PEMERIKSAAN LABORATORIUM INFEKSI TROPIS

Laboratorium Patologi Klinik

Fakultas Kedokteran Unissula

MALARIA

Diagnosis malaria dapat ditegakkan melalui :

1. Diagnosis klinis

2. Malaria blood smear : hapusan darah tipis (thin blood film)

tetes tebal (thick blood film)

3. Fluorescent microscopyMisal : menggunakan Acridine Orange (AO) → Bio-Imaging navigatoratau mikroskop fluoresens

“Quantitative Buffy coat”

4. Antigen detection menggunakan metode imunokromatografi(ICT) → Rapid Diagnostic Test (RDT)

5. Polymerase Chain Reaction (PCR)

6. Intraleucocytic malaria pigment (hemozoin) → flowcytometry

PEMERIKSAAN LABORATORIUM MALARIA

Secara garis besar diagnosis laboratoris demam malaria:

- Pemeriksaan mikroskopik (Malaria Blood Smear)

- Uji imunoserologis (Ag spesifik/ Ab spesifik thd Plasmodium) RDT

Terkini: sidik DNA (mendeteksi potongan DNA Plasmodium) PCR (Polymerase Chain Reaction), DNA lengkap (entire genome probe)

Gold Standar mikroskopis (menemukan Plasmodium di DT)

Uji imunoserologis pelengkap pemeriksaan mikroskopis

PEMERIKSAAN MIKROSKOPIS MALARIA

• Pemeriksaan mikroskopis 1x dg hasil negatif tidak menyingkirkan diagnosis malaria

• Diperlukan pemeriksaan serial dg interval antar pemeriksaan 1 hari

• Syarat pemeriksaan:

1. Pengambilan sampel pd akhir periode demam memasuki periode berkeringat (∑ trofozoit max & matur)

2. Vol darah finger prick 1-1,5µL (sediaan tipis), 3,0-4,0 µL (tebal)

3. Kualitas preparat baik

4. Identifikasi spesies baik

Sediaan darah tipis Sediaan darah tebal

bidang sediaan luas Bidang sediaan lebih sempit

kemungkinan adanya parasit lebih sedikit

kemungkinan adanya parasitmenjadi lebih besar

waktu pemeriksaannya lebih lama

pemeriksaan lebih cepat.

menentukan spesies parasit malaria

menegakkan diagnosis malaria

QBC (SEMI QUANTITATIVE BUFFY COAT)

• Prinsip dasar: Tes fluoresensi, yaitu adanya protein pada Plasmodium yang dapat mengikat acridine orange, akan mengidentifikasi eritrosit terinfeksi Plasmodium

• Eritrosit yang terinfeksi terlihat berflourosensi

• QBC teknik pemeriksaan cepat tapi tidak dapat membedakan spesies Plasmodium

BUFFY COAT

PEMERIKSAAN IMUNOSEROLOGIS

Mendeteksi Ab spesifik terhadap Plasmodium atau Ag spesifik Plasmodium/ eritrosit yang terinfeksi plasmodium

Metode: RIA, ELISA (low detection limit 50 parasil/ µL drh)

RIA lebih sensitif, kurang praktis

ELISA lebih praktis. Modifikasi: Imunokromatografi

Prinsip ELISA sandwich ELISA : Ab spesifik terhadap HRP-II (protein yg disekresi eritrosit terinfeksi plasmodium) dilekatkan pd fase padat akan ikat HRP-II dari spesimen penderita, kemudian ditambahkan rabbit anti HRP-II liposom sbg konjugat berkromogen

Hasil (+) terbentuk band merah pd fase padat disamping band kontrol

• Kelemahan tes imunoserologik utk mendeteksi Ag adalah bhw tes tidak dapat memberikan informasi derajat parasitemia tidak memberi makna klinis terutama pd malaria berat

• Selain itu tak dapat digunakan utk mengevaluasi hasil pengobatan krn intensitas warna band tidak mempunyai korelasi dg jumlah parasit di sirkulasi

PEMERIKSAAN BIOMOLEKULER

• Digunakan utk mendeteksi DNA spesifik Plasmodium dalam darah penderita malaria.

• Metode: PCR, DNA lengkap

• Kelemahan: tak mempunyai korelasi dg derajat parasitemia bukan pilihan terbaik utk diagnosis malaria di daerah endemis

• PCR sangat mahal, butuh waktu s.d 48 jam

INTERPRETASI HASIL PEMERIKSAAN LABORATORIUM

• Pemeriksaan Hematologi

Hb anemia (ringan s.d berat)

∑ leukosit N/ ↓ (pd fase akut infeksi leukositosis)

LED ↑

∑ trombosit N

∑ retikulosit ↑

• Pemeriksaan mikroskopis

Hitung parasit pada tetes tebal dihitung berdasar leukosit (per 200 leukosit).

Jk hasil 1.500 parasit/ 200 leuko, jk ∑ leuko 8.000/µL mk ∑ parasit 60.000/µL

Penilaian: <100.000/µL, mortalitas <1%

>500.000/ µL, mortalitas >50%

• Secara kasar pelaporan pd tetes tebal: + : 1-10 parasit/ 100 lap pandang

++ : 11-100 parasit/ 100 lap pandang

+++ : 1-10 parasit/ lap pandang

++++ : > 10 parasit/ lap pandang

• Pada parasitemia yang tinggi dapat melakukan hitung parasit berdasar jumlah eritrosit (per 1.000 atau 10.000 eritrosit)

• Pemeriksaan imunoserologis

• Pemeriksaan kimia klinis; Bilirubin, kreatinin, ureum, glukosa darah, urinalisis (Hb-uria), studi koagulasi

DEMAM BERDARAH DENGUE

PEMERIKSAAN LABORATORIS DBD

• HEMATOLOGI

∑ trombosit ↓ (≤ 100.000/mmk) terjadi sebelum ↑ht & terjadi sblm suhu ↓. Ditemukan antara hari sakit ke 3 s.d ke 7

Kadar Hematokrit Hemokonsentrasi selalu ditemui pd DBD, mrpkn indikator yg peka adanya perembesan plasma. Diperiksa secara berkala.

• PEMERIKSAAN LABORAT LAIN

Kadar Albumin menurun sementara

Eritrosit feces mikroskopis (+)

Penurunan faktor koagulasi & fibrinolitik (fibrinogen, protrombin, f VIII, f XII, AT 3)

Kasus berat disfungsi hati (↓ f V, VII, IX, X)

APTT, PPT memanjang

Komplemen serum ↓

Kadar protein ↓

Kadar Na ↓

SGOT, SGPT ↑

Asidosis metabolik berat & BUN ↑

• DIAGNOSIS LABORATORIS

Diagnosis definitif infeksi virus dengue hanya dapat dilakukan dg cara isolasi virus, deteksi antigen virus atau RNA, deteksi Ab spesifik

• DIAGNOSIS SEROLOGIS

Dikenal 5 jenis uji serologi utk tentukan adanya infeksi virus dengue:

1. Uji Hemaglutinasi inhibisi (HI test)

2. Uji komplemen fiksasi (CF test)

3. Uji netralisasi (Ntest)

4. Ig M ELISA

5. Ig G ELISA

Ig M ELISA (Ig M captured ELISA/ Mac ELISA)

Untuk mengetahui kandungan IgM dalam serum pasien.

Hal-hal yang perlu diperhatikan pd uji Mac ELISA:

1. Pd hari ke 4-5 infx virus Dengue, akan timbul IgM yg diikuti IgG

2. Adakalanya harus mengulang krn hasil masih negatif

3. Apabila hari ke 6 hasil masih negatif dilaporkan sbg negatif

4. IgM dapat bertahan di darah sampai 2-3 bln pasca infx.

5. IgM tidak boleh dipakai sbg satu2nya uji diagnostik

6. Sekarang telah beredar uji IgG ELISA, Dengue rapid IgM/IgG

7. NS1 Ag

NS1 (Non structural 1)

• Pemeriksaan Non Struktural 1 (NS1) ditujukan untukmendeteksi virus dengue lebih awal.

• Virus dengue memiliki 3 protein structural dan 7 protein non structural. NS1 adalah glikoprotein non structural yang diperlukan untuk kelangsungan hidup virus.

█ Respon pada Infeksi Primer

1. Antigen NS1

Hari pertama demam setelah onset (sebaiknya diperiksa pada hari 1-3 demam), sampai hari ke-9.Tidak terdeteksi ketika antibodi IgG mulai diproduksi

2. Antibodi IgM

Hari ke-5 setelah onset, bertahan selama 1-3 minggubahkan hingga 60 hari

3. Antibodi IgG

Hari ke-14 setelah onset dan bertahan seumur hidup

Dengue Markers

█ Respon pada Infeksi Sekunder

1. Antigen NS1

Hari pertama demam setelah onset ,sampai hari ke-9Tidak terdeteksi ketika antibodi IgG mulai diproduksi

2. Antibodi IgM

Diproduksi dalam kadar rendah atau tidak terdeteksi pada jangka waktu cepat dibanding dengan infeksi primer.

3. Antibodi IgG

Meningkat pesat 1-2 hari setelah timbulnya gejala

Dengue Markers

Deteksi Antigen

NS1

Deteksi Antibodi•IgG/IgM Dengue

Terapi dini

Diagnosa Dengue

NS1 Ag

for early acute phase samples (day 1~5)

IgG/IgM Ab

Ag/A

b level

Day

NS1 Ag

IgM

IgG

Ag/A

b level

Day

NS1 Ag

IgM

IgG

0 1 2 3 4 5 6 7 8 ≥90 1 2 3 4 5 6 7 8 ≥9

Panbio Dengue Early Rapid

• Pemeriksaan antigen NS1

• Deteksi kualitatif antigen NS1 pada serum

dan plasma

26

Tes prosedur

1. Add 50µL serum

2. Add 25µL Running buffer

3. Add 25µL Gold conjugate

Put dipstick in the tube to

touch the bottom

Read results in exactly 15

minutes after adding dipstick

to test tube

Interpretation

Garis merah muda apapun dianggap sebagai hasil positif

Dengue Duo Cassette

• Deteksi kualitatif antibodi IgM dan IgG

untuk diagnosis Demam Dengue

• Dapat membedakan infeksi primer

dan sekunder

• Cut off IgG Sekunder setara titer HAI

1: 2560

Kemasan Dengue Rapid

Casette

25 test per kit

Buffer

Dengue Rapid Casette

dikemas secara

individual

Casette device

MicroSafe tube

Dengue Duo Cassette

Interpretasi hasil

Dengue Primer - Sekunder

Lubang penetesan

Specimen (serum, WB)

Lubang penetesan

Buffer

Dengue Duo Cassette

Cut off IgG Sekunder sesuaidengan titer HAI 1: 2560

Korelasi Antara Infeksi Dengue Primer –Sekunder Dengan Beratnya Penyakit

•Studi epidemiologi di Asia-Tenggara telah menunjukkan bahwa

DBD/DSS banyak terjadi selama infeksi sekunder, oleh virus serotipe

berbeda terhadap virus yang menyebabkan infeksi primer.

(Halstead SB : Phatogenesis of Dengue, Chaellenger to Molecular

Biology Science. 239;476. 1988)

•Suatu infeksi DHF/DSS yang lebih tinggi pada infeksi sekunder

juga telah diobservasi selama kejadian epidemis di Kuba.

(Kouri at.al. : Haemorrhagic Dengue in Kuba : History of an

Epidemic, PAHD Bull. 20:24 : 1986)

Korelasi Antara Infeksi Dengue Primer – SekunderDengan Beratnya Penyakit

•Manifestasi klinis infeksi sekunder virus dengue lebih berat

dibandingkan infeksi primer, meskipun infeksi primer atau

sekunder menunjukkan manifestasi klinis sebagaimana

Demam Dengue atau Demam Berdarah Dengue.

(Usman Hadi et.al.: The correlatious between major sign of Fengue Viral infections with the serological Haemaglutination Inhibition Test (HT) in

adult tropical an infectious diseased Dr. Soetomo Hospital, Surabaya. Proceeding seminar on infectious duseases in tropics, TDC Unair : 1999

Prosedur

Interpretasi

DEN38

Anti-human

IgM & IgG

pd membrane

(test line)

Serum

IgM and IgG

antibodies

Antigen

dengue

rekombinan N-

terminal 80 %

viral envelope

glocoproteins

(DEN-1, 2, 3, 4)

Pada bantalan

antigen

Gold

Labelled

Monoclonal

anti-dengue

virus

(Conjugate)

Muncul garis

Warna pink/purple

Capture Immunochromatographic

Prinsip Reaksi

DEMAM TIFOID

• penyakit infeksi sistemik yang disebabkan oleh kuman batanggram negatif Salmonella typhi maupun Salmonella paratyphiA,B,C.

• ditularkan melalui makanan atau minuman yang terkontaminasi oleh kuman tersebut, dikenal sebagaipenularan tinja-mulut (Fecaloral).

• Kuman masuk ke saluran cerna, usus dan kelenjar limfe usus, selanjutnya melalui aliran darah masuk ke hati dan limpa.

PATOFISIOLOGI

PEMERIKSAAN LABORATORIS DEMAM TIFOID

• HEMATOLOGI:

∑ eritrosit : anemia normokrom normositik

∑ leukosit : sering leukopenia, tp bias N/ ↑

Eosinofil : Aneosinofilia

Diff count : shift to the left (neutropenia dgn limfositosisrelative)

GDT : limfositosis relatif pd perjalanan akhir penyakit (20-30% penderita anak) terjadi krn rangsangan endotoksin

Peningkatan jml netrofil, monositosis

LED ↑

∑ Trombosit N/↓

PPT, APTT ↑

Fibrinogen, FDP ↓

• KIMIA KLINIK

SGOT, SGPT ↑

Bilirubin serum ↑

HipoNa, Hipo K

• PEMERIKSAAN URIN

Proteinuria (+)

Leukosit sedimen ↑ringan

• PEMERIKSAAN TINJA

Darah (+), Lendir (+) perdarahan usus & infx

DIAGNOSIS LABORATORIS

1. Isolasi Kuman Salmonella Typhi dari spesimen darah, sutul, urin, tinja

2. Uji serologi utk melacak peningkatan kadar Ab terhadap Ag S.Typhi

3. Pelacakan DNA spesifik S.typhi (cara: DNA probe & PCR)

Keterbatasan isolasi kuman:

Rendahnya keberhasilan biakan (krn pemberian Antibiotik, vaksin), waktu pengambilan tak tepat, vol spesimen kurang), Darah tidak segera dimasukkan ke media gall False negatif

Kelemahan isolasi:

Fecal carrier (+) palsu, sensitifitas rendah, hasil lama

Spesimen yang digunakan :

Awal darah, stadium lanjut urin / tinja

UJI SEROLOGI

- Pelacakan adanya Ag spesifik S.typhi dlm spesimen (Widal)

- Pelacakan adanya Ab spesifik S.typhi dlm spesimen (Ig M, IgG Salmonella)

Keterbatasan uji Widal:

1. Penyebab hasil negatif

• Tidak terjadi infeksi S.typhi

• Pasien carrier

• Inokulul Ag kuman tidak adekuat

• Kesalahan teknis

• Pemberian antibiotik sebelumnya

• Variabilitas antigen yg tersedia

2. Penyebab hasil positif:• Memang menderita demam tifoid• Imunisasi dg Ag Salmonella sblmnya• Reaksi silang dg non typhoidal Salmonella• Variabilitas & buruknya standarisasi pembuatan Ag komersial• Infeksi dg malaria atau enterobacteriaceae• Penyakit lain (dengue)• Reaksi anamnestic (pernah sakit sebelumnya)

Diagnosis Demam Tifoid / Paratifoid dinyatakan bilaa/titer O = 1/160

Titer O meningkat setelah akhir minggu. Permintaan tes widal ini pada penderita yang baru

menderita demam beberapa hari kurang tepat. Bilahasil reaktif (positif) maka kemungkinan besarbukan disebabkan oleh penyakit saat itu tetapi darikontrak sebelumnya.

Uji serologi utk melacak peningkatan kadar Ab terhadap Ag S.Typhi (Ig M Salmonella)

Tubex® TF adalah test diagnosis in vitroyang cepat untuk mendeteksi demamtifoid, penyakit yang disebabkan olehSalmonella enterica serovar Typhi.

Tubex® TF menggunakan metode IMBI™(Inhibition Magnetic BindingImmunoassay). Metode inimemungkinkan diagnosis fase akut infeksiS. Thyphi dengan mendeteksi anti-Salmonella O9 (Imunoglobulin M) dalamserum pasien.

Hasil Tubex® TF positif dan ditandaidengan gejala klinis khas, merupakanindikasi kuat demam tifoid akut.

LEPTOSPIROSIS

• Penyakit zoonosis

• Kontak dengan air tergenang yang terkontaminasi dgn kencingbinatang yang terinfeksi, atau mpunyai pekerjaan yang berhubdgn tanah basah yang terkontaminasi dgn leptospira

Pemeriksaan Laboratorium

1. Pemeriksaan bakteriSECARA LANGSUNG

Spesimen dilihat scr langsung menggunakan mikroskoplapangan gelap atau mikroskop cahaya dgn pewarnaan sesuai

Sampel darah diambil 6 hari setelah timbul gejala

ISOLASI BAKTERI HIDUP

Spesimen dibiakkan dalam media

2. Deteksi bakteriRIA, ELISA

3. Antibodi (IgM/ IgG)Antibodi terdeteksi 5-7hari setelah munculnya gejala.

Uji IgM & IgG terhadap Leptospira