PEGylierte Sterole zur Funktionalisierung

liposomaler Oberflächen

Inaugural-

Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau

vorgelegt von

Thomas Steenpaß

aus Bocholt

2004

Ich danke allen meinen Kollegen, die mich bei meiner Arbeit unterstützt haben.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. R. Schubert, der stets für Anregungen,

Diskussionen und Unterstützung bereit war und mir viel Freiraum für eigene Ideen und

Konzepte gelassen hat. In guter Erinnerung wird mir die familiäre Atmosphäre des AK

Schubert bleiben, die Prof. Schubert durch die Organisation gemütlicher gemeinsamer Feiern

und menschliches Miteinander pflegte.

Des weiteren danke ich Frau PD Dr. R. Peschka-Süss für ausführliche Diskussionen rund um

das Thema Octreotid-modifizierte Liposomen.

Meiner Laborkollegin Frau Dr. A. Kimpfler danke ich für die Aufnahme der Cryo-TEM

Bilder und die angenehme Zusammenarbeit.

Herr Prof. Dr. J. Seelig und Herr PD Dr. H. Heerklotz haben mir die ITC-Anlage zur

Verfügung gestellt und mich in Theorie und Praxis der mikrokalorimetrischen Messung

eingeführt. Auch hierfür möchte ich mich herzlich bedanken.

Die praktischen Arbeiten zur Erstellung dieser Dissertationsschrift wurden im Zeitraum von

Juli 2000 bis April 2004 am Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie des Institutes für

Pharmazeutische Wissenschaften der Albert-Ludwigs-Universität in Freiburg im Breisgau

durchgeführt.

Dekan: Prof. Dr. K. Bucher

Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. G. E. Schulz

Referent: Prof. Dr. R. Schubert

Korreferentin: PD Dr. R. Peschka-Süss

Tag der Bekanntgabe des Prüfungsergebnisses: 11.11.2004

Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht:

Kimpfler, A., Steenpaß, T., Falk, U., Gerber, C., Bruchelt, G., Schubert, R. Aufnahme von Glucose-Oxidase-Liposomen in Phagozyten – Einfluss von Lipidzusammensetzung und Oberflächenmodifikation, (Poster) DPhG-Tagung, Oktober 2001, Halle

Steenpaß, T., Lung, A., Schubert, R.

Tresyl-activated ethoxylated soy sterols for coupling of proteins to liposomes (Poster) 10th International Conference on Pharmaceutical Technology, April Florenz 2002

Steenpaß, T.

Tresylated sterol-PEG anchors for coupling of proteins to liposomes, (Vortrag) The 15th Mountain / Sea Liposome Workshop Oberjoch / Allgäu, März 2002

Steenpaß, T.

Octreotide coupled to the liposomal surface (Vortrag) The 2nd Dutch Oberjoch Liposome Workshop on the Isle of Ameland, September 2003

Steenpaß, T. Drug-Targeting durch Funktionalisierung von Liposomen (Vortrag)

FAF-Meeting, Januar 2004, Freiburg

Manuskript fertig gestellt: Steenpaß, T., Lung, A., Schubert, R.

Tresylated PEG-sterols for subsequent attachment of proteins to preformed liposomes einzureichen in Biochim Biophys Acta, 2005

Inhaltsverzeichnis I

1 ALLGEMEINER TEIL 1

1.1 Liposomen 1 1.1.1 Definition, Aufbau und Klassifizierung 1 1.1.2 Herstellungsmethoden 6

1.1.2.1 Filmmethode 6 1.1.2.2 Extrusion 7 1.1.2.3 Ultrabeschallung 8 1.1.2.4 Detergenzentfernung 8

1.1.3 Charakterisierung von Liposomen 10 1.1.4 Nicht therapeutische Anwendungsgebiete von Liposomen 12 1.1.5 Therapeutische Anwendungsgebiete von Liposomen, Liposomen als Drug-Delivery-Systeme 12

1.1.5.1 Passives liposomales Targeting, der EPR-Effekt 13 1.1.5.2 Aktives liposomales Targeting 17

1.2 Modifikation liposomaler Oberflächen 20 1.2.1 Hydrophile Polymere zur sterischen Stabilisierung liposomaler Drug-Carrier-Systeme 20

1.2.1.1 Modifizierung mit PEG-Phospholipiden 21 1.2.1.2 Modifizierung mit PEG-Sterolen 23

1.2.2 Ligand-modifizierte liposomale Oberflächen 24 1.2.2.1 Ligand-modifizierte Liposomen: Arten und Methoden zu ihrer Herstellung 24 1.2.2.2 Kopplungsmethoden zur Präparation Ligand-modifizierter Oberflächen 28

1.2.2.2.1 Nicht kovalente Methoden 28 1.2.2.2.2 Kovalente Methoden 30

1.2.2.2.2.1 Aminoreaktive, direkte Kopplung 30 1.2.2.2.2.2 Thiolaktive, direkte Kopplung 34 1.2.2.2.2.3 Aminoaktive distale Kopplung an PEG-Ketten 40 1.2.2.2.2.4 Thiolaktive, distale Kopplungen 41

1.2.3 Zusammenfassung der Kopplungsprinzipien 43

1.3 Isotherme Titrationskalorimetrie zur Untersuchung der Interaktionen von Detergenzien mit

Phospholipidvesikeln 45 1.3.1 Geräteaufbau und Messprinzip 45 1.3.2 Untersuchungsgegenstände der isothermen Titrationskalorimetrie in Membran-Detergenz-Systemen

47

2 AUFGABENSTELLUNG UND ZIELSETZUNG 49

3 MATERIAL UND GERÄTE 50

II Inhaltsverzeichnis

3.1 Lipide und Membrankomponenten 50

3.2 Chemikalien 50

3.3 Verbrauchsmaterialien 54

3.4 Geräte 55

4 METHODEN 57

4.1 Synthesen 57 4.1.1 Aufreinigung von BPS-30 57 4.1.2 Synthese von tresyliertem BPS 58 4.1.3 Synthese von N-Hydroxysuccinimid-aktiviertem BPS 59 4.1.4 Synthese von p-Maleimidophenylisocyanat-aktiviertem BPS 60

4.2 CMC- Bestimmungen 61

4.3 Liposomenherstellung 61 4.3.1 Lipidkompositionen 62 4.3.2 Herstellung durch Extrusion 62

4.4 Charakterisierung der Liposomendispersionen 63 4.4.1 Messung der Größenverteilung durch PCS 63 4.4.2 Bestimmung des Phosphatgehalts nach Bartlett 64 4.4.3 Cryo-TEM 65

4.5 Einlagerungsverhalten von ethoxylierten Sojasterolen in vorgefertigte Liposomen 67 4.5.1 Überprüfung der Separation von Mizellen und Liposomen mittels Dünnschichtchromatographie 67 4.5.2 Einlagerungskinetik und Transfer Raten 67 4.5.3 Isotherme Titrationskalorimetrie zur Untersuchung der Interaktionen von PEGylierten Sterolen mit

Liposomen 69 4.5.3.1 Demizellisierungsexperiment 70 4.5.3.2 Verteilungsexperiment 70 4.5.3.3 Solubilisierungsexperiment 73

4.5.4 Membran-Leakage während der BPS-30 Einlagerung 73 4.5.4.1 Freisetzung unterhalb der CMC 73 4.5.4.2 Freisetzung oberhalb der CMC 76

4.6 Oberflächenmodifikation präformulierter Liposomen mit BSA-BPS-Derivaten 78 4.6.1 Das Standardkopplungsprotokoll 78 4.6.2 Ermittlung der Kopplungseffizienz 80

4.6.2.1 Iodierung des Liganden 80

Inhaltsverzeichnis III

4.6.2.2 Quantifizierung des gebundenen Anteils über GPC 80 4.6.3 Kopplungsversuche unter Verwendung von tresyliertem Generol 81

4.6.3.1 Überprüfung der Eignung von GET zur Kopplung von BSA an Liposomen 82 4.6.3.2 Kontrolle des pH-Optimums bei Verwendung tresylierter Sojasterole zur Kopplung von BSA

83 4.6.3.3 Abhängigkeit der Kopplungseffizienz von pH-Wert und Stoffmenge des eingesetzten GET 83 4.6.3.4 Untersuchungen zur Dauer des ersten Inkubationsschritts 84

4.6.4 Kopplungsversuche unter Verwendung von BPS-TRE 85 4.6.4.1 Versuche zur Dauer des zweiten Inkubationsschritts 85 4.6.4.2 Free-Flow Elektrophorese als Werkzeug zum Nachweis der Oberflächenmodifikation von

Liposomen 85 4.6.4.3 Kopplungseffizienz in Abhängigkeit von Lipidzusammensetzung und BSA-Konzentration 87 4.6.4.4 Untersuchung der Größenentwicklung während des zweiten Inkubationsschrittes 88 4.6.4.5 Stabilität der Verankerung in Anwesenheit von humanem Serum 89

4.6.5 Versuche unter Verwendung BPS-NHS 90 4.6.5.1 Überprüfung der Eignung von BPS-NHS zur Kopplung von BSA an Liposomen 90 4.6.5.2 Vergleich der Kopplung unter Verwendung verschiedener aktivierter Lipide in Abhängigkeit

der Temperatur des zweiten Inkubationsschritts 90

4.7 Abschätzung der Ligandenzahl pro Liposom 91

5 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 93

5.1 Interpretation der 1H NMR Spektren 93 5.1.1 Tresyliertes BPS 93 5.1.2 N-Hydroxysuccinimid aktiviertes BPS 94

5.2 CMC der PEG-Lipide 96

5.3 Einlagerungsverhalten von PEG-Lipiden in präformulierte Liposomen 97 5.3.1 Trennung von mizellarem und liposomal assoziiertem PEG-Lipid über GPC 98 5.3.2 Einlagerungsgeschwindigkeit und Transferraten der PEG-Lipide 99 5.3.3 Ergebnisse der mikrokalorimetrischen Untersuchungen (ITC) 105

5.3.3.1 Demizellisierungsexperiment 105 5.3.3.2 Verteilungsexperiment 107 5.3.3.3 Solubilisierungsexperimente 108 5.3.3.4 Zusammenfassung der ITC-Experimente 111

5.3.4 Freisetzung von liposomal verkapseltem Calcein während der Einlagerung von BPS in

präformulierte Liposomen 111 5.3.4.1 Freisetzung unterhalb der CMC 111 5.3.4.2 Freisetzung oberhalb der CMC 116

IV Inhaltsverzeichnis

5.4 Oberflächenmodifikation von präformulierten Liposomen mit BSA als Modellprotein 119 5.4.1 Versuche unter Verwendung von tresyliertem Generol E-25 119

5.4.1.1 Grundsätzliche Eignung tresylierter Sojasterole zur Kopplung von BSA an Liposomen 121 5.4.1.2 pH-Abhängigkeit der Kopplung mittels tresyliertem Generol 122 5.4.1.3 Abhängigkeit der Kopplungseffizienz von pH-Wert und Ankerkonzentration 123 5.4.1.4 Reaktionsgeschwindigkeit des ersten Inkubationsschrittes 125

5.4.2 Versuche unter Verwendung von tresyliertem BPS-30 126 5.4.2.1 Geschwindigkeit der Einlagerung des BSA-Sterol-PEG Konjugats 127 5.4.2.2 Kontrolle auf Koelution durch Formation von Proteinaggregaten 128 5.4.2.3 Kopplungseffizienz in Abhängigkeit von Lipidkomposition und Proteinkonzentration 130 5.4.2.4 Calcein-Freisetzung bei Einlagerung des BSA-BPS-Komplexes 135 5.4.2.5 Stabilität des Liposom-BSA-Komplexes in humanem Serum 136 5.4.2.6 Größenentwicklung der BSA-modifizierten Liposomen 139

5.4.3 Versuche unter Verwendung von BPS-NHS 145 5.4.3.1 Grundsätzliche Eignung von BPS-NHS zur Kopplung von BSA an Liposomen 146 5.4.3.2 Vergleich der Kopplungseffizienz unter Verwendung verschiedener aktivierter PEG-Lipide

147

6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 150

7 LITERATURVERZEICHNIS 157

Abkürzungsverzeichnis V

In dieser Arbeit verwendete Abkürzungen:

(Allgemein übliche Abkürzungen, sowie gebräuchliche SI- und von ihnen abgeleitete

Einheiten werden nicht mit angeführt)

Ab antibody; Antikörper

ACS - Qualität American Chemical Society, Qualitätsstandard der Amerikanischen Chemischen Gesellschaft

BPS-30 ethoxyliertes Sojasterolgemisch mit einer durchschnittlichen PEG - Kettenlänge von 30 Etylenoxid-Einheiten

BPS-NHS N-Hydroxysuccinimid aktiviertes BPS-30

BPS-TRE Tresylat aktiviertes BPS-30

BSA bovines Serum Albumin

Bq Becquerel, Aktivität eines radioaktiven Materials [s-1]

CHEMS Cholesterylhemisuccinat

Chol Cholesterol

CMC critical micelle concentration, kritische Mizell(bildungs)konzentration

cpm counts per minute, Zählimpulse pro Minute

cps countes per second, Zählimpulse pro Sekunde

Cryo-TEM Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie

DAB Deutsches Arzneibuch

DPH Diphenylhexatrien

DR Dragendorff Reagenz R

DSC N,N’-Disuccinimidylcarbonat

DSPC 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospatidylcholin

DSS N,N’-Disuccinimidylsuberat

DTT Dithiothreitol

EDC 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz

EMCS N-(-maleimidocaproyloxy)succinimid

EO Ethylenoxid

EPC Eiphosphatidylcholin

EPR enhanced permeability and retention, gesteigerte Aufnahme und Rückhaltung

VI Abkürzungsverzeichnis

EtOH Ethanol

Fab’ Antigen bindendes Antikörper Fragment

FFE Free-Flow Elektophorese, kontinuierliche Free-Flow Zonenelektophorese ohne stationäre Phase

FDA Food and Drug Administration; Amerikanische Aufsichtsbehörde für Lebens- und Arzneimittel

GET tresyliertes Generol E-25

GL Gesamtlipid 1H NMR hydrogen nuclear magnetic resonance-spectroscopy, Wasserstoff

Kernspinresonanz-Spektroskopie

HSPC hydriertes Sojaphosphatidylcholin

HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure

ITC isothermal titration calorimetry, Isotherme Titrationskalorimetrie

LSC liquid scintillation counting; Flüssigszintillationszählung

LtL Ligand-targetierte-Liposomen

LUV large unilamellar vesicle, großes unilamellares Vesikel

MALDI-MS matrix assisted laser desorption ionisation mass spectroscopy; Matrix assistierte Laserdesorptionsionisation Massenspektroskopie

MAL-PEG-DSPE Polyethylenglykol--distearoylphosphatidyl-

ethanolamin--maleimid

MeOH Methanol

MLV multilamellar vesicle, multilamellares Vesikel

MPEG2000-DSPE 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy-poly(ethylenglycol)-2000]

MPEG2000-DPPE 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy-poly(ethylenglycol)-2000]

MPS mononukläres Phagozytensystem

M-Wasser mit der Millipore® Simplicity185 Wasseraufbereitungsanlage aufbereitetes Wasser

MWCO molecular weight cut-off; Ausschluss - Molekularmasse einer Dialysemembran

NaC Natriumcholat

NaCl Natriumchlorid

NGPE N-Glutarylphosphatidylethanolamin

NHSIA N-Hydroxysuccinimidyliodoacetat

Abkürzungsverzeichnis VII

NHS-PEG-DSPE Polyethylenglykol--distearoylphosphatidyl-

ethanolamin--N-hydroxysuccinimidester

N-MPB-PE 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamin-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramid]

N-PDP-PE 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamin-N-[3-(2-pyridyldithio)propionat]

NR Ninhydrin Reagenz R

OG n-Octyl--D-glucopyranosid

OLV oligolamellar vesicle, oligolamellares Vesikel

OSCl O-Succinylcardiolipin

PCS photon correlation spectroscopy, Photonenkorrelationsspektroskopie

PE Phosphatidylethanolamin

PEG Polyethylenglykol

PEG-PE-Lipide PEG-Phosphatidylethanolamine

Ph.Eur. Pharmacopoea Europaea; Europäisches Arzneibuch

PI Phosphatidylinositol

PI Polydisperitätsindex, Maß für die Breite der Partikelgrößenverteilung auf Basis der PCS (Gerätespezifikationen vgl. 3.4)

PIT Post-Insertion-Technique; Strategie zur nachträglichen Einlagerung von PEG-PE-Derivaten in PL-Bilayer

PL Phospholipid

PMPI p- Maleimidophenylisocyanat

PP Polypropylen

ppm parts per million; Teile pro Millionen

RES retikuloendotheliales System

rpm rotation per minute, Umdrehungen pro Minute

RT Raumtemperatur

SMCC Succinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate

SEC size exclusion chromatography, Größenausschlusschromatographie

SMPB N-Succinimidyl[4-(p-maleimidophenyl)]butyrat

SPDP N-Succinimidyldithiopropionat

STL Standardlaufmittel

Sulfo-NHS N-Hydroxysulfosuccinimid

SUV small unilamellar vesicle, kleines unilamellares Vesikel

VIII Abkürzungsverzeichnis

Tc Phasenübergangstemperatur

TEA Triethylamin

THF Tetrahydrofuran

tSIE transformed Spectral Index of the External standard, transformierter spektraler Index des externen Standards; Packard spezifischer Parameter zur Beschreibung des Quenchverhaltens einer Probe über die eingebaute Bariumquelle des Geräts

z-Av z-Average, durchschnittlicher hydrodynamischer Partikelgrößendurchmesser auf Basis der PCS nach Malvern

Allgemeiner Teil 1

1 Allgemeiner Teil

1.1 Liposomen

1.1.1 Definition, Aufbau und Klassifizierung

Nach heutiger Definition werden unter Liposomen sphärische Vesikel im grob- bis

kolloiddispersen Bereich verstanden, die durch konzentrisch angeordnete hydrophobe

Lipiddoppelschichten (Bilayer), einen wässrigen intravesikulären Raum von einem ebenfalls

wässrigen Außenmedium abtrennen (Abb. 1-1).

Die Entdeckung der Liposomen geht auf Beobachtungen des Verhaltens von Phospholipiden

(PL) in wässrigen Medien durch Bangham und Mitarbeiter in den 60er Jahren zurück

(Bangham 1963; Bangham et al. 1964; Papahadjopoulos & Bangham 1966). Der amphiphile

Charakter der PL führt bei Hydratisierung zur Quellung der im trockenen Zustand in planaren

Doppelschichten vorliegenden Lipide und resultiert in der spontanen Formation von stabilen,

sphärischen Vesikeln. Die Stabilität liegt im Entropiegewinn begründet, der aus der

Selbstorganisation der amphiphilen Phospholipide resultiert.

Theorien zur Vesikelbildung verbinden Einflüsse der freien Wechselwirkungsenergie,

Molekülgeometrie und Entropie (Helfrich 1973; Israelachvili et al. 1977). Letztlich kann die

Bildung von Vesikeln als Minimierung des energetisch ungünstigen Kontaktes der

hydrophoben Fettsäureketten an den Endigungen der zunächst planaren Strukturen mit der

wässrigen Umgebung aufgefasst werden. Dementsprechend schirmen die polaren

Kopfgruppen der Amphiphile einen in sich geschlossen hydrophoben Raum nach innen wie

nach außen vor der Interaktion mit dem hydrophilen Umgebungsmedium ab.

hydrophobe Lipidmembran

hydrophiler intravesikulärer Raum

Abb. 1-1: Schematische Darstellung des Schnitts durch ein Liposom

2 Allgemeiner Teil

N+

O

O

O

O-O

O

PH

OO

Die meisten Amphiphile mit selbstassoziierendem Charakter weisen

Mizellbildungskonzentrationen (CMCs) unterhalb des nanomolaren Bereichs auf, ohne die die

Stabilität bei großer Verdünnung nicht möglich wäre und aus denen die im Vergleich zu

anderen oberflächenaktiven Verbindungen geringe Aggressivität der PL resultiert. Analog zu

natürlichen Membranen bilden PL die Hauptkomponenten in Liposomenmembranen.

Tabelle 1-1: Struktur und Eigenschaften einiger wichtiger synthetischer Phospholipide mit membranbildenden Eigenschaften, R = 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphatidylrest (nach http1)

Gemäß ihrem amphiphilen Charakter lassen sie sich in zwei, in ihrer Polarität

unterschiedliche Strukturen unterteilen: eine polare Kopfgruppe, die durch einen

Phosphorsäurediester zu einem Glycerol und einem weiteren kurzkettigen Molekülteil

ausgebildet wird (einem Ethanolamin, Cholin, einem weiteren Glycerol, Inositol oder einem

Serin), sowie einen lipophilen Teil, bestehend aus zwei Fettsäureresten, die zumeist über

einen Ester mit den verbleibenden zwei Hydroxylgruppen des zentralen Glycerols verknüpft

sind.

hydrophile Kopfgruppe lipophiler Fettsäurerest

Bezeichnung Struktur Fettsäurerest Kürzel Tc (°C) Ladung pH 7,4

2 x C16 (Palmitinsäure) DPPC 41 0

2 x C18 (Stearinsäure) DSPC 55 0

Phosphatidyl-

Cholin

(PC) CH3

CH3

CH3N

+ R

2 x C18:1 (Ölsäure) DOPC -20 0

2 x C14 (Myristinsäure) DMPE 50 0

2 x C18 (Palmitinsäure) DPPE 63 0 Phosphatidyl-

Ethanolamin (PE) H

H

HN

+R

2 x C18:1 (Ölsäure) DOPE -16 0

2 x C14 (Myristinsäure) DMPG 23 -1

2 x C18 (Palmitinsäure) DPPG 41 -1

Phosphatidyl-

Glycerol

(PG) OH

OH

R

2 x C18:1 (Ölsäure) DOPG -18 -1

2 x C14 (Myristinsäure) DMPS 35 -1

2 x C18 (Palmitinäure) DPPS 54 -1

Phosphatidyl-

Serin

(PS)

HNH3+

O

O-

R

2 x C18:1 (Ölsäure) DOPS -11 -1

DSPC

Allgemeiner Teil 3

Tabelle 1-1 führt die Strukturen und Bezeichnungen einiger wichtiger membranbildender

Phospholipide auf (Phosphoinositole (PI) und mono-Phosphorsäurederivate (PA) wurden der

Übersichtlichkeit halber außer Acht gelassen).

Neben den symmetrischen Diacylphospholipiden, die synthetischer Natur sind, spielen

unsymmetrische PL, die in Position sn-1 und sn-2 des Glycerols unterschiedliche

Fettsäurereste tragen, für die Herstellung von Liposomen eine zentrale Rolle.

Die Lecithine natürlichen Ursprungs sind in der Regel unsymmetrisch aufgebaut (d.h. sie

tragen zwei unterschiedliche Fettsäurereste) und zeichnen sich durch einen hohen Anteil an

(mehrfach) ungesättigten Fettsäuren aus. Die Länge der Fettsäuren, die in bis zu vierfach

ungesättigter Form auftreten, liegt zwischen 12 und 24 C-Atomen.

Gängige Quellen zur Gewinnung von Lecithinen sind Sojabohnen und Eigelb, wobei

Phosphatidylcholine die Hauptkomponenten der vorkommenden Lecithine darstellen. Da die

Zusammensetzung dieser PL naturgemäß sehr komplex und chargenabhängig differieren

kann, kommen in der biophysikalischen Grundlagenforschung eher definierte synthetische PL

zum Einsatz, während Liposomen - nicht zuletzt aus Kostengründen - in der Regel aus

natürlichen PL hergestellt werden. Häufig wird die hydrierte Form der nativen PL der

ungesättigten vorgezogen, da die Elimination der Doppelbindungen mit einer erhöhten

Stabilität gegenüber oxidativer Degeneration der Zubereitung und einer geringeren

Permeabilität der Liposomenmembran bei Raumtemperatur (RT) verbunden ist.

Als Funktion der Temperatur, der Kettenlänge der Fettsäuren, dessen Grad der Ungesättigtheit

sowie der hydrophilen Kopfgruppe (siehe Tabelle 1-1) der zu ihrem Aufbau verwendeten PL

können liposomale Membranen in flüssig kristalliner (L) Form oder im Gelzustand (L)

vorliegen (Chapman 1975; Melchior & Steim 1976; Lee 1977).

Mit steigender Temperatur gehen Phospholipidmembranen vom Gelzustand, in dem die PL in

einem quasikristallinen Gitter fixiert sind, in den flüssigkristallinen Zustand über, der dem

einzelnen Lipidmolekül die laterale Diffusion innerhalb des Bilayers (Lee et al. 1995) und

eine Eigenrotation längs und senkrecht zur Membran erlaubt (Knowles & Marsh 1991).

Die Phasenübergangstemperatur Tc charakterisiert die Temperatur, bei der eine Koexistenz

beider polymorphen Phasen gegeben ist. Aufgrund der uneinheitlichen Zusammensetzung von

PC aus Soja oder Eigelb werden für diese natürlichen Phospholipide

Phasenübergangstemperaturen zwischen -15 und - 7 °C abgegeben (New 1989), für ihre

hydrierten Pendants liegen die Werte zwischen 55 und 65 °C.

4 Allgemeiner Teil

Neben der Tc hat auch die Ladung die ein PL in die Liposomenmembran einbringt

maßgeblichen Einfluss auf die Stabilität und die fusogenen Eigenschaften einer

Liposomenpräparation.

Gegenüber einer ungeladenen Membran führt die permanente Ladung durch Einbringen eines

PG oder PS Anteils in den Bilayer zu einer elektrostatischen Abstoßung der Vesikel

untereinander, wodurch das Fusionieren der einzelnen Liposomen erschwert wird.

Eine weitere wichtige Komponente für den Aufbau von Liposomenmembranen ist

Cholesterol, das entscheidenden Einfluss auf deren Eigenschaften hat. Wird Cholesterol in

eine PL-Mischung eingebracht, die in L Modifikation vorliegt, führt die Interaktion der

3-OH Funktion mit dem Phosphorsäurerest der PL zu einer Verfestigung der

Membranstrukturen und damit zu einer reduzierten Permeabilität. Unterhalb der Tc erfährt

eine Phospholipidmembran durch einen Cholesterolanteil eine Verflüssigung und daraus

resultierend eine Erhöhung der Permeabilität (Demel & De Kruyff 1976). Die Funktion von

Cholesterol als “Fluiditätsmodifikator“ basiert auf der parallelen Anordnung des

Sterolgerüstes zu den Fettsäureketten der PL was eingeschränkte Beweglichkeit derselben zur

Folge hat (Jain et al. 1980).

Wird einer Phospholipidmischung Cholesterol im molaren Überschuss zugesetzt, ist dessen

Kristallisation unvermeidbar, so dass in Liposomen in der Regel nicht mehr als 45 mol%

Cholesterol eingearbeitet werden.

Interessanterweise ermöglicht der Einsatz von äquimolaren Mengen an Cholesterol die

Vesikelbildung aus Lysophosphatiden, die sonst durch ihre fusogene Wirkung die Ausbildung

lamellarer Strukturen stören (Kitagawa et al. 1976a; Kitagawa et al. 1976b).

Eine gebräuchliche Klassifizierung der verschiedenen Liposomenspezies (Papahadjopoulos &

New York Academy of Sciences. 1978; New 1989) wird über die Partikelgröße und die

Lamellarität der Vesikel vorgenommen. Dabei werden unterschieden:

▪ Small unilamellar vesicles (SUV) sind kleine unilamellare Vesikel mit einem

Durchmesser von bis zu 50 nm. Die Membran ist aufgrund der geringen Größe der

Liposomen hier stark gekrümmt und somit energetisch ungünstig. Durch eine

gegenüber der inneren Membran erhöhten Anzahl an Lipidmolekülen im äußeren

Layer wird ein Teil der Membranspannung kompensiert, so dass stabile Vesikel

entstehen, die sich jedoch durch eine hohe Fusogenität auszeichnen. Die

Desintegration von MLV (siehe unten) durch Ultrabeschallung (~ 20 kHz)

Allgemeiner Teil 5

repräsentiert die gängigste Art der Gewinnung von SUV. Trotz ihres geringen

Einschlussvolumens von 0,2-1,5 l/mol Lipid und ihrer daher schlechten

Einschlusseffizienz für hydrophile Substanzen, hat man aufgrund ihrer

vergleichsweise langen Bluthalbwertszeit eine Vielzahl bioaktiver Substanzen in SUV

eingeschlossen. Werden SUV unterhalb der Tc gelagert kommt es zur spontanen

Fusion der Vesikel, da der starre Gelzustand die starke Kurvatur der Membranen nicht

zulässt.

▪ Large unilamellar vesicles (LUV) besitzen als große einschichtige Vesikel mit einem

Durchmesser von mehr als 50 nm ebenfalls nur einen Bilayer, der bei diesem

Vesikeltyp nicht mehr sehr stark gekrümmt ist. LUV liegen praktisch spannungsfrei

vor und sind bedeutend lagerstabiler als die SUV. Die Größe erlaubt hier auch die

Einlagerung von RNA oder Enzymen.

▪ Oligolamellar/multilamellar vesicles (OLV/MLV) sind oligo- bzw. multilamellare

Vesikel mit einem Durchmesser zwischen 0,3 µm sowie einigen µm. Sie besitzen

mehrere (OLV) bzw. viele (MLV) Bilayer. Diese Klasse von PL-Vesikeln stellen die

thermodynamische stabilste Form des Systems Phospholipid/Wasser dar und bilden

sich bei deren Hydratisierung oberhalb der Tc spontan. Nachteile der MLV sind ihre

stark schwankende Partikelgröße und großen Durchmesser. Durch kurze Beschallung,

Verwendung geladener Lipide oder die Anwendung der French-Press Methode

(Hamilton et al. 1980) lassen sich OLV mit geringer und definierterer Partikelgröße

gewinnen. Da die Darstellung dieser Vesikel sehr schonend verläuft eignet sich eine

MLV Herstellung zur Verarbeitung von empfindlichen Substanzen wie Enzymen,

Nukleinsäuren und Proteinen, insbesondere Membranproteinen.

6 Allgemeiner Teil

1.1.2 Herstellungsmethoden

In der Literatur sind zahlreiche Methoden zur Herstellung der verschiedenen Vesikelarten

angeführt. Die folgende Tabelle stellt den verschiedenen Liposomenspezies

Herstellungsmethoden gegenüber, die zu ihrer Gewinnung genutzt werden können. Im

Anschluss folgt eine kurze Erläuterung der wichtigsten Verfahrenstechniken zur Herstellung

liposomaler Dispersionen.

Tabelle 1-2: Auswahl der Methoden zur Herstellung von Liposomen

1.1.2.1 Filmmethode

Die Herstellung von Liposomendispersionen nach der Filmmethode beruht auf der

Entdeckung der Selbstassoziation von PL in wässrigen System durch Bangham (Bangham et

al. 1965). In einem Rundkolben werden die Membrankomponenten sowie (wenn erwünscht)

hydrophobe Wirkstoffe in einem organischen Lösungsmittel(gemisch) gelöst und unter

reduziertem Druck bei Temperaturen um 40 °C zur Trockene eingeengt. Zu Entfernung von

Lösungsmittelresten wird im Hochvakuum nachgetrocknet.

Liposomenart Herstellungsmethode Partikelgröße (nm)

MLV Filmmethode (Bangham et al. 1965)

(Hydratisieren eines Lipidfilms)

300-10000

LUV/OLV

Extrusion (Olson et al. 1979; Mayer et al. 1986)

Hochdruckextrusion (Berger et al. 2001)

Freeze-Thaw Methode (Mayer et al. 1985)

30-800

100-1000

SUV/LUV

Detergenzentfernung (Schubert 2003)

- BioBeads (Philippot et al. 1985)

- Gelpermeationsmethode (Brunner et al. 1976)

- Membrandialyse (Milsmann et al. 1978)

- Tangentialfiltration (Peschka et al. 1998)

40-180

SUV

Hochdruckhomogenisation - French Press (Hamilton et al. 1980)

- Gaulin Micron Lab 40 (Brandl et al. 1990)

- Microfluidizer (Mayhew et al. 1984)

Ultrabeschallung (Huang 1969)

Ethanol-/ Etherinjektionsverfahren (Batzri & Korn 1973)

20-40

30-60

25-125

Allgemeiner Teil 7

Der im Kolben zurückbleibende transparente, homogene Lipidfilm wird anschließend in

(wirkstoffhaltigem) Puffer aufgenommen, wobei sich spontan MLV bilden. Dabei muss

oberhalb der Tc gearbeitet werden, um einen homogen zusammengesetzten Bilayer zu

erhalten.

Die durch die Filmmethode hergestellten Rohdispersionen können anschließend in weiteren

Verfahrensschritten (wie Extrusion, Hochdruckhomogenisation, Ultrabeschallung) zu

Vesikeln geringerer Größe, definierterer Membrananzahl und Partikelgrößenverteilung

weiterverarbeitet werden.

Um eine Vorhomogenisierung zu erreichen ist mehrmaliges Einfrieren in flüssigem Stickstoff

und Auftauen der MLV Dispersion sinnvoll. Die Entstehung von Eiskristallen führt zur

Ruptur der Strukturen und anschließender Reorganisation von Vesikeln mit geringerer Anzahl

von Bilayern. Durch die wiederholten Frier-Tau-Zyklen lassen sich außerdem bessere

Einschlusseffizienzen erzielen.

1.1.2.2 Extrusion

Die Extrusion (Olson et al. 1979; Berger et al. 2001) ist eine wiederholte Passage einer durch

die Filmmethode gewonnen MLV Dispersion durch eine Membran mit definierter

Porengröße.

Üblich sind Polycarbonatmembranen mit einem Porendurchmesser von 50-800 nm. Die

Vesikel der Rohdispersion müssen Poren passieren, die einen weit geringeren Querschnitt

aufweisen als sie selbst. Durch “Abscheren“ äußerer Monolayer und Kavitationseffekte

kommt es zur Bildung von kleineren Bilayerstrukturen, die durch Ausbildung neuer Vesikel

in eine energetisch günstigere Form übergehen.

Die wiederholte Extrusion führt zu homogenen Vesikelpopulationen einer geringen

Partikelgrößenverteilung mit einem bis zwei Bilayern (Schubert et al. 1991). Die Größe der

Liposomen befindet sich im Bereich der Porenweite der Membranen. Häufig ist durch die

elastische Verformung der Vesikel bei Passage der Pore ein leicht über dem

Porendurchmesser liegender durchschnittlicher Partikeldurchmesser zu verzeichnen. Die

Extrusion von MLV ist nur möglich wenn sich die Membran der Vesikel im

flüssigkristallinen Zustand befindet. Liegt die Tc der Rohdispersion oberhalb der RT muss die

MLV zur Extrusion erhitzt werden.

8 Allgemeiner Teil

1.1.2.3 Ultrabeschallung

Auch die Ultrabeschallung (Huang 1969) kann von einer durch die Filmmethode gewonnenen

MLV Dispersion ausgehen. Gebräuchlich ist die Verwendung von Ultraschallspitzen oder

Ultraschallbädern zur Gewinnung von SUV Dispersionen. Auch in diesem Fall sollte

oberhalb der Tc gearbeitet werden.

Der Energieeintrag durch Ultrabeschallung führt zur Ruptur der bestehenden Strukturen, die

Revesikulierung der entstandenen Bruchstücke zur Formation kleiner unilamellarer Vesikel.

1.1.2.4 Detergenzentfernung

Eine Methode, die zu sehr einheitlichen und unilamellaren Vesikeln führt, ist die

Detergenzentfernung (Brunner et al. 1976; Milsmann et al. 1978; Philippot et al. 1985;

Peschka et al. 1998; Basu & Basu 2002; Schubert 2003). Auch in diesem Fall eignet sich die

Filmmethode zur Herstellung liposomaler Systeme. Der Film setzt sich jedoch nicht

ausschließlich aus den eigentlichen Membrankomponenten zusammen, sondern enthält einen

molaren Überschuss eines geeigneten Detergenz, das vor der Filmbildung zusammen mit den

anderen Bestandteilen in organische Lösung gebracht wird. Resultiert aus direktem Mischen

des Puffersystems mit dem Lipid und dem Detergenz eine klare assoziationskolloidale Lösung

kann sogar vollständig vom Einsatz organischer Lösungsmittel abgesehen werden.

Entsprechend der erwünschten Größe der Vesikel finden Gallensalze (z.B. Natriumcholat,

NaC) oder n-Alkyl-Saccharide (z. B. n-Octyl--D-glucopyranosid, OG) Anwendung.

Aufgrund der Anwesenheit der oberflächenaktiven Substanzen bei der Hydratisierung des

Lipidfilms ist die Ausbildung von membranösen Strukturen unmöglich. Vielmehr entstehen

zunächst Mischmizellen, die je nach Art des verwendeten Detergenz strukturell

unterschiedlich aufgebaut sein können.

Da monomeres Detergenz im dynamischen Gleichgewicht mit dem in den Mischmizellen

vorliegenden Detergenz steht, wird durch Entfernung des freien Monomers ständig neue

Gleichgewichtseinstellung erzwungen, die mit einer Verarmung der Mischmizellen an

Detergenz einhergeht. Aufgrund der geringen Monomerenlöslichkeit der PL liegen diese

praktisch ausschließlich im mizellaren Verband vor und unterliegen damit keiner

Gleichgewichtseinstellung mit dem Außenmedium. Die Strukturen, die auf dem Weg zum

Vesikel durch kontinuierliche Entfernung des Detergenz aus dem System durchlaufen werden,

sollen im Folgenden - exemplarisch für die Verwendung von Gallensalzen - erläutert werden.

Bei hohem molaren Überschuss an Gallensalzen wird eine Solubilisierung eines PL-Dimers

Allgemeiner Teil 9

mit 16-20 Gallensalzmolekülen angenommen (Schubert 2003), wobei die Fettsäurereste der

PL einander zugewandt sind. Bei geringeren Gallensalzkonzentrationen existieren so

genannte “Wurmmizellen“, zylindrische PL-Detergenz-Formationen, deren Aufbau von einer

Vielzahl von Parametern abhängig ist.

Weitere Entfernung des freien Monomers aus den zueinander im Gleichgewicht befindlichen

Strukturen hat die Bildung von Scheibenmizellen zur Folge (Abb. 1-2). Die hydrophoben

Außenkanten der Mizellen sind von einem sie umfassenden Ring von Gallensalzen vor der

Interaktion mit dem hydrophilen Außenmedium abschirmt. Die sukzessive Entfernung

weiterer freier Monomere ist von einer Vergrößerung der Scheibenmizellen, der Krümmung

derselben und endlich der Vesikulierung begleitet.

Die Vesikel treten zunächst in Koexistenz mit Scheibenmizellen auf (Gallensalz/Lipid

zwischen 1:1 und 1:0,3 mol/mol). Unterhalb dieses Verhältnisses weisen die Liposomen

aufgrund des Restanteils an Detergenz zunächst noch Membranschäden auf und neigen zur

Fusion unter Ausbildung multilamellarer Strukturen. Erst unterhalb eines Detergenzgehaltes

von 10 mol% liegen die Liposomen defektfrei vor.

Koexistenz von Mischmizellen und Vesikeln

zwischen GSbound / Lipid

1/1 und 0.3/1 (mol/mol)

Wurm-Mizellen

Strukturen im Gleichgewicht

Strukturen während dynamischer Entfernung von Detergenz

viel Detergenz

wenigerDetergenz

Stäbchen

Scheiben-Mizellen

Dialyse, Filtration,Verdünnung,Adsorption

Koexistenz von Mischmizellen und Vesikeln

zwischen GSbound / Lipid

1/1 und 0.3/1 (mol/mol)

Wurm-Mizellen

Strukturen im Gleichgewicht

Strukturen während dynamischer Entfernung von Detergenz

viel Detergenz

wenigerDetergenz

Stäbchen

Scheiben-Mizellen

Dialyse, Filtration,Verdünnung,Adsorption

Abb. 1-2: Gallensalz-PL Strukturen bei der Herstellung von Liposomen über

Detergenzdialyse nach Schubert (2003)

10 Allgemeiner Teil

Die Größe der durch die Detergenzentfernung hergestellten Vesikel ist von einer Reihe von

Parametern abhängig. Eine wichtige Rolle spielen die Art des verwendeten

Detergenz(gemisches), die molaren Verhältnisse von Lipid zu Detergenz, Ionenstärke und

pH-Wert des Mediums, Gesamtkonzentration von Lipid und Detergenz sowie die

Geschwindigkeit der Detergenzentfernung.

Die häufig verwendeten Detergenzien NaC und OG werden bei einer 20mM

Lipidkonzentration in der Regel in einem molaren Lipid/Detergenz Verhältnis von 1:2 bzw.

1:5 eingesetzt. Die Größe der Vesikel bei der Dialyse gegen Wasser liegt dann im Bereich

von 40 nm für die mittels NaC und 140 nm für die durch OG hergestellten Vesikel und lässt

sich durch Ionenstärke, Temperatur u.a. beeinflussen (Rhoden & Goldin 1979; Schwendener

et al. 1981; Zumbuehl & Weder 1981; Schurtenberger et al. 1998).

1.1.3 Charakterisierung von Liposomen

Es bieten sich eine Reihe von Parametern an, die zur Charakterisierung von Liposomen

herangezogen werden können. Einige wichtige Größen und Methoden zu deren Bestimmung

sind:

▪ Fluidität Anisotropiemessungen

▪ Lamellarität Cryo-TEM, NMR

▪ Oberflächenladung -Potentialbestimmung

▪ Permeabilität Fluoreszenz-Dequenching

▪ Partikelgröße(nverteilung) Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS)

▪ PL-Konzentration Bartlett-Phosphatassay

Da die Photonenkorrelationsspektroskopie als Routineverfahren im Laboralltag zur Erstellung

dieser Arbeit einen besonderen Stellenwert einnahm, soll das Funktionsprinzip im Folgenden

kurz erläutert werden. Weitere verwendete Verfahren werden im entsprechenden Abschnitt

des Methodenteils näher erläutert.

Die PCS gestattet die quantitative Analyse der Partikelgrößenverteilung kolloiddisperser

Systeme und hat auch für die Charakterisierung liposomaler Zubereitungen breite Anwendung

gefunden (Goll et al. 1982; Beney et al. 1998; Ingebrigtsen & Brandl 2002). Liposomen, wie

auch andere dispergierte Teilchen in deren Größenordnung, unterliegen aufgrund der

Allgemeiner Teil 11

Brown’schen Molekularbewegung der freien Diffusion. Die Geschwindigkeit der Diffusion

korreliert mit dem Diffusionskoeffizienten D, der nach der Stokes-Einstein-Beziehung

r6TkD

Gleichung 1-1

abhängig ist von der Temperatur T, der dynamischen Viskosität des Mediums sowie dem

hydrodynamischen Partikeldurchmesser r. Bei bekannter Temperatur und gegebener

Viskosität des Mediums lässt sich bei Kenntnis des Diffusionskoeffizienten der

hydrodynamische Durchmesser eines Teilchens bestimmen.

Wird eine Probe in einen Lichtstrahl (bei der PCS einen Laserstrahl) gebracht, resultiert

Streulicht, das mit Hilfe eines Photomultipliers in ein messbares elektrisches Signal

umgewandelt werden kann.

Die Fluktuation in der Intensität und die absolute Intensität des vermessenen Streulichtes ist

eine Funktion der Größe der im Laserstrahl befindlichen Teilchen. Da kleine Teilchen

aufgrund ihrer schnelleren Diffusion ihre Lage zueinander rascher verändern als große

Teilchen, resultieren Streulichtmuster, die bei diesen Partikeln in ihrer Intensität schneller

schwanken als bei großen Teilchen. Hingegen ist die Intensität der einzelnen Signale großer

Partikel im Regelfall wesentlich größer als die kleiner Partikel. Im Messwinkel von 90° ist die

Signalintensität aufgrund ihrer Winkelabhängigkeit relativ partikelgrößenunabhängig.

Die vom Photomultiplier amplifizierten Streulichtsignale werden an einen Korrelator

Abb.1-3: Schematischer Aufbau eines PCS Gerätes

Laser

Probe

Photomultiplier Korrelator

Rechner

12 Allgemeiner Teil

weitergegeben, mit dem aus dem vielschichtigen Streulichmuster eine

Autokorrelationsfunktion erstellt werden kann, die die Ermittlung des Diffusionskoeffizienten

D erlaubt. Auf Grundlage der Autokorrelationsfunktion lässt sich so durch mathematische

Algorithmen der mittlere hydrodynamische Durchmesser (z-Average, z-Av) sowie ein Maß für

die Partikelgrößenverteilung (Polydipersitätsindex, PI) berechnen.

1.1.4 Nicht therapeutische Anwendungsgebiete von Liposomen

Das Anwendungsgebiet von Liposomen ist groß. Neben den folgenden Erläuterungen zu der

für diese Arbeit maßgeblichen Verwendung von Liposomen im therapeutischen Bereich sei

erwähnt, dass Liposomen auch in zahlreiche nicht therapeutische (Forschungs)Disziplinen

Einzug gehalten haben (Lasic & Barenholz 1996).

Allgemein bekannt sind ihre topische Applikation im Bereich der Kosmetika, sowie ihre

Verwendung als Membranmodelle (Sessa & Weissmann 1968; Bangham 1972; Masserini et

al. 2002; Stauch et al. 2002).

Untersucht wird u.a. das Assoziations-, Einlagerungs-, Umlagerungs-, Verteilungs- und

Permeationsverhalten von Arzneistoffen (Ahmed et al. 1981; Hellwich & Schubert 1995;

Takegami et al. 2003; Matos et al. 2004), Tensiden (Schubert et al. 1983; Scholmerich et al.

1984; Schubert et al. 1986; Schubert & Schmidt 1988), Proteinen und Peptiden

(Beschiaschvili & Seelig 1992).

1.1.5 Therapeutische Anwendungsgebiete von Liposomen, Liposomen als Drug-Delivery-Systeme

Um sich auf die Verwendung von Liposomen als Arzneistoffträger zu beschränken wird für

einen Überblick über die gesamte Breite medizinisch pharmazeutischer Anwendungen von

Liposomen an dieser Stelle auf das Werk “Medical Applications of Liposomes“ (Lasic 1998)

verwiesen.

Eine große Herausforderung im Bereich der pharmazeutischen Forschung stellt die

Entwicklung zielgerichteter Drug-Delivery-Systeme dar. Dahinter verbirgt sich die Idee,

einen Wirkstoff direkt an das pathologisch veränderte Gewebe zu bringen, um durch

Vermeidung des Kontakts mit gesundem Gewebe die häufigste Ursache für unerwünschte

Wirkungen auszuschalten. Ein ideales Vesikel für den systemischen Arzneistofftransport

erfüllt nach Willis & Forssen (1998) folgende Kriterien:

Es garantiert einen exklusiven Wirkstofftransport zum Wirkort und gewährleistet so minimale

Allgemeiner Teil 13

Nebenwirkungen, ist physiologisch und pharmakologisch indifferent, metabolisierbar und

nach Erfüllung seiner Transportfunktion aus der Zirkulation entfernt.

Die Tatsache, dass die Hauptkomponenten liposomaler Zubereitungen - Phospholipide und

Cholesterol - natürliche Bestandteile der Säugertierzellmembran darstellen, bedingt eine

geringe Toxizität, gute biologische Abbaubarkeit, geringe Immunogenität, Biokompatibilität

und eine physiologische Metabolite. Aufgrund der strukturellen Besonderheiten von

Liposomen sowohl der Einschluss hydrophiler Arzneistoffe im Vesikelinnenraum als auch die

Anreicherung lipophiler Arzneistoffe in den Membranen der Liposomen möglich womit das

Liposom einen universell einsetzbaren Transporter darstellt. Gleichzeitig gewährt die

liposomale Verpackung dem Wirkstoff Separation und damit Stabilisierung vor

enzymatischem Abbau sowie einen gewissen Schutz vor hydrolytischen und oxidativen

Zersetzungsreaktionen. Diese besonderen Eigenschaften führten dazu, dass schon in den 70er

Jahren das therapeutische Potential der Liposomen als Drug-Carrier-System erkannt wurde

(Gregoriadis 1976a; Gregoriadis 1976b).

Das Targeting der Liposomen kann durch zwei verschiedene Mechanismen sichergestellt

werden. Während sich der erste Weg die physiologischen bzw. morphologischen Eigenarten

des Zielgewebes zu Nutze macht und damit passiver Natur ist, wird mit der Kopplung von

Zielvektoren an die Oberfläche von Liposomen eine aktive Ansteuerung eines pathologisch

veränderten Gewebes angestrebt. Die folgenden Abschnitte erläutern das Prinzip dieser

unterschiedlichen Ansätze.

1.1.5.1 Passives liposomales Targeting, der EPR-Effekt

Bei Applikation von Liposomen in die systemische Zirkulation lässt sich innerhalb kürzester

Zeit eine nahezu vollständige Elimination der Vesikel aus der Blutbahn beobachten.

Verantwortlich für die rasche Absenkung des Plasmaspiegels ist die Aufnahme der Vesikel

durch das retikuloendotheliale System (RES), das mononukläre Phagozytensystem in

verschiedenen Geweben wie Milz, Knochenmark und vor allem Leber.(Kaye & Richardson

1979; Richardson et al. 1979).

(häufig synonym verwendet: mononukläres Phagozytensystem, MPS und

retikuloendotheliales System, RES; Definition laut Roche Lexikon Medizin:

“Funktionseinheit aus Zellen, die zu Phagozytose und Speicherung von Stoffen/Partikeln

befähigt sind. Besteht aus Retikulumzellen des retikulären Bindegewebes, aus Blut- u.

Lymphgefäßendothelien und den die Blut- u. Lymphsinus endothelartig auskleidenden Zellen

14 Allgemeiner Teil

(Retikuloendothel), aus Fibrozyten (gewöhnliche Bindegewebszellen) und aus eigenständigen

Histiozyten (wie die Makrophagen aus Monozyten hervorgehend); dient wesentlich der

Beseitigung von Abfall- u. Fremdstoffen einschließlich eingedrungener Mikroorganismen,

wobei Antikörper (Immunglobuline der Klasse G = IgG) und das Komplement C'3 eine

Hilfsfunktion haben (Monozyten u. Makrophagen besitzen für beide Stoffklassen spezifische

Rezeptoren, die Granulozyten nur für C'3, werden aber durch ihre Anwesenheit aktiviert.)“)

Aus heutiger Sicht führt die Anheftung von Plasmaproteinen, so genannter Opsonine, auf der

Oberfläche der Liposomen zu ihrer raschen Phagozytose durch Makrophagen, die ihrerseits

für einen Abtransport der Vesikel in Leber und Milz sorgen (Abb. 1-4 links). Zunächst

bedeutet dies eine empfindliche Einschränkung der Verwendbarkeit von Liposomen, da mit

der Entfernung aus der Blutbahn eine Interaktion mit oder Anreicherung in Geweben

außerhalb des retikuloendothelialen Systems unmöglich erscheint.

Dieses Phänomen lässt sich jedoch auch therapeutisch nutzen, wenn eben diese Organe von

schweren Infektionen betroffen sind (Alving 1983; Gilbreath et al. 1985). Beispiele hierfür

sind die Therapie systemischer Mykosen mit liposomalem Amphothericin B, die

Anreicherung von Anti-Leishmanose-Wirkstoffen in Zellen des MPS (Minodier et al. 2003),

sowie die Aktivierung von Makrophagen zur Behandlung von Immundefizienzen (Gerber et

al. 2001), Immunmodulation (Dasgupta et al. 2000) oder in der Tumortherapie (Whitworth et

al. 1990).

Eine andere Möglichkeit des passiven Targeting ergibt sich durch die morphologischen

Besonderheiten einiger solider Tumoren und wird unter dem Stichwort EPR-Effekt (Park

2002a) (enhanced permeability and retention effect) zusammengefasst. Bedingt durch das

rasche Wachstum und schnelle Neovaskulierung des tumoralen Gewebes sowie das Fehlen

von Muskelgewebe und Basalmembran entstehen lückenhafte vaskuläre Endothelien (Roberts

& Palade 1997; Roberts et al. 1998) (fenestrae mit einem Durchmesser bis zu 400 nm) mit

gesteigerter Permeabilität, in denen sich Liposomen aufgrund ihrer Größe durch Extravasation

anreichern können (Dvorak et al. 1988; Maruyama et al. 1997; Wu et al. 1997; Laverman et

al. 2001b).

Da Tumoren i. d. R. keine Lymphgefäße ausbilden kommt es zusätzlich zur im Vergleich zum

gesunden Gewebe verlängerten Retention der Liposomen im Tumor. Es entsteht ein

intratumorales Drug-Depot das durch enzymatische Degradation und phagozytotischen

Angriff seinen Wirkstoff zur Diffusion in das Gewebe freigibt (Abb. 1-4 rechts). Um dieses

Allgemeiner Teil 15

Phänomen therapeutisch nutzen zu können, ist die Umgehung der Elimination des liposomal

formulierten Arzneistoffs jedoch eine Grundvoraussetzung, da nur auf diese Weise eine

Zirkulationszeit erreicht werden kann, die die Akkumulation im Tumorgewebe erlaubt.

Mechanismen, die eine effektive Verlängerung der Bluthalbwertszeit liposomaler

Zubereitungen erlauben, werden im Kapitel 1.2 ausgeführt.

Die onkologisch bedeutende Gruppe der Anthracycline, die sich durch “Ionen-Fallen-

Systeme“ besonders effizient mit Liposomen assoziieren lassen, befindet sich in drei

verschiedenen liposomalen Formulierungen auf dem Markt. Allen ist die gegenüber dem

freien Wirkstoff entscheidend veränderte Pharmakokinetik und Biodistribution mit

verringertem Verteilungsvolumen sowie ein verbesserter therapeutischer Index (Maß für die

Sicherheit eines Medikaments, das die Spanne zwischen therapeutischer und toxischer Dosis

angibt), auf Grundlage des EPR-Effekts gemeinsam (Theodoulou & Hudis 2004).

▪ Myocet™ ist ein drei Vial System (1. Citronensäure Puffer; 2. EPC/Chol (7/3

mol/mol; ~ 190 nm) Liposomen; 3. lyophilisiertes Doxorubicin) das vor Ort gemischt

wird und Doxorubicin hocheffizient (> 99%) liposomal verkapselt. Es gewährleistet

eine moderat verlängerte Bluthalbwertszeit des Wirkstoffs, verändert seine

Biodistribution und reduziert auf diese Weise die Häufigkeit des Auftretens von

Kardiotoxizität und Neutropenien (Batist et al. 2001; Park 2002a).

Abb. 1-4: Passives Targeting liposomaler Drug-Carrier Systeme

gesundesGewebe

Lymphbahnen

Tumorgewebe

Endothelzelle

Makrophage

OpsoninekonventionellesLiposom

Sterisch stabilisiertesLiposom

Beispiel:Doxil®

gesundesGewebe

Lymphbahnen

TumorgewebegesundesGewebe

Lymphbahnen

gesundesGewebe

Lymphbahnen

Tumorgewebe

Endothelzelle

MakrophageMakrophage

OpsoninekonventionellesLiposom

Sterisch stabilisiertesLiposom

Beispiel:Doxil®

16 Allgemeiner Teil

▪ DaunoXome® (DSPC/Chol, (2/1 mol/mol); ~45 nm) garantiert aufgrund der geringen

Liposomengröße und der hohen Rigidität der Membranen eine verringerte Aufnahme

durch das MPS und hat Wirksamkeit bei HIV-assoziierten Kaposi Sarkomen und

anderen Tumoren bewiesen (Gill et al. 1996).

▪ Doxil®/Caelyx® ist eine liposomale Zubereitung von Doxorubicin

(HSPC/Chol/MPEG2000-DSPE (2/1/0,16 mol/mol/mol); ~100 nm), die die bisher

deutlichste Verlängerung der Bluthalbwertszeit ermöglicht und so im Tumorgewebe

akkumuliert (Gabizon 1992; Symon et al. 1999; Gabizon et al. 2003).

Im Hinblick auf die Kardiotoxizität von Doxorubicin lassen sich durch liposomale

Darreichungsformen besondere Fortschritte erzielen.

Von Herzmuskelzellen ist bekannt, dass sie eine niedrige Katalaseaktivität aufweisen und ein

geringes antioxidatives Potential (Kang et al. 1996) besitzen. Da die pharmakologische

Wirksamkeit der Anthracyklinderivaten u.a. auf oxidativen Prozessen basiert, wird die

besondere Beeinträchtigung des Herzens auf die oxidative Wirkkomponente dieser

Substanzen zurückgeführt. Durch die liposomale Verpackung des Wirkstoffes werden die

Herzmuskelzellen mit einer geringeren Menge an freiem Doxorubicin konfrontiert, das Herz

erfährt in der Folge eine deutlich geringere Belastung durch reaktive Sauerstoffspezies und ist

somit durch eine liposomale Therapie weniger in Mitleidenschaft gezogen als bei

konventionellem Einsatz von Doxorubicin.

Durch die geringere toxische Belastung des Knochenmarks lässt sich die Minimierung des

Neutropenierisikos erreichen. Weiterhin lässt sich die Inzidenz der bei der Applikation des

freien Wirkstoffs auftretenden Toxizitätserscheinungen wie Alopezie, Übelkeit und Erbrechen

verringern. Auf der anderen Seite tritt gehäuft eine bei Applikation von freiem Doxorubicin

selten beobachtete toxische Hauterscheinung an Händen und Füßen auf (hand-foot-syndrom,

PPES palmar-plantares Erythrodysästhesie Syndrom: eine schmerzhafte, schälende

Dermatitis) (Lotem et al. 2000).

Allgemeiner Teil 17

1.1.5.2 Aktives liposomales Targeting

Ein aktives oder direktes Targeting von Liposomen setzt eine Funktionalisierung, d. h. eine

Kopplung eines Vektors an der Oberfläche des Vesikels voraus, der mit hoher Spezifität und

Selektivität mit Strukturen des Zielgewebe interagiert. Für den Erfolg ist außerdem die

Präsenz einer in Art oder zumindest Quantität besonderen Oberflächenstruktur im Zielgewebe

erforderlich, die in ausreichendem Maße und möglichst nur in pathologisch verändertem

Gewebe zu finden sein sollte.

Im Gegensatz zu einfachen Antikörper-Wirkstoffkonjugaten, die lediglich eine geringe

Anzahl von Wirkstoffmolekülen an das Zielgewebe bringen können, bietet die Targetierung

des Mikroreservoirs Liposom neben dem günstigeren Vektor/Drug Verhältnis zusätzlich den

Vorteil der multivalenten Bindung an das Zielkompartiment, die durch die laterale

Beweglichkeit des Zielvektors in der Liposomenmembran unterstützt wird.

Bereits in den 70er Jahren wurde der erste erfolgreiche liposomale Targeting Versuch

publiziert (Gregoriadis & Neerunjun 1975). Heute finden sich in der Literatur zahlreiche

Beispiele für die Kopplung von Liganden an die Oberfläche von Liposomen (Drummond et

al. 2000; Maruyama 2000; Torchilin 2000; Bendas 2001; Maruyama 2002; Park 2002b; Sapra

& Allen 2003), wobei beide Komponenten verschiedenster Natur sein können.

Ein Forschungsschwerpunkt ist die Anwendung von zielgerichteten Liposomen für die

antitumorale Therapie. Außer den wohl am häufigsten zur Kopplung verwendeten Vektoren,

den Antikörpern (Ab) oder Antikörper-Fragmenten, wurden unter anderem

Kohlenhydratstrukturen (z. B. Sialyl-Lewisx-Tetrasaccharid (Murohara et al. 1995; Stahn et

al. 2001), Peptide (z.B. RGD (Oku et al. 1996; Janssen et al. 2003; Schiffelers et al. 2003),

Transferrin (Kakudo et al. 2004), Folat (Sudimack & Lee 2000; Saul et al. 2003) und Lectine

(Abu-Dahab et al. 2001) zum aktiven Targeting genutzt. Dabei konnte in vivo und in vitro

eine deutliche Überlegenheit der zielgerichteten Liposomen gezeigt werden (Lopes de

Menezes et al. 1998; Maruyama 2000).

Die Probleme, die für deren erfolgreichen Einsatz überwunden werden müssen, sind

vielschichtiger Natur.

Wie bereits unter 1.1.5.1 erwähnt, ist die Applikation vesikulärer Systeme durch körpereigene

Abwehrmechanismen (RES, MPS, Opsonisierung) in seiner Effektivität stark eingeschränkt,

wenn keine entsprechenden Gegenmaßnahmen getroffen werden (siehe hierzu 1.2.1). Vektor-

18 Allgemeiner Teil

modifizierte Liposomen sind davon in deutlich stärkerem Ausmaß betroffen als

konventionelle PEGylierte (siehe hierzu 1.2.1) Liposomen, da die Präsentation des Liganden,

besonders im Falle von Antikörpern und Proteinen, mit einer gesteigerten Antigenität des

gesamten Komplexes verbunden ist (Harding et al. 1997; Kamps et al. 2000).

Es wurde gezeigt, dass bei steigender Antikörperdichte auf der Oberfläche der Liposomen die

Zirkulationszeit deutlich sinkt (Allen et al. 1995). Antikörperlasten oberhalb von 70 µg/µmol

Lipid führen zu einem rapiden Abfall der Bluthalbwertszeiten. Als guter Kompromiss

zwischen Targetierungspotential und systemischer Halbwertszeit wird eine Antikörperdichte

von 30-50 µg/µmol Lipid angesehen (Allen et al. 1995).

In diesem Zusammenhang ist auch zu erwähnen, dass gerade die Kopplung von Ab

problematisch ist. Die in den Anfängen der Immunoliposomen zur Anwendung gekommenen

Antikörpergemische und auch die in den 90er Jahren verwendeten monoklonalen Ab

(Gewinnung aus Hybridomzellen: Verschmelzung von Myelom- und Milzzelle einer

immunisierten Maus), durch die zwar aufgrund ihrer Homogenität eine geringere

Antikörperlast eingestellt werden konnte, werden aufgrund ihrer exponierten Fc-Teile von

Makrophagen schnell als körperfremd erkannt.

Es gab daher Versuche, die Aufnahme von Immunoliposomen durch Einsatz von Ab gegen

die Fc-Rezeptoren der Makrophagen zu hemmen (Aragnol & Leserman 1986; Koning et al.

2002; Koning et al. 2003). Die durch Mehrfachapplikation hervorgerufene Sensibilisierung

des Organismus mit einhergehender Bildung von Anti-Maus-Antikörpern stellt ein weiteres

Problem dar.

Durch die Entwicklung von Fab’-Fragmenten, chimären Antikörpern und humanisierten

Antikörpern und deren Einsatz zum liposomalen Targeting (Cao & Suresh 2000; Park et al.

2001; Park et al. 2002; Zhang et al. 2002; Lee et al. 2003; Rait et al. 2003) wurden bereits

gute Erfolge erzielt, so dass die anfänglichen Probleme in der Immunoliposomentherapie

heute lösbar erscheinen. Es konnte gezeigt werden, dass die Bluthalbwertszeit eines

Immunoliposoms bei Verwendung des Fab’-Teils statt des vollständigen Antikörpers (ca. 50

Stück/Liposom) trotz 10fach höherer Beladung des Liposoms (ca. 520 Stück/Liposom) um

das sechsfache verlängert werden kann (Maruyama et al. 1997).

Die Akkumulation des Ligand-modifizierten Liposoms am angesteuerten Wirkort ist zwar

eine Vorraussetzung, jedoch keine Garantie für die Wirksamkeit des Systems, da außerdem

die Verfügbarkeit des Wirkstoffs sichergestellt werden muss. Hierfür stehen im Prinzip

Allgemeiner Teil 19

mehrere Wege zur Verfügung:

Erstens besteht die Möglichkeit der extrazellulären Freisetzung des Wirkstoffs mit Aufnahme

in die Zielzelle, zweitens die Endozytose des Zellmembran-Rezeptor-gebundenen

Immunoliposoms und Freisetzung des Arzneistoffs in der Zelle und drittens die Fusion der

Vesikelmembran mit der Zell- oder der Endosomenmembran.

Die extrazelluläre Freisetzung des Wirkstoffs aus dem Arzneistoffträger kann durch

verschiedene Konzepte forciert werden. Die Konstruktion von pH-sensitiven Liposomen

(Huang et al. 1987; Wang & Huang 1987; Skalko et al. 1998; Skalko-Basnet et al. 2002; Roux

et al. 2004), die bei extrazellulär erniedrigtem pH in Tumoren und Entzündungsgebieten

eingesetzt werden können, thermosensitiven (Kong & Dewhirst 1999; Ishida et al. 2000;

Gaber 2002) oder photosensitiven Liposomenmembranen (Morgan et al. 1992; Bisby et al.

1999; Bisby et al. 2000) stellen einige mögliche Ansatzpunkte dar. Diese Formulierungen

bieten den Vorteil, dass auch nicht direkt angesteuerte Zellen vom Arzneistoff erreicht werden

können. Jedoch ist die Stabilität des Vesikels in der Blutbahn einerseits bei gleichzeitiger

Notwendigkeit der Destabilisierung vor Ort andererseits erforderlich, so dass ein externer

Anstoß zur Wirkstofffreisetzung mit der speziellen Konstruktion des Vesikels gepaart werden

muss. Zuletzt seien die target-sensitiven Liposomen (Pinnaduwage & Huang 1992; Ng et al.

2000) erwähnt, die durch ihre besondere Konstruktion durch Destabilisierung der Membran

am Wirkort ihren Wirkstoff freigeben.

Die Aufnahme von (Zelloberflächen)Rezeptor-Ligand-Komplexen in die Zelle zum Zwecke

der Down-Regulation oder dem Recycling der Rezeptoren ist ein häufig zu findender

Mechanismus. Für eine Reihe von Rezeptoren (epidermal growth factor receptor, Transferrin

Rezeptor, Folat Rezeptor) konnte gezeigt werden, dass Liposomen auf diesem Wege in die

Zelle eingeschleust werden können (Ishii et al. 1989; Sarti et al. 1996; Huwyler et al. 1997;

Park et al. 2001). Vesikel, die über die rezeptorvermittelte Endozytose aufgenommen werden,

durchlaufen auf ihrem Weg der intrazellulären Prozessierung auch das Lysosom. Die

enzymatischen Bedingungen und/oder der pH-Stress in diesem Zellkompartiment können die

Unwirksamkeit des Wirkstoffes zur Folge haben. Um dies zu vermeiden wird eine Fusion des

Liposoms mit der Endosomenmembran angestrebt, die insbesondere im Zusammenhang mit

den obenan erwähnten pH-sensitiven Lipidkompositionen diskutiert wird (Schubert &

Peschka-Suess 2003).

Synthetische (Nir et al. 1999; Nir & Nieva 2000; Kakudo et al. 2004) und virale Peptide ( z.

B. TAT, GALA (Torchilin et al. 2001b; Torchilin 2002; Tseng et al. 2002; Levchenko et al.

20 Allgemeiner Teil

2003; Torchilin & Levchenko 2003)) vermitteln die Fusion von Liposomen- und

Plasmamembranen und können so die cytosolische Wirkstoffbereitstellung sicherstellen. Sie

agieren als plasmamembran-destabilisierende und porenbildende Bestandteile eines

modifizierten Liposoms, das zudem über einen weiteren Liganden eine Zielausrichtung

erfahren kann.

Auch im Hinblick auf die in vivo Stabilität stellen Ab-modifizierte Liposomen einen

Sonderfall dar. Zwar sind konventionelle Vesikel ebenso den Attacken des humoralen

Abwehrsystems, der Interaktion mit Plasmakomponenten (Immunoglobuline,

Gerinnungsfaktoren, C-reaktives Protein) (Schenkman et al. 1981; Jones & Nicholas 1991)

sowie der Extraktion von PL durch Serumlipoproteine ausgesetzt, also Wechselwirkungen,

die zum einem Leckschlagen (leakage) der Membranen führen kann (Scherphof et al. 1978),

doch erhöht die Fähigkeit der Ab Komplementfaktoren zu binden zusätzlich das Risiko einer

komplementinduzierten Lyse des Bilayers (Strejan et al. 1981; Szebeni et al. 1996).

1.2 Modifikation liposomaler Oberflächen

Wie in Kapitel 1.1.5.2 ausgeführt sind die Plasmastabilität von Liposomen sowie die

Umgehung des RES in den meisten Fällen notwendige Bedingungen zum sinnvollen Einsatz

von Liposomen als Drug-Carrier-Systeme. Beiden Anforderungen wird heute durch die

Implementierung hydrophiler Polymere in den Bilayer erfolgreich begegnet. Substanzen, die

zu diesem Zweck zum Einsatz kommen, sind Teil des nächsten Abschnittes.

1.2.1 Hydrophile Polymere zur sterischen Stabilisierung liposomaler Drug-Carrier-Systeme

Die rasche Erkennung und in der Folge die schnelle Entfernung der Liposomen aus dem

Blutkreislauf durch die Zellen des MPS (Ishida et al. 2002a), vornehmlich durch

Gewebsmakrophagen der Leber (Kupfferzellen) und Milz (Scherphof et al. 1985; Derksen et

al. 1988) war wohl die größte Hürde, die es bei der Anwendung von Liposomen als Drug-

Carrier-System zu überwinden galt. Die aus diesen physiologischen (Abwehr)Reaktionen

resultierenden kurzen Bluthalbwertszeiten erlauben kein Erreichen ausreichender

Wirkstoffspiegel am Zielort.

Die ersten Strategien, die Liposomen vor diesem Schicksal zu bewahren, umfassten die

Absättigung der Aufnahmekapazität der Makrophagen mit wirkstofffreien Liposomen vor der

Applikation des eigentlichen Wirkstoffträgers, bzw. die Prädisposition des Organismus mit

Allgemeiner Teil 21

Dextransulfat zum selben Zweck (Patel et al. 1983). Andere Methoden die Bluthalbwertszeit

zu verlängern waren die Inkorporation von Polyvinylpyrrolidonpolyacrylamidlipiden

(Torchilin et al. 1994b), Glucoronsäurelipiden (Namba et al. 1990) in die Bilayer, die

Verwendung von Lipiden mit einer hohen Tc (Forssen et al. 1992) und die Herstellung

kleiner, rigider Cholesterol-reicher Vesikel (Kirby & Gregoriadis 1983). Auch die Versuche

der Oberflächenmodifikation von Liposomen mit Proteinen, Polysacchariden und

Glycolipiden aus Erythrozyten sind in diesem Zusammenhang zu nennen (Voinea &

Simionescu 2002).

1.2.1.1 Modifizierung mit PEG-Phospholipiden

1987 entdeckten Allen und Mitarbeiter, dass der Einbau von Gangliosid GM1 in

Liposomenmembranen einen deutlich zirkulationsverlängernden Effekt aufwies (Allen &

Chonn 1987; Allen et al. 1989). Als Ursache für ihre Beobachtungen sahen sie eine

Verringerung der Opsoninanlagerung durch das große Volumen, die Hydrophilie und

Flexibilität der Zuckerkopfgruppe an. Anfang der 90er Jahre nutzten Blume und Cevc

erstmals Polyethylenglykol (PEG)-Kopfgruppen für den gleichen Effekt und eliminierten

damit die Limitierung, die von der Bioinkompatibilität der Ganglioside ausging

(Halbwertszeitverlängerung nur in der Maus, nicht in Ratte oder Kaninchen, da diese

AnitGM1-Antikörper entwickeln (Liu et al. 1995)). Zudem ließen sich mit den neuen PEG-

Lipiden deutlich längere Halbwertszeiten einstellen (Blume & Cevc 1990). Für die

langzirkulierenden Liposomen wurde der kommerzielle Name “Stealth®-Liposomen“

eingeführt.

Die Länge der PEG-Kette hat einen entscheidenden Einfluss auf die Halbwertszeit in vivo.

Maruyama und Mitarbeiter ermittelten (Maruyama et al. 1991), dass sich für DSPC/Chol

Liposomen, die mit 6 mol% DSPE-PEG modifiziert waren (Molekularmasse der PEG-Kette

zwischen 1 und 12 kDa), maximale Zirkulationszeit einstellen ließ. Heute haben sich PEG-

Lipide mit einer Molekularmasse von 1 - 5 kDa durchgesetzt (Woodle & Lasic 1992; Woodle

et al. 1994), wobei die eingesetzte Menge an PEG-Lipid von der Kettenlänge des PEG-Restes

abhängt und für die am häufigsten verwendeten Derivate mit einer PEG-Kettenlänge von 2

kDa (entsprechend 45 Ethylenoxid (EO)-Einheiten) mit 5 mol% angegeben wird. Am

weitesten verbreitet ist die Verwendung von PEG-Derivaten gesättigter

Phosphatidylethanolamine (PEG-PE) wie MPEG2000-5000-DSPE und MPEG2000-5000-DPPE

(Abb. 1-5).

22 Allgemeiner Teil

Die Derivate besitzen aus einem hydrophilen PEG-Anteil, der für die Entstehung einer

flexiblen, hydrophilen Corona um das Liposom verantwortlich ist. Die Fettsäurereste der

Moleküle verankern diese in der Lipidmembran. Die Methoxygruppe am distalen Ende der

PEG-Kette hat ihren Ursprung in der Synthese der Derivate. Hier werden monofunktionelle

PEG-Derivate eingesetzt, um die Bildung von Lipid-PEG-Lipiden (Dimeren) zu vermeiden.

Mussten in den Anfängen der Liposomen-Pegylierung die PEG-Lipide noch selbst

synthetisiert werden, befinden sich diese Derivate mittlerweile im Handel. Doxil® ist das erste

zugelassene Präparat, indem MPEG2000-DSPE eingesetzt wird.

Obwohl der genaue Mechanismus, der hinter dem Effekt der MPS-Vermeidung steckt nach

wie nicht eindeutig geklärt ist (Price et al. 2001), wird in der Literatur im Allgemeinen davon

ausgegangen, dass die Formation des hoch hydratisierten PEG-Polymerschilds um das

Liposom, welches sowohl elektrostatische als auch hydrophobe Interaktionen sterisch

unterbindet, für eine Vermeidung der Anlagerung von Plasmakomponenten verantwortlich ist

(Lasic et al. 1991; Woodle & Lasic 1992; Torchilin et al. 1994a; Papisov 1998; Ishida et al.

2002a). Daher werden PEG-modifizierte Liposomen auch als sterisch stabilisierte Liposomen

bezeichnet. Auch die Stabilität der Liposomen während der Lagerung wird durch den Einsatz

von PEGylierten Lipiden günstig beeinflusst. Die sterische Abschirmung der liposomalen

Oberfläche trägt entscheidend zur Reduktion von Aggregation und Fusion (Needham et al.

1992) bei und steigert die Stabilität der Vesikel gegenüber chemischem und enzymatischem

Abbau.

Kritisch anzumerken ist, dass in der Literatur seit dem Jahr 2000 das so genannte ABC-

(accelerated blood clearance) Phänomen (teils kontrovers) diskutiert wird (Dams et al. 2000;

Laverman et al. 2001a; Ishida et al. 2002b; Bendas et al. 2003; Ishida et al. 2003a; Ishida et al.

2003b; Ishida et al. 2004). Während die sterische Stabilisierung der Liposomen bei der

O

O

O

CH2O

CH2

O

PO

O-

O

NH

O

OO

CH3

CH3

CH3

12-18

12-18

20-50

Abb. 1-5: Allgemeine Struktur häufig verwendeter PEG-Lipide zum Zweck der sterischen Stabilisierung liposomaler Drug-Carrier-Systeme

Allgemeiner Teil 23

primären Injektion die aus der Literatur bekannte Verlängerung der Bluthalbwertszeit

garantiert, erfolgt bei wiederholter Injektion in Maus, Ratte und Rhesusaffe eine dramatische

Verkürzung der Zirkulationszeit mit einer Anreicherung der Liposomen in der Leber, ohne

dass diese eine pathologische Veränderung zeigt. Der gleiche Effekt zeigt sich auch bei

konventionellen Liposomen und kann durch die Pegylierung der Liposomen nicht

unterbunden, wohl aber abgeschwächt werden. Trotz PEGylierung ist die mehrfache

Applikation von mit sterisch stabilisierten Liposomen also nicht unproblematisch.

1.2.1.2 Modifizierung mit PEG-Sterolen

Neben den in der Anwendung etablierten PEG-PE-Derivaten bieten sich PEG-Sterole zur

sterischen Stabilisierung von Liposomen an. Eine Reihe von Arbeiten beschäftigt sich mit der

Modifikation liposomaler Oberflächen durch Sterol-PEG-Derivate.

Es konnte gezeigt werden, dass die Implementierung von Cholesterol-PEG mit verschiedenen

Kettenlängen eine signifikante, wenn auch weniger ausgeprägte Verlängerung der

Bluthalbwertszeit in vivo sicherstellen kann (Allen et al. 1991; Ishiwata et al. 1995; Yuda et

al. 1996) und zur sterischen Stabilisierung von Liposomen beiträgt (Beugin et al. 1998).

Zudem wurde herausgearbeitet, dass der Einbau von PEG-Chol in liposomale Membranen mit

einer im Vergleich zur Verwendung von PE-PEG Derivaten verringerten Freisetzung von

Calcein (Modellsubstanz für hydrophile Arzneistoffe) verbunden ist (Ishiwata et al. 1995;

Sriwongsitanont & Ueno 2002).

Weiter wurde gezeigt, dass PEG-Chol durch eine Hemmung der Komplement-induzierten

Opsonisierung zur Verlängerung der Bluthalbwertszeit beiträgt (Bradley et al. 1998), die

Aufnahme von Liposomen mittels Clathrin unabhängiger Phagozytose blockiert (Ishiwata et

al. 1997; Ishiwata et al. 1998) und die Anlagerung von Serumproteinen deutlich reduziert

(Carrion et al. 2001). Auch wenn der wichtigste Parameter für die Anwendung von PEG-

Lipiden zur sterischen Stabilisierung, die Verlängerung der Bluthalbwertszeit, klar für die

Verwendung von PEG-PE-Lipiden spricht, bieten sich PEG-Sterole - auch wegen ihrer

leichten und kostengünstigen Herstellung im industriellen Maßstab - zur

Oberflächenmodifikation von Liposomen an.

Die Präparation sterisch stabilisierter Liposomen erfolgt üblicherweise über die Filmmethode

(vgl. 1.1.2.1), indem die PEG-Lipide den übrigen Membrankomponenten vor der Herstellung

der organischen Lösung zugemischt werden. Damit resultieren Liposomen, die sowohl nach

außen wie nach innen PEG-Ketten präsentieren. Dies ist mit einer empfindlichen

24 Allgemeiner Teil

Verminderung des zur Verfügung stehen liposomalen Innenraums verbunden, so dass die

Beladungskapazität der sterisch stabilisierten Liposomen deutlich geringer ist, als die

konventioneller Liposomen (Nicholas et al. 2000). Will man diesen Effekt vermeiden, ist man

entweder auf eine umständliche chemische Derivatisierung vorgefertigter Liposomen mittels

aktivierter Polyethylenglykole angewiesen, oder versucht PEG-Lipide in einem

nachgeschalteten Schritt in die Liposomenmembran einzubauen.

Die Literatur beschreibt, dass dieses aufgrund der langsamen Einlagerungskinetik von PEG-

PE-Lipiden nur unter erhöhten Temperaturen und/oder langen Inkubationszeiten möglich ist

(Uster et al. 1996; Sou et al. 2000).

Im Verlaufe dieser Arbeit wird diskutiert, inwiefern der Einsatz PEGylierter Sterole die

Oberflächenmodifikation vorgefertigter Liposomen erlaubt.

1.2.2 Ligand-modifizierte liposomale Oberflächen

Mit der PEGylierung liposomaler Oberflächen wurde die Nutzung des EPR-Effektes, also das

passive Targeting mit Liposomen ermöglicht. Die aktive Zielausrichtung bedarf einer

weiteren Modifikation der Vesikeloberfläche. Das Anbringen von Liganden, verschiedenster

Natur (siehe 1.1.5.2), denen gemein ist, dass sie spezifisch mit einem Zielgewebe

interagieren, macht die Konstruktion eines intelligenten Drug-Carrier-Systems möglich. In

diesem Abschnitt wird ein Überblick über die Strategien gegeben, die bei der Kopplung von

Vektoren an Liposomen verfolgt werden können.

1.2.2.1 Ligand-modifizierte Liposomen: Arten und Methoden zu ihrer Herstellung

Es können zwei Hauptstrategien zur Kopplung von Liganden an Liposomen unterschieden

werden: Die erste umfasst Methoden, mit welchen der Ligand unmittelbar an der Oberfläche

des Liposoms angebracht wird. Die zweite solche, bei denen der Vektor mit der terminalen

Hydroxylgruppe einer im Bilayer verankerten PEG-Kette verbunden ist. Abb. 1-6 stellt die

unterschiedlichen Typen von Liposomen dar, die auf ihre Eignung zum aktiven Drug-

Targeting untersucht wurden.

Beim so genannten Typ A funktionalisierter Liposomen ist der Vektor direkt an der

Oberfläche eines konventionellen Liposoms gebunden. Besonders bei Antikörpern als

Zielvektoren bedingt die offene Exposition auf der Vesikeloberfläche eine rasche Enfernung

aus der Zirkulation (Fc-Rezeptor vermittelte Phagozytose (Aragnol & Leserman 1986;

Allgemeiner Teil 25

Derksen et al. 1988)). Der Typ B vereint die Vorteile einer PEGylierung liposomaler Vesikel

mit der oberflächengebundenen Funktionalisierung. Problematisch ist hier die sterische

Interferenz der PEG-Ketten und des Vektors, wodurch die Interaktion des Liganden mit der

Oberflächendeterminante des Zielgewebes erschwert wird. Außerdem reduziert die

PEGylierung die Effizienz der Kopplung durch die schlechte Zugänglichkeit der in der

Lipidmatrix befindlichen Kopplungskomponenten.

Typ C steht am Ende der Entwicklung Ligand-modifizierter Liposomen und zeichnet sich

durch die Kopplung des Vektors an den PEG-Terminus aus. Die freie Präsentation und die

flexible PEG-Kette erlauben eine gute Interaktion von Ligand und Zielstruktur bei

gleichzeitiger langer Zirkulationszeit. Im Hinblick auf den Zusammenhang zwischen

Zirkulationszeit und Ligandenlast sei auf 1.1.5.2 und die Literatur (Allen et al. 1995;

Maruyama et al. 1995; Huwyler et al. 1997) verwiesen.

Die Kopplungsmethoden, die seit Beginn der 70er Jahre entwickelt wurden, basieren letztlich

alle auf der hydrophoben Verankerung des Liganden in der Lipidmatrix. Als hydrophober

Membrananker werden hierzu entweder Sterol- (Benzinger et al. 2000; Carrion et al. 2001;

Fleiner et al. 2001), jedoch zumeist PE-Derivate verwendet (Torchilin & Weissig 2003). Je

nach Art der gewünschten Vesikel (Typ A, B, C) sind die hydrophoben Membrananker

entsprechend direkt, oder am Terminus eines Spacers (i.d.R. PEG) zur Kopplung eines

Liganden vorbereitet. Die Konjugation von Liposom und Vektor kann auf drei verschiedene

Arten zustande kommen.

(1) Das aktivierte (PEG)Lipid wird zunächst mizellar angeboten. Es erfolgt die (PEG)Lipid-

Modifizierung des zu koppelnden Liganden und abschließend eine Vesikulierung durch

Abb. 1-6: Schematische Darstellung der verschiedenen Vektor-modifizierten Liposomen

Typ A Typ B Typ C

26 Allgemeiner Teil

Dialyse (Holmberg et al. 1989; Laukkanen et al. 1994). Auf diese Weise entstehen

Liposomen, bei denen der Vektor zu beiden Seiten des Bilayers, zum Vesikelinneren und zum

Umgebungsmedium hin, orientiert ist. Damit ist das Interaktionspotential der auf diese Weise

präparierten Liposomen im Vergleich zu Methoden, die ausschließlich extravesikulär

orientierte Vektoren garantieren, bei gleicher Kopplungseffizienz nur halb so groß. Aus

diesem Grund und aufgrund des erhöhten Arbeitsaufwands im Vergleich zu anderen

Methoden, wird die Dialyse selten zur Herstellung von Vektorliposomen angewandt und ist

ehr als Exot zu betrachten.

(2) Das aktivierte (PEG-)Lipid wird mit den übrigen Membranbestandteilen gemischt und

somit während der Präparation der Vesikel in den Bilayer eingearbeitet. Wird das Liposom

nun mit dem zu koppelnden Liganden konjugiert, kann dieser, ist er nicht membrangängig,

nur auf der Mediumseite der Membran lokalisiert sein. Das Interaktionspotential ist bei

gleicher Anzahl an angebrachten Zielvektoren im Vergleich zur Dialysemethode doppelt so

groß. Die hier geschilderte Methode ist das Standardverfahren zur Kopplung von Liganden

und wurde mit verschiedensten aktivierten (PEG-)Lipiden und Liganden erprobt (Maruyama

2000; Torchilin 2000; Bendas 2001; Maruyama 2002; Sapra & Allen 2003; Torchilin &

Weissig 2003). Probleme können durch Interaktionen des aktivierten (PEG-)Lipids mit

anderen Membrankomponenten oder mit dem Arzneistoff zustande kommen. Da Reaktionen,

die zur Inaktivierung von Wirkstoff oder aktiviertem Lipid führen können vermieden werden

müssen, ist die Methode nicht universell einsetzbar. Werden aktivierte PEG-Lipide

verwendet, sind die PEG-Ketten, durch den geschilderten Herstellungsprozess der

Liposomen, statistisch über inneren und äußeren Monolayer verteilt. Daraus ergibt sich - wie

unter 1.2.1 erwähnt - ein verringertes Aufnahmevermögen für hydrophile Wirkstoffe im

wässrigen Innenraum (Nicholas et al. 2000). Zudem bleiben die nach innen zeigenden

aktivierten (PEG-)Lipide ungenutzt, so dass störende Nebenreaktionen befürchtet werden

müssen. Ist diese die Kopplung des Liganden an der Oberfläche des Liposoms vorgesehen

(Typ B), ist nicht nur mit der sterischen Hinderung von Interaktion des an der Oberfläche

gekoppelten Vektors und der Zielstruktur sondern auch mit erschwerter Konjugation selbst zu

rechnen.

(3) Das aktivierte PEG-Lipid wird in einem vorgeschalteten Schritt mit dem Liganden

umgesetzt. Auch hier wird es in mizellarer Phase angeboten, so dass (nach den heutigen

Vorstellungen in der Literatur) zunächst “Immunomizellen“ entstehen. Das hydrophobisierte

Ligand-PEG-Lipid-Konjugat wird in einem zweiten Schritt mit vorgefertigten Liposomen

Allgemeiner Teil 27

zusammengebracht und lagert sich aus mizellarer Phase über das Monomer in die Membran

ein. In der Literatur ist diese Kopplungstechnik unter dem Namen Post-Insertion-Technique

(PIT) bekannt und wurde 1999 von Allen und Mitarbeitern unter diesem Namen eingeführt

(Uster et al. 1996; Zalipsky et al. 1997; Ishida et al. 1999; Iden & Allen 2001; Allen et al.

2002a; Allen et al. 2002b; Moreira et al. 2002), jedoch vom Prinzip her bereits 1997 von

Zalipsky et al. beschrieben und genutzt.

Ein großer Vorteil dieser Methode liegt in der Vermeidung von Interaktionen zwischen

aktiviertem PEG-Lipid mit anderen Membrankomponenten und/oder Wirkstoff. Zudem

erlaubt dieser Ansatz theoretisch die Modifikation bereits auf dem Markt befindlicher

liposomaler Formulierungen, die so auf einfache und schnelle Weise den experimentellen

oder therapeutischen Vorraussetzungen angepasst werden können. Die Methode erlaubt den

exklusiven Einbau von Liganden in den äußeren Layer, umgeht somit die Probleme der

Minimierung des Einschlusspotentials und nutzt gleichzeitig die eingesetzte Menge des

Liganden optimal (Nicholas et al. 2000).

Die Modifizierung bereits PEGylierter Liposomen hat sich jedoch als schwierig erwiesen und

wird in der Literatur zum Teil widersprüchlich beschrieben. Ist der zu koppelnde Ligand ein

AB und bereits mehr als 3 mol% MPEG2000-DSPE in der Membran implementiert (z.B. bei

Doxil®), sind die Transferraten aus der Immunomizelle selbst bei 37 °C so niedrig, dass die

auf der liposomalen Oberfläche einstellbare Ligandendichte ein effizientes aktives Targeting

kaum mehr erlaubt (Ishida et al. 1999). Zalipsky et al. (1997) hingegen beobachteten, dass

trotz 2-3 mol% PEG-Lipid in der Membran die Einlagerung von 1,2 -1,5 mol% DSPE-PEG-

Ligand nahezu vollständig von statten geht (Zalipsky et al. 1997). Der Ligand war in diesem

Falle allerdings ein Folsäurederivat - also ein vergleichsweise kleines Molekül.

Die PIT ist bislang nur für PE-PEG-Derivate beschrieben und beruht auf der spontanen

Einlagerung PEGylierter PE-Derivate in PL-Bilayer (Uster et al. 1996; Sou et al. 2000). Die

Einlagerungskinetik ist bei RT langsam, so dass die Inkubation der Immunomizellen mit den

Vesikeln i.d.R. bei 60 °C durchgeführt wird, um einen ausreichenden Transfer in praktikabler

Zeit zu gewährleisten. Ist ein thermolabiler Wirkstoff und/oder Ligand vorgesehen, stößt die

Anwendbarkeit der PIT an ihre Grenzen. In Abhängigkeit der Menge und Art des Liganden

kann die PIT auch zu einem massiven Leckschlagen der Membran führen. So wird

beschrieben, dass die Anwendung der PIT zur Kopplung von IgG nur eine vernachlässigbare

Freisetzung von Doxorubicin zur Folge hatte (Ishida et al. 1999) während die Kopplung von

Agonist G je nach Menge des in der Membran eingesetzten MPEG2000-DSPE 60-90% des

28 Allgemeiner Teil

Wirkstoffes freisetzte (Moreira et al. 2002). Die Umsetzung des Vektors mit dem Lipid muss

jedoch nicht zwangsläufig aus wässriger Phase erfolgen. Soll die Targetierung über ein

Peptid, Vitamin oder Saccharid erfolgen, das in organischer Lösung stabil ist, bietet sich eine

Synthese zur Herstellung eines Vektor-Lipid-Konjugats an. Diese Derivate können

aufgereinigt und charakterisiert (HPLC, NMR, MALDI-MS) werden, bevor sie auf eine der

drei oben beschriebenen Methoden in die Liposomenmembran eingebaut werden (Wong et al.

1997; Gabizon et al. 1999).

1.2.2.2 Kopplungsmethoden zur Präparation Ligand-modifizierter Oberflächen

Eine ideale Kopplungstechnik sollte folgenden Anforderungen genügen:

Sie sollte in möglichst wenigen, einfachen Schritten mit geringem präparativen Aufwand eine

ausreichend hohe Ligandendichte auf der Oberfläche des Vesikels gewährleisten, ohne dabei

die Funktionalität des Vektors oder die Integrität des Liposoms negativ zu beeinflussen.

Seit den späten 70er Jahren wurde eine Reihe von Kopplungsmethoden entwickelt, die die

Funktionalisierung liposomaler Oberflächen erlauben. Diese können unterschieden werden in

solche, die die Verknüpfung zwischen Liposom und Ligand über kovalente oder nicht

kovalente Bindung vermitteln. Im Prinzip lassen sich beide Arten der Bindung für die

Herstellung der Ligand-modifizierten Liposomentypen A-C (Abb. 1-6) nutzen.

1.2.2.2.1 Nicht kovalente Methoden

Die nicht kovalenten oder “Sandwich-Methoden“ beruhen entweder auf der Biotin-Avidin

Bindung (Rivnay et al. 1987), oder auf der so genannten Protein A Methode (Urdal &

Hakomori 1980; Leserman et al. 1981).

Die Biotin-Avidin Bindung ist mit einer Dissoziationskonstante von 10-15 M nahezu

irreversibel und findet breite Anwendung in der Immunohistochemie. Je nach Herkunft des

Proteins unterscheidet man zwischen Avidin (gewonnen aus dem Hühnereiweiß, 67 kDa,

Glykoprotein) und Streptavidin (Herkunft Streptomyces Arten, 60 kDa, kein Zuckerrest).

Jedes Avidin Tetramer besitzt vier hochaffine Bindungsstellen für Biotin. Die Kopplung über

die Biotin-Avidin Methode geht von biotinylierten Proteinen oder Peptiden und biotinyliertem

Lipid (Abb. 1-8) aus, wobei das Avidin mit seinen vier Bindungsstellen als Linker zwischen

Ligand und Liposom fungiert (Abb. 1-7(1)) (Vermette et al. 2002; Xiao et al. 2002).

Allgemeiner Teil 29

Alternativ kann das Avidin mittels kovalenter Bindung direkt an das Liposom angebracht

(Abb. 1-7 (2)) werden (Urdal & Hakomori 1980). Die dritte, selten gebrauchte Möglichkeit

sieht die Kopplung eines Avidin-Ligand Konjugats (Schnyder et al. 2004) an ein biotinyliertes

Lipid in der Lipidmatrix vor (Abb. 1-7 (3)).

Da die Biotinylierung von Peptiden und Proteinen durch im Handel befindliche Kits relativ

einfach und kostengünstig geworden ist, ist durch die Herstellung eines Liposoms mit

ankonjugiertem Avidin ein recht universell einsetzbares Werkzeug gewonnen, an das sich

auch verschiedene Proteine gleichzeitig einfach anbringen lassen. Ein weiterer Vorteil ist,

dass die nicht kovalente Bindung die Bioaktivität des Liganden sicherstellt, sofern die

Bindung an das Avidin keine für die Rezeptorwechselwirkung essentielle Domäne des

Liganden sterisch abschirmt.

Die Protein A Methode nutzt die Interaktion von IgG mit einem Staphylokokkenprotein (Abb.

Abb. 1-8: Biotinyliertes DOPE-Derivat zur Biotin-Avidin Kopplung

Biotinyl-PE

O N H

H S

H H

N H

O O

H N O

O - P

O O

H O

O O

Abb. 1-7: “Sandwich-Methoden“ zur Kopplung von Liganden an liposomale Oberflächen

(2)

(1)

(3)

(4)

30 Allgemeiner Teil

1-7 (4)) aus. Protein A ist ein an der Zellwand von Staphylokokken gebundenes Protein, das

bei Kopplung an Liposomen die Möglichkeit eröffnet, IgG über den Fc-Terminus des

Antikörpers an der Oberfläche der Liposomen anzubringen. Auf diese Weise ist mit einer

besseren Interaktion von targetiertem Liposom und Zielgewebe zu rechnen.

Als für beide “Sandwich-Methoden“ kritischer Punkt ist jedoch die Immunogenität der für

Tier und Mensch körperfremden Proteine anzusehen (Li et al. 2002).

1.2.2.2.2 Kovalente Methoden

Die Literatur zur Kopplung von Liganden an liposomale Oberflächen ist aufgrund der

Vielzahl der publizierten chemischen Methoden, der breiten Palette unterschiedlicher Abläufe

und nicht zuletzt aufgrund der uneinheitlichen Nomenklatur für die einzelnen Techniken, sehr

unübersichtlich. In diesem Abschnitt wird versucht, die wichtigsten Methoden, ohne

Anspruch auf Vollständigkeit, zusammenzufassen.

Im Allgemeinen nutzen die etablierten Methoden zur Kopplung eines Liganden direkt an die

liposomale Oberfläche (Typ A, B) oder an das Ende eines PEG-Spacers (Typ C Abb. 1-6)

entweder freie Amine oder Thiole des Liganden um die Bindung zum Liposom herzustellen.

Einen Sonderfall stellt die Hydrazonkopplung über die Kohlenhydratstrukturen am Fc-Teil

eines Antikörpers dar, die an späterer Stelle genauer vorgestellt wird.

Ist in der Struktur eines Liganden keine Thiolfunktion vorhanden, eine aminoaktive Kopplung

jedoch (aufgrund einer aminhaltigen Membrankomponente oder der möglichen Reaktion mit

dem Wirkstoff) nicht möglich, kann mit Hilfe von Thiolierungsreagenzien, Thiol-Disulfid-

Austauschreaktionen sowie Reduktion von vorhandenen Disulfidbrücken dennoch eine

Kopplung über eine Thiolfunktion ermöglicht werden.

1.2.2.2.2.1 Aminoreaktive, direkte Kopplung

Zunächst sollen Kopplungsmethoden für die direkte Bindung an die PL-Vesikel ausgeführt

werden, die Aminofunktionen des Liganden zu dessen Bindung nutzen.

Für diesen Zweck haben sich Carboxyacyl-Derivate (Kung & Redemann 1986) des PE bzw.

des Cardiolipins durchgesetzt (Niedermann et al. 1991) (Abb. 1-9).

Allgemeiner Teil 31

Während die Carboxyacylderivate von Phoshatidylethanolaminen (z.B. N-Glutaryl-Dioleyl-

Phosphatidylethanolamin; NGPE) im Handel sind, müssen Derivate der Cardiolipine selbst

synthetisiert werden. Eine solche Synthese lohnt sich immer dann, wenn eine geringe Anzahl

von Aminofunktionen derivatisiert werden soll, um die biologische Aktivität des Liganden

nicht zu gefährden und dennoch eine stabile Verankerung in der Membran gewährleistet sein

soll (Weissig et al. 1986; Niedermann et al. 1991).

Die zu koppelnden Liganden werden zunächst mit den Carboxyacylderivaten umgesetzt,

wodurch es zu einer Hydrophobisierung der Liganden kommt. Wird diese Reaktion in

Anwesenheit eines Detergenz durchgeführt, entstehen Ligand-modifizierte Mischmizellen, die

anschließend mit einer Mischmizelldispersion der Membranlipide zusammengegeben und der

Detergenzdialyse (1.1.2.4) unterzogen werden können (Gregoriadis 1983). Ein anderes

Protokoll (Bogdanov et al. 1988) sieht die Herstellung NGPE-haltiger Liposomen vor, die

nach dessen Aktivierung mit dem Liganden umgesetzt werden.

Abb. 1-10 stellt die Reaktionsbedingungen und Abläufe schematisch dar. Die

Kopplungsreaktion beruht auf der Aktivierung des Carboxyacyl-Lipids mit einem

wasserlöslichen Carbodiimid (1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid; EDC) in

Gegenwart von N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS), durch dessen Anwesenheit

Nebenreaktionen vermieden (Holmberg et al. 1989) und höhere Kopplungsausbeuten erzielt

werden können. Als Nebenprodukt entsteht ein untoxisches Harnstoffderivat. Dieses sowie

nicht gebundenes Protein kann über eine GPC Säule abgetrennt werden.

Succinyl Cardiolipin (OSCl)

N - Glutaryl - PE (NGPE)

O - -

O O

H O

O O N H

O O - P O

O H O O

O

O

O

O

H

O

O

H

O

O

O O - O P

O - O

O P

O O

O

O O H O

Abb. 1-9: Strukturformeln der zur direkten aminoaktiven Ligandenkopplung eingesetzten Lipide

32 Allgemeiner Teil

NGPE wird normalerweise 10 mol%ig in Bezug auf das Gesamtlipid eingesetzt und führt in

dieser Menge zu ausreichenden Kopplungsausbeuten. Der Vektor ist über eine stabile

Amidbindung direkt am Liposom gebunden.

Eine weitere Methode zur direkten Kopplung über Aminfunktionen ist in Abb. 1-11

dargestellt. Genutzt wird die Bildung von Amidbindungen bei der Inkubation von primären

Aminen mit succinimidylaktivierten Carbonsäuren im wässrigen Medium bei neutralen pH-

Werten.

PE wird zunächst in organischem Lösungsmittel mit dem bifunktionellen DSS

(Disuccinimidylsuberat) - das hier als Beispiel für alle auf dem gleichen Prinzip beruhenden

Crosslinker aufgeführt wird - umgesetzt und das aktivierte Lipid während der Herstellung der

Vesikel in die Liposomenmembranen eingearbeitet, bevor das Protein mit den aktivierten

Liposomen inkubiert wird (Haga et al. 1990; Nakano et al. 1999; Uchida 2003).

O

OHNGPE

O

ONGPE

NH

N R1

R2

N C N N

N

SO

O

O-O

O

OH

O

ONGPE

N

SO

O

O-O

O

O

NHNHR2R1

NH2 Ligand

O

NHNGPE

Ligand

(1) Umsetzen mit EDC

pH 5,5; RT; 5 min

(2) Umsetzen mit Sulfo-NHS

pH 5,5; RT; 5 min

(3) Umsetzen mit Ligand

pH 7,5; 4 °C; über Nacht

EDC

Sulfo-NHS

Harnstoffderivat

R2 R1

Abb. 1-10: Reaktionsabläufe und Bedingungen bei der Kopplung von Liganden mit Carboxyacylderivaten

Allgemeiner Teil 33

Die letzte wichtige Konjugationsmethode beruht auf der Umsetzung von Aldehyden mit

primären Aminen zur Schiffschen Base (Imin).

Die Aldehydfunktion kann entweder durch die milde Oxidation glykolipidhaltiger Liposomen

mit Periodat (Urdal & Hakomori 1980; Heath et al. 1981; Bogdanov et al. 1984) (Abb. 1-12

(1)), die Verwendung von bifunktionellen Aldehyden (i.d.R. Glutaraldehyd) (Nakano et al.

1999; Uchida 2003) (Abb. 1-12 (2)), oder den direkten Einbau von Glutaraldehydlipiden in

die Liposomenmembran (Haga et al. 1990) (Abb. 1-12 (3)), zur Verfügung gestellt werden.

Das praktische Vorgehen sei für das Beispiel der Verwendung von Glykolipiden näher

ausgeführt:

Die bei der Oxidation von vincinalen Hydroxylgruppen mit Periodat (IO4-) (Abb. 1-12 (1))

entstehenden Aldehyde reagieren mit primären Aminen zu einem reaktiven Imin weiter, das

abschließend, zusammen mit überschüssigem Aldehyd, nach erfolgter Kopplung durch

Cyanoborhydrid in unreaktive funktionelle Gruppen (sekundäres Amin, Alkohol) überführt

wird. Die Oxidation der Liposomen erfolgt in schwach basischem pH-Bereich (pH 8,4) bei

RT für 30 min, das überschüssige Periodat wird abgetrennt (Dialyse,

Gelpermeationschromatographie (GPC)), bevor der zu koppelnde Ligand bei 4 °C über Nacht

FS

O

OH FS

O

OO

NH2O

O-P ONO

O

OO

N O (CH2)6

O

OO

O

N O (CH2)6

O

OO

NH

Lipid

O

(CH2)6

O

NH

LipidNH

Ligand

NH2Ligand

Disuccinimidylsuberat

(DSS) TEA

pH 7,4; RT; 6 h

Phosphatidylethanolamin

(PE)

Abb. 1-11: Konjugationsschema unter Verwendung von DSS

34 Allgemeiner Teil

in Gegenwart von Cyanoborhydrid mit den oxidierten Liposomen inkubiert wird. Unter

optimalen Bedingungen (hohe Proteinkonzentration; z.B.: IgG 30-60 mg/ml und 20 mol%

Galactocerebrosid) lassen sich 20% des eingesetzten Proteins an die Oberfläche der

Liposomen binden.

1.2.2.2.2.2 Thiolaktive, direkte Kopplung

Die zwei bedeutendsten thiolaktiven Kopplungen beruhen auf der Reaktion der beiden

käuflichen, reaktiven PL 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphatidylethanolamin-N-[4-(p-

maleimidophenyl)butyramid] (N-MPB-DPPE) und 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-

Phosphatidylethanolamin-N-[3-(2-pyridyldithio)propionat] (N-PDP-DPPE) (Abb. 1-13),

wobei die Fettsäurereste variabel sein können (daher wird im Folgenden auf die nähere

Spezifikation des Fettsäurerestes verzichtet und verallgemeinernd von PE gesprochen). Bei

der Kopplung mittels N-PDP-PE handelt es sich um einen Disulfidbrückenaustausch, bei dem

die instabile aromatische Pyridylthiolgruppe gespalten und durch eine neue Disulfidbrücke

Abb. 1-12: Kopplungen von Liganden über Bildung einer Schiff’schen Base mit anschließender Reduktion des Imins

Glycolipid

OH OH

O

H

O

H

NH2 Ligand

IO4-

N

H

Ligand

NH

H

Ligand

H

NaBH3CN

NH2 LigandNH2Lipid

CHO-(CH2)3-CHO

Lipid-NH-CH2-(CH2)3-CH2-NH-Ligand

NH2 LigandLipid-CHO

Lipid-CH2-NH-Ligand

(2)(1)

(3)

Allgemeiner Teil 35

zum Liganden ausgetauscht wird (Abb. 1-13).Die entstehende Brücke ist also reversibel und

kann in Gegenwart von Thiolen (z.B.: Glutathion, das in vivo ubiquitär in höheren

Konzentrationen vorhanden ist, Cystein, Dithiothreitol) leicht gespalten werden.

Im Gegensatz dazu resultiert aus der Umsetzung von N-MPB-PE mit der durch den Vektor

offerierten SH-Gruppe eine stabile Thioetherstruktur (Abb. 1-13). Bei der Kopplung über

maleimidaktiviertes PE ist der im Vergleich zur SPDP Aktivierung wesentlich kleinere pH-

Toleranzbereich zu beachten.

Außer den angeführten heterobifunktionellen Aktivierungsreagenzien SPDP und SMPB

werden auch Succinimidyl-Maleimidderivate mit alternativen Spacern (z.B. N-(-

maleimidocaproyloxy)succinimid (EMCS) (Nakano et al. 1999; Uchida 2003), oder SMCC

(Succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate) verwendet.

Der Vollständigkeit halber sei die Aktivierung von PE-Lipiden mit N-

Abb. 1-13: Darstellung thiolaktiver Lipide und deren Umsetzungsbedingungen mit Sulfhydrylgruppen tragenden Liganden

O

HN

LipidS

SN

O

O

N

O

HN

Lipid

O

O

N

O

ON

O

OO

OSSN N

O

O

FS

O

OH FS

O

OO

NH2O

O-P O

SH Ligand

O

HN

LipidS

SLigand

O

O

N

O

HN

Lipid

SLigand

N-Succinimidylpyridyldithiopropionat

(SPDP)

N-Succinimidyl (4-(p-maleimidophenyl))

butyrat (SMPB)

TEA, CH3Cl3, N2 TEA, CH3Cl3, N2

Phosphatidylethanolamin

N-PDP-PEN-MPB-PE

12h, RT, pH 6-812h-16h, RT,

pH 6,5 -6,8

36 Allgemeiner Teil

Hydroxysuccinimidyliodacetat (NHSIA) erwähnt, die jedoch, vermutlich aufgrund sterischer

Hinderungen, nur zu schlechten Kopplungsausbeuten führt (Abb. 1-14).

Die thiolaktiven Lipide können als normaler Bestandteil der Liposomenmembran während der

Herstellung der Liposomen eingebaut werden, was eine intra- und extravesikuläre

Lokalisation der reaktiven Funktionen mit den daraus entstehenden Problemen der

Interaktionen mit weiteren Systemkomponenten zur Folge hat. Ebenso ist eine Umsetzung

PE-haltiger Liposomen mit SPDP oder SMPB möglich, indem die Reagenzien in organischer

Lösung (Ethanol, Dimethylformamid, Dioxane; bis zu 5%iger (v/v) Zusatz an organischem

Lösungsmittel möglich, abhängig vom Chol-Anteil der Membran) oder als Feststoff zugesetzt

werden (PE:Reagenz ~ 1:10-20 (Torchilin & Weissig 2003)), so dass ausschließlich die

äußere Membran aktiviert wird. In diesem Fall ist auf eine ausreichende Pufferkapazität zu

achten, um ein Absinken des pH-Werts und die daraus folgende Entstehung der freien Säure

der Derivate durch Hydrolyse zu vermeiden.

Den thiolreaktiven Konjugationsmechanismen, abgesehen von der NHSIA-Methode, ist eine

hohe Kopplungsausbeute gemeinsam. Ein offensichtlicher Nachteil der N-PDP-PE Methode

ist die zu erwartende Spaltung der Disulfidbrücke in vivo. Für den relativ großen Maleimido-

Benzoyl-Rest, der durch die N-MPB-Methode eingebracht wird, wird, insbesondere bei der

Kopplung kleiner Proteine und Peptide, eine immunogene oder auch sterisch hindernde

Eigenschaft diskutiert (Torchilin & Weissig 2003).

O

O

O

N

ON

O

O

O

O

NO

ON

O

O

O

ON

O

OCH2I

NH2Lipid

O

NH

CH2ILipid

SH Ligand

O

NH

LipidS Ligand

SMCC

EMCS

NHSIA

Abb. 1-14: Strukturen alternativer heterobifunktioneller thiolaktiver Kopplungskomponenten sowie Ablauf der Konjugation über NHSIA

Allgemeiner Teil 37

Der entscheidende Nachteil der thiolaktiven Kopplungen ist jedoch die Tatsache, dass das

Vorkommen von freien Thiolen in Proteinen, Peptiden und anderen möglichen Liganden

selten ist, so dass häufig eine Aktivierung des Liganden notwendig wird, um die Konjugation

zu ermöglichen. Diese Aktivierung kann entweder durch direktes Einführen von

Thiolgruppen, das Umsetzen des Liganden mit SMPB oder SPDP, oder - in besonderen Fällen

- durch die Reduktion endogener Disulfidbrücken des Liganden erzielt werden. Abb.1-16 gibt

einen Überblick über die Methoden zur Thiolierung aminhaltiger Vektoren, sowie über die

weitere Prozessierung zur Umsetzung mit den thiolaktiven Lipiden N-PDP-PE und N-MPB-

PE.

Der erste Weg (Abb.1-16 (1)) zur Kopplung des Liganden führt über das bereits vorgestellte

SPDP. Dieses reagiert unter milden Bedingungen (5% EtOH (v/v); RT; pH 7,5; 30 min) zum

Dithiopyridyl-modifizierten Liganden ab. Wird dieses Konjugat im schwach Sauren (pH 5,5;

RT, 30 min) mit Dithiothreitol (DTT, Strukturformel Abb. 1-15) reduziert, wurden

Aminofunktionen des Liganden in Thiolfunktion überführt. Diese kann nun, wie im Schaubild

illustriert, mit in der Liposomenmembran befindlichem N-PDP-PE, oder alternativ N-MPB-

PE (nicht dargestellt), unter Ausbildung einer Disulfidbrücke bzw. eines Thioethers zur

Konjugation des Liganden genutzt werden.

Eine zweite Möglichkeit (Abb.1-16 (2)) einen Vektor zur thiolaktiven Kopplung an ein

Liposom vorzubereiten besteht in dessen Derivatisierung mit SMPB. Parallel zur

Derivatisierung des Liganden wird eine Liposomendispersion mit 1-10 mol% N-PDP-PE

präpariert, die anschließend mit DTT reduziert wird. An der Oberfläche der Liposomen

entstehen freie Thiole, die eine Thioetherbrücke zum aktivierten Protein ausbilden können.

Pepsin-S-S-

-S-S-

IgG

F(ab')2

DTT-SH HS-

2Fab'SHOH

SH OH

Abb. 1-15: Aktivierung endogener Thiole mit Dithiothreitol

38 Allgemeiner Teil

Abb.1-16: R

eaktionsschema zur Thiolierung von Liganden zur K

onjugation mit thiolaktiven L

ipiden.

Ligand

O

Ligand

NH

2

SP

DP

SM

PB

NS

-S-Ligand

OO

Ligand

DTT

Ligand-S-H

NS

-S-Lipid

Lipid-S-S

-Ligand

SLipid

Ligand

OO

Lipid-S-HDTT

NO

OO

SO

SA

TA

NH

SLigand

O

O

NH

2 OHNH

SH

LigandO

N-P

DP

-PE

NS

-S-Lipid

N-P

DP

-PE

OO

Lipid

S

Lipid

OO

NH

O

N-M

PB-PE

SN + H

H Cl -

NH

SH

N +H

H

Ligand

Cl -

Trauts Reagenz

NH

SN

H

LigandS

Lipid

(1)(2)

(4)(3)

Allgemeiner Teil 39

Das Reagenz SATA (Succinimidyl-S-acetyl-thioactat) kann verwendet werden, um die

Anzahl der Reinigungsschritte zu reduzieren (Abtrennung von überschüssigen Reagenz,

Entfernung des DTT, Abtrennen von freiem Ligand), die bei der Aktivierung mittels SPDP

oder SMPB nötig sind. Außerdem wird der aus der Aufarbeitung resultierende analytische

Aufwand sowie Ligandenverlust durch Säulen minimiert. SATA (Abb.1-16 (3)) führt das

Schwefelatom in Form eines Thioester in die Struktur des Liganden ein. Dieser wird durch

Zugabe von Hydroxylamin leicht in ein freies Thiol überführt. Dieses kann wiederum - wie

gezeigt - mit N-MPB-PE oder N-PDP-PE enthaltenden Liposomen zu Liposom-Vektor-

Komplexen weiterverarbeitet werden. Da das Hydroxylamin den letzten Schritt nicht stört,

muss nur ein Reinigungsschritt zur Entfernung des nicht abreagierten SATA’s vorgenommen

werden.

Ein weiteres Reagenz ist Iminothiolan (Trauts Reagenz Abb.1-16 (4)), das ohne den Einsatz

von Hydroxylamin auskommt, da die Umsetzung des Liganden mit dem Reagenz unter

Ringöffnung ein freies Thiol in die Struktur einführt, das wie gewohnt weiter prozessiert

werden kann.

Eine sehr elegante Methode ist die Reduktion endogener Disulfidbrücken (Abb. 1-15). Ein

Antikörper kann nach Pepsin-Verdau und Gewinnung der F(ab’)2 Stücke durch Reduktion mit

DTT in ein Fab’ Fragment gespalten werden, das nun ein freies Thiol bietet.

Bei allen thiolaktiven Kopplungen ist die leichte Oxidierbarkeit des freien Thiols im Auge zu

behalten. In Anwesenheit von Sauerstoff und katalytischen Mengen von Schwermetallen kann

die (mühsam) gewonnene Sulfhydrylgruppe schnell oxidiert werden. Daher sollten alle Puffer

mit Stickstoff gespült, soweit wie es ein vernünftiger Arbeitsaufwand zulässt unter

Stickstoffatmosphäre gearbeitet und auf die Komplexierung von Schwermetallen mit EDTA

geachtet werden.

Die bis hierher aufgeführten Verfahren sind zum großen Teil zu Beginn der Forschung mit

zielgerichteten Liposomen entwickelt worden. Mit der Einführung der Stealth® Liposomen

wurde es nötig, um die Vorzüge beider Techniken, der PEGylierung und Funktionalisierung

von Liposomen, in einer Präparation nutzen zu können, die bei oberflächenfixierten Vektoren

auftretende sterische Hinderung der Interaktion mit der Zieldeterminate dadurch zu umgehen,

dass der Zielvektor am distalen Ende des zur sterischen Stabilisierung verwendeten PEG

angebracht wurde. Da die Chemie der zu koppelnden Liganden, die heute, wie auch in den

Anfängen der Immunoliposomen, größtenteils Proteine und Peptide sind, die Art der

Kopplung bestimmen, sind die chemischen Methoden, mit denen heute Vektoren an terminale

40 Allgemeiner Teil

Hydroxylfunktionen liposomaler Zubereitungen gekoppelt werden, prinzipiell die gleichen,

die auch schon zu ihrer Fixierung an der Vesikeloberfläche genutzt wurden und werden.

1.2.2.2.2.3 Aminoaktive distale Kopplung an PEG-Ketten

Bei der Kopplung von Liganden an die terminale Hydroxylfunktion von PEG-Ketten wird fast

immer von einem Molekül der Grundstruktur

R-PEG45-115-Diacylphosphatidylethanolamin

ausgegangen, in der R eine Funktion darstellt, die zu Kopplung eines Liganden genutzt

werden kann. War die Synthese dieser Lipide zunächst noch aufwendig, ist diese durch die

breite Palette an kommerziellen heterobifunktionellen PEG Derivaten (z.B. Biotin-PEG-

Succinimidylcarbonat, Mal-PEG-Succinimidylcarbonat) sehr einfach geworden.

In der neueren Literatur wird größtenteils eine PEG-Kette aus 45 EO-Einheiten in

Kombination mit DOPE, DPPE oder DSPE eingesetzt, da eine Reihe von aktivierten

Derivaten dieser Strukturen im Handel ist.

Abgesehen vom ersten in Tabelle 1-3 aufgeführten Derivat sind die vorgestellten aktivierten

PEG-Lipide Eigensynthesen. Alle liefern nach Kopplung des Liganden in vivo stabile

Brücken zum Liganden. Die Aktivierung des PEG-Restes mittels Cyanursäure und para-

Nitrophenylcarbonat sind zwei neuere Ansätze für die Kopplung von Liganden an

Liposomen, die nicht auf den zur direkten Kopplung genutzten Strategien beruhen.

Ursprünglich wurden sie zur PEGylierung zum Zwecke der Modifikation

pharmakokinetischer Eigenschaften von Proteinen untersucht.

Das Succinimidylcarbonatderivat befindet sich seit Ende der 90er Jahre im Handel und ist

wohl aufgrund seiner Esterbindung zum PEG-Teil des Moleküls, die eine schnelle Abspaltung

des Liganden in vivo oder Anwesenheit von Serum erwarten lässt, bisher nur selten zum

Einsatz gekommen.

Der Vorteil gegenüber den thiolaktiven Derivaten, die bei der Kopplung an PEG-Termini die

bedeutendste Rolle spielen, liegt darin, dass auf die Aktivierung des Liganden verzichtet

werden kann.

Allgemeiner Teil 41

O

HN

O

FS

O

FSO

O-O

OP

HOO

OR(OCH2CH2)n

N O O

OO

O

PEG-Lipid NH

O

O

PEG-LipidLigand

O O

O

PEG-LipidN+

O-

ONH

O

O

PEG-LipidLigand

O

OHPEG-Lipid N

H

O

Ligand PEG-Lipid

N

N

N

O-PEG-Lipid

Cl

Cl

N

N

N

O

Cl

PEG-LipidNHLigand

Allgemeine Struktur

Struktur Rest R Bindung zum Ligand Kommentar Literatur

Succinimidylcarbonat Urethan (Carbamat)

Derivat des DSPE im Handel, Ester zum PEG, RT, pH 7-8 empfohlen

Shearwater Polymers Inc, Produktkatalog

Nitrophenylcarbonat Urethan (Carbamat)

PE-Derivat in Liposomen einbauen (pH 5); zur Kopplung pH auf 8,5 erhöhen

(Torchilin et al. 2001a; Torchilin et al. 2001b)

Carboxylat Amid

Aktivierung mit EDC, siehe Abb. 1-10

(Blume et al. 1993; Maruyama et al. 1995; Ishida et al. 2001)

Cyanursäurederivat Cyanursäurebrücke

Bindung zu PE-Rest hier auch über Cyanursäure

Einbau des Derivates in die Liposomen, Kopplung bei RT, 16 h, pH 8.8

(Bendas et al. 1999)

Tabelle 1-3: Aminoaktive Lipidderivate zur distalen Kopplung von Liganden an PEG-Liposomen

1.2.2.2.2.4 Thiolaktive, distale Kopplungen

Die Möglichkeiten der Kopplungen über Thiole wurden bereits bei den direkten

Kopplungsmethoden besprochen (Abb. 1-13). Die dort angeführten Bedingungen und

Protokolle gelten genauso für die Kopplung von Liganden an aktivierte PEG-Ketten. In der

Zwischenzeit befindet sich Mal-PEG-DSPE, ein Maleimid aktiviertes DSPE-PEG-Derivat, im

Handel. Die PDP-Aktivierung von PEG-Lipidderivaten muss allerdings nach wie vor in

Eigensynthese geschehen.

Auch bei der distalen Kopplung von Liganden über Thiole bleibt die Aktivierung des Vektors

in den meisten Fällen ein Muss. Die zur Verfügung stehenden Reagenzien, sowie die

verschiedenen Kombinationsmöglichkeiten wurden in Abb.1-16 vorgestellt.

42 Allgemeiner Teil

O

HN

O

FS

O

FSO

O-O

OP

HOO

OR(OCH2CH2)n

N

O

O

SpacerO

NH PEG-Lipid

N

O

O

SLigand

PEG-Lipid

N

SS

PEG-Lipid

LigandS

SPEG-Lipid

Allgemeine Struktur

Struktur Rest R Bindung zum Ligand Kommentar Literatur

Maleimidgruppe Thioether

Das Standardverfahren; Bedingungen:

Abb. 1-13

(Shahinian & Silvius 1995; Kirpotin et al. 1997)

Pyridyldithiogruppe Disulfidbrücke

Erzeugung von HS-PEG-DSPE, Kopplung von Bromacetyl und Maleimid-Liganden

(Allen et al. 1995; Zalipsky et al. 1997; Sapra & Allen 2004)

Tabelle 1-4: Thiolaktive Lipidderivate zur distalen Kopplung von Liganden an PEG-Liposomen

Die letzte Methode, die hier besprochen wird, basiert auf der Oxidation der

Kohlenhydratstrukturen am Fc-Teil von Ab, die 1984 von Chua et al. eingeführt und

weiterentwickelt wurde (Chua et al. 1984; Zalipsky 1993). Die Oxidation von

Zuckerstrukturen mit Periodat, die auch bei dieser Kopplungsmethode Anwendung findet,

wurde bereits vorgestellt (Abb. 1-12). In diesem Fall wird jedoch keine Bindung über ein

Imin mit anschließender Reduktion zur Fixierung des Liganden genutzt. Die Konjugation des

Vektors erfolgt vielmehr durch ein hydrazinhaltiges PEG-PE-Derivat, das mit dem durch die

Periodat entstandene Aldehydfunktion des Antikörpers unter Formation eines Hydrazones

abreagiert.

Ein Vorteil der Methode liegt in der gerichteten Kopplung des Antikörpers. Im Gegensatz zu

allen anderen vorgestellten Methoden (mit Ausnahme der Nutzung endogener Thiole durch

Spaltung von F(ab’)2 Teilen), die den Liganden in rein statistischer Weise gebunden haben,

wird mit der Hydrazonkopplung sichergestellt, dass die zur Interaktion mit der Zielstruktur

notwendige Domäne durch den Kopplungsprozess nicht beeinträchtigt wird.

Allgemeiner Teil 43

NH

NH2 NHO

O

O PEG-LipidAntikörperH

O+

Antikörper NNH

NH

O PEG-LipidO

O

pH 5,5; über Nacht, Kühlschrank

Abb. 1-17: Kopplung von Antikörpern über hydrazidaktivierte PEG-Lipide

Ein weiterer Vorteil ist die schwere Zugänglichkeit des Fc Teils für Makrophagen (Aragnol &

Leserman 1986) und die damit zu erwartende verlängerte Bluthalbwertszeit (1.1.5.2).

Allerdings wird in vivo dieser Effekt teilweise durch den Scavenger Rezeptor der

Makrophagen aufgehoben. Dieser Rezeptor scheint, in Analogie zur Aufnahme von ox-LDL,

für die schnelle Entfernung der mit oxidativ geschädigten Antikörpern modifizierten

Liposomen verantwortlich zu sein (Krieger & Herz 1994).

1.2.3 Zusammenfassung der Kopplungsprinzipien

Zusammengefasst stellt sich die Situation der Kopplung von Liganden an liposomale

Oberflächen wie folgt dar:

▪ Zur Fixierung des Liganden an der Oberfläche werden i.d.R. gesättigte PL-Derivate

verwendet. Cholesterol-PEG Derivate spielen eine untergeordnete Rolle, sind jedoch

in vitro bereits erfolgreich eingesetzt worden (Benzinger et al. 2000).

▪ Der Einbau der Derivate in die Liposomenmembran erfolgt zumeist auf direkte Weise

während der Herstellung der Vesikel.

▪ Am vielversprechendsten stellt sich die Präparation der Typ C Ligand-targetierten-

Liposomen (LtL) dar. Er verbindet, bei richtiger Ligandenlast, die Vorzüge der

Stealth®-Liposomen mit der aktiven Zielausrichtung.

▪ Die Verwendung von aminoaktiven Lipiden spielt eine untergeordnete Rolle obwohl

keine zusätzliche Aktivierung des Liganden nötig ist, da die aminoaktiven Lipide mit

zahlreichen Wirkstoffen (darunter das liposomal am häufigsten verwendete

Aminoglykosidderivat Doxorubicin), Membrankomponenten (PE) und aminhaltigen

Puffern interagieren.

44 Allgemeiner Teil

▪ Die Post-Insertion-Technique (PIT) ist ein hoffnungsvoller Ansatz, der eine optimale

Nutzung des eingesetzten Liganden erlaubt, da dieser exklusiv in den externen Layer

eingebaut wird. Damit ist zusätzlich eine gegenüber der konventionellen direkten

Einbauvariante des aktivierten PEG-Lipids eine optimale Beladungskapazität des

Innenraums sichergestellt.

▪ Die Datenlage, die sich aus der Literatur zur PIT ergibt, spricht für eine Abhängigkeit

der Einlagerungseffizienz von der Struktur (PEG-Lipid-Anteil, rigide oder fluide

Membranen) der zu modifizierenden Liposomen (Zalipsky et al. 1997; Ishida et al.

1999) und eventuell der Größe und Art des einzulagernden Liganden sowie der

Stabilität der Mizellen, die mit den Vesikeln co-inkubiert werden.

▪ Ein zuverlässiger nachträglicher Einbau größerer Liganden (Antikörper, Fab’-Teile,

Proteine), der die spätere Interaktion der Vesikel mit der Zielstruktur garantiert, ist nur

bei erhöhter Temperatur (60 °C) sicher gezeigt (Ishida et al. 1999).

▪ Standardverfahren zur Kopplung bleibt der direkte Einbau der teuren oder in mehreren

Schritten zu synthetisierenden, thiolaktiven PEG-Lipide mit der daraus resultierenden

notwendigen Aktivierung des Liganden und dem insgesamt langwierigen

Herstellungsprozess von LtL.

Allgemeiner Teil 45

1.3 Isotherme Titrationskalorimetrie zur Untersuchung der

Interaktionen von Detergenzien mit Phospholipidvesikeln

Sowohl chemische als auch physikalische Vorgänge (z.B. nicht kovalente Bindungsvorgänge)

können von der Auf- oder Abgabe von Wärme begleitet sein. Die isotherme

Titrationskalorimetrie (ITC) misst die Wärmen, die bei der Mischung zweier Lösungen

unterschiedlicher Zusammensetzung durch physikalische oder chemische Vorgänge

entstehen.

1.3.1 Geräteaufbau und Messprinzip

Abb. 1-18 zeigt die schematische Darstellung eines Titrationskalorimeters. Es besteht im

wesentlichen aus zwei Zellen, einer Probenzelle und einer Referenzzelle (Volumen ca. 1 ml),

die die gleiche Lösung enthalten und sich in einem beheizbaren Mantel befinden.

In die Messzelle wird eine computergesteuerte Spritze eingeführt, deren Spritzenkopf zu

einem Spiralrührer abgeflacht ist, der während Basislinieneinstellung und während der

Messung mit definierter Drehzahl rotiert (300-400 rpm). Das Untersuchungsmaterial wird in

kleinen Aliquots (i.d.R. 5-20 µl) injiziert und die entstandene oder konsumierte Wärme in

Abhängigkeit der Zeit aufgezeichnet.

Das Gerät ist als adiabatisches System konzipiert, das im Leistungskompensationsmodus

arbeitet. D. h., dass die durch die Injektion des Reaktanden hervorgerufenen Wärmeeffekte

Spritze

Referenzzelle Probenzelle

adiabatisches

Schild

Rührer

Heizungen

Abb. 1-18: Schematische Darstellung eines Titrationskalorimeters

46 Allgemeiner Teil

aktiv durch das Rückkopplungssystem des Kalorimeters ausgeglichen werden, um Proben-

und Referenzzelle auf einer konstanten, sehr geringen Temperaturdifferenz zu halten.

Realisiert wird dies durch eine sehr präzise Messung der Temperaturdifferenz zwischen den

beiden Zellen. Die Referenzzelle wird kontinuierlich mit sehr geringer Leistung

(20 µW) beheizt. Da der dadurch bedingte Temperaturanstieg der Referenzzelle mit

30-60 mK/h sehr gering ist, kann innerhalb von einem Injektions- und Reaktionszyklus von

“isothermen“ Bedingungen ausgegangen werden.

Die Reaktionszelle ist ebenfalls mit einer Heizung versehen, deren Heizleistung über einen

Rückkopplungsmechanismus kontrolliert wird. Dieser stellt sicher, dass Proben- und

Referenzelle auf der konstanten Temperaturdifferenz gehalten werden. Aufgrund der sehr

genauen Anpassung der Zellgrößen und des gleichen Inhaltes der beiden Zellen ist die

Heizleistung der Probenheizung solange nahezu gleich der der Referenzheizung, wie kein

Reaktand in die Messzelle eingebracht wird. Bei Injektion der Probe und dadurch bedingter

Wärmeentstehung oder Konsumierung ist eine Regulation der Heizleistung an der Probenzelle

nötig, um die ursprünglichen Temperaturverhältnisse wiederherzustellen. Die angezeigten

Signale einer Messreihe sind eine Serie von Pulsen, die die Heizrate an der Probenzelle als

eine Funktion der Zeit darstellen (vgl. Abb. 1-19). Dabei werden endotherme Vorgänge mit

positivem (Hochfahren der Heizleistung), exotherme Vorgänge mit negativem Vorzeichen

(Herunterfahren der Heizleistung) versehen. Die Integration dieser Signale liefert die Wärme

der Reaktion.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

µcal

/sec

Zeit [min]

0 20 40 60 80 100 120 140

-0,7

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

Zeit [min]

(A) (B)

Abb. 1-19: Rohdaten zweier ITC-Messungen, A endotherme Vorgänge, B exotherme Vorgänge

Allgemeiner Teil 47

Das dritte Heizsystem, das im Gerätemantel integriert ist, wird durch einen weiteren

Kompensationsmechanismus reguliert. Dieser sorgt dafür, dass die Temperatur des Mantels

exakt auf der der Referenzzelle gehalten wird. Dieses adiabatische Schild garantiert, dass kein

Wärmeaustausch mit der Umgebung stattfinden kann.

1.3.2 Untersuchungsgegenstände der isothermen Titrationskalorimetrie in Membran-Detergenz-Systemen

Die ITC hat sich zur Untersuchung von Detergenz-Membran-Interaktionen als nützlich

erwiesen. Eine Reihe von Enthalpien sind direkt zugänglich und können über spezielle

experimentelle Setups ermittelt werden (Heerklotz & Seelig 2000).

Im Allgemeinen werden drei Arten von Experimenten unterschieden:

▪ Bei Experimenten zur Bestimmung der CMC (Demizellisierungsexperiment)

(Olofsson 1985) kann gleichzeitig die molare Enthalpie (△H) des Transfers des

Detergenz-Monomers (D) aus der Mizelle (mi) in Wasser (w) ermittelt werden.

bimiDΔH

Experimentell wird die CMC als reverser Prozess der Mizellisierung durch Injektion

einer mizellaren Lösung des Detergenz in Puffer bestimmt.

Mizelle Monomer

Verteilungs-experiment

Solubilisierungs-experiment

Bilayer

bimiDΔH biw

DΔH

Demizellisierungs-experiment

wmiDΔH

Abb. 1-20: Schema zu den mittels ITC zugänglichen Verteilungsenthalpien

48 Allgemeiner Teil

▪ Die Untersuchung des Verteilungsgleichgewichts zwischen monomerem und

membrangebundenem Detergenz (Verteilungsexperiment) (Heerklotz & Seelig 2000)

liefert die molare Enthalpie des Transfers des freien Monomers aus Wasser (w) in den

Bilayer (bi)

biwDΔH

und den Verteilungskoeffizienten K nach Schurtenberger (Schurtenberger et al. 1985).

Bei diesen Experimenten wird eine submizellar konzentrierte Lösung des Detergenz in

Puffer mit Vesikeln titriert.

▪ Ein Membransolubilisierungsexperiment bei hohen Detergenzkonzentrationen

(Solubilisierungsexperiment) (Keller et al. 1997) basiert auf der Injektion von

Detergenz oberhalb der CMC in eine Vesikelsuspension. Auf diese Weise lassen sich

Phasendiagramme und Phasengrenzen von Lipid-Detergenz-Systemen sowie die

Wärme des Detergenztransfers

bimiDΔH

aus der Mizelle (mi) in den Bilayer (bi) ermitteln.

Ein weiteres Experiment stellt die Umkehrung des Verteilungsexperimentes

(Releaseexperiment) dar, bei dem mit Detergenzanteil hergestellte Vesikel in Puffer injiziert

werden. Auch die Umkehrung der Membransolubilisierung (Formation von gemischten

Bilayern durch Titration von Mizellen mit Vesikeln) wurde experimentell mit der ITC

verfolgt (Heerklotz et al. 1998).

In dieser Arbeit wurde die ITC verwendet um die Einlagerung vom PEG-Lipiden in

Liposomen thermodynamisch zu untersuchen. Dabei wurden alle drei oben aufgeführten

Experimente durchgeführt (vgl. 4.5.3 und 5.3.3).

Zielsetzung 49

2 Aufgabenstellung und Zielsetzung

Die Entwicklung intelligenter Arnzeistoffträgersysteme, die in der Lage sind Wirkstoffe

gezielt an den Wirkort zu transportieren, ist ein Ausgangspunkt auf dem Weg zu effizienteren

und verträglicheren Therapieformen. Eine Möglichkeit, diesem Ziel näher zu kommen, stellt

die Oberflächenmodifikation liposomaler Zubereitungen mit spezifisch auf eine

Zieldeterminante ausgerichteten Vektoren dar.

Die Substanzen, die derzeit für die Kopplung von Liganden an liposomale Oberflächen zur

Verfügung stehen, bedingen aufwendige und nicht universell einsetzbare

Kopplungsprozeduren. Im Rahmen dieser Arbeit sollte herausgearbeitet werden, ob

ethoxylierte Sterole eine Alternative zu den konventionellen Membranankern sind, die heute

zur Funktionalisierung liposomaler Zubereitungen genutzt werden.

Gegenstände der Arbeit waren daher:

▪ Die Untersuchung der Einlagerung der PEG-Sterole in Phospholipid-

vesikel in Abhängigkeit der Membranzusammensetzung bei Raumtemperatur.

Schwerpunkte sollten auf die Ermittlung der Insertionsrate und -geschwindigkeit

sowie auf die Prüfung auf Entstehung von Membrandefekten gelegt werden.

▪ Die Entwicklung und Charakterisierung von chemisch aktivierten PEGylierten

Sterolen. Hier galt es, die Synthese von tresylierten und N-Hydroxysuccinimid

aktivierten Sojasterolen zu entwickeln, zu optimieren und das Kopplungspotential der

Substanzen zu untersuchen.

▪ Die Herausarbeitung und Optimierung eines Protokolls zur Funktionalisierung

liposomaler Oberflächen. Anhand des Modellproteins Rinderserumalbumin (BSA)

sollte eine Methode erarbeitet werden, die eine möglichst einfache, effiziente und

schonende Funktionalisierung von Liposomen verschiedenster Zusammensetzung

erlaubt. Der Einfluss des pH-Wertes, der Proteinkonzentration, der Menge des

eingesetzten aktivierten Lipids, der Lipidzusammensetzung der Membran und der

Reaktionszeit der Kopplungsreaktion sollte im Hinblick auf Kopplungseffizienz,

Größenentwicklung und Membranintegrität näher betrachtet werden.

50 Material und Geräte

3 Material und Geräte

3.1 Lipide und Membrankomponenten

Tabelle 3-1: Lipide und weitere Membrankomponenten

Bezeichnung Qualität Mr

[g/mol]

Abkürzung Bezugsquelle

Cholesterol Ph.Eur. 386,7 Chol Caelo, Hilden

1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy-poly(ethylenglycol)-2000]

Potency HPLC

104 %

2805 MPEG2000-DSPE Genzyme Pharmaceuticals, Liestal, CH

Polyethylenglykol--distearolylphosphatidyl-ethanolamin N-hydroxy-succinimidester

0,8 % NHS (m/m) Anteil

3440 DSPE-PEG-NHS Shearwater Polymers Inc., Birmingham, USA

Ei-Phosphatidylcholin > 98 % 780 EPC Lipoid GmbH, Ludwigshafen

ethoxylierte Sojasterole (BPS-30)

GPC gereinigt 1735 BPS

(Handelsname) Nikko Chemicals, Tokio, Japan

ethoxylierte Sojasterole (BPS-20)

GPC gereinigt 1295 BPS

(Handelsname) Nikko Chemicals, Tokio, Japan

hydriertes Soja-Phospatidylcholin

> 98 % 790 HSPC Lipoid GmbH, Ludwigshafen

3.2 Chemikalien

Tabelle 3-2: Chemikalien zur Synthese

Bezeichnung Qualität Mr

[g/mol]

Abkürzung/

Summenformel

Bezugsquelle

ethoxylierte Sojasterole (BPS-30)

GPC gereinigt

1735 BPS Nikko Chemicals, Tokio, Japan

ethoxylierte Sojasterole (Generol E 25)

1515 Generol Cognis, Düsseldorf

p-Maleimidophenyl-isocyanat

> 98% 214,18 PMPI Pierce, Rockford, USA

N,N’-Disuccinimidylcarbonat

> 97% 256,17 DSC Fluka, Buchs, CH

Material und Geräte 51

Bezeichnung Qualität Mr

[g/mol]

Abkürzung/

Summenformel

Bezugsquelle

Polyethylenglykol--distearoylphosphatidyl-ethanolamin N-hydroxy-succinimidester

0,8 % NHS (m/m) Anteil

3440 DSPE-PEG-NHS Shearwater Polymers Inc., Birmingham, USA

Triethylamin HPLC 101,19 TEA Fluka, Buchs, CH

Trifluoressigsäure p. A. TFA Merck, Darmstadt

2,2,2-Trifluorethansulfonsäure-chlorid (Tresylchlorid)

> 97% 182,55 Tresylat Fluka, Buchs, CH

Tabelle 3-3: Verbrauchschemikalien

Bezeichnung Reinheit Mr

[g/mol]

Abkürzung/

Summenformel

Bezugsquelle

Ammoniumheptamolybdat Tetrahydrat

p.a. 1235,9 (NH4)6Mo7O24 x 4 H2O

Merck, Darmstadt

Borsäure > 99,5 % 61,83 H3BO3 Sigma, St. Louis, USA

bovines Serum Albumin

Fraktion V

für die Biochemie

67 kDa BSA Merck, Darmstadt

Calcein p.a. 622,55 C30H26N2O13 Sigma, St. Louis, USA

1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien

> 98 % 232,32 C18H16 Fluka, Buchs, CH

2,2-Dihydroxyhydrinen-1,3-dion (Ninhydrin)

Ph. Eur. 178,15 C9H6O4 Merck, Darmstadt

Dinatriumhydrogen-

phosphat Dihydrat

> 99,5 % 177,96 Na2HPO4 x 2H2O Fluka, Buchs, CH

Ethylendiamintetraessig-säure Dihydrat, Dinatrium Salz

Ph. Eur. 372,2 C10H14N2Na2O8 ·

x 2 H2O

EDTA

Merck, Darmstadt

Fiske-Subbarow-Reducer Fluka, Buchs, CH

2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure

> 99,5 % 238,31 C8H18N2O4S

HEPES

C. Roth, Karlsruhe

52 Material und Geräte

Bezeichnung Reinheit Mr

[g/mol]

Abkürzung/

Summenformel Bezugsquelle

L-Hisitidin-HCl Monohydrat

Ph.Eur. 209,63 C6H10ClN3O2· H2O

Histidin-HCl

Merck, Darmstadt

Kaliumdihydrogen-phosphat

> 99 % 136,09 KH2PO4 Fluka, Buchs, CH

Kaliumjodid p.a. 166,01 KJ Merck, Darmstadt

Natriumhydroxid Rotuli p.a. 40,00 NaOH Merck, Darmstadt

Natrium-125Iodid 149,89 Na125I Hartmann Analytik, Braunschweig

Triton® X-100 für Molekular-biologie

576,6 C30H32N4O8 Sigma, St. Louis, USA

Wasserstoffperoxidlösung 30% (m/m)

ACS Qualität

H2O2 Sigma, St. Louis, USA

Tabelle 3-4: Lösungsmittel

Bezeichnung Qualität Bezugsquelle

Chloroform Ph. Eur. C. Roth, Karlsruhe

Dichlormethan p. A.., wasserfrei Fluka, Buchs, Schweiz

Diethylether HPLC, Rotisolv C. Roth, Karlsruhe

Ethanol HPLC, Rotisolv C. Roth, Karlsruhe

Methanol HPLC, Rotisolv C. Roth, Karlsruhe

Tetrahydrofuran p. A, wasserfrei Fluka, Buchs, Schweiz

Wasser (M-Wasser) Elix-Sytem Millipore Simplicity 185 Milli Anlage

Tabelle 3-5: Puffer und wässrige Lösungen

Bezeichnung Abkürzung Bestandteile Zusammensetzung

pH-Wert

Borat Puffer 100 mM BBS 100 Borsäure

NaOH (1N)

6,18 g/l

ad pH 8,4

Borat Puffer 650 mM BBS 650 Borsäure

NaOH Rotuli

40,2 g/l

ad pH 8,0 -9,0

Material und Geräte 53

Bezeichnung Abkürzung Bestandteile Zusammensetzung

pH-Wert

Calcein Lösung 50 mM Calcein

NaOH (1N)

HBS E

311 mg

bis gelöst

ad 10 ml

Puffer für die Free-Flow Elektrophorese

Trennpuffer

Stabilisierungspuffer

Elektrodenpuffer

Na2HPO4 x 2 H2O

KH2PO4

NaOH (1N)

Na2HPO4 x 2 H2O

KH2PO4

NaOH (1N)

Na2HPO4 x 2 H2O

KH2PO4

NaOH (1N)

0,54 g/l

0,27 g/l

ad pH 7,0

5,34 g/l

2,72 g/l

ad pH 7,0

13,5 g/l

6,8 g/l

ad pH 7,0

HEPES Puffer 20 mM HBS HEPES

NaCl

NaOH (1N)

4,76 g/l (20 mM)

7,6 g/l (130 mM)

ad pH 7,4

HEPES Puffer EDTA-haltig HBS E HBS

EDTA

NaOH (1N)

1 l

1,86 g/l

ad pH 7,4

Sörensen Phosphatpuffer

pH 7,4

PBS Kaliumdihydrogen

-phosphat

Dinatriumhydrogen-phosphat Dihydrat

dem. Wasser

KH2PO4 9,08 g/l

(Lösung A)

Na2HPO4 x 2H2O 11,88 g/l

(Lösung B)

808 ml Lösung B

ad 1 l Lösung A

Triton X-100 Lösung Triton X-100 Triton X-100

M-Wasser

10 g

ad 100 ml

54 Material und Geräte

Tabelle 3-6: Organische Lösungen und Detektionsmittel

Bezeichnung Abkürzung Bestandteile Zusammensetzung

Dragendorff Reagenz R DR Basisches Bismutnitrat

Eisessig

KJ-Lösung

dem. Wasser

0,85 g

10 ml

20 ml (400 g/l)

40 ml

Ninhydrin Reagenz R1 NR Eisessig

Ethanol

Ninhydrin

10 ml

50 ml

1g

Schwefelsäure, verdünnte R Schwefelsäure 98%

dem. Wasser

5,5 ml

ad 100 ml

Standardlaufmittel STL Chloroform

Methanol

85 Teile (Volumen)

15 Teile (Volumen)

3.3 Verbrauchsmaterialien

Tabelle 3-7: Verbrauchsmaterialien

Bezeichnung Bezugsquelle

DC-Platten, Kieselgel 60 F254 Merck, Darmstadt

Dialysemembranen, 10 kDa MWCO, high permeability

Diachema, München

Falcon-Röhrchen,

PP-Röhrchen, steril, 15 ml , 50 ml

Greiner-Bio One GmbH,

Frickenhausen

Filter, Minisart 0,22 µm

Celluloseacetatfilter 0,22µm

Sartorius, Göttingen

Iodo-Beads Pierce Rockford, USA

Kieselgel 60 (0,04-0,063 mm) Merck, Darmstadt

LSC Cocktail High Ionic Fluor Packard Bioscience, Groningen, NL

Polycarbonatmembranen, 200 nm, 80 nm Nuclepore GmbH, Tuttlingen

Quantifoil® Carbon Grids Structure Probe, Inc. / SPI Supplies, West Chester, USA

Sephadex G-25 Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden

Material und Geräte 55

Bezeichnung Bezugsquelle

Sepharose CL-4B Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden

Szintillationsmessröhrchen, Mini Vial B C. Roth, Karlsruhe

3.4 Geräte

Tabelle 3-8: Geräte

Bezeichnung Typ Hersteller

Analysenwaage Sartorius Research R180 D-*D1

ACS 211 S

Sartorius AG, Göttingen

Cryotransfer-Einheit Oxford Oxford, GB

Evaporationszentrifuge Concentrator 5301, Eppendorf Eppendorf Netheler Hinz GmbH, Hamburg

Fraktionssammler Retriever 500 (Synthesen)

Frac-100, 200 Fraction Collector

ISCO, Lincoln, USA

Pharmacia Biotech, Uppsala, SUI

Flüssigszintillationszähler Tri-Carb Liquid Scintillation Analyzer 1900 TR

Packard Instrument Company, Meriden, USA

Entgasungsapparatur ThermoVac MicroCal™ Incorporated, Northampton, USA

Gelchromatographiesäulen diverse Gelbettvolumina Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Gefriertrockner Lyovac GT 2

sowie

alpha 2-4 Christ

Finn-Aqua, Santasalo-Sohlberg

GmbH, Hürth

Martin Christ GmbH, Osterode

GPC-Pumpe Persitaltik Pump P1 Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden

Handextruder LiposoFast Avestin Inc. Ottawa, CAN

Heizblock Liebisch SON/D A Gebr. Liebisch, Bielefeld

Laborschüttler Vibramax 100, Heidolph Instruments, Schwabach

Lumineszenzphotometer LS 50B Perkin Elmer, Überlingen

NMR-Spektrometer Varian U-300 Varian, Palo Alto, USA

56 Material und Geräte

Bezeichnung Typ Hersteller

pH-Meter pH Delta 320 Mettler-Toledo, Steinbach

Photonenkorrelations-spektroskop

Zetasizer S

Sofware: Version 1.4.1

Malvern Instruments, Malvern, GB

Titrationskalorimeter VP-ITC 2000 MicroCal™ Incorporated, Northampton, USA

Pipetten Research-Serie

Multipette plus

sowie

Pipetman® P-Serie

Eppendorf AG, Hamburg

Gilson , Middleton, USA

Tischzentrifugen Hermle Z 382K

Biofuge pico

Hermle Labortechnik, Wehingen

Heraeus, Osterode

Transmissionselektronen-mikroskop

Leo 912 Omega

Zeiss, Oberkochem

Ultraschallbäder Sonorex Super RK 255 H Sonorex RK 106 S

Bandelin, Berlin

UV/Vis Spektralphotometer Uvikon 933 A Kroton Instruments, Mailand, I

Wasserbäder WB14

Haake N2

Memmert, Schwabach

Thermo Haake, Hannover

Wasserfiltersystem Simplicity185Milli Millipore, Eschborn

Methoden 57

4 Methoden

4.1 Synthesen

4.1.1 Aufreinigung von BPS-30

Um Nebenreaktionen zu vermeiden und den Reaktionsansatz von Anfang an möglichst

definiert zu gestalten wurden die als Gratisproben bezogenen PEGylierten Sterole vor der

chemischen Aktivierung einem Reinigungsschritt unterzogen.

BPS-30 ist ein auf der Basis von natürlichen Sojasterolen gewonnenes Produkt und daher von

inhomogener Zusammensetzung. Nach Herstellerangaben besteht der Sterolteil aus Sitosterol,

Campesterol und Sigmasterol im Molverhältnis 2:1:1. Die durchschnittliche Kettenlänge des

PEG umfasst 30-EO Einheiten.

Die Zusammensetzung des Generol E 25 entspricht der des BPS-30. Lediglich die Länge der

PEG-Kette variiert und wird vom Hersteller mit durchschnittlich 25 EO-Einheiten angegben.

Neben diesen Hauptkomponenten sind laut Hersteller ca. 2-3 Gewichtsprozent freies PEG

enthalten. Dieses und weitere Verunreinigungen wurden sehr effizient durch mizellare

Abb. 4-1: Zusammensetzung des BPS-30

n=30O

OH

17

17

17

Stigmasterol

Campesterol

Sitosterol

58 Methoden

Chromatographie abgetrennt. Zu diesem Zweck wurde eine Sepharose CL-4B Säule (3 x 10

cm) mit Wasser equilibriert, welches zuvor unter Verwendung der Millipore Simplicity 185

Milli Anlage (M-Wasser) aufbereitet wurde.

5 ml einer BPS-30 Lösung (Konzentration: 100 mg/ml) wurden auf die Säule aufgebracht.

Nach einem Vorlauf von 20-25 ml wurden 2,5 - 5 ml Fraktionen gesammelt. Mittels

Dünnschichtchromatographie (Fließmittel: Chloroform/MeOH 85/15, (V/V); Standard-

laufmittel (STL)), Detektion: Dragendorffs Reagenz (DR)) erfolgte die Untersuchung der

einzelnen Fraktionen auf freies PEG .

Da BPS-30 in größerer Menge kostenfrei zur Verfügung stand, wurde auf eine Optimierung

der Trennung verzichtet. Die gewählte Auftragsmenge erlaubte keine saubere Trennung von

freiem PEG und den PEGylierten Sterolen. Daher enthielten einige Fraktionen neben den

PEG-Sterolen freies PEG. Die Fraktionen, die ausschließlich PEG-Sterole beinhalteten

wurden vereinigt, je 10 - 15 ml in einen Rundkolben eingebracht und nach Einfrieren in

flüssigem Stickstoff gefriergetrocknet.

Die Ausbeute lag bei 200-300 mg an reinem Sojasterol pro Säulengang.

4.1.2 Synthese von tresyliertem BPS

Die Synthese von tresyliertem BPS-30 (BPS-TRE) erfolgte in modifizierter Form nach

Delgado et al (1990): Zu einer Lösung von 520 mg (0,3 mmol) des gereinigten BPS-30 in

10 ml Tetrahydrofuran (THF) wurden 120 µl (0,9 mmol) Triethylamin (TEA) hinzugefügt.

Vor der tropfenweisen Zugabe von 64 µl (0,6 mmol) Tresylchlorid in 5 ml THF unter

Stickstoffatmosphäre wurde die Lösung mittels Eisbad auf 0 °C abgekühlt. Nach der Zugabe

des Tresylchlorids wurde der Ansatz bei RT 4 h gerührt, das ausgefallene

Triethylammoniumchlorid abfiltriert und das Filtrat am Rotationsverdampfer zur Trockene

eingeengt. Der Rückstand wurde in 10 ml Diethylether aufgenommen und über Nacht bei

-27 °C gelagert. Das ausgeflockte Produkt wurde bei -10 °C durch Zentrifugation vom

Überstand getrennt, in Methanol (MeOH) aufgenommen, am Rotationsverdampfer getrocknet

und wiederum in 2-3 ml Chloroform aufgenommen. Die Lösung wurde abschließend über

eine Kieselgel 60 Säule (3,5x10 cm, mobile Phase: Standardlaufmittel (STL)) fraktioniert und

die Produkt-enthaltenden Fraktionen (DC, Dragendorff-Kontrolle) gesammelt. Die

vereinigten Fraktionen wurden am Rotationsverdampfer bei 35 °C eingedampft und über

Nacht am Hochvakuum getrocknet. Das Produkt war ein elfenbeinfarbendes amorphes

Wachs.

Methoden 59

Durch Lösen in einer kleinen Menge MeOH und Abkühlen der zähen Masse bei -75 °C im

Trockeneis/Isopropanol-Gemisch kann es am Hochvakuum mit zwischengeschalteter

Trockenfalle in ein weißes, gut zu handhabendes Pulver überführt werden. Die Ausbeute liegt

bei ~ 300 mg pro Ansatz (~ 60%).

theoretische mittlere Molekularmasse: ~ 1880 g/mol

1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5,55 (s, 1H,-C=CH- Sterol), 4,52 (m, 2H, CH2OSO2), 4,22 (q,

2H, 3JH,F = 9.0 Hz, CH2CF3); 3,52-3,58 (m, EO-CH2), 0,68 - 2,5 (m, Sterol-CH)

4.1.3 Synthese von N-Hydroxysuccinimid-aktiviertem BPS

Die Synthese von mit Succinimidylcarbonat aktiviertem BPS-30 (BPS-NHS) erfolgte in

modifizierter Form nach Boden (1998): Zu einer gerührten Lösung von 520 mg (0,3 mmol)

des gereinigten BPS-30 in 15 ml wasserfreiem Dichlormethan wurden 120 µl (0,9 mmol)

TEA und 154 mg (0,6 mmol) N,N’-Disuccinimidylcarbonat (DSC) hinzugefügt. Der Ansatz

wurde 6 h bei RT unter Stickstoff gerührt und eine Umsatzkontrolle durch DC vorgenommen.

Als Fließmittel diente das STL. Die Detektion erfolgte parallel über DR und Ninhydrin

Reagenz (NR). War knapp unterhalb des Ninhydrin positiven Produktflecks noch ein

deutlicher Ninhydrin-negativer, Dragendorff-positiver Fleck erkennbar, wird die Lösung zur

Trockene eingedampft, in MeOH aufgenommen und über Nacht bei -27 °C gelagert. Das

ausgeflockte Rohprodukt wurde durch Zentrifugation in der Kälte vom Überstand getrennt, in

wenigen Millilitern MeOH gelöst, eingedampft und abermals in Dichlormethan

aufgenommen. Die Umsetzung wurde unter gleichen Bedingungen wiederholt. Waren alle

Reagenzien einwandfrei (wasserfreies Dichlormethan, frisches DSC) war die Reaktion nun

quantitativ abgelaufen.

Zur Aufarbeitung des Produktes erfolgte eine zweimalige Präzipitation: Zunächst aus MeOH,

dann aus Diethylether bei -27 °C über Nacht. Anschließend wurde das Rohprodukt wie unter

4.1.2 geschildert mittels Kieselgelchromatographie aufgereinigt und getrocknet. Die Ausbeute

lag bei ~ 300 mg pro Ansatz (~60%).

theoretische mittlere Molekularmasse: 1875 g/mol

1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5,55 (s, 1H,-C=CH- Sterol), 4,45 (t, 2H, COOCH2), 3,75-3,78

(m, 4H, COOCH2CH2); 3,52-3,58 (m, EO-CH2), 3,52-3,58 (m, EO-CH2), 2,82 (s, 4H,

succinimidyl), 0,68 - 2,5 (m, Sterol-CH)

60 Methoden

4.1.4 Synthese von p-Maleimidophenylisocyanat-aktiviertem BPS

Die Synthese von p-Maleimidophenylisocyanat aktiviertem BPS-30 (BPS-PMPI) erfolgte in

modifizierter Form nach Annunziato et al. (1993): Zu einer gerührten Lösung von 130 mg

(0,07 mmol) des gereinigten BPS-30 in 5 ml wasserfreiem THF wurden 50 mg (0,23 mmol)

p-Maleimidophenylisocyanat (PMPI) hinzugefügt. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT unter

Stickstoff gerührt und der Fortschritt der Reaktion mittels DC (Fließmittel: STL) sowie UV

Löschung und DR verfolgt.

Da es sich bei BPS-PMPI lediglich um einen ersten Versuchsansatz zur Überprüfung der

Eignung des BPS-PMPI zur Ligandenkopplung handelte, erfolgte die Aufreinigung unter

Verzicht auf die Säulenchromatographie.

Die Reinigung des Rohproduktes war durch Präzipitation aus MeOH und einer weiteren aus

Diethylether jeweils bei -27 °C über Nacht möglich.

theoretische mittlere Molekularmasse: 1935 g/mol

Methoden 61

4.2 CMC- Bestimmungen

Zur Bestimmung der CMC der verschiedenen PEG-Lipide wurden ca. 25 mg

Diphenylhextrien (DPH) in 10 ml THF gelöst und 1ml dieser Stammlösung zu 50 ml

methanolischer Lösung verdünnt. 30 µl dieser Lösung wurden mit einer Glasspritze in

Polystyrol-Halbmikroküvetten eingebracht. Die Küvetten wurden in einen evakuierbaren

Exsikkator überführt und das organische Lösungsmittel zunächst bei 100 mbar (10 min) und

anschließend für am Hochvakuum (1 h) entfernt.

Parallel erfolgte die Herstellung von 10 - 15 Dispersionen der PEG-Lipide in 20 mM HEPES

Puffer pH 7,4 (HBS) im Konzentrationsbereich von 0,05 - 50 µM. Je 2 ml dieser Lösungen

wurden in die vorbereiteten Küvetten pipettiert und die entstandene Dispersion durch

mehrmaliges Aufziehen der Pipette gut durchmischt. Die Dispersionen wurden über Nacht im

Dunklen gelagert und am nächsten Morgen am Fluoreszenzspektrometer (LS 50B, Perkin

Elmer, exc: 370 nm, em: 430 nm, Spaltbreiten je 10 nm) gegen die jeweiligen PEG-Lipid-

Dispersionen ohne DPH vermessen. Als CMC wurde der Schnittpunkt der in

halblogarithmischer Auftragung eingezeichneten Graden zur Beschreibung des Graphen

definiert.

4.3 Liposomenherstellung

Je nach Volumen und Molarität der zu präparierenden Liposomen wurden entweder

Direkteinwaagen der Lipide vorgenommen oder mit Lipidstammlösungen gearbeitet. Um

durch Wägefehler bedingte Diskontinuitäten der einzelnen Präparationen zu vermeiden,

wurden Einwaagen unter 5 mg möglichst vermieden.

Bei der Präparation HSPC-haltiger Lipidkompositionen diente ein Gemisch von

Chloroform/Methanol im Verhältnis von 3:1 (V/V) als Lösungsmittel, ansonsten wurden rein

ethanolische Lösungen verwendet. Für die Verwendbarkeit der Lipidstammlösungen wurden

Lagerungszeiten von ca. einer Woche bei 4 °C, ca. einem Monat bei - 27 °C und bis zu sechs

Monaten bei - 80 °C als vertretbar angesehen.

Hergestellte Liposomendispersionen wurden bei 4 - 7 °C gelagert und innerhalb von einer

Woche verbraucht.

62 Methoden

4.3.1 Lipidkompositionen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden hauptsächlich Liposomen mit vier verschiedenen Standard-

Lipidzusammensetzungen gearbeitet. In der folgenden Tabelle sind die Einwaagen für 5 ml

einer 25 mM Liposomendispersion aufgeführt. Sofern bei den entsprechenden Versuchsteilen

nicht anders deklariert, sind die in der Tabelle aufgelisteten Einwaagen und Molverhältnisse

zu Grunde zu legen.

Komposition EPC (mg) HSPC (mg) MPEG (mg) Chol (mg) Verhältnis

PL/Chol(/MPEG)

mol/mol(/mol)

EPC/Chol 4/1 78 9,67 4/1

EPC/Chol 7/3 68,2 14,5 7/3

HSPC/Chol 65,8 16,1 2/1

HSPC/Chol/MPEG 62,5 17,5 15,3 2/1/0,16

Tabelle 4-1: Standardmolverhältnisse und Einwaagen der verschiedenen Liposomenpräparationen (5 ml, 25 mM)

4.3.2 Herstellung durch Extrusion

Die Liposomenherstellung erfolgte, solange nicht anders beschrieben, mittels Filmmethode

und anschließender Handextrusion (1.1.2.2).

Hierzu wurden die Membrankomponenten entweder direkt in einen 100 ml Rundkolben

eingewogen oder als Stammlösung mit einer Glasspritze in den Kolben eingebracht. Die

Lösungen wurden im Wasserbad auf 40 - 45 °C erwärmt und unter reduziertem Druck und

beständiger Rotation bis zur Trockene eingeengt. Der im Rundkolben entstandene Lipidfilm

wurde anschließend mindestens 4 h am Hochvakuum (p < 0,5 mbar) nachgetrocknet, um

Restmengen an Lösungsmittel zu entfernen. Lipidmengen von 5 - 10 µmol wurden

mindestens 30 min nachgetrocknet.

Der vorbereitete Lipidfilm wurde unter Verwendung mehrerer Glaskügelchen durch

kontinuierliches Schwenken oder Rotation am Rotationsverdampfer bei Normaldruck,

suspendiert. Das Volumen des Puffers wurde so gewählt, dass eine MLV-Dispersion der

gewünschten Lipidkonzentration entstand. Bei Präparation HSPC-haltiger Liposomen wurde

Methoden 63

der Puffer während der Herstellung der MLV Dispersion auf 60 - 65° C erhitzt (> Tc HSPC).

Durch wiederholte Extrusion durch Polycarbonatmembranen mit einer Porengröße von 80

oder 200 nm wurde die inhomogene MLV-Dispersion in eine homogene, nahezu unilamellare

Liposomenpopulation überführt. In der Regel wurden 21 Extrusionsschritte durchgeführt. Die

hohe Anzahl an Membranpassagen gewährleistet eine effiziente Reduktion der Lamellenzahl

der Vesikel, die ungerade Anzahl garantiert, dass der gesamte Ansatz die Membran passiert

hat.

Die Extrusion von auf HSPC basierenden Liposomen wurde bei 65 °C im Wasserbad

vorgenommen. Als Kriterium für eine ausreichende Anzahl an Extrusionszyklen wurde der

Polydipersitätsindex (PI) auf Basis der Partikelgrößenbestimmung mittels PCS (vgl. 4.4.1)

herangezogen.

4.4 Charakterisierung der Liposomendispersionen

4.4.1 Messung der Größenverteilung durch PCS

Zur Bestimmung der durchschnittlichen Partikelgröße und zur Ermittlung eines Parameters

zur Beschreibung der Güte der Partikelgrößenverteilung wurden PCS Messungen (vgl. 4.4.1)

mit dem Malvern Zetamaster S durchgeführt. Das Gerät arbeitet mit einem Diodenlaser mit

einer Wellenlänge von 670 nm und misst die Fluktuationen des Streulichtes in einem fixen

Winkel von 90°. Als Maß für den durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser der

Liposomen wurde der von der Software unter Standardeinstellungen ermittelte z-Average (z-

Av) als Qualitätsparameter für die Größenverteilung unter gleichen Bedingungen der PI

herangezogen.

Der Hersteller gibt an, dass bei einem PI von < 0,1 von einer monomodalen Probe gesprochen

werden kann, während PI-Werte von > 0,3 Kennzeichen einer sehr breit verteilten,

inhomogenen Probe sind. Daher wurde bei der routinemäßigen Kontrolle der

Liposomendispersionen ein PI von < 0,2 als Minimum für eine weitere Verwendung der

Liposomen festgelegt. Zur Bestimmung von PI und z-Av wurde die zu analysierende Probe so

verdünnt, dass die für das Gerät als optimal beschriebene Messsignalfrequenz von 50 000 -

200 000 Impulsen pro Sekunde eingehalten wird. Da die Intensität des vermessenen

Streulichtes in der sechsten Potenz mit dem Durchmessers der Partikels zusammenhängt, ist

auf eine schwebstofffreie Probe zu achten. Daher wurden die zur Verdünnung der Proben

verwendeten Puffer zunächst durch Membranfilter mit einer deklarierten Porengröße von

64 Methoden

0,22 µm filtriert. Um osmotische Phänomene mit Auswirkungen auf z-Av und PI zu

vermeiden, wurden zur Verdünnung der Vesikeldispersionen stets die gleichen Puffer

verwendet, die auch zu ihrer Herstellung benutzt wurden. Die Messung selbst erfolgte bei RT

in Polystyrolküvetten. Pro Probe wurden 3 Hauptmessungen (bestehend aus 15

Untermessungen) zu je 300 sec durchgeführt.

4.4.2 Bestimmung des Phosphatgehalts nach Bartlett

Als Routinemethode zur Quantifizierung des PL-Gehaltes einer Liposomenpräparation wurde

die photometrische Bestimmung der Konzentration von Phospholipiden über den

Phosphorgehalt (Bartlett 1959) herangezogen.

Die Methode beruht auf der oxidativen Veraschung einer phosphathaltigen Probe, bei der das

organisch vorliegende Phosphat eines PL in anorganisches überführt wird. Über eine

Farbreaktion lässt sich der genaue PL-Gehalt einer Probe spektroskopisch erfassen.

Um Einschleppen von Fremdphosphor zu vermeiden ist bei der Durchführung des Assays

darauf zu achten, das alle Gerätschaften phosphatfrei gespült und zur Herstellung der

Abb. 4-2: Kalibrationsreihe einer Bartlett - Phosphatbestimmung

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5Y = A + B * X

Parameter Value Error------------------------------------------------------------A -2,39072E-4 0,0015B 5,48942 0,00662------------------------------------------------------------

R2 SD N P------------------------------------------------------------0,99997 0,00231 6 <0.0001------------------------------------------------------------

Abs

orpt

ion

Phosphor [µmol]

Methoden 65

benötigten Lösungen sowie für den letzten Spülschritt ausschließlich mit der Millipore®-

Anlage aufbereitetes Wasser (M-Wasser) verwendet wird. Zum Ausschließen von

Pipettierfehlern werden Proben und Kalibratoren als Doppelwerte direkt in austarierte

Reagenzgläser pipettiert und ausgewogen.

Zur Erstellung der Kalibrationsfunktion werden 0, 50, 100, 200, 300 und 400 µl einer 1 mM

Phosphat-Standardlösung verwendet. Die Probe wird, falls nötig, auf einen Phosphorgehalt

von maximal 10 µg eingestellt. Dabei wird zu Grunde gelegt, dass ca. 4% der eingesetzten

PL-Masse durch den organisch gebundenen Phosphor gestellt werden. Daraus ergibt sich für

eine 20 mM PL-Zubereitung ein Probenvolumen von ca. 15 µl.

Nach Einwiegen der Proben und Kalibratoren werden alle Ansätze mit 500 µl 10 N H2SO4

versetzt nach kurzem Vortexen über 3 h bei 160 °C im Heißluftschrank verascht, in der Folge

140 µl einer 30%igen (V/V) H2O2 Lösung zugegeben und die Ansätze weitere zwei Stunden

bei 160 °C inkubiert.

In der Zwischenzeit kann die Herstellung einer 0,22%igen (m/V) Ammoniummolybdat- und

einer 14,8%igen (m/V) Fiske-Subbarow-Reducer Lösung erfolgen. Nach Beendigung des

zweiten Inkubationsschrittes werden zunächst 4,6 ml der Ammoniummolybdatlösung und

anschießend 200 µl Fiske-Subbarow-Reducer hinzupipettiert und gevortext. Die

Reagenzgläser werden mit Murmeln verschlossen und im Heizblock 10 min lang auf 95 °C

erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur erfolgt die spektralphotometrische Vermessung

bei einer Wellenlänge von 830 nm gegen den Leerwert.

Die Standardproben liefern die Kalibrationsfunktion, mit welcher die Phosphorkonzentration

der Proben berechnet wird. Bei phosphatfreien Puffern und Verwendung der in dieser Arbeit

benutzten PL ist diese gleich der ermittelten Phosphatkonzentration.

War außer der PL-Komponenten Chol als Membranbestandteil enthalten, wurde der auf

Grundlage des Phosphorgehalts bestimmte Faktor zur Berechnung der

Gesamtlipidkonzentration der Präparation genutzt.

4.4.3 Cryo-TEM

Die elektronenmikroskopischen Arbeiten wurden von A. Kimpfler durchgeführt. Die unten

angeführte Beschreibung der Probenvorbereitung orientiert sich an dem relevanten Kapitel

ihrer Dissertation (Kimpfler 2003).

66 Methoden

Ein Tropfen der Präparationen wurde mit Hilfe einer Pipette auf ein Kupfernetzchen

(Durchmesser 5 mm) aufgetragen. Die Kupfergrids wurden entweder vor dem Gebrauch mit

einem Kohlelochfilm präpariert oder bereits mit einem Kohlelochfilm versehen vom

Hersteller bezogen (Quantifoil®).

Die überschüssige Flüssigkeit wurde mit einem Streifen Filterpapier abgezogen, die Probe in

flüssiges Ethan (90 K) getaucht und schockgefroren. Das Absaugen führt zur Bildung eines

sehr dünnen (< 1µm) amorphen Wasserfilms. Daher ist ein rasches Einfrieren des Materials

nötig, um Kristallbildung von Wasser und Auskristallisieren von Puffersalzen zu vermeiden.

Außerdem wird damit das Verdunsten von Wasser und damit die Entstehung von Artefakten

(z.B. Einschnürungen) durch osmotische Effekte minimiert. Die geringe Höhe des

Untersuchungsmaterials nach dem Absaugen hat zur Folge, dass große Probestandteile mit

dem überschüssigen Medium entfernt werden.

Die tiefe Temperatur des Ethans wurde durch Kühlung mit flüssigem Stickstoff in einer Cryo-

Präparationskammer erreicht. Nach dem Einfrieren wurde überschüssiges Ethan abgestreift

und die Probe mittels eines Oxford-Cryo-Stabes unter Spülung mit kaltem N2-Gas in das

Elektronenmikroskop transferiert, welches ebenfalls mit flüssigem Stickstoff auf ca. 90 K

gekühlt wurde.

Nach der Fokussierung wurde die Aufnahme des gewünschten Bildausschnittes mit einer

Belichtungszeit von 1,0 ms getätigt. Die Bildausschnitte konnten in verschiedenen

Vergrößerungen bis zu 50 000-fach digital abgespeichert werden. Anhand der Bilder konnten

die Liposomen nach Größen und Lamellaritäten ausgezählt werden.

Methoden 67

4.5 Einlagerungsverhalten von ethoxylierten Sojasterolen in

vorgefertigte Liposomen

4.5.1 Überprüfung der Separation von Mizellen und Liposomen mittels Dünnschichtchromatographie

Ein Teil der Untersuchungen zum Einlagerungsverhalten von BPS-Derivaten in Liposomen

beruht auf gelpermeationschromatographischen Trennungen (GPC-Trennungen). Da die in

4.5.2 durchgeführten Experimente in Konzentrationsbereichen oberhalb der CMC der PEG-

Lipide stattfanden, war eine Koelution von Liposomen und Mizellen zu befürchten.

Um zu überprüfen, ob eine saubere Trennung von liposomal gebundenem und freiem PEG-

Lipid über eine Sepharose CL-4B Säule (1,5 x 12 cm, äquilibriert mit 50 mM NaCl in

M-Wasser, Peristaltic Pump P1) möglich war, wurden Proben der einzelnen Ansätze

unmittelbar nach Zugabe der PEG-Lipide zu den Liposomen fraktioniert (Vorlauf ca. 2 min,

Fraktionsgröße ca. 500 µl) und dünnschichtchromatographisch untersucht. 5-10 µl der

einzelnen Fraktionen wurden mehrmals auf eine Kieselgel 60 Aluminiumfolie aufgebracht.

Als Laufmittel diente das Standardlaufmittel (STL). Zur Visualisierung der Flecke wurde die

DC-Platte kurz in 10 N Schwefelsäure getaucht und mit dem Heißluftföhn erhitzt. Zur

Detektion von MPEG2000-DSPE diente DR.

4.5.2 Einlagerungskinetik und Transfer Raten

Zur vergleichenden Untersuchung der Einlagerung von MPEG2000-DSPE und BPS-30 in

Lipidmembranen unterschiedlicher Komposition wurden Liposomen der Zusammensetzungen

EPC/Chol 7/3, HSPC/Chol und HSPC/Chol/MPEG (vgl. Tabelle 4-1, Seite 62) in HEPES-

Puffer pH 7,4 (HBS) mittels Extrusion durch 80 nm Membranen hergestellt (c (Lipid):

50 mM). Bei der Präparation der Liposomen wurden hohe Anforderungen an den PI der

Liposomen gestellt (< 0,1) um sicherzustellen, dass bei allen Präparationen möglichst

unilamellare Liposomen verwendetet wurden. Da das Ausmaß der Einlagerung im Sinne der

Verteilung als Funktion des verfügbaren Lipids vermutet wurde ist bei Liposomen mit

mehreren Lamellen eine geringere absolute Einlagerungsmenge zu erwarten.

Von beiden PEG-Lipiden wurde eine Stammlösung der Konzentration 10 mg/ml in

50 mM NaCl in M-Wasser hergestellt. Für die Erstellung einer Kalibrationsfunktion wurden

68 Methoden

je 200 µl der 50 mM Liposomendispersionen eingewogen und mit unterschiedlichen Massen

der beiden PEG-Derivat-Lösungen gemischt, so dass die Menge an zupipettetiertem PEG-

Lipid zwischen 0,07 und 10 mol% bezogen auf das Gesamtlipid (GL) lag. Die Kalibratoren

wurden mit NaCl Lösung (50 mM, M-Wasser) auf 1,5 g aufgefüllt, gefriergetrocknet, in

deuteriertem Chloroform aufgenommen und mittels 1H NMR vermessen.

Bei Auftreten von Peakverbreiterungen durch ausgefallenes NaCl und daraus resultierenden

Schwierigkeiten bei der Festlegung der Integrationsgrenzen wurde dieses durch einen

Zentrifugationsschritt (Eppendorfcup, Biofuge pico, 5000 U/min, 30 sec) abgeschieden.

Die NMR Daten wurden mit der Software “Mestre-C“ Fourier-transformiert und nach

automatischer Phasen- und Basislinienkorrektur integriert.

Die Kalibrationsfunktion ergab sich aus dem Verhältnis der Peakfläche der Protonen der

PEG-Kette (3,57-3,67 ppm) zu der der Cholin-Methyl-Protonen der Phospholipide

(3,3-3,45 ppm) (Rostin et al. 2000; Sou et al. 2000). Die Berechnung der molaren

Zusammensetzung der einzelnen Kalibratoren erfolgte auf Basis der mittels Bartlett-Assay

bestimmten Phospholipidgehalte der Lipiddispersion unter Berücksichtigung ihrer Einwaagen

und der zupipettierten Massen der entsprechenden PEG-Lipid Lösung (vgl. Abb. 5-5).

3,70 3,65 3,60 3,55 3,50 3,45 3,40 3,35 3,30

9,59 mol%7,22 mol%

4,73 mol%2,84 mol%

0,89 mol%

ppm

Abb. 4-3: 1H NMR Daten zur Aufstellung der Kalibrationsfunktion zur Einlagerung von BPS-30 in EPC/Chol 7/3

Methoden 69

Zur Ermittlung der Einlagerungskinetik und des molaren Anteils an liposomal assoziiertem

PEG-Lipid nach Gleichgewichtseinstellung wurde je 1 ml (50 µmol Lipid) der Liposomen-

präparationen im Wasserbad auf 21 0,5 °C temperiert. Es erfolgte die Zugabe von 500 µl

einer PEG-Lipid Lösung in HBS, die 7,5 mol% der PEG-Lipide (4,054 µmol) in Bezug auf

das Gesamtlipid (inklusive der PEG-Lipide) enthielten. Nach festgelegten Zeiten wurden

Proben von 300 µl entnommen, auf eine Sepharose CL-4B Säule aufgebracht und fraktioniert,

wobei nicht liposomal gebundenes PEG-Lipid von liposomalem getrennt wurde.

Die opaleszenten Lipid-enthaltenden Proben wurden vereinigt, wobei die letzten lipidhaltigen

Proben verworfen wurden, um ein Einschleppen von freiem PEG-Lipid in die liposomalen

Fraktionen zu vermeiden. Die gepoolten Lipidfraktionen wurden entsprechend den

Kalibratoren auf 1,5 g eingestellt und entsprechend prozessiert.

4.5.3 Isotherme Titrationskalorimetrie zur Untersuchung der Interaktionen von PEGylierten Sterolen mit Liposomen

Die ITC-Versuche wurden unter Anleitung von PD Dr. H. Heerklotz in der Abteilung für

Biophysikalische Chemie des Biozentrums in Basel (Leitung: Prof. J. Dr. Seelig)

durchgeführt.

Alle verwendeten Liposomen wurden durch Extrusion durch Polycarbonatmembranen mit

einer Porenweite von 80 nm hergestellt und die Lipidkonzentration nach einem Bartlett-

Phosphatassay (vgl. 4.4.2) auf die gewünschte Konzentration eingestellt. Als Puffersystem

diente ein HBS-Puffer mit einer Kochsalzkonzentration von 100 mM und einem pH-Wert von

7,4. Zur Vermeidung von Wärmetönung durch pH-Effekte wurden sowohl die

Liposomendispersionen, als auch die PEG-Lipid-Lösungen in dem gleichen Puffer hergestellt.

Alle Lösungen wurden vor Gebrauch bei 45 °C entgast (ThermoVac, Microcal) und unter

Vermeidung von Luftblasen in die mehrmals mit Puffer und einmalig mit dem Füllgut

gespülten Zellen des Titrationskalorimeters (VP-ITC 2000, MicroCal™) eingebracht. Die

Referenzzelle enthielt stets die gleiche Lösung wie die Messzelle. Beim Befüllen der

computergesteuerten Injektionseinheit wurde darauf geachtet, dass keine Luftblasen in das

System gelangten und der als Rührer dienende abgeflachte Spritzenkopf gut gereinigt wurde.

Obwohl in allen Versuchen dieser Arbeit BPS-30 bzw. Generol E-25 zum Einsatz kam, wurde

in dieser Versuchsreihe auf BPS-20 zurückgegriffen, das mit einer CMC von ca. 8 µM (9 µM

eigene Messung mittels DPH-Methode, vgl. 4.2, Literaturwert 7 µM (Folmer & Svensson

70 Methoden

1999)) günstigere Eigenschaften für die Messungen aufwies. Gerade die Bestimmung des

Verteilungskoeffizienten nach Schurtenberger (Schurtenberger et al. 1985) im

Verteilungsexperiment sollte mit submizellaren Lösungen durchgeführt werden, damit die

vermessenen Wärmen ausschließlich aus der Einlagerung des freien Monomers in die

Membran resultieren und nicht durch Demizellisierungswärmen überlagert werden. Trotz der

hohen Sensitivität des Gerätes (unter optimalen Bedingungen sind Reaktionswärmen bis

1 µcal messbar; entsprechend einer Temperaturänderung 10-6 K bei 1ml Volumen), ist beim

Verteilungsexperiment aufgrund des geringen Stoffmengentransports die auftretende

Wärmetönung so schwach, dass die Messungen, auch bei der Verwendung von BPS-20, an

der Leistungsgrenze des Gerätes erfolgten. Ein Teil der Messungen wurde bei 50 °C

durchgeführt, da sich bei dieser Temperatur bessere Messsignale erhalten ließen.

Die Auswertung der Rohdaten erfolgte über MicroCal Origin Version 5 mit entsprechendem

VP-ITC Plug-In unter Vernachlässigung des ersten Peaks, da das dem Gerät vorgegebene

Volumen der ersten Injektion durch das Reinigen der Injektionsspritze nicht genau mit dem

tatsächlich injizierten Volumen übereinstimmt.

4.5.3.1 Demizellisierungsexperiment

Für das Demizellisierungsexperiment wurden beide Zellen mit Puffer beschickt und die

computergesteuerte Spritze mit einer 1 mM BPS-20 Lösung befüllt. Nach einmaliger

Injektion von 1 µl erfolgten jeweils Injektionen von 5 µl.

4.5.3.2 Verteilungsexperiment

Das Verteilungsexperiment (vgl. 1.3.2) dient der direkten Messung der Wärmeenthalpie bei

der Einlagerung des Detergenz in die Liposomenmembran. Experimentell wurde so

vorgegangen, dass Mess- und Referenzzelle mit einer BPS-20 Lösung unter der CMC (4 µM

bzw. 8 µM) gefüllt wurden. Nach der Equilibrierung der Zelltemperatur auf 25 oder 50 °C

wurde die Messung automatisch gestartet. Das Injektionsvolumen betrug 3 - 5 µl. Die

Lipidkomposition der verwendeten Vesikel war EPC/Chol 4/1.

Auch für MPEG2000-DSPE wurden Verteilungsexperimente durchgeführt. Hier wurden

EPC/Chol 4/1-Liposomen verwendet und die Lösungen wurden auf 60 °C erhitzt bevor mit

den Messungen begonnen werden konnte. Außerdem lag die Konzentration der verwendeten

Methoden 71

PEG-PE Lösung oberhalb der selbst ermittelten CMC (vgl. 4.2), jedoch unter dem in

Sou et al. (2000) angegebenen Wert. Diese Kompromisse mussten eingegangen werden, um

überhaupt messbare Signale zu erhalten.

Die Auswertung erfolgte unter Annahme der Gültigkeit des Verteilungskoeffizienten nach

Schurtenberger, der die vermessenen Werte besser beschrieb als der

Molenbruchverteilungskoeffizient P (Tanford 1980).

f,D0b,D

f,D0b,D CK

CC

bzw. CKn

n

LL

Gleichung 4-1

Dabei ist:

nD,b Stoffmenge des Detergenz im Bilayer

nL0 Stoffmenge des Lipids

K Verteilungskoeffizient nach Schurtenberger

CD,f Konzentration des freien Detergenz

CD,b = nD,b / V mit V gleich dem Volumen der Zelle

CL0=nL

0 / V mit V gleich demVolumen der Zelle

Die Konzentration des freien Detergenz (CD,f) ergibt sich aus der Differenz des gebundenen

(CD,b) und der Gesamtmenge (CD0) des in der Lösung befindlichen Detergenz

(CD,f = CD0 - CD,b). Daraus ergibt sich für den Verteilungskoeffizienten K:

0L

0L0

Db,D KC1KCCC

Gleichung 4-2

Die Verteilungswärme (hi), die bei der i-ten Injektion des Lipids beobachtet werden kann, ist

abhängig von:

der Transferenthalpie biwDΔH und

der Stoffmenge (nD,b(i)) des Detergenz, das bei der i-ten Injektion aus der Lösung

in die Membran wandert (bzw. volumenbezogen von △CD,b(i) · Vcell).

72 Methoden

Die vermessene Verteilungswärme der Injektionen nimmt bei Zunahme der Lipidmenge in

der Zelle in dem Maße ab, wie sich weniger Detergenz in die Membran einlagern kann. Es

gilt:

cell)i(b,D

biwDi VCHh Gleichung 4-3

Die Ableitung des Ausdrucks für den Verteilungskoeffizient nach Schurtenberger

(Gleichung 4-1)

0L20

L

0D

)i(b,D C

)CiK1(KCC

Gleichung 4-4

liefert zusammen mit Gleichung 4-3

cell0L20

L

0D

biWDi VC

)CiK1(KCHh

Gleichung 4-5,

die die Änderung der Menge (Konzentration) des gebundenen Detergenz bei Änderung des

Lipidgehalts in der Zelle um CL0 beschreibt.

Die beobachtete Wärme (qobs) einer Injektion ergibt sich damit zu:

molkJ

)CiK1(KCH

CVhq 20

L

0D

biWD0

Lcell

iobs

Gleichung 4-6

Die Änderung der Wärmen hi der Injektionen ergibt sich direkt aus der Integration der

Rohdaten. Da die Änderung der Konzentration CL0 bei bekanntem Volumen der Zelle und

bekannter Lipidkonzentration ebenfalls bekannt ist, kann der Fit eines Plots von hi gegen CL0

zur gleichzeitigen Bestimmung des Verteilungskoeffizienten nach Schurtenberger und zur

Bestimmung der molaren Transferenthalpie biwDΔH herangezogen werden.

Die Funktion wurde unter Einführung eines weiteren Parameters zur Beschreibung der

Verdünnungswärme bei bereits vollständiger Insertion des PEG-Lipids und eines Faktors γ

zur Korrektur des zur Einlagerung zur Verfügung stehenden Lipidanteils (hier aufgrund

gleicher Lipidanzahl im inneren und äußeren Monolayers, des auszuschließenden Flippflopps

der PEG-Lipide unter Annahme von unilamellaren Vesikeln gleich 0,5 gesetzt) in Origin 5

implementiert und zur Bestimmung von K und biwDΔH genutzt.

Methoden 73

4.5.3.3 Solubilisierungsexperiment

Für die Untersuchung der Solubilisierung von EPC-Membranen durch BPS-20 wurde eine

46,6 mM Lösung des PEG-Sterols in Puffer hergestellt. Diese wurde bei 50 °C zu einer 5 mM

EPC Liposomendispersion ohne Cholesterolanteil titriert.

4.5.4 Membran-Leakage während der BPS-30 Einlagerung

4.5.4.1 Freisetzung unterhalb der CMC

Um die Freisetzung hydrophiler Substanzen aus dem Liposomeninnenraum, induziert durch

die Einlagerung von BPS-30 in den äußeren Monolayer zu untersuchen, wurden Lipidfilme

(EPC/Chol 7/3, HSPC/Chol, MPEG/HSPC (Tabelle 4-1, Seite 62)) mit einer 50 mM Calcein

Lösung in EDTA-haltigem HBS (5 mM EDTA in HBS, (HBS E)) suspendiert

(Endkonzentration des Lipids: 50 mM).

Die MLV wurde drei Frier-Tau Zyklen unterzogen und freies Calcein über eine GPC Säule

(Sepharose CL-4B, 1,5 x 12 cm, Elutionsmittel HBS E, pH 7,4) abgetrennt, die

Liposomenfraktionen vereinigt und auf 1,5 mM Lipid verdünnt.

5 - 10 µl (7,5 - 15 nmol Lipid) der Liposomendispersionen wurden in einer Polystyrolküvette

mit 3 ml HBS E-Puffer gemischt. Die verschiedenen Volumina waren Folge der

differierenden Verkapselungseffizienzen zwischen den einzelnen Chargen und

Lipidkompositionen und wurden gewählt, um einen maximalen Fluoreszenzanstieg nach

Zerstören der Liposomen zu erzielen.

Nach Basislinienäquilibrierung erfolgte die Zugabe von 1-50 mol% BPS-30

(0,075 - 3,75 nmol; 0,13 - 6,5 µg bei 10 µl Liposomen) in Bezug auf das Gesamtlipid, wobei

das Volumen dem der Liposomendispersion entsprach.

Die Einlagerung des BSA-BPS-Konjugats wurde entsprechend verfolgt, wobei der BPS

Anteil (vorliegend als Konjugat mit BSA (vgl. 4.5.4.2)) 7,5 mol% betrug.

Das BPS-BSA-Konjugat wurde am Vortag in einem BPS-TRE gecoateten

Eppendorfreaktionsgefäß durch Zugabe eines BSA-haltigen (c = 2 mg/ml) Boratpuffers

(100 mM, pH 8,4, BBS 100) vorbereitet. BSA selbst hatte keinen signifikanten Einfluss auf

die Membranpermeabilität.

Der bei der Einlagerung des Sterol-PEG in die Liposomenmembran freigesetzte Calcein

74 Methoden

Anteil ließ sich über die Änderung der Fluoreszenz bestimmen. Dazu wurde diese mit Hilfe

eines Fluoreszenzspektrometers (LS 50B, Perkin Elmer, exc: 470 nm, em: 510 nm,

Spaltbreiten je 5 nm, Messinterval 15 sec, Integrationszeit: 1 sec), über einen Zeitraum von

ca. 1 h bei einer Temperatur von 21 ± 0,5 °C unter konstantem Rühren verfolgt. Zur

Bestimmung der maximalen Fluoreszenzintenstät, entsprechend 100% Freisetzung des

gequenchten Calceins, wurden die Liposomen durch Zugabe von 10 µl Triton X-100 (10 % in

M-Wasser; m/m) zerstört. Weder Triton noch BPS haben unter den gewählten Anregungs-

und Emissionswellenlängen Einfluss auf die Fluoreszenzmessungen. Die basale Freisetzung

von Calcein aus den verschiedenen Liposomenspezies war über einen Zeitraum von 6 h

vernachlässigbar und brauchte daher bei der Bestimmung der Freisetzung des Calceins durch

das Sterol-PEG nicht weiter berücksichtigt werden.

Die prozentuale Calcein-Freisetzung wurde berechnet nach:

100 IIIICalcein %

0

0tfrei

Gleichung 4-7

It Fluoreszenzintensität der Probe nach BPS-Zugabe

I∞ Fluoreszenzintensität nach Tritonzugabe

I0 theoretische Fluoreszenzintensität vor BPS-Zugabe

Die zur Berechnung zu Grunde gelegten Fluoreszenzintensitäten stellen hierbei die

Mittelwerte der letzten 5 - 10 Einzelmessungen dar (vgl. Kästen in Abb. 4-5). Der

Korrekturfaktor (1,003 - 1,005), der sich aus der Verdünnung des Ansatzes durch die Zugabe

von Triton X-100 ergibt, wurde bei der Berechnung der prozentualen Freisetzung aufgrund

seines vernachlässigbaren Einflusses außer Acht gelassen.

Methoden 75

Abb. 4-5: Freisetzung von Calcein aus HSPC/Chol Liposomen bei Zugabe von 50 mol% BPS-30; Anstieg der Fluoreszenz durch Dequenching

großer Graph:

Gesamtverlauf eines Freisetzungsversuchs

Ausschnitt: Freisetzung bei Zugabe von

■ 50 mol%

● 15 mol%

▲ 7,5 mol%

BPS-30 zu HSPC/Chol Liposomen

0 10 20 30 40 50 60 700

100

200

300

400

500

600

700

0 10 20 30 40 50 6030

40

50

60

70

Fluo

resz

enzi

nten

sitä

t

Zeit [min]

I0 It

I

BPS-Zusatz

Triton-Zusatz

0 2 4 6 8 10 12 14

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Fluo

resz

enzi

nten

sitä

t

c Lipid [nM]

durchgezogene Linie:

Liposomen zerstört

━■━ EPC/Chol 7/3

━●━ HSPC/Chol ━▲━ HSPC/Chol/MPEG

gestrichelte Linie:

Liposomen intakt

┄□┄ EPC/Chol 7/3

┄○┄ HSPC/Chol

┄△┄ HSPC/Chol/MPEG

Abb. 4-4: Linearität des Messbereichs zur Bestimmung der BPS-30 induzierten Calcein Freisetzung

76 Methoden

Für die Gültigkeit der aufgestellten Beziehung ist ein linearer Zusammenhang der

Fluoreszenzintensität innerhalb des Messbereichs erforderlich. Der Nachweis der Linearität

konnte über die Erstellung einer Verdünnungsreihe aus einer Probe, die 20 µl

(1mM oder 1,5 mM bei HSPC/Chol/MPEG) der entsprechenden Liposomenpräparation

enthielt, durch Vermessen vor und nach Zerstören mit 20 µl Triton X-100, erbracht werden

(vgl. Abb. 4-4).

4.5.4.2 Freisetzung oberhalb der CMC

Die starke Verdünnung der Liposomen, die für eine direkte Vermessung des freigesetzten

Anteils an Calcein notwendig war, führte zu BPS-Konzentrationen unterhalb der CMC.

Zusätzlich wurden auch Versuche durchgeführt, die das Leakageverhalten oberhalb der CMC

zum Gegenstand hatten.

Um die Calcein-Freisetzung oberhalb der CMC des BPS verfolgen zu können, müssen

entsprechend höhere Lipidkonzentrationen eingestellt werden. Da in den Kopplungsversuchen

meist mit 7,5 mol% Anker gearbeitet wurde, sollte dieser Anteil nun mizellar angeboten

werden. Dabei sollten die Einlagerungsbedingungen möglichst nahe an den tatsächlichen

Kopplungsbedingungen angelehnt sein. Daher wurde zur Untersuchung des

Freisetzungsverhaltens von Calcein aus Liposomen in Anwesenheit von BPS Mizellen wie

folgt vorgegangen:

Es erfolgte die Präparation von EPC/Chol 7/3 Liposomen analog 4.5.4.1.

Nach dem Abtrennen des freien Calceins wurde eine Konzentration von 10 mM GL

eingestellt (HBS E), bei der die direkte Verfolgung der Calcein-Freisetzung aufgrund der

hohen Fluoreszenzintensität nicht mehr möglich war. 250 µl der Liposomenpräparation

wurden wahlweise mit 125 µl HBS E (Blindwert) oder 125 µl BPS-haltigem HBS E versetzt.

Die Stoffmenge BPS in den 125 µl entsprach 7,5 mol% des GL in der Probe (Lipid: 2,5 µmol;

BPS: 0,203 µmol, 352 µg; Endkonzentration BPS ~ 540 µM). Aus beiden

Liposomendispersionen (BPS-haltig, nicht BPS-haltig) wurden nach einer Inkubationszeit von

mindestens 30 min 2µl - Proben entnommen und am Fluorimeter vermessen (Bedingungen,

Wellenlängen, Spaltbreiten analog 4.5.4.1, single read Modus, Integrationszeit 10 sec).

Die Proben der jeweiligen Liposomendispersionen wurden mit 3000 µl HBS E gemischt,

vermessen, mit 10 µl Triton zerstört und abermals vermessen.

Methoden 77

Die Grundfluoreszenz I0 ist bei den BPS-haltigen Proben nicht direkt zugänglich, da mit dem

Zusatz des PEG-Lipids zur Liposomendispersion die Freisetzung des Calceins begann. Zur

Ermittlung des freigesetzten Calceinanteils unter Berücksichtigung des (bei 2µl

Probenvolumen erheblichen) Pipettierfehlers konnte wie folgt vorgegangen werden:

Mindestens zehn 2 µl Proben des Leerwertes wurden wie oben beschrieben jeweils vor und

nach Tritonzugabe vermessen.

Da innerhalb des Messbereiches die Linearität gewährleistet war (vgl. Abb. 4-4), ließ sich auf

Grundlage dieser Leerwerte aus den einzelnen Messpaaren ein mittlerer Faktor (FI) für die

Fluoreszenzzunahme durch Tritonbehandlung der Liposomen errechnen. Dieser ergab sich

aus dem Mittelwert der Quotienten aus der Fluoreszenzintensität vor und nach der Zerstörung

der Liposomen:

1

n n10I I

In1F Gleichung 4-8

n Anzahl der Messungen

I∞ Fluoreszenzintensität nach Tritonzugabe

I0 Fluoreszenzintensität vor Tritonzugabe

FI mittlerer Fluoreszenzintensitätsfaktor

Da BPS keine Eigenfluoreszenz im Messbereich aufweist konnte dieser Faktor zur

Bestimmung der theoretischen Fluoreszenzintensität (I0t) der BPS-haltigen Proben

herangezogen werden.

Aus den aufgrund des Pipettierfehlers variierenden Messwerten nach Zerstörung der

Liposomen (I∞ ) lässt sich mit Hilfe der Faktors FI auf die theoretische Grundfluoreszenz (I0t)

zum Zeitpunkt Null bei Zugabe des BPS zu der Probe zurückrechnen.

It0 F

II Gleichung 4-9

78 Methoden

Die Berechnung des freigesetzten Calceinanteils ergibt sich nun analog zu Gleichung 4-7

wobei I0 durch I0t ersetzt wird.

100 IIIICalcein %

t0

t0tfrei

Gleichung 4-10

It Fluoreszenzintensität der Probe nach BPS-Zugabe

I∞ Fluoreszenzintensität nach Tritonzugabe

I0t theoretische Fluoreszenzintensität vor BPS-Zugabe

Die Methode wurde gewählt, da sich auf diese Weise die Calcein-Freisetzung mehrerer

Proben nebeneinander (auch in Abhängigkeit der Zeit) verfolgen lässt, ohne das eine

Verfolgung der Fluoreszenz online nötig war. Die Freisetzung des Calceins oberhalb der

CMC lässt sich somit ohne eine GPC-Aufbereitung der Probe verfolgen.

Im Falle der Untersuchung freigesetzter Calceinmengen durch Einlagerung des BSA-BPS-

Konjugats wurde entsprechend vorgegangen. In einem Eppendorfgefäß wurde eine

methanolische BPS-TRE Lösung (10 µl, 0,203 µmol BPS-TRE) verdampft und mit 125 µl

BSA-haltigem (c = 2 mg/ml) BBS 100 (pH 8,4) versetzt. Nach Inkubation über Nacht bei RT

erfolgte die Zugabe von 250 µl 10 mM EPC/Chol 7/3 Dispersion. Als Leerwert zur

Ermittlung des Faktors FI diente eine reine BSA-Liposomen-Mischung mit gleichen

Konzentrationsverhältnissen.

4.6 Oberflächenmodifikation präformulierter Liposomen mit BSA-BPS-Derivaten

4.6.1 Das Standardkopplungsprotokoll

Die Kopplung von BSA an die Oberfläche präformulierter Liposomen wurde in zwei

Schritten (vgl. Abb. 4-6) durchgeführt. Im ersten Schritt erfolgte die Umsetzung des Proteins

mit dem aktivierten PEG-Sterol. Dazu wurde das aktivierte Lipid als ethanolische Lösung mit

einer Hamilton-Spritze zu dem im Kopplungspuffer gelösten Protein gegeben. Die Mischung

aus Protein und PEG-Sterol wurde über Nacht bei RT inkubiert. In diesem ersten

Inkubationsschritt setzte sich das aktivierte PEG-Sterol mit dem Protein um, so dass es mit

Methoden 79

mehreren PEG-Sterolen kovalent verknüpft wurde.

Am nächsten Morgen erfolgte die Zugabe vorgefertigter Liposomen zu dem Ansatz. Das

Sterol-PEG-Protein-Konjugat lagerte sich in einem zweiten Inkubationsschritt in die

Liposomen ein. Hierbei kann man davon ausgehen, dass die Verknüpfung des Konjugats mit

den Liposomen über den hydrophoben Sterolteil vermittelt wird, der sich in die

Liposomenmembran einlagert und als Anker zur Fixierung des Proteins an der liposomalen

Oberfläche fungiert. Die Dauer des zweiten Inkubationsschrittes betrug i.d.R. 2 - 4 h.

Nach der Kopplung des Proteins an die Liposomenoberfläche konnten die modifizierten

Liposomen über eine GPC-Säule von nicht gebundenem Liganden abgetrennt werden.

Alternativ zur Verwendung der ethanolischen Lösung des aktivierten Lipids im ersten

Inkubationschritt konnte dieses auch als dünner Film an der Wandung eines Eppendorf-

Reaktionsgefäßes angeboten werden. Die Einzelschritte zur Vorbereitung dieser Gefäße seien

im Folgenden näher erläutert: Eine methanolische Lösung (aufgrund des niedrigeren

Dampfdruckes gegenüber der ethanolischen Lösung vorzuziehen) des BPS-TRE oder BPS-

NHS (i.d.R. 10 l, bei höheren Konzentrationen an BPS-TRE aufgrund der besseren

Löslichkeit des aktivierten Lipids in ethanolischer Lösung) wurde mit einer Hamilton-Spritze

in ein Reaktionsgefäß eingebracht und in einem evakuierbaren Exsikkator bei vermindertem

Druck zur Trockne eingeengt. Um die Entstehung von Siedeverzügen zu vermeiden wurde bei

größeren Mengen Lösungsmitteln (> 30 µl) eine Evaporationszentrifuge (Concentrator 5301,

Abb. 4-6: Darstellung des Zwei-Schritt-Protokolls zur Kopplung von BSA an die Oberfläche präformulierter Liposomen

Schritt 1 Schritt 2

80 Methoden

Eppendorf) eingesetzt. Die auf diese Weise präparierten Cups waren bei -27 °C gelagert

mindestens eine Woche verwendbar.

4.6.2 Ermittlung der Kopplungseffizienz

4.6.2.1 Iodierung des Liganden

Die Quantifizierung des an den Liposomen gebundenen Proteins erfolgte über einen

radioaktiven Marker. Unter Verwendung von Iodo-Beads® (Pierce, Rockford, USA) wurde

der Ligand mit 125Iod, entsprechend dem firmenseitig beigefügten Protokoll, gelabelt.

Freies Iod konnte über eine Sephadex G-25 Säule (äquilibriert mit HBS) und - wenn nötig -

mit nachfolgender Dialyse (selbstkonstruierte Dialysekammer, Cellulosemembran Diachema,

10 kDa cutoff, high permeability) über Nacht gegen HBS abgetrennt werden.

4.6.2.2 Quantifizierung des gebundenen Anteils über GPC

Die Lösung des zu koppelnden Liganden wurde mit einer Spur (ca. 250 - 350 Bq/Probe, 14C

oder 125I) radioaktiv markiertem BSA versetzt.

Nach der Kopplung des Liganden wurde ein Teil des Gesamtansatzes auf eine mit

Kopplungspuffer äquilibrierte Sepharose CL-4B Säule (100 - 400 µl Probe; 1,5 x 12 cm oder

1 x 25 cm) aufgebracht und fraktioniert. Die einzelnen Fraktionen (200-800 µl,

Fraktionssammler Frac-100) wurden direkt in Szintillationsmessröhrchen (Mini Vials B, C.

Roth) gesammelt, im Verhältnis 1:4 (Probe : Szintillationsflüssigkeit) mit High Ionic Fluor

(Packard Bioscience) aufgefüllt, geschüttelt und im Szintillationszähler (Tri-Carb 1900 TR,

Packard Bioscience) vermessen.

Die Berechnung des gebundenen Proteinanteils war durch Bezug auf einen Teil des gesamten

Kopplungsansatzes, der als Referenz mit vermessen wurde, möglich. Zur Angleichung des

tSIE-Wertes (transformed Spectral Index of the External standard) der Referenz an die der

zugehörigen Fraktionen musste die ungefähre Masse der Fraktionen ermittelt werden. Durch

Zugabe von Elutionspuffer zur Referenzprobe wurde ihre Masse der der Fraktionen

angepasst. So ließ sich der prozentuale Anteil der auf die Säule aufgebrachten Gesamtaktivität

in jeder einzelnen Fraktion bestimmen. Die Berücksichtigung der Hintergrundstrahlung des

Elutionspuffers erfolgte durch Vermessen eines der Masse der Fraktionen entsprechenden

Nullwerts.

Der erste in Abbildung Abb. 4-7 verzeichnete Peak entspricht dem liposomal gebundenen

Methoden 81

Proteinanteil, der zweite stellt den freien BSA-Peak dar. Der letzte (kleine) Peak steht für den

Anteil des freien 125I an der Gesamtaktivität, war je nach verwendeter Charge an “heißem“

Protein unterschiedlich groß und ließ sich durch zusätzliches Abtrennen von freiem Iod durch

Dialyse vollständig vermeiden. Dieser Anteil wurde bei der Ermittlung des prozentual

gekoppelten Proteinanteils nicht berücksichtigt.

Bei Basislinientrennung zum zweiten Peak wurde der erste Peak zur Bestimmung des

liposomal gebundenen Anteils herangezogen.

4.6.3 Kopplungsversuche unter Verwendung von tresyliertem Generol

Die ersten Synthesen und Kopplungsversuche zur Untersuchung der Eignung von

ethoxylierten Sojasterolen wurden unter Bedingungen durchgeführt, die sich an der

Dissertation von Andreas Lung (Lung 2002) orientierten.

Die Syntheseansätze wurden dementsprechend mit dem von A. Lung genutzten Generol E-25

durchgeführt, das sich in der Kettenlänge der PEG Einheit von dem später genutzten BPS

unterscheidet. Auf eine Aufreinigung des Ausgangsmaterials für die Synthesen wurde

verzichtet, die des Produktes erfolgte ausschließlich über Fällung aus MeOH, Diethylether

und Petrolether.

4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

Elutionsvolumen [ml]

Aktiv

ität [

cpm

]

0

20

40

60

80

100 Summ

e der Gesam

taktivität [%]

━■━ (linke Achse)

Elutionsprofil eines

Kopplungversuchs

━□━ (rechte Achse)

Summe der eluierten

Anteile der auf die

Säule aufgetragenen

Gesamtaktivtät [%]

Abb. 4-7: Exemplarischer Verlauf der GPC-Fraktionierung eines Kopplungsansatzes unter Verwendung von BSA als Modellprotein

82 Methoden

Die Lipidzusammensetzung der verwendeten Liposomen entsprach der in Tabelle 4-1

(Seite62) näher charakterisierten EPC/Chol 4/1 Formulierung.

Bei allen Versuchen wurde gemäß des Standardprotokolls vorgegangen (vgl. 4.6.1). Die BSA-

Konzentration in BBS 650 (bzw. Sörensen Phosphatpuffer; PBS) betrug 1,0 mg/ml, die

Lipidkonzentration 20 mM, die Extrusion der Liposomen erfolgte über 200 nm

Membranporen. Die Stoffmenge an eingesetztem tresylierten Generol (GET) lag - sofern

nicht anders beschrieben - bei 7,5 mol% in Bezug auf das GL.

Zur Kopplung wurden im ersten Inkubationsschritt 325 µl der BSA Lösung mit 25 µl

ethanolischer GET-Lösung (c = 7,93 mg/100l, n = 1,054 µmol) versetzt. Es erfolgte die

Inkubation über Nacht mit Zugabe der Liposomen (650 µl) am nächsten Morgen. Nach der

zweiten Inkubation wurden die Ansätze entsprechend 4.6.2.2 ausgewertet.

4.6.3.1 Überprüfung der Eignung von GET zur Kopplung von BSA an Liposomen

In der Arbeit von A. Lung (Lung 2002) wurde die Eignung der tresylierten Sojasterole zur

Kopplung von BSA an Liposomen bereits ausführlich diskutiert. Dennoch war eine

Überprüfung der Funktionalität des neu synthetisierten GET nötig, zumal die von A. Lung

hauptsächlich genutzte “Eintopf-Methode“ in das zwei Schritt Kopplungsverfahren

umgewandelt wurde (vgl. 4.6.1).

Diese Modifikation erfolgte, um die zu Beginn der Arbeit immer wieder auftretenden

Probleme bezüglich der Wiederfindungsraten des auf die GPC-Säule aufgebrachten

radioaktiven Materials in den Griff zu bekommen. Die Zwei-Schritt Methode bot bessere

Kopplungseffizienzen bei geringerem Partikelwachstum (vgl.4.6.4.4 und 5.4.2.6).

Als Blindprobe diente ein Ansatz, bei dem BSA mit 7,5 mol% reinem

Generol E-25 (statt mit GET) über Nacht bei RT stehen gelassen wurde. In einem weiteren

Ansatz wurde das Generol durch die entsprechende Menge GET ersetzt.

Die Kopplung des BSA an die Liposomen konnte mittels GPC

(Sepharose CL-4B, 1 x 25 cm) nachgewiesen werden (vgl. 4.6.2.2). Zur Erstellung eines

genauen Elutionsprofils musste jedes Szintillationsröhrchen vor und nach der Fraktionierung

der Proben ausgewogen werden, um die Masse jeder einzelnen Fraktion zu bestimmen. Durch

Subtraktion der beiden Elutionskurven (für Blindversuch und Kopplungsversuch) konnte eine

Methoden 83

durch die Behandlung mit GET induzierte Koelution von Liposomen und Protein

nachgewiesen werden. Aufgrund der durch die Opaleszenz der Liposomenfraktionen einfach

möglichen visuellen Überprüfung der Übereinstimmung von Liposomen- und

Proteinfraktionen im Fall der Verwendung von GET, wurde auf einen separaten PL Nachweis

verzichtet. Der Nachweis von Koelution von Liposomen und Protein wurde im Rahmen eines

Free-Flow Elektrophorese Experiments erbracht (vgl. 5.4.2.2).

4.6.3.2 Kontrolle des pH-Optimums bei Verwendung tresylierter Sojasterole zur Kopplung von BSA

Die Literatur (vgl. auch 5.4.1) schlägt schwach alkalisches Medium für die Kopplung von

Aminen mit tresylierten PEG vor. Um den für die Kopplung von BSA an die Liposomen

optimalen pH-Bereich auszuloten, wurden Boratpuffer (650 mM) im pH-Bereich von 8,3-9,0

hergestellt. Zum Vergleich der Kopplungseffizienz bei neutralen pH-Werten diente ein

Sörensen Phosphatpuffer pH 7,4 (PBS, vgl. Tabelle 3-5) als Reaktionsmedium des ersten

Inkubationsschritt.

4.6.3.3 Abhängigkeit der Kopplungseffizienz von pH-Wert und Stoffmenge des eingesetzten GET

Ausgehend von einer ethanolischen Stammlösung von GET, die bei einem Volumen vom

25 µl 7,5 mol% des später zugegebenen Lipids enthielt, wurde eine Verdünnungsreihe von

GET hergestellt, indem die jeweils höher konzentrierte Lösung 1:1 mit EtOH verdünnt wurde

(4 Verdünnungsschritte). Bei Zugabe von 25 µl der Lösungen 1-5 resultierten nach Zugabe

der Liposomen GET-Anteile zwischen 7,5 und 0,5 mol%.

Die Untersuchungen erfolgten bei drei verschiedenen pH-Werten (BBS 650, pH 8,5 und pH

9,0 sowie PBS pH 7,4).

Im aufgrund der Ergebnisse von 4.6.3.2 und Literaturangaben zur Kopplung festgelegten pH-

Bereich von 8,4 - 8,5 (vgl. 5.4.1 und 5.4.1.2) wurden Dreifachbestimmungen durchgeführt.

84 Methoden

4.6.3.4 Untersuchungen zur Dauer des ersten Inkubationsschritts

Das Kopplungsprotokoll sollte bezüglich der Dauer der beiden Inkubationsschritte optimiert

werden. Da es sich bei der Derivatisierung mit tresylaktivierten Lipiden um aminoaktive

Kopplungen handelt konnte die Reaktion zwischen BPS-TRE und BSA, das bei diesen

Untersuchungen als Modellprotein diente, durch Zugabe eines großen molaren Überschusses

an einer aminhaltigen Komponente wie Histidin-HCl unterbrochen werden. Da das pH-

Optimum für Tresylatkopplungen zudem im schwach alkalischen Bereich liegt (Sperinde et

al. 1999) wurde die Histidin-HCl Lösung in ihrem pH-Wert nicht auf den pH-Wert des

Kopplungspuffers angeglichen, so dass ein End-pH von ca. 5 resultierte.

Die Liposomen für diese Versuchsreihe wurden durch Extrusion über Membranen einer

Porenweite von 80 nm hergestellt. Die folgende Aufstellung gibt Auskunft über die näheren

Details der Liposomenpräparationen, die in dieser Versuchsreihe verwendet wurden:

Liposomen:

Lipidkomposition: EPC/Chol 4/1

Größe: 110 - 125 nm

Lipidkonzentration: 25 mM

Puffer: Borat 650 mM (BBS 650), pH 8,4

Volumen: 650 µl

Stoffmenge Lipid: 16,74 µmol GL (inkl. BPS)

Vorgegangen wurde gemäß dem unter 4.6.1 vorgestellten Standardprotokoll. 25 µl einer

ethanolischen Lösung von BPS-TRE (4 mg/100 µl; entsprechend 3 mol% des GL) wurden mit

325 µl einer BSA Lösung in Boratpuffer 650 mM, pH 8,4 (BBS 650, 1mg/ml) durch Vortexen

gemischt. Nach 5, 10, 60, 120, 300, 720 min erfolgte der Abbruch der Reaktion durch Zugabe

eines großen molaren Überschusses an Histidin-HCl (100 µl, 60 mg/ml). Der Ansatz wurde

über Nacht bei RT stehen gelassen bevor am nächsten Tag die Zugabe der Liposomen

erfolgte. Nach einer weiteren Inkubation (Standardprotokoll Schritt 2; vgl. Abb. 4-6) über 4 h

bei RT wurde über eine GPC Säule gemäß 4.6.2.2 fraktioniert und ausgewertet.

Methoden 85

4.6.4 Kopplungsversuche unter Verwendung von BPS-TRE

4.6.4.1 Versuche zur Dauer des zweiten Inkubationsschritts

Die Dauer des zweiten Inkubationsschritts ergab sich indirekt aus den Beobachtungen der

Leakage- und NMR-Versuche. Um die Einlagerung des BPS-BSA-Derivates in die

Liposomen auch direkt verfolgen zu können wurde nach einem ersten Inkubationsschritt über

Nacht eine Liposomendispersion zum Ansatz gegeben. Die Einlagerung konnte durch die

Fraktionierung der Probe über eine GPC Säule (1,5 x 12 cm; Sepharose CL-4B) unterbrochen

werden.

Dazu wurde ein Ansatz von BSA in Boratpuffer 100 mM, pH 8,4 (1,5 mg/ml, 250 µl) mit

BPS-TRE (in 10 µl EtOH, entsprechend 7,5 mol% aktiviertes Lipid in Bezug auf das GL)

gemischt und über Nacht inkubiert. Unmittelbar (ca. 1 min) nach der Zugabe der Liposomen

(EPC/Chol 7/3, 25 mM, 500 µl) zu dieser Mischung erfolgte die Fraktionierung der Probe

über die Sepharose Säule.

4.6.4.2 Free-Flow Elektrophorese als Werkzeug zum Nachweis der Oberflächenmodifikation von Liposomen

Die Free-Flow Elektrophorese (FFE, Octopus PZE, Dr. Weber GmbH) ermöglicht die

Auftrennung unterschiedlichster Proben (Liposomen, Proteine, Zellen) aufgrund ihres

-Potentials. Es handelt sich um ein System, das ohne stationäre Phase auskommt. Die Probe

wird in einen laminar fließenden Puffer, an den ein Hochspannungsfeld angelegt ist,

eingebracht und mit diesem mitgeführt. Auf dem Weg durch die Trennkammer wird das

Untersuchungsmaterial entsprechend seiner Ladung entweder in Richtung Anode oder

Kathode abgelenkt.

Am Ende der Trennkammer befindet sich ein Fraktionssammler, der die gesamte Breite der

Trennkammer in 96 unterschiedliche Kompartimente einteilt. Definitionsgemäß liegt hierbei

die Fraktion 96 direkt an der Kathode, die Fraktion 1 ist zur Anode hin gelegen. Je nach

erwarteter Ladung des Untersuchungsmaterials kann diese entweder in der Mitte der

Trennkammer, an der Anode oder Kathode in den kontinuierlich durch die Trennkammer

gepumpten Trennpuffer eingebracht werden. Durch den kontinuierlichen Pufferstrom ist es

möglich kleine (wenige µg) bis hin zu größeren Probenmengen (einige g) zu fraktionieren.

Oberhalb des Fraktionssammlers sorgt ein dem Trennpuffer entgegenkommender

86 Methoden

Stabilisierungspuffer für ein quantitatives Auffangen der Probe durch den Fraktionssammler.

Auf diese Weise ermöglicht die Apparatur nicht nur eine qualitative sondern auch eine

quantitative Analyse des Probenmaterials. Die mögliche Temperierung der Kammer, die

Variabilität der Geschwindigkeit des Probeneinlasses, der Flussgeschwindigkeit des Puffers

und der angelegten Spannung sorgen für eine hohe Flexibilität der Anlage und erlauben die

Lösung zahlreicher Trennprobleme.

Die Modifizierung von Liposomen mit Proteinen ist in der Regel mit der Veränderung der

elektrophoretischen Mobilität der Vesikel verbunden, da mit der Fixierung von Proteinen, die

durch die Wahl des richtigen Puffers geladen vorliegen, eine Änderung der

Oberflächenladung der Vesikel einhergeht.

Die FFE wurde genutzt um die Kopplung von BSA an EPC/Chol 4/1 Liposomen zu belegen.

Dazu wurde eine BSA Lösung (c = 1 mg/ml, 240 µl, BBS 100, pH 8,4, Zusatz von 10 kBq 125I markiertem BSA) mit BPS-NHS in EtOH (10 µl, 1,216 µmol (2,28 mg) BPS-NHS

entsprechend 7,5 mol% des GL) versetzt. Nach Inkubation über Nacht erfolgte die Zugabe

von 750 µl Liposomen (20 mM, 80 nm Extrusion) und der zweite Inkubationschritt (4 h).

Zwischenzeitlich wurden 96 Röhrchen für den FFE-Fraktionssammler ausgewogen. Nach der

Abb. 4-8: Schematische Darstellung der Octopus PZE der Firma Dr. Weber GmbH

Trennpuffer

Gegenpuffer

Probeneinlässe Probeneinlass

Trennpuffereinlass

Stabilisierungs-puffer

Fraktionierung

Methoden 87

Inkubation wurden innerhalb von 2 min 199 µg des Ansatzes über den an der Kathode

gelegenen Probeneinlass in das System eingebracht. Das genaue Gewicht der Probenmenge

wurde durch Differenzwägung des Reaktionsgefäßes vor und nach Probenapplikation

ermittelt.

Nachfolgend sind die verwendeten Puffer aufgeführt (für genaue Zusammensetzung vgl.

Tabelle 3-5):

Trennpuffer: Phosphatpuffer 5 mM, pH 7,0

Stabilisierungspuffer: Phosphatpuffer 50 mM, pH 7,0

Elektrodenpuffer: Phosphatpuffer 125 mM, pH 7,0

Die Spannung lag bei 600 V (entsprechend einer elektrischen Feldstärke von 75 V/cm), die

Trennpufferförderrate bei 330 ml/h.

Nach erfolgter Fraktionierung wurden die gesammelten Fraktionen ausgewogen und je 200 µl

in LSC-Fläschen eingewogen und im Betacounter vermessen. Der Rest der Fraktionen wurde

mit der PCS unter Verwendung der 400 nm Blende unter Standardbedingungen auf

Streulichtimpulsanzahl (kcps) vermessen.

Als Vergleichsprobe diente eine nicht modifizierte Liposomen-Präparation. Da in diesem Fall

keine Bilanzierung von radioaktiv markiertem Material nötig war, konnte auf das Auswiegen

der Fraktionsröhrchen verzichtet werden.

Die Versuchsreihe wurde unter Anleitung von J. Momm durchgeführt in dessen Arbeit eine

genauerer Beschreibung der Inbetriebnahme, Validierung und Reinigung der Anlage

beschrieben ist (Momm 2004). Eine ausführliche Diskussion des analytischen und

präparativen Potentials der FFE im liposomalen Anwendungsbereich stellt die Doktorarbeit

von T. Dern (Dern 2002) dar.

4.6.4.3 Kopplungseffizienz in Abhängigkeit von Lipidzusammensetzung und BSA-Konzentration

Zur Untersuchung der Eignung von BPS-TRE zur Kopplung von Proteinen an liposomale

Oberflächen wurden die drei Standardliposomenpräparationen EPC/Chol 7/3, HSPC/Chol und

HSPC/Chol/MPEG in HEPES/NaCl Puffer (20 mM/130 mM, pH 7,4) hergestellt. Die

88 Methoden

Extrusion erfolgte durch Polycarbonatmembranen mit 80 nm Poren, wodurch Liposomen mit

einem hydrodynamischen Durchmesser von 110 - 125 nm resultierten.

10 µl einer methanolischen BPS-TRE Lösung (entsprechend 0,915 mg, 0,486 µmol des

aktivierten PEG-Sterols) wurden in einem 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß bis zur Trockene

eingedampft (vgl. 4.6.1). Anschließend erfolgte die Zugabe von 150 µl der verschiedenen

BSA Lösung in BBS 100 (c = 1 - 5 mg/ml). Dies entsprach 7,5 mol% des für den zweiten

Inkubationsschritt zugegebenen GL.

Um das Ablösen des BPS-TRE Films von der Gefäßwand zu beschleunigen wurde der Ansatz

kurz in ein Ultraschallbad eingebracht und gevortext. Nach Inkubation über Nacht (RT)

erfolgte die Zugabe der verschiedenen Liposomenpräparationen (300 µl, 20 mM), 4 h weitere

Inkubation bei RT und die Fraktionierung der Ansätze über GPC (Elutionspuffer entsprach

dem Puffer bei der Liposomenherstellung) mit Quantifizierung des liposomal gebunden

Proteinanteils über LSC.

4.6.4.4 Untersuchung der Größenentwicklung während des zweiten Inkubationsschrittes

Die Kopplung von BSA mit aktivierten Ankern ist aufgrund des im Überschuss eingesetzten

Lipidankers sowie der Multireaktivität des Proteins mit der mehrfachen Modifizierung des

Moleküls verbunden. Die Einlagerung aller an einem Protein angebrachten Ankermoleküle in

dasselbe Liposom ist jedoch äußerst unwahrscheinlich. Daher ist mit einer Quervernetzung

der Liposomen zu rechnen, bei der das Protein die Rolle des Cross-Linkers übernimmt.

Parallel zu den Untersuchungen zur Kopplungseffizienz in Abhängigkeit der

Lipidzusammensetzung und des Proteingehalts (4.6.4.3) wurde daher ein Teil der Proben

mittels PCS auf Größenzunahme untersucht (vgl. 4.4.1). Dazu wurden 4 bzw. 12 h nach der

Zugabe der Liposomen Proben genommen und mit filtriertem (Porengröße 0,22 μm) HBS

verdünnt.

In einer anderen Versuchsreihe zur Größenentwicklung der BSA-modifizierten Liposomen

wurde von der EPC/Chol 4/1 Kombination ausgegangen. Auch in diesem Fall betrug der

Anteil an BPS-TRE 7,5 mol% am GL und wurde in 25 µl ethanolische Lösung eingesetzt.

Nach der Inkubation (RT) von 325 µl BSA in BBS 650 (1 mg/ml) mit dem aktivierten Lipid

über Nacht erfolgte die Zugabe von 650 µl 25 mM Liposomen, die entweder als

Methoden 89

konventionelle oder sterisch stabilisierte Liposomen vorlagen. Der PEG-Schutz wurde dabei

entweder durch 5 mol% MPEG2000-DSPE oder 7,5 mol% BPS, die während der Herstellung

der Liposomen mit in den Lipidfilm eingearbeitet wurden, realisiert.

4.6.4.5 Stabilität der Verankerung in Anwesenheit von humanem Serum

Plasma- und Serumkomponenten haben einen entscheidenden Einfluss auf die strukturelle

Integrität von Liposomen. Dies gilt auch für oberflächenmodifizierte Liposomen, bei denen

der Ligand eventuell durch Serum extrahiert werden könnte. Untersuchungen der Stabilität

des Ligand-Liposom-Komplexes in Anwesenheit von humanem Serum machen eine erste

Abschätzung der Stabilität in systemischer Zirkulation möglich.

Ein Hinweis auf die Stabilität der Verankerung des Modellproteins BSA über BPS-TRE in der

Liposomenmembran wurde durch ein Rechromatographieverfahren erhalten.

Zunächst erfolgte die Modifikation von EPC/Chol 7/3, HSPC/Chol und HSPC/Chol/MPEG

Liposomen unter den unter 4.6.4.3 beschriebenen Bedingungen. Als BSA-Konzentration

wurde 3 mg/ml angesetzt. Ein Teil des Ansatzes wurde nach erfolgter Kopplung des Proteins

auf die Kopplungseffizienz untersucht.

Eine zweite Probe desselben Ansatzes diente der Abtrennung des freien Proteinanteils durch

einen GPC Schritt. Die vereinigten Liposomenfraktionen wurden 1:1 mit humanem Serum

verdünnt und nach 20 h bei 37 °C im Wasserbad (Haake N2) über GPC auf neu auftretendes

freies Protein geprüft.

Als Kontrolle wurde einem Ansatz nach der Abtrennung des freien Proteins durch die erste

Chromatographie 125I-markiertes BSA zugemischt, um auf eine eventuelle Koelution von

abgespaltenem BSA, provoziert durch die Anwesenheit des Serums (z.B. Bildung von

größeren Aggregaten, Anlagerung des freien BSA an Serumlipoproteine) zu prüfen. Bei

sämtlichen Chromatographieschritten diente Sepharose CL-4B als Trennmedium. Als

Elutionspuffer wurde HBS verwendet.

90 Methoden

4.6.5 Versuche unter Verwendung BPS-NHS

4.6.5.1 Überprüfung der Eignung von BPS-NHS zur Kopplung von BSA an Liposomen

Zur Überprüfung der Eignung von BPS-NHS zur Kopplung von Proteinen an die

Liposomenoberfläche wurde entsprechend 4.6.3.1 vorgegangen. Der wichtigste Unterschied

bestand in der Verwendung von PBS statt BBS, da die Kopplung über NHS-aktivierte Lipide

auch in neutralem pH-Bereich vorgenommen werden kann.

Die Kopplung erfolgte durch einen ersten Inkubationsschritt von 325 µl der BSA Lösung

(1 mg/ml) mit 25 µl ethanolischer BPS-NHS Lösung (7,5 mol% des GL). Anschließend

wurde über Nacht inkubiert bevor am nächsten Tag die Liposomen (EPC/Chol 7/3 oder

HSPC/Chol 20 mM. 650 µl) zugesetzt wurden. Die Ermittlung des prozentual gebundenen

BSA Anteils erfolgte wie in 4.6.2.2 beschrieben.

4.6.5.2 Vergleich der Kopplung unter Verwendung verschiedener aktivierter Lipide in Abhängigkeit der Temperatur des zweiten Inkubationsschritts

Auch diese Versuchsreihe wurde unter Beibehaltung des Standardkopplungsprotokolls

durchgeführt. Es fanden je 5 mol% (in Bezug auf das GL nach Zugabe der Liposomen im

zweiten Inkubationsschritt) BPS-TRE, BPS-NHS und NHS-PEG-DSPE Anwendung, bevor

HSPC/Chol und EPC/Chol 4/1 Liposomen zu dem hydrophobisierten BSA gegeben wurden.

Die BSA Konzentration betrug 1 mg/ml (250 µl), die aktivierten Lipide waren in 15 µl EtOH

gelöst, das Volumen der Liposomendispersionen betrug 500 µl bei einer Lipidkonzentration

von 20 mM. Bei Kopplungen mit den NHS-aktivierten Lipiden wurde in PBS gearbeitet, die

Kopplung mittels BPS-TRE verlief wie üblich in BBS bei einem pH-Wert von 8,4.

Nach Zugabe der Liposomendispersionen wurden die Ansätze, bei denen NHS-PEG-DSPE

eingesetzt wurde, geteilt. Die erste Hälfte wurde nach einer Inkubation über Nacht, die zweite

nach einer Stunde Inkubation im Wasserbad bei 60 °C über eine GPC-Säule fraktioniert.

Methoden 91

4.7 Abschätzung der Ligandenzahl pro Liposom

Um die Anzahl von BSA Molekülen pro Liposom grob berechnen zu können wurde wie folgt

vorgegangen. Zunächst erfolgte die Berechnung der Gesamtfläche des Lipidbilayers nach:

LipidLipidL cV5,0FNA Gleichung 4-11

Dabei ist:

N Avogardozahl 6,023 · 1023 [mol-1]

FL durchschnittliche Fläche eines Lipids in der Membran 0,51 [nm²]

VLipid Volumen der eingesetzten Liposomendispersion [l]

cLipid Konzentration der eingesetzten Liposomendispersion [mol/l]

Das Produkt der Avogardo-Konstante, der durchschnittlichen Fläche eines Lipidmoleküls im

Bilayer, das vereinfachend für alle Kombinationen wenig fluider Lipide gleich 0,51 [nm²]

gesetzt wurde und dem Faktor 0,5, der der Tatsache Rechnung trägt, dass sich die PL zu

einem Bilayer anordnen, liefert den konstanten Faktor 1,536 · 1023 mit der Einheit [nm²/mol].

Geht man davon aus, dass unilamellare Liposomen vorliegen, gilt für die mittlere Lipidfläche

AL eines Liposoms die Beziehung (Schubert et al. 1991):

2L )5,2r(4A Gleichung 4-12

AL Fläche eines Liposoms [nm²]

r Radius eines Liposoms [nm].

Zur Berechnung der Fläche im Inneren des Bilayers wurde die halbe Membrandicke von

2,5 nm angenommen.

92 Methoden

Die Zahl der Liposomen pro Ansatz ergibt sich somit zu:

LAA

Liposoms eines Bilayers des FlächeyersGesamtbila des Flächen Gleichung 4-13

Über die Molekularmasse des BSA (67 000 g/mol) und die prozentuale Kopplungseffizienz

lässt sich so die Anzahl von Proteinen an der liposomalen Oberfläche abschätzen.

Ergebnisse und Diskussion 93

5 Ergebnisse und Diskussion

Gegenstand der praktischen Arbeiten war die Evaluierung der Eignung von PEGylierten

Sterolen zur Funktionalisierung von PL-Vesikeln. Von Interesse war zum einen das

Einlagerungsverhalten der PEG-Sterole in liposomale Membranen, zum anderen das

Kopplungspotential chemisch aktivierter, aminoreaktiver Derivate zur Fixierung von

Proteinen an Liposomen. Das Einlagerungsverhalten wurde im Hinblick auf Transferraten

und Geschwindigkeiten (vgl. 5.3.2), Membrandefekte während der Einlagerung der PEG-

Sterole unterhalb (vgl. 5.3.4.1) und oberhalb (vgl. 5.3.4.2) der CMC charakterisiert. ITC-

Untersuchungen (vgl. 5.3.3) gaben Auskunft über das Solubilisierungsverhalten und den

lipidnormierten Verteilungskoeffizienten der PEG-Sterole. Durch Untersuchungen des

Kopplungspotentials (vgl. 5.4) der aktivierten Lipide in Abhängigkeit der

Lipidzusammensetzung, der Proteinkonzentration, des pH-Wertes, der Dauer der beiden

Inkubationsschritte und der Stoffmenge der Substanzen wurde eine Zwei-Schritt-

Kopplungsmethode (vgl. 4.6.1) etabliert und optimiert. Weitere Versuchsreihen beschäftigten

sich mit der Stabilität der Fixierung des Proteins an der Liposomenoberfläche (vgl. 5.4.2.5)

und Größenwachstumsphänomenen während der Einlagerung des hydrophobisierten Proteins

in die Vesikeloberfläche (vgl. 5.4.2.6).

5.1 Interpretation der 1H NMR Spektren

5.1.1 Tresyliertes BPS

Die Integration der Flächen der relevanten Peaks erlaubt eine Abschätzung des Umsatzgrades

der distalen Hydroxylgruppe der ethoxylierten Sojasterole mit dem Aktivierungsreagenz. Das

in Abb. 5-1 mit A gekennzeichnete Signal repräsentiert das olefinische Proton an C6 des

Sterolgerüstes. Trotz der Inhomogenität des hydrophoben Molekülteils aufgrund des

natürlichen Ursprungs der Substanzen ist dieses Proton in jedem Molekül vorhanden, da die

Variationen des Ankers in der Seitenkette liegt (vgl. Abb. 4-1; olefinische Protonen der

Seitenkette liegen zwischen 4,95 und 5,25 ppm). Bei vollständiger Umsetzung der distalen

Hydroxylgruppe mit Tresylchlorid ist die Peakfläche der Protonen in der

Trifluorethansulfonsäuregruppe (C) und der zum Sulfonsäurester gelegenen Methylengruppe

(B) doppelt so groß wie das des C6 Protons (A).

94 Ergebnisse und Diskussion

5.1.2 N-Hydroxysuccinimid aktiviertes BPS

Das Massenspektrum (vgl. Abb. 5-2 (1)) verdeutlicht die Polydispersität der PEG-Kette;

entsprechend der Molekularmasse einer EO-Einheit differieren die einzelnen Hauptpeaks um

44 Masseneinheiten, die Inhomogenität des Sterolanker spiegelt sich in der Unterverteilung

der Massen wieder.

Entsprechend der Reaktion mit Tresylchlorid muss auch bei der Umsetzung des BPS mit

Disuccinimidylcarbonat (DSC) die gleiche Methylengruppe eine doppelt so große Fläche

aufweisen wie das C6 Proton. Die vier Protonen der Succinimidylabgangsgruppe liegen bei

2,8 ppm (C). Dieses Signal wies bei allen Syntheseansätzen deutlich zu hohe Peakflächen

(4,5 - 5,5) auf und ist auf einen Restanteil an N-Hydroxysuccinimid zurückzuführen. Dies

stellt auch das bei der Kopplung entstehende Nebenprodukt dar und hat keinen störenden

Einfluss. Bei der Aufarbeitung der Ansätze über die GPC Säule wird es von den

oberflächenmodifizierten Liposomen abgetrennt. Die Umsetzung der PEG-Hydroxylfunktion

mit DSC war quantitativ (vgl. Abb. 5-2 (2)).

ppm (t1) 4.505.00

1.00

2.00

2.00

ppm (t1)1.02.03.04.05.0

OO

S

O

OF

FF

n=30

A

B

C

A

B C

Abb. 5-1: 1H NMR Spektrum von BPS-TRE

Ergebnisse und Diskussion 95

m/z1200 2600

Inte

nsity

200

0

1854

.1

(1)

(2)

ppm (f1) 4.505.00

1.00

2.00

ppm (f1)1.02.03.04.05.0O

OO

ON

O

O

n=30

A B

B A C

C

Abb. 5-2: MALDI-MS (1) und 1H NMR-Spektrum (2) von BPS-NHS

96 Ergebnisse und Diskussion

5.2 CMC der PEG-Lipide

Eine Reihe von Versuchen beschäftigte sich mit dem Freisetzungsverhalten von Calcein aus

dem liposomalen Innenraum. Es wurde erwartet, dass die Freisetzung des Markers abhängig

von der Konzentration des in der Liposomendispersion befindlichen PEG-Lipids ist.

Unterhalb der CMC kann die Einlagerung des Monomers in die Liposomenmembran zu

Membranstörungen führen, aus denen eine Erhöhung der Permeabilität der Membran

resultieren kann. Oberhalb der CMC könnten zusätzlich Solubilisierungseffekte zu einer

gesteigerten Calcein-Freisetzung führen.

Für beide relevanten Substanzen (BPS-30 und MPEG2000-DSPE) finden sich CMC-Angaben

in der Literatur. Die erste Quelle gibt für BPS-30 einen Wert von 3 µM an (Ermittlung durch

Messung der Oberflächenspannung mittels Wilhelmy-Plate (Folmer & Svensson 1999)). Für

MPEG2000-DSPE finden sich unterschiedliche Angaben. Während Ishida (Ishida et al. 1999)

auf Basis von Trübungsmessungsdaten bei 240 nm eine CMC von 2,3 µM angibt, ermitteln

Sou und Mitarbeiter durch DPH Fluoreszenzmessung eine CMC von 9 µM (Sou et al. 2000).

Da in dieser Arbeit mit anderen Puffersystemen gearbeitet wurde, das BPS-30 vor

Verwendung vom freien PEG befreit und im Falle des MPEG2000-DSPEs eine andere

0,1 1 10

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

BPS-30 MPEG2000-DSPE

CMC MPEG2000

-DSPE3,2 µM

CMC BPS-30 4,8 µM

Fluo

resz

enzi

nten

sitä

t

c PEG-Lipid [µM]

Abb. 5-3: Darstellung der Fluoreszenz einer DPH Dispersion in Abhängigkeit der Konzentration von MPEG2000-DSPE und BPS-30

Ergebnisse und Diskussion 97

Bezugsquelle genutzt wurde, mussten eigene CMC Bestimmungen durchgeführt werden.

Der Anstieg der Fluoreszenz oberhalb der CMC ist auf die beginnende Solubilisierung des

Fluoreszenzfarbstoffes zurückzuführen, die erst bei Auftreten von Mizellen, also oberhalb der

CMC möglich ist. Die ermittelten CMC-Werte liegen mit Werten von 3,2 µM für

MPEG2000-DSPE und 4,8 µM in derselben Größenordnung wie die Literaturwerte.

5.3 Einlagerungsverhalten von PEG-Lipiden in präformulierte Liposomen

Die Modifikation präformulierter Liposomen bringt gegenüber den konventionellen

Targetierungstechniken (vgl. 1.2.2.2) einige Vorteile mit sich. Zum einen ermöglicht sie die

Funktionalisierung bereits im Handel befindlicher liposomaler Zubereitungen, um diese den

experimentellen oder therapeutischen Erfordernissen anzupassen, zum anderen vermeidet sie

mögliche Interaktionen von Wirkstoffen und/oder Membrankomponenten mit den zur

Kopplung der Liganden erforderlichen chemisch aktivierten Lipiden. Ein weiterer Vorteil

liegt in der exklusiven Einlagerung des PEG-Lipids in den äußeren Monolayer, so dass auf

diese Weise der Innenraum der Liposomen für die Aufnahme zu verkapselnder Wirkstoffe

nicht eingeschränkt wird (Nicholas et al. 2000).

Von besonderem Interesse ist hierbei die Einlagerung bei RT. Sie ermöglicht eine schonende

Modifikation der Liposomen ohne die liposomal assoziierten Wirkstoffe oder Liganden

thermisch zu stressen. Die Literatur kennt bislang keine Verfahren, die die Einlagerung von

PEG-Lipid-Derivaten bei RT ermöglicht. Die Post Insertion Technique (PIT) nach Ishida

(Ishida et al. 1999) und Zalpisky (Zalipsky et al. 1997) erlaubt zwar die nachträgliche

Implementierung von DSPE-PEG-Liganden aus mizellarer Phase, doch ist die Methode nicht

universell einsetzbar (vgl. 1.2.2.1).

Zalipsky beschreibt die Einlagerung von Kohlenhydrat- bzw. Peptid-Liganden - also

strukturell relativ kleinen Liganden - in präformulierte Liposomen bei 37 °C (Zalipsky et al.

1997). Die Modifizierung HSPC-basierender Liposomen mit größeren Liganden wie

Antikörpern ist nur bei deutlich höheren Temperaturen (60 °C) möglich. Beinhalten die zu

funktionalisierenden Liposomen bereits ein PEG-Lipid-Derivat in höherer Konzentration (wie

es zum Beispiel bei Doxil® bzw. Caelyx® gegeben ist) ist die Anzahl der über die PIT

implementierbarer Liganden zu klein, um ein effizientes Targeting zu gewährleisten (Ishida et

al. 1999).

98 Ergebnisse und Diskussion

Die selbständige Einlagerung der Sojasterole in bestehende Liposomenmembranen ist die

Grundvorrausetzung für ihren möglichen Einsatz zur Modifikation von präformulierten

liposomalen Zubereitungen. Dabei ist nicht nur ihr Einsatz als mögliche Anker zur Fixierung

von “Homing Devices“ von Interesse, sondern auch ihre Verwendbarkeit zur Herstellung von

Stealth®-Liposomen aus einer konventionellen Vorstufe. Daher wurde eine Reihe von

Experimenten durchgeführt, um das Einlagerungsverhalten der ethoxylierten Sojasterole in

Lipidmembranen unterschiedlicher Komposition bei RT näher zu charakterisieren. Dabei

orientierten sich die gewählten Lipidkompositionen am FDA-Draft

(http 2) für Doxil® (HSPC/Chol/MPEG 2/1/0,16 mol/mol/mol) und an der für Myocet®

(EPC/Chol 7/3 mol/mol) angegebenen Lipidmischung. Als dritte Liposomenvariante wurden

HSPC/Chol (2/1 mol/mol) untersucht.

5.3.1 Trennung von mizellarem und liposomal assoziiertem PEG-Lipid über GPC

Für eine saubere NMR-Analytik zur Einlagerungskinetik der PEG-Lipidderivate in die

verschiedenen Liposomenpräparationen ist eine Trennung von gebundenem und freiem PEG-

Lipid nötig. Da die NMR Versuche jedoch Probenmassen im mg-Bereich benötigten wurde in

Konzentrationsbereichen weit oberhalb der CMC gearbeitet.

In der Literatur lassen sich für MPEG2000-DSPE-Mizellen Größenangaben von 30-50 nm

(Ishida et al. 1999) und für mizellare Strukturen der Sojasterol-Ethoxylate mit 30 EO-

Einheiten von ca. 7 nm finden (Folmer & Svensson 1999). Daher war insbesondere bei den

MPEG2000-DSPE-Derivaten eine Koelution von Liposomen und Mizellen im

Ausschlussvolumen zu befürchten.

Die DC Analytik der über die GPC gewonnenen Fraktionen beweist, dass eine Trennung der

Mizellen von Liposomen möglich ist. Wie nach der Literatur zu erwarten, trennen sich die

BPS-Mizellen aufgrund ihrer geringen Größe gut von den Liposomen ab.

Abb. 5-4 A zeigt, dass zwischen der für die NMR Quantifizierung verwendeten

liposomenhaltigen Hauptfraktion (Fraktion 5) und dem ersten freien PEG sechs Fraktionen (je

ca. 500 l) liegen. Außerdem wird deutlich, dass bereits eine sehr kurze Inkubationszeit

genügt, um eine signifikante BPS-Menge liposomal zu binden. Wie am Cholesterol-Fleck

(größter Rf-Wert) zu erkennen, schleppt sich ein Teil der Liposomen bis in die Fraktionen des

freien PEG hinein. Da es sich bei der quantitativen NMR Analytik jedoch um ein

Relativverfahren handelt und davon auszugehen ist, dass sich früh und spät eluierte

Ergebnisse und Diskussion 99

Liposomen in ihrem PEG-Anteil nicht unterscheiden, wurden lediglich die Hauptfraktionen

zur Quantifizierung genutzt.

Gleiches gilt für die MPEG2000-DSPE-Versuche, bei denen eine Trennung der beiden PEG-

Lipid-Spezies schwieriger war. Da sich das DSPE-PEG nicht mit Schwefelsäure visualisieren

lässt wurde hier DR zur Detektion genutzt, mit dem sich die Lipide nur schwer nachweisen

lassen. Dennoch zeigt Abb. 5-4 B deutlich, dass die NMR Probe (Fraktion 3), die die

Liposomenhauptfraktion darstellt, kein MPEG2000-DSPE enthält. Dass die Trennung im Falle

des DSPE-PEG erfolgreich war zeigen auch die Resultate der NMR-Quantifizierung.

5.3.2 Einlagerungsgeschwindigkeit und Transferraten der PEG-Lipide

Die Einlagerungsgeschwindigkeit der PEG-Sterole ist von Interesse um die Zeitspanne

abschätzen zu können, die nötig ist, bis sich ein Maximum der PEG-Lipide in die Membran

eingelagert hat.

Abb. 5-5 zeigt die zur Berechnung des PEG-Lipid Anteils der verschiedenen Liposomen

A B

Abb. 5-4: DC Kontrolle der Separation von freiem und liposomal assoziiertem PEG-Lipid

A: 1 min Inkubation, EPC/Chol 7/3 Liposomen, BPS, H2SO4-Detektion

B: 1 min Inkubation, EPC/Chol 7/3 Liposomen, MPEG2000-DSPE, Dragendorff-Detektion

L: Kontroll-Liposomen

B: BPS-Kontrolle

M: MPEG2000-DSPE

3-19: Fraktionsnummern

100 Ergebnisse und Diskussion

benutzten Kalibriergeraden. Mit Regressionskoeffizienten von R² > 0,999 ließ sich die

Einlagerung der PEG-Lipide in alle Präparationen hinreichend genau verfolgen.

Da die PEG-Lipide als Membrankomponenten eingesetzt werden, werden sie in der Arbeit

auch als Teil des Gesamtlipids (GL) betrachtet. Damit ergibt sich bei einer

Kalibrationsfunktion jedoch mit steigendem Anteil an PEG-Lipid ein geringerer Anteil an PL

und somit kein linearer Zusammenhang zwischen Peakfläche und mol% PEG-Lipid.

Um dennoch eine leicht auswertbare Kalibrationsgerade zu erhalten, wurde der PL-Gehalt der

einzelnen Kalibratoren konstant gehalten und mit steigenden PEG-Lipid-Mengen versetzt. In

Abb. 5-5 ist deshalb auf der x-Achse statt mol% der prozentuale Anteil der PEG-Lipide in

Bezug auf die übrigen Membranbestandteile exklusive dem PEG-Lipid (mol%exk) selbst

angegeben.

Die aus den Peakflächenverhältnissen der Proben über die Kalibrationsfunktion erhaltenen

Werte sind damit ebenso zu verstehen. Die Umrechnung der bei der Auswertung der Proben

gelieferten Ergebnisse in mol%exk lassen sich durch eine einfache Beziehung in mol%

überführen. Es gilt:

Abb. 5-5: Kalibrationsfunktionen zur Bestimmung des PEG-Lipid Anteils liposomaler Membranen

durchgezogene Linie:

BPS Kombinationen

━■━ EPC/Chol 7/3

━●━ HSPC/Chol

━▲━ HSPC/Chol/MPEG

gestrichelte Linie:

MPEG Kombinationen

┄□┄ EPC/Chol 7/3

┄○┄ HSPC/Chol

0 2 4 6 8 10 120,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,4

2,8

3,2

3,6

mol PEG-Lipid / mol andere Membranlipide [%]

Pea

kflä

chen

verh

ältn

is

PE

G-P

roto

nen/

Cho

lin-P

roto

nen

Ergebnisse und Diskussion 101

%mol%mol100

%mol100exk

exk

Gleichung 5-1

exk%mol%mol100

%mol100

Gleichung 5-2

Aus dem gezeigten linearen Zusammenhang ergibt sich die Möglichkeit, bei künftigen

Versuchen eine Einpunkt-Kalibrierung mit einem 100% Wert (nicht gesäulter Probenanteil)

vorzunehmen (Sou et al. 2000).

Außerdem lässt sich bei ermitteltem PL Gehalt und bekannter Länge des PEG-Anteils die

Kalibrationsfunktion leicht berechnen. Da der ermittelte PL-Gehalt als interner Standard

fungiert, kann auch die durchschnittliche EO-Einheiten Anzahl eines PEG-Derivates auf diese

Art ermittelt werden. Die beiden verwendeten PEG-Lipide haben eine deklarierte EO Anzahl

von 30 für BPS-30 und 45 für MPEG2000-DSPE. Auf Grundlage dieser PEG-Kettenlängen

Abb. 5-6: Berechnete und praktisch ermittelte Kalibrationsfunktion zur Bestimmung des BPS-Anteils in EPC/Chol 7/3 Liposomen

durchgezogene Linie:

━■━ berechnete

Kalibrationsfunktion

gestrichelte Linie:

┄□┄ gefundene

Kalibrationsfunktion

0 2 4 6 8 100,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

Peak

fläch

enve

rhäl

tnis

mol%

102 Ergebnisse und Diskussion

ergibt sich nach Korrektur des Lipidgehaltes der Kalibratoren durch die Bartlett-

Phosphatbestimmung die in Abb. 5-6 exemplarisch für die BPS-EPC/Chol-7/3

Kombinationen gezeigte gute Übereinstimmung der berechneten und experimentell

gefundenen Kalibrationsfunktion.

Abb. 5-7 zeigt die Einlagerungkinetik von BPS in Liposomen verschiedener Kompositionen.

Angeboten wurden 7,5 mol%, die sich im Falle der EPC/Chol 7/3 Liposomen zu ca. 90% in

die Liposomen einlagerten. Bei den beiden bei RT im Gelzustand vorliegenden HSPC-

basierenden Liposomen zeigte sich mit rund 30 % Einbau des angebotenen PEG-Lipids bei

den MPEG2000-DSPE-haltigen Liposomen und ca. 40 % bei den nicht PEGylierten Liposomen

ein deutlicher Unterschied zu den fluiden EPC-Membranen. Die

Einlagerungsgeschwindigkeit ist jedoch weitgehend unabhängig von der

Membrankomposition. Der Anteil an PEG-Lipid bei maximaler Sättigung der Membran

ergibt sich zu 6,75 mol% für die EPC/Chol 7/3-, 3,2 mol% für die HSPC/Chol- und 2,4 mol%

für die HSPC/Chol/MPEG-Liposomen.

Die bei der Versuchsreihe verwendeten Liposomen wiesen eine Größe von 110 - 120 nm

Durchmesser auf. Bei dieser Größe kann in guter Näherung von der gleichen Anzahl von

Lipidmolekülen im äußeren und inneren Monolayer ausgegangen werden. Aufgrund der

großen hydrophilen Reste der PEG-Lipide ist ein Flip-Flop ausgeschlossen und somit nur der

äußere Layer zugänglich, so dass sich in Bezug auf diesen ein doppelt so hoher prozentualer

PEG-Lipid-Anteil ergibt. Die differierenden Insertionsraten bei unterschiedlicher

Lipidkomposition lassen sich z.T. über die unterschiedlichen Phasenzustände der Membran

erklären. Die fluide EPC-Membran erlaubt offensichtlich einen höheren Einlagerungsanteil

als die rigiden HSPC-Membranen. Interessant ist die Tatsache, dass trotz des PEG-Lipid

Anteils der HSPC/Chol/MPEG Liposomen erhebliche weitere Einlagerung eines PEG-Lipids,

wenn auch mit geringerer Kettenlänge, möglich ist.

Abb. 5-8 zeigt die Ergebnisse der gleichen Untersuchungen mit MPEG2000-DSPE als PEG-

Lipid. Im Gegensatz zum BPS ist nach 4 Stunden Inkubation praktisch keine Einlagerung des

Derivates in die Liposomenmembranen erkennbar. Auch in der fluiden EPC Membran waren

über den beobachteten Zeitraum lediglich 3% des zupipettierten MPEG2000-DSPE liposomal

nachweisbar. Angesichts der langsamen Einlagerung des MPEG2000-DSPE in die beiden

untersuchten Liposomenpopulationen wurde auf eine Versuchsreihe mit HSPC/Chol/MPEG-

Liposomen verzichtet.

Ergebnisse und Diskussion 103

In der Literatur wird die Einlagerung von DSPE-PEG-Lipiden in Lipidmembranen

beschrieben. Diese führen jedoch nur bei Erhöhung der Temperatur auf 37 °C oder 60 °C

(Uster et al. 1996; Zalipsky et al. 1997; Sou et al. 2000; Iden & Allen 2001; Allen et al.

2002a; Moreira et al. 2002) zu nennenswerten Insertionsraten. Iden et al.(Iden & Allen 2001)

bringen die langsame Inkorporationskinetik der DSPE-PEG-Lipide mit der Tc der

untersuchten Membranen (HSPC/Chol 2/1 mol/mol bzw. Doxil®-Komposition) in

Zusammenhang und erhitzen daher zur Inkorporation von PEG-Lipid-Ligand-Konjugaten in

präformulierte Liposomen eine Stunde auf 60 °C.

Da die Transferrate in die bei RT fluiden Lipidmembranen (EPC/Chol 7/3, Abb. 5-8) keinen

signifikanten Unterschied zu der in die HSPC/Chol Membranen aufweist, ist der beschriebene

Modifikationserfolg bei 60 °C kaum mit dem Phasenzustand der Membran in Zusammenhang

zu bringen.

Die bei erhöhter Temperatur erfolgreiche Einlagerung der PE-PEG-Derivate in

Lipidmembranen kann vielleicht auf eine verringerte Stabilität der Mizellen bei höheren

Temperaturen zurückgeführt werden. DPH Anisotropiemessungen zeigten eine starke

Temperaturabhängigkeit der Beweglichkeit der Alkylseitenketten (Sou et al. 2000). Mit

steigender Temperatur wurde eine deutliche Verringerung der DPH-Anisotropie beobachtet,

die sich aus der Reduktion der hydrophoben Wechselwirkungen der Alkylketten

untereinander und verringerte Stabilität der Mizellen erklären lässt.

Ishida et al gehen bei der PIT von Mizellen der Komposition MPEG2000-DSPE und

MAL-PEG2000-DSPE im molaren Verhältnis von 4/1 aus, um Liposomen mit IgG zu

modifizieren. Zur Gewährleistung einer für Targetierungsversuche ausreichenden

Antikörperlast sind bei diesem Vorgehen 60 °C nötig. Dagegen beschreiben Zalipsky et al.

(1997) und Saul et al. (2003) ein erfolgreiches Targeting nach Inkubation von DSPE-PEG-

Ligand-Mizellen mit Liposomen bei 37 °C. Der Ligand war hier jeweils eine strukturell

kleines Molekül (Folat, Oligosaccharide, Peptide). Neben der unterschiedlichen Größe als

möglicher Ursache für das differierende Einlagerungsverhalten sollte auch über die

unterschiedliche Stabilität der Mizellen als möglichem Grund für dieses Phänomen

nachgedacht werden. Bei den von Zalipsky und Saul verwendeten DSPE-PEG-Ligand-

Derivaten handelt es sich um durch in einem vorgeschalteten Syntheseschritt stöchiometrisch

umgesetzte Produkte, bei denen die Endstruktur aller Moleküle durch die Einführung der

Liganden signifikant von der des grundlegenden PEG-PE abweicht. Es kann als davon

ausgegangen werden, dass sich das Phasenverhalten entscheidend geändert haben wird.

104 Ergebnisse und Diskussion

0 50 100 150 200 250

0

20

40

60

80

100

BPS

lipo

som

al a

ssoz

iiert

[%]

Zeit [min]

Lipidkompositionen:

━■━ EPC/Chol 7/3

━●━ HSPC/Chol

━▲━ HSPC/Chol/MPEG

Abb. 5-7: Einlagerung von BPS in Liposomen verschiedener Zusammensetzung als Funktion der Zeit

0 50 100 150 200 250

0

1

2

3

4

5

MPE

G20

00-D

SPE

lipos

omal

ass

oziie

rt [%

]

Zeit [min]

Lipidkompositionen:

━■━ EPC/Chol 7/3

━●━ HSPC/Chol

Abb. 5-8: Einlagerung von MPEG2000-DSPE in Liposomen verschiedener Zusammensetzung als Funktion der Zeit

Ergebnisse und Diskussion 105

Bei der Methode nach Ishida et al. (1999) hingegen wird von bereits bestehenden Mizellen

ausgegangen, bei denen nur einzelne DSPE-PEG Moleküle durch einen Ab modifiziert

werden, so dass die strukturelle Integrität der Mizellen nicht verändert wird.

Mit der nachgewiesenen selbstständigen Einlagerung der PEG-Sterole weist die

Versuchsreihe auf eine universelle Verwendbarkeit der Derivate zur Modifikation

unterschiedlicher präformulierter Liposomen hin.

5.3.3 Ergebnisse der mikrokalorimetrischen Untersuchungen (ITC)

5.3.3.1 Demizellisierungsexperiment

Bei der Injektion von 10 µl der mizellaren Lösung eines Lipids in die ITC-Probenzelle

(Volumen der Zelle ca. 1,4 ml) erfährt die Probe eine mehr als 100-fache Verdünnung. Die

Mizellen lösen sich dabei in Monomere auf. Dieser Prozess ist mit der Freisetzung oder

Aufnahme von Wärme verbunden. Mit ansteigender Detergenzkonzentration in der Zelle

kommt der Demizellisierungsprozess schließlich zum Erliegen, so dass nur noch

Verdünnungswärme zu beobachten ist.

Abb. 5-9: Beispiel für ein Demizellisierungsexperiment aus (Heerklotz & Seelig 2000) ; Titration von C12EO8 in Wasser

106 Ergebnisse und Diskussion

Abb. 5-9 zeigt den klassischen Verlauf eines Demizellisierungsexperimentes. Zu Beginn der

Titration lösen sich die Mizellen vollständig auf (vgl. Abb. 5-9 A). Aus den ersten Injektionen

lässt sich die molare Demizellisierungsenthalpie berechnen, indem das Integral der einzelnen

Injektionswärmen durch die Anzahl der injizierten Mole geteilt wird und die

Verdünnungswärme berücksichtigt wird. Diese ergibt sich aus dem Mittelwert der Wärmen

der letzten Peaks und resultiert aus geringen Temperaturdifferenzen zwischen der injizierten

Probe und dem Inhalt der Probenzelle.

Trägt man die ermittelten molaren Enthalpien gegen die Detergenzkonzentration in der Zelle

auf, ergibt sich ein sigmoider Kurvenverlauf, der den breiten Phasenübergang zwischen

Mizellen und Monomer beschreibt (vgl. Abb. 5-9 B). Die Auftragung der ersten Ableitung der

Kurve erlaubt dann eine präzise Bestimmung der CMC vgl. (Abb. 5-9 C).

Abb. 5-10 zeigt die Rohdaten eines Demizellisierungsversuches unter Verwendung von

BPS-20. Im kleinen Fenster ist die molare Demizellisierungswärme gegen die PEG-Lipid-

Konzentration in der Probenzelle aufgetragen. Obwohl die ersten drei Injektionen zu

Konzentrationen innerhalb der Zelle führen, die unterhalb der mittels der DPH-Methode

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600

-0,25

-0,20

-0,15

-0,10

-0,05

0,00

0,05

0,00 0,05 0,10 0,15

-20,92

-16,74

-12,55

-8,37

-4,18

0,00

4,18

Ges

amtw

ärm

e pr

o In

jekt

ion

[kJ/

mol

]

PEG-Lipid-Konzentration [mM]

µcal

/sec

Zeit [min]

Abb. 5-10: Darstellung der Rohdaten (großer Graph) und der daraus bestimmten molaren Demizellisierungsenthalpien bei Titration von BPS-20 in Puffer

Ergebnisse und Diskussion 107

ermittelten CMC liegen, ist kein Phasenübergang zwischen Mizelle und Monomer zu

erkennen. Dies spricht für einen sukzessiven Abbau der Mizellen über immer kleiner

werdende Strukturen bis hin zum Monomer.

5.3.3.2 Verteilungsexperiment

Beim ITC-Verteilungsexperiment wird eine Vesikeldispersion in eine detergenzhaltige

Lösung injiziert, deren Konzentration unterhalb der CMC liegt. Dadurch wird direkt die

Wärme ermittelt, die bei der Einlagerung des BPS-20 in die Liposomenmembran frei oder

verbraucht wird.

Das Verteilungsexperiment sollte dazu dienen, den Verteilungskoeffizienten K nach

Schurtenberger als ein Maß für die Bindungsstabilität der Verankerung in der

Liposomenmembran zu ermitteln. Dieser sollte in gleicher Weise auch für MPEG2000-DSPE

bestimmt werden. Aufgrund der niedrigen CMC des PE-PEG war die Auswertung der

erhaltenen Signale jedoch noch schwierig.

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20

-1,67

-1,46

-1,26

-1,05

-0,84

-0,63

-0,42

-0,21

0 20 40 60 80 100

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

µcal

/sec

Zeit [min]

Ges

amtw

ärm

e pr

o In

jekt

ion

[kJ/

mol

]

Lipidkonzentration [mM]

Abb. 5-11: Rohdaten und die daraus berechneten molaren Verteilungsenthalpien der individuellen Injektionen in Abhängigkeit der Lipidkonzentration

108 Ergebnisse und Diskussion

Abb. 5-11 zeigt im kleinen Graphen den Verlauf eines Verteilungsexperiments. Die

Lipidkonzentration in der Zelle betrug 4 µM, die der Liposomendispersion 5 mM. Das

Experiment wurde bei RT durchgeführt. Bereits nach der ersten auswertbaren Injektion (der

erste kleine Peak muss ignoriert werden, vgl. 4.5.3.2) ist ein Großteil des zur Verfügung

stehenden PEG-Lipids im Lipidbilayer gebunden. Die folgenden Injektion liefern nur noch

kleine Signale, die letzten Injektionen stellen die durch die Verdünnungswärme resultierenden

Peaks dar. Die durchgezogene Linie repräsentiert den vom Computer nach 4.5.3.2 errechneten

optimalen Fit mit einem lipidnormierten Verteilungskoeffizienten K von 61,3 mmol-1 . Die

gestrichelten Linien stellen berechnete Fitfunktionen dar, bei denen im flacheren Verlauf von

einem K von 50 mmol-1 und im steileren Verlauf von einem K von 500 mmol-1 ausgegangen

wurde. Die Abbildung demonstriert, dass bei K-Werten im Bereich von 50-500 mmol-1 ein

guter Fit nach 4.5.3.2 möglich ist. Da die Methode an ihre Grenzen stößt, ist auf diese Art

keine genauere Aussage möglich. Der tatsächliche K-Wert dürfte allerdings eher oberhalb von

50 mmol-1 liegen, da die Datenpunkte eher eine Abweichung des berechneten K-Werts hin zu

höheren K-Werten erlauben. Wiederholungen der Experimente ergaben konsequenter Weise

auch einen durchschnittlichen K-Wert von ca. 85 mmol-1. Messungen bei 50 °C ergaben

ähnliche Werte.

Auch für MPEG2000-DSPE wurden Verteilungsexperimente durchgeführt. Hier wurden

EPC/Chol 4/1 Liposomen verwendet und die Lösungen wurden auf 60 °C erhitzt bevor mit

den Messungen begonnen werden konnte. Außerdem lag die Konzentration der verwendeten

PEG-PE Lösung oberhalb der selbst ermittelten CMC (vgl. 4.2) jedoch unter dem in (Sou et

al. 2000) angegebenen Wert. Diese Kompromisse mussten eingegangen werden um überhaupt

messbare Signale zu erhalten. Die Ermittlung eines K-Wertes für MPEG2000-DSPE ist nach

dem geschilderten Verfahrens streng genommen nicht zulässig, da die geschilderte

Auswertungsfunktion die durch das PEG-PE in die Membran eingebrachte Ladung nicht

berücksichtigt. Dennoch lieferte das Model einen guten Fit (Chi² < 1000) der Messpunkte.

Die auf Grundlage dieser Versuche ermittelten K-Werte lagen zwischen 60 und 130 mmol-1

und damit in einem ähnlichen Bereich wie die des BPS-20.

5.3.3.3 Solubilisierungsexperimente

Beim einem ITC-Solubilisierungsexperiment wird eine Detergenzlösung zu einer

Vesikelpräparation titriert. Der klassische Verlauf eines Solubilsierungsexperimentes stellt

Ergebnisse und Diskussion 109

sich wie folgt dar: Zu Beginn der Titration lagert sich immer mehr Detergenz in die Membran

ein, wodurch diese mehr und mehr gesättigt wird. Dies führt zu immer geringeren

Wärmemengen währender ersten Injektionen. Ab einer bestimmten Konzentration ist die

Membran gesättigt und die weitere Injektion von Detergenz führt nicht mehr zur Einlagerung

von Detergenz, sondern zur Koexistenz von Liposomen und Mizellen. Der Koexistenzbereich

existiert häufig über einen größeren Bereich und zeigt deutlich andere Wärmen als zu Beginn

der Titration. Ab einer kritischen Konzentration des Detergenz in der Zelle beginnt die

Solubilisierung der Membran, was sich abermals in einer Änderung der Wärmen der

Einzelinjektionen äußert.

Tragt man die beobachteten Wärmen gegen den Molenbruch aus Detergenz und PL Menge

auf, erhält man ein Diagramm, dass die Phasengrenzen des Systems Detergenz/PL

charakterisiert.

Abb. 5-12: Darstellung eines klassischen Solubilisierungsexperiments (A) bzw. deren Umkehrung (B) durch Titration von Mizellen mit PL-Vesikeln aus (Heerklotz & Seelig 2000)

110 Ergebnisse und Diskussion

Abb. 5-12 ist aus (Heerklotz & Seelig 2000) entnommen und demonstriert die Beobachtungen

für Palmitoyl-Oleoylphosphatidycholin (POPC) Vesikel (5 mM), die mit einer 100 mM

C12EO7 Lösung titriert wurden (A). Die einzelnen Phasen sind gut zu unterscheiden. Auch die

umgekehrte Vorgehensweise ist möglich wie in Teil B der Abbildung zu sehen. In diesem

Fall wurde von Mizellen (4,9 mM C12EO7) ausgegangen, zu denen eine POPC-

Vesikeldispersion (15 mM) titriert wurde. Beide Experimente liefern dieselben

Phasengrenzen.

Vergleicht man die Beobachtungen der Untersuchung der Titration von EPC Vesikeln (5 mM)

mit BPS-20 (46,6 mM), zeigt sich ein vollkommen anderes Bild. Die ohne Cholesterolzusatz

hergestellten Vesikel zeigen kein klassisches Solubilisierungsmuster.

Die Titration zeigt lediglich die zu Beginn zu erwartende Abnahme der Einzelwärmen durch

die Sättigung der Membran. Bis zu einem Molverhältnis von 1:1 lassen sich keine

Solubilisierungstendenzen der Membran feststellen.

Diese Beobachtung spricht für einen weiten Bereich der Koexistenz von BPS Mizellen und

PL Vesikeln ohne Entstehung von Mischmizellen durch Membransolubilisierung.

Abb. 5-13: Darstellung der Ergebnisse der Rohdaten und der Auftragung der Wärmen der Einzelinjektionen gegen das molare PEG-Lipid/Lipid -Verhältnis (kleiner Graph)

0 50 100 150 200 250 300

-10

-8

-6

-4

-2

0

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

-10,00

-8,00

-6,00

-4,00

-2,00

0,00

Gea

mtw

ärm

e pr

o In

jekt

ion

[kJ/

mol

]

molPEG-LIPID

/molLipid

µcal

/sec

Zeit [min]

Ergebnisse und Diskussion 111

5.3.3.4 Zusammenfassung der ITC-Experimente

Insgesamt sind die Ergebnisse der ITC-Untersuchungen zwar schwer zu interpretieren, liefern

jedoch einige wichtige Informationen .Die ITC-Verteilungsexperimente liefern einen sehr

hohen Verteilungskoeffizienten K und deuten damit auf eine stabile Verankerung der

Sterolanker in der Membran hin. Außerdem konnte gezeigt werden, dass selbst reine EPC-

Membranen auch bei hohen BPS-Konzentrationen nicht solubilisiert werden. Das

Demizellisierungsexperiment deutet auf einen sehr breiten Konzentrationsbereich hin in dem

der Übergang zwischen Mizellen und Monomeren von Statten geht.

5.3.4 Freisetzung von liposomal verkapseltem Calcein während der Einlagerung von BPS in präformulierte Liposomen

Die exklusive Insertion der PEG-Sterole in den äußeren Monolayer lässt das Auftreten von

Membranspannungen vermuten, die Ursache für Entstehung von Membranschäden und in der

Folge dem Austreten von verkapseltem Material sein könnten. Daher sollte untersucht

werden, ob Membrandefekte während der Einlagerung der PEG-Sterole ihre Nutzung durch

die Entstehung permanenter Poren oder einem vorübergehenden aber massiven

Materialverlust unmöglich machen. Das zu diesem Zweck in den hydrophilen Innenraum in

selbst quenchender Konzentration eingeschlossene Calcein führt bei Freisetzung aus den

Liposomen und die dadurch bedingte starke Verdünnung zu einem Anstieg der Fluoreszenz

der Probe.

5.3.4.1 Freisetzung unterhalb der CMC

In dieser Versuchsreihe lagen die Konzentration der PEG-Sterole auch bei der größten Menge

an zugesetztem BPS (Endkonzentration in der Küvette: 2,5 µM, Lipidkonzentration

2,5 - 5 µM) unterhalb der CMC. Die beobachtete Calcein-Freisetzung ist damit ausschließlich

auf bei der Insertion auftretende Vorgänge zurückzuführen und nicht mit eventuellen

Solubilisierungseigenschaften von BPS-Mizellen in Zusammenhang zu bringen.

Abb. 5-14 zeigt die freigesetzten Calcein-Mengen aus den drei Standardliposomentypen. Wie

zu erwarten erwiesen sich die fluiden EPC-Membranen gegenüber der Einlagerung des BPS

als am empfindlichsten. Die Unterschiede der Freisetzung zwischen den HSPC/Chol- und

112 Ergebnisse und Diskussion

MPEG/Chol-Liposomen sind hingegen wenig ausgeprägt.

Wie der Abb. 5-15 zu entnehmen strebt die Freisetzung des Calceins aus den Liposomen nicht

in jedem Fall einem Endwert zu. Dargestellt ist der relative Fluoreszenzanstieg in Bezug auf

den maximalen zu verzeichnenden Anstieg bei Zerstörung der Liposomen mit Triton über die

Zeit, in Abhängigkeit vom zupipettierten BPS Anteil. Die Auftragsweise wurde gewählt, da

aufgrund der geringen Volumina der eingesetzten Liposomendispersionen durch den

Pipettierfehler unterschiedliche Grundfluoreszenz resultiert, die einen direkten Vergleich der

Fluoreszenzverläufe unübersichtlich macht.

Bei höheren Konzentrationen an BPS in der Küvette (30 und 50 mol%) kann es zu einer

bleibenden Steigerung der Permeabilität der Membran kommen. Dies war bei EPC/Chol 7/3

in jedem Versuch der Fall, während bei den HSPC basierenden Liposomen das Auftreten

dieses Effektes nicht reproduzierbar war (vgl. Abb. 4-5).

Die in Abb. 5-14 dargestellten Ergebnisse der Leakage Versuche stellen also im Falle der 30

und 50 mol%igen Zugabe von BPS keine Endwerte dar. Es ist mit einem geringen Anstieg im

weiteren Verlauf zu rechnen. Ab 15 mol% BPS Zusatz war bei keiner der Formulierung eine

Abb. 5-14: Prozent freigesetztes Calcein 50 min nach Zugabe variabler Mengen BPS zu Liposomen (2,5 - 5 µM) verschiedener Membranzusammensetzung

1 3 7.5 15 30 500

2

4

6

8

10 EPC/Chol 7/3 HSPC/Chol HSPC/MPEG

freig

eset

ztes

Cal

cein

[%]

BPS [mol%]

Ergebnisse und Diskussion 113

bleibende Schädigung der Liposomen zu verzeichnen. Nach Zugabe des BPS kommt es hier

zu einem raschen initialen Anstieg der Fluoreszenzintensitäten, die sich innerhalb von ca. 15

min auf bleibendem Niveau einpendeln. Nach dieser Zeit “heilen“ also die Membrandefekte.

Abb. 5-16 führt die Vorgänge für einen 7,5 mol%igen Zusatz von BPS für die drei

untersuchten Liposomenpräparationen auf. Die Freisetzung liegt für die EPC/Chol 7/3-

Liposomen bei ca. 4,5 % und für die HSPC basierenden Liposomen im Mittel bei ca. 2%.

Ein Zusatz von 15 mol% BPS und weniger, wie im Rahmen dieser Arbeit geschehen, ist

damit für die Stabilität der Liposomenmembran bei allen drei Liposomenpräparationen

zunächst als unproblematisch zu betrachten. Der freigesetzte Anteil des verkapselten

Materials kann - falls nötig - durch einen geeigneten Separationsschritt (GPC, Dialyse,

Ultrazentrifugation) abgetrennt werden. Da die Schädigung der Membranen nur

vorübergehender Natur ist, ist kein neuerliches Auftreten des verkapselten Materials zu

erwarten.

Betrachtet man die NMR-Einlagerungsversuche und die Versuche zur Calcein-Freisetzung im

Zusammenhang ergeben sich einige Diskussionspunkte.

━■━ 50 mol%

┄○┄ 30 mol%

━▲━ 15 mol%

┄□┄ 7,5 mol%

━●━ 3 mol%

┄△┄ 1 mol%

Abb. 5-15: Calceinfreisetzung aus EPC/Chol 7/3 Liposomen mit verschiedenen Mengen an BPS (5 µM GL)

0 10 20 30 40 50

0

2

3

5

7

8

freig

eset

ztes

Cal

cein

[%]

Zeit nach BPS Zugabe [min]

114 Ergebnisse und Diskussion

Die NMR-Experimente demonstrieren, dass die Einlagerung in die Liposomen bei keiner der

Präparationen vollständig ist. Die gut 90%ige Einlagerung des angebotenen BPS (von 7,5

mol% in Bezug auf das GL, vgl. Abb. 5-7) in die EPC/Chol 7/3-Liposomen führt zu einem

BPS Anteil von 6,75 mol% des GL.

Bei den anderen Liposomenpräparationen lagen die Werte bei 3,2 mol% und 2,4 mol%

(HSPC/Chol, HSPC/Chol/MPEG). Die Leakageversuche haben einerseits gezeigt, dass die

Einlagerung eines solchen Prozentsatzes BPS in den äußeren Layer nicht zu permanenten

Membranschäden führt, so dass nach Abtrennen des initial austretenden verkapselten

Materials mit einer stabilen Formulierung umgegangen werden kann. Andererseits zeigt sich

aber auch, dass das Zupipettieren von BPS oberhalb der Molprozentsätze, die bei den NMR

Versuchen als Maximum ermittelt wurden (nämlich 6,75, 3,2 und 2,4 mol% je nach

Lipidkomposition), bei den Leakageversuchen auch dann noch einen Einfluss auf die

Freisetzung hat, wenn die Einlagerung laut NMR abgeschlossen ist. Dies deutet auf

Flippflopp-Ereignisse in der Membran hin, zumindest der nicht PEGylierten Membranlipide,

wodurch in geringem Maße neue Membrandefekte auftreten.

Zu beachten ist jedoch, dass bei den NMR-Versuchen oberhalb und den Leakageversuchen

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

0

1

2

3

4

5

6

freig

eset

ztes

Cal

cein

[%]

Zeit nach BPS Zugabe [min]

━■━EPC/Chol 7/3

━●━HSPC/Chol

━▲━HSPC/Chol/MPEG

Abb. 5-16: Calceinfreisetzung aus den verschiedenen Liposomenkombinationen bei Zugabe von 7,5 mol% BPS (2,5 - 5 µM GL)

Ergebnisse und Diskussion 115

unterhalb der CMC gearbeitet wurde.

Im letzten Fall besteht ein Gleichgewicht also nur zwischen membranär gebundenem und

freiem BPS. Da unterhalb der CMC für das Monomer kein mit der Liposomenmembran

konkurrierendes Kompartiment zur Einlagerung zur Verfügung steht, lassen sich über einen

breiten Konzentrationsbereich Auswirkungen auf das Freisetzungsverhalten von Calcein

vermessen. Die vollständige Einlagerung von 50 mol% BPS ausschließlich in den äußeren

Monolayer ohne vollständige Desintegration des Vesikels ist kaum vorstellbar. Im

submizellaren Bereich ist zu erwarten, dass sich mit steigender Konzentration eine Sättigung

der Membran einstellt, so dass sich nun ein Gleichgewicht zwischen freiem und

membrangebundenem BPS ausbildet. Dieses sollte sich mehr und mehr auf die Seite des

freien Monomers verschieben.

Dies zeigt sich auch in der Auftragung der Calcein-Freisetzung gegen die zugefügte BPS

Menge. Abb. 5-17 zeigt mit steigender BPS Menge eine deutliche Abflachung der prozentual

freigesetzten Calceinmenge was auf einen wachsenden Anteil auf ungebundenem Monomer

hindeutet.

Insgesamt ist die Einlagerung des PEG-Lipids in die Membran der experimentell untersuchten

Abb. 5-17: Prozentuale Freisetzung von Calcein in Abhängigkeit von Lipidkomposition und zugeführter Menge BPS (2,5 - 5 µM GL)

0 10 20 30 40 50

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

freig

eset

ztes

Cal

cein

[%]

zugeführte Menge BPS [mol%]

━■━ EPC/Chol 7/3

━●━ HSPC/Chol

━▲━ HSPC/Chol/MPEG

116 Ergebnisse und Diskussion

Liposomen weder mit bleibenden Membranschäden noch mit einem massiven Verlust des

verkapselten Materials verbunden. Der Anteil an freigesetztem Calcein ist im für die

Kopplung von Liganden interessanten Bereich von 1 - 7,5 mol% aktiviertem BPS mit 1-4%

sehr niedrig. Die Zahlenwerte sind vergleichbar mit den Prozentsatz der bei Verwendung der

PIT für den Arzneistoff Doxorubicin gefunden wurden (Ishida et al. 1999).

Die Kopplung von Liganden an die Oberfläche von Liposomen verläuft jedoch zumeist in

Konzentrationsbereichen oberhalb der CMC, so dass mit Solubilisierungseffekten zu rechnen

ist, die eine Steigerung der Calcein-Freisetzung zur Folge haben können. Daher wurden

Experimente durch geführt, die die Calcein-Freisetzung oberhalb der CMC untersuchten.

5.3.4.2 Freisetzung oberhalb der CMC

Oberhalb des Konzentrationsbereiches der CMC stellt sich die Situation wie folgt dar: Die

Insertion in die Vesikelmembran wird oberhalb eines von der Lipidzusammensetzung des

Vesikels abhängigen Sättigungsbereiches zugunsten der bei diesen Verhältnissen

thermodynamisch günstigeren Mizelle zurückgedrängt.

Da die EPC/Chol 7/3 sich gegenüber der Wechselwirkung mit BPS am empfindlichsten

erwiesen hatte, wurde mit dieser Formulierung der Einfluss von BPS-Mizellen auf die

Freisetzung von Calcein untersucht. Dazu wurde wie unter 4.5.4.2 geschildert vorgegangen.

Die angebotene Menge BPS betrug 7,5 mol% BPS und entsprach damit der üblicherweise bei

der Kopplung verwendeten Menge an aktiviertem BPS.

Die Versuchsreihe war zunächst als eine Kinetikstudie gedacht. Bereits nach den ersten

Versuchsreihen stellte sich jedoch heraus, dass die Freisetzung des Calceins, analog zu den

Beobachtungen der Einlagerung von BPS in die verschiedenen Liposomentypen, bereits

innerhalb weniger Minuten abgeschlossen war (vgl. Abb. 5-18). Geht man davon aus, dass die

bei den NMR Versuchen für diesen Liposomentyp gefundene Einlagerungsrate von 90% auch

unter den in diesen Versuchen gewählten Bedingungen Gültigkeit hat, bedeutet dies, dass

nach Absättigung der Membran noch 10% der zugefügten Menge BPS frei in der Probe

vorliegen. Dies entspricht einer Endkonzentration von rund 50 µM und liegt somit deutlich

über der CMC des BPS.

Im Standardprotokoll (vgl. 4.6.1) ist für den zweiten Inkubationsschritt, bei dem der Kontakt

zwischen Liposom und BPS zu Stande kommt, mindestens eine Stunde Inkubationszeit

Ergebnisse und Diskussion 117

vorgesehen. Da die Freisetzung des Calceins jedoch nur initial stattfindet und innerhalb von

15-30 min abgeschlossen ist, wurden in den folgenden Versuchen mindestens 30 min nach

Zugabe des BPS zur Liposomendispersion Proben genommen und vor und nach der

Zerstörung der Liposomen durch Triton vermessen.

Das Erreichen eines stabilen Freisetzungsniveaus erlaubt das problemlose Vermessen

mehrerer Proben nebeneinander. Durch wiederholte Fluoreszenzermittlung derselben Probe

ist eine genauere Bestimmung der freigesetzten Calceinmenge möglich. Gleiches gilt auch für

die Vermessung der Leerwerte, die zur Ermittlung des Faktors (FI) dienten (vgl. 4.5.4.2), der

für die Berechnung der theoretischen Anfangsfluoreszenz (I0t) der BPS-haltigen Liposomen

bestimmt werden musste. Daher wurden zur Ermittlung des Faktors (FI) mindestens 15

Messwiederholungen (mit langer Integrationszeit der Einzelmessung) desselben Ansatzes

vorgenommen. Abb. 5-19 zeigt die prozentuale Calcein-Freisetzung aus EPC/Chol 7/3-

Liposomen nach Zugabe von 7,5 mol% BPS im mizellaren Bereich. Die Ermittlung des freien

Anteils begann frühestens 30 min nach Zupipettieren des BPS um sicherzustellen, dass die

maximale Calceinmenge freigesetzt wurde. Die Bestimmung der prozentualen Freisetzung

des Calceins beruht auf wenigstens neun Messwiederholungen pro Ansatz.

0 40 80 120 160 200 240-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

freig

eset

ztes

Cal

cein

[%]

Zeit nach BPS Zugabe [min]

Abb. 5-18: Freisetzung von Calcein aus EPC/Chol 7/3 Liposomen in Anwesenheit von 54 M BPS in Abhängigkeit der Zeit (n = 2)

118 Ergebnisse und Diskussion

Aus den drei unabhängigen Ansätzen ergab sich im Mittel eine Freisetzung von ca. 6,3 % des

verkapselten Calceins. Die Freisetzung ist damit ca. 2,5 % höher als im submizellaren Bereich

(in Bezug auf die maximale Freisetzung).

Festzuhalten ist, dass auch in Anwesenheit von mizellaren BPS-Strukturen bei der für die

Kopplung relevanten Obergrenze von 7,5 mol% aktiviertem BPS keine bleibenden

Membranschäden auftreten. Eine Abtrennung von eventuell im Ansatz befindlichen BPS-

Mizellen während des zweiten Inkubationsschritts muss also nicht zwingend in zeitlich engem

Rahmen nach Beginn der Insertion erfolgen, um die Freisetzung von verkapseltem Material

zu unterbinden.

Abb. 5-19: Freisetzung von Calcein aus EPC/Chol 7/3 Liposomen in Anwesenheit von 54 M BPS

1 2 3 Mittel0

1

2

3

4

5

6

7

8 6,27

freig

eset

ztes

Cal

cein

[%]

Ansatz

Ergebnisse und Diskussion 119

5.4 Oberflächenmodifikation von präformulierten Liposomen

mit BSA als Modellprotein

Dieses Kapitel der Arbeit beschäftigt sich mit dem Kopplungspotential der aktivierten PEG-

Sterole unter Verwendung von BSA als Modellprotein. Untersucht wurde die Abhängigkeit

der Kopplungseffizienz von der Lipidkomposition der Membran, der BSA-Konzentration,

dem pH-Wert und der Dauer der beiden Inkubationsschritte (vgl. 4.6.1). Weitere Gegenstände

des Kapitels sind die Calcein-Freisetzung bei der Einlagerung der Sterol-PEG-BSA-

Konjugate in die Liposomenmembran sowie die Stabilität der Verankerung in Anwesenheit

von humanem Serum. Unterkapitel 5.4.2.6 beschäftigt sich mit der Entwicklung der

Partikelgröße nach Zugabe der Liposomen zum hydrophobisierten Protein.

5.4.1 Versuche unter Verwendung von tresyliertem Generol E-25

Während des ersten Inkubationsschrittes des Standardkopplungsprotokolls erfolgt die

Derivatisierung (im Folgenden wegen des Anbringens des Sterols am Protein auch

“Hydrophobisierung“ genannt) des Proteins. Durch das Umsetzten mit dem aktivierten Lipid

entsteht eine kovalente Bindung zwischen Sterol-PEG und Protein. Die chemischen Abläufe,

die während dieses Schrittes von statten gehen, werden im folgenden Schema stark

vereinfacht, dargestellt (vgl. Abb. 5-20).

Die Kopplung von tresyliertem PEG mit Aminogruppen wurde nach der Entdeckung der

Tresylate zunächst als eine einfache Alkylierung mit einer resultierenden sekundären

Aminstruktur angesehen. Bei diesem Reaktionsweg fungiert das Tresylat im Sinne einer SN2-

Reaktion als Abgangsgruppe (Nilsson & Mosbach 1984). Spätere Studien (King & Gill 1996;

Sperinde et al. 1999) brachten weitere Reaktionswege in den Focus, von dem die

-Eliminierung/Michael-Addition der wichtigste ist. Diese endet in der Formation eines

Sulfoacetamids. Der dritte wichtige Reaktionsweg ist die Hydrolyse, bei der auf dem

Hauptweg der Tresylatabspaltung eine Inaktivierung des PEG vonstattengeht.

Während das auf dem ersten Weg gebildete sekundäre Amin (vgl. Abb. 5-20 Mitte) in vivo

stabil ist, besteht bei der Sulfoacetamidbindung Hydrolysegefahr. Zudem bietet die

Ausbildung des sekundären Amins die Möglichkeit die ursprünglichen Ladungsverhältnisse

des Liganden beizubehalten. Die üblichen aminoaktiven Kopplungen, sowie auch die

thiolaktiven Kopplungen, die aufgrund des häufigen Fehlens einer Thiolfunktion auf die

Derivatisierung eines Amins zurückgreifen, enden in einem Verlust der ursprünglichen

Ladung des Liganden durch Bildung eines Carbamates oder Amids.

120 Ergebnisse und Diskussion

Neben dem Vorteil der in vivo Stabilität ist die Bildung des Amins also auch deswegen zu

katalysieren, da mit der Konservierung der positiven Ladung am Liganden auch eine bessere

biologische Aktivität desselben zu erwarten ist (Zalipsky 1995).

Durch die Wahl eines pH-Werts von 8-9 im wässrigen Medium kann die Bildung eines

sekundären Amins gegenüber den Nebenreaktionen gefördert werden (Sperinde et al. 1999).

Die Reaktion bei tieferen Temperaturen kann eine weitere Steigerung der Aminbildung

bringen. Dies ist jedoch in Abhängigkeit von den Konzentrationsverhältnissen und dem pks-

Wert des Liganden zu betrachten.

Generell bringt ein schwach basischer pH-Wert eine Verbesserung der Ausbeute an

sekundärem Amin. Daher wurde in dieser Arbeit nach Untersuchung des optimalen pH-

Wertes für eine möglichst effiziente Kopplung ein Boratpuffer mit einem pH-Wert von 8,3 -

8,5 als Reaktionsmedium gewählt.

Abb. 5-20: Reaktionsschema zur Kopplung von aminhaltigen Liganden mit BPS-TRE

OO

S

O

O

F

FF

HN-BSA

OSO

O

O

OSterol

HN-BSAOSterol

n=30

n=30

NH2 BSA

n=30

H2O, pH 8-9

Acylierung

Alkylierung

Hydrolyse

OHOSterol

n=30

Ergebnisse und Diskussion 121

5.4.1.1 Grundsätzliche Eignung tresylierter Sojasterole zur Kopplung von BSA an Liposomen

Die ersten Versuche zur Untersuchung tresylierter Sojasterole als mögliche Reagenzien zur

Kopplung von Proteinen an Liposomen wurden unter den von A. Lung (Lung 2002)

beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Da eine Neusynthese der Substanzen nötig war

und eine Modifikation im Kopplungsprotokoll (Umstellen der Kopplung auf das

Standardprotokoll (vgl. 4.6.1)) zu Gunsten einer besseren Reproduzierbarkeit der einzelnen

Versuche vorgenommen worden war, beschäftigten sich die ersten Versuche mit der

grundsätzlichen Überprüfung des Kopplungspotentials des tresylierten Generols (GET) unter

den veränderten Bedingungen.

Wie in Abb. 5-21 zu sehen, führt die Behandlung von BSA mit tresyliertem Generol zur

Elution des Proteins mit den Liposomen. Wird das Protein mit Generol E-25 inkubiert, ist

keine Anreicherung des BSA in den liposomalen Fraktionen erkennbar. Damit ist eine passive

Anlagerung des Proteins auf der Liposomenoberfläche als Ursache für die Koelution von

Liposomen und Protein auszuschließen.

5 10 15 20 25

0

10

20

30

40

50

60

70

BS

A [%

]

Elutionsvolumen [ml]

━■━ Elutionsprofil bei

Verwendung von GET

im ersten

Inkubationsschritt

┄□┄ Elutionsprofil bei

Verwendung von

Generol E-25 im ersten

Inkubationsschritt

Abb. 5-21: Vergleich des Elutionsverlaufs von BSA bei der Verwendung von GET bzw. nicht tresyliertem Generol während des ersten Inkubationsschritts.

122 Ergebnisse und Diskussion

5.4.1.2 pH-Abhängigkeit der Kopplung mittels tresyliertem Generol

Für die Konjugation von tresyliertem PEG an verschiedene Amine ist eine pH-Abhängigkeit

der Kopplungseffizienz beschrieben (Sperinde et al. 1999). Die Reaktion verläuft in schwach

basischem pH-Bereich besonders effektiv. Das genaue pH-Optimum ist dabei auch von den

pKs-Werten der Amine des zu koppelnden Liganden abhängig und daher von Protein zu

Protein unterschiedlich. Dennoch sollte untersucht werden, ob im pH-Bereich von 8,3 bis 9,0

signifikante Unterschiede der Kopplungseffizienz zu verzeichnen sind, die darauf hindeuten,

dass der gewählte pH-Wert außerhalb des pH-Optimums für effiziente Kopplung liegt. Als

Vergleichswert wurde die einstellbare BSA-Oberflächen-Dichte in µg/µmol GL (vgl. 5.4.2.3)

ermittelt.

Bei vollständiger Kopplung des angebotenen Proteins an die Liposomenoberfläche ergab sich

unter den Bedingungen (vgl. 4.6.3.2) eine maximale Ligandendichte von 25 µg/µmol GL

(4,85 nmol BSA/13 µmol GL; 35,7 µg BSA/mg GL).

Abb. 5-22 illustriert die Ergebnisse der Untersuchungen zur pH-Abhängigkeit der Kopplung.

Wie in der Literatur beschrieben zeigt sich die deutliche Abhängigkeit der Kopplungseffizienz

vom pH-Wert. Bei einem pH-Wert von 7,4 ist die Hydrolyse von wesentlich größerer

Abb. 5-22: pH-Abhängigkeit der Kopplungseffizienz bei Verwendung von GET

7,4 8,3 8,5 8,7 90

5

23

24

25

BS

A-D

icht

e [µ

g/µm

ol G

L]

pH-Wert

Ergebnisse und Diskussion 123

Bedeutung als im schwach alkalischen pH-Bereich. Die im PBS ermittelte Ligandendichte

von ca. 8,3 µg/µmol GL entspricht der Kopplung von ca. 33%.

Im pH-Bereich von 8,3 - 9,0 zeigt sich die eindeutige Tendenz, dass mit steigendem pH-Wert

höhere Kopplungsausbeuten erzielbar sind. Die prozentualen Kopplungseffizienzen liegen mit

95 % bei einem pH-Wert von 8,3 und 99 % bei einem pH von 9,0 jedoch sehr nah

beieinander. Da die Kopplung über die Bildung des in vitro stabilen sekundären Amins bei

pH-Werten knapp über 8,0 bevorzugt abläuft, während höhere pH-Werte die Bildung des

hydrolyseempfindlichen Sulfoacetamids fördern, wurde als vertretbarer Kompromiss

zwischen Kopplungsausbeute und zu erwartendem Anteil an entstehenden sekundären

Aminen ein Boratpuffer mit einem pH-Wert von 8,3 - 8,5 als Standardkopplungspuffer

festgelegt. Höhere pH-Werte können zudem die Anwendbarkeit der Methode einschränken,

da Instabilitäten mit pH-empfindlichen Liganden zu befürchten sind und in dem Fall, dass der

Kopplungspuffer gleich dem Liposomenpuffer gewählt werden muss, auch die PL zunehmend

hydrolysiert werden.

5.4.1.3 Abhängigkeit der Kopplungseffizienz von pH-Wert und Ankerkonzentration

In den meisten Kopplungsversuchen wurden routinemäßig 7,5 mol% Anker eingesetzt. Dies

gewährleistet eine nahezu vollständige Kopplung bei gleichzeitig maximaler sterischer

Stabilisierung der Liposomen durch die tresylierten PEG-Sterole (vgl. 5.3.2), die durch

Kopplung oder Hydrolyse inaktiviert werden. Die durch die Einlagerung provozierten

Verluste an verkapseltem Material liegen zudem im vertretbaren Bereich (vgl. 5.3.4.2).

Abb. 5-23 zeigt, dass bereits 5 mol% GET für eine nahezu vollständige Fixierung des BSA

am Liposom ausreichen. Auch bei der niedrigen Konzentration von 0,5 mol% werden schon

ca. 60% des zur Kopplung zur Verfügung stehenden Proteins mit den Liposomen koeluiert.

Bei der Versuchsreihe wurde GET in hohem molarem Überschuss zum BSA eingesetzt (220 -

13/1; GET/BSA (mol/mol)). Aus der Multireaktivität des Proteins ergibt sich so eine

mehrmalige Umsetzung eines Proteins mit dem aktivierten Lipid, die auch bei niedrigen GET

Mengen zu einem hohen Anteil an gekoppeltem BSA führt.

124 Ergebnisse und Diskussion

Im Zusammenhang der Ermittlung der Kopplungseffizienz in Abhängigkeit der

Proteinkonzentration und Lipidkomposition (vgl. 5.4.2.3) wird dies näher diskutiert.

Festzuhalten ist, dass sich bereits mit kleinen GET-Anteilen hohe Kopplungseffizienzen

einstellen lassen. Dabei stellt sich heraus, dass bei einem pH von 8,5 niedrige GET

Stoffmengen zu höheren Kopplungsausbeuten führen, als bei einem pH-Wert von 9,0. Dies

lässt sich vielleicht dadurch erklären, dass bei dem höheren pH-Wert die Bildung des

(hydrolytisch instabilen) Sulfoacetamids eine größere Bedeutung erlangt.

Da diese Reaktion über einen anderen Weg abläuft (E1cB, monomolekulare -Eliminierung

mit konjugierter Base, geschwindigkeitsbestimmender Schritt verläuft nach erster Ordnung)

als die Bildung des sekundären Amins (SN2, nucleophile Substitution,

geschwindigkeitsbestimmender Schritt verläuft 2. Ordnung) ergibt sich auch eine andere Lage

des chemischen Gleichgewichts der Reaktion nach Ablauf der Reaktionen in Konkurrenz

zueinander und zur parallel stattfindenden Hydrolyse. Die Komplexität der Vorgänge macht

eine weitere Interpretation der Kurven auf Grundlage des vorhandenen Datenmaterials rein

spekulativ.

Wie schon in 5.4.1.1 gezeigt sind neutrale pH-Werte bei der Kopplung von Proteinen über

GET an Liposomen ungünstig. Bei einem pH-Wert von 7,4 werden nicht mehr als 35 % des

Abb. 5-23: Abhängigkeit der Kopplungseffizienz von pH-Wert und eingesetztem GET-Anteil der Membran

━■━ pH 8,5 (n = 3)

┄△┄ pH 9,0 (n = 1)

━▲━ pH 7,4 (n = 1)

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0

20

40

60

80

100

BS

A li

poso

mal

geb

unde

n [%

]

GET [mol% des GL]

Ergebnisse und Diskussion 125

angebotenen BSA an die Liposomen gebunden, wobei die Effizienz der Kopplung im

Vergleich zu den beiden anderen pH-Werten am wenigstens von der eingesetzten Stoffmenge

des aktivierten Ankers abhängt.

5.4.1.4 Reaktionsgeschwindigkeit des ersten Inkubationsschrittes

Sinn der Versuchsreihe war es, die Dauer des ersten Inkubationsschrittes festzulegen, die für

eine möglichst effiziente Kopplung notwendig ist. Bei geringen Ligand- und BPS-TRE-

Konzentrationen ist mit einer langsamen Derivatisierung des Proteins zu rechnen. Außerdem

gewinnt die Hydrolyse des BPS-TRE als Konkurrenzreaktion zur Derivatisierung, an

Bedeutung. Beides sorgt letztlich für eine verlangsamte Hydrophobisierung des Proteins und

führt so zu geringeren Kopplungsausbeuten. Mit der Wahl der relativ geringen Ankermenge

(3 mol% des GL) und der niedrigen Proteinkonzentration (1 mg/ml) wurden also schlechte

Vorraussetzungen für einen schnellen Derivatisierungsverlauf geschaffen.

Da unter diesen “worst case“ Bedingungen eine Inkubation über Nacht ausreichend war,

wurde im Standardprotokoll eine 12stündige Inkubation des BPS-TRE mit BSA festgelegt.

0 100 200 300 400 500 600 700 8000

20

40

60

80

100

BS

A g

ebun

den

[%]

Zeit [min]

Abb. 5-24: Kopplungseffizienz in Abhängigkeit der Dauer der Derivatisierungsreaktion zwischen BSA und BPS-TRE (Schritt 1 des Standardkopplungsprotokolls)

126 Ergebnisse und Diskussion

Die Aminosäuresequenz des BSA enthält 60 Lysine und 17 Histidine, die als

Kopplungspartner in Frage kommen. Da die genaue (sterische) Verfügbarkeit der einzelnen

möglichen Kopplungsstellen nicht genau abgeschätzt werden kann wurde vereinfachend mit

ca. 70 für die Kopplung zugänglichen Aminosäuren pro BSA gerechnet. Mit Histidin-HCl

wurde die Reaktion zwischen aktiviertem Anker und Protein zu verschiedenen Zeitpunkten

gestoppt. Bei der gewählten Einwaage von 60 mg Histidin-HCl/ml, die als Kompromiss

zwischen praktikabler Löslichkeit und Überangebot an Aminen zu verstehen ist, ergab sich

ein 80facher molarer Überschuss an Histidin gegenüber den möglichen Kopplungsstellen des

BSA. Neben der Unterdrückung der Derivatisierung des Proteins durch das Amin der

Aminosäuregruppe sollte auch eine Reaktion des BPS-TRE mit der Imidazolgruppe der

Seitenkette möglich sein (Shearwater Polymers 2000), die bisher nur für N-

Hydroxysuccinimidester-aktivierte PEG in der Literatur beschrieben ist (Wylie et al. 2001;

Roberts et al. 2002). Zudem führt die Absenkung des pH-Wertes durch den Einsatz des

Hydrochlorids zu für die Kopplung ungünstigen Bedingungen (Sperinde et al. 1999).

Abb. 5-24 zeigt deutlich, dass die Inkubation über Nacht auch bei niedrigen

Proteinkonzentrationen (1 mg/ml) und BPS-Stoffmengen (3 mol% des GL) ausreicht, um eine

effiziente Kopplung des Proteins zu gewährleisten.

5.4.2 Versuche unter Verwendung von tresyliertem BPS-30

Nach den ersten Versuchsreihen, bei denen Generol in seiner tresylierten Form zum Einsatz

kam, wurde mit tresyliertem BPS weitergearbeitet, da dieses mit seiner längeren PEG-Kette

zu einer besseren sterischen Stabilisierung der Liposomen beitragen sollte. Wird die sterische

Stabilisierung der Liposomen gar nicht durch das PEGylierte Sterol, sondern durch ein bereits

in der Membran befindliches PE-PEG gewährleistet (vgl. 5.4.2.3), ist eine längere PEG-Kette

des Sterol-Ankers von Vorteil. Da die PEG-PEs i.d.R. mit einer Kettenlänge von 45 EO-

Einheiten eingesetzt werden, bedeutet eine kürzere PEG-Kette ein tieferes Eintauchen des

Liganden in PEG-Corona des Liposoms, was mit einer gesteigerten sterischen Hinderung der

Interaktion zwischen Ligand und Zielstruktur verbunden sein sollte.

Ein weiterer Grund für die Verwendung von BPS statt Generol lag in der besseren

Verfügbarkeit des BPS (Fa. Nikkol, Tokyo), das zudem auch mit verschiedenen EO-

Kettenlängen (5, 10, 20, 30 EO-Einheiten) sowie in einer alternativen Form mit hydriertem

Sterolgerüst (30 EO-Einheiten) kostenfrei zur Verfügung gestellt wurde.

Ergebnisse und Diskussion 127

5.4.2.1 Geschwindigkeit der Einlagerung des BSA-Sterol-PEG Konjugats

Der zweite Inkubationsschritt dient der Einlagerung des Sterol-PEG-Protein-Konjugats in die

Liposomen.

Die NMR Versuche 5.3.2 zeigen, dass die Einlagerung des reinen BPS in die Liposomen aller

untersuchten Zusammensetzungen sehr rasch verläuft. In weniger als 15 min ist die

Einlagerung völlig abgeschlossen und ein Endwert erreicht.

Das oben angeführte Elutionsprofil, das unmittelbar nach der Zugabe von EPC/Chol 7/3-

Liposomen zu einem Ansatz aus 7,5 mol% BPS-TRE (c BSA 1,5 mg/ml) ermittelt wurde

verdeutlicht, dass die Einlagerung des BSA-BPS-Derivates in die Liposomen in Analogie zur

Einlagerung des reinen BPS innerhalb kurzer Zeit abgeschlossen ist.

Da nach 1 min bereits eine 80%ige Fixierung des BSA-BPS-Konjugats an der

Liposomenoberfläche erfolgte, war eine ausgiebige Untersuchung der Einlagerungskinetik

nicht erforderlich.

Die Dauer des zweiten Inkubationsschrittes richtete sich nach Beobachtungen zum

Partikelgrößenwachstum (vgl. 5.4.2.6), die zeigen, dass eine lange Inkubation von

Abb. 5-25: exemplarisches Elutionsprofil 1 min nach Zugabe von EPC/Chol 7/3-Liposomen zu einem Inkubationsansatz von BSA mit BPS-TRE

━■━ (linke Achse)

Elutionsprofil 1 min

nach Zugabe der

Liposomen

┄□┄ (rechte Achse)

Summe der eluierten

Anteile der auf die

Säule aufgetragenen

Gesamtaktivtät [%]

4 6 8 10 12 14 16 18

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

BSA

[%]

Elutionsvolumen [ml]

0

20

40

60

80

100 S

umm

e der Gesam

taktivität [%]

128 Ergebnisse und Diskussion

BPS-BSA-Konjugat mit Liposomen zu deren problematischer Größenzunahme führen

können.

Die Dauer des zweiten Inkubationsschrittes wurde daher auf mindestens 2 h und maximal 4 h

festgelegt.

5.4.2.2 Kontrolle auf Koelution durch Formation von Proteinaggregaten

Bei Konjugation von aktiviertem BPS (BPS-TRE und BPS-NHS) mit Proteinen wurde -

besonders bei hohem molarem Überschuss des Ankers (vgl. 5.4.2.3) - eine nicht

reproduzierbare schwache Trübung der Lösung während des ersten Inkubationsschrittes

beobachtet. Diese trat innerhalb von wenigen Minuten auf und war bei BPS-NHS wesentlich

deutlicher ausgeprägt als bei BPS-TRE.

Die Trübung trat nicht in jedem Ansatz und unabhängig vom Puffersystem und pH-Wert auf.

Bei längerem Stehen dieser Proben war sogar die Entstehung eines leicht resuspendierbaren

Niederschlags zu beobachten. PCS-Messungen dieser trüben Ansätze lieferten einen z-Av

zwischen 130 und 300 nm bei einem PI oberhalb von 0,25. Diese Beobachtungen sprechen

für die Formation von Proteinaggregaten. Durch die mehrfache Umsetzung eines Proteins mit

den aktivierten Ankern ist eine Interaktion der hydrophoben Sterole verschiedener

Proteinmoleküle denkbar, die in der Formation von Proteinaggregaten enden.

Aufgrund der Größe der Aggregate ist ihre Elution zusammen mit den Liposomen im

Ausschlussvolumen zu erwarten, ohne dass eine direkte Fixierung des Proteins am Liposom

vorliegt. Damit wäre die als Nachweis für eine gelungene Kopplung angeführte GPC-

Fraktionierung mit Erstellen von Elutionsprofilen (vgl. 5.4.1.1) nicht stichhaltig.

Zur Untersuchung der tatsächlich vorliegenden Situation wurde das FFE-

Fraktionierungsmuster (vgl. Abb. 5-26) einer konventionellen EPC/Chol 4/1-Formulierung

mit dem einer BSA gekoppelten Probe verglichen. Da die FFE unterschiedliche

Oberflächenladungen zur Auftrennung einer Probe nutzt, lassen sich mit ihrer Hilfe

verschieden geladene Liposomenpopulationen innerhalb eines Ansatzes trennen.

Die Wanderung der Liposomen im elektrischen Feld wurde über die Untersuchung der

gesammelten Fraktionen mittels PCS und LSC verfolgt. Abb. 5-26 zeigt das

Verteilungsschema der Liposomen bei Fraktionierung mittels FFE. Um die Abbildung

übersichtlich zu gestalten wurde nicht jede Fraktion dargestellt.

Ergebnisse und Diskussion 129

Auf der rechten Achse ist die Anzahl von Streulichtimpulsen in der jeweiligen Fraktion

aufgetragen, die linke Achse zeigt die Verteilung des radioaktiv markierten BSA über die

unterschiedlichen Fraktionen.

Da die Lipide der EPC/Chol 4/1-Liposomen keine Ladung aufweisen, ist hier keine

Wanderung im Spannungsfeld nach Probenzugabe in Höhe der Fraktion 73 zu erwarten.

Analog zu den Beobachtungen von T. Dern (Dern 2002) und J. Momm (Momm 2004) wurde

trotzdem eine leichte Ablenkung der konventionellen EPC/Chol 4/1-Liposomen zur Anode

(vgl. Abb. 5-26, Anode liegt bei niedrigen Fraktionsnummern, höchste Fraktionsnummer ist

96) festgestellt, die auf die Absorption von Phosphationen an die Oberfläche der Liposomen

zurückgeführt wird. Die konventionellen Liposomen wurden nahe der Kathode mit einem

Maximum der Streulichtintensität in Fraktion 65 wieder gefunden.

Bei neutralem pH-Wert liegt BSA, dessen isoelektrischer Punkt bei pH 4,7 festgestellt wurde

(Kim & Cremer 2001) 18fach negativ geladen vor (vgl. http 3).

Die Kopplung von BSA an die Liposomen sollte also zu einer Ablenkung der modifizierten

Vesikel in Richtung Anode führen. Die Untersuchung der Fraktionen zeigt eine deutliche

Wanderung der Liposomen im elektrischen Feld. Die Hauptfraktion der BSA modifizierten

Abb. 5-26: Verteilung Protein-modifizierter und konventioneller Liposomen nach Fraktionierung über die Free-Flow Elektrophorese

(Anode bei Fraktion 1, Kathode bei Fraktion 96)

20 30 40 50 60 70 80

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

A

ktiv

ität [

kcpm

]

Fraktionsnummer

0

200

400

600

800

Streulichtim

pulse [kcps]

linke Achse:

━□━ Verteilung des 125I markierten BSA

in 1000 cpm/Fraktion

rechte Achse:

Verteilung der

Streulicht verursach-

enden Fraktionen

━■━ modifizierte

━●━ konventionelle

Liposomen

130 Ergebnisse und Diskussion

Liposomen liegt zwischen Fraktionsnummer 45 und 50. Die Kurvenverläufe für die

Untersuchung der Fraktionen mittels PCS verläuft deckungsgleich mit der die LSC Analytik

repräsentierenden Kurve. Außerdem ist kein PCS-Peak zu verzeichnen, der auf das

Vorkommen von nicht BSA-modifizieren Liposomen hindeuten würde.

Das gemeinsame Auftreten von Streulichtsignalen und Aktivität in den gleichen Fraktionen,

bekräftigt durch das Fehlen eines Peaks für konventionelle Liposomen im gekoppelten

Ansatz, belegt die Interaktion von BSA mit den Liposomen. Die Bilanzierung des

radioaktiven Materials lieferte eine Wiederfindungsrate von über 95%, so dass davon

ausgegangen werden kann, dass das BSA in diesem Versuch vollständig an die Liposomen

gebunden war. Theoretisch ist auch eine zufällige Koelution von BSA-BPS-Aggregaten und

BSA-modifizierten Liposomen denkbar. Angesichts der vollkommenen Übereinstimmung der

PCS und Aktivitätssignale ist dieser Fall vor dem Hintergrund der unterschiedlichen

Ladungsdichte von Liposomen und Aggregaten sowie der breiten Partikelgrößenverteilung

der BSA-BPS-Aggregate jedoch äußerst unwahrscheinlich.

Die veränderte Oberflächenladung ließ sich auch über eine -Potentialmessung bestätigen.

Dieses lag bei den konventionellen Liposomen bei ca. - 6 mV während die BSA-modifizierten

Liposomen ein -Potential von - 20 mV aufwiesen. Die FFE-Fraktionierung bot jedoch den

Vorteil eines zuverlässigeren Nachweises von (hier nicht) vorkommenden ungekoppelten

Liposomen.

5.4.2.3 Kopplungseffizienz in Abhängigkeit von Lipidkomposition und Proteinkonzentration

Die Kopplungseffizienz ist bei der Präparation von Ligand-targetierten Liposomen von großer

Bedeutung. Die heute am häufigsten verwendeten Fab’-Teile und monoklonalen Ab sollten

aufgrund ihres hohen Preises möglichst vollständig an ein Liposom gebunden werden, um das

Verwerfen oder die Rückgewinnung des nicht gekoppelten Anteils zu vermeiden.

Die Experimente zur Kopplungseffizienz sollten Auskunft darüber liefern, welcher Anteil des

BPS-TRE bei dem gewählten Kopplungsverfahren (vgl. 4.6.1 und 4.6.4.3) liposomal

gebunden werden konnte. Die Effizienz wurde in Abhängigkeit der Lipidkomposition und der

Konzentration des Modellproteins BSA untersucht.

Interessant ist vor allem die Frage nach der möglichen Modifizierung von Stealth®-

Ergebnisse und Diskussion 131

Liposomen, die in der Literatur bisher nur bei erhöhter Temperatur und mit synthetisierten

Lipid-PEG-Konjugaten gelungen ist (vgl. 5.3.2).

Als Modell zur Untersuchung der Einlagerung der BPS-BSA-Konjugate in PEGylierte

Liposomen diente zum einen die Liposomenspezies HSPC/Chol/MPEG, die sich in ihrer

Zusammensetzung am Doxil® orientierte. Die beiden anderen Formulierungen repräsentieren

einen bei Raumtemperatur fluiden (EPC/Chol 7/3) bzw. rigiden Membranzustand

(HSPC/Chol). Dabei entsprach die Zusammensetzung der EPC/Chol 7/3-Liposomen der des

Myocet®.

Abb. 5-27 zeigt die Ergebnisse der Kopplungsversuche. Wie zu erwarten nimmt die

prozentuale Kopplungseffizienz mit zunehmender BSA-Konzentration ab. Die Unterschiede

zwischen den einzelnen Lipidkompositionen sind gering. Lediglich bei der

HSPC/Chol/MPEG-Liposomenpopulation ist die eindeutige Tendenz zu einer gegenüber den

anderen Zubereitungen verringerten Kopplungseffizienz zu verzeichnen.

Neben der Angabe der prozentualen Kopplungseffizienz ist die durch ein Kopplungsverfahren

einstellbare Ligandenlast von entscheidender Bedeutung.

Abb. 5-27: Kopplungseffizienz in Abhängigkeit von Lipidkomposition und Proteinkonzentration

1 2 3 50

60

70

80

90

100

110

EPC/Chol 7/3 HSPC/Chol HSPC/Chol/MPEG

BSA

geb

unde

n [%

]

c BSA [mg/ml]

132 Ergebnisse und Diskussion

Die Ligandendichte auf der Oberfläche muss groß genug sein, um eine effiziente Interaktion

des Ligand-Liposom-Komplexes mit dem Zielgewebe sicherzustellen. Die meisten Versuche

zum aktiven liposomalen Targeting wurden mit Antikörpern oder Fab’-Stücken

unternommen. Hierbei wird die Antikörperdichte häufig in der Einheit µg Ab/ µmol PL

angegeben. Die Anzahl der Liganden, die für ein erfolgreiches Targeting nötig ist kann nicht

präzise angegeben werden, da sie auch von der Oberflächendichte der Zieldeterminante

abhängt.

Park et al. (2002) und Kirpotin et al (1997) beispielsweise beschreiben ein erfolgreiches in

vitro Targeting gegen die p185HER2 (HER2; ErbB2) Rezeptor-Tyrosinekinase (einem auf einer

Reihe von Tumoren stark überexpremiertem Oberflächenantigen) mit 30-50 Fragmenten von

monoklonalen Antikörpern pro Vesikel (Größe 100 ± 10 nm).

In Saul (2003) werden 10 - 1000 Folat-PEG-Lipide pro Liposom angebracht und die so

modifizierten Liposomen auf ihre Eignung zum aktiven liposomalen Targeting untersucht.

Das in der Literatur als optimal beschriebene Verhältnis zur Kopplung von Ab liegt bei

1/1000 (mol Ab/mol PL) (Hansen et al. 1995; Bendas et al. 1999) und führt beim Einsatz von

Abb. 5-28: Vergleich der absoluten BSA-Last in Abhängigkeit von Lipidkomposition und BSA Konzentration

1 2 3 50

20

40

60

80

100 EPC/Chol 7/3 HSPC/Chol HSPC/Chol/MPEG

µg

BS

A/ µ

mol

GL

c BSA [mg/ml]

Ergebnisse und Diskussion 133

3-8 mol% des aktivierten Lipids zur einer angestrebten Antikörperdichte von 30-50 µg/µmol,

oberhalb derer eine beschleunigte Eliminierung der Ligand-Liposom-Konjugate aus der

Blutbahn zu verzeichnen ist (vgl. 1.1.5.2).

Die in der Versuchsreihe gewählten Konzentrationen und Volumina wurden so gewählt, dass

das Verhältnis von BSA zu PL (mol/mol) im Bereich von ca. 1/540 - 1/2700 lag

(entsprechend 25 - 100 µg BSA/µmol GL bzw. - bezogen auf die EPC basierenden

Liposomen - 37,8 - 188,8 µg/mg GL).

Abb. 5-28 zeigt die aus dem prozentual gebundenen Anteil berechnete Masse an BSA/µmol

des GL. Auf Kosten der relativen Kopplungseffizienz lässt sich mit BPS-TRE bei steigender

BSA-Konzentration eine größere Proteinmasse an der Oberfläche der Liposomen

immobilisieren. Wie auch schon den prozentualen Zahlen zu entnehmen ist, unterscheidet

sich die BSA-Dichte auf der Oberfläche der Liposomen bei fluiden und rigiden Membranen

nur geringfügig. Dies ist zunächst nicht unbedingt einzusehen, da die NMR-Versuche klar

gezeigt haben, dass die Akzeptanz der HSPC basierenden Membranen gegenüber der

Insertion des Sterols wesentlich geringer ist als die der EPC-Membranen. In der Konsequenz

ist also bei den rigiden Membranen eine deutlich verringerte Kopplungseffizienz zu erwarten.

Die hohe Funktionalisierungsrate auch der rigiden Membranen ist wie folgt zu erklären:

Während des ersten Inkubationsschrittes erfolgt die Umsetzung von BSA mit dem aktivierten

Lipid, bei der Aminogruppen des Proteins mit der Tresylfunktion abreagieren (vgl. Abb.

5-20). Das auf diese Weise hydrophobisierte Protein kann anschließend mit der

Liposomenmembran interagieren - es kommt zur Fixierung des Proteins an der

Liposomenoberfläche.

Bei allen Ansätzen wurde die Stoffmenge des BPS-TRE konstant gehalten und betrug jeweils

7,5 mol% des vor der 2. Inkubation eingebrachten GL. Mit steigender BSA-Konzentration

nimmt daher die Zahl der für die Reaktion mit dem Protein zur Verfügung stehenden

BPS-TRE Moleküle ab. Es ist daher verständlich, dass der Grad der Hydrophobisierung des

Proteins und damit auch die Affinität des derivatisierten Proteins zur Liposomenmembran mit

steigender BSA-Konzentration während des ersten Inkubationsschritts abnimmt.

134 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 5-1: Überblick über die wichtigsten Parameter der Versuchsreihe

In der Tabelle sind die wichtigsten Kennzahlen der Ansätze mit kleinster und größter

eingesetzter BSA-Konzentration aufgeführt. Sie verdeutlicht, dass die Anker-Stoffmenge klar

über der des BSA liegt. Selbst bei der größten Proteinkonzentration beläuft sich das

Anker/BSA-Verhältnis auf mehr als 40/1. Daraus lässt sich ableiten, dass trotz der parallel

ablaufenden Hydrolyse des BPS-TRE jedes BSA-Molekül mit mehr als einem Sterol-PEG

umgesetzt wird. Vor diesem Hintergrund ist die geringe Abhängigkeit der Kopplungseffizienz

von der Lipidzusammensetzung einzusehen.

Geht man davon aus, dass sich für die Fixierung eines Proteins an der Oberfläche eines

Liposoms mehrere Sterolanker beteiligen können ist es vorstellbar, dass die Anzahl der

Sterole, die sich in die Liposomen einlagern können in (fast) jedem Fall ausreicht, um das

Protein zu fixieren. Deshalb ist das Protein bei den fluiden Membranen eventuell lediglich

über eine größere Anzahl von Verankerungen an der Oberfläche immobilisiert, so dass die

Stabilität der Fixierung in diesem Fall größer sein mag.

In Betracht zu ziehen ist auch, dass die NMR-Versuche (vgl. 5.3.2) gezeigt haben, dass die

Insertion von BPS in HSPC/Chol/MPEG- und HSPC/Chol-Liposomen oberhalb von 2,4 bzw.

3,2 mol% zum Erliegen kommt. Da die Hydrolyse parallel zur Derivatisierung stattfindet, ist

davon auszugehen, dass ein Teil der Aufnahmekapazität der Membran für die Sterolanker

bereits durch hydrolysiertes, freies BPS abgesättigt wird.

Die Ligandendichte, die sich mit der BPS-TRE Methode an der Liposomenoberfläche

BSA/GL [mol/mol]

Anker/BSA (Anker/Amin) % gebunden µg BSA/µmol

GL BSA/Liposom

(genähert)

c BSA

[mg/ml] 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5

EPC/Chol

7/3

97,1

0,70

78,7

2,34

24,4 0,13

99,0 2,8 54 218

HSPC/Chol 99,9

0,32

73,1

1,87

25,0 0,11

91,3 2,3 55 202

HSPC/Chol

/MPEG

1/2700 1/540 ca. 220

(>3)

ca. 44

(>0,6)

93,3

0,35

70,1

2,33

23,32 0,1

87,63 2,1 52 195

Ergebnisse und Diskussion 135

einstellen lässt, liegt unter den gewählten Bedingungen zwischen 25 und 100 µg BSA/µmol

GL. Berücksichtigt man, dass die Molekularmasse eines Antikörpers mehr als doppelt so hoch

ist wie die des BSA, sollte die optimale Antikörperlast von 30 - 50 µg/µmol PL mit der BPS-

TRE Methode leicht erreicht werden können.

Überschlägt man die Anzahl der BSA-Moleküle pro Liposom, indem man die unter 4.7

gemachten Vereinfachungen annimmt, wurden zwischen 50 und 200 BSA-Moleküle an die

Oberfläche der Liposomen gebunden - eine Ligandenanzahl, die für eine Interaktion mit dem

Zielgewebe ausreichen sollte. Angesichts der groben Vereinfachungen, die für die

Berechnung der Ligandenanzahl pro Liposom als gültig angenommen wurden, wird auf die

Angabe der Standardabweichung verzichtet.

5.4.2.4 Calcein-Freisetzung bei Einlagerung des BSA-BPS-Komplexes

Erwartungsgemäß sollte sich die Freisetzung von Calcein bei der Einlagerung des BSA-BPS-

Derivates in die Liposomen gegenüber dem reinen PEG-Sterol nicht wesentlich verändern.

Vielmehr wurde verringerte Freisetzung angenommen, da die Fixierung des BPS am BSA-

Molekül zu verringerter Mobilität und eventuell der sterischen Hinderung der Einlagerung

einzelner PEG-Sterole in die Membran führen könnte. Zur Kontrolle dieser Annahme und zur

Demonstration der Stabilität der Membranen bei der Einlagerung der Konjugate oberhalb und

unterhalb der CMC des BPS wurde entsprechend 4.5.4.2 und 4.5.4.1 vorgegangen.

Zunächst erfolgte die Bestimmung des freigesetzten Calceinanteils bei Einlagerung des

Protein-PEG-Sterol Komplexes in HSPC/Chol/MPEG- und EPC/Chol 7/3-Liposomen

unterhalb der CMC. In beiden Fällen lag die freigesetzte Menge an Calcein knapp unter dem

Wert, der bei der Einlagerung des reinen PEG-Sterols in dieselben Membranen ermittelt

worden war. Dieser lag bei EPC/Chol 7/3 Liposomen bei 3,5% und für die

HSPC/Chol/MPEG Liposomen bei 2,2 % (vgl. 5.3.4.1).

Auch die Ermittlung der Freisetzung des Calcein aus fluiden Liposomen oberhalb der CMC

zeigte mit knapp 5,3% freigesetztem Calcein einen um ca. 1% (in Bezug auf die maximale

Freisetzung) verringerten Anteil an unverkapseltem Marker.

136 Ergebnisse und Diskussion

5.4.2.5 Stabilität des Liposom-BSA-Komplexes in humanem Serum

Liposomen zeigen im Serum eine deutlich geringere Stabilität als in Puffer. Sie sind hier

sowohl der Interaktion mit Plasmakomponenten (vgl. 1.1.5.2) als auch enzymatischen

Attacken ausgesetzt.

Als kritische Stellen für die Stabilität der Verbindung zwischen Liposom und Ligand sind

einerseits die Verankerung des Liganden in der Membran, die rein hydrophober Natur ist, und

die kovalente Bindung zwischen Ligand und Membrananker anzusehen (Parr et al. 1994).

Wird die kovalente Bindung zwischen Lipidanker und Ligand gespalten, oder die

Liposomenmembran durch die Wechselwirkung mit dem Komplementsystem, dem Entzug

von PL durch Serumlipoproteine und weiteren enzymatischen Attacken in ihrer Integrität

dermaßen beeinträchtigt, dass der Lipidanker mit ankonjugiertem Liganden als Ganzes nicht

genug Halt in der Membran findet, ist eine Interaktion mit dem Zielgewebe nicht mehr

gewährleistet.

Die Untersuchung der Stabilität der Verankerung in humanem Serum liefert einen ersten

Anhaltspunkt für die zu erwartende in vivo Stabilität des gesamten Systems (Ishida et al.

Abb. 5-29: Calcein-Freisetzung bei Einlagerung des BSA-BPS-Konjugats in Liposomen-membranen

0

1

2

3

4

5

6

7

HSPC/Chol/MPEG + BSA-BPS-Konjugat EPC/Chol 7/3 + BSA-BPS-Konjugat EPC/Chol 7/3 + BSA-BPS-Konjugat (>CMC)

freig

eset

ztes

Cal

cein

[%]

Ergebnisse und Diskussion 137

1999). Auch in diesem Versuch dienten die EPC/Chol 7/3-, die HSPC/Chol- und

HSPC/Chol/MPEG-Liposomen als Repräsentanten für fluide, rigide und PEGylierte

Liposomen als Modellsysteme. Nach der Durchführung der Kopplung von BSA an die

Liposomen erfolgte die Abtrennung des freien BSA vom liposomal gebundenem. Das

Elutionsprofil ist in Abb. 5-30 dargestellt. Rund 80% des BSA werden mit den Liposomen

koeluiert.

Abb. 5-31 zeigt das Elutionsprofil derselben Ansätze nach 20-stündiger Inkubation der

Liposomen mit gleichem Volumen an humanem Serum bei 37 °C. Alle drei Ansätze zeigen

keine Neuentstehung von freiem BSA. Es ist daher davon auszugehen, dass die bei der

Kopplung der Liposomen ausgebildete kovalente Bindung zum Sterolanker auch in

Anwesenheit des Serums und der darin enthaltenden Enzyme (insbesondere der Esterasen, die

die teils auftretende Sulfoacetamidbindung spalten könnten) stabil ist.

Der vierte Ansatz diente der Überprüfung der Nachweisbarkeit von abgespaltenem BSA nach

Inkubation mit humanem Serum. Hierzu wurde einem Ansatz ein freier Anteil an 125I-

markiertem BSA zugesetzt. Auf diese Weise sollte auf eine denkbare Bildung von

Aggregaten des neu entstandenen freien BSA mit anderen Serumkomponenten, resultierend in

der Koelution mit den Liposomen, geprüft werden. Ebenso ist die Anlagerung des freien BSA

an Serumlipoproteine denkbar. Auch dieser Vorgang würde die tatsächliche Entstehung von

freiem BSA verschleiern. Bei Auftreten dieser Phänomene sollte der Zusatz der sehr geringen

Stoffmenge des markierten BSA einen solchen Vorgang durch die Eliminierung des zweiten

Peaks demonstrieren.

Der Aufbau der Versuchsreihe orientierte sich an dem in Ishida et al. (1999) zur

Untersuchung der Bindungsstabilität zwischen Liposom und Ligand nach Anwendung der

PIT angewendeten Methodik. Allerdings ist das gewählte experimentelle Setup lediglich in

Bezug auf die Stabilität der Bindung zwischen Membrananker und Ligand wirklich

aussagekräftig. Die Integrität der Bindung zwischen Liposom und Membrananker kann durch

diesen Versuch nicht eindeutig geklärt werden, da eine Umlagerung des BSA-BPS-Konjugats

aus der Liposomenmembran in Serumlipoproteine denkbar ist. In diesem Fall ist davon

auszugehen, dass BSA, das nicht mehr liposomal sondern z.B. an einem LDL gebunden

vorliegt, mit den liposomalen Fraktionen eluiert wird, so dass mittels GPC keine

Differenzierung möglich ist. Aufschluss über diese Fragestellung könnte eine

Dichtezentrifugationsversuch oder ein Free-Flow Experiment liefern.

138 Ergebnisse und Diskussion

linke Achse:

━■━ EPC/Chol

━●━ HSPC/Chol ━▲━ HSPC/Chol/MPEG

━◆━ HSPC/Chol plus BSA

rechte Achse:

━□━ EPC/Chol

━○━ HSPC/Chol ━△━ HSPC/Chol/MPEG

0 4 8 12 16 20 24 28

0

10

20

30

40

Fraktionsnummer

BSA

/Fra

ktio

n [%

]

0

20

40

60

80

100

Sum

me der G

esamtaktivtät

Abb. 5-31: Elutionsprofile der Rechromatographie nach Inkubation derselben Ansätze von BSA-Liposomen nach 20 h Inkubation mit 50% (V/V) humanem Serum bei 37 °C

0 5 10 15 200

5

10

15

20

25

30

35

40

45

B

SA

/Fra

ktio

n [%

]

Fraktionsnummer

0

20

40

60

80

100

Sum

me der G

esamtaktivität [%

]

linke Achse:

━■━ EPC/Chol

━●━ HSPC/Chol

━▲━ HSPC/Chol/MPEG

rechte Achse:

━□━EPC/Chol

━○━HSPC/Chol

━△━ HSPC/Chol/MPEG

Abb. 5-30: Elutionsprofil bei Abtrennung des freien Proteins der Kopplungsansätze zur Untersuchung der Serumstabilität BSA-modifizierter Liposomen

[%]

Ergebnisse und Diskussion 139

5.4.2.6 Größenentwicklung der BSA-modifizierten Liposomen

In Abschnitt 5.4.2.3 wurde bereits diskutiert, dass es sehr wahrscheinlich ist, dass jedes BSA-

Molekül mehrfach mit BPS-TRE umgesetzt wird.

Ist ein BSA mit mehreren Sterol-PEG modifiziert, ist es unwahrscheinlich, dass sich alle

Anker in einem Liposom einlagern. Die Folge kann eine Ausbildung eines Netzwerkes aus

Liposomen sein, bei dem das Protein die Rolle eines Quervernetzers übernimmt. Aus diesem

Grund wurde die Größenentwicklung modifizierter Liposomen in Abhängigkeit der

Lipidkomposition und der BSA-Konzentration verfolgt.

Abb. 5-32 gibt einen Überblick über die Resultate der Messreihe. Die PCS Daten belegen eine

deutliche Abhängigkeit der Partikelgrößenzunahme sowohl von der Lipidzusammensetzung

als auch von der BSA-Konzentration im ersten Inkubationsschritt (1 - 5 mg/ml). Eine

besonders ausgeprägte Zunahme der Partikelgröße lässt sich bei den EPC/Chol 7/3-

Liposomen beobachten. Die PCS Messung lieferte für die reine Liposomendispersion 12 h

nach ihrer Herstellung einen durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser von 118 nm.

Die Lagerung der Liposomen bei RT in Anwesenheit von reinem BSA im relevanten

Konzentrationsbereich hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Partikelgröße. Auch die

Abb. 5-32: Entwicklung der Partikelgröße nach Kopplung von BSA an Liposomen der drei Standardzusammensetzungen

0 1 2 3 5 0 1 2 3 5 0 1 2 3 50

100

200

300

400

500

600

700

800

900 0 Wert 4h 12h

EPC/Chol 7/3HSPC/CholHSPC/Chol/MPEG

Parti

kelg

röße

[nm

]

c BSA [mg/ml]

140 Ergebnisse und Diskussion

Inkubation von 7,5 mol% BPS mit den verschiedenen Liposomentypen war von keinem

signifikanten Anstieg der Liposomengröße begleitet.

Hingegen stieg der Durchmesser bei der Inkubation der Liposomen mit dem BSA-BPS

Konjugat bei der Maximalkonzentration innerhalb von 12 h auf über 815 nm an. Bei den

beiden anderen Lipidkompositionen war die Partikelgrößenzunahme nicht so ausgeprägt wie

bei den fluiden EPC/Chol 7/3-Liposomen. Allerdings war auch hier ein deutliches

Partikelwachstum zu verzeichnen. Unter Extrembedingungen (12 h, 5 mg/ml BSA)

verdoppelte sich die Größe der HSPC/Chol/MPEG-Liposomen, während bei den HSPC/Chol-

Liposomen eine Verdreifachung des hydrodynamischen Durchmessers verzeichnet wurde.

Tabelle 5-2: Überblick über die Größenentwicklung und Änderungen des PI bei Lagerung BSA-modifizierter Liposomen (kursiv: vgl. Text)

Bei allen drei Formulierungen war parallel zum Anstieg des z-Av eine deutliche Zunahme des

PI zu beobachten. Die Steigerung des PI spricht für die Zusammenlagerung mehrer Vesikel

zu unregelmäßig geformten Aggregaten und weniger für eine Fusion von Membranen unter

Ausbildung neuer Vesikel. Dies konnte auch durch Cryo-TEM Aufnahmen gestützt werden.

EPC/Chol 7/3 HSPC/Chol HSPC/Chol/MPEG

BSA [mg/ml] 0 1 5 0 1 5 0 1 5

4 h -- 170,1

3,46

374,3

3,21 --

121,8

1,73

228,13

2,51 --

130,3

5,82 172,6

2,7 z-Av

12 h 118,2

1,56

209,9

10,61

816,2

18,4

115,3

2,31

120,5

1,91

334,97

11,72

119,2

1,13

136,0

3,11

226,6

3,6

4 h -- 0,12

0,02

0,28

0,01 --

0,04

0,02

0,2

0,1 --

0,12

0,01

0,26

0,03 PI

12 h 0,098

0,02

0,2

0,01

0,56

0,09

0,076

0,02

0,06

0,04

0,31

0,02

0,083

0,01

0,11

0,01

0,38

0,02

Ergebnisse und Diskussion 141

Abb. 5-33: repräsentative Cryo-TEM Aufnahmen von dialysierten EPC-Liposomen vor (A, B) und nach (C, D) der Kopplung von BSA an die Liposomenoberfläche (Balken: 200 nm)

Zur visuellen Charakterisierung der Aggregate wurden EPC-Liposomen durch

Detergenzdialyse (EPC/OG 1/2 (mol/mol), 10 kDa MWCO, Dialysekammer:

Eigenkonstruktion vgl. 1.1.2.4) hergestellt, da diese Methode unilamellare, eng

größenverteilte Vesikel liefert, die bei elektronenmikroskopischen Untersuchungen ein

homogenes Bild garantieren. Die Bilder A und B zeigen repräsentative Aufnahmen von nicht

Oberflächen-modifizierten Liposomen. Bei niedriger Lipidkonzentration liegen die

Liposomen vereinzelt vor, bei höherer lokaler Konzentration ordnen sie sich in einer Ebene

an. Deformationen der Membranen, wie in Abbildung D zu erkennen, sind auch in diesem

A B

C D D

142 Ergebnisse und Diskussion

Fall nicht zu erkennen. Im Gegensatz dazu erkennt man in Bild C, dass sich die gekoppelten

Vesikel zu Aggregaten formieren, deren einzelne Individuen z.T. in mehreren Ebenen

übereinander angeordnet sind. Bild D stellt ein in manchen Präparationen zu beobachtendes

Phänomen dar, das ausschließlich bei Ligand-modifizierten Liposomen beobachtet wurde: die

Vesikel lagern sich zu Aggregaten zusammen, bei denen die einzelnen Liposomen, unter

Abflachung ihrer Membranen mit definiertem Membranabstand durch sterische

Stabilisierung, miteinander verknüpft sind. Außerdem ist offensichtlich, dass die beobachtete

Partikelgrößenzunahme nicht auf Fusion von Liposomen zurückzuführen ist.

Die Probenpräparation bei der Cryo-TEM verzerrt das tatsächliche Bild der Größenverteilung

des Untersuchungsmaterials, da zu große Strukturen nicht auf dem polymermodifizierten Grid

fixiert bleiben, wenn der Flüssigkeitsfilm mit dem Filterpapier abgezogen wird. Daher ist

davon auszugehen, dass die BSA-modifizierte Probe größere Aggregate enthält, als auf den

Abbildungen zu erkennen sind.

In einer zweiten Versuchsreihe zur Änderung der Partikelgröße wurde untersucht, ob auch

durch einen Einbau von BPS eine Reduzierung der Aggregation möglich ist. Die

Ligandendichte lag in dieser Versuchsreihe bei 21 µg/µmol GL. Dies entspricht -

hochgerechnet auf die Molekularmasse eines Antikörpers - der optimalen Ligandendichte für

in vivo Applikationen. Es wurden EPC/Chol 4/1-Liposomen mit 5 mol% MPEG2000-DSPE

bzw. 7,5 mol% BPS präpariert und mit dem BSA-BPS-Konjugat inkubiert. Der größere PEG-

Lipid-Anteil bei der BPS-Zubereitung trägt der geringeren PEG-Kettenlänge des BPS

Rechnung. Als Kontrolle diente eine konventionelle EPC/Chol 4/1-Präparation, die statt mit

dem BSA-BPS-Konjugat mit nativem BSA inkubiert wurde. Abb. 5-34 verdeutlicht den

Einfluss der verschiedenen PEG-Lipide auf die Stabilisierung der Partikelgröße im Vergleich

zu nicht PEGylierten Liposomen.

Während in Anwesenheit des nativen BSA im Zeitraum von 48 h kein signifikantes

Vesikelwachstum wahrnehmbar ist, zeigt sich wie erwartet auch hier ein Ansteigen der

Partikelgröße der konventionellen EPC/Chol 4/1-Liposomen. Die sterische Stabilisierung mit

MPEG2000-DSPE trägt zu einer deutlichen Stabilisierung der Größe bei. Auch die BPS-

Modifizierung hat einen positiven Einfluss und reduziert die Bildung von Aggregaten klar.

Obwohl die Ligandendichte dieser Versuchsreihe unwesentlich unter der der in Tabelle 5-2

zusammengefassten lag, ist bei der konventionellen EPC/Chol 4/1-Präparation bereits nach

5 h eine größere durchschnittliche Partikelgröße zu verzeichnen als bei der ersten

Ergebnisse und Diskussion 143

Versuchsreihe nach 12 h (vgl. EPC/Chol 7/3 in Tabelle 5-2, kursive Zelle).

Geht man von der Quervernetzung der Liposomen als Ursache des beobachteten Phänomens

aus, ist eine Abhängigkeit der Geschwindigkeit der Aggregatbildung von der

Gesamtlipidkonzentration und der BSA-Konzentration einleuchtend. Da in der zweiten

Versuchsreihe die Endkonzentration in Bezug auf die Lipidkonzentration (15,6 mM

gegenüber 13,3 mM) etwas höher und in Bezug auf die BSA-Konzentration (0,325 mg/ml

gegenüber 0,333 mg/ml) während des zweiten Inkubationsschritts nahezu gleich war, ist die

raschere Bildung von Aggregaten wohl auf die erhöhte Lipidkonzentration, oder den

niedrigeren Cholesterolgehalt der Präparation zurückzuführen.

Das Gesamtbild, das die Versuchsreihen von den Vorgängen der Aggregatbildung entwerfen,

ist schwerer zu interpretieren. Tabelle 5-2 und Abb. 5-32 zeigen, dass die BSA-Konzentration

während der Umsetzung des BPS-TREs mit dem Protein einen entscheidenden Einfluss auf

die Geschwindigkeit der Größenzunahme hat, obwohl eine höhere Proteinkonzentration

während des ersten Inkubationsschrittes einen geringeren Hydrophobisierungsgrad des

einzelnen Proteins bedeutet. Damit ist die Aggregationsneigung in erster Linie von der

0 10 20 30 40 50100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

z-Av

[nm

]

Zeit [h]

━■━ EPC/Chol

+ BPS-BSA

━●━ EPC/Chol/BPS

+ BPS-BSA

━▲━ EPC/Chol/MPEG

+ BPS-BSA

━◆━ EPC/Chol

+ natives BSA

EPC/Chol stets 4/1

(mol/mol)

Abb. 5-34: Zunahme der Partikelgröße als Funktion der Zeit in Abhängigkeit der Lipid-kombination von EPC/Chol 4/1-Liposomen mit MPEG2000-DSPE und BPS

144 Ergebnisse und Diskussion

Ligandendichte des BSA auf der Liposomenoberfläche (vgl. Tabelle 5-1) und erst in zweiter

Linie vom Grad der Umsetzung des aktivierten Lipids mit dem Protein abhängig.

Die PEGylierung der Liposomen mit dem PEG-PE-Derivat bringt eine permanente negative

Ladung in die Liposomenoberfläche ein. Diese führt zu einer elektrostatischen Abstoßung der

Liposomen untereinander und ist ein möglicher Grund für den stabilisierenden Effekt, da eine

Annäherung der Vesikel erschwert wird, so dass die räumliche Ausdehnung eines BSA-

(BPS)n-Derivates nicht zur Quervernetzung zweier Liposomen ausreicht.

Auch BPS zeigt diesen positiven Einfluss im Hinblick auf die Konservierung der

Individualität des Vesikels, ist jedoch ein nicht-ionisches PEG-Derivat. Die beobachtete

schwächere Ausprägung des Effekts ist eventuell auf das fehlende Einbringen einer Ladung

oder den geringeren sterisch stabilisierenden Effekt wegen der kürzeren PEG-Ketten

zurückzuführen.

Während die Kopplungseffizienz von der Lipidzusammensetzung relativ unbeeinflusst bleibt,

ist das Partikelwachstum eindeutig von der Liposomenkomposition abhängig. Die

Beobachtungen zur Einlagerung des BPS in die verschiedenen Liposomentypen (vgl. 5.3.2)

können zur Erklärung der Unterschiede zwischen den einzelnen Liposomenpopulationen

herangezogen werden. Die insgesamt wahrscheinliche schwächere Verankerung der einzelnen

BSA-Moleküle in den HSPC basierenden Membranen führt zu einer geringeren Ausbildung

von Aggregaten.

Das Partikelwachstum ist auch makroskopisch leicht zu beobachten. Die Trübung der

Liposomendispersionen nimmt nach Zugabe derselben zum BSA-BPS Derivat schnell zu. Die

Entwicklung größerer Aggregate ist von praktischem Interesse: ein zu langer zweiter

Inkubationsschritt macht die Aufarbeitung und Charakterisierung durch GPC schwierig, da

ein Teil des Lipids aufgrund der Größe der Agglomerate auf dem Gelbett zurückbleibt. Nach

Ultrazentrifugation von BSA gekoppelten Liposomen wurde die Entstehung von nicht

resuspendierbaren Pellets beobachtet.

Die Ausbildung von Aggregaten bedeutet eine mögliche Einschränkung der gekoppelten

Liposomen in vivo und in vitro. Daher ist ein Kompromiss zwischen Ligandendichte und

Stabilität der Vesikelgröße gefordert, der bei jedem Ligand neu gefunden werden muss.

Der Einsatz von PEG-Derivaten als zusätzliche Membranbestandteile kann zur Minimierung

des Partikelwachstums genutzt werden. Auch ein PG oder PS Anteil in der Membran könnte

durch elektrostatische Abstoßung zur Reduzierung des Phänomens beitragen.

Ergebnisse und Diskussion 145

5.4.3 Versuche unter Verwendung von BPS-NHS

NHS-aktivierte PEG werden schon lange zur Modifizierung von Proteinen verwendet

(Roberts et al. 2002). Im Zusammenhang mit der Kopplung von Proteinen am Liposomen ist

aber bisher keine Literatur vorhanden, obwohl ein käufliches DSPE-PEG-Derivat (vgl. Abb.

5-35) vorübergehend im Handel war. Der Grund für das geringe Interesse an diesem Derivat

liegt wohl in der Kombination der geringen Stabilität der Substanz in wässrigen Medien

(Halbwertszeit wird mit ca. 20 min angegeben; Nektar (vormals Shearwater Polymers)

Produktkatalog) und dem hydrophoben Molekülteil (DSPE), der meist den Einbau in die

Lipidmembran während der Herstellung der Liposomen erfordert (vgl. 1.2.2.1).

Bevor die Verwendung der PIT populär wurde befand sich das NHS-PEG-DSPE nicht mehr

im Handel. Ein weiterer Nachteil dieses aminoreaktiven DSPE-PEG-Derivates liegt in der Art

der Verknüpfung der Abgangsgruppe, die über einen Bernsteinsäurespacer mit dem PEG-

OO

O

FSO

FS

O

PO

O-

ONH

O

OO

OO

ON

O

O

50

OOO

ON

O

O

n=30

pH 7,4 - 8,5 NH2 BSA

n=30O

O

O

NH

BSA

(B)

Abb. 5-35: Umsetzung von NHS-aktiviertem BPS mit BSA und Strukturformel von NHS-PEG-DSPE

(A)

n=

146 Ergebnisse und Diskussion

Anteil des Moleküls verestert ist. Dieser Ester zum PEG legt die Instabilität der Kopplung in

vivo nahe.

Die Umsetzung der distalen Hydroxylgruppe mit N,N’-Disuccinimidylcarbonat (Synthese vgl.

4.1.3) führt zur Ausbildung eines NHS-aktivierten Kohlensäureesters, bei dem NHS als

klassische Abgangsgruppe fungiert.

Der Einsatz von NHS-aktivierten ethoxylierten Sterolen ermöglicht die Modifizierung von

Liposomen mit Proteinen, da sich der hydrophobisierte Ligand - wie im Rahmen dieser Arbeit

gezeigt - bei RT nachträglich in PL-Membranen einlagern kann und die Hydrolyse des NHS-

Esters in Anwesenheit von Aminen zugunsten der Ausbildung des in vivo stabilen

Carbamates (Torchilin et al. 2001a; Roberts et al. 2002) zurückgedrängt wird.

Der Vorteil gegenüber der Tresylmethode liegt in der Möglichkeit auch bei pH-Werten im

neutralen Bereich arbeiten zu können. Zudem entsteht ausschließlich ein definiertes Produkt

(Carbamtbindung), dessen in vivo Stabilität außer Frage steht. Der Nachteil liegt im Verlust

der ursprünglichen Ladung des zur Kopplung genutzten Amins des Liganden (vgl. 5.4.1).

5.4.3.1 Grundsätzliche Eignung von BPS-NHS zur Kopplung von BSA an Liposomen

Wie schon bei der Untersuchung der Eignung der tresylierten PEG-Sterole zur Kopplung von

BSA an die Liposomen wurden auch in den hier resümierten Versuchen Elutionsprofile von

mit reinem BPS (keine Kopplung erwartet) und mit BPS-NHS behandelten BSA (Ansatz mit

erwarteter Kopplung) nach Zugabe von Liposomen verglichen.

Die Kopplung von BSA an die Liposomen ist bei Verwendung von 7,5 mol% BPS-NHS und

einer BSA-Konzentration von 1mg/ml vollständig. Das in Abb. 5-36 dargestellte

Elutionsprofil, das unter Verwendung von EPC/Chol 7/3-Liposomen entstanden ist, ist

repräsentativ für unter gleichen Bedingungen durchgeführte Versuche mit anderen

Lipidkompositionen. Da der für die Verankerung in der Membran verantwortliche Sterolteil

des BSA-BPS-Komplexes bei BPS-NHS-Kopplungen identisch zu den BPS-TRE-

Kopplungen ist, war diese Beobachtung zu erwarten gewesen.

Ergebnisse und Diskussion 147

5.4.3.2 Vergleich der Kopplungseffizienz unter Verwendung verschiedener aktivierter PEG-Lipide

Sinn der Versuchsreihe war es festzustellen, inwiefern die mit dem Sterolanker einstellbare

Ligandendichte auch mit dem DSPE-PEG-Derivat bei der Modifikation von präformulierten

Liposomen unterschiedlicher Zusammensetzung bei RT möglich war. Daher wurden Vesikel

mit bei RT rigider und fluider Membran verwendet und die Elutionsprofile der verschiedenen

aktivierten Lipide verglichen.

Wie Abb. 5-37 verdeutlicht, hat die Art der Bindung zwischen Protein und Anker, wie

erwartet, keinen Einfluss auf die Effizienz der Kopplung des BSA an die

Liposomenoberfläche. Auch mit BPS-NHS ist bei RT eine vollständige Kopplung von BSA

an HSPC/Chol (Effizienz: 95,3 ± 2,5 %, n=3, bei c[BSA] = 1mg/ml, 5 mol% BPS-NHS,

Endkonzentration des Ansatzes 13,3 mM Lipid) und fluide EPC basierende Liposomen

(Effizienz: 97,2 ± 3,4 %, n=3, bei c[BSA] = 1mg/ml, 5 mol% BPS-NHS, Endkonzentration

des Ansatzes 13,3 mM Lipid) möglich.

Abb. 5-36: Vergleich des Elutionsverlaufs bei der Verwendung von BPS-NHS bzw. nicht aktiviertem BPS während des ersten Inkubationsschritts

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

0

2

4

6

8

10

12

Aktiv

ität [

kcpm

]

Fraktionsnummer

━■━ Elutionsprofil

bei Verwendung von

BPS-NHS im ersten

Inkubationsschritt

━●━ Elutionsprofil

bei Verwendung von

BPS im ersten

Inkubationsschritt

148 Ergebnisse und Diskussion

0 5 10 15 20

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

% B

SA/F

rakt

ion

Fraktionsnummer

━■━ Elutionsprofil

bei Inkubation über

Nacht und RT

━●━ Elutionsprofil

bei Inkubation für

eine Stunde bei 60 °C

Abb. 5-38: Vergleich des Elutionsverlaufs bei Verwendung von NHS-PEG-DSPE zur Kopplung von BSA an HSPC/Chol Liposomen

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

0

10

20

30

40

50

60

% B

SA/F

rakt

ion

Fraktionsnummer

━■━ HSPC/Chol

━●━ EPC/Chol 4/1

Abb. 5-37: Elutionsprofile bei Verwendung von BPS-NHS zur Kopplung von BSA an Liposomen verschiedener Membranzusammensetzung und RT beim zweiten Inkubationsschritt

Ergebnisse und Diskussion 149

Der Vergleich der Kopplungseffizienz bei Verwendung von 5 mol% BPS-NHS und BPS-

GET liefert unter den gewählten Bedingungen keine signifikanten Unterschiede. Beide

Methoden führen zu einer für die nahezu vollständige Kopplung ausreichenden

Hydrophobisierung des eingesetzten BSA (vgl. Abb. 5-23).

Die Fixierung von BSA an Liposomen mittels NHS-PEG-DSPE funktioniert nur, wenn im

zweiten Inkubationsschritt bei erhöhten Temperaturen inkubiert wird.

Abb. 5-38 demonstriert die klare Temperaturabhängigkeit der Insertion des BSA-PEG-DSPE-

Konjugats in HSPC/Chol-Liposomen. Während die Inkubation des mit dem

NHS-PEG-DSPE umgesetzten BSA auch über Nacht keine nennenswerte BSA-Dichte an der

Liposomenoberfläche garantieren kann, reicht bereits eine Stunde Inkubation bei 60 °C aus

um ca. 75 % des Proteins an der Liposomenoberfläche zu fixieren.

Inwieweit sich durch eine längere Inkubationsdauer bei erhöhter Temperatur eine bessere

Kopplungseffizienz erreichen lässt, wurde bisher nicht untersucht. Da das aktivierte

DSPE-PEG-Derivat wie die anderen Lipide 5mol%ig eingesetzt wurde und die Chemie der

Kopplungsreaktionen der beiden NHS-Lipide nahezu identisch ist, ist zu erwarten, dass die

Effizienz mit länger dauernder Inkubation bei 60 °C quantitativer verläuft.

Andere mögliche Erklärungen für die nicht vollständige Kopplung liegen im

Aktivierungsgrad des NHS-PEG-DSPE, der mittels 1H NMR analog zu 5.1.2 bestimmt wurde

und bei 85% lag. Außerdem ist die Hydrolyse des Bernsteinsäure-PEG-Esters zu bedenken.

150 Zusammenfassung

6 Zusammenfassung und Ausblick

Bei der Entwicklung neuer Therapiekonzepte gerät das aktive Ansteuern von pathologisch

verändertem Gewebe mehr und mehr in den Focus der Forschung, um bei maximaler

Effizienz minimale unerwünschte Wirkungen zur erreichen. Die Funktionalisierung von

liposomalen Zubereitungen mit zielgerichteten Vektoren stellt einen hoffnungsvollen

Ausgangspunkt auf dem Weg zur Entwicklung intelligenter Wirkstoffträgersysteme dar.

Mit der therapeutischen Etablierung von sterisch stabilisierten Doxorubicin-haltigen

Liposomen, die der schnellen Eliminierung aus der systemischen Zirkulation entgehen (Allen

et al. 1991), ist eine Komponente eines solchen Systems vorhanden.

Die stark im Vormarsch befindliche Entwicklung von monoklonalen, humanisierten und

chimären Antikörpern zur Nutzung als Therapeutika oder Diagnostika (besonders im

onkologischen Bereich) liefert eine immer größer werdende Zahl von möglichen Liganden,

die zur aktiven Zielausrichtung von Liposomen genutzt werden können. Auch die in den

Anfängen der Immunoliposomen beobachteten Probleme in Bezug auf Immunogenität und

Interaktion der modifizierten Vesikel mit Makrophagen (Harding et al. 1997) konnten durch

die Verwendung dieser Liganden weitgehend überwunden werden (Park et al. 2001).

Kombiniert man die sterische Stabilisierung von Liposomen mit der Kopplung von Liganden

an die distale Hydroxylfunktion von Polyethylenglykolketten, lassen sich in vivo und in vitro

die besten Targetierungserfolge erzielen.

Die Kopplungsmethoden, die üblicherweise zur Fixierung von Liganden an der liposomalen

Oberfläche eingesetzt werden sind zwar effizient, jedoch nach wie vor kompliziert, teuer und

nicht universell einsetzbar (vgl. 1.2). Für die weit verbreitete Methode der Kopplung von

Liganden über die Ausbildung einer Thioetherstruktur zu Maleimid-aktivierten Lipiden ist in

der Regel das Einführen von Thiolstrukturen in den Liganden erforderlich. Die

Thiolierungsreagenzien setzen dabei an Aminen des zu koppelnden Vektors an, so dass die

Bindung zwischen diesem und dem Liposom indirekt über Amine vermittelt wird.

Aminoreaktive Kopplungsreagenzien vermeiden also einen Präparationsschritt und die

resultierende analytische Charakterisierung des thiolierten Liganden. Sie sind somit den

thiolaktiven vorzuziehen, weisen jedoch i.d.R. Hydrolyseempfindlichkeit auf und bergen die

Gefahr der Reaktion mit anderen Systemkomponenten, so dass sie nicht während der

Liposomenpräparation in die Membran der Vesikel integriert werden können. Daher müssen

Zusammenfassung 151

die zu fixierenden Liganden in einer vorgeschalteten Derivatisierungsreaktion mit aktivierten

PEG-Lipiden hydrophobisiert und anschließend in die Membran vorgefertigter Liposomen

implementiert werden. Die von Zalipsky und Ishida (Zalipsky et al. 1997; Ishida et al. 1999)

eingeführte Technik zur nachträgliche Modifizierung liposomaler Membranen (vgl. 1.2.2.1)

erfährt durch die notwendigen erhöhten Temperaturen und unbefriedigende Ligandendichte

an der Oberfläche sterisch stabilisierter Liposomen erhebliche Einschränkungen in ihrer

praktischen Bedeutung. Die Ursache für die geschilderte Problematik liegt in der Art des

hydrophoben Membranankers (i.d.R. Distearoylphosphatidylethanolamin) begründet, bei

denen sich die zwei Kohlenwasserstoffketten nur schlecht in die Liposomenmembran

einfügen.

Die Entwicklung eines aminoaktiven Kopplungsreagenzes mit alternativem Membrananker

zur nachträglichen Modifizierung liposomaler Oberflächen bei Raumtemperatur würde die

Präparation sterisch-stabilisierter, zielgerichteter Liposomen deutlich vereinfachen. Im

Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob chemisch aktivierte, ethoxylierte

(PEGylierte) Sojasterole zur Funktionalisierung von Liposomen geeignet sind.

PEGylierte Sojasterole sind halbsynthetische Massenprodukte, die in der Waschmittel- und

Kosmetikindustrie zum Einsatz kommen. Aus diesem Grund sind sie preiswert und wurden

kostenfrei zur Verfügung gestellt. Allerdings werden im nicht-pharmazeutischen Bereich auch

nur geringe Anforderungen an die Reinheit des Produktes gestellt, so dass in dieser Arbeit

eine Aufreinigung des Ausgangsmaterials notwendig war. Die Hauptverunreinigung ist freies

Polyethylenglykol (PEG), das sehr effizient mittels mizellarer Chromatographie in Wasser

entfernt werden konnte (vgl. 4.1.1).

Eine Grundvoraussetzung für die Verwendbarkeit PEGylierter Sojasterole zur nachträglichen

Funktionalisierung liposomaler Oberflächen bei Raumtemperatur ist die selbstständige

Einlagerung der Substanzen in Phospholipidvesikel. Die mittels quantitativer 1H NMR

bestimmten Einlagerungsraten lagen in Abhängigkeit der Membranzusammensetzung

zwischen 90 und 30% des angebotenen Materials. Daraus resultierte ein PEG-Lipid-Gehalt

der Membran von 6,75-2,4 mol% in Bezug auf das Gesamtlipid (vgl. 5.3.2).

Da die Einlagerung der PEG-Sterole ausschließlich in den äußeren Monolayer erfolgt, ist das

Auftreten von Membranspannungen mit daraus entstehenden Membrandefekten zu erwarten.

Das Ausmaß dieser Schädigungen wurde mittels Fluoreszenz-Dequenching untersucht. Bei

Einlagerung der PEGylierten Sojasterole wurde in selbst-quenchender Konzentration

verkapseltes Calcein aus den Liposomen freigesetzt und fluoreszenzspektrometrisch

152 Zusammenfassung

quantifiziert (vgl. 4.5.4). Je nach Membranzusammensetzung und Menge des eingesetzten

Membranankers ergaben sich Freisetzungsraten zwischen 1 und 8% des verkapselten Markers

(vgl. 5.3.4.1) Werte, die mit den Freisetzungsdaten der Einlagerung von PEGylierten

Phosphatidylethanolaminderivaten vergleichbar sind (Uster et al. 1996). Da die

Membranschäden außerdem transienter Natur waren, bedeuten sie keine Einschränkung der

Verwendbarkeit der PEGylierten Sterole zum Zwecke der Liposomenfunktionalisierung.

Die eigentliche Kopplung von Liganden an die Oberfläche von Liposomen läuft in

Konzentrationsbereichen oberhalb der CMC ab. Daher war neben den Membrandefekten

durch die Einlagerung der Derivate mit zusätzlicher Freisetzung von verkapseltem Material

durch Solubilisierungseffekte zu rechnen. Die Bestimmung der Freisetzung von Calcein

oberhalb der CMC (vgl. 4.5.4.2) ergab, dass diese nur unwesentlich über den Werten der

Freisetzung, provoziert durch die reine Einlagerung der Derivate, lag (vgl.5.3.4.2).

Auch in mikrokalorimetrischen Untersuchungen (vgl. 4.5.3 und 5.3.3) bestätigte sich das

geringe Solubilisierungspotential der PEG-Sterole. Selbst bei hohen Konzentrationen der

PEG-Lipide (PEG-Lipide/Lipid 1:1 mol/mol) konnten keine Solubilisierung der Membran

beobachtet werden. Außerdem lieferten diese Untersuchungen einen hohen lipidnormierten

Verteilungskoeffizienten (> 50 mmol-1), der auf eine stabile Membranverankerung hindeutet.

Die chemische Aktivierung der terminalen Hydroxylfunktion des PEG-Teils des Moleküls

durch Tresylchlorid wurde erstmals von A. Lung (Skalko et al. 1998; Lung 2002) beschrieben

und führte zu einem Derivat, dass zur Kopplung von Proteinen an Liposomen genutzt werden

konnte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde durch die Optimierung der von A. Lung

beschriebenen Synthese und Modifikation der Aufreinigungsschritte der tresylierten Sterole

(vgl. 4.1.2) eine vollständige Aktivierung des PEG-Sterols mit Tresylchlorid erreicht und

mittels 1H NMR gezeigt (vgl. 5.1.1).

Nachdem unter Verwendung von radioaktiv markiertem BSA als Modellprotein mittels

Gelpermeationschromatographie und Free-Flow-Elektrophorese (vgl. 4.6.4.2) gezeigt wurde,

dass die Verwendung von tresylierten PEG-Sterolen die Kopplung von Proteinen an

liposomale Oberflächen erlaubt (vgl. 5.4.1.1), wurde der Funktionalisierungsprozess in Bezug

auf den pH-Wert, die Menge des zu verwendenden tresylierten Sterols und die Dauer der

beiden Inkubationsschritte optimiert (vgl. 4.6.3 und 4.6.4).

Die Kopplung der Proteine läuft in zwei einfachen Inkubationsschritten bei Raumtemperatur

ab (vgl. 4.6.1). Im ersten Schritt wird eine Lösung des zu koppelnden Proteins mit einer

Zusammenfassung 153

ethanolischen Lösung des aktivierten Lipids gemischt, oder in ein Reaktionsgefäß

eingebracht, dessen Wände mit dem aktivierten Anker gecoatet sind. Nun erfolgte die erste

Inkubation, in der das Protein durch Umsetzung seiner Aminofunktionen mit dem tresylierten

PEG-Derivat hydrophobisiert wird. Nach Zugabe der Liposomen beginnt der zweite

Inkubationsschritt, während dessen die Einlagerung des derivatisierten Proteins in die

Liposomen stattfindet.

Wie die Literatur nahe legte (Sperinde et al. 1999), war die Derivatisierung des Proteins im

schwach-alkalischen pH-Bereich von 8,0 - 9,0 weit effektiver als im neutralen pH-Bereich

(vgl. 5.4.1.2), was sich in wesentlich höheren Kopplungseffizienzen äußerte.

In Bezug auf die Abhängigkeit der Kopplungseffizienz von der Menge des eingesetzten

aktivierten Lipids zeigt Kapitel 5.4.1.3 auf, dass bereits 1 - 5 mol% des aktivierten Lipids in

Bezug auf das Gesamtlipid der Liposomendispersion ausreichen, um eine Ligandendichte von

20 µg Protein/µmol Lipid auf der liposomalen Oberfläche einzustellen. Rechnet man diese

Proteinmenge auf die Molekularmasse eines Antikörpers hoch, liegt die Ligandendichte in

einem Bereich, der für ein erfolgreiches Targeting optimal ist (Hansen et al. 1995).

Durch Zufügen eines großen molaren Überschusses eines Amins während des ersten

Inkubationsschrittes konnte die Derivatisierungsreaktion unterbrochen werden. Auf diese

Weise ließ sich ermitteln, dass eine 12stündige Dauer für den ersten Schritt des

Kopplungsprotokolls auch unter schlechten Bedingungen ausreichend ist (vgl. 5.4.1.4). Die

Dauer des zweiten Inkubationsschritts wurde durch Unterbrechung des Einlagerungsschrittes

des Kopplungsprotokolls mittels Gelpermeationschromatographie bestimmt. So konnte

gezeigt werden, dass in diesem eine Inkubation von 2 h völlig ausreicht, um die Bindung des

Proteins an die Liposomen zu vervollständigen (vgl. 5.4.2.1).

Auch die Freisetzung des Markers bei Einlagerung des Protein-Anker-Komplexes in Calcein-

beladene Liposomen ober- und unterhalb der CMC war von Interesse, um abschätzen zu

können, ob der Komplex einen negativen Einfluss auf die Membranintegrität ausübt.

Verglichen mit dem freien PEG-Sterol beobachtet man in diesen Fällen eine verringerte

prozentuale Freisetzung des Calceins, was für eine Reduktion der auftretenden

Membrandefekte spricht (vgl. 5.4.2.4). Die Fixierung der Sterole am Protein führt zu einer

verringerten Mobilität der Ankermoleküle und kann so und auf sterische Art das Ausmaß der

Einlagerung im Vergleich zum freien Molekül verringern. Oberhalb der CMC stellt sich die

Frage, ob nach der Umsetzung des Lipids mit dem Protein, angesichts der fundamentalen

Veränderung der Polaritätsverhältnisse und der Umsetzung des Proteins mit dem aktivierten

154 Zusammenfassung

PEG-Lipid, überhaupt noch Mizellen vorliegen, die durch Solubilisierung der Membran eine

Steigerung der Calcein-Freisetzung provozieren könnten.

Weitere Versuchsreihen beschäftigten sich mit der Untersuchung des Einflusses der

Lipidkomposition auf die Kopplungseffizienz und das Partikelwachstum während des zweiten

Inkubationsschrittes (vgl. 4.6.4.3 und 4.6.4.4). Beides wurde auch in Abhängigkeit der

Proteinkonzentration analysiert. Die Lipidkompositionen der unterschiedlichen

Liposomenspezies wurden so gewählt, dass bei Raumtemperatur sowohl fluide als auch bei

Raumtemperatur rigide Membranen vorlagen. Eine drittes Spezies repräsentierte sterisch

stabilisierte rigide Liposomen. Wie erwartet nimmt die relative Kopplungseffizienz mit

zunehmender BSA-Menge ab. Dennoch lässt sich auf Kosten der relativen

Kopplungsausbeute absolut eine höhere Ligandendichte einstellen (vgl. 5.4.2.3). Da bei allen

Versuchen der Anker im molaren Überschuss gegenüber dem Protein vorlag, liegt die

Vermutung nahe, dass eine größere Anzahl von Sterolen pro Protein nur für eine stabilere

Bindung des Proteins an der Liposomenoberfläche sorgt, und bereits wenige Sterolanker für

die Fixierung des Proteins an der Oberfläche des Liposoms ausreichen. Dafür spricht auch,

dass die Unterschiede in der Membranzusammensetzung nur einen geringen Einfluss auf die

Kopplungseffizienz haben, obwohl die NMR-Versuche eine deutliche Abhängigkeit der

Insertionsrate von der Lipidzusammensetzung der Membran demonstriert haben.

Mittels Photonenkorrelationsspektroskopie wurde die Entwicklung der Partikelgröße während

des zweiten Inkubationsschrittes untersucht (vgl. 4.6.4.4). Die Größenentwicklung während

der Einlagerung des Protein-Anker-Komplexes in die Liposomenmembran ist auf die

Quervernetzung von Liposomen über das zu koppelnde Protein zurückzuführen. Die

Geschwindigkeit der Größenzunahme hängt wesentlich von der Proteinkonzentration während

der Derivatisierungsreaktion (erster Inkubationsschritt) und der Lipidkomposition der

Membran ab. Fluide Liposomen mit einer Größe von ca. 120 nm agglomerieren innerhalb

kurzer Zeit zu polydispersen großen Aggregaten (> 800 nm), während sterisch stabilisierte

Liposomen nur eine geringe Zunahme von Polydispersität und Größe aufweisen (vgl. 5.4.2.6).

Der Einbau von PEG-Lipiden in die Vesikelmembran erlaubt auch bei fluiden Vesikeln eine

signifikante Reduktion der Partikelgrößenzunahme, ohne dass, wie für Phospholipid-PEG-

Derivate gezeigt (vgl. 5.4.2.3), eine nicht hinnehmbare Reduktion der Ligandendichte zu

befürchten wäre. Da jedes Protein mehrere Anker tragen kann, ist die Verknüpfung der

Liposomen untereinander eine logische Folge. Dass nicht etwa Fusionsprozesse für die

Größenzunahme verantwortlich sind konnte durch Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie

Zusammenfassung 155

nachgewiesen werden. (vgl. 4.4.3 und 5.4.2.6).

Einen ersten Hinweis auf die in vivo Stabilität der Verankerung lieferten

Rechromatographieversuche nach der Inkubation der Liposomen mit humanem Serum bei

37 °C (vgl. 4.6.4.5). Die Auswertung des Experiments zeigte, dass der Einfluss von

Serumkomponenten nicht zu einer Abspaltung des gekoppelten Proteins von der liposomalen

Oberfläche führt (vgl. 5.4.2.5) und deutet damit auf eine auch in vivo stabile Verknüpfung

hin.

Als eine Alternative zum Tresylchlorid als Aktivierungsreagenz wurde N,N’-

Disuccinimidylcarbonat eingeführt, das in einer einfachen einstufigen Synthese mit den

PEGylierten Sterolen umgesetzt wurde (vgl. 4.1.3). Der entstehende N-Hydroxysuccinimid-

Polyethylenglykol-Kohlensäurediester reagiert bei neutralem pH-Wert mit Aminen unter

Ausbildung eines in vivo stabilen Carbamates ab. Analog zur Kopplung mittels tresylierten

PEG-Sterolen konnte die grundsätzliche Eignung der Substanz zur Kopplung von Proteinen

an Liposomen gezeigt werden (vgl.5.4.3.1). Damit stehen zwei aktivierte Sterole zur

Verfügung um je nach Anforderung des Experimentes bei unterschiedlichen pH-Werten

aminoaktive Kopplungen von Proteinen an Liposomenoberflächen durchzuführen.

Insgesamt konnte gezeigt werden, dass aktivierte PEGylierte Sterole als mögliche Kandidaten

zur Funktionalisierung von Liposomen in Frage kommen und ihre Eignung in weiteren

Versuchen verifiziert werden sollte, da sie das Potential haben, die Funktionalisierung von

liposomalen Zubereitungen entscheidend zu vereinfachen. Die Einlagerung in Liposomen

verschiedenster Zusammensetzung verläuft rasch und ohne die Entstehung permanenter

Membrandefekte. Mittels der aminoaktiven tresylierten und N-Hydroxysuccinimid-aktivierten

PEG-Sterole sind mit einem einfachen Zwei-Schritt-Kopplungsprotokoll hohe

Ligandendichten an der liposomalen Oberfläche einstellbar, ohne dass eine Erhöhung der

Temperatur notwendig wäre. Die problematische Größenzunahme während der Einlagerung

des Protein-Anker-Komplexes in die Liposomenmembran lässt sich durch einen PEG-Lipid-

Anteil der Membran, sowie eine zeitliche Begrenzung des zweiten Inkubationsschrittes in den

Griff bekommen.

In zukünftigen Untersuchungen kommt es nun darauf an zunächst in Zellversuchen und später

im Mausmodell die Eignung der Substanzen zu verifizieren. Ein kritischer Punkt ist sicherlich

die Stabilität der hydrophoben Membranverankerung, über die letztlich bloß ein in vivo

Experiment Aufschluss geben kann. Auf jeden Fall sollten sich die Substanzen jedoch für

Targetierungsversuche im Zellmodell eignen. Sollten in vivo Versuche demonstrieren, dass

156 Zusammenfassung

die sterische Stabilisierung durch PEG-Sterole nicht in ausreichendem Maße gewährleistet

werden kann, besteht die Möglichkeit bereits PEGylierte Liposomen zu funktionalisieren.

Außerdem erfordert nicht jede Applikation eine Zirkulationszeit von deutlich über 10

Stunden. Sollen sowohl Gewebsmakrophagen als auch humorale Makrophagen angesteuert

werden, wie im Falle der Behandlung der chronischen Granulomatose (vgl. Gerber et al.

(2001) und Kimpfler (2003)), ist eine kürzere Halbwertzeit durchaus wünschenswert. Des

weiteren ist eine Verwendung im Bereich der liposomalen Immunisierung denkbar, die in

letzter Zeit immer intensiver untersucht wird. Aufgrund der starken Immunogenität liposomal

präsentierter Antigene zeigen solche Zubereitungen deutliche Vorteile gegenüber

herkömmlichen Impfzubereitungen (Humphries et al. 2004; Neidhart et al. 2004). Auch in

diesem Fall ist nicht unbedingt eine lange Zirkulationszeit der modifizierten Vesikel

erwünscht.

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Persönliche Daten und Lebenslauf Persönliche Daten

Name: Thomas Steenpaß

Geburtsort: Bocholt

Geburtsdatum: 27.09.1973

Familienstand:

Kinder:

verheiratet mit Silja Steenpaß, geborene Nobes

Zwillinge Melina und Jan Steenpaß (*17.02. 2004)

Nationalität: deutsch

Lebenslauf Schulausbildung 08/1980 - 06/1984

08/1984 - 06/1993

Grundschule Dingden

St. Josefs-Gymnasium in Bocholt

Abschluss Abitur

Wehrdienst 07/1993 - 10/1994 Pflegediensthelfer im St. Josef Altenpflegeheim Dingden

Studium WS 93/94

SS 94 - WS 99

05/1999 - 10/1999

11/1999 - 04/2000

05/2000

06/2000

Beginn des Pharmaziestudiums an der J.W. Goethe Universität in Frankfurt am Main

Fortführen des Studiums an der H.H. Universität Düsseldorf

Erster Teil des Praktischen Jahres bei der BASF-AG Ludwigshafen

Zweiter Teil des Praktischen Jahres in der Wilhelm Busch Apotheke in Bocholt

Drittes Staatsexamen

Approbation als Apotheker

Promotion 06/2000 - 07/2004 Doktorand am Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie an der

Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Arbeitskreis von Prof. Dr. R. Schubert;

Arbeiten zum Thema “PEGylierte Sterole zur Funktionalisierung liposomaler Oberflächen“