe so
verdünnt, dass die für das Gerät als optimal beschriebene Messsignalfrequenz von 50 000 -
200 000 Impulsen pro Sekunde eingehalten wird. Da die Intensität des vermessenen
Streulichtes in der sechsten Potenz mit dem Durchmessers der Partikels zusammenhängt, ist
auf eine schwebstofffreie Probe zu achten. Daher wurden die zur Verdünnung der Proben
verwendeten Puffer zunächst durch Membranfilter mit einer deklarierten Porengröße von
64 Methoden
0,22 µm filtriert. Um osmotische Phänomene mit Auswirkungen auf z-Av und PI zu
vermeiden, wurden zur Verdünnung der Vesikeldispersionen stets die gleichen Puffer
verwendet, die auch zu ihrer Herstellung benutzt wurden. Die Messung selbst erfolgte bei RT
in Polystyrolküvetten. Pro Probe wurden 3 Hauptmessungen (bestehend aus 15
Untermessungen) zu je 300 sec durchgeführt.
4.4.2 Bestimmung des Phosphatgehalts nach Bartlett
Als Routinemethode zur Quantifizierung des PL-Gehaltes einer Liposomenpräparation wurde
die photometrische Bestimmung der Konzentration von Phospholipiden über den
Phosphorgehalt (Bartlett 1959) herangezogen.
Die Methode beruht auf der oxidativen Veraschung einer phosphathaltigen Probe, bei der das
organisch vorliegende Phosphat eines PL in anorganisches überführt wird. Über eine
Farbreaktion lässt sich der genaue PL-Gehalt einer Probe spektroskopisch erfassen.
Um Einschleppen von Fremdphosphor zu vermeiden ist bei der Durchführung des Assays
darauf zu achten, das alle Gerätschaften phosphatfrei gespült und zur Herstellung der
Abb. 4-2: Kalibrationsreihe einer Bartlett - Phosphatbestimmung
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5Y = A + B * X
Parameter Value Error------------------------------------------------------------A -2,39072E-4 0,0015B 5,48942 0,00662------------------------------------------------------------
R2 SD N P------------------------------------------------------------0,99997 0,00231 6 <0.0001------------------------------------------------------------
Abs
orpt
ion
Phosphor [µmol]
Methoden 65
benötigten Lösungen sowie für den letzten Spülschritt ausschließlich mit der Millipore®-
Anlage aufbereitetes Wasser (M-Wasser) verwendet wird. Zum Ausschließen von
Pipettierfehlern werden Proben und Kalibratoren als Doppelwerte direkt in austarierte
Reagenzgläser pipettiert und ausgewogen.
Zur Erstellung der Kalibrationsfunktion werden 0, 50, 100, 200, 300 und 400 µl einer 1 mM
Phosphat-Standardlösung verwendet. Die Probe wird, falls nötig, auf einen Phosphorgehalt
von maximal 10 µg eingestellt. Dabei wird zu Grunde gelegt, dass ca. 4% der eingesetzten
PL-Masse durch den organisch gebundenen Phosphor gestellt werden. Daraus ergibt sich für
eine 20 mM PL-Zubereitung ein Probenvolumen von ca. 15 µl.
Nach Einwiegen der Proben und Kalibratoren werden alle Ansätze mit 500 µl 10 N H2SO4
versetzt nach kurzem Vortexen über 3 h bei 160 °C im Heißluftschrank verascht, in der Folge
140 µl einer 30%igen (V/V) H2O2 Lösung zugegeben und die Ansätze weitere zwei Stunden
bei 160 °C inkubiert.
In der Zwischenzeit kann die Herstellung einer 0,22%igen (m/V) Ammoniummolybdat- und
einer 14,8%igen (m/V) Fiske-Subbarow-Reducer Lösung erfolgen. Nach Beendigung des
zweiten Inkubationsschrittes werden zunächst 4,6 ml der Ammoniummolybdatlösung und
anschießend 200 µl Fiske-Subbarow-Reducer hinzupipettiert und gevortext. Die
Reagenzgläser werden mit Murmeln verschlossen und im Heizblock 10 min lang auf 95 °C
erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur erfolgt die spektralphotometrische Vermessung
bei einer Wellenlänge von 830 nm gegen den Leerwert.
Die Standardproben liefern die Kalibrationsfunktion, mit welcher die Phosphorkonzentration
der Proben berechnet wird. Bei phosphatfreien Puffern und Verwendung der in dieser Arbeit
benutzten PL ist diese gleich der ermittelten Phosphatkonzentration.
War außer der PL-Komponenten Chol als Membranbestandteil enthalten, wurde der auf
Grundlage des Phosphorgehalts bestimmte Faktor zur Berechnung der
Gesamtlipidkonzentration der Präparation genutzt.
4.4.3 Cryo-TEM
Die elektronenmikroskopischen Arbeiten wurden von A. Kimpfler durchgeführt. Die unten
angeführte Beschreibung der Probenvorbereitung orientiert sich an dem relevanten Kapitel
ihrer Dissertation (Kimpfler 2003).
66 Methoden
Ein Tropfen der Präparationen wurde mit Hilfe einer Pipette auf ein Kupfernetzchen
(Durchmesser 5 mm) aufgetragen. Die Kupfergrids wurden entweder vor dem Gebrauch mit
einem Kohlelochfilm präpariert oder bereits mit einem Kohlelochfilm versehen vom
Hersteller bezogen (Quantifoil®).
Die überschüssige Flüssigkeit wurde mit einem Streifen Filterpapier abgezogen, die Probe in
flüssiges Ethan (90 K) getaucht und schockgefroren. Das Absaugen führt zur Bildung eines
sehr dünnen (< 1µm) amorphen Wasserfilms. Daher ist ein rasches Einfrieren des Materials
nötig, um Kristallbildung von Wasser und Auskristallisieren von Puffersalzen zu vermeiden.
Außerdem wird damit das Verdunsten von Wasser und damit die Entstehung von Artefakten
(z.B. Einschnürungen) durch osmotische Effekte minimiert. Die geringe Höhe des
Untersuchungsmaterials nach dem Absaugen hat zur Folge, dass große Probestandteile mit
dem überschüssigen Medium entfernt werden.
Die tiefe Temperatur des Ethans wurde durch Kühlung mit flüssigem Stickstoff in einer Cryo-
Präparationskammer erreicht. Nach dem Einfrieren wurde überschüssiges Ethan abgestreift
und die Probe mittels eines Oxford-Cryo-Stabes unter Spülung mit kaltem N2-Gas in das
Elektronenmikroskop transferiert, welches ebenfalls mit flüssigem Stickstoff auf ca. 90 K
gekühlt wurde.
Nach der Fokussierung wurde die Aufnahme des gewünschten Bildausschnittes mit einer
Belichtungszeit von 1,0 ms getätigt. Die Bildausschnitte konnten in verschiedenen
Vergrößerungen bis zu 50 000-fach digital abgespeichert werden. Anhand der Bilder konnten
die Liposomen nach Größen und Lamellaritäten ausgezählt werden.
Methoden 67
4.5 Einlagerungsverhalten von ethoxylierten Sojasterolen in
vorgefertigte Liposomen
4.5.1 Überprüfung der Separation von Mizellen und Liposomen mittels Dünnschichtchromatographie
Ein Teil der Untersuchungen zum Einlagerungsverhalten von BPS-Derivaten in Liposomen
beruht auf gelpermeationschromatographischen Trennungen (GPC-Trennungen). Da die in
4.5.2 durchgeführten Experimente in Konzentrationsbereichen oberhalb der CMC der PEG-
Lipide stattfanden, war eine Koelution von Liposomen und Mizellen zu befürchten.
Um zu überprüfen, ob eine saubere Trennung von liposomal gebundenem und freiem PEG-
Lipid über eine Sepharose CL-4B Säule (1,5 x 12 cm, äquilibriert mit 50 mM NaCl in
M-Wasser, Peristaltic Pump P1) möglich war, wurden Proben der einzelnen Ansätze
unmittelbar nach Zugabe der PEG-Lipide zu den Liposomen fraktioniert (Vorlauf ca. 2 min,
Fraktionsgröße ca. 500 µl) und dünnschichtchromatographisch untersucht. 5-10 µl der
einzelnen Fraktionen wurden mehrmals auf eine Kieselgel 60 Aluminiumfolie aufgebracht.
Als Laufmittel diente das Standardlaufmittel (STL). Zur Visualisierung der Flecke wurde die
DC-Platte kurz in 10 N Schwefelsäure getaucht und mit dem Heißluftföhn erhitzt. Zur
Detektion von MPEG2000-DSPE diente DR.
4.5.2 Einlagerungskinetik und Transfer Raten
Zur vergleichenden Untersuchung der Einlagerung von MPEG2000-DSPE und BPS-30 in
Lipidmembranen unterschiedlicher Komposition wurden Liposomen der Zusammensetzungen
EPC/Chol 7/3, HSPC/Chol und HSPC/Chol/MPEG (vgl. Tabelle 4-1, Seite 62) in HEPES-
Puffer pH 7,4 (HBS) mittels Extrusion durch 80 nm Membranen hergestellt (c (Lipid):
50 mM). Bei der Präparation der Liposomen wurden hohe Anforderungen an den PI der
Liposomen gestellt (< 0,1) um sicherzustellen, dass bei allen Präparationen möglichst
unilamellare Liposomen verwendetet wurden. Da das Ausmaß der Einlagerung im Sinne der
Verteilung als Funktion des verfügbaren Lipids vermutet wurde ist bei Liposomen mit
mehreren Lamellen eine geringere absolute Einlagerungsmenge zu erwarten.
Von beiden PEG-Lipiden wurde eine Stammlösung der Konzentration 10 mg/ml in
50 mM NaCl in M-Wasser hergestellt. Für die Erstellung einer Kalibrationsfunktion wurden
68 Methoden
je 200 µl der 50 mM Liposomendispersionen eingewogen und mit unterschiedlichen Massen
der beiden PEG-Derivat-Lösungen gemischt, so dass die Menge an zupipettetiertem PEG-
Lipid zwischen 0,07 und 10 mol% bezogen auf das Gesamtlipid (GL) lag. Die Kalibratoren
wurden mit NaCl Lösung (50 mM, M-Wasser) auf 1,5 g aufgefüllt, gefriergetrocknet, in
deuteriertem Chloroform aufgenommen und mittels 1H NMR vermessen.
Bei Auftreten von Peakverbreiterungen durch ausgefallenes NaCl und daraus resultierenden
Schwierigkeiten bei der Festlegung der Integrationsgrenzen wurde dieses durch einen
Zentrifugationsschritt (Eppendorfcup, Biofuge pico, 5000 U/min, 30 sec) abgeschieden.
Die NMR Daten wurden mit der Software “Mestre-C“ Fourier-transformiert und nach
automatischer Phasen- und Basislinienkorrektur integriert.
Die Kalibrationsfunktion ergab sich aus dem Verhältnis der Peakfläche der Protonen der
PEG-Kette (3,57-3,67 ppm) zu der der Cholin-Methyl-Protonen der Phospholipide
(3,3-3,45 ppm) (Rostin et al. 2000; Sou et al. 2000). Die Berechnung der molaren
Zusammensetzung der einzelnen Kalibratoren erfolgte auf Basis der mittels Bartlett-Assay
bestimmten Phospholipidgehalte der Lipiddispersion unter Berücksichtigung ihrer Einwaagen
und der zupipettierten Massen der entsprechenden PEG-Lipid Lösung (vgl. Abb. 5-5).
3,70 3,65 3,60 3,55 3,50 3,45 3,40 3,35 3,30
9,59 mol%7,22 mol%
4,73 mol%2,84 mol%
0,89 mol%
ppm
Abb. 4-3: 1H NMR Daten zur Aufstellung der Kalibrationsfunktion zur Einlagerung von BPS-30 in EPC/Chol 7/3
Methoden 69
Zur Ermittlung der Einlagerungskinetik und des molaren Anteils an liposomal assoziiertem
PEG-Lipid nach Gleichgewichtseinstellung wurde je 1 ml (50 µmol Lipid) der Liposomen-
präparationen im Wasserbad auf 21 0,5 °C temperiert. Es erfolgte die Zugabe von 500 µl
einer PEG-Lipid Lösung in HBS, die 7,5 mol% der PEG-Lipide (4,054 µmol) in Bezug auf
das Gesamtlipid (inklusive der PEG-Lipide) enthielten. Nach festgelegten Zeiten wurden
Proben von 300 µl entnommen, auf eine Sepharose CL-4B Säule aufgebracht und fraktioniert,
wobei nicht liposomal gebundenes PEG-Lipid von liposomalem getrennt wurde.
Die opaleszenten Lipid-enthaltenden Proben wurden vereinigt, wobei die letzten lipidhaltigen
Proben verworfen wurden, um ein Einschleppen von freiem PEG-Lipid in die liposomalen
Fraktionen zu vermeiden. Die gepoolten Lipidfraktionen wurden entsprechend den
Kalibratoren auf 1,5 g eingestellt und entsprechend prozessiert.
4.5.3 Isotherme Titrationskalorimetrie zur Untersuchung der Interaktionen von PEGylierten Sterolen mit Liposomen
Die ITC-Versuche wurden unter Anleitung von PD Dr. H. Heerklotz in der Abteilung für
Biophysikalische Chemie des Biozentrums in Basel (Leitung: Prof. J. Dr. Seelig)
durchgeführt.
Alle verwendeten Liposomen wurden durch Extrusion durch Polycarbonatmembranen mit
einer Porenweite von 80 nm hergestellt und die Lipidkonzentration nach einem Bartlett-
Phosphatassay (vgl. 4.4.2) auf die gewünschte Konzentration eingestellt. Als Puffersystem
diente ein HBS-Puffer mit einer Kochsalzkonzentration von 100 mM und einem pH-Wert von
7,4. Zur Vermeidung von Wärmetönung durch pH-Effekte wurden sowohl die
Liposomendispersionen, als auch die PEG-Lipid-Lösungen in dem gleichen Puffer hergestellt.
Alle Lösungen wurden vor Gebrauch bei 45 °C entgast (ThermoVac, Microcal) und unter
Vermeidung von Luftblasen in die mehrmals mit Puffer und einmalig mit dem Füllgut
gespülten Zellen des Titrationskalorimeters (VP-ITC 2000, MicroCal™) eingebracht. Die
Referenzzelle enthielt stets die gleiche Lösung wie die Messzelle. Beim Befüllen der
computergesteuerten Injektionseinheit wurde darauf geachtet, dass keine Luftblasen in das
System gelangten und der als Rührer dienende abgeflachte Spritzenkopf gut gereinigt wurde.
Obwohl in allen Versuchen dieser Arbeit BPS-30 bzw. Generol E-25 zum Einsatz kam, wurde
in dieser Versuchsreihe auf BPS-20 zurückgegriffen, das mit einer CMC von ca. 8 µM (9 µM
eigene Messung mittels DPH-Methode, vgl. 4.2, Literaturwert 7 µM (Folmer & Svensson
70 Methoden
1999)) günstigere Eigenschaften für die Messungen aufwies. Gerade die Bestimmung des
Verteilungskoeffizienten nach Schurtenberger (Schurtenberger et al. 1985) im
Verteilungsexperiment sollte mit submizellaren Lösungen durchgeführt werden, damit die
vermessenen Wärmen ausschließlich aus der Einlagerung des freien Monomers in die
Membran resultieren und nicht durch Demizellisierungswärmen überlagert werden. Trotz der
hohen Sensitivität des Gerätes (unter optimalen Bedingungen sind Reaktionswärmen bis
1 µcal messbar; entsprechend einer Temperaturänderung 10-6 K bei 1ml Volumen), ist beim
Verteilungsexperiment aufgrund des geringen Stoffmengentransports die auftretende
Wärmetönung so schwach, dass die Messungen, auch bei der Verwendung von BPS-20, an
der Leistungsgrenze des Gerätes erfolgten. Ein Teil der Messungen wurde bei 50 °C
durchgeführt, da sich bei dieser Temperatur bessere Messsignale erhalten ließen.
Die Auswertung der Rohdaten erfolgte über MicroCal Origin Version 5 mit entsprechendem
VP-ITC Plug-In unter Vernachlässigung des ersten Peaks, da das dem Gerät vorgegebene
Volumen der ersten Injektion durch das Reinigen der Injektionsspritze nicht genau mit dem
tatsächlich injizierten Volumen übereinstimmt.
4.5.3.1 Demizellisierungsexperiment
Für das Demizellisierungsexperiment wurden beide Zellen mit Puffer beschickt und die
computergesteuerte Spritze mit einer 1 mM BPS-20 Lösung befüllt. Nach einmaliger
Injektion von 1 µl erfolgten jeweils Injektionen von 5 µl.
4.5.3.2 Verteilungsexperiment
Das Verteilungsexperiment (vgl. 1.3.2) dient der direkten Messung der Wärmeenthalpie bei
der Einlagerung des Detergenz in die Liposomenmembran. Experimentell wurde so
vorgegangen, dass Mess- und Referenzzelle mit einer BPS-20 Lösung unter der CMC (4 µM
bzw. 8 µM) gefüllt wurden. Nach der Equilibrierung der Zelltemperatur auf 25 oder 50 °C
wurde die Messung automatisch gestartet. Das Injektionsvolumen betrug 3 - 5 µl. Die
Lipidkomposition der verwendeten Vesikel war EPC/Chol 4/1.
Auch für MPEG2000-DSPE wurden Verteilungsexperimente durchgeführt. Hier wurden
EPC/Chol 4/1-Liposomen verwendet und die Lösungen wurden auf 60 °C erhitzt bevor mit
den Messungen begonnen werden konnte. Außerdem lag die Konzentration der verwendeten
Methoden 71
PEG-PE Lösung oberhalb der selbst ermittelten CMC (vgl. 4.2), jedoch unter dem in
Sou et al. (2000) angegebenen Wert. Diese Kompromisse mussten eingegangen werden, um
überhaupt messbare Signale zu erhalten.
Die Auswertung erfolgte unter Annahme der Gültigkeit des Verteilungskoeffizienten nach
Schurtenberger, der die vermessenen Werte besser beschrieb als der
Molenbruchverteilungskoeffizient P (Tanford 1980).
f,D0b,D
f,D0b,D CK
CC
bzw. CKn
n
LL
Gleichung 4-1
Dabei ist:
nD,b Stoffmenge des Detergenz im Bilayer
nL0 Stoffmenge des Lipids
K Verteilungskoeffizient nach Schurtenberger
CD,f Konzentration des freien Detergenz
CD,b = nD,b / V mit V gleich dem Volumen der Zelle
CL0=nL
0 / V mit V gleich demVolumen der Zelle
Die Konzentration des freien Detergenz (CD,f) ergibt sich aus der Differenz des gebundenen
(CD,b) und der Gesamtmenge (CD0) des in der Lösung befindlichen Detergenz
(CD,f = CD0 - CD,b). Daraus ergibt sich für den Verteilungskoeffizienten K:
0L
0L0
Db,D KC1KCCC
Gleichung 4-2
Die Verteilungswärme (hi), die bei der i-ten Injektion des Lipids beobachtet werden kann, ist
abhängig von:
der Transferenthalpie biwDΔH und
der Stoffmenge (nD,b(i)) des Detergenz, das bei der i-ten Injektion aus der Lösung
in die Membran wandert (bzw. volumenbezogen von △CD,b(i) · Vcell).
72 Methoden
Die vermessene Verteilungswärme der Injektionen nimmt bei Zunahme der Lipidmenge in
der Zelle in dem Maße ab, wie sich weniger Detergenz in die Membran einlagern kann. Es
gilt:
cell)i(b,D
biwDi VCHh Gleichung 4-3
Die Ableitung des Ausdrucks für den Verteilungskoeffizient nach Schurtenberger
(Gleichung 4-1)
0L20
L
0D
)i(b,D C
)CiK1(KCC
Gleichung 4-4
liefert zusammen mit Gleichung 4-3
cell0L20
L
0D
biWDi VC
)CiK1(KCHh
Gleichung 4-5,
die die Änderung der Menge (Konzentration) des gebundenen Detergenz bei Änderung des
Lipidgehalts in der Zelle um CL0 beschreibt.
Die beobachtete Wärme (qobs) einer Injektion ergibt sich damit zu:
molkJ
)CiK1(KCH
CVhq 20
L
0D
biWD0
Lcell
iobs
Gleichung 4-6
Die Änderung der Wärmen hi der Injektionen ergibt sich direkt aus der Integration der
Rohdaten. Da die Änderung der Konzentration CL0 bei bekanntem Volumen der Zelle und
bekannter Lipidkonzentration ebenfalls bekannt ist, kann der Fit eines Plots von hi gegen CL0
zur gleichzeitigen Bestimmung des Verteilungskoeffizienten nach Schurtenberger und zur
Bestimmung der molaren Transferenthalpie biwDΔH herangezogen werden.
Die Funktion wurde unter Einführung eines weiteren Parameters zur Beschreibung der
Verdünnungswärme bei bereits vollständiger Insertion des PEG-Lipids und eines Faktors γ
zur Korrektur des zur Einlagerung zur Verfügung stehenden Lipidanteils (hier aufgrund
gleicher Lipidanzahl im inneren und äußeren Monolayers, des auszuschließenden Flippflopps
der PEG-Lipide unter Annahme von unilamellaren Vesikeln gleich 0,5 gesetzt) in Origin 5
implementiert und zur Bestimmung von K und biwDΔH genutzt.
Methoden 73
4.5.3.3 Solubilisierungsexperiment
Für die Untersuchung der Solubilisierung von EPC-Membranen durch BPS-20 wurde eine
46,6 mM Lösung des PEG-Sterols in Puffer hergestellt. Diese wurde bei 50 °C zu einer 5 mM
EPC Liposomendispersion ohne Cholesterolanteil titriert.
4.5.4 Membran-Leakage während der BPS-30 Einlagerung
4.5.4.1 Freisetzung unterhalb der CMC
Um die Freisetzung hydrophiler Substanzen aus dem Liposomeninnenraum, induziert durch
die Einlagerung von BPS-30 in den äußeren Monolayer zu untersuchen, wurden Lipidfilme
(EPC/Chol 7/3, HSPC/Chol, MPEG/HSPC (Tabelle 4-1, Seite 62)) mit einer 50 mM Calcein
Lösung in EDTA-haltigem HBS (5 mM EDTA in HBS, (HBS E)) suspendiert
(Endkonzentration des Lipids: 50 mM).
Die MLV wurde drei Frier-Tau Zyklen unterzogen und freies Calcein über eine GPC Säule
(Sepharose CL-4B, 1,5 x 12 cm, Elutionsmittel HBS E, pH 7,4) abgetrennt, die
Liposomenfraktionen vereinigt und auf 1,5 mM Lipid verdünnt.
5 - 10 µl (7,5 - 15 nmol Lipid) der Liposomendispersionen wurden in einer Polystyrolküvette
mit 3 ml HBS E-Puffer gemischt. Die verschiedenen Volumina waren Folge der
differierenden Verkapselungseffizienzen zwischen den einzelnen Chargen und
Lipidkompositionen und wurden gewählt, um einen maximalen Fluoreszenzanstieg nach
Zerstören der Liposomen zu erzielen.
Nach Basislinienäquilibrierung erfolgte die Zugabe von 1-50 mol% BPS-30
(0,075 - 3,75 nmol; 0,13 - 6,5 µg bei 10 µl Liposomen) in Bezug auf das Gesamtlipid, wobei
das Volumen dem der Liposomendispersion entsprach.
Die Einlagerung des BSA-BPS-Konjugats wurde entsprechend verfolgt, wobei der BPS
Anteil (vorliegend als Konjugat mit BSA (vgl. 4.5.4.2)) 7,5 mol% betrug.
Das BPS-BSA-Konjugat wurde am Vortag in einem BPS-TRE gecoateten
Eppendorfreaktionsgefäß durch Zugabe eines BSA-haltigen (c = 2 mg/ml) Boratpuffers
(100 mM, pH 8,4, BBS 100) vorbereitet. BSA selbst hatte keinen signifikanten Einfluss auf
die Membranpermeabilität.
Der bei der Einlagerung des Sterol-PEG in die Liposomenmembran freigesetzte Calcein
74 Methoden
Anteil ließ sich über die Änderung der Fluoreszenz bestimmen. Dazu wurde diese mit Hilfe
eines Fluoreszenzspektrometers (LS 50B, Perkin Elmer, exc: 470 nm, em: 510 nm,
Spaltbreiten je 5 nm, Messinterval 15 sec, Integrationszeit: 1 sec), über einen Zeitraum von
ca. 1 h bei einer Temperatur von 21 ± 0,5 °C unter konstantem Rühren verfolgt. Zur
Bestimmung der maximalen Fluoreszenzintenstät, entsprechend 100% Freisetzung des
gequenchten Calceins, wurden die Liposomen durch Zugabe von 10 µl Triton X-100 (10 % in
M-Wasser; m/m) zerstört. Weder Triton noch BPS haben unter den gewählten Anregungs-
und Emissionswellenlängen Einfluss auf die Fluoreszenzmessungen. Die basale Freisetzung
von Calcein aus den verschiedenen Liposomenspezies war über einen Zeitraum von 6 h
vernachlässigbar und brauchte daher bei der Bestimmung der Freisetzung des Calceins durch
das Sterol-PEG nicht weiter berücksichtigt werden.
Die prozentuale Calcein-Freisetzung wurde berechnet nach:
100 IIIICalcein %
0
0tfrei
Gleichung 4-7
It Fluoreszenzintensität der Probe nach BPS-Zugabe
I∞ Fluoreszenzintensität nach Tritonzugabe
I0 theoretische Fluoreszenzintensität vor BPS-Zugabe
Die zur Berechnung zu Grunde gelegten Fluoreszenzintensitäten stellen hierbei die
Mittelwerte der letzten 5 - 10 Einzelmessungen dar (vgl. Kästen in Abb. 4-5). Der
Korrekturfaktor (1,003 - 1,005), der sich aus der Verdünnung des Ansatzes durch die Zugabe
von Triton X-100 ergibt, wurde bei der Berechnung der prozentualen Freisetzung aufgrund
seines vernachlässigbaren Einflusses außer Acht gelassen.
Methoden 75
Abb. 4-5: Freisetzung von Calcein aus HSPC/Chol Liposomen bei Zugabe von 50 mol% BPS-30; Anstieg der Fluoreszenz durch Dequenching
großer Graph:
Gesamtverlauf eines Freisetzungsversuchs
Ausschnitt: Freisetzung bei Zugabe von
■ 50 mol%
● 15 mol%
▲ 7,5 mol%
BPS-30 zu HSPC/Chol Liposomen
0 10 20 30 40 50 60 700
100
200
300
400
500
600
700
0 10 20 30 40 50 6030
40
50
60
70
Fluo
resz
enzi
nten
sitä
t
Zeit [min]
I0 It
I
BPS-Zusatz
Triton-Zusatz
0 2 4 6 8 10 12 14
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Fluo
resz
enzi
nten
sitä
t
c Lipid [nM]
durchgezogene Linie:
Liposomen zerstört
━■━ EPC/Chol 7/3
━●━ HSPC/Chol ━▲━ HSPC/Chol/MPEG
gestrichelte Linie:
Liposomen intakt
┄□┄ EPC/Chol 7/3
┄○┄ HSPC/Chol
┄△┄ HSPC/Chol/MPEG
Abb. 4-4: Linearität des Messbereichs zur Bestimmung der BPS-30 induzierten Calcein Freisetzung
76 Methoden
Für die Gültigkeit der aufgestellten Beziehung ist ein linearer Zusammenhang der
Fluoreszenzintensität innerhalb des Messbereichs erforderlich. Der Nachweis der Linearität
konnte über die Erstellung einer Verdünnungsreihe aus einer Probe, die 20 µl
(1mM oder 1,5 mM bei HSPC/Chol/MPEG) der entsprechenden Liposomenpräparation
enthielt, durch Vermessen vor und nach Zerstören mit 20 µl Triton X-100, erbracht werden
(vgl. Abb. 4-4).
4.5.4.2 Freisetzung oberhalb der CMC
Die starke Verdünnung der Liposomen, die für eine direkte Vermessung des freigesetzten
Anteils an Calcein notwendig war, führte zu BPS-Konzentrationen unterhalb der CMC.
Zusätzlich wurden auch Versuche durchgeführt, die das Leakageverhalten oberhalb der CMC
zum Gegenstand hatten.
Um die Calcein-Freisetzung oberhalb der CMC des BPS verfolgen zu können, müssen
entsprechend höhere Lipidkonzentrationen eingestellt werden. Da in den Kopplungsversuchen
meist mit 7,5 mol% Anker gearbeitet wurde, sollte dieser Anteil nun mizellar angeboten
werden. Dabei sollten die Einlagerungsbedingungen möglichst nahe an den tatsächlichen
Kopplungsbedingungen angelehnt sein. Daher wurde zur Untersuchung des
Freisetzungsverhaltens von Calcein aus Liposomen in Anwesenheit von BPS Mizellen wie
folgt vorgegangen:
Es erfolgte die Präparation von EPC/Chol 7/3 Liposomen analog 4.5.4.1.
Nach dem Abtrennen des freien Calceins wurde eine Konzentration von 10 mM GL
eingestellt (HBS E), bei der die direkte Verfolgung der Calcein-Freisetzung aufgrund der
hohen Fluoreszenzintensität nicht mehr möglich war. 250 µl der Liposomenpräparation
wurden wahlweise mit 125 µl HBS E (Blindwert) oder 125 µl BPS-haltigem HBS E versetzt.
Die Stoffmenge BPS in den 125 µl entsprach 7,5 mol% des GL in der Probe (Lipid: 2,5 µmol;
BPS: 0,203 µmol, 352 µg; Endkonzentration BPS ~ 540 µM). Aus beiden
Liposomendispersionen (BPS-haltig, nicht BPS-haltig) wurden nach einer Inkubationszeit von
mindestens 30 min 2µl - Proben entnommen und am Fluorimeter vermessen (Bedingungen,
Wellenlängen, Spaltbreiten analog 4.5.4.1, single read Modus, Integrationszeit 10 sec).
Die Proben der jeweiligen Liposomendispersionen wurden mit 3000 µl HBS E gemischt,
vermessen, mit 10 µl Triton zerstört und abermals vermessen.
Methoden 77
Die Grundfluoreszenz I0 ist bei den BPS-haltigen Proben nicht direkt zugänglich, da mit dem
Zusatz des PEG-Lipids zur Liposomendispersion die Freisetzung des Calceins begann. Zur
Ermittlung des freigesetzten Calceinanteils unter Berücksichtigung des (bei 2µl
Probenvolumen erheblichen) Pipettierfehlers konnte wie folgt vorgegangen werden:
Mindestens zehn 2 µl Proben des Leerwertes wurden wie oben beschrieben jeweils vor und
nach Tritonzugabe vermessen.
Da innerhalb des Messbereiches die Linearität gewährleistet war (vgl. Abb. 4-4), ließ sich auf
Grundlage dieser Leerwerte aus den einzelnen Messpaaren ein mittlerer Faktor (FI) für die
Fluoreszenzzunahme durch Tritonbehandlung der Liposomen errechnen. Dieser ergab sich
aus dem Mittelwert der Quotienten aus der Fluoreszenzintensität vor und nach der Zerstörung
der Liposomen:
1
n n10I I
In1F Gleichung 4-8
n Anzahl der Messungen
I∞ Fluoreszenzintensität nach Tritonzugabe
I0 Fluoreszenzintensität vor Tritonzugabe
FI mittlerer Fluoreszenzintensitätsfaktor
Da BPS keine Eigenfluoreszenz im Messbereich aufweist konnte dieser Faktor zur
Bestimmung der theoretischen Fluoreszenzintensität (I0t) der BPS-haltigen Proben
herangezogen werden.
Aus den aufgrund des Pipettierfehlers variierenden Messwerten nach Zerstörung der
Liposomen (I∞ ) lässt sich mit Hilfe der Faktors FI auf die theoretische Grundfluoreszenz (I0t)
zum Zeitpunkt Null bei Zugabe des BPS zu der Probe zurückrechnen.
It0 F
II Gleichung 4-9
78 Methoden
Die Berechnung des freigesetzten Calceinanteils ergibt sich nun analog zu Gleichung 4-7
wobei I0 durch I0t ersetzt wird.
100 IIIICalcein %
t0
t0tfrei
Gleichung 4-10
It Fluoreszenzintensität der Probe nach BPS-Zugabe
I∞ Fluoreszenzintensität nach Tritonzugabe
I0t theoretische Fluoreszenzintensität vor BPS-Zugabe
Die Methode wurde gewählt, da sich auf diese Weise die Calcein-Freisetzung mehrerer
Proben nebeneinander (auch in Abhängigkeit der Zeit) verfolgen lässt, ohne das eine
Verfolgung der Fluoreszenz online nötig war. Die Freisetzung des Calceins oberhalb der
CMC lässt sich somit ohne eine GPC-Aufbereitung der Probe verfolgen.
Im Falle der Untersuchung freigesetzter Calceinmengen durch Einlagerung des BSA-BPS-
Konjugats wurde entsprechend vorgegangen. In einem Eppendorfgefäß wurde eine
methanolische BPS-TRE Lösung (10 µl, 0,203 µmol BPS-TRE) verdampft und mit 125 µl
BSA-haltigem (c = 2 mg/ml) BBS 100 (pH 8,4) versetzt. Nach Inkubation über Nacht bei RT
erfolgte die Zugabe von 250 µl 10 mM EPC/Chol 7/3 Dispersion. Als Leerwert zur
Ermittlung des Faktors FI diente eine reine BSA-Liposomen-Mischung mit gleichen
Konzentrationsverhältnissen.
4.6 Oberflächenmodifikation präformulierter Liposomen mit BSA-BPS-Derivaten
4.6.1 Das Standardkopplungsprotokoll
Die Kopplung von BSA an die Oberfläche präformulierter Liposomen wurde in zwei
Schritten (vgl. Abb. 4-6) durchgeführt. Im ersten Schritt erfolgte die Umsetzung des Proteins
mit dem aktivierten PEG-Sterol. Dazu wurde das aktivierte Lipid als ethanolische Lösung mit
einer Hamilton-Spritze zu dem im Kopplungspuffer gelösten Protein gegeben. Die Mischung
aus Protein und PEG-Sterol wurde über Nacht bei RT inkubiert. In diesem ersten
Inkubationsschritt setzte sich das aktivierte PEG-Sterol mit dem Protein um, so dass es mit
Methoden 79
mehreren PEG-Sterolen kovalent verknüpft wurde.
Am nächsten Morgen erfolgte die Zugabe vorgefertigter Liposomen zu dem Ansatz. Das
Sterol-PEG-Protein-Konjugat lagerte sich in einem zweiten Inkubationsschritt in die
Liposomen ein. Hierbei kann man davon ausgehen, dass die Verknüpfung des Konjugats mit
den Liposomen über den hydrophoben Sterolteil vermittelt wird, der sich in die
Liposomenmembran einlagert und als Anker zur Fixierung des Proteins an der liposomalen
Oberfläche fungiert. Die Dauer des zweiten Inkubationsschrittes betrug i.d.R. 2 - 4 h.
Nach der Kopplung des Proteins an die Liposomenoberfläche konnten die modifizierten
Liposomen über eine GPC-Säule von nicht gebundenem Liganden abgetrennt werden.
Alternativ zur Verwendung der ethanolischen Lösung des aktivierten Lipids im ersten
Inkubationschritt konnte dieses auch als dünner Film an der Wandung eines Eppendorf-
Reaktionsgefäßes angeboten werden. Die Einzelschritte zur Vorbereitung dieser Gefäße seien
im Folgenden näher erläutert: Eine methanolische Lösung (aufgrund des niedrigeren
Dampfdruckes gegenüber der ethanolischen Lösung vorzuziehen) des BPS-TRE oder BPS-
NHS (i.d.R. 10 l, bei höheren Konzentrationen an BPS-TRE aufgrund der besseren
Löslichkeit des aktivierten Lipids in ethanolischer Lösung) wurde mit einer Hamilton-Spritze
in ein Reaktionsgefäß eingebracht und in einem evakuierbaren Exsikkator bei vermindertem
Druck zur Trockne eingeengt. Um die Entstehung von Siedeverzügen zu vermeiden wurde bei
größeren Mengen Lösungsmitteln (> 30 µl) eine Evaporationszentrifuge (Concentrator 5301,
Abb. 4-6: Darstellung des Zwei-Schritt-Protokolls zur Kopplung von BSA an die Oberfläche präformulierter Liposomen
Schritt 1 Schritt 2
80 Methoden
Eppendorf) eingesetzt. Die auf diese Weise präparierten Cups waren bei -27 °C gelagert
mindestens eine Woche verwendbar.
4.6.2 Ermittlung der Kopplungseffizienz
4.6.2.1 Iodierung des Liganden
Die Quantifizierung des an den Liposomen gebundenen Proteins erfolgte über einen
radioaktiven Marker. Unter Verwendung von Iodo-Beads® (Pierce, Rockford, USA) wurde
der Ligand mit 125Iod, entsprechend dem firmenseitig beigefügten Protokoll, gelabelt.
Freies Iod konnte über eine Sephadex G-25 Säule (äquilibriert mit HBS) und - wenn nötig -
mit nachfolgender Dialyse (selbstkonstruierte Dialysekammer, Cellulosemembran Diachema,
10 kDa cutoff, high permeability) über Nacht gegen HBS abgetrennt werden.
4.6.2.2 Quantifizierung des gebundenen Anteils über GPC
Die Lösung des zu koppelnden Liganden wurde mit einer Spur (ca. 250 - 350 Bq/Probe, 14C
oder 125I) radioaktiv markiertem BSA versetzt.
Nach der Kopplung des Liganden wurde ein Teil des Gesamtansatzes auf eine mit
Kopplungspuffer äquilibrierte Sepharose CL-4B Säule (100 - 400 µl Probe; 1,5 x 12 cm oder
1 x 25 cm) aufgebracht und fraktioniert. Die einzelnen Fraktionen (200-800 µl,
Fraktionssammler Frac-100) wurden direkt in Szintillationsmessröhrchen (Mini Vials B, C.
Roth) gesammelt, im Verhältnis 1:4 (Probe : Szintillationsflüssigkeit) mit High Ionic Fluor
(Packard Bioscience) aufgefüllt, geschüttelt und im Szintillationszähler (Tri-Carb 1900 TR,
Packard Bioscience) vermessen.
Die Berechnung des gebundenen Proteinanteils war durch Bezug auf einen Teil des gesamten
Kopplungsansatzes, der als Referenz mit vermessen wurde, möglich. Zur Angleichung des
tSIE-Wertes (transformed Spectral Index of the External standard) der Referenz an die der
zugehörigen Fraktionen musste die ungefähre Masse der Fraktionen ermittelt werden. Durch
Zugabe von Elutionspuffer zur Referenzprobe wurde ihre Masse der der Fraktionen
angepasst. So ließ sich der prozentuale Anteil der auf die Säule aufgebrachten Gesamtaktivität
in jeder einzelnen Fraktion bestimmen. Die Berücksichtigung der Hintergrundstrahlung des
Elutionspuffers erfolgte durch Vermessen eines der Masse der Fraktionen entsprechenden
Nullwerts.
Der erste in Abbildung Abb. 4-7 verzeichnete Peak entspricht dem liposomal gebundenen
Methoden 81
Proteinanteil, der zweite stellt den freien BSA-Peak dar. Der letzte (kleine) Peak steht für den
Anteil des freien 125I an der Gesamtaktivität, war je nach verwendeter Charge an “heißem“
Protein unterschiedlich groß und ließ sich durch zusätzliches Abtrennen von freiem Iod durch
Dialyse vollständig vermeiden. Dieser Anteil wurde bei der Ermittlung des prozentual
gekoppelten Proteinanteils nicht berücksichtigt.
Bei Basislinientrennung zum zweiten Peak wurde der erste Peak zur Bestimmung des
liposomal gebundenen Anteils herangezogen.
4.6.3 Kopplungsversuche unter Verwendung von tresyliertem Generol
Die ersten Synthesen und Kopplungsversuche zur Untersuchung der Eignung von
ethoxylierten Sojasterolen wurden unter Bedingungen durchgeführt, die sich an der
Dissertation von Andreas Lung (Lung 2002) orientierten.
Die Syntheseansätze wurden dementsprechend mit dem von A. Lung genutzten Generol E-25
durchgeführt, das sich in der Kettenlänge der PEG Einheit von dem später genutzten BPS
unterscheidet. Auf eine Aufreinigung des Ausgangsmaterials für die Synthesen wurde
verzichtet, die des Produktes erfolgte ausschließlich über Fällung aus MeOH, Diethylether
und Petrolether.
4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Elutionsvolumen [ml]
Aktiv
ität [
cpm
]
0
20
40
60
80
100 Summ
e der Gesam
taktivität [%]
━■━ (linke Achse)
Elutionsprofil eines
Kopplungversuchs
━□━ (rechte Achse)
Summe der eluierten
Anteile der auf die
Säule aufgetragenen
Gesamtaktivtät [%]
Abb. 4-7: Exemplarischer Verlauf der GPC-Fraktionierung eines Kopplungsansatzes unter Verwendung von BSA als Modellprotein
82 Methoden
Die Lipidzusammensetzung der verwendeten Liposomen entsprach der in Tabelle 4-1
(Seite62) näher charakterisierten EPC/Chol 4/1 Formulierung.
Bei allen Versuchen wurde gemäß des Standardprotokolls vorgegangen (vgl. 4.6.1). Die BSA-
Konzentration in BBS 650 (bzw. Sörensen Phosphatpuffer; PBS) betrug 1,0 mg/ml, die
Lipidkonzentration 20 mM, die Extrusion der Liposomen erfolgte über 200 nm
Membranporen. Die Stoffmenge an eingesetztem tresylierten Generol (GET) lag - sofern
nicht anders beschrieben - bei 7,5 mol% in Bezug auf das GL.
Zur Kopplung wurden im ersten Inkubationsschritt 325 µl der BSA Lösung mit 25 µl
ethanolischer GET-Lösung (c = 7,93 mg/100l, n = 1,054 µmol) versetzt. Es erfolgte die
Inkubation über Nacht mit Zugabe der Liposomen (650 µl) am nächsten Morgen. Nach der
zweiten Inkubation wurden die Ansätze entsprechend 4.6.2.2 ausgewertet.
4.6.3.1 Überprüfung der Eignung von GET zur Kopplung von BSA an Liposomen
In der Arbeit von A. Lung (Lung 2002) wurde die Eignung der tresylierten Sojasterole zur
Kopplung von BSA an Liposomen bereits ausführlich diskutiert. Dennoch war eine
Überprüfung der Funktionalität des neu synthetisierten GET nötig, zumal die von A. Lung
hauptsächlich genutzte “Eintopf-Methode“ in das zwei Schritt Kopplungsverfahren
umgewandelt wurde (vgl. 4.6.1).
Diese Modifikation erfolgte, um die zu Beginn der Arbeit immer wieder auftretenden
Probleme bezüglich der Wiederfindungsraten des auf die GPC-Säule aufgebrachten
radioaktiven Materials in den Griff zu bekommen. Die Zwei-Schritt Methode bot bessere
Kopplungseffizienzen bei geringerem Partikelwachstum (vgl.4.6.4.4 und 5.4.2.6).
Als Blindprobe diente ein Ansatz, bei dem BSA mit 7,5 mol% reinem
Generol E-25 (statt mit GET) über Nacht bei RT stehen gelassen wurde. In einem weiteren
Ansatz wurde das Generol durch die entsprechende Menge GET ersetzt.
Die Kopplung des BSA an die Liposomen konnte mittels GPC
(Sepharose CL-4B, 1 x 25 cm) nachgewiesen werden (vgl. 4.6.2.2). Zur Erstellung eines
genauen Elutionsprofils musste jedes Szintillationsröhrchen vor und nach der Fraktionierung
der Proben ausgewogen werden, um die Masse jeder einzelnen Fraktion zu bestimmen. Durch
Subtraktion der beiden Elutionskurven (für Blindversuch und Kopplungsversuch) konnte eine
Methoden 83
durch die Behandlung mit GET induzierte Koelution von Liposomen und Protein
nachgewiesen werden. Aufgrund der durch die Opaleszenz der Liposomenfraktionen einfach
möglichen visuellen Überprüfung der Übereinstimmung von Liposomen- und
Proteinfraktionen im Fall der Verwendung von GET, wurde auf einen separaten PL Nachweis
verzichtet. Der Nachweis von Koelution von Liposomen und Protein wurde im Rahmen eines
Free-Flow Elektrophorese Experiments erbracht (vgl. 5.4.2.2).
4.6.3.2 Kontrolle des pH-Optimums bei Verwendung tresylierter Sojasterole zur Kopplung von BSA
Die Literatur (vgl. auch 5.4.1) schlägt schwach alkalisches Medium für die Kopplung von
Aminen mit tresylierten PEG vor. Um den für die Kopplung von BSA an die Liposomen
optimalen pH-Bereich auszuloten, wurden Boratpuffer (650 mM) im pH-Bereich von 8,3-9,0
hergestellt. Zum Vergleich der Kopplungseffizienz bei neutralen pH-Werten diente ein
Sörensen Phosphatpuffer pH 7,4 (PBS, vgl. Tabelle 3-5) als Reaktionsmedium des ersten
Inkubationsschritt.
4.6.3.3 Abhängigkeit der Kopplungseffizienz von pH-Wert und Stoffmenge des eingesetzten GET
Ausgehend von einer ethanolischen Stammlösung von GET, die bei einem Volumen vom
25 µl 7,5 mol% des später zugegebenen Lipids enthielt, wurde eine Verdünnungsreihe von
GET hergestellt, indem die jeweils höher konzentrierte Lösung 1:1 mit EtOH verdünnt wurde
(4 Verdünnungsschritte). Bei Zugabe von 25 µl der Lösungen 1-5 resultierten nach Zugabe
der Liposomen GET-Anteile zwischen 7,5 und 0,5 mol%.
Die Untersuchungen erfolgten bei drei verschiedenen pH-Werten (BBS 650, pH 8,5 und pH
9,0 sowie PBS pH 7,4).
Im aufgrund der Ergebnisse von 4.6.3.2 und Literaturangaben zur Kopplung festgelegten pH-
Bereich von 8,4 - 8,5 (vgl. 5.4.1 und 5.4.1.2) wurden Dreifachbestimmungen durchgeführt.
84 Methoden
4.6.3.4 Untersuchungen zur Dauer des ersten Inkubationsschritts
Das Kopplungsprotokoll sollte bezüglich der Dauer der beiden Inkubationsschritte optimiert
werden. Da es sich bei der Derivatisierung mit tresylaktivierten Lipiden um aminoaktive
Kopplungen handelt konnte die Reaktion zwischen BPS-TRE und BSA, das bei diesen
Untersuchungen als Modellprotein diente, durch Zugabe eines großen molaren Überschusses
an einer aminhaltigen Komponente wie Histidin-HCl unterbrochen werden. Da das pH-
Optimum für Tresylatkopplungen zudem im schwach alkalischen Bereich liegt (Sperinde et
al. 1999) wurde die Histidin-HCl Lösung in ihrem pH-Wert nicht auf den pH-Wert des
Kopplungspuffers angeglichen, so dass ein End-pH von ca. 5 resultierte.
Die Liposomen für diese Versuchsreihe wurden durch Extrusion über Membranen einer
Porenweite von 80 nm hergestellt. Die folgende Aufstellung gibt Auskunft über die näheren
Details der Liposomenpräparationen, die in dieser Versuchsreihe verwendet wurden:
Liposomen:
Lipidkomposition: EPC/Chol 4/1
Größe: 110 - 125 nm
Lipidkonzentration: 25 mM
Puffer: Borat 650 mM (BBS 650), pH 8,4
Volumen: 650 µl
Stoffmenge Lipid: 16,74 µmol GL (inkl. BPS)
Vorgegangen wurde gemäß dem unter 4.6.1 vorgestellten Standardprotokoll. 25 µl einer
ethanolischen Lösung von BPS-TRE (4 mg/100 µl; entsprechend 3 mol% des GL) wurden mit
325 µl einer BSA Lösung in Boratpuffer 650 mM, pH 8,4 (BBS 650, 1mg/ml) durch Vortexen
gemischt. Nach 5, 10, 60, 120, 300, 720 min erfolgte der Abbruch der Reaktion durch Zugabe
eines großen molaren Überschusses an Histidin-HCl (100 µl, 60 mg/ml). Der Ansatz wurde
über Nacht bei RT stehen gelassen bevor am nächsten Tag die Zugabe der Liposomen
erfolgte. Nach einer weiteren Inkubation (Standardprotokoll Schritt 2; vgl. Abb. 4-6) über 4 h
bei RT wurde über eine GPC Säule gemäß 4.6.2.2 fraktioniert und ausgewertet.
Methoden 85
4.6.4 Kopplungsversuche unter Verwendung von BPS-TRE
4.6.4.1 Versuche zur Dauer des zweiten Inkubationsschritts
Die Dauer des zweiten Inkubationsschritts ergab sich indirekt aus den Beobachtungen der
Leakage- und NMR-Versuche. Um die Einlagerung des BPS-BSA-Derivates in die
Liposomen auch direkt verfolgen zu können wurde nach einem ersten Inkubationsschritt über
Nacht eine Liposomendispersion zum Ansatz gegeben. Die Einlagerung konnte durch die
Fraktionierung der Probe über eine GPC Säule (1,5 x 12 cm; Sepharose CL-4B) unterbrochen
werden.
Dazu wurde ein Ansatz von BSA in Boratpuffer 100 mM, pH 8,4 (1,5 mg/ml, 250 µl) mit
BPS-TRE (in 10 µl EtOH, entsprechend 7,5 mol% aktiviertes Lipid in Bezug auf das GL)
gemischt und über Nacht inkubiert. Unmittelbar (ca. 1 min) nach der Zugabe der Liposomen
(EPC/Chol 7/3, 25 mM, 500 µl) zu dieser Mischung erfolgte die Fraktionierung der Probe
über die Sepharose Säule.
4.6.4.2 Free-Flow Elektrophorese als Werkzeug zum Nachweis der Oberflächenmodifikation von Liposomen
Die Free-Flow Elektrophorese (FFE, Octopus PZE, Dr. Weber GmbH) ermöglicht die
Auftrennung unterschiedlichster Proben (Liposomen, Proteine, Zellen) aufgrund ihres
-Potentials. Es handelt sich um ein System, das ohne stationäre Phase auskommt. Die Probe
wird in einen laminar fließenden Puffer, an den ein Hochspannungsfeld angelegt ist,
eingebracht und mit diesem mitgeführt. Auf dem Weg durch die Trennkammer wird das
Untersuchungsmaterial entsprechend seiner Ladung entweder in Richtung Anode oder
Kathode abgelenkt.
Am Ende der Trennkammer befindet sich ein Fraktionssammler, der die gesamte Breite der
Trennkammer in 96 unterschiedliche Kompartimente einteilt. Definitionsgemäß liegt hierbei
die Fraktion 96 direkt an der Kathode, die Fraktion 1 ist zur Anode hin gelegen. Je nach
erwarteter Ladung des Untersuchungsmaterials kann diese entweder in der Mitte der
Trennkammer, an der Anode oder Kathode in den kontinuierlich durch die Trennkammer
gepumpten Trennpuffer eingebracht werden. Durch den kontinuierlichen Pufferstrom ist es
möglich kleine (wenige µg) bis hin zu größeren Probenmengen (einige g) zu fraktionieren.
Oberhalb des Fraktionssammlers sorgt ein dem Trennpuffer entgegenkommender
86 Methoden
Stabilisierungspuffer für ein quantitatives Auffangen der Probe durch den Fraktionssammler.
Auf diese Weise ermöglicht die Apparatur nicht nur eine qualitative sondern auch eine
quantitative Analyse des Probenmaterials. Die mögliche Temperierung der Kammer, die
Variabilität der Geschwindigkeit des Probeneinlasses, der Flussgeschwindigkeit des Puffers
und der angelegten Spannung sorgen für eine hohe Flexibilität der Anlage und erlauben die
Lösung zahlreicher Trennprobleme.
Die Modifizierung von Liposomen mit Proteinen ist in der Regel mit der Veränderung der
elektrophoretischen Mobilität der Vesikel verbunden, da mit der Fixierung von Proteinen, die
durch die Wahl des richtigen Puffers geladen vorliegen, eine Änderung der
Oberflächenladung der Vesikel einhergeht.
Die FFE wurde genutzt um die Kopplung von BSA an EPC/Chol 4/1 Liposomen zu belegen.
Dazu wurde eine BSA Lösung (c = 1 mg/ml, 240 µl, BBS 100, pH 8,4, Zusatz von 10 kBq 125I markiertem BSA) mit BPS-NHS in EtOH (10 µl, 1,216 µmol (2,28 mg) BPS-NHS
entsprechend 7,5 mol% des GL) versetzt. Nach Inkubation über Nacht erfolgte die Zugabe
von 750 µl Liposomen (20 mM, 80 nm Extrusion) und der zweite Inkubationschritt (4 h).
Zwischenzeitlich wurden 96 Röhrchen für den FFE-Fraktionssammler ausgewogen. Nach der
Abb. 4-8: Schematische Darstellung der Octopus PZE der Firma Dr. Weber GmbH
Trennpuffer
Gegenpuffer
Probeneinlässe Probeneinlass
Trennpuffereinlass
Stabilisierungs-puffer
Fraktionierung
Methoden 87
Inkubation wurden innerhalb von 2 min 199 µg des Ansatzes über den an der Kathode
gelegenen Probeneinlass in das System eingebracht. Das genaue Gewicht der Probenmenge
wurde durch Differenzwägung des Reaktionsgefäßes vor und nach Probenapplikation
ermittelt.
Nachfolgend sind die verwendeten Puffer aufgeführt (für genaue Zusammensetzung vgl.
Tabelle 3-5):
Trennpuffer: Phosphatpuffer 5 mM, pH 7,0
Stabilisierungspuffer: Phosphatpuffer 50 mM, pH 7,0
Elektrodenpuffer: Phosphatpuffer 125 mM, pH 7,0
Die Spannung lag bei 600 V (entsprechend einer elektrischen Feldstärke von 75 V/cm), die
Trennpufferförderrate bei 330 ml/h.
Nach erfolgter Fraktionierung wurden die gesammelten Fraktionen ausgewogen und je 200 µl
in LSC-Fläschen eingewogen und im Betacounter vermessen. Der Rest der Fraktionen wurde
mit der PCS unter Verwendung der 400 nm Blende unter Standardbedingungen auf
Streulichtimpulsanzahl (kcps) vermessen.
Als Vergleichsprobe diente eine nicht modifizierte Liposomen-Präparation. Da in diesem Fall
keine Bilanzierung von radioaktiv markiertem Material nötig war, konnte auf das Auswiegen
der Fraktionsröhrchen verzichtet werden.
Die Versuchsreihe wurde unter Anleitung von J. Momm durchgeführt in dessen Arbeit eine
genauerer Beschreibung der Inbetriebnahme, Validierung und Reinigung der Anlage
beschrieben ist (Momm 2004). Eine ausführliche Diskussion des analytischen und
präparativen Potentials der FFE im liposomalen Anwendungsbereich stellt die Doktorarbeit
von T. Dern (Dern 2002) dar.
4.6.4.3 Kopplungseffizienz in Abhängigkeit von Lipidzusammensetzung und BSA-Konzentration
Zur Untersuchung der Eignung von BPS-TRE zur Kopplung von Proteinen an liposomale
Oberflächen wurden die drei Standardliposomenpräparationen EPC/Chol 7/3, HSPC/Chol und
HSPC/Chol/MPEG in HEPES/NaCl Puffer (20 mM/130 mM, pH 7,4) hergestellt. Die
88 Methoden
Extrusion erfolgte durch Polycarbonatmembranen mit 80 nm Poren, wodurch Liposomen mit
einem hydrodynamischen Durchmesser von 110 - 125 nm resultierten.
10 µl einer methanolischen BPS-TRE Lösung (entsprechend 0,915 mg, 0,486 µmol des
aktivierten PEG-Sterols) wurden in einem 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß bis zur Trockene
eingedampft (vgl. 4.6.1). Anschließend erfolgte die Zugabe von 150 µl der verschiedenen
BSA Lösung in BBS 100 (c = 1 - 5 mg/ml). Dies entsprach 7,5 mol% des für den zweiten
Inkubationsschritt zugegebenen GL.
Um das Ablösen des BPS-TRE Films von der Gefäßwand zu beschleunigen wurde der Ansatz
kurz in ein Ultraschallbad eingebracht und gevortext. Nach Inkubation über Nacht (RT)
erfolgte die Zugabe der verschiedenen Liposomenpräparationen (300 µl, 20 mM), 4 h weitere
Inkubation bei RT und die Fraktionierung der Ansätze über GPC (Elutionspuffer entsprach
dem Puffer bei der Liposomenherstellung) mit Quantifizierung des liposomal gebunden
Proteinanteils über LSC.
4.6.4.4 Untersuchung der Größenentwicklung während des zweiten Inkubationsschrittes
Die Kopplung von BSA mit aktivierten Ankern ist aufgrund des im Überschuss eingesetzten
Lipidankers sowie der Multireaktivität des Proteins mit der mehrfachen Modifizierung des
Moleküls verbunden. Die Einlagerung aller an einem Protein angebrachten Ankermoleküle in
dasselbe Liposom ist jedoch äußerst unwahrscheinlich. Daher ist mit einer Quervernetzung
der Liposomen zu rechnen, bei der das Protein die Rolle des Cross-Linkers übernimmt.
Parallel zu den Untersuchungen zur Kopplungseffizienz in Abhängigkeit der
Lipidzusammensetzung und des Proteingehalts (4.6.4.3) wurde daher ein Teil der Proben
mittels PCS auf Größenzunahme untersucht (vgl. 4.4.1). Dazu wurden 4 bzw. 12 h nach der
Zugabe der Liposomen Proben genommen und mit filtriertem (Porengröße 0,22 μm) HBS
verdünnt.
In einer anderen Versuchsreihe zur Größenentwicklung der BSA-modifizierten Liposomen
wurde von der EPC/Chol 4/1 Kombination ausgegangen. Auch in diesem Fall betrug der
Anteil an BPS-TRE 7,5 mol% am GL und wurde in 25 µl ethanolische Lösung eingesetzt.
Nach der Inkubation (RT) von 325 µl BSA in BBS 650 (1 mg/ml) mit dem aktivierten Lipid
über Nacht erfolgte die Zugabe von 650 µl 25 mM Liposomen, die entweder als
Methoden 89
konventionelle oder sterisch stabilisierte Liposomen vorlagen. Der PEG-Schutz wurde dabei
entweder durch 5 mol% MPEG2000-DSPE oder 7,5 mol% BPS, die während der Herstellung
der Liposomen mit in den Lipidfilm eingearbeitet wurden, realisiert.
4.6.4.5 Stabilität der Verankerung in Anwesenheit von humanem Serum
Plasma- und Serumkomponenten haben einen entscheidenden Einfluss auf die strukturelle
Integrität von Liposomen. Dies gilt auch für oberflächenmodifizierte Liposomen, bei denen
der Ligand eventuell durch Serum extrahiert werden könnte. Untersuchungen der Stabilität
des Ligand-Liposom-Komplexes in Anwesenheit von humanem Serum machen eine erste
Abschätzung der Stabilität in systemischer Zirkulation möglich.
Ein Hinweis auf die Stabilität der Verankerung des Modellproteins BSA über BPS-TRE in der
Liposomenmembran wurde durch ein Rechromatographieverfahren erhalten.
Zunächst erfolgte die Modifikation von EPC/Chol 7/3, HSPC/Chol und HSPC/Chol/MPEG
Liposomen unter den unter 4.6.4.3 beschriebenen Bedingungen. Als BSA-Konzentration
wurde 3 mg/ml angesetzt. Ein Teil des Ansatzes wurde nach erfolgter Kopplung des Proteins
auf die Kopplungseffizienz untersucht.
Eine zweite Probe desselben Ansatzes diente der Abtrennung des freien Proteinanteils durch
einen GPC Schritt. Die vereinigten Liposomenfraktionen wurden 1:1 mit humanem Serum
verdünnt und nach 20 h bei 37 °C im Wasserbad (Haake N2) über GPC auf neu auftretendes
freies Protein geprüft.
Als Kontrolle wurde einem Ansatz nach der Abtrennung des freien Proteins durch die erste
Chromatographie 125I-markiertes BSA zugemischt, um auf eine eventuelle Koelution von
abgespaltenem BSA, provoziert durch die Anwesenheit des Serums (z.B. Bildung von
größeren Aggregaten, Anlagerung des freien BSA an Serumlipoproteine) zu prüfen. Bei
sämtlichen Chromatographieschritten diente Sepharose CL-4B als Trennmedium. Als
Elutionspuffer wurde HBS verwendet.
90 Methoden
4.6.5 Versuche unter Verwendung BPS-NHS
4.6.5.1 Überprüfung der Eignung von BPS-NHS zur Kopplung von BSA an Liposomen
Zur Überprüfung der Eignung von BPS-NHS zur Kopplung von Proteinen an die
Liposomenoberfläche wurde entsprechend 4.6.3.1 vorgegangen. Der wichtigste Unterschied
bestand in der Verwendung von PBS statt BBS, da die Kopplung über NHS-aktivierte Lipide
auch in neutralem pH-Bereich vorgenommen werden kann.
Die Kopplung erfolgte durch einen ersten Inkubationsschritt von 325 µl der BSA Lösung
(1 mg/ml) mit 25 µl ethanolischer BPS-NHS Lösung (7,5 mol% des GL). Anschließend
wurde über Nacht inkubiert bevor am nächsten Tag die Liposomen (EPC/Chol 7/3 oder
HSPC/Chol 20 mM. 650 µl) zugesetzt wurden. Die Ermittlung des prozentual gebundenen
BSA Anteils erfolgte wie in 4.6.2.2 beschrieben.
4.6.5.2 Vergleich der Kopplung unter Verwendung verschiedener aktivierter Lipide in Abhängigkeit der Temperatur des zweiten Inkubationsschritts
Auch diese Versuchsreihe wurde unter Beibehaltung des Standardkopplungsprotokolls
durchgeführt. Es fanden je 5 mol% (in Bezug auf das GL nach Zugabe der Liposomen im
zweiten Inkubationsschritt) BPS-TRE, BPS-NHS und NHS-PEG-DSPE Anwendung, bevor
HSPC/Chol und EPC/Chol 4/1 Liposomen zu dem hydrophobisierten BSA gegeben wurden.
Die BSA Konzentration betrug 1 mg/ml (250 µl), die aktivierten Lipide waren in 15 µl EtOH
gelöst, das Volumen der Liposomendispersionen betrug 500 µl bei einer Lipidkonzentration
von 20 mM. Bei Kopplungen mit den NHS-aktivierten Lipiden wurde in PBS gearbeitet, die
Kopplung mittels BPS-TRE verlief wie üblich in BBS bei einem pH-Wert von 8,4.
Nach Zugabe der Liposomendispersionen wurden die Ansätze, bei denen NHS-PEG-DSPE
eingesetzt wurde, geteilt. Die erste Hälfte wurde nach einer Inkubation über Nacht, die zweite
nach einer Stunde Inkubation im Wasserbad bei 60 °C über eine GPC-Säule fraktioniert.
Methoden 91
4.7 Abschätzung der Ligandenzahl pro Liposom
Um die Anzahl von BSA Molekülen pro Liposom grob berechnen zu können wurde wie folgt
vorgegangen. Zunächst erfolgte die Berechnung der Gesamtfläche des Lipidbilayers nach:
LipidLipidL cV5,0FNA Gleichung 4-11
Dabei ist:
N Avogardozahl 6,023 · 1023 [mol-1]
FL durchschnittliche Fläche eines Lipids in der Membran 0,51 [nm²]
VLipid Volumen der eingesetzten Liposomendispersion [l]
cLipid Konzentration der eingesetzten Liposomendispersion [mol/l]
Das Produkt der Avogardo-Konstante, der durchschnittlichen Fläche eines Lipidmoleküls im
Bilayer, das vereinfachend für alle Kombinationen wenig fluider Lipide gleich 0,51 [nm²]
gesetzt wurde und dem Faktor 0,5, der der Tatsache Rechnung trägt, dass sich die PL zu
einem Bilayer anordnen, liefert den konstanten Faktor 1,536 · 1023 mit der Einheit [nm²/mol].
Geht man davon aus, dass unilamellare Liposomen vorliegen, gilt für die mittlere Lipidfläche
AL eines Liposoms die Beziehung (Schubert et al. 1991):
2L )5,2r(4A Gleichung 4-12
AL Fläche eines Liposoms [nm²]
r Radius eines Liposoms [nm].
Zur Berechnung der Fläche im Inneren des Bilayers wurde die halbe Membrandicke von
2,5 nm angenommen.
92 Methoden
Die Zahl der Liposomen pro Ansatz ergibt sich somit zu:
LAA
Liposoms eines Bilayers des FlächeyersGesamtbila des Flächen Gleichung 4-13
Über die Molekularmasse des BSA (67 000 g/mol) und die prozentuale Kopplungseffizienz
lässt sich so die Anzahl von Proteinen an der liposomalen Oberfläche abschätzen.
Ergebnisse und Diskussion 93
5 Ergebnisse und Diskussion
Gegenstand der praktischen Arbeiten war die Evaluierung der Eignung von PEGylierten
Sterolen zur Funktionalisierung von PL-Vesikeln. Von Interesse war zum einen das
Einlagerungsverhalten der PEG-Sterole in liposomale Membranen, zum anderen das
Kopplungspotential chemisch aktivierter, aminoreaktiver Derivate zur Fixierung von
Proteinen an Liposomen. Das Einlagerungsverhalten wurde im Hinblick auf Transferraten
und Geschwindigkeiten (vgl. 5.3.2), Membrandefekte während der Einlagerung der PEG-
Sterole unterhalb (vgl. 5.3.4.1) und oberhalb (vgl. 5.3.4.2) der CMC charakterisiert. ITC-
Untersuchungen (vgl. 5.3.3) gaben Auskunft über das Solubilisierungsverhalten und den
lipidnormierten Verteilungskoeffizienten der PEG-Sterole. Durch Untersuchungen des
Kopplungspotentials (vgl. 5.4) der aktivierten Lipide in Abhängigkeit der
Lipidzusammensetzung, der Proteinkonzentration, des pH-Wertes, der Dauer der beiden
Inkubationsschritte und der Stoffmenge der Substanzen wurde eine Zwei-Schritt-
Kopplungsmethode (vgl. 4.6.1) etabliert und optimiert. Weitere Versuchsreihen beschäftigten
sich mit der Stabilität der Fixierung des Proteins an der Liposomenoberfläche (vgl. 5.4.2.5)
und Größenwachstumsphänomenen während der Einlagerung des hydrophobisierten Proteins
in die Vesikeloberfläche (vgl. 5.4.2.6).
5.1 Interpretation der 1H NMR Spektren
5.1.1 Tresyliertes BPS
Die Integration der Flächen der relevanten Peaks erlaubt eine Abschätzung des Umsatzgrades
der distalen Hydroxylgruppe der ethoxylierten Sojasterole mit dem Aktivierungsreagenz. Das
in Abb. 5-1 mit A gekennzeichnete Signal repräsentiert das olefinische Proton an C6 des
Sterolgerüstes. Trotz der Inhomogenität des hydrophoben Molekülteils aufgrund des
natürlichen Ursprungs der Substanzen ist dieses Proton in jedem Molekül vorhanden, da die
Variationen des Ankers in der Seitenkette liegt (vgl. Abb. 4-1; olefinische Protonen der
Seitenkette liegen zwischen 4,95 und 5,25 ppm). Bei vollständiger Umsetzung der distalen
Hydroxylgruppe mit Tresylchlorid ist die Peakfläche der Protonen in der
Trifluorethansulfonsäuregruppe (C) und der zum Sulfonsäurester gelegenen Methylengruppe
(B) doppelt so groß wie das des C6 Protons (A).
94 Ergebnisse und Diskussion
5.1.2 N-Hydroxysuccinimid aktiviertes BPS
Das Massenspektrum (vgl. Abb. 5-2 (1)) verdeutlicht die Polydispersität der PEG-Kette;
entsprechend der Molekularmasse einer EO-Einheit differieren die einzelnen Hauptpeaks um
44 Masseneinheiten, die Inhomogenität des Sterolanker spiegelt sich in der Unterverteilung
der Massen wieder.
Entsprechend der Reaktion mit Tresylchlorid muss auch bei der Umsetzung des BPS mit
Disuccinimidylcarbonat (DSC) die gleiche Methylengruppe eine doppelt so große Fläche
aufweisen wie das C6 Proton. Die vier Protonen der Succinimidylabgangsgruppe liegen bei
2,8 ppm (C). Dieses Signal wies bei allen Syntheseansätzen deutlich zu hohe Peakflächen
(4,5 - 5,5) auf und ist auf einen Restanteil an N-Hydroxysuccinimid zurückzuführen. Dies
stellt auch das bei der Kopplung entstehende Nebenprodukt dar und hat keinen störenden
Einfluss. Bei der Aufarbeitung der Ansätze über die GPC Säule wird es von den
oberflächenmodifizierten Liposomen abgetrennt. Die Umsetzung der PEG-Hydroxylfunktion
mit DSC war quantitativ (vgl. Abb. 5-2 (2)).
ppm (t1) 4.505.00
1.00
2.00
2.00
ppm (t1)1.02.03.04.05.0
OO
S
O
OF
FF
n=30
A
B
C
A
B C
Abb. 5-1: 1H NMR Spektrum von BPS-TRE
Ergebnisse und Diskussion 95
m/z1200 2600
Inte
nsity
200
0
1854
.1
(1)
(2)
ppm (f1) 4.505.00
1.00
2.00
ppm (f1)1.02.03.04.05.0O
OO
ON
O
O
n=30
A B
B A C
C
Abb. 5-2: MALDI-MS (1) und 1H NMR-Spektrum (2) von BPS-NHS
96 Ergebnisse und Diskussion
5.2 CMC der PEG-Lipide
Eine Reihe von Versuchen beschäftigte sich mit dem Freisetzungsverhalten von Calcein aus
dem liposomalen Innenraum. Es wurde erwartet, dass die Freisetzung des Markers abhängig
von der Konzentration des in der Liposomendispersion befindlichen PEG-Lipids ist.
Unterhalb der CMC kann die Einlagerung des Monomers in die Liposomenmembran zu
Membranstörungen führen, aus denen eine Erhöhung der Permeabilität der Membran
resultieren kann. Oberhalb der CMC könnten zusätzlich Solubilisierungseffekte zu einer
gesteigerten Calcein-Freisetzung führen.
Für beide relevanten Substanzen (BPS-30 und MPEG2000-DSPE) finden sich CMC-Angaben
in der Literatur. Die erste Quelle gibt für BPS-30 einen Wert von 3 µM an (Ermittlung durch
Messung der Oberflächenspannung mittels Wilhelmy-Plate (Folmer & Svensson 1999)). Für
MPEG2000-DSPE finden sich unterschiedliche Angaben. Während Ishida (Ishida et al. 1999)
auf Basis von Trübungsmessungsdaten bei 240 nm eine CMC von 2,3 µM angibt, ermitteln
Sou und Mitarbeiter durch DPH Fluoreszenzmessung eine CMC von 9 µM (Sou et al. 2000).
Da in dieser Arbeit mit anderen Puffersystemen gearbeitet wurde, das BPS-30 vor
Verwendung vom freien PEG befreit und im Falle des MPEG2000-DSPEs eine andere
0,1 1 10
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
BPS-30 MPEG2000-DSPE
CMC MPEG2000
-DSPE3,2 µM
CMC BPS-30 4,8 µM
Fluo
resz
enzi
nten
sitä
t
c PEG-Lipid [µM]
Abb. 5-3: Darstellung der Fluoreszenz einer DPH Dispersion in Abhängigkeit der Konzentration von MPEG2000-DSPE und BPS-30
Ergebnisse und Diskussion 97
Bezugsquelle genutzt wurde, mussten eigene CMC Bestimmungen durchgeführt werden.
Der Anstieg der Fluoreszenz oberhalb der CMC ist auf die beginnende Solubilisierung des
Fluoreszenzfarbstoffes zurückzuführen, die erst bei Auftreten von Mizellen, also oberhalb der
CMC möglich ist. Die ermittelten CMC-Werte liegen mit Werten von 3,2 µM für
MPEG2000-DSPE und 4,8 µM in derselben Größenordnung wie die Literaturwerte.
5.3 Einlagerungsverhalten von PEG-Lipiden in präformulierte Liposomen
Die Modifikation präformulierter Liposomen bringt gegenüber den konventionellen
Targetierungstechniken (vgl. 1.2.2.2) einige Vorteile mit sich. Zum einen ermöglicht sie die
Funktionalisierung bereits im Handel befindlicher liposomaler Zubereitungen, um diese den
experimentellen oder therapeutischen Erfordernissen anzupassen, zum anderen vermeidet sie
mögliche Interaktionen von Wirkstoffen und/oder Membrankomponenten mit den zur
Kopplung der Liganden erforderlichen chemisch aktivierten Lipiden. Ein weiterer Vorteil
liegt in der exklusiven Einlagerung des PEG-Lipids in den äußeren Monolayer, so dass auf
diese Weise der Innenraum der Liposomen für die Aufnahme zu verkapselnder Wirkstoffe
nicht eingeschränkt wird (Nicholas et al. 2000).
Von besonderem Interesse ist hierbei die Einlagerung bei RT. Sie ermöglicht eine schonende
Modifikation der Liposomen ohne die liposomal assoziierten Wirkstoffe oder Liganden
thermisch zu stressen. Die Literatur kennt bislang keine Verfahren, die die Einlagerung von
PEG-Lipid-Derivaten bei RT ermöglicht. Die Post Insertion Technique (PIT) nach Ishida
(Ishida et al. 1999) und Zalpisky (Zalipsky et al. 1997) erlaubt zwar die nachträgliche
Implementierung von DSPE-PEG-Liganden aus mizellarer Phase, doch ist die Methode nicht
universell einsetzbar (vgl. 1.2.2.1).
Zalipsky beschreibt die Einlagerung von Kohlenhydrat- bzw. Peptid-Liganden - also
strukturell relativ kleinen Liganden - in präformulierte Liposomen bei 37 °C (Zalipsky et al.
1997). Die Modifizierung HSPC-basierender Liposomen mit größeren Liganden wie
Antikörpern ist nur bei deutlich höheren Temperaturen (60 °C) möglich. Beinhalten die zu
funktionalisierenden Liposomen bereits ein PEG-Lipid-Derivat in höherer Konzentration (wie
es zum Beispiel bei Doxil® bzw. Caelyx® gegeben ist) ist die Anzahl der über die PIT
implementierbarer Liganden zu klein, um ein effizientes Targeting zu gewährleisten (Ishida et
al. 1999).
98 Ergebnisse und Diskussion
Die selbständige Einlagerung der Sojasterole in bestehende Liposomenmembranen ist die
Grundvorrausetzung für ihren möglichen Einsatz zur Modifikation von präformulierten
liposomalen Zubereitungen. Dabei ist nicht nur ihr Einsatz als mögliche Anker zur Fixierung
von “Homing Devices“ von Interesse, sondern auch ihre Verwendbarkeit zur Herstellung von
Stealth®-Liposomen aus einer konventionellen Vorstufe. Daher wurde eine Reihe von
Experimenten durchgeführt, um das Einlagerungsverhalten der ethoxylierten Sojasterole in
Lipidmembranen unterschiedlicher Komposition bei RT näher zu charakterisieren. Dabei
orientierten sich die gewählten Lipidkompositionen am FDA-Draft
(http 2) für Doxil® (HSPC/Chol/MPEG 2/1/0,16 mol/mol/mol) und an der für Myocet®
(EPC/Chol 7/3 mol/mol) angegebenen Lipidmischung. Als dritte Liposomenvariante wurden
HSPC/Chol (2/1 mol/mol) untersucht.
5.3.1 Trennung von mizellarem und liposomal assoziiertem PEG-Lipid über GPC
Für eine saubere NMR-Analytik zur Einlagerungskinetik der PEG-Lipidderivate in die
verschiedenen Liposomenpräparationen ist eine Trennung von gebundenem und freiem PEG-
Lipid nötig. Da die NMR Versuche jedoch Probenmassen im mg-Bereich benötigten wurde in
Konzentrationsbereichen weit oberhalb der CMC gearbeitet.
In der Literatur lassen sich für MPEG2000-DSPE-Mizellen Größenangaben von 30-50 nm
(Ishida et al. 1999) und für mizellare Strukturen der Sojasterol-Ethoxylate mit 30 EO-
Einheiten von ca. 7 nm finden (Folmer & Svensson 1999). Daher war insbesondere bei den
MPEG2000-DSPE-Derivaten eine Koelution von Liposomen und Mizellen im
Ausschlussvolumen zu befürchten.
Die DC Analytik der über die GPC gewonnenen Fraktionen beweist, dass eine Trennung der
Mizellen von Liposomen möglich ist. Wie nach der Literatur zu erwarten, trennen sich die
BPS-Mizellen aufgrund ihrer geringen Größe gut von den Liposomen ab.
Abb. 5-4 A zeigt, dass zwischen der für die NMR Quantifizierung verwendeten
liposomenhaltigen Hauptfraktion (Fraktion 5) und dem ersten freien PEG sechs Fraktionen (je
ca. 500 l) liegen. Außerdem wird deutlich, dass bereits eine sehr kurze Inkubationszeit
genügt, um eine signifikante BPS-Menge liposomal zu binden. Wie am Cholesterol-Fleck
(größter Rf-Wert) zu erkennen, schleppt sich ein Teil der Liposomen bis in die Fraktionen des
freien PEG hinein. Da es sich bei der quantitativen NMR Analytik jedoch um ein
Relativverfahren handelt und davon auszugehen ist, dass sich früh und spät eluierte
Ergebnisse und Diskussion 99
Liposomen in ihrem PEG-Anteil nicht unterscheiden, wurden lediglich die Hauptfraktionen
zur Quantifizierung genutzt.
Gleiches gilt für die MPEG2000-DSPE-Versuche, bei denen eine Trennung der beiden PEG-
Lipid-Spezies schwieriger war. Da sich das DSPE-PEG nicht mit Schwefelsäure visualisieren
lässt wurde hier DR zur Detektion genutzt, mit dem sich die Lipide nur schwer nachweisen
lassen. Dennoch zeigt Abb. 5-4 B deutlich, dass die NMR Probe (Fraktion 3), die die
Liposomenhauptfraktion darstellt, kein MPEG2000-DSPE enthält. Dass die Trennung im Falle
des DSPE-PEG erfolgreich war zeigen auch die Resultate der NMR-Quantifizierung.
5.3.2 Einlagerungsgeschwindigkeit und Transferraten der PEG-Lipide
Die Einlagerungsgeschwindigkeit der PEG-Sterole ist von Interesse um die Zeitspanne
abschätzen zu können, die nötig ist, bis sich ein Maximum der PEG-Lipide in die Membran
eingelagert hat.
Abb. 5-5 zeigt die zur Berechnung des PEG-Lipid Anteils der verschiedenen Liposomen
A B
Abb. 5-4: DC Kontrolle der Separation von freiem und liposomal assoziiertem PEG-Lipid
A: 1 min Inkubation, EPC/Chol 7/3 Liposomen, BPS, H2SO4-Detektion
B: 1 min Inkubation, EPC/Chol 7/3 Liposomen, MPEG2000-DSPE, Dragendorff-Detektion
L: Kontroll-Liposomen
B: BPS-Kontrolle
M: MPEG2000-DSPE
3-19: Fraktionsnummern
100 Ergebnisse und Diskussion
benutzten Kalibriergeraden. Mit Regressionskoeffizienten von R² > 0,999 ließ sich die
Einlagerung der PEG-Lipide in alle Präparationen hinreichend genau verfolgen.
Da die PEG-Lipide als Membrankomponenten eingesetzt werden, werden sie in der Arbeit
auch als Teil des Gesamtlipids (GL) betrachtet. Damit ergibt sich bei einer
Kalibrationsfunktion jedoch mit steigendem Anteil an PEG-Lipid ein geringerer Anteil an PL
und somit kein linearer Zusammenhang zwischen Peakfläche und mol% PEG-Lipid.
Um dennoch eine leicht auswertbare Kalibrationsgerade zu erhalten, wurde der PL-Gehalt der
einzelnen Kalibratoren konstant gehalten und mit steigenden PEG-Lipid-Mengen versetzt. In
Abb. 5-5 ist deshalb auf der x-Achse statt mol% der prozentuale Anteil der PEG-Lipide in
Bezug auf die übrigen Membranbestandteile exklusive dem PEG-Lipid (mol%exk) selbst
angegeben.
Die aus den Peakflächenverhältnissen der Proben über die Kalibrationsfunktion erhaltenen
Werte sind damit ebenso zu verstehen. Die Umrechnung der bei der Auswertung der Proben
gelieferten Ergebnisse in mol%exk lassen sich durch eine einfache Beziehung in mol%
überführen. Es gilt:
Abb. 5-5: Kalibrationsfunktionen zur Bestimmung des PEG-Lipid Anteils liposomaler Membranen
durchgezogene Linie:
BPS Kombinationen
━■━ EPC/Chol 7/3
━●━ HSPC/Chol
━▲━ HSPC/Chol/MPEG
gestrichelte Linie:
MPEG Kombinationen
┄□┄ EPC/Chol 7/3
┄○┄ HSPC/Chol
0 2 4 6 8 10 120,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
2,4
2,8
3,2
3,6
mol PEG-Lipid / mol andere Membranlipide [%]
Pea
kflä
chen
verh
ältn
is
PE
G-P
roto
nen/
Cho
lin-P
roto
nen
Ergebnisse und Diskussion 101
%mol%mol100
%mol100exk
exk
Gleichung 5-1
exk%mol%mol100
%mol100
Gleichung 5-2
Aus dem gezeigten linearen Zusammenhang ergibt sich die Möglichkeit, bei künftigen
Versuchen eine Einpunkt-Kalibrierung mit einem 100% Wert (nicht gesäulter Probenanteil)
vorzunehmen (Sou et al. 2000).
Außerdem lässt sich bei ermitteltem PL Gehalt und bekannter Länge des PEG-Anteils die
Kalibrationsfunktion leicht berechnen. Da der ermittelte PL-Gehalt als interner Standard
fungiert, kann auch die durchschnittliche EO-Einheiten Anzahl eines PEG-Derivates auf diese
Art ermittelt werden. Die beiden verwendeten PEG-Lipide haben eine deklarierte EO Anzahl
von 30 für BPS-30 und 45 für MPEG2000-DSPE. Auf Grundlage dieser PEG-Kettenlängen
Abb. 5-6: Berechnete und praktisch ermittelte Kalibrationsfunktion zur Bestimmung des BPS-Anteils in EPC/Chol 7/3 Liposomen
durchgezogene Linie:
━■━ berechnete
Kalibrationsfunktion
gestrichelte Linie:
┄□┄ gefundene
Kalibrationsfunktion
0 2 4 6 8 100,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
Peak
fläch
enve
rhäl
tnis
mol%
102 Ergebnisse und Diskussion
ergibt sich nach Korrektur des Lipidgehaltes der Kalibratoren durch die Bartlett-
Phosphatbestimmung die in Abb. 5-6 exemplarisch für die BPS-EPC/Chol-7/3
Kombinationen gezeigte gute Übereinstimmung der berechneten und experimentell
gefundenen Kalibrationsfunktion.
Abb. 5-7 zeigt die Einlagerungkinetik von BPS in Liposomen verschiedener Kompositionen.
Angeboten wurden 7,5 mol%, die sich im Falle der EPC/Chol 7/3 Liposomen zu ca. 90% in
die Liposomen einlagerten. Bei den beiden bei RT im Gelzustand vorliegenden HSPC-
basierenden Liposomen zeigte sich mit rund 30 % Einbau des angebotenen PEG-Lipids bei
den MPEG2000-DSPE-haltigen Liposomen und ca. 40 % bei den nicht PEGylierten Liposomen
ein deutlicher Unterschied zu den fluiden EPC-Membranen. Die
Einlagerungsgeschwindigkeit ist jedoch weitgehend unabhängig von der
Membrankomposition. Der Anteil an PEG-Lipid bei maximaler Sättigung der Membran
ergibt sich zu 6,75 mol% für die EPC/Chol 7/3-, 3,2 mol% für die HSPC/Chol- und 2,4 mol%
für die HSPC/Chol/MPEG-Liposomen.
Die bei der Versuchsreihe verwendeten Liposomen wiesen eine Größe von 110 - 120 nm
Durchmesser auf. Bei dieser Größe kann in guter Näherung von der gleichen Anzahl von
Lipidmolekülen im äußeren und inneren Monolayer ausgegangen werden. Aufgrund der
großen hydrophilen Reste der PEG-Lipide ist ein Flip-Flop ausgeschlossen und somit nur der
äußere Layer zugänglich, so dass sich in Bezug auf diesen ein doppelt so hoher prozentualer
PEG-Lipid-Anteil ergibt. Die differierenden Insertionsraten bei unterschiedlicher
Lipidkomposition lassen sich z.T. über die unterschiedlichen Phasenzustände der Membran
erklären. Die fluide EPC-Membran erlaubt offensichtlich einen höheren Einlagerungsanteil
als die rigiden HSPC-Membranen. Interessant ist die Tatsache, dass trotz des PEG-Lipid
Anteils der HSPC/Chol/MPEG Liposomen erhebliche weitere Einlagerung eines PEG-Lipids,
wenn auch mit geringerer Kettenlänge, möglich ist.
Abb. 5-8 zeigt die Ergebnisse der gleichen Untersuchungen mit MPEG2000-DSPE als PEG-
Lipid. Im Gegensatz zum BPS ist nach 4 Stunden Inkubation praktisch keine Einlagerung des
Derivates in die Liposomenmembranen erkennbar. Auch in der fluiden EPC Membran waren
über den beobachteten Zeitraum lediglich 3% des zupipettierten MPEG2000-DSPE liposomal
nachweisbar. Angesichts der langsamen Einlagerung des MPEG2000-DSPE in die beiden
untersuchten Liposomenpopulationen wurde auf eine Versuchsreihe mit HSPC/Chol/MPEG-
Liposomen verzichtet.
Ergebnisse und Diskussion 103
In der Literatur wird die Einlagerung von DSPE-PEG-Lipiden in Lipidmembranen
beschrieben. Diese führen jedoch nur bei Erhöhung der Temperatur auf 37 °C oder 60 °C
(Uster et al. 1996; Zalipsky et al. 1997; Sou et al. 2000; Iden & Allen 2001; Allen et al.
2002a; Moreira et al. 2002) zu nennenswerten Insertionsraten. Iden et al.(Iden & Allen 2001)
bringen die langsame Inkorporationskinetik der DSPE-PEG-Lipide mit der Tc der
untersuchten Membranen (HSPC/Chol 2/1 mol/mol bzw. Doxil®-Komposition) in
Zusammenhang und erhitzen daher zur Inkorporation von PEG-Lipid-Ligand-Konjugaten in
präformulierte Liposomen eine Stunde auf 60 °C.
Da die Transferrate in die bei RT fluiden Lipidmembranen (EPC/Chol 7/3, Abb. 5-8) keinen
signifikanten Unterschied zu der in die HSPC/Chol Membranen aufweist, ist der beschriebene
Modifikationserfolg bei 60 °C kaum mit dem Phasenzustand der Membran in Zusammenhang
zu bringen.
Die bei erhöhter Temperatur erfolgreiche Einlagerung der PE-PEG-Derivate in
Lipidmembranen kann vielleicht auf eine verringerte Stabilität der Mizellen bei höheren
Temperaturen zurückgeführt werden. DPH Anisotropiemessungen zeigten eine starke
Temperaturabhängigkeit der Beweglichkeit der Alkylseitenketten (Sou et al. 2000). Mit
steigender Temperatur wurde eine deutliche Verringerung der DPH-Anisotropie beobachtet,
die sich aus der Reduktion der hydrophoben Wechselwirkungen der Alkylketten
untereinander und verringerte Stabilität der Mizellen erklären lässt.
Ishida et al gehen bei der PIT von Mizellen der Komposition MPEG2000-DSPE und
MAL-PEG2000-DSPE im molaren Verhältnis von 4/1 aus, um Liposomen mit IgG zu
modifizieren. Zur Gewährleistung einer für Targetierungsversuche ausreichenden
Antikörperlast sind bei diesem Vorgehen 60 °C nötig. Dagegen beschreiben Zalipsky et al.
(1997) und Saul et al. (2003) ein erfolgreiches Targeting nach Inkubation von DSPE-PEG-
Ligand-Mizellen mit Liposomen bei 37 °C. Der Ligand war hier jeweils eine strukturell
kleines Molekül (Folat, Oligosaccharide, Peptide). Neben der unterschiedlichen Größe als
möglicher Ursache für das differierende Einlagerungsverhalten sollte auch über die
unterschiedliche Stabilität der Mizellen als möglichem Grund für dieses Phänomen
nachgedacht werden. Bei den von Zalipsky und Saul verwendeten DSPE-PEG-Ligand-
Derivaten handelt es sich um durch in einem vorgeschalteten Syntheseschritt stöchiometrisch
umgesetzte Produkte, bei denen die Endstruktur aller Moleküle durch die Einführung der
Liganden signifikant von der des grundlegenden PEG-PE abweicht. Es kann als davon
ausgegangen werden, dass sich das Phasenverhalten entscheidend geändert haben wird.
104 Ergebnisse und Diskussion
0 50 100 150 200 250
0
20
40
60
80
100
BPS
lipo
som
al a
ssoz
iiert
[%]
Zeit [min]
Lipidkompositionen:
━■━ EPC/Chol 7/3
━●━ HSPC/Chol
━▲━ HSPC/Chol/MPEG
Abb. 5-7: Einlagerung von BPS in Liposomen verschiedener Zusammensetzung als Funktion der Zeit
0 50 100 150 200 250
0
1
2
3
4
5
MPE
G20
00-D
SPE
lipos
omal
ass
oziie
rt [%
]
Zeit [min]
Lipidkompositionen:
━■━ EPC/Chol 7/3
━●━ HSPC/Chol
Abb. 5-8: Einlagerung von MPEG2000-DSPE in Liposomen verschiedener Zusammensetzung als Funktion der Zeit
Ergebnisse und Diskussion 105
Bei der Methode nach Ishida et al. (1999) hingegen wird von bereits bestehenden Mizellen
ausgegangen, bei denen nur einzelne DSPE-PEG Moleküle durch einen Ab modifiziert
werden, so dass die strukturelle Integrität der Mizellen nicht verändert wird.
Mit der nachgewiesenen selbstständigen Einlagerung der PEG-Sterole weist die
Versuchsreihe auf eine universelle Verwendbarkeit der Derivate zur Modifikation
unterschiedlicher präformulierter Liposomen hin.
5.3.3 Ergebnisse der mikrokalorimetrischen Untersuchungen (ITC)
5.3.3.1 Demizellisierungsexperiment
Bei der Injektion von 10 µl der mizellaren Lösung eines Lipids in die ITC-Probenzelle
(Volumen der Zelle ca. 1,4 ml) erfährt die Probe eine mehr als 100-fache Verdünnung. Die
Mizellen lösen sich dabei in Monomere auf. Dieser Prozess ist mit der Freisetzung oder
Aufnahme von Wärme verbunden. Mit ansteigender Detergenzkonzentration in der Zelle
kommt der Demizellisierungsprozess schließlich zum Erliegen, so dass nur noch
Verdünnungswärme zu beobachten ist.
Abb. 5-9: Beispiel für ein Demizellisierungsexperiment aus (Heerklotz & Seelig 2000) ; Titration von C12EO8 in Wasser
106 Ergebnisse und Diskussion
Abb. 5-9 zeigt den klassischen Verlauf eines Demizellisierungsexperimentes. Zu Beginn der
Titration lösen sich die Mizellen vollständig auf (vgl. Abb. 5-9 A). Aus den ersten Injektionen
lässt sich die molare Demizellisierungsenthalpie berechnen, indem das Integral der einzelnen
Injektionswärmen durch die Anzahl der injizierten Mole geteilt wird und die
Verdünnungswärme berücksichtigt wird. Diese ergibt sich aus dem Mittelwert der Wärmen
der letzten Peaks und resultiert aus geringen Temperaturdifferenzen zwischen der injizierten
Probe und dem Inhalt der Probenzelle.
Trägt man die ermittelten molaren Enthalpien gegen die Detergenzkonzentration in der Zelle
auf, ergibt sich ein sigmoider Kurvenverlauf, der den breiten Phasenübergang zwischen
Mizellen und Monomer beschreibt (vgl. Abb. 5-9 B). Die Auftragung der ersten Ableitung der
Kurve erlaubt dann eine präzise Bestimmung der CMC vgl. (Abb. 5-9 C).
Abb. 5-10 zeigt die Rohdaten eines Demizellisierungsversuches unter Verwendung von
BPS-20. Im kleinen Fenster ist die molare Demizellisierungswärme gegen die PEG-Lipid-
Konzentration in der Probenzelle aufgetragen. Obwohl die ersten drei Injektionen zu
Konzentrationen innerhalb der Zelle führen, die unterhalb der mittels der DPH-Methode
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
-0,25
-0,20
-0,15
-0,10
-0,05
0,00
0,05
0,00 0,05 0,10 0,15
-20,92
-16,74
-12,55
-8,37
-4,18
0,00
4,18
Ges
amtw
ärm
e pr
o In
jekt
ion
[kJ/
mol
]
PEG-Lipid-Konzentration [mM]
µcal
/sec
Zeit [min]
Abb. 5-10: Darstellung der Rohdaten (großer Graph) und der daraus bestimmten molaren Demizellisierungsenthalpien bei Titration von BPS-20 in Puffer
Ergebnisse und Diskussion 107
ermittelten CMC liegen, ist kein Phasenübergang zwischen Mizelle und Monomer zu
erkennen. Dies spricht für einen sukzessiven Abbau der Mizellen über immer kleiner
werdende Strukturen bis hin zum Monomer.
5.3.3.2 Verteilungsexperiment
Beim ITC-Verteilungsexperiment wird eine Vesikeldispersion in eine detergenzhaltige
Lösung injiziert, deren Konzentration unterhalb der CMC liegt. Dadurch wird direkt die
Wärme ermittelt, die bei der Einlagerung des BPS-20 in die Liposomenmembran frei oder
verbraucht wird.
Das Verteilungsexperiment sollte dazu dienen, den Verteilungskoeffizienten K nach
Schurtenberger als ein Maß für die Bindungsstabilität der Verankerung in der
Liposomenmembran zu ermitteln. Dieser sollte in gleicher Weise auch für MPEG2000-DSPE
bestimmt werden. Aufgrund der niedrigen CMC des PE-PEG war die Auswertung der
erhaltenen Signale jedoch noch schwierig.
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20
-1,67
-1,46
-1,26
-1,05
-0,84
-0,63
-0,42
-0,21
0 20 40 60 80 100
-0,08
-0,06
-0,04
-0,02
0,00
0,02
µcal
/sec
Zeit [min]
Ges
amtw
ärm
e pr
o In
jekt
ion
[kJ/
mol
]
Lipidkonzentration [mM]
Abb. 5-11: Rohdaten und die daraus berechneten molaren Verteilungsenthalpien der individuellen Injektionen in Abhängigkeit der Lipidkonzentration
108 Ergebnisse und Diskussion
Abb. 5-11 zeigt im kleinen Graphen den Verlauf eines Verteilungsexperiments. Die
Lipidkonzentration in der Zelle betrug 4 µM, die der Liposomendispersion 5 mM. Das
Experiment wurde bei RT durchgeführt. Bereits nach der ersten auswertbaren Injektion (der
erste kleine Peak muss ignoriert werden, vgl. 4.5.3.2) ist ein Großteil des zur Verfügung
stehenden PEG-Lipids im Lipidbilayer gebunden. Die folgenden Injektion liefern nur noch
kleine Signale, die letzten Injektionen stellen die durch die Verdünnungswärme resultierenden
Peaks dar. Die durchgezogene Linie repräsentiert den vom Computer nach 4.5.3.2 errechneten
optimalen Fit mit einem lipidnormierten Verteilungskoeffizienten K von 61,3 mmol-1 . Die
gestrichelten Linien stellen berechnete Fitfunktionen dar, bei denen im flacheren Verlauf von
einem K von 50 mmol-1 und im steileren Verlauf von einem K von 500 mmol-1 ausgegangen
wurde. Die Abbildung demonstriert, dass bei K-Werten im Bereich von 50-500 mmol-1 ein
guter Fit nach 4.5.3.2 möglich ist. Da die Methode an ihre Grenzen stößt, ist auf diese Art
keine genauere Aussage möglich. Der tatsächliche K-Wert dürfte allerdings eher oberhalb von
50 mmol-1 liegen, da die Datenpunkte eher eine Abweichung des berechneten K-Werts hin zu
höheren K-Werten erlauben. Wiederholungen der Experimente ergaben konsequenter Weise
auch einen durchschnittlichen K-Wert von ca. 85 mmol-1. Messungen bei 50 °C ergaben
ähnliche Werte.
Auch für MPEG2000-DSPE wurden Verteilungsexperimente durchgeführt. Hier wurden
EPC/Chol 4/1 Liposomen verwendet und die Lösungen wurden auf 60 °C erhitzt bevor mit
den Messungen begonnen werden konnte. Außerdem lag die Konzentration der verwendeten
PEG-PE Lösung oberhalb der selbst ermittelten CMC (vgl. 4.2) jedoch unter dem in (Sou et
al. 2000) angegebenen Wert. Diese Kompromisse mussten eingegangen werden um überhaupt
messbare Signale zu erhalten. Die Ermittlung eines K-Wertes für MPEG2000-DSPE ist nach
dem geschilderten Verfahrens streng genommen nicht zulässig, da die geschilderte
Auswertungsfunktion die durch das PEG-PE in die Membran eingebrachte Ladung nicht
berücksichtigt. Dennoch lieferte das Model einen guten Fit (Chi² < 1000) der Messpunkte.
Die auf Grundlage dieser Versuche ermittelten K-Werte lagen zwischen 60 und 130 mmol-1
und damit in einem ähnlichen Bereich wie die des BPS-20.
5.3.3.3 Solubilisierungsexperimente
Beim einem ITC-Solubilisierungsexperiment wird eine Detergenzlösung zu einer
Vesikelpräparation titriert. Der klassische Verlauf eines Solubilsierungsexperimentes stellt
Ergebnisse und Diskussion 109
sich wie folgt dar: Zu Beginn der Titration lagert sich immer mehr Detergenz in die Membran
ein, wodurch diese mehr und mehr gesättigt wird. Dies führt zu immer geringeren
Wärmemengen währender ersten Injektionen. Ab einer bestimmten Konzentration ist die
Membran gesättigt und die weitere Injektion von Detergenz führt nicht mehr zur Einlagerung
von Detergenz, sondern zur Koexistenz von Liposomen und Mizellen. Der Koexistenzbereich
existiert häufig über einen größeren Bereich und zeigt deutlich andere Wärmen als zu Beginn
der Titration. Ab einer kritischen Konzentration des Detergenz in der Zelle beginnt die
Solubilisierung der Membran, was sich abermals in einer Änderung der Wärmen der
Einzelinjektionen äußert.
Tragt man die beobachteten Wärmen gegen den Molenbruch aus Detergenz und PL Menge
auf, erhält man ein Diagramm, dass die Phasengrenzen des Systems Detergenz/PL
charakterisiert.
Abb. 5-12: Darstellung eines klassischen Solubilisierungsexperiments (A) bzw. deren Umkehrung (B) durch Titration von Mizellen mit PL-Vesikeln aus (Heerklotz & Seelig 2000)
110 Ergebnisse und Diskussion
Abb. 5-12 ist aus (Heerklotz & Seelig 2000) entnommen und demonstriert die Beobachtungen
für Palmitoyl-Oleoylphosphatidycholin (POPC) Vesikel (5 mM), die mit einer 100 mM
C12EO7 Lösung titriert wurden (A). Die einzelnen Phasen sind gut zu unterscheiden. Auch die
umgekehrte Vorgehensweise ist möglich wie in Teil B der Abbildung zu sehen. In diesem
Fall wurde von Mizellen (4,9 mM C12EO7) ausgegangen, zu denen eine POPC-
Vesikeldispersion (15 mM) titriert wurde. Beide Experimente liefern dieselben
Phasengrenzen.
Vergleicht man die Beobachtungen der Untersuchung der Titration von EPC Vesikeln (5 mM)
mit BPS-20 (46,6 mM), zeigt sich ein vollkommen anderes Bild. Die ohne Cholesterolzusatz
hergestellten Vesikel zeigen kein klassisches Solubilisierungsmuster.
Die Titration zeigt lediglich die zu Beginn zu erwartende Abnahme der Einzelwärmen durch
die Sättigung der Membran. Bis zu einem Molverhältnis von 1:1 lassen sich keine
Solubilisierungstendenzen der Membran feststellen.
Diese Beobachtung spricht für einen weiten Bereich der Koexistenz von BPS Mizellen und
PL Vesikeln ohne Entstehung von Mischmizellen durch Membransolubilisierung.
Abb. 5-13: Darstellung der Ergebnisse der Rohdaten und der Auftragung der Wärmen der Einzelinjektionen gegen das molare PEG-Lipid/Lipid -Verhältnis (kleiner Graph)
0 50 100 150 200 250 300
-10
-8
-6
-4
-2
0
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-10,00
-8,00
-6,00
-4,00
-2,00
0,00
Gea
mtw
ärm
e pr
o In
jekt
ion
[kJ/
mol
]
molPEG-LIPID
/molLipid
µcal
/sec
Zeit [min]
Ergebnisse und Diskussion 111
5.3.3.4 Zusammenfassung der ITC-Experimente
Insgesamt sind die Ergebnisse der ITC-Untersuchungen zwar schwer zu interpretieren, liefern
jedoch einige wichtige Informationen .Die ITC-Verteilungsexperimente liefern einen sehr
hohen Verteilungskoeffizienten K und deuten damit auf eine stabile Verankerung der
Sterolanker in der Membran hin. Außerdem konnte gezeigt werden, dass selbst reine EPC-
Membranen auch bei hohen BPS-Konzentrationen nicht solubilisiert werden. Das
Demizellisierungsexperiment deutet auf einen sehr breiten Konzentrationsbereich hin in dem
der Übergang zwischen Mizellen und Monomeren von Statten geht.
5.3.4 Freisetzung von liposomal verkapseltem Calcein während der Einlagerung von BPS in präformulierte Liposomen
Die exklusive Insertion der PEG-Sterole in den äußeren Monolayer lässt das Auftreten von
Membranspannungen vermuten, die Ursache für Entstehung von Membranschäden und in der
Folge dem Austreten von verkapseltem Material sein könnten. Daher sollte untersucht
werden, ob Membrandefekte während der Einlagerung der PEG-Sterole ihre Nutzung durch
die Entstehung permanenter Poren oder einem vorübergehenden aber massiven
Materialverlust unmöglich machen. Das zu diesem Zweck in den hydrophilen Innenraum in
selbst quenchender Konzentration eingeschlossene Calcein führt bei Freisetzung aus den
Liposomen und die dadurch bedingte starke Verdünnung zu einem Anstieg der Fluoreszenz
der Probe.
5.3.4.1 Freisetzung unterhalb der CMC
In dieser Versuchsreihe lagen die Konzentration der PEG-Sterole auch bei der größten Menge
an zugesetztem BPS (Endkonzentration in der Küvette: 2,5 µM, Lipidkonzentration
2,5 - 5 µM) unterhalb der CMC. Die beobachtete Calcein-Freisetzung ist damit ausschließlich
auf bei der Insertion auftretende Vorgänge zurückzuführen und nicht mit eventuellen
Solubilisierungseigenschaften von BPS-Mizellen in Zusammenhang zu bringen.
Abb. 5-14 zeigt die freigesetzten Calcein-Mengen aus den drei Standardliposomentypen. Wie
zu erwarten erwiesen sich die fluiden EPC-Membranen gegenüber der Einlagerung des BPS
als am empfindlichsten. Die Unterschiede der Freisetzung zwischen den HSPC/Chol- und
112 Ergebnisse und Diskussion
MPEG/Chol-Liposomen sind hingegen wenig ausgeprägt.
Wie der Abb. 5-15 zu entnehmen strebt die Freisetzung des Calceins aus den Liposomen nicht
in jedem Fall einem Endwert zu. Dargestellt ist der relative Fluoreszenzanstieg in Bezug auf
den maximalen zu verzeichnenden Anstieg bei Zerstörung der Liposomen mit Triton über die
Zeit, in Abhängigkeit vom zupipettierten BPS Anteil. Die Auftragsweise wurde gewählt, da
aufgrund der geringen Volumina der eingesetzten Liposomendispersionen durch den
Pipettierfehler unterschiedliche Grundfluoreszenz resultiert, die einen direkten Vergleich der
Fluoreszenzverläufe unübersichtlich macht.
Bei höheren Konzentrationen an BPS in der Küvette (30 und 50 mol%) kann es zu einer
bleibenden Steigerung der Permeabilität der Membran kommen. Dies war bei EPC/Chol 7/3
in jedem Versuch der Fall, während bei den HSPC basierenden Liposomen das Auftreten
dieses Effektes nicht reproduzierbar war (vgl. Abb. 4-5).
Die in Abb. 5-14 dargestellten Ergebnisse der Leakage Versuche stellen also im Falle der 30
und 50 mol%igen Zugabe von BPS keine Endwerte dar. Es ist mit einem geringen Anstieg im
weiteren Verlauf zu rechnen. Ab 15 mol% BPS Zusatz war bei keiner der Formulierung eine
Abb. 5-14: Prozent freigesetztes Calcein 50 min nach Zugabe variabler Mengen BPS zu Liposomen (2,5 - 5 µM) verschiedener Membranzusammensetzung
1 3 7.5 15 30 500
2
4
6
8
10 EPC/Chol 7/3 HSPC/Chol HSPC/MPEG
freig
eset
ztes
Cal
cein
[%]
BPS [mol%]
Ergebnisse und Diskussion 113
bleibende Schädigung der Liposomen zu verzeichnen. Nach Zugabe des BPS kommt es hier
zu einem raschen initialen Anstieg der Fluoreszenzintensitäten, die sich innerhalb von ca. 15
min auf bleibendem Niveau einpendeln. Nach dieser Zeit “heilen“ also die Membrandefekte.
Abb. 5-16 führt die Vorgänge für einen 7,5 mol%igen Zusatz von BPS für die drei
untersuchten Liposomenpräparationen auf. Die Freisetzung liegt für die EPC/Chol 7/3-
Liposomen bei ca. 4,5 % und für die HSPC basierenden Liposomen im Mittel bei ca. 2%.
Ein Zusatz von 15 mol% BPS und weniger, wie im Rahmen dieser Arbeit geschehen, ist
damit für die Stabilität der Liposomenmembran bei allen drei Liposomenpräparationen
zunächst als unproblematisch zu betrachten. Der freigesetzte Anteil des verkapselten
Materials kann - falls nötig - durch einen geeigneten Separationsschritt (GPC, Dialyse,
Ultrazentrifugation) abgetrennt werden. Da die Schädigung der Membranen nur
vorübergehender Natur ist, ist kein neuerliches Auftreten des verkapselten Materials zu
erwarten.
Betrachtet man die NMR-Einlagerungsversuche und die Versuche zur Calcein-Freisetzung im
Zusammenhang ergeben sich einige Diskussionspunkte.
━■━ 50 mol%
┄○┄ 30 mol%
━▲━ 15 mol%
┄□┄ 7,5 mol%
━●━ 3 mol%
┄△┄ 1 mol%
Abb. 5-15: Calceinfreisetzung aus EPC/Chol 7/3 Liposomen mit verschiedenen Mengen an BPS (5 µM GL)
0 10 20 30 40 50
0
2
3
5
7
8
freig
eset
ztes
Cal
cein
[%]
Zeit nach BPS Zugabe [min]
114 Ergebnisse und Diskussion
Die NMR-Experimente demonstrieren, dass die Einlagerung in die Liposomen bei keiner der
Präparationen vollständig ist. Die gut 90%ige Einlagerung des angebotenen BPS (von 7,5
mol% in Bezug auf das GL, vgl. Abb. 5-7) in die EPC/Chol 7/3-Liposomen führt zu einem
BPS Anteil von 6,75 mol% des GL.
Bei den anderen Liposomenpräparationen lagen die Werte bei 3,2 mol% und 2,4 mol%
(HSPC/Chol, HSPC/Chol/MPEG). Die Leakageversuche haben einerseits gezeigt, dass die
Einlagerung eines solchen Prozentsatzes BPS in den äußeren Layer nicht zu permanenten
Membranschäden führt, so dass nach Abtrennen des initial austretenden verkapselten
Materials mit einer stabilen Formulierung umgegangen werden kann. Andererseits zeigt sich
aber auch, dass das Zupipettieren von BPS oberhalb der Molprozentsätze, die bei den NMR
Versuchen als Maximum ermittelt wurden (nämlich 6,75, 3,2 und 2,4 mol% je nach
Lipidkomposition), bei den Leakageversuchen auch dann noch einen Einfluss auf die
Freisetzung hat, wenn die Einlagerung laut NMR abgeschlossen ist. Dies deutet auf
Flippflopp-Ereignisse in der Membran hin, zumindest der nicht PEGylierten Membranlipide,
wodurch in geringem Maße neue Membrandefekte auftreten.
Zu beachten ist jedoch, dass bei den NMR-Versuchen oberhalb und den Leakageversuchen
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0
1
2
3
4
5
6
freig
eset
ztes
Cal
cein
[%]
Zeit nach BPS Zugabe [min]
━■━EPC/Chol 7/3
━●━HSPC/Chol
━▲━HSPC/Chol/MPEG
Abb. 5-16: Calceinfreisetzung aus den verschiedenen Liposomenkombinationen bei Zugabe von 7,5 mol% BPS (2,5 - 5 µM GL)
Ergebnisse und Diskussion 115
unterhalb der CMC gearbeitet wurde.
Im letzten Fall besteht ein Gleichgewicht also nur zwischen membranär gebundenem und
freiem BPS. Da unterhalb der CMC für das Monomer kein mit der Liposomenmembran
konkurrierendes Kompartiment zur Einlagerung zur Verfügung steht, lassen sich über einen
breiten Konzentrationsbereich Auswirkungen auf das Freisetzungsverhalten von Calcein
vermessen. Die vollständige Einlagerung von 50 mol% BPS ausschließlich in den äußeren
Monolayer ohne vollständige Desintegration des Vesikels ist kaum vorstellbar. Im
submizellaren Bereich ist zu erwarten, dass sich mit steigender Konzentration eine Sättigung
der Membran einstellt, so dass sich nun ein Gleichgewicht zwischen freiem und
membrangebundenem BPS ausbildet. Dieses sollte sich mehr und mehr auf die Seite des
freien Monomers verschieben.
Dies zeigt sich auch in der Auftragung der Calcein-Freisetzung gegen die zugefügte BPS
Menge. Abb. 5-17 zeigt mit steigender BPS Menge eine deutliche Abflachung der prozentual
freigesetzten Calceinmenge was auf einen wachsenden Anteil auf ungebundenem Monomer
hindeutet.
Insgesamt ist die Einlagerung des PEG-Lipids in die Membran der experimentell untersuchten
Abb. 5-17: Prozentuale Freisetzung von Calcein in Abhängigkeit von Lipidkomposition und zugeführter Menge BPS (2,5 - 5 µM GL)
0 10 20 30 40 50
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
freig
eset
ztes
Cal
cein
[%]
zugeführte Menge BPS [mol%]
━■━ EPC/Chol 7/3
━●━ HSPC/Chol
━▲━ HSPC/Chol/MPEG
116 Ergebnisse und Diskussion
Liposomen weder mit bleibenden Membranschäden noch mit einem massiven Verlust des
verkapselten Materials verbunden. Der Anteil an freigesetztem Calcein ist im für die
Kopplung von Liganden interessanten Bereich von 1 - 7,5 mol% aktiviertem BPS mit 1-4%
sehr niedrig. Die Zahlenwerte sind vergleichbar mit den Prozentsatz der bei Verwendung der
PIT für den Arzneistoff Doxorubicin gefunden wurden (Ishida et al. 1999).
Die Kopplung von Liganden an die Oberfläche von Liposomen verläuft jedoch zumeist in
Konzentrationsbereichen oberhalb der CMC, so dass mit Solubilisierungseffekten zu rechnen
ist, die eine Steigerung der Calcein-Freisetzung zur Folge haben können. Daher wurden
Experimente durch geführt, die die Calcein-Freisetzung oberhalb der CMC untersuchten.
5.3.4.2 Freisetzung oberhalb der CMC
Oberhalb des Konzentrationsbereiches der CMC stellt sich die Situation wie folgt dar: Die
Insertion in die Vesikelmembran wird oberhalb eines von der Lipidzusammensetzung des
Vesikels abhängigen Sättigungsbereiches zugunsten der bei diesen Verhältnissen
thermodynamisch günstigeren Mizelle zurückgedrängt.
Da die EPC/Chol 7/3 sich gegenüber der Wechselwirkung mit BPS am empfindlichsten
erwiesen hatte, wurde mit dieser Formulierung der Einfluss von BPS-Mizellen auf die
Freisetzung von Calcein untersucht. Dazu wurde wie unter 4.5.4.2 geschildert vorgegangen.
Die angebotene Menge BPS betrug 7,5 mol% BPS und entsprach damit der üblicherweise bei
der Kopplung verwendeten Menge an aktiviertem BPS.
Die Versuchsreihe war zunächst als eine Kinetikstudie gedacht. Bereits nach den ersten
Versuchsreihen stellte sich jedoch heraus, dass die Freisetzung des Calceins, analog zu den
Beobachtungen der Einlagerung von BPS in die verschiedenen Liposomentypen, bereits
innerhalb weniger Minuten abgeschlossen war (vgl. Abb. 5-18). Geht man davon aus, dass die
bei den NMR Versuchen für diesen Liposomentyp gefundene Einlagerungsrate von 90% auch
unter den in diesen Versuchen gewählten Bedingungen Gültigkeit hat, bedeutet dies, dass
nach Absättigung der Membran noch 10% der zugefügten Menge BPS frei in der Probe
vorliegen. Dies entspricht einer Endkonzentration von rund 50 µM und liegt somit deutlich
über der CMC des BPS.
Im Standardprotokoll (vgl. 4.6.1) ist für den zweiten Inkubationsschritt, bei dem der Kontakt
zwischen Liposom und BPS zu Stande kommt, mindestens eine Stunde Inkubationszeit
Ergebnisse und Diskussion 117
vorgesehen. Da die Freisetzung des Calceins jedoch nur initial stattfindet und innerhalb von
15-30 min abgeschlossen ist, wurden in den folgenden Versuchen mindestens 30 min nach
Zugabe des BPS zur Liposomendispersion Proben genommen und vor und nach der
Zerstörung der Liposomen durch Triton vermessen.
Das Erreichen eines stabilen Freisetzungsniveaus erlaubt das problemlose Vermessen
mehrerer Proben nebeneinander. Durch wiederholte Fluoreszenzermittlung derselben Probe
ist eine genauere Bestimmung der freigesetzten Calceinmenge möglich. Gleiches gilt auch für
die Vermessung der Leerwerte, die zur Ermittlung des Faktors (FI) dienten (vgl. 4.5.4.2), der
für die Berechnung der theoretischen Anfangsfluoreszenz (I0t) der BPS-haltigen Liposomen
bestimmt werden musste. Daher wurden zur Ermittlung des Faktors (FI) mindestens 15
Messwiederholungen (mit langer Integrationszeit der Einzelmessung) desselben Ansatzes
vorgenommen. Abb. 5-19 zeigt die prozentuale Calcein-Freisetzung aus EPC/Chol 7/3-
Liposomen nach Zugabe von 7,5 mol% BPS im mizellaren Bereich. Die Ermittlung des freien
Anteils begann frühestens 30 min nach Zupipettieren des BPS um sicherzustellen, dass die
maximale Calceinmenge freigesetzt wurde. Die Bestimmung der prozentualen Freisetzung
des Calceins beruht auf wenigstens neun Messwiederholungen pro Ansatz.
0 40 80 120 160 200 240-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
freig
eset
ztes
Cal
cein
[%]
Zeit nach BPS Zugabe [min]
Abb. 5-18: Freisetzung von Calcein aus EPC/Chol 7/3 Liposomen in Anwesenheit von 54 M BPS in Abhängigkeit der Zeit (n = 2)
118 Ergebnisse und Diskussion
Aus den drei unabhängigen Ansätzen ergab sich im Mittel eine Freisetzung von ca. 6,3 % des
verkapselten Calceins. Die Freisetzung ist damit ca. 2,5 % höher als im submizellaren Bereich
(in Bezug auf die maximale Freisetzung).
Festzuhalten ist, dass auch in Anwesenheit von mizellaren BPS-Strukturen bei der für die
Kopplung relevanten Obergrenze von 7,5 mol% aktiviertem BPS keine bleibenden
Membranschäden auftreten. Eine Abtrennung von eventuell im Ansatz befindlichen BPS-
Mizellen während des zweiten Inkubationsschritts muss also nicht zwingend in zeitlich engem
Rahmen nach Beginn der Insertion erfolgen, um die Freisetzung von verkapseltem Material
zu unterbinden.
Abb. 5-19: Freisetzung von Calcein aus EPC/Chol 7/3 Liposomen in Anwesenheit von 54 M BPS
1 2 3 Mittel0
1
2
3
4
5
6
7
8 6,27
freig
eset
ztes
Cal
cein
[%]
Ansatz
Ergebnisse und Diskussion 119
5.4 Oberflächenmodifikation von präformulierten Liposomen
mit BSA als Modellprotein
Dieses Kapitel der Arbeit beschäftigt sich mit dem Kopplungspotential der aktivierten PEG-
Sterole unter Verwendung von BSA als Modellprotein. Untersucht wurde die Abhängigkeit
der Kopplungseffizienz von der Lipidkomposition der Membran, der BSA-Konzentration,
dem pH-Wert und der Dauer der beiden Inkubationsschritte (vgl. 4.6.1). Weitere Gegenstände
des Kapitels sind die Calcein-Freisetzung bei der Einlagerung der Sterol-PEG-BSA-
Konjugate in die Liposomenmembran sowie die Stabilität der Verankerung in Anwesenheit
von humanem Serum. Unterkapitel 5.4.2.6 beschäftigt sich mit der Entwicklung der
Partikelgröße nach Zugabe der Liposomen zum hydrophobisierten Protein.
5.4.1 Versuche unter Verwendung von tresyliertem Generol E-25
Während des ersten Inkubationsschrittes des Standardkopplungsprotokolls erfolgt die
Derivatisierung (im Folgenden wegen des Anbringens des Sterols am Protein auch
“Hydrophobisierung“ genannt) des Proteins. Durch das Umsetzten mit dem aktivierten Lipid
entsteht eine kovalente Bindung zwischen Sterol-PEG und Protein. Die chemischen Abläufe,
die während dieses Schrittes von statten gehen, werden im folgenden Schema stark
vereinfacht, dargestellt (vgl. Abb. 5-20).
Die Kopplung von tresyliertem PEG mit Aminogruppen wurde nach der Entdeckung der
Tresylate zunächst als eine einfache Alkylierung mit einer resultierenden sekundären
Aminstruktur angesehen. Bei diesem Reaktionsweg fungiert das Tresylat im Sinne einer SN2-
Reaktion als Abgangsgruppe (Nilsson & Mosbach 1984). Spätere Studien (King & Gill 1996;
Sperinde et al. 1999) brachten weitere Reaktionswege in den Focus, von dem die
-Eliminierung/Michael-Addition der wichtigste ist. Diese endet in der Formation eines
Sulfoacetamids. Der dritte wichtige Reaktionsweg ist die Hydrolyse, bei der auf dem
Hauptweg der Tresylatabspaltung eine Inaktivierung des PEG vonstattengeht.
Während das auf dem ersten Weg gebildete sekundäre Amin (vgl. Abb. 5-20 Mitte) in vivo
stabil ist, besteht bei der Sulfoacetamidbindung Hydrolysegefahr. Zudem bietet die
Ausbildung des sekundären Amins die Möglichkeit die ursprünglichen Ladungsverhältnisse
des Liganden beizubehalten. Die üblichen aminoaktiven Kopplungen, sowie auch die
thiolaktiven Kopplungen, die aufgrund des häufigen Fehlens einer Thiolfunktion auf die
Derivatisierung eines Amins zurückgreifen, enden in einem Verlust der ursprünglichen
Ladung des Liganden durch Bildung eines Carbamates oder Amids.
120 Ergebnisse und Diskussion
Neben dem Vorteil der in vivo Stabilität ist die Bildung des Amins also auch deswegen zu
katalysieren, da mit der Konservierung der positiven Ladung am Liganden auch eine bessere
biologische Aktivität desselben zu erwarten ist (Zalipsky 1995).
Durch die Wahl eines pH-Werts von 8-9 im wässrigen Medium kann die Bildung eines
sekundären Amins gegenüber den Nebenreaktionen gefördert werden (Sperinde et al. 1999).
Die Reaktion bei tieferen Temperaturen kann eine weitere Steigerung der Aminbildung
bringen. Dies ist jedoch in Abhängigkeit von den Konzentrationsverhältnissen und dem pks-
Wert des Liganden zu betrachten.
Generell bringt ein schwach basischer pH-Wert eine Verbesserung der Ausbeute an
sekundärem Amin. Daher wurde in dieser Arbeit nach Untersuchung des optimalen pH-
Wertes für eine möglichst effiziente Kopplung ein Boratpuffer mit einem pH-Wert von 8,3 -
8,5 als Reaktionsmedium gewählt.
Abb. 5-20: Reaktionsschema zur Kopplung von aminhaltigen Liganden mit BPS-TRE
OO
S
O
O
F
FF
HN-BSA
OSO
O
O
OSterol
HN-BSAOSterol
n=30
n=30
NH2 BSA
n=30
H2O, pH 8-9
Acylierung
Alkylierung
Hydrolyse
OHOSterol
n=30
Ergebnisse und Diskussion 121
5.4.1.1 Grundsätzliche Eignung tresylierter Sojasterole zur Kopplung von BSA an Liposomen
Die ersten Versuche zur Untersuchung tresylierter Sojasterole als mögliche Reagenzien zur
Kopplung von Proteinen an Liposomen wurden unter den von A. Lung (Lung 2002)
beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Da eine Neusynthese der Substanzen nötig war
und eine Modifikation im Kopplungsprotokoll (Umstellen der Kopplung auf das
Standardprotokoll (vgl. 4.6.1)) zu Gunsten einer besseren Reproduzierbarkeit der einzelnen
Versuche vorgenommen worden war, beschäftigten sich die ersten Versuche mit der
grundsätzlichen Überprüfung des Kopplungspotentials des tresylierten Generols (GET) unter
den veränderten Bedingungen.
Wie in Abb. 5-21 zu sehen, führt die Behandlung von BSA mit tresyliertem Generol zur
Elution des Proteins mit den Liposomen. Wird das Protein mit Generol E-25 inkubiert, ist
keine Anreicherung des BSA in den liposomalen Fraktionen erkennbar. Damit ist eine passive
Anlagerung des Proteins auf der Liposomenoberfläche als Ursache für die Koelution von
Liposomen und Protein auszuschließen.
5 10 15 20 25
0
10
20
30
40
50
60
70
BS
A [%
]
Elutionsvolumen [ml]
━■━ Elutionsprofil bei
Verwendung von GET
im ersten
Inkubationsschritt
┄□┄ Elutionsprofil bei
Verwendung von
Generol E-25 im ersten
Inkubationsschritt
Abb. 5-21: Vergleich des Elutionsverlaufs von BSA bei der Verwendung von GET bzw. nicht tresyliertem Generol während des ersten Inkubationsschritts.
122 Ergebnisse und Diskussion
5.4.1.2 pH-Abhängigkeit der Kopplung mittels tresyliertem Generol
Für die Konjugation von tresyliertem PEG an verschiedene Amine ist eine pH-Abhängigkeit
der Kopplungseffizienz beschrieben (Sperinde et al. 1999). Die Reaktion verläuft in schwach
basischem pH-Bereich besonders effektiv. Das genaue pH-Optimum ist dabei auch von den
pKs-Werten der Amine des zu koppelnden Liganden abhängig und daher von Protein zu
Protein unterschiedlich. Dennoch sollte untersucht werden, ob im pH-Bereich von 8,3 bis 9,0
signifikante Unterschiede der Kopplungseffizienz zu verzeichnen sind, die darauf hindeuten,
dass der gewählte pH-Wert außerhalb des pH-Optimums für effiziente Kopplung liegt. Als
Vergleichswert wurde die einstellbare BSA-Oberflächen-Dichte in µg/µmol GL (vgl. 5.4.2.3)
ermittelt.
Bei vollständiger Kopplung des angebotenen Proteins an die Liposomenoberfläche ergab sich
unter den Bedingungen (vgl. 4.6.3.2) eine maximale Ligandendichte von 25 µg/µmol GL
(4,85 nmol BSA/13 µmol GL; 35,7 µg BSA/mg GL).
Abb. 5-22 illustriert die Ergebnisse der Untersuchungen zur pH-Abhängigkeit der Kopplung.
Wie in der Literatur beschrieben zeigt sich die deutliche Abhängigkeit der Kopplungseffizienz
vom pH-Wert. Bei einem pH-Wert von 7,4 ist die Hydrolyse von wesentlich größerer
Abb. 5-22: pH-Abhängigkeit der Kopplungseffizienz bei Verwendung von GET
7,4 8,3 8,5 8,7 90
5
23
24
25
BS
A-D
icht
e [µ
g/µm
ol G
L]
pH-Wert
Ergebnisse und Diskussion 123
Bedeutung als im schwach alkalischen pH-Bereich. Die im PBS ermittelte Ligandendichte
von ca. 8,3 µg/µmol GL entspricht der Kopplung von ca. 33%.
Im pH-Bereich von 8,3 - 9,0 zeigt sich die eindeutige Tendenz, dass mit steigendem pH-Wert
höhere Kopplungsausbeuten erzielbar sind. Die prozentualen Kopplungseffizienzen liegen mit
95 % bei einem pH-Wert von 8,3 und 99 % bei einem pH von 9,0 jedoch sehr nah
beieinander. Da die Kopplung über die Bildung des in vitro stabilen sekundären Amins bei
pH-Werten knapp über 8,0 bevorzugt abläuft, während höhere pH-Werte die Bildung des
hydrolyseempfindlichen Sulfoacetamids fördern, wurde als vertretbarer Kompromiss
zwischen Kopplungsausbeute und zu erwartendem Anteil an entstehenden sekundären
Aminen ein Boratpuffer mit einem pH-Wert von 8,3 - 8,5 als Standardkopplungspuffer
festgelegt. Höhere pH-Werte können zudem die Anwendbarkeit der Methode einschränken,
da Instabilitäten mit pH-empfindlichen Liganden zu befürchten sind und in dem Fall, dass der
Kopplungspuffer gleich dem Liposomenpuffer gewählt werden muss, auch die PL zunehmend
hydrolysiert werden.
5.4.1.3 Abhängigkeit der Kopplungseffizienz von pH-Wert und Ankerkonzentration
In den meisten Kopplungsversuchen wurden routinemäßig 7,5 mol% Anker eingesetzt. Dies
gewährleistet eine nahezu vollständige Kopplung bei gleichzeitig maximaler sterischer
Stabilisierung der Liposomen durch die tresylierten PEG-Sterole (vgl. 5.3.2), die durch
Kopplung oder Hydrolyse inaktiviert werden. Die durch die Einlagerung provozierten
Verluste an verkapseltem Material liegen zudem im vertretbaren Bereich (vgl. 5.3.4.2).
Abb. 5-23 zeigt, dass bereits 5 mol% GET für eine nahezu vollständige Fixierung des BSA
am Liposom ausreichen. Auch bei der niedrigen Konzentration von 0,5 mol% werden schon
ca. 60% des zur Kopplung zur Verfügung stehenden Proteins mit den Liposomen koeluiert.
Bei der Versuchsreihe wurde GET in hohem molarem Überschuss zum BSA eingesetzt (220 -
13/1; GET/BSA (mol/mol)). Aus der Multireaktivität des Proteins ergibt sich so eine
mehrmalige Umsetzung eines Proteins mit dem aktivierten Lipid, die auch bei niedrigen GET
Mengen zu einem hohen Anteil an gekoppeltem BSA führt.
124 Ergebnisse und Diskussion
Im Zusammenhang der Ermittlung der Kopplungseffizienz in Abhängigkeit der
Proteinkonzentration und Lipidkomposition (vgl. 5.4.2.3) wird dies näher diskutiert.
Festzuhalten ist, dass sich bereits mit kleinen GET-Anteilen hohe Kopplungseffizienzen
einstellen lassen. Dabei stellt sich heraus, dass bei einem pH von 8,5 niedrige GET
Stoffmengen zu höheren Kopplungsausbeuten führen, als bei einem pH-Wert von 9,0. Dies
lässt sich vielleicht dadurch erklären, dass bei dem höheren pH-Wert die Bildung des
(hydrolytisch instabilen) Sulfoacetamids eine größere Bedeutung erlangt.
Da diese Reaktion über einen anderen Weg abläuft (E1cB, monomolekulare -Eliminierung
mit konjugierter Base, geschwindigkeitsbestimmender Schritt verläuft nach erster Ordnung)
als die Bildung des sekundären Amins (SN2, nucleophile Substitution,
geschwindigkeitsbestimmender Schritt verläuft 2. Ordnung) ergibt sich auch eine andere Lage
des chemischen Gleichgewichts der Reaktion nach Ablauf der Reaktionen in Konkurrenz
zueinander und zur parallel stattfindenden Hydrolyse. Die Komplexität der Vorgänge macht
eine weitere Interpretation der Kurven auf Grundlage des vorhandenen Datenmaterials rein
spekulativ.
Wie schon in 5.4.1.1 gezeigt sind neutrale pH-Werte bei der Kopplung von Proteinen über
GET an Liposomen ungünstig. Bei einem pH-Wert von 7,4 werden nicht mehr als 35 % des
Abb. 5-23: Abhängigkeit der Kopplungseffizienz von pH-Wert und eingesetztem GET-Anteil der Membran
━■━ pH 8,5 (n = 3)
┄△┄ pH 9,0 (n = 1)
━▲━ pH 7,4 (n = 1)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
20
40
60
80
100
BS
A li
poso
mal
geb
unde
n [%
]
GET [mol% des GL]
Ergebnisse und Diskussion 125
angebotenen BSA an die Liposomen gebunden, wobei die Effizienz der Kopplung im
Vergleich zu den beiden anderen pH-Werten am wenigstens von der eingesetzten Stoffmenge
des aktivierten Ankers abhängt.
5.4.1.4 Reaktionsgeschwindigkeit des ersten Inkubationsschrittes
Sinn der Versuchsreihe war es, die Dauer des ersten Inkubationsschrittes festzulegen, die für
eine möglichst effiziente Kopplung notwendig ist. Bei geringen Ligand- und BPS-TRE-
Konzentrationen ist mit einer langsamen Derivatisierung des Proteins zu rechnen. Außerdem
gewinnt die Hydrolyse des BPS-TRE als Konkurrenzreaktion zur Derivatisierung, an
Bedeutung. Beides sorgt letztlich für eine verlangsamte Hydrophobisierung des Proteins und
führt so zu geringeren Kopplungsausbeuten. Mit der Wahl der relativ geringen Ankermenge
(3 mol% des GL) und der niedrigen Proteinkonzentration (1 mg/ml) wurden also schlechte
Vorraussetzungen für einen schnellen Derivatisierungsverlauf geschaffen.
Da unter diesen “worst case“ Bedingungen eine Inkubation über Nacht ausreichend war,
wurde im Standardprotokoll eine 12stündige Inkubation des BPS-TRE mit BSA festgelegt.
0 100 200 300 400 500 600 700 8000
20
40
60
80
100
BS
A g
ebun
den
[%]
Zeit [min]
Abb. 5-24: Kopplungseffizienz in Abhängigkeit der Dauer der Derivatisierungsreaktion zwischen BSA und BPS-TRE (Schritt 1 des Standardkopplungsprotokolls)
126 Ergebnisse und Diskussion
Die Aminosäuresequenz des BSA enthält 60 Lysine und 17 Histidine, die als
Kopplungspartner in Frage kommen. Da die genaue (sterische) Verfügbarkeit der einzelnen
möglichen Kopplungsstellen nicht genau abgeschätzt werden kann wurde vereinfachend mit
ca. 70 für die Kopplung zugänglichen Aminosäuren pro BSA gerechnet. Mit Histidin-HCl
wurde die Reaktion zwischen aktiviertem Anker und Protein zu verschiedenen Zeitpunkten
gestoppt. Bei der gewählten Einwaage von 60 mg Histidin-HCl/ml, die als Kompromiss
zwischen praktikabler Löslichkeit und Überangebot an Aminen zu verstehen ist, ergab sich
ein 80facher molarer Überschuss an Histidin gegenüber den möglichen Kopplungsstellen des
BSA. Neben der Unterdrückung der Derivatisierung des Proteins durch das Amin der
Aminosäuregruppe sollte auch eine Reaktion des BPS-TRE mit der Imidazolgruppe der
Seitenkette möglich sein (Shearwater Polymers 2000), die bisher nur für N-
Hydroxysuccinimidester-aktivierte PEG in der Literatur beschrieben ist (Wylie et al. 2001;
Roberts et al. 2002). Zudem führt die Absenkung des pH-Wertes durch den Einsatz des
Hydrochlorids zu für die Kopplung ungünstigen Bedingungen (Sperinde et al. 1999).
Abb. 5-24 zeigt deutlich, dass die Inkubation über Nacht auch bei niedrigen
Proteinkonzentrationen (1 mg/ml) und BPS-Stoffmengen (3 mol% des GL) ausreicht, um eine
effiziente Kopplung des Proteins zu gewährleisten.
5.4.2 Versuche unter Verwendung von tresyliertem BPS-30
Nach den ersten Versuchsreihen, bei denen Generol in seiner tresylierten Form zum Einsatz
kam, wurde mit tresyliertem BPS weitergearbeitet, da dieses mit seiner längeren PEG-Kette
zu einer besseren sterischen Stabilisierung der Liposomen beitragen sollte. Wird die sterische
Stabilisierung der Liposomen gar nicht durch das PEGylierte Sterol, sondern durch ein bereits
in der Membran befindliches PE-PEG gewährleistet (vgl. 5.4.2.3), ist eine längere PEG-Kette
des Sterol-Ankers von Vorteil. Da die PEG-PEs i.d.R. mit einer Kettenlänge von 45 EO-
Einheiten eingesetzt werden, bedeutet eine kürzere PEG-Kette ein tieferes Eintauchen des
Liganden in PEG-Corona des Liposoms, was mit einer gesteigerten sterischen Hinderung der
Interaktion zwischen Ligand und Zielstruktur verbunden sein sollte.
Ein weiterer Grund für die Verwendung von BPS statt Generol lag in der besseren
Verfügbarkeit des BPS (Fa. Nikkol, Tokyo), das zudem auch mit verschiedenen EO-
Kettenlängen (5, 10, 20, 30 EO-Einheiten) sowie in einer alternativen Form mit hydriertem
Sterolgerüst (30 EO-Einheiten) kostenfrei zur Verfügung gestellt wurde.
Ergebnisse und Diskussion 127
5.4.2.1 Geschwindigkeit der Einlagerung des BSA-Sterol-PEG Konjugats
Der zweite Inkubationsschritt dient der Einlagerung des Sterol-PEG-Protein-Konjugats in die
Liposomen.
Die NMR Versuche 5.3.2 zeigen, dass die Einlagerung des reinen BPS in die Liposomen aller
untersuchten Zusammensetzungen sehr rasch verläuft. In weniger als 15 min ist die
Einlagerung völlig abgeschlossen und ein Endwert erreicht.
Das oben angeführte Elutionsprofil, das unmittelbar nach der Zugabe von EPC/Chol 7/3-
Liposomen zu einem Ansatz aus 7,5 mol% BPS-TRE (c BSA 1,5 mg/ml) ermittelt wurde
verdeutlicht, dass die Einlagerung des BSA-BPS-Derivates in die Liposomen in Analogie zur
Einlagerung des reinen BPS innerhalb kurzer Zeit abgeschlossen ist.
Da nach 1 min bereits eine 80%ige Fixierung des BSA-BPS-Konjugats an der
Liposomenoberfläche erfolgte, war eine ausgiebige Untersuchung der Einlagerungskinetik
nicht erforderlich.
Die Dauer des zweiten Inkubationsschrittes richtete sich nach Beobachtungen zum
Partikelgrößenwachstum (vgl. 5.4.2.6), die zeigen, dass eine lange Inkubation von
Abb. 5-25: exemplarisches Elutionsprofil 1 min nach Zugabe von EPC/Chol 7/3-Liposomen zu einem Inkubationsansatz von BSA mit BPS-TRE
━■━ (linke Achse)
Elutionsprofil 1 min
nach Zugabe der
Liposomen
┄□┄ (rechte Achse)
Summe der eluierten
Anteile der auf die
Säule aufgetragenen
Gesamtaktivtät [%]
4 6 8 10 12 14 16 18
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
BSA
[%]
Elutionsvolumen [ml]
0
20
40
60
80
100 S
umm
e der Gesam
taktivität [%]
128 Ergebnisse und Diskussion
BPS-BSA-Konjugat mit Liposomen zu deren problematischer Größenzunahme führen
können.
Die Dauer des zweiten Inkubationsschrittes wurde daher auf mindestens 2 h und maximal 4 h
festgelegt.
5.4.2.2 Kontrolle auf Koelution durch Formation von Proteinaggregaten
Bei Konjugation von aktiviertem BPS (BPS-TRE und BPS-NHS) mit Proteinen wurde -
besonders bei hohem molarem Überschuss des Ankers (vgl. 5.4.2.3) - eine nicht
reproduzierbare schwache Trübung der Lösung während des ersten Inkubationsschrittes
beobachtet. Diese trat innerhalb von wenigen Minuten auf und war bei BPS-NHS wesentlich
deutlicher ausgeprägt als bei BPS-TRE.
Die Trübung trat nicht in jedem Ansatz und unabhängig vom Puffersystem und pH-Wert auf.
Bei längerem Stehen dieser Proben war sogar die Entstehung eines leicht resuspendierbaren
Niederschlags zu beobachten. PCS-Messungen dieser trüben Ansätze lieferten einen z-Av
zwischen 130 und 300 nm bei einem PI oberhalb von 0,25. Diese Beobachtungen sprechen
für die Formation von Proteinaggregaten. Durch die mehrfache Umsetzung eines Proteins mit
den aktivierten Ankern ist eine Interaktion der hydrophoben Sterole verschiedener
Proteinmoleküle denkbar, die in der Formation von Proteinaggregaten enden.
Aufgrund der Größe der Aggregate ist ihre Elution zusammen mit den Liposomen im
Ausschlussvolumen zu erwarten, ohne dass eine direkte Fixierung des Proteins am Liposom
vorliegt. Damit wäre die als Nachweis für eine gelungene Kopplung angeführte GPC-
Fraktionierung mit Erstellen von Elutionsprofilen (vgl. 5.4.1.1) nicht stichhaltig.
Zur Untersuchung der tatsächlich vorliegenden Situation wurde das FFE-
Fraktionierungsmuster (vgl. Abb. 5-26) einer konventionellen EPC/Chol 4/1-Formulierung
mit dem einer BSA gekoppelten Probe verglichen. Da die FFE unterschiedliche
Oberflächenladungen zur Auftrennung einer Probe nutzt, lassen sich mit ihrer Hilfe
verschieden geladene Liposomenpopulationen innerhalb eines Ansatzes trennen.
Die Wanderung der Liposomen im elektrischen Feld wurde über die Untersuchung der
gesammelten Fraktionen mittels PCS und LSC verfolgt. Abb. 5-26 zeigt das
Verteilungsschema der Liposomen bei Fraktionierung mittels FFE. Um die Abbildung
übersichtlich zu gestalten wurde nicht jede Fraktion dargestellt.
Ergebnisse und Diskussion 129
Auf der rechten Achse ist die Anzahl von Streulichtimpulsen in der jeweiligen Fraktion
aufgetragen, die linke Achse zeigt die Verteilung des radioaktiv markierten BSA über die
unterschiedlichen Fraktionen.
Da die Lipide der EPC/Chol 4/1-Liposomen keine Ladung aufweisen, ist hier keine
Wanderung im Spannungsfeld nach Probenzugabe in Höhe der Fraktion 73 zu erwarten.
Analog zu den Beobachtungen von T. Dern (Dern 2002) und J. Momm (Momm 2004) wurde
trotzdem eine leichte Ablenkung der konventionellen EPC/Chol 4/1-Liposomen zur Anode
(vgl. Abb. 5-26, Anode liegt bei niedrigen Fraktionsnummern, höchste Fraktionsnummer ist
96) festgestellt, die auf die Absorption von Phosphationen an die Oberfläche der Liposomen
zurückgeführt wird. Die konventionellen Liposomen wurden nahe der Kathode mit einem
Maximum der Streulichtintensität in Fraktion 65 wieder gefunden.
Bei neutralem pH-Wert liegt BSA, dessen isoelektrischer Punkt bei pH 4,7 festgestellt wurde
(Kim & Cremer 2001) 18fach negativ geladen vor (vgl. http 3).
Die Kopplung von BSA an die Liposomen sollte also zu einer Ablenkung der modifizierten
Vesikel in Richtung Anode führen. Die Untersuchung der Fraktionen zeigt eine deutliche
Wanderung der Liposomen im elektrischen Feld. Die Hauptfraktion der BSA modifizierten
Abb. 5-26: Verteilung Protein-modifizierter und konventioneller Liposomen nach Fraktionierung über die Free-Flow Elektrophorese
(Anode bei Fraktion 1, Kathode bei Fraktion 96)
20 30 40 50 60 70 80
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
A
ktiv
ität [
kcpm
]
Fraktionsnummer
0
200
400
600
800
Streulichtim
pulse [kcps]
linke Achse:
━□━ Verteilung des 125I markierten BSA
in 1000 cpm/Fraktion
rechte Achse:
Verteilung der
Streulicht verursach-
enden Fraktionen
━■━ modifizierte
━●━ konventionelle
Liposomen
130 Ergebnisse und Diskussion
Liposomen liegt zwischen Fraktionsnummer 45 und 50. Die Kurvenverläufe für die
Untersuchung der Fraktionen mittels PCS verläuft deckungsgleich mit der die LSC Analytik
repräsentierenden Kurve. Außerdem ist kein PCS-Peak zu verzeichnen, der auf das
Vorkommen von nicht BSA-modifizieren Liposomen hindeuten würde.
Das gemeinsame Auftreten von Streulichtsignalen und Aktivität in den gleichen Fraktionen,
bekräftigt durch das Fehlen eines Peaks für konventionelle Liposomen im gekoppelten
Ansatz, belegt die Interaktion von BSA mit den Liposomen. Die Bilanzierung des
radioaktiven Materials lieferte eine Wiederfindungsrate von über 95%, so dass davon
ausgegangen werden kann, dass das BSA in diesem Versuch vollständig an die Liposomen
gebunden war. Theoretisch ist auch eine zufällige Koelution von BSA-BPS-Aggregaten und
BSA-modifizierten Liposomen denkbar. Angesichts der vollkommenen Übereinstimmung der
PCS und Aktivitätssignale ist dieser Fall vor dem Hintergrund der unterschiedlichen
Ladungsdichte von Liposomen und Aggregaten sowie der breiten Partikelgrößenverteilung
der BSA-BPS-Aggregate jedoch äußerst unwahrscheinlich.
Die veränderte Oberflächenladung ließ sich auch über eine -Potentialmessung bestätigen.
Dieses lag bei den konventionellen Liposomen bei ca. - 6 mV während die BSA-modifizierten
Liposomen ein -Potential von - 20 mV aufwiesen. Die FFE-Fraktionierung bot jedoch den
Vorteil eines zuverlässigeren Nachweises von (hier nicht) vorkommenden ungekoppelten
Liposomen.
5.4.2.3 Kopplungseffizienz in Abhängigkeit von Lipidkomposition und Proteinkonzentration
Die Kopplungseffizienz ist bei der Präparation von Ligand-targetierten Liposomen von großer
Bedeutung. Die heute am häufigsten verwendeten Fab’-Teile und monoklonalen Ab sollten
aufgrund ihres hohen Preises möglichst vollständig an ein Liposom gebunden werden, um das
Verwerfen oder die Rückgewinnung des nicht gekoppelten Anteils zu vermeiden.
Die Experimente zur Kopplungseffizienz sollten Auskunft darüber liefern, welcher Anteil des
BPS-TRE bei dem gewählten Kopplungsverfahren (vgl. 4.6.1 und 4.6.4.3) liposomal
gebunden werden konnte. Die Effizienz wurde in Abhängigkeit der Lipidkomposition und der
Konzentration des Modellproteins BSA untersucht.
Interessant ist vor allem die Frage nach der möglichen Modifizierung von Stealth®-
Ergebnisse und Diskussion 131
Liposomen, die in der Literatur bisher nur bei erhöhter Temperatur und mit synthetisierten
Lipid-PEG-Konjugaten gelungen ist (vgl. 5.3.2).
Als Modell zur Untersuchung der Einlagerung der BPS-BSA-Konjugate in PEGylierte
Liposomen diente zum einen die Liposomenspezies HSPC/Chol/MPEG, die sich in ihrer
Zusammensetzung am Doxil® orientierte. Die beiden anderen Formulierungen repräsentieren
einen bei Raumtemperatur fluiden (EPC/Chol 7/3) bzw. rigiden Membranzustand
(HSPC/Chol). Dabei entsprach die Zusammensetzung der EPC/Chol 7/3-Liposomen der des
Myocet®.
Abb. 5-27 zeigt die Ergebnisse der Kopplungsversuche. Wie zu erwarten nimmt die
prozentuale Kopplungseffizienz mit zunehmender BSA-Konzentration ab. Die Unterschiede
zwischen den einzelnen Lipidkompositionen sind gering. Lediglich bei der
HSPC/Chol/MPEG-Liposomenpopulation ist die eindeutige Tendenz zu einer gegenüber den
anderen Zubereitungen verringerten Kopplungseffizienz zu verzeichnen.
Neben der Angabe der prozentualen Kopplungseffizienz ist die durch ein Kopplungsverfahren
einstellbare Ligandenlast von entscheidender Bedeutung.
Abb. 5-27: Kopplungseffizienz in Abhängigkeit von Lipidkomposition und Proteinkonzentration
1 2 3 50
60
70
80
90
100
110
EPC/Chol 7/3 HSPC/Chol HSPC/Chol/MPEG
BSA
geb
unde
n [%
]
c BSA [mg/ml]
132 Ergebnisse und Diskussion
Die Ligandendichte auf der Oberfläche muss groß genug sein, um eine effiziente Interaktion
des Ligand-Liposom-Komplexes mit dem Zielgewebe sicherzustellen. Die meisten Versuche
zum aktiven liposomalen Targeting wurden mit Antikörpern oder Fab’-Stücken
unternommen. Hierbei wird die Antikörperdichte häufig in der Einheit µg Ab/ µmol PL
angegeben. Die Anzahl der Liganden, die für ein erfolgreiches Targeting nötig ist kann nicht
präzise angegeben werden, da sie auch von der Oberflächendichte der Zieldeterminante
abhängt.
Park et al. (2002) und Kirpotin et al (1997) beispielsweise beschreiben ein erfolgreiches in
vitro Targeting gegen die p185HER2 (HER2; ErbB2) Rezeptor-Tyrosinekinase (einem auf einer
Reihe von Tumoren stark überexpremiertem Oberflächenantigen) mit 30-50 Fragmenten von
monoklonalen Antikörpern pro Vesikel (Größe 100 ± 10 nm).
In Saul (2003) werden 10 - 1000 Folat-PEG-Lipide pro Liposom angebracht und die so
modifizierten Liposomen auf ihre Eignung zum aktiven liposomalen Targeting untersucht.
Das in der Literatur als optimal beschriebene Verhältnis zur Kopplung von Ab liegt bei
1/1000 (mol Ab/mol PL) (Hansen et al. 1995; Bendas et al. 1999) und führt beim Einsatz von
Abb. 5-28: Vergleich der absoluten BSA-Last in Abhängigkeit von Lipidkomposition und BSA Konzentration
1 2 3 50
20
40
60
80
100 EPC/Chol 7/3 HSPC/Chol HSPC/Chol/MPEG
µg
BS
A/ µ
mol
GL
c BSA [mg/ml]
Ergebnisse und Diskussion 133
3-8 mol% des aktivierten Lipids zur einer angestrebten Antikörperdichte von 30-50 µg/µmol,
oberhalb derer eine beschleunigte Eliminierung der Ligand-Liposom-Konjugate aus der
Blutbahn zu verzeichnen ist (vgl. 1.1.5.2).
Die in der Versuchsreihe gewählten Konzentrationen und Volumina wurden so gewählt, dass
das Verhältnis von BSA zu PL (mol/mol) im Bereich von ca. 1/540 - 1/2700 lag
(entsprechend 25 - 100 µg BSA/µmol GL bzw. - bezogen auf die EPC basierenden
Liposomen - 37,8 - 188,8 µg/mg GL).
Abb. 5-28 zeigt die aus dem prozentual gebundenen Anteil berechnete Masse an BSA/µmol
des GL. Auf Kosten der relativen Kopplungseffizienz lässt sich mit BPS-TRE bei steigender
BSA-Konzentration eine größere Proteinmasse an der Oberfläche der Liposomen
immobilisieren. Wie auch schon den prozentualen Zahlen zu entnehmen ist, unterscheidet
sich die BSA-Dichte auf der Oberfläche der Liposomen bei fluiden und rigiden Membranen
nur geringfügig. Dies ist zunächst nicht unbedingt einzusehen, da die NMR-Versuche klar
gezeigt haben, dass die Akzeptanz der HSPC basierenden Membranen gegenüber der
Insertion des Sterols wesentlich geringer ist als die der EPC-Membranen. In der Konsequenz
ist also bei den rigiden Membranen eine deutlich verringerte Kopplungseffizienz zu erwarten.
Die hohe Funktionalisierungsrate auch der rigiden Membranen ist wie folgt zu erklären:
Während des ersten Inkubationsschrittes erfolgt die Umsetzung von BSA mit dem aktivierten
Lipid, bei der Aminogruppen des Proteins mit der Tresylfunktion abreagieren (vgl. Abb.
5-20). Das auf diese Weise hydrophobisierte Protein kann anschließend mit der
Liposomenmembran interagieren - es kommt zur Fixierung des Proteins an der
Liposomenoberfläche.
Bei allen Ansätzen wurde die Stoffmenge des BPS-TRE konstant gehalten und betrug jeweils
7,5 mol% des vor der 2. Inkubation eingebrachten GL. Mit steigender BSA-Konzentration
nimmt daher die Zahl der für die Reaktion mit dem Protein zur Verfügung stehenden
BPS-TRE Moleküle ab. Es ist daher verständlich, dass der Grad der Hydrophobisierung des
Proteins und damit auch die Affinität des derivatisierten Proteins zur Liposomenmembran mit
steigender BSA-Konzentration während des ersten Inkubationsschritts abnimmt.
134 Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 5-1: Überblick über die wichtigsten Parameter der Versuchsreihe
In der Tabelle sind die wichtigsten Kennzahlen der Ansätze mit kleinster und größter
eingesetzter BSA-Konzentration aufgeführt. Sie verdeutlicht, dass die Anker-Stoffmenge klar
über der des BSA liegt. Selbst bei der größten Proteinkonzentration beläuft sich das
Anker/BSA-Verhältnis auf mehr als 40/1. Daraus lässt sich ableiten, dass trotz der parallel
ablaufenden Hydrolyse des BPS-TRE jedes BSA-Molekül mit mehr als einem Sterol-PEG
umgesetzt wird. Vor diesem Hintergrund ist die geringe Abhängigkeit der Kopplungseffizienz
von der Lipidzusammensetzung einzusehen.
Geht man davon aus, dass sich für die Fixierung eines Proteins an der Oberfläche eines
Liposoms mehrere Sterolanker beteiligen können ist es vorstellbar, dass die Anzahl der
Sterole, die sich in die Liposomen einlagern können in (fast) jedem Fall ausreicht, um das
Protein zu fixieren. Deshalb ist das Protein bei den fluiden Membranen eventuell lediglich
über eine größere Anzahl von Verankerungen an der Oberfläche immobilisiert, so dass die
Stabilität der Fixierung in diesem Fall größer sein mag.
In Betracht zu ziehen ist auch, dass die NMR-Versuche (vgl. 5.3.2) gezeigt haben, dass die
Insertion von BPS in HSPC/Chol/MPEG- und HSPC/Chol-Liposomen oberhalb von 2,4 bzw.
3,2 mol% zum Erliegen kommt. Da die Hydrolyse parallel zur Derivatisierung stattfindet, ist
davon auszugehen, dass ein Teil der Aufnahmekapazität der Membran für die Sterolanker
bereits durch hydrolysiertes, freies BPS abgesättigt wird.
Die Ligandendichte, die sich mit der BPS-TRE Methode an der Liposomenoberfläche
BSA/GL [mol/mol]
Anker/BSA (Anker/Amin) % gebunden µg BSA/µmol
GL BSA/Liposom
(genähert)
c BSA
[mg/ml] 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5
EPC/Chol
7/3
97,1
0,70
78,7
2,34
24,4 0,13
99,0 2,8 54 218
HSPC/Chol 99,9
0,32
73,1
1,87
25,0 0,11
91,3 2,3 55 202
HSPC/Chol
/MPEG
1/2700 1/540 ca. 220
(>3)
ca. 44
(>0,6)
93,3
0,35
70,1
2,33
23,32 0,1
87,63 2,1 52 195
Ergebnisse und Diskussion 135
einstellen lässt, liegt unter den gewählten Bedingungen zwischen 25 und 100 µg BSA/µmol
GL. Berücksichtigt man, dass die Molekularmasse eines Antikörpers mehr als doppelt so hoch
ist wie die des BSA, sollte die optimale Antikörperlast von 30 - 50 µg/µmol PL mit der BPS-
TRE Methode leicht erreicht werden können.
Überschlägt man die Anzahl der BSA-Moleküle pro Liposom, indem man die unter 4.7
gemachten Vereinfachungen annimmt, wurden zwischen 50 und 200 BSA-Moleküle an die
Oberfläche der Liposomen gebunden - eine Ligandenanzahl, die für eine Interaktion mit dem
Zielgewebe ausreichen sollte. Angesichts der groben Vereinfachungen, die für die
Berechnung der Ligandenanzahl pro Liposom als gültig angenommen wurden, wird auf die
Angabe der Standardabweichung verzichtet.
5.4.2.4 Calcein-Freisetzung bei Einlagerung des BSA-BPS-Komplexes
Erwartungsgemäß sollte sich die Freisetzung von Calcein bei der Einlagerung des BSA-BPS-
Derivates in die Liposomen gegenüber dem reinen PEG-Sterol nicht wesentlich verändern.
Vielmehr wurde verringerte Freisetzung angenommen, da die Fixierung des BPS am BSA-
Molekül zu verringerter Mobilität und eventuell der sterischen Hinderung der Einlagerung
einzelner PEG-Sterole in die Membran führen könnte. Zur Kontrolle dieser Annahme und zur
Demonstration der Stabilität der Membranen bei der Einlagerung der Konjugate oberhalb und
unterhalb der CMC des BPS wurde entsprechend 4.5.4.2 und 4.5.4.1 vorgegangen.
Zunächst erfolgte die Bestimmung des freigesetzten Calceinanteils bei Einlagerung des
Protein-PEG-Sterol Komplexes in HSPC/Chol/MPEG- und EPC/Chol 7/3-Liposomen
unterhalb der CMC. In beiden Fällen lag die freigesetzte Menge an Calcein knapp unter dem
Wert, der bei der Einlagerung des reinen PEG-Sterols in dieselben Membranen ermittelt
worden war. Dieser lag bei EPC/Chol 7/3 Liposomen bei 3,5% und für die
HSPC/Chol/MPEG Liposomen bei 2,2 % (vgl. 5.3.4.1).
Auch die Ermittlung der Freisetzung des Calcein aus fluiden Liposomen oberhalb der CMC
zeigte mit knapp 5,3% freigesetztem Calcein einen um ca. 1% (in Bezug auf die maximale
Freisetzung) verringerten Anteil an unverkapseltem Marker.
136 Ergebnisse und Diskussion
5.4.2.5 Stabilität des Liposom-BSA-Komplexes in humanem Serum
Liposomen zeigen im Serum eine deutlich geringere Stabilität als in Puffer. Sie sind hier
sowohl der Interaktion mit Plasmakomponenten (vgl. 1.1.5.2) als auch enzymatischen
Attacken ausgesetzt.
Als kritische Stellen für die Stabilität der Verbindung zwischen Liposom und Ligand sind
einerseits die Verankerung des Liganden in der Membran, die rein hydrophober Natur ist, und
die kovalente Bindung zwischen Ligand und Membrananker anzusehen (Parr et al. 1994).
Wird die kovalente Bindung zwischen Lipidanker und Ligand gespalten, oder die
Liposomenmembran durch die Wechselwirkung mit dem Komplementsystem, dem Entzug
von PL durch Serumlipoproteine und weiteren enzymatischen Attacken in ihrer Integrität
dermaßen beeinträchtigt, dass der Lipidanker mit ankonjugiertem Liganden als Ganzes nicht
genug Halt in der Membran findet, ist eine Interaktion mit dem Zielgewebe nicht mehr
gewährleistet.
Die Untersuchung der Stabilität der Verankerung in humanem Serum liefert einen ersten
Anhaltspunkt für die zu erwartende in vivo Stabilität des gesamten Systems (Ishida et al.
Abb. 5-29: Calcein-Freisetzung bei Einlagerung des BSA-BPS-Konjugats in Liposomen-membranen
0
1
2
3
4
5
6
7
HSPC/Chol/MPEG + BSA-BPS-Konjugat EPC/Chol 7/3 + BSA-BPS-Konjugat EPC/Chol 7/3 + BSA-BPS-Konjugat (>CMC)
freig
eset
ztes
Cal
cein
[%]
Ergebnisse und Diskussion 137
1999). Auch in diesem Versuch dienten die EPC/Chol 7/3-, die HSPC/Chol- und
HSPC/Chol/MPEG-Liposomen als Repräsentanten für fluide, rigide und PEGylierte
Liposomen als Modellsysteme. Nach der Durchführung der Kopplung von BSA an die
Liposomen erfolgte die Abtrennung des freien BSA vom liposomal gebundenem. Das
Elutionsprofil ist in Abb. 5-30 dargestellt. Rund 80% des BSA werden mit den Liposomen
koeluiert.
Abb. 5-31 zeigt das Elutionsprofil derselben Ansätze nach 20-stündiger Inkubation der
Liposomen mit gleichem Volumen an humanem Serum bei 37 °C. Alle drei Ansätze zeigen
keine Neuentstehung von freiem BSA. Es ist daher davon auszugehen, dass die bei der
Kopplung der Liposomen ausgebildete kovalente Bindung zum Sterolanker auch in
Anwesenheit des Serums und der darin enthaltenden Enzyme (insbesondere der Esterasen, die
die teils auftretende Sulfoacetamidbindung spalten könnten) stabil ist.
Der vierte Ansatz diente der Überprüfung der Nachweisbarkeit von abgespaltenem BSA nach
Inkubation mit humanem Serum. Hierzu wurde einem Ansatz ein freier Anteil an 125I-
markiertem BSA zugesetzt. Auf diese Weise sollte auf eine denkbare Bildung von
Aggregaten des neu entstandenen freien BSA mit anderen Serumkomponenten, resultierend in
der Koelution mit den Liposomen, geprüft werden. Ebenso ist die Anlagerung des freien BSA
an Serumlipoproteine denkbar. Auch dieser Vorgang würde die tatsächliche Entstehung von
freiem BSA verschleiern. Bei Auftreten dieser Phänomene sollte der Zusatz der sehr geringen
Stoffmenge des markierten BSA einen solchen Vorgang durch die Eliminierung des zweiten
Peaks demonstrieren.
Der Aufbau der Versuchsreihe orientierte sich an dem in Ishida et al. (1999) zur
Untersuchung der Bindungsstabilität zwischen Liposom und Ligand nach Anwendung der
PIT angewendeten Methodik. Allerdings ist das gewählte experimentelle Setup lediglich in
Bezug auf die Stabilität der Bindung zwischen Membrananker und Ligand wirklich
aussagekräftig. Die Integrität der Bindung zwischen Liposom und Membrananker kann durch
diesen Versuch nicht eindeutig geklärt werden, da eine Umlagerung des BSA-BPS-Konjugats
aus der Liposomenmembran in Serumlipoproteine denkbar ist. In diesem Fall ist davon
auszugehen, dass BSA, das nicht mehr liposomal sondern z.B. an einem LDL gebunden
vorliegt, mit den liposomalen Fraktionen eluiert wird, so dass mittels GPC keine
Differenzierung möglich ist. Aufschluss über diese Fragestellung könnte eine
Dichtezentrifugationsversuch oder ein Free-Flow Experiment liefern.
138 Ergebnisse und Diskussion
linke Achse:
━■━ EPC/Chol
━●━ HSPC/Chol ━▲━ HSPC/Chol/MPEG
━◆━ HSPC/Chol plus BSA
rechte Achse:
━□━ EPC/Chol
━○━ HSPC/Chol ━△━ HSPC/Chol/MPEG
0 4 8 12 16 20 24 28
0
10
20
30
40
Fraktionsnummer
BSA
/Fra
ktio
n [%
]
0
20
40
60
80
100
Sum
me der G
esamtaktivtät
Abb. 5-31: Elutionsprofile der Rechromatographie nach Inkubation derselben Ansätze von BSA-Liposomen nach 20 h Inkubation mit 50% (V/V) humanem Serum bei 37 °C
0 5 10 15 200
5
10
15
20
25
30
35
40
45
B
SA
/Fra
ktio
n [%
]
Fraktionsnummer
0
20
40
60
80
100
Sum
me der G
esamtaktivität [%
]
linke Achse:
━■━ EPC/Chol
━●━ HSPC/Chol
━▲━ HSPC/Chol/MPEG
rechte Achse:
━□━EPC/Chol
━○━HSPC/Chol
━△━ HSPC/Chol/MPEG
Abb. 5-30: Elutionsprofil bei Abtrennung des freien Proteins der Kopplungsansätze zur Untersuchung der Serumstabilität BSA-modifizierter Liposomen
[%]
Ergebnisse und Diskussion 139
5.4.2.6 Größenentwicklung der BSA-modifizierten Liposomen
In Abschnitt 5.4.2.3 wurde bereits diskutiert, dass es sehr wahrscheinlich ist, dass jedes BSA-
Molekül mehrfach mit BPS-TRE umgesetzt wird.
Ist ein BSA mit mehreren Sterol-PEG modifiziert, ist es unwahrscheinlich, dass sich alle
Anker in einem Liposom einlagern. Die Folge kann eine Ausbildung eines Netzwerkes aus
Liposomen sein, bei dem das Protein die Rolle eines Quervernetzers übernimmt. Aus diesem
Grund wurde die Größenentwicklung modifizierter Liposomen in Abhängigkeit der
Lipidkomposition und der BSA-Konzentration verfolgt.
Abb. 5-32 gibt einen Überblick über die Resultate der Messreihe. Die PCS Daten belegen eine
deutliche Abhängigkeit der Partikelgrößenzunahme sowohl von der Lipidzusammensetzung
als auch von der BSA-Konzentration im ersten Inkubationsschritt (1 - 5 mg/ml). Eine
besonders ausgeprägte Zunahme der Partikelgröße lässt sich bei den EPC/Chol 7/3-
Liposomen beobachten. Die PCS Messung lieferte für die reine Liposomendispersion 12 h
nach ihrer Herstellung einen durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser von 118 nm.
Die Lagerung der Liposomen bei RT in Anwesenheit von reinem BSA im relevanten
Konzentrationsbereich hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Partikelgröße. Auch die
Abb. 5-32: Entwicklung der Partikelgröße nach Kopplung von BSA an Liposomen der drei Standardzusammensetzungen
0 1 2 3 5 0 1 2 3 5 0 1 2 3 50
100
200
300
400
500
600
700
800
900 0 Wert 4h 12h
EPC/Chol 7/3HSPC/CholHSPC/Chol/MPEG
Parti
kelg
röße
[nm
]
c BSA [mg/ml]
140 Ergebnisse und Diskussion
Inkubation von 7,5 mol% BPS mit den verschiedenen Liposomentypen war von keinem
signifikanten Anstieg der Liposomengröße begleitet.
Hingegen stieg der Durchmesser bei der Inkubation der Liposomen mit dem BSA-BPS
Konjugat bei der Maximalkonzentration innerhalb von 12 h auf über 815 nm an. Bei den
beiden anderen Lipidkompositionen war die Partikelgrößenzunahme nicht so ausgeprägt wie
bei den fluiden EPC/Chol 7/3-Liposomen. Allerdings war auch hier ein deutliches
Partikelwachstum zu verzeichnen. Unter Extrembedingungen (12 h, 5 mg/ml BSA)
verdoppelte sich die Größe der HSPC/Chol/MPEG-Liposomen, während bei den HSPC/Chol-
Liposomen eine Verdreifachung des hydrodynamischen Durchmessers verzeichnet wurde.
Tabelle 5-2: Überblick über die Größenentwicklung und Änderungen des PI bei Lagerung BSA-modifizierter Liposomen (kursiv: vgl. Text)
Bei allen drei Formulierungen war parallel zum Anstieg des z-Av eine deutliche Zunahme des
PI zu beobachten. Die Steigerung des PI spricht für die Zusammenlagerung mehrer Vesikel
zu unregelmäßig geformten Aggregaten und weniger für eine Fusion von Membranen unter
Ausbildung neuer Vesikel. Dies konnte auch durch Cryo-TEM Aufnahmen gestützt werden.
EPC/Chol 7/3 HSPC/Chol HSPC/Chol/MPEG
BSA [mg/ml] 0 1 5 0 1 5 0 1 5
4 h -- 170,1
3,46
374,3
3,21 --
121,8
1,73
228,13
2,51 --
130,3
5,82 172,6
2,7 z-Av
12 h 118,2
1,56
209,9
10,61
816,2
18,4
115,3
2,31
120,5
1,91
334,97
11,72
119,2
1,13
136,0
3,11
226,6
3,6
4 h -- 0,12
0,02
0,28
0,01 --
0,04
0,02
0,2
0,1 --
0,12
0,01
0,26
0,03 PI
12 h 0,098
0,02
0,2
0,01
0,56
0,09
0,076
0,02
0,06
0,04
0,31
0,02
0,083
0,01
0,11
0,01
0,38
0,02
Ergebnisse und Diskussion 141
Abb. 5-33: repräsentative Cryo-TEM Aufnahmen von dialysierten EPC-Liposomen vor (A, B) und nach (C, D) der Kopplung von BSA an die Liposomenoberfläche (Balken: 200 nm)
Zur visuellen Charakterisierung der Aggregate wurden EPC-Liposomen durch
Detergenzdialyse (EPC/OG 1/2 (mol/mol), 10 kDa MWCO, Dialysekammer:
Eigenkonstruktion vgl. 1.1.2.4) hergestellt, da diese Methode unilamellare, eng
größenverteilte Vesikel liefert, die bei elektronenmikroskopischen Untersuchungen ein
homogenes Bild garantieren. Die Bilder A und B zeigen repräsentative Aufnahmen von nicht
Oberflächen-modifizierten Liposomen. Bei niedriger Lipidkonzentration liegen die
Liposomen vereinzelt vor, bei höherer lokaler Konzentration ordnen sie sich in einer Ebene
an. Deformationen der Membranen, wie in Abbildung D zu erkennen, sind auch in diesem
A B
C D D
142 Ergebnisse und Diskussion
Fall nicht zu erkennen. Im Gegensatz dazu erkennt man in Bild C, dass sich die gekoppelten
Vesikel zu Aggregaten formieren, deren einzelne Individuen z.T. in mehreren Ebenen
übereinander angeordnet sind. Bild D stellt ein in manchen Präparationen zu beobachtendes
Phänomen dar, das ausschließlich bei Ligand-modifizierten Liposomen beobachtet wurde: die
Vesikel lagern sich zu Aggregaten zusammen, bei denen die einzelnen Liposomen, unter
Abflachung ihrer Membranen mit definiertem Membranabstand durch sterische
Stabilisierung, miteinander verknüpft sind. Außerdem ist offensichtlich, dass die beobachtete
Partikelgrößenzunahme nicht auf Fusion von Liposomen zurückzuführen ist.
Die Probenpräparation bei der Cryo-TEM verzerrt das tatsächliche Bild der Größenverteilung
des Untersuchungsmaterials, da zu große Strukturen nicht auf dem polymermodifizierten Grid
fixiert bleiben, wenn der Flüssigkeitsfilm mit dem Filterpapier abgezogen wird. Daher ist
davon auszugehen, dass die BSA-modifizierte Probe größere Aggregate enthält, als auf den
Abbildungen zu erkennen sind.
In einer zweiten Versuchsreihe zur Änderung der Partikelgröße wurde untersucht, ob auch
durch einen Einbau von BPS eine Reduzierung der Aggregation möglich ist. Die
Ligandendichte lag in dieser Versuchsreihe bei 21 µg/µmol GL. Dies entspricht -
hochgerechnet auf die Molekularmasse eines Antikörpers - der optimalen Ligandendichte für
in vivo Applikationen. Es wurden EPC/Chol 4/1-Liposomen mit 5 mol% MPEG2000-DSPE
bzw. 7,5 mol% BPS präpariert und mit dem BSA-BPS-Konjugat inkubiert. Der größere PEG-
Lipid-Anteil bei der BPS-Zubereitung trägt der geringeren PEG-Kettenlänge des BPS
Rechnung. Als Kontrolle diente eine konventionelle EPC/Chol 4/1-Präparation, die statt mit
dem BSA-BPS-Konjugat mit nativem BSA inkubiert wurde. Abb. 5-34 verdeutlicht den
Einfluss der verschiedenen PEG-Lipide auf die Stabilisierung der Partikelgröße im Vergleich
zu nicht PEGylierten Liposomen.
Während in Anwesenheit des nativen BSA im Zeitraum von 48 h kein signifikantes
Vesikelwachstum wahrnehmbar ist, zeigt sich wie erwartet auch hier ein Ansteigen der
Partikelgröße der konventionellen EPC/Chol 4/1-Liposomen. Die sterische Stabilisierung mit
MPEG2000-DSPE trägt zu einer deutlichen Stabilisierung der Größe bei. Auch die BPS-
Modifizierung hat einen positiven Einfluss und reduziert die Bildung von Aggregaten klar.
Obwohl die Ligandendichte dieser Versuchsreihe unwesentlich unter der der in Tabelle 5-2
zusammengefassten lag, ist bei der konventionellen EPC/Chol 4/1-Präparation bereits nach
5 h eine größere durchschnittliche Partikelgröße zu verzeichnen als bei der ersten
Ergebnisse und Diskussion 143
Versuchsreihe nach 12 h (vgl. EPC/Chol 7/3 in Tabelle 5-2, kursive Zelle).
Geht man von der Quervernetzung der Liposomen als Ursache des beobachteten Phänomens
aus, ist eine Abhängigkeit der Geschwindigkeit der Aggregatbildung von der
Gesamtlipidkonzentration und der BSA-Konzentration einleuchtend. Da in der zweiten
Versuchsreihe die Endkonzentration in Bezug auf die Lipidkonzentration (15,6 mM
gegenüber 13,3 mM) etwas höher und in Bezug auf die BSA-Konzentration (0,325 mg/ml
gegenüber 0,333 mg/ml) während des zweiten Inkubationsschritts nahezu gleich war, ist die
raschere Bildung von Aggregaten wohl auf die erhöhte Lipidkonzentration, oder den
niedrigeren Cholesterolgehalt der Präparation zurückzuführen.
Das Gesamtbild, das die Versuchsreihen von den Vorgängen der Aggregatbildung entwerfen,
ist schwerer zu interpretieren. Tabelle 5-2 und Abb. 5-32 zeigen, dass die BSA-Konzentration
während der Umsetzung des BPS-TREs mit dem Protein einen entscheidenden Einfluss auf
die Geschwindigkeit der Größenzunahme hat, obwohl eine höhere Proteinkonzentration
während des ersten Inkubationsschrittes einen geringeren Hydrophobisierungsgrad des
einzelnen Proteins bedeutet. Damit ist die Aggregationsneigung in erster Linie von der
0 10 20 30 40 50100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
z-Av
[nm
]
Zeit [h]
━■━ EPC/Chol
+ BPS-BSA
━●━ EPC/Chol/BPS
+ BPS-BSA
━▲━ EPC/Chol/MPEG
+ BPS-BSA
━◆━ EPC/Chol
+ natives BSA
EPC/Chol stets 4/1
(mol/mol)
Abb. 5-34: Zunahme der Partikelgröße als Funktion der Zeit in Abhängigkeit der Lipid-kombination von EPC/Chol 4/1-Liposomen mit MPEG2000-DSPE und BPS
144 Ergebnisse und Diskussion
Ligandendichte des BSA auf der Liposomenoberfläche (vgl. Tabelle 5-1) und erst in zweiter
Linie vom Grad der Umsetzung des aktivierten Lipids mit dem Protein abhängig.
Die PEGylierung der Liposomen mit dem PEG-PE-Derivat bringt eine permanente negative
Ladung in die Liposomenoberfläche ein. Diese führt zu einer elektrostatischen Abstoßung der
Liposomen untereinander und ist ein möglicher Grund für den stabilisierenden Effekt, da eine
Annäherung der Vesikel erschwert wird, so dass die räumliche Ausdehnung eines BSA-
(BPS)n-Derivates nicht zur Quervernetzung zweier Liposomen ausreicht.
Auch BPS zeigt diesen positiven Einfluss im Hinblick auf die Konservierung der
Individualität des Vesikels, ist jedoch ein nicht-ionisches PEG-Derivat. Die beobachtete
schwächere Ausprägung des Effekts ist eventuell auf das fehlende Einbringen einer Ladung
oder den geringeren sterisch stabilisierenden Effekt wegen der kürzeren PEG-Ketten
zurückzuführen.
Während die Kopplungseffizienz von der Lipidzusammensetzung relativ unbeeinflusst bleibt,
ist das Partikelwachstum eindeutig von der Liposomenkomposition abhängig. Die
Beobachtungen zur Einlagerung des BPS in die verschiedenen Liposomentypen (vgl. 5.3.2)
können zur Erklärung der Unterschiede zwischen den einzelnen Liposomenpopulationen
herangezogen werden. Die insgesamt wahrscheinliche schwächere Verankerung der einzelnen
BSA-Moleküle in den HSPC basierenden Membranen führt zu einer geringeren Ausbildung
von Aggregaten.
Das Partikelwachstum ist auch makroskopisch leicht zu beobachten. Die Trübung der
Liposomendispersionen nimmt nach Zugabe derselben zum BSA-BPS Derivat schnell zu. Die
Entwicklung größerer Aggregate ist von praktischem Interesse: ein zu langer zweiter
Inkubationsschritt macht die Aufarbeitung und Charakterisierung durch GPC schwierig, da
ein Teil des Lipids aufgrund der Größe der Agglomerate auf dem Gelbett zurückbleibt. Nach
Ultrazentrifugation von BSA gekoppelten Liposomen wurde die Entstehung von nicht
resuspendierbaren Pellets beobachtet.
Die Ausbildung von Aggregaten bedeutet eine mögliche Einschränkung der gekoppelten
Liposomen in vivo und in vitro. Daher ist ein Kompromiss zwischen Ligandendichte und
Stabilität der Vesikelgröße gefordert, der bei jedem Ligand neu gefunden werden muss.
Der Einsatz von PEG-Derivaten als zusätzliche Membranbestandteile kann zur Minimierung
des Partikelwachstums genutzt werden. Auch ein PG oder PS Anteil in der Membran könnte
durch elektrostatische Abstoßung zur Reduzierung des Phänomens beitragen.
Ergebnisse und Diskussion 145
5.4.3 Versuche unter Verwendung von BPS-NHS
NHS-aktivierte PEG werden schon lange zur Modifizierung von Proteinen verwendet
(Roberts et al. 2002). Im Zusammenhang mit der Kopplung von Proteinen am Liposomen ist
aber bisher keine Literatur vorhanden, obwohl ein käufliches DSPE-PEG-Derivat (vgl. Abb.
5-35) vorübergehend im Handel war. Der Grund für das geringe Interesse an diesem Derivat
liegt wohl in der Kombination der geringen Stabilität der Substanz in wässrigen Medien
(Halbwertszeit wird mit ca. 20 min angegeben; Nektar (vormals Shearwater Polymers)
Produktkatalog) und dem hydrophoben Molekülteil (DSPE), der meist den Einbau in die
Lipidmembran während der Herstellung der Liposomen erfordert (vgl. 1.2.2.1).
Bevor die Verwendung der PIT populär wurde befand sich das NHS-PEG-DSPE nicht mehr
im Handel. Ein weiterer Nachteil dieses aminoreaktiven DSPE-PEG-Derivates liegt in der Art
der Verknüpfung der Abgangsgruppe, die über einen Bernsteinsäurespacer mit dem PEG-
OO
O
FSO
FS
O
PO
O-
ONH
O
OO
OO
ON
O
O
50
OOO
ON
O
O
n=30
pH 7,4 - 8,5 NH2 BSA
n=30O
O
O
NH
BSA
(B)
Abb. 5-35: Umsetzung von NHS-aktiviertem BPS mit BSA und Strukturformel von NHS-PEG-DSPE
(A)
n=
146 Ergebnisse und Diskussion
Anteil des Moleküls verestert ist. Dieser Ester zum PEG legt die Instabilität der Kopplung in
vivo nahe.
Die Umsetzung der distalen Hydroxylgruppe mit N,N’-Disuccinimidylcarbonat (Synthese vgl.
4.1.3) führt zur Ausbildung eines NHS-aktivierten Kohlensäureesters, bei dem NHS als
klassische Abgangsgruppe fungiert.
Der Einsatz von NHS-aktivierten ethoxylierten Sterolen ermöglicht die Modifizierung von
Liposomen mit Proteinen, da sich der hydrophobisierte Ligand - wie im Rahmen dieser Arbeit
gezeigt - bei RT nachträglich in PL-Membranen einlagern kann und die Hydrolyse des NHS-
Esters in Anwesenheit von Aminen zugunsten der Ausbildung des in vivo stabilen
Carbamates (Torchilin et al. 2001a; Roberts et al. 2002) zurückgedrängt wird.
Der Vorteil gegenüber der Tresylmethode liegt in der Möglichkeit auch bei pH-Werten im
neutralen Bereich arbeiten zu können. Zudem entsteht ausschließlich ein definiertes Produkt
(Carbamtbindung), dessen in vivo Stabilität außer Frage steht. Der Nachteil liegt im Verlust
der ursprünglichen Ladung des zur Kopplung genutzten Amins des Liganden (vgl. 5.4.1).
5.4.3.1 Grundsätzliche Eignung von BPS-NHS zur Kopplung von BSA an Liposomen
Wie schon bei der Untersuchung der Eignung der tresylierten PEG-Sterole zur Kopplung von
BSA an die Liposomen wurden auch in den hier resümierten Versuchen Elutionsprofile von
mit reinem BPS (keine Kopplung erwartet) und mit BPS-NHS behandelten BSA (Ansatz mit
erwarteter Kopplung) nach Zugabe von Liposomen verglichen.
Die Kopplung von BSA an die Liposomen ist bei Verwendung von 7,5 mol% BPS-NHS und
einer BSA-Konzentration von 1mg/ml vollständig. Das in Abb. 5-36 dargestellte
Elutionsprofil, das unter Verwendung von EPC/Chol 7/3-Liposomen entstanden ist, ist
repräsentativ für unter gleichen Bedingungen durchgeführte Versuche mit anderen
Lipidkompositionen. Da der für die Verankerung in der Membran verantwortliche Sterolteil
des BSA-BPS-Komplexes bei BPS-NHS-Kopplungen identisch zu den BPS-TRE-
Kopplungen ist, war diese Beobachtung zu erwarten gewesen.
Ergebnisse und Diskussion 147
5.4.3.2 Vergleich der Kopplungseffizienz unter Verwendung verschiedener aktivierter PEG-Lipide
Sinn der Versuchsreihe war es festzustellen, inwiefern die mit dem Sterolanker einstellbare
Ligandendichte auch mit dem DSPE-PEG-Derivat bei der Modifikation von präformulierten
Liposomen unterschiedlicher Zusammensetzung bei RT möglich war. Daher wurden Vesikel
mit bei RT rigider und fluider Membran verwendet und die Elutionsprofile der verschiedenen
aktivierten Lipide verglichen.
Wie Abb. 5-37 verdeutlicht, hat die Art der Bindung zwischen Protein und Anker, wie
erwartet, keinen Einfluss auf die Effizienz der Kopplung des BSA an die
Liposomenoberfläche. Auch mit BPS-NHS ist bei RT eine vollständige Kopplung von BSA
an HSPC/Chol (Effizienz: 95,3 ± 2,5 %, n=3, bei c[BSA] = 1mg/ml, 5 mol% BPS-NHS,
Endkonzentration des Ansatzes 13,3 mM Lipid) und fluide EPC basierende Liposomen
(Effizienz: 97,2 ± 3,4 %, n=3, bei c[BSA] = 1mg/ml, 5 mol% BPS-NHS, Endkonzentration
des Ansatzes 13,3 mM Lipid) möglich.
Abb. 5-36: Vergleich des Elutionsverlaufs bei der Verwendung von BPS-NHS bzw. nicht aktiviertem BPS während des ersten Inkubationsschritts
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
0
2
4
6
8
10
12
Aktiv
ität [
kcpm
]
Fraktionsnummer
━■━ Elutionsprofil
bei Verwendung von
BPS-NHS im ersten
Inkubationsschritt
━●━ Elutionsprofil
bei Verwendung von
BPS im ersten
Inkubationsschritt
148 Ergebnisse und Diskussion
0 5 10 15 20
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
% B
SA/F
rakt
ion
Fraktionsnummer
━■━ Elutionsprofil
bei Inkubation über
Nacht und RT
━●━ Elutionsprofil
bei Inkubation für
eine Stunde bei 60 °C
Abb. 5-38: Vergleich des Elutionsverlaufs bei Verwendung von NHS-PEG-DSPE zur Kopplung von BSA an HSPC/Chol Liposomen
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
0
10
20
30
40
50
60
% B
SA/F
rakt
ion
Fraktionsnummer
━■━ HSPC/Chol
━●━ EPC/Chol 4/1
Abb. 5-37: Elutionsprofile bei Verwendung von BPS-NHS zur Kopplung von BSA an Liposomen verschiedener Membranzusammensetzung und RT beim zweiten Inkubationsschritt
Ergebnisse und Diskussion 149
Der Vergleich der Kopplungseffizienz bei Verwendung von 5 mol% BPS-NHS und BPS-
GET liefert unter den gewählten Bedingungen keine signifikanten Unterschiede. Beide
Methoden führen zu einer für die nahezu vollständige Kopplung ausreichenden
Hydrophobisierung des eingesetzten BSA (vgl. Abb. 5-23).
Die Fixierung von BSA an Liposomen mittels NHS-PEG-DSPE funktioniert nur, wenn im
zweiten Inkubationsschritt bei erhöhten Temperaturen inkubiert wird.
Abb. 5-38 demonstriert die klare Temperaturabhängigkeit der Insertion des BSA-PEG-DSPE-
Konjugats in HSPC/Chol-Liposomen. Während die Inkubation des mit dem
NHS-PEG-DSPE umgesetzten BSA auch über Nacht keine nennenswerte BSA-Dichte an der
Liposomenoberfläche garantieren kann, reicht bereits eine Stunde Inkubation bei 60 °C aus
um ca. 75 % des Proteins an der Liposomenoberfläche zu fixieren.
Inwieweit sich durch eine längere Inkubationsdauer bei erhöhter Temperatur eine bessere
Kopplungseffizienz erreichen lässt, wurde bisher nicht untersucht. Da das aktivierte
DSPE-PEG-Derivat wie die anderen Lipide 5mol%ig eingesetzt wurde und die Chemie der
Kopplungsreaktionen der beiden NHS-Lipide nahezu identisch ist, ist zu erwarten, dass die
Effizienz mit länger dauernder Inkubation bei 60 °C quantitativer verläuft.
Andere mögliche Erklärungen für die nicht vollständige Kopplung liegen im
Aktivierungsgrad des NHS-PEG-DSPE, der mittels 1H NMR analog zu 5.1.2 bestimmt wurde
und bei 85% lag. Außerdem ist die Hydrolyse des Bernsteinsäure-PEG-Esters zu bedenken.
150 Zusammenfassung
6 Zusammenfassung und Ausblick
Bei der Entwicklung neuer Therapiekonzepte gerät das aktive Ansteuern von pathologisch
verändertem Gewebe mehr und mehr in den Focus der Forschung, um bei maximaler
Effizienz minimale unerwünschte Wirkungen zur erreichen. Die Funktionalisierung von
liposomalen Zubereitungen mit zielgerichteten Vektoren stellt einen hoffnungsvollen
Ausgangspunkt auf dem Weg zur Entwicklung intelligenter Wirkstoffträgersysteme dar.
Mit der therapeutischen Etablierung von sterisch stabilisierten Doxorubicin-haltigen
Liposomen, die der schnellen Eliminierung aus der systemischen Zirkulation entgehen (Allen
et al. 1991), ist eine Komponente eines solchen Systems vorhanden.
Die stark im Vormarsch befindliche Entwicklung von monoklonalen, humanisierten und
chimären Antikörpern zur Nutzung als Therapeutika oder Diagnostika (besonders im
onkologischen Bereich) liefert eine immer größer werdende Zahl von möglichen Liganden,
die zur aktiven Zielausrichtung von Liposomen genutzt werden können. Auch die in den
Anfängen der Immunoliposomen beobachteten Probleme in Bezug auf Immunogenität und
Interaktion der modifizierten Vesikel mit Makrophagen (Harding et al. 1997) konnten durch
die Verwendung dieser Liganden weitgehend überwunden werden (Park et al. 2001).
Kombiniert man die sterische Stabilisierung von Liposomen mit der Kopplung von Liganden
an die distale Hydroxylfunktion von Polyethylenglykolketten, lassen sich in vivo und in vitro
die besten Targetierungserfolge erzielen.
Die Kopplungsmethoden, die üblicherweise zur Fixierung von Liganden an der liposomalen
Oberfläche eingesetzt werden sind zwar effizient, jedoch nach wie vor kompliziert, teuer und
nicht universell einsetzbar (vgl. 1.2). Für die weit verbreitete Methode der Kopplung von
Liganden über die Ausbildung einer Thioetherstruktur zu Maleimid-aktivierten Lipiden ist in
der Regel das Einführen von Thiolstrukturen in den Liganden erforderlich. Die
Thiolierungsreagenzien setzen dabei an Aminen des zu koppelnden Vektors an, so dass die
Bindung zwischen diesem und dem Liposom indirekt über Amine vermittelt wird.
Aminoreaktive Kopplungsreagenzien vermeiden also einen Präparationsschritt und die
resultierende analytische Charakterisierung des thiolierten Liganden. Sie sind somit den
thiolaktiven vorzuziehen, weisen jedoch i.d.R. Hydrolyseempfindlichkeit auf und bergen die
Gefahr der Reaktion mit anderen Systemkomponenten, so dass sie nicht während der
Liposomenpräparation in die Membran der Vesikel integriert werden können. Daher müssen
Zusammenfassung 151
die zu fixierenden Liganden in einer vorgeschalteten Derivatisierungsreaktion mit aktivierten
PEG-Lipiden hydrophobisiert und anschließend in die Membran vorgefertigter Liposomen
implementiert werden. Die von Zalipsky und Ishida (Zalipsky et al. 1997; Ishida et al. 1999)
eingeführte Technik zur nachträgliche Modifizierung liposomaler Membranen (vgl. 1.2.2.1)
erfährt durch die notwendigen erhöhten Temperaturen und unbefriedigende Ligandendichte
an der Oberfläche sterisch stabilisierter Liposomen erhebliche Einschränkungen in ihrer
praktischen Bedeutung. Die Ursache für die geschilderte Problematik liegt in der Art des
hydrophoben Membranankers (i.d.R. Distearoylphosphatidylethanolamin) begründet, bei
denen sich die zwei Kohlenwasserstoffketten nur schlecht in die Liposomenmembran
einfügen.
Die Entwicklung eines aminoaktiven Kopplungsreagenzes mit alternativem Membrananker
zur nachträglichen Modifizierung liposomaler Oberflächen bei Raumtemperatur würde die
Präparation sterisch-stabilisierter, zielgerichteter Liposomen deutlich vereinfachen. Im
Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob chemisch aktivierte, ethoxylierte
(PEGylierte) Sojasterole zur Funktionalisierung von Liposomen geeignet sind.
PEGylierte Sojasterole sind halbsynthetische Massenprodukte, die in der Waschmittel- und
Kosmetikindustrie zum Einsatz kommen. Aus diesem Grund sind sie preiswert und wurden
kostenfrei zur Verfügung gestellt. Allerdings werden im nicht-pharmazeutischen Bereich auch
nur geringe Anforderungen an die Reinheit des Produktes gestellt, so dass in dieser Arbeit
eine Aufreinigung des Ausgangsmaterials notwendig war. Die Hauptverunreinigung ist freies
Polyethylenglykol (PEG), das sehr effizient mittels mizellarer Chromatographie in Wasser
entfernt werden konnte (vgl. 4.1.1).
Eine Grundvoraussetzung für die Verwendbarkeit PEGylierter Sojasterole zur nachträglichen
Funktionalisierung liposomaler Oberflächen bei Raumtemperatur ist die selbstständige
Einlagerung der Substanzen in Phospholipidvesikel. Die mittels quantitativer 1H NMR
bestimmten Einlagerungsraten lagen in Abhängigkeit der Membranzusammensetzung
zwischen 90 und 30% des angebotenen Materials. Daraus resultierte ein PEG-Lipid-Gehalt
der Membran von 6,75-2,4 mol% in Bezug auf das Gesamtlipid (vgl. 5.3.2).
Da die Einlagerung der PEG-Sterole ausschließlich in den äußeren Monolayer erfolgt, ist das
Auftreten von Membranspannungen mit daraus entstehenden Membrandefekten zu erwarten.
Das Ausmaß dieser Schädigungen wurde mittels Fluoreszenz-Dequenching untersucht. Bei
Einlagerung der PEGylierten Sojasterole wurde in selbst-quenchender Konzentration
verkapseltes Calcein aus den Liposomen freigesetzt und fluoreszenzspektrometrisch
152 Zusammenfassung
quantifiziert (vgl. 4.5.4). Je nach Membranzusammensetzung und Menge des eingesetzten
Membranankers ergaben sich Freisetzungsraten zwischen 1 und 8% des verkapselten Markers
(vgl. 5.3.4.1) Werte, die mit den Freisetzungsdaten der Einlagerung von PEGylierten
Phosphatidylethanolaminderivaten vergleichbar sind (Uster et al. 1996). Da die
Membranschäden außerdem transienter Natur waren, bedeuten sie keine Einschränkung der
Verwendbarkeit der PEGylierten Sterole zum Zwecke der Liposomenfunktionalisierung.
Die eigentliche Kopplung von Liganden an die Oberfläche von Liposomen läuft in
Konzentrationsbereichen oberhalb der CMC ab. Daher war neben den Membrandefekten
durch die Einlagerung der Derivate mit zusätzlicher Freisetzung von verkapseltem Material
durch Solubilisierungseffekte zu rechnen. Die Bestimmung der Freisetzung von Calcein
oberhalb der CMC (vgl. 4.5.4.2) ergab, dass diese nur unwesentlich über den Werten der
Freisetzung, provoziert durch die reine Einlagerung der Derivate, lag (vgl.5.3.4.2).
Auch in mikrokalorimetrischen Untersuchungen (vgl. 4.5.3 und 5.3.3) bestätigte sich das
geringe Solubilisierungspotential der PEG-Sterole. Selbst bei hohen Konzentrationen der
PEG-Lipide (PEG-Lipide/Lipid 1:1 mol/mol) konnten keine Solubilisierung der Membran
beobachtet werden. Außerdem lieferten diese Untersuchungen einen hohen lipidnormierten
Verteilungskoeffizienten (> 50 mmol-1), der auf eine stabile Membranverankerung hindeutet.
Die chemische Aktivierung der terminalen Hydroxylfunktion des PEG-Teils des Moleküls
durch Tresylchlorid wurde erstmals von A. Lung (Skalko et al. 1998; Lung 2002) beschrieben
und führte zu einem Derivat, dass zur Kopplung von Proteinen an Liposomen genutzt werden
konnte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde durch die Optimierung der von A. Lung
beschriebenen Synthese und Modifikation der Aufreinigungsschritte der tresylierten Sterole
(vgl. 4.1.2) eine vollständige Aktivierung des PEG-Sterols mit Tresylchlorid erreicht und
mittels 1H NMR gezeigt (vgl. 5.1.1).
Nachdem unter Verwendung von radioaktiv markiertem BSA als Modellprotein mittels
Gelpermeationschromatographie und Free-Flow-Elektrophorese (vgl. 4.6.4.2) gezeigt wurde,
dass die Verwendung von tresylierten PEG-Sterolen die Kopplung von Proteinen an
liposomale Oberflächen erlaubt (vgl. 5.4.1.1), wurde der Funktionalisierungsprozess in Bezug
auf den pH-Wert, die Menge des zu verwendenden tresylierten Sterols und die Dauer der
beiden Inkubationsschritte optimiert (vgl. 4.6.3 und 4.6.4).
Die Kopplung der Proteine läuft in zwei einfachen Inkubationsschritten bei Raumtemperatur
ab (vgl. 4.6.1). Im ersten Schritt wird eine Lösung des zu koppelnden Proteins mit einer
Zusammenfassung 153
ethanolischen Lösung des aktivierten Lipids gemischt, oder in ein Reaktionsgefäß
eingebracht, dessen Wände mit dem aktivierten Anker gecoatet sind. Nun erfolgte die erste
Inkubation, in der das Protein durch Umsetzung seiner Aminofunktionen mit dem tresylierten
PEG-Derivat hydrophobisiert wird. Nach Zugabe der Liposomen beginnt der zweite
Inkubationsschritt, während dessen die Einlagerung des derivatisierten Proteins in die
Liposomen stattfindet.
Wie die Literatur nahe legte (Sperinde et al. 1999), war die Derivatisierung des Proteins im
schwach-alkalischen pH-Bereich von 8,0 - 9,0 weit effektiver als im neutralen pH-Bereich
(vgl. 5.4.1.2), was sich in wesentlich höheren Kopplungseffizienzen äußerte.
In Bezug auf die Abhängigkeit der Kopplungseffizienz von der Menge des eingesetzten
aktivierten Lipids zeigt Kapitel 5.4.1.3 auf, dass bereits 1 - 5 mol% des aktivierten Lipids in
Bezug auf das Gesamtlipid der Liposomendispersion ausreichen, um eine Ligandendichte von
20 µg Protein/µmol Lipid auf der liposomalen Oberfläche einzustellen. Rechnet man diese
Proteinmenge auf die Molekularmasse eines Antikörpers hoch, liegt die Ligandendichte in
einem Bereich, der für ein erfolgreiches Targeting optimal ist (Hansen et al. 1995).
Durch Zufügen eines großen molaren Überschusses eines Amins während des ersten
Inkubationsschrittes konnte die Derivatisierungsreaktion unterbrochen werden. Auf diese
Weise ließ sich ermitteln, dass eine 12stündige Dauer für den ersten Schritt des
Kopplungsprotokolls auch unter schlechten Bedingungen ausreichend ist (vgl. 5.4.1.4). Die
Dauer des zweiten Inkubationsschritts wurde durch Unterbrechung des Einlagerungsschrittes
des Kopplungsprotokolls mittels Gelpermeationschromatographie bestimmt. So konnte
gezeigt werden, dass in diesem eine Inkubation von 2 h völlig ausreicht, um die Bindung des
Proteins an die Liposomen zu vervollständigen (vgl. 5.4.2.1).
Auch die Freisetzung des Markers bei Einlagerung des Protein-Anker-Komplexes in Calcein-
beladene Liposomen ober- und unterhalb der CMC war von Interesse, um abschätzen zu
können, ob der Komplex einen negativen Einfluss auf die Membranintegrität ausübt.
Verglichen mit dem freien PEG-Sterol beobachtet man in diesen Fällen eine verringerte
prozentuale Freisetzung des Calceins, was für eine Reduktion der auftretenden
Membrandefekte spricht (vgl. 5.4.2.4). Die Fixierung der Sterole am Protein führt zu einer
verringerten Mobilität der Ankermoleküle und kann so und auf sterische Art das Ausmaß der
Einlagerung im Vergleich zum freien Molekül verringern. Oberhalb der CMC stellt sich die
Frage, ob nach der Umsetzung des Lipids mit dem Protein, angesichts der fundamentalen
Veränderung der Polaritätsverhältnisse und der Umsetzung des Proteins mit dem aktivierten
154 Zusammenfassung
PEG-Lipid, überhaupt noch Mizellen vorliegen, die durch Solubilisierung der Membran eine
Steigerung der Calcein-Freisetzung provozieren könnten.
Weitere Versuchsreihen beschäftigten sich mit der Untersuchung des Einflusses der
Lipidkomposition auf die Kopplungseffizienz und das Partikelwachstum während des zweiten
Inkubationsschrittes (vgl. 4.6.4.3 und 4.6.4.4). Beides wurde auch in Abhängigkeit der
Proteinkonzentration analysiert. Die Lipidkompositionen der unterschiedlichen
Liposomenspezies wurden so gewählt, dass bei Raumtemperatur sowohl fluide als auch bei
Raumtemperatur rigide Membranen vorlagen. Eine drittes Spezies repräsentierte sterisch
stabilisierte rigide Liposomen. Wie erwartet nimmt die relative Kopplungseffizienz mit
zunehmender BSA-Menge ab. Dennoch lässt sich auf Kosten der relativen
Kopplungsausbeute absolut eine höhere Ligandendichte einstellen (vgl. 5.4.2.3). Da bei allen
Versuchen der Anker im molaren Überschuss gegenüber dem Protein vorlag, liegt die
Vermutung nahe, dass eine größere Anzahl von Sterolen pro Protein nur für eine stabilere
Bindung des Proteins an der Liposomenoberfläche sorgt, und bereits wenige Sterolanker für
die Fixierung des Proteins an der Oberfläche des Liposoms ausreichen. Dafür spricht auch,
dass die Unterschiede in der Membranzusammensetzung nur einen geringen Einfluss auf die
Kopplungseffizienz haben, obwohl die NMR-Versuche eine deutliche Abhängigkeit der
Insertionsrate von der Lipidzusammensetzung der Membran demonstriert haben.
Mittels Photonenkorrelationsspektroskopie wurde die Entwicklung der Partikelgröße während
des zweiten Inkubationsschrittes untersucht (vgl. 4.6.4.4). Die Größenentwicklung während
der Einlagerung des Protein-Anker-Komplexes in die Liposomenmembran ist auf die
Quervernetzung von Liposomen über das zu koppelnde Protein zurückzuführen. Die
Geschwindigkeit der Größenzunahme hängt wesentlich von der Proteinkonzentration während
der Derivatisierungsreaktion (erster Inkubationsschritt) und der Lipidkomposition der
Membran ab. Fluide Liposomen mit einer Größe von ca. 120 nm agglomerieren innerhalb
kurzer Zeit zu polydispersen großen Aggregaten (> 800 nm), während sterisch stabilisierte
Liposomen nur eine geringe Zunahme von Polydispersität und Größe aufweisen (vgl. 5.4.2.6).
Der Einbau von PEG-Lipiden in die Vesikelmembran erlaubt auch bei fluiden Vesikeln eine
signifikante Reduktion der Partikelgrößenzunahme, ohne dass, wie für Phospholipid-PEG-
Derivate gezeigt (vgl. 5.4.2.3), eine nicht hinnehmbare Reduktion der Ligandendichte zu
befürchten wäre. Da jedes Protein mehrere Anker tragen kann, ist die Verknüpfung der
Liposomen untereinander eine logische Folge. Dass nicht etwa Fusionsprozesse für die
Größenzunahme verantwortlich sind konnte durch Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie
Zusammenfassung 155
nachgewiesen werden. (vgl. 4.4.3 und 5.4.2.6).
Einen ersten Hinweis auf die in vivo Stabilität der Verankerung lieferten
Rechromatographieversuche nach der Inkubation der Liposomen mit humanem Serum bei
37 °C (vgl. 4.6.4.5). Die Auswertung des Experiments zeigte, dass der Einfluss von
Serumkomponenten nicht zu einer Abspaltung des gekoppelten Proteins von der liposomalen
Oberfläche führt (vgl. 5.4.2.5) und deutet damit auf eine auch in vivo stabile Verknüpfung
hin.
Als eine Alternative zum Tresylchlorid als Aktivierungsreagenz wurde N,N’-
Disuccinimidylcarbonat eingeführt, das in einer einfachen einstufigen Synthese mit den
PEGylierten Sterolen umgesetzt wurde (vgl. 4.1.3). Der entstehende N-Hydroxysuccinimid-
Polyethylenglykol-Kohlensäurediester reagiert bei neutralem pH-Wert mit Aminen unter
Ausbildung eines in vivo stabilen Carbamates ab. Analog zur Kopplung mittels tresylierten
PEG-Sterolen konnte die grundsätzliche Eignung der Substanz zur Kopplung von Proteinen
an Liposomen gezeigt werden (vgl.5.4.3.1). Damit stehen zwei aktivierte Sterole zur
Verfügung um je nach Anforderung des Experimentes bei unterschiedlichen pH-Werten
aminoaktive Kopplungen von Proteinen an Liposomenoberflächen durchzuführen.
Insgesamt konnte gezeigt werden, dass aktivierte PEGylierte Sterole als mögliche Kandidaten
zur Funktionalisierung von Liposomen in Frage kommen und ihre Eignung in weiteren
Versuchen verifiziert werden sollte, da sie das Potential haben, die Funktionalisierung von
liposomalen Zubereitungen entscheidend zu vereinfachen. Die Einlagerung in Liposomen
verschiedenster Zusammensetzung verläuft rasch und ohne die Entstehung permanenter
Membrandefekte. Mittels der aminoaktiven tresylierten und N-Hydroxysuccinimid-aktivierten
PEG-Sterole sind mit einem einfachen Zwei-Schritt-Kopplungsprotokoll hohe
Ligandendichten an der liposomalen Oberfläche einstellbar, ohne dass eine Erhöhung der
Temperatur notwendig wäre. Die problematische Größenzunahme während der Einlagerung
des Protein-Anker-Komplexes in die Liposomenmembran lässt sich durch einen PEG-Lipid-
Anteil der Membran, sowie eine zeitliche Begrenzung des zweiten Inkubationsschrittes in den
Griff bekommen.
In zukünftigen Untersuchungen kommt es nun darauf an zunächst in Zellversuchen und später
im Mausmodell die Eignung der Substanzen zu verifizieren. Ein kritischer Punkt ist sicherlich
die Stabilität der hydrophoben Membranverankerung, über die letztlich bloß ein in vivo
Experiment Aufschluss geben kann. Auf jeden Fall sollten sich die Substanzen jedoch für
Targetierungsversuche im Zellmodell eignen. Sollten in vivo Versuche demonstrieren, dass
156 Zusammenfassung
die sterische Stabilisierung durch PEG-Sterole nicht in ausreichendem Maße gewährleistet
werden kann, besteht die Möglichkeit bereits PEGylierte Liposomen zu funktionalisieren.
Außerdem erfordert nicht jede Applikation eine Zirkulationszeit von deutlich über 10
Stunden. Sollen sowohl Gewebsmakrophagen als auch humorale Makrophagen angesteuert
werden, wie im Falle der Behandlung der chronischen Granulomatose (vgl. Gerber et al.
(2001) und Kimpfler (2003)), ist eine kürzere Halbwertzeit durchaus wünschenswert. Des
weiteren ist eine Verwendung im Bereich der liposomalen Immunisierung denkbar, die in
letzter Zeit immer intensiver untersucht wird. Aufgrund der starken Immunogenität liposomal
präsentierter Antigene zeigen solche Zubereitungen deutliche Vorteile gegenüber
herkömmlichen Impfzubereitungen (Humphries et al. 2004; Neidhart et al. 2004). Auch in
diesem Fall ist nicht unbedingt eine lange Zirkulationszeit der modifizierten Vesikel
erwünscht.
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Persönliche Daten und Lebenslauf Persönliche Daten
Name: Thomas Steenpaß
Geburtsort: Bocholt
Geburtsdatum: 27.09.1973
Familienstand:
Kinder:
verheiratet mit Silja Steenpaß, geborene Nobes
Zwillinge Melina und Jan Steenpaß (*17.02. 2004)
Nationalität: deutsch
Lebenslauf Schulausbildung 08/1980 - 06/1984
08/1984 - 06/1993
Grundschule Dingden
St. Josefs-Gymnasium in Bocholt
Abschluss Abitur
Wehrdienst 07/1993 - 10/1994 Pflegediensthelfer im St. Josef Altenpflegeheim Dingden
Studium WS 93/94
SS 94 - WS 99
05/1999 - 10/1999
11/1999 - 04/2000
05/2000
06/2000
Beginn des Pharmaziestudiums an der J.W. Goethe Universität in Frankfurt am Main
Fortführen des Studiums an der H.H. Universität Düsseldorf
Erster Teil des Praktischen Jahres bei der BASF-AG Ludwigshafen
Zweiter Teil des Praktischen Jahres in der Wilhelm Busch Apotheke in Bocholt
Drittes Staatsexamen
Approbation als Apotheker
Promotion 06/2000 - 07/2004 Doktorand am Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie an der
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Arbeitskreis von Prof. Dr. R. Schubert;
Arbeiten zum Thema “PEGylierte Sterole zur Funktionalisierung liposomaler Oberflächen“
