Physiologische und funktionelle Charakterisierung von ... · „stop-flow “-Ischämie die ... MAP Mitogen-Activated Protein MgCl 2 Magnesiumchlorid MgSO 4 Magnesiumsulfat min Minuten

Physiologische und funktionelle Charakterisierung

von kardiodepressiven Substanzen aus dem post-

ischämischen, reperfundierten Rattenherzen

Inauguraldissertation

zur

Erlangung des akademischen Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

vorgelegt von

Katrin Birkenmeier

geboren am 15.08.1976

in Freiburg

Greifswald, 28.07.2008

Dekan: Prof. Dr.rer.nat. Klaus Fesser

1. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Uwe Völker

2. Gutachter: Prof. Dr. med. Karl Stangl

Tag der Promotion: 21.11.2008

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Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

Zusammenfassung

1 Einleitung………………………………………………………………………… 1 1.1. Das Säugetierherz............................................................................................................................... 1

1.1.1. Anatomie und Funktionsweise........................................................................................................... 1

1.1.2. Myokardiale Ischämie – Grundlagen und Pathologie beim Menschen.............................................. 2

1.2. Physiologie von Herzmuskelzellen.................................................................................................... 4

1.2.1. Die adulte Herzmuskelzelle................................................................................................................ 4

1.2.2. Die neonatale Herzmuskelzelle.......................................................................................................... 7

1.2.3. Zelluläre und physiologische Veränderungen nach myokardialer Ischämie...................................... 8

1.2.4. Besondere Rolle des Prostaglandin-Stoffwechsels nach myokardialer Ischämie.............................. 10

1.2.5. Besondere Rolle von Kalium(ATP)-Kanälen nach myokardialer Ischämie...................................... 11

1.3. Ischämie in nicht-kardialem Gewebe................................................................................................. 12

1.4. Stoffwechsel der Prostaglandine........................................................................................................ 13

1.4.1. Arachidonsäure als Ausgangssubstanz der Prostaglandine bzw. Eicosanoide................................... 13

1.4.2. Weitere Ausgangssubstrate für Prostaglandine bzw. Eicosanoide..................................................... 16

1.4.3. Physiologie der Cyclooxygenase........................................................................................................ 16

1.4.4. Prostaglandin-Subklassen und Rezeptortypen................................................................................... 18

1.4.5. Pharmakologie von Cyclooxygenasen und Prostaglandin-Rezeptoren.............................................. 21

1.5. Kalium(ATP)-Kanäle......................................................................................................................... 23

1.5.1. Struktur und Funktionsweise von Kalium(ATP)-Kanälen................................................................. 23

1.5.2. Pharmakologie von Kalium(ATP)-Kanälen....................................................................................... 25

2 Fragestellung……………………………………………………………………...

27

3 Material…………………………………………………………………………...

30

3.1. Versuchstiere...................................................................................................................................... 30

3.2. Chemikalien, Enzyme, Zellkulturmedien, Kits und weitere Reagenzien........................................... 30

3.3. Puffer.................................................................................................................................................. 32

3.4. Enzyminhibitoren............................................................................................................................... 34

3.5. Rezeptorantagonisten......................................................................................................................... 35

Inhaltsverzeichnis

4 Methoden…………………………………………………………………………. 43 4.1. Tierexperimentelle Arbeiten nach Langendorff................................................................................. 43

4.1.1. Prinzip und Aufbau des Langendorff-Modells................................................................................... 43

4.1.2. Entnahme und Präparation von adulten Rattenherzen....................................................................... 45

4.1.3. Vorbereitung der Langendorff-Anlage............................................................................................... 45

4.1.4. Anschluss des Rattenherzens an der Langendorff-Anlage................................................................. 45

4.1.5. Isolation von adulten, ventrikulären Kardiomyozyten....................................................................... 47

4.1.6. Gewinnung von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat aus adulten Rattenherzen...... 48

4.2. Isolation und Kultivierung von neonatalen Kardiomyozyten............................................................ 49

4.2.1. Entnahme und Präparation von neonatalen Rattenherzen.................................................................. 49

4.2.2. Isolation von neonatalen Kardiomyozyten......................................................................................... 49

4.2.3. Kultivierung von isolierten neonatalen Kardiomyozyten.................................................................. 50

4.3. Mikroskopische Techniken................................................................................................................ 50

4.3.1. Bestimmung von Kontraktilität und Calciumtransient an adulten Kardiomyozyten......................... 50

4.3.1.1. Vorbereitungen....................................................................................................... 50

4.3.1.2. Messung von Kontraktilität und Calciumtransient am Fluoreszenzmikroskop..... 52

4.3.2. Bestimmung von Schlagfrequenz und Calciumtransient an kultivierten neonatalen

Kardiomyozyten.................................................................................................................................

57

4.3.2.1. Voraussetzungen.................................................................................................... 57

4.3.2.2. Messung von Schlagfrequenz und Calciumtransient am

Fluoreszenzmikroskop von Ionoptix......................................................................

57

4.3.3. Fluoreszenzmikroskopische Messreihen mit Inhibitoren und Antagonisten/Agonisten................... 58

4.3.4. Immunfluoreszenzfärbung von adulten Kardiomyozyten................................................................. 58

4.4. Proteinbiochemische Techniken......................................................................................................... 60

4.4.1. Herstellung von Kardiomyozytenlysaten........................................................................................... 60

4.4.2. Herstellung von Proteinextrakten aus Rattenherzen.......................................................................... 61

4.4.3. Proteinbestimmung von Lysaten und Extrakten................................................................................ 61

4.4.4. Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)................................................................... 61

4.4.5. Western Blot....................................................................................................................................... 63

4.4.6. Densitometrische Auswertung........................................................................................................... 65

3.6. Rezeptoragonisten.............................................................................................................................. 37

3.7. Antikörper.......................................................................................................................................... 37

3.8. Geräte................................................................................................................................................. 39

3.9. Verbrauchsmaterialien........................................................................................................................ 41

3.10. Glaswaren........................................................................................................................................... 42

Inhaltsverzeichnis

4.5. „Enzyme-Linked Immunosorbend Assay (ELISA)“ zur cAMP-Bestimmung in

Kardiomyozytenlysaten......................................................................................................................

65

4.6. Statistische Auswertung..................................................................................................................... 65

5 Ergebnisse………………………………………………………………………... 67 5.1. Charakterisierung des Effekts von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat auf adulte

Kardiomyozyten.................................................................................................................................

67

5.2. Metabolismus der negativ-inotropen Mediatoren des post-ischämischen Effluates in adulten

Kardiomyozyten: Rolle der Cyclooxygenasen COX-1 und COX-2..................................................

73

5.2.1. Expression von COX-1 und COX-2 in adulten Kardiomyozyten...................................................... 74

5.2.2. Reagiert IF in isolierten adulten Kardiomyozyten Cyclooxygenase-abhängig?................................ 76

5.2.3. COX-2-Expression im ganzen Herzen der adulten Ratte: Verstärkt eine 10-minütige

„stop-flow“-Ischämie die Expression der COX-2?............................................................................

81

5.3. Metabolismus von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat in neonatalen

Kardiomyozyten.................................................................................................................................

83

5.3.1. Wirkung von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat auf Schlagfrequenz und

Calciummetabolismus........................................................................................................................

84

5.3.2. Rolle der Cyclooxygenase................................................................................................................. 86

5.4. Signaltransduktion „downstream“ der COX-2 in adulten Kardiomyozyten...................................... 90

5.4.1. Expression von Prostaglandin-Rezeptoren in adulten Kardiomyozyten............................................ 91

5.4.2. Rolle von Prostaglandin-Rezeptoren in der Wirkung von post-ischämischem Effluat..................... 93

5.4.3. Wirkung von Prostaglandinen auf isolierte adulte Kardiomyozyten................................................. 105

5.5. Funktionelle Charakterisierung der kardiodepressiven Mediatoren im post-ischämischen

Effluat.................................................................................................................................................

110

6 Diskussion………………………………………………………………………... 115

6.1. Besonderheiten des vorliegenden Untersuchungsmodells................................................................. 116

6.2. Zentrale Rolle der Cyclooxygenase bei der Vermittlung des negativ-inotropen Effekts in adulten

und neonatalen Kardiomyozyten der Ratte........................................................................................

118

6.2.1. Abhängigkeit des negativ-inotropen Effekts von post-ischämischem Effluat von der

Cyclooxygenase-2 in adulten Kardiomyozyten.................................................................................

119

6.2.2. Basale Expression von COX-1 und COX-2 in isolierten adulten Kardiomyozyten.......................... 120

6.2.3. Erhöhte COX-2-Expression nach Laminierung................................................................................. 122

6.2.4. COX-2-Expression im kompletten Rattenherzen vor und nach Ischämie......................................... 124

6.2.5. Rückschlüsse aus der COX-2-Abhängigkeit auf die Identität der Mediatoren aus dem post-

ischämischen Effluat..........................................................................................................................

127

6.2.6. Rückschlüsse auf die zelluläre Herkunft der Mediatoren aus dem post-ischämischen Effluat.......... 130

Inhaltsverzeichnis

6.2.7. Bestätigung des reduzierenden Effekts und der COX-2-Abhängigkeit von post-ischämischem

Effluat an neonatalen Kardiomyozyten..............................................................................................

131

6.3. Vermittlung des Effekts von post-ischämischem Effluat auf adulte Kardiomyozyten

„downstream“ der COX-2 über Prostaglandin-Rezeptoren...............................................................

132 6.3.1. Expression von Prostaglandin-Rezeptoren in adulten Kardiomyozyten............................................ 132

6.3.2. Abhängigkeit des negativ-inotropen Effekts von den Prostaglandin E-Rezeptoren EP2 und EP4... 135

6.3.3. Rückschlüsse auf die Identität der in den Kardiomyozyten gebildeten Intermediate........................ 138

6.4. Abhängigkeit des negativ-inotropen Effekts von der Proteinkinase A.............................................. 140

6.5. Nachweis des kardioprotektiven Effekts von post-ischämischem Effluat......................................... 143

6.5.1. Schutz vor Überladung der Kardiomyozyten mit Calcium................................................................ 143

6.5.2. Beeinflussung von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen............................................................... 144

6.5.3. Kardioprotektion durch COX-2, Prostaglandin E/I und EP-Rezeptoren........................................... 146

6.6. Schlussfolgerungen für das post-ischämische, reperfundierte Herz in „vivo“................................... 147

7 Ausblick…………………………………………………………………………...

148

8 Literatur…………………………………………………………………………..

150

Eidesstattliche Erklärung

Publikationen aus der vorliegenden Arbeit

Weitere Publikationen

Danksagung

Lebenslauf



AA Arachidonsäure

Abb. Abbildung

AC Adenylat-Zyklase

ADP Adenosindiphosphat

AG Aktiengesellschaft

APS Ammoniumperoxodisulfat

Aqua dest. destiliertes Wasser

AraC 1-(�-D-Arabino-furanosyl)-cytosin-hydrochlorid

ATP Adenosintriphosphat

bar Einheit des Drucks

BCA Bicinchoninic Acid

BRD Bundesrepublik Deutschland

BSA Bovines Serumalbumin

bzw. beziehungsweise

c Vorsatzzeichen „zenti“

C Farbstoffkonzentration

°C Grad-Celsius

ca. circa

Ca++ Calcium

CaCl2 Calciumchlorid

cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat

C-Atom Kohlenstoffatom

CH Schweiz

CIRC Calcium-induced calcium release

COX/COX-1/COX-2/COX-3 Cyclooxygenase/-1/-2/-3

Cu+/++ Kupferionen

D Dicke der Zelle

DAG Diacylglycerol

DAPI 4’,-6’-Diamidino-2-phenylindoldilactat

DGLA Dihomogammalinolensäure

d.h. das heißt

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DP Prostaglandin D-Rezeptor

DTT Dithiothreitol

EC-coupling excitation-contraction-coupling

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EET Epoxyeicosatetraensäure


ELISA Enzyme Linked Immunosorbend Assay

EP Prostaglandin E-Rezeptor

EPA Eicosapentaensäure

et al. et aliquot

f([Ca++]) Funktion der Calciumkonzentration

F Fluoreszenz

FKS Fötales Kälberserum

FP Prostaglandin F-Rezeptor

Fura-2AM Fura-2-Acetoxymethylester

g Gramm

Gi/Gq/Gs G(Guanin-Nukleotid bindende)-Proteine

Glib Glibenclamid

GTP Guanosintriphosphat

h Stunde

HCl Chlorwasserstoffsäure

5-HD 5-Hydroxydekanoat

HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansolfonsäure

HETE Hydroxyeicosatetraensäure

HMR Höchst Marion Roussel

H2O2 Wasserstoffperoxid

HPETE Hydroperoxyeicosatetraensäure

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HRPO Horse Radish Peroxidase

Hz Hertz

I ischämisches Herz

IC 50 Inhibitorkonzentration mit 50% blockiertem Rezeptor

IF post-ischämisches Effluat oder Immunfluoreszenz

Ig Immunglobulin

Indo Indomethacin

IP Prostaglandin I-Rezeptor

IP3 Inositol-1,4,5-trisphosphat

Isoprot Isoproterenol

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

k Vorsatzzeichen „kilo“

K nicht-ischämisches Kontrollherz oder Konstante (optische

Eigenschaften der Messapparatur)

KCl Kaliumchlorid

KF nicht-ischämisches Effluat

KH Krebs-Henseleit

KHK Koronare Herzkrankheit


KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat

Kir Kalium-inward-rectifier

Konz. Konzentration

l Liter

LO. Alkoxylradikal

Lum Lumiracoxib

m/m2/m3 Meter oder Vorsatzzeichen “milli”/ Quadratmeter/

Kubikmeter

µ Vorsatzzeichen “mikro”

MAP Mitogen-Activated Protein

MgCl2 Magnesiumchlorid

MgSO4 Magnesiumsulfat

min Minuten

mitochon. mitochondrial

mmHg Druck von Quecksilbersäule in mm

mol/molar Einheit der Stoffmenge/Stoffmenge pro Liter

mRNA messenger RNA (Botenribonukleinsäure)

ms Millisekunden

Myristoyl-Phe-Ala-Arg-Lys-Gly-Ala-Leu-Arg-Gln Myristyliertes Peptid aus Phenylalanin-Alanin-Arginin-

Lysin-Glycin-Alanin-Leucin-Arginin-Glutamin

n Anzahl der Experimente für die statistische Auswertung

oder Vorsatzzeichen „nano“

N2 Stickstoff

NaCl Natriumchlorid

Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat

NaOH Natriumhydroxid

NBCS New Born Calf Serum

NHLBI National Heart Lung and Blood Institute

NL Niederlande

NO Stickstoffmonoxid

NSAR nicht-steroidale Antirheumatika

O2 Sauerstoff

O2- Hyperoxidanion

OH. Hydroxylradikal

ONOO- Peroxynitrit

p p-Wert („Überschreitungswahrscheinlichkeit“; Angabe

der Signifikanz)

PBS Phosphate Buffered Saline

PC Phosphatidylcholin

PE Phosphatidylethanolamin


PFA Paraformaldehyd

PGD/PGE/PGF/PGI Prostaglandin D, E, F, I

pH negativ dekadischer Logarithmus der Protonen-

konzentration

Pi Phosphatrest

PIOX Pathogen-induzierbare Oxygenase

PIP2 Phosphatidylinositoldiphosphat

PKA Proteinkinase A

PKC Proteinkinase C

PLA2 Phospholipase A2

PLC Phospholipase C

PLD Phosholipase D

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

rcf relative centrifugal force

RNA Ribonukleinsäure

rpm revolutions per minute

RSV Ram Seminal Vesicle

RT-PCR Reverse Transkiptase-Polymerase Chain Reaction

sarkolem. sarkolemmal

SDS sodium-dodecylsulfate

SDS-PAGE sodium-dodecylsulfate polyacrylamide gel

elektrophoresis

SUR sulfonylurea receptor

TBS Tris Buffered Saline

TEMED N,N,N`,N´-Tetramethylethylendiamin,

1,2-Bis(dimethylamino)-ethan

TGF Tumor Growth Factor

TNF Tumor Necrosis Factor

TP Thromboxan-Rezeptor

TRIS 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propan-1,3-diol

TXA/TXB Thromboxan A oder B

U Einheit der Enzymaktivität; 1U = 1µmol umgesetztes

Substrat pro Minute

UK United Kingdom

USA United States of America

V Volt

vs. versus

WB Western Blot

x …..fach

z.B. zum Beispiel

Zusammenfassung

Zusammenfassung

Wird nach einer ischämischen Phase, in der Herzmuskelgewebe vorübergehend mit

Sauerstoff und weiteren Nährstoffen pathologisch bedingt unterversorgt wird, die

Durchblutung des Gewebes wiederhergestellt (Reperfusion), finden auf zellulärer Ebene

komplexe Signaltransduktionsmechanismen statt, die entweder für das Gewebe schädlich sein

können („Ischämie-Reperfusionsschaden“) oder das Herzmuskelgewebe vor weiteren

Schädigungen schützen (Kardioprotektion). Felix et al. gaben Hinweise auf während der

frühen Reperfusion freigesetzte Substanzen in post-ischämischem Effluat, die den

Calciummetabolismus von isolierten adulten Rattenkardiomyozyten beeinflussen und in Folge

die Kontraktilität reduzieren (negative Inotropie; Felix et al. 2001). Ziel der vorliegenden

Arbeit war es, die Signalwege zu identifizieren, die negativ-inotrop auf isolierte

Kardiomyozyten wirken, um letztendlich Rückschlüsse auf die Identität der Mediatoren im

Effluat ziehen zu können. Experimentelle Vorarbeiten gaben Hinweise darauf, dass die

negativ-inotropen Mediatoren des Effluates aus dem Arachidonsäure-Stoffwechsel freigesetzt

werden. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Rolle des Cyclooxygenase- und

Prostaglandin-Metabolismus bei der Vermittlung des negativ-inotropen Effekts von post-

ischämischem Effluat auf isolierte Kardiomyozyten untersucht.

Nach 10 min globaler „stop-flow“-Ischämie wurden Herzen adulter Ratten reperfundiert und

das Koronareffluat über 30 s gesammelt. Die Effekte dieses post-ischämischen Effluates auf

die Zellkontraktion (systolische Zellverkürzung) und den Calciumstoffwechsel

(Calciumtransienten) wurden mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie an elektrisch

stimulierten, laminierten und mit Fura-2AM gefärbten adulten Rattenkardiomyozyten

analysiert. Als Kontrolle wurde Effluat aus der Perfusion vor der Ischämiephase verwendet.

Die vorliegende Untersuchung analysierte die Rolle der Cyclooxygenase und von

Prostaglandin-Rezeptoren in der Signaltransduktion der negativ-inotropen Faktoren durch

Anwendung verschiedener Inhibitoren und Antagonisten. Die Expression der

Cyclooxygenase-Isoformen und der verschiedenen Prostaglandin-Rezeptoren wurde mittels

Western Blot und Immunfluoreszenzfärbungen untersucht.

Laminierte und mit Fura-2AM gefärbte adulte Kardiomyozyten exprimierten beide Isoformen

der Cyclooxygenase. Die Expression der Stress-induzierten Cyclooxygenase-2 war in

laminierten Kardiomyozyten im Vergleich zu nicht-laminierten Kardiomyozyten erhöht.

Zusammenfassung

Adulte Rattenherzen exprimierten auf niedrigem Level basal die Cyclooxygenase-2. Eine 10-

minütige Ischämiephase führte nicht zu einer Verstärkung der Expression. Durch

Vorinkubation der Zellen mit dem Cyclooxygenase-Inhibitor Indomethacin und den

Cyclooxygenase-2-Inhibitoren NS-398 und Lumiracoxib wurde der negativ-inotrope Effekt

von post-ischämischem Effluat auf Calciummetabolismus und Kontraktilität gehemmt. Der

Cyclooxygenase-1-Inhibitor SC-560 hingegen beeinflusste die Effekte des post-ischämischen

Effluates nicht. Post-ischämisches Effluat reduzierte in autonom kontrahierenden neonatalen

Kardiomyozyten wie in adulten Zellen den Calciumtransienten und wirkte außerdem

reprimierend auf die Schlagfrequenz. Die reduzierende Wirkung auf beide Parameter konnte

durch Anwendung von Indomethacin, NS-398 und Lumiracoxib blockiert werden.

Im Western Blot konnten in isolierten Kardiomyozyten Prostaglandin-Rezeptoren für

Prostaglandin D (DP1 und DP2), E (EP1-EP4), I und Thromboxane nachgewiesen werden.

Durch die Anwendung selektiver Prostaglandin-Rezeptor-Antagonisten konnte der

Signaltransduktionsmechanismus „downstream“ der Cyclooxygenase-2 auf die Rezeptoren

EP2 und EP4 eingegrenzt werden. Der Effekt von post-ischämischem Effluat ist außerdem

Proteinkinase A-abhängig. Die Ergebnisse der Experimente mit dem Proteinkinase A-

Inhibitor Rp-cAMPS stehen im Einklang mit den cAMP-Analysen von Lysaten adulter

Kardiomyozyten, die mit post-ischämischem Effluat vorbehandelt wurden und im Vergleich

zur Kontrolle eine erhöhte cAMP-Konzentration aufwiesen.

Die negativ-inotrope Wirkung von post-ischämischem Effluat zeigt eine kardioprotektive

Funktion der post-ischämisch freigesetzten Substanzen an. Die Wirkung des Effluates konnte

durch Anwendung des Inhibitors für sarkolemmale und mitochondriale Kalium(ATP)-Kanäle

Glibenclamid und des für sarkolemmale Kalium(ATP)-Kanäle selektiven Inhibitors

HMR-1098 aufgehoben werden. Außerdem wurde die zelluläre Wirkung des post-

ischämischen Effluates auf Kardiomyozyten in extrazellulärem Milieu mit erhöhter

Calciumkonzentration untersucht. Im Unterschied zur Kontrolle verminderte das post-

ischämische Effluat den intrazellulären diastolischen und systolischen Calciumanstieg.

Bei den Mediatoren im post-ischämischen Effluat handelt es sich vermutlich um Substanzen

aus dem Arachidonsäuere-Stoffwechsel, die in isolierten Kardiomyozyten durch die

Cyclooxygenase-2 umgesetzt werden und über EP2-/EP4-Rezeptoren durch die Aktivierung

von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen negativ-inotrop und kardioprotektiv wirken.

1 Einleitung

1

1 Einleitung

1.1. Das Säugetierherz

1.1.1. Anatomie und Funktionsweise

Das Herz ist das erste funktionsfähige Organ im sich entwickelnden Organismus. Als

Hohlmuskel pumpt es durch rhythmische Kontraktion das mit Sauerstoff angereicherte Blut

aus der Lunge in die Arterien des Körperkreislaufs. Dadurch wird die Verteilung von

Nährstoffen und der Abtransport von nicht mehr benötigten Stoffwechselprodukten

gewährleistet. Das bei der Atmung entstandene Kohlendioxid (CO2) wird über die Lungen an

die Umwelt abgegeben, lösliche Stoffe werden über die Nieren ausgeschieden.

Das Herz von Säugetieren ist aus vier Kammern aufgebaut (Abb.1.1.). Das mit Sauerstoff

(O2) angereicherte Blut aus der Lunge strömt durch das linke Atrium (linker Vorhof) in den

linken muskulösen Ventrikel (linke Herzkammer). Dieser pumpt das Blut durch die Aorta in

den Körperkreislauf. Das mit CO2 angereicherte Blut aus dem Körper fließt über die obere

und untere Hohlvene in das rechte Atrium (rechter Vorhof). Von hier gelangt das Blut in den

weniger muskulösen rechten Ventrikel (rechte Herzkammer), der es in den Lungenkreislauf

pumpt, wo es CO2 abgibt und O2 aufnimmt (Klinke 2005).

Den Kontraktionszylus des Herzens kann man in zwei Phasen einteilen. Die Systole ist die

Anspannungs- und Auswurfphase des Herzens, die Diastole ist die Entspannungs- und

Füllungsphase. Während der Systole zieht sich die Muskulatur der Kammern zusammen und

das Blut wird in die Lungen- und Körperarterien gedrückt. Während der Diastole entspannt

sich der Muskel und das in den Vorhöfen gesammelte Blut strömt in die Herzkammern

(Roche-Lexikon 2003, Klinke 2005).

Der Hohlmuskel ist aus drei verschiedenen Zellschichten aufgebaut. Das äußere Epikard

besteht aus Epithelzellen und Bindegewebe. Das sehr viel dickere Myokard besteht aus den

sich kontrahierenden Herzmuskelzellen, den Kardiomyozyten, die Bündel von

Muskelfibrillen enthalten. Aufgrund der regelmäßigen Anordnung dieser Fibrillen in der Zelle

spricht man beim Myokard wie bei der Skelettmuskulatur von einer Querstreifung der

Muskulatur. Eine Gruppe von spezialisierten Herzmuskelzellen im rechten Vorhof besitzt die

1 Einleitung

2

Abb.1.1. Schematische Darstellung des Säugetierherzens (aus Klinke, Pape, Silbernagel 2005): vier Kammern (linker und rechter Vorhof, linke und rechte Herzkammer (Ventrikel)); Venen (obere und untere Hohlvene (Vena cava superior und inferior), Lungenvene (Pulmonalvene)) und Arterien (Aorta, Lungenarterie (Pulmonalarterie)); Herzklappen (Mitral- und Trikuspedalklappe zwischen Vorhöfen und Herzkammern wegen ihrer Form als Segelklappen bezeichnet, Aortenklappe und Pulmonalklappe zwischen Herzkammern und Aorta bzw. Lungenarterie wegen ihrer Form als Taschenklappen bezeichnet).

Fähigkeit zur spontanen Depolarisation. Die entstandene elektrische Erregung wird über

elektrische Synapsen zwischen den Zellen auf den gesamten Herzmuskel übertragen. Man

spricht von einer Schrittmacherfunktion dieser spezialisierten Zellen und bezeichnet sie in

ihrer Gesamtheit als Sinusknoten. Das Endokard kleidet das Herz von innen aus. Es besteht

wie das Epikard aus Epithelzellen und Bindegwebe (Roche-Lexikon 2003, Klinke 2005).

1.1.2. Myokardiale Ischämie – Grundlagen und Pathologie beim Menschen

Der Begriff „Ischämie“ stammt aus dem Griechischen und setzt sich zusammen aus „isch“ für

griechisch „der Halt“ und „häma“ für griechisch „das Blut“. Ischämie bedeutet Blutleere und

ist eine pathologisch bedingte Unterversorgung von Gewebe bzw. eines Organs mit Sauerstoff

und anderen Nährstoffen. Eine myokardiale Ischämie ist daher eine durch

Minderdurchblutung bedingte Nährstoffunterversorgung der Herzmuskulatur (Roche-Lexikon

2003).

Man unterscheidet zwischen einer relativen Ischämie, bei der ein unzureichender Blutfluss

und damit eine Nährstoffunterversorgung nachgewiesen werden kann, und einer absoluten

1 Einleitung

3

Ischämie, die durch das komplette Unterbleiben der arteriellen Durchblutung bzw.

Nährstoffversorgung gekennzeichnet ist. Bei einer myokardialen Ischämie besteht in jedem

Fall ein Missverhältnis zwischen dem Sauerstoffbedarf des Herzens und der Sauerstoffzufuhr.

Dieses Missverhältnis kann durch eine Verminderung des Sauerstoffangebots oder durch eine

Erhöhung des Sauerstoffbedarfs des Herzens zustande kommen (Roche-Lexikon 2003). Der

Mangel an Sauerstoff kann eine myokardiale Dysfunktion zur Folge haben (Felix et al. 1997,

Roche-Lexikon 2003).

Die häufigste Ursache für eine Verminderung oder vollständige Unterbrechung der

Durchblutung eines Herzmuskelbezirks und eine daraus resultierende verminderte

myokardiale Sauerstoffzufuhr ist eine Arteriosklerose der Koronararterien („koronare

Herzkrankheit (KHK)“). Hierbei handelt es sich um eine bindegewebige Verhärtung und

Verengung der Blutgefäße durch Ablagerungen von Blutfetten, Thromben, Bindegewebe und

Kalk in den Gefäßwänden. Wesentlich seltenere Ursachen sind eine Aortenklappenstenose,

die eine durch Entzündung oder Verkalkung verursachte Verengung der Aortenklappe

darstellt, eine Kardiomyopathie (Herzmuskelentzündung) oder Anomalien der Koronargefäße.

Symptomatisch kann sich eine myokardiale Ischämie als Herzinfarkt, Angina pectoris oder als

Sekundenherztod (Herzschlag) äußern. Eine Erhöhung des myokardialen Sauerstoffbedarfs

tritt z.B. bei bestimmten Formen der Kardiomyopathie, bei Herzklappenerkrankungen,

Bluthochdruck, Infektionskrankheiten und Fieber auf (Renz-Polster 2004, Classen 2006).

Herz-Kreislauferkrankungen sind die häufigste Todesursache in Industrienationen. Dabei

führt die KHK seit vielen Jahren die Todesstatistik an. Im Jahr 2005 wurden in Deutschland

mehr als 17% aller registrierten Todesfälle durch chronische KHK und Herzinfarkt

verursacht. Das Erstereignis ist in ca. 50% der Fälle ein Herzinfarkt, in 10% der Fälle ein

plötzlicher Herztod. Beim Rest der Fälle entwickelt sich als erstes klinisches Symptom eine

Angina pectoris. Etwa 2% der Bevölkerung leiden an einer klinisch asymptomatischen

Durchblutungsstörung des Herzens ohne Krankheitserscheinungen wie Angina pectoris

(NHLBI 2002, Eurostat 2006/2007).

Ziel der medikamentösen Therapie von myokardialen Ischämien ist es, die metabolische

Balance zwischen Sauerstoffzufuhr und Sauerstoffbedarf wiederherzustellen. Der

myokardiale Sauerstoffbedarf kann durch Reduzierung der Herzfrequenz und der

myokardialen Kontraktilität verringert werden. Die Sauerstoffzufuhr kann unter anderem

1 Einleitung

4

durch Verlängerung der Diastolendauer erhöht werden. Gegenwärtig werden bei

myokardialen Ischämien zur Therapie Nitrate und �-Rezeptor-Blocker eingesetzt. Nitrate

senken den Sauerstoffbedarf des Herzens durch Verminderung des Gefäßwiderstandes, �-

Rezeptor-Blocker durch Reduzierung der Herzfrequenz und der myokardialen Kontraktilität.

Die Anwendung von �-Rezeptor-Blockern ist aufgrund ihrer Wirkung auf die

Myokardkontraktilität nicht unproblematisch. Eine sehr starke Reduktion der Kontraktilität

kann zu einer progressiven Verschlechterung des ohnehin durch die Ischämie geschädigten

Myokards führen (Dietz und Rauch 2003, Wolff und Weihrauch 2004).

1.2. Physiologie von Herzmuskelzellen

1.2.1. Die adulte Herzmuskelzelle

Die Herzmuskulatur nimmt eine Mittelstellung zwischen Skelettmuskulatur und glatter

Muskulatur ein. Herzmuskelzellen enthalten wie Skelettmuskelzellen die Myofibrillen in

regelmäßiger Anordnung, besitzen aber im Gegensatz zu den vielkernigen

Skelettmuskelzellen nur einen oder maximal zwei Zellkerne. Eine Besonderheit von

Herzmuskelzellen sind die sog. Glanzstreifen. In diesen Membranbereichen sind die

Plasmamembranen einzelner Zellen miteinander verbunden, und hier stehen die Myofibrillen

mit der Membran in Kontakt. Die Glanzstreifen setzen sich aus „Gap Junctions“ zur

Reizweiterleitung und aus Desmosomen und Adhärenzkontakten zur Stabilisierung des

Zellverbands zusammen (Kleinig 1997).

Kardiomyozyten enthalten zahlreiche Myofibrillen, in denen Filamente aus Actin und Myosin

organisiert sind. Die Myofibrillen liegen in Längsrichtung der Zellen. Die funktionelle Einheit

in den Fibrillen ist das Sarkomer (Abb.1.2.a.). Es enthält dünne Filamente aus Actin und

dicke Filamente aus Myosin. Beide sind für die Kontraktion verantwortlich. Jedes Sarkomer

wird von zwei Z-Scheiben begrenzt, in denen die Actinfilamente mit ihren plus-Enden

verankert sind. In der Mitte des Sarkomers befindet sich die M-Scheibe, die wiederum die

Mitte der bipolaren Myosinfilamente markiert. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen

sind M- und Z-Scheiben deutlich als helle bzw. dunkle Querstreifen zu erkennen (Abb.1.2.a.).

1 Einleitung

5

Abb.1.2.a. 1. Muskelzellaufbau (schematisch) nach Kleinig, Sitte, Maier 1997. Darstellung einer Muskelzelle (A), einer Myofibrille (B) und eines Sarkomers in Längsschnitt und Querschnitt (C, D). In den Z-Scheiben (Z) sind die Actinfilamente verankert, die M-Scheiben (M) markieren die Mitte der Myosinfilamente. Im Querschnitt ist die Anordnung der Filamente sehr regelmäßig. 2. Muskelzelle im Elektronenmikroskop nach Kleinig, Sitte, Maier 1997. Ausschnitt aus einer Herzmuskelzelle der Ratte im kontrahierten Zustand: Myofibrillen sind durch Mitochondrien voneinander getrennt. In den Sarkomeren sind die dunklen Z-Scheiben und die helleren M-Scheiben deutlich zu erkennen. Im kontrahierten Zustand ist der Bereich der Actinfilamente (I-Bande) sehr schmal, der Bereich der Myosinfilamente (A-Bande) sehr breit.

Neben Actin und Myosin enthält die Muskelzelle die funktionell für die Kontraktion

wichtigen Proteine Tropomyosin und Troponin. Das 40 nm lange Tropomyosin liegt als

Dimer in den Längsstreifen der Filamente und reicht über sieben Actinmoleküle hinweg. Alle

40 nm findet sich ein Troponin, das sich aus den Untereinheiten Troponin T (Tropomyosin-

bindend), Troponin I (inhibitorisch) und Troponin C (Calcium-bindend) zusammensetzt

(Abb.1.2.b.). Die Elastizität der Sarkomere wird durch Titin vermittelt, das in Z- und M-

Scheibe festliegt und außerdem an die Myosinfilamente gebunden ist (Kleinig 1997).

1. Muskelzellaufbau (schematisch) 2. Muskelzelle im Elektronenmikroskop

A.

B.

C.

D.

M-Scheibe Z-Scheibe

Z-Scheibe

Sarkomer

1 Einleitung

6

Abb.1.2.b. Schematische Darstellung von Myofilamenten aus Wehner, Gehring 1990: Actinfilament (Af) und Myosinfilament (Mf). Jedes Actinfilament besteht aus globulären Actinmonomeren (Ac), die zu einer langen Doppelhelix polymerisiert sind (Länge ca. 1µm); diese Doppelhelix trägt im Abstand von jeweils 7 Monomeren einen Troponin-Molekülkomplex aus Troponon I, C und T (Tp); die Doppelhelix bildet eine „Grube“, in die sich eine Tropomyosindoppelhelix (Tm) einfügt. Im Myosinfilament sind ca. 150 Myosinmoleküle in zwei Gruppen enthalten, die in entgegengesetzter Polarität (die „Köpfchen“ in entgegengesetzter Richtung) angeordnet sind. Die „Köpfchen“ stehen zur Seite ab.

Die Kontraktion kommt durch zyklisches Binden und Lösen von Myosinköpfen und

Actinmolekülen in den Filamenten zustande. Sie wird durch Calcium reguliert. Der Ablauf

eines Kontraktionszyklus ist in Abb.1.3. dargestellt. Unmittelbarer Auslöser einer Kontraktion

der Herzmuskelzelle ist der Calciumausstrom aus dem endoplasmatischen Retikulum

(sarkoplasmatischen Retikulum) ins Cytoplasma der Zelle. Troponin C bindet Calcium,

wodurch eine Konformationsänderung im Troponin/Tropomyosin-Komplex entsteht. Die

hemmende Wirkung von Troponin I wird dabei aufgehoben und Tropomyosin tiefer in die

Rille des Actinfilaments verlagert. Neue Bindungsstellen für Myosin werden frei. Das

Myosinköpfchen bindet sowohl in der ATP-Form als auch in der hydrolysierten ADP/Pi-

Form zunächst schwach an Actin. Bei der Abdiffusion von Pi kommt es zur Kippbewegung

des Myosinköpfchens und damit zu einem Kraftschlag, der sich auf das Actinfilament

überträgt und dieses in Richtung der M-Scheibe zieht. Durch Austausch von ADP gegen ATP

am Myosinköpfchen löst sich Myosin von Actin. Durch erneute Hydrolyse von ATP kann der

nächste Zyklus beginnen (Kleinig 1997).

1 Einleitung

7

Abb.1.3. Ablauf des Myosin-Actin-Zyklus (schematische Zusammenfassung aus Kleinig, Sitte, Maier 1997). Der blaue Bindestrich betont die Festigkeit der Bindung zwischen Myosin und Actin, wenn Myosin nach Abdiffusion des Phosphatrests (Pi) ADP gebunden hat.

1.2.2. Die neonatale Herzmuskelzelle

Bei neonatalen Herzmuskelzellen bestehen charakteristische Unterschiede bei den

Mechanismen, die zur Auslösung einer Kontraktion führen („excitation-contraction (EC)-

coupling“), im Vergleich zu adulten Zellen. In kardialem Gewebe kommt es durch

Depolarisation zur Öffnung von spannungsabhängigen L-Typ-Calciumkanälen, die sich in der

Cytoplasmamembran der Muskelzelle (Sarkolem) bzw. den sogenannten t-Tubuli

(Einstülpungen des Sarkolems) befinden. Der Calciumeinstrom aktiviert Ryanodin-

Rezeptoren im sarkoplasmatischen Retikulum, was zu einer massiven Freisetzung an Calcium

aus dem sarkoplasmatischen Retikulum führt und unmittelbar die Kontraktion auslöst

(Kleinig 1997, Escobar et al. 2004). Man bezeichnet diesen Mechanismus als Calcium-

abhängige Calciumfreisetzung („calcium-induced calcium release (CIRC)“) und geht davon

aus, dass dieser Prozess in adulten Kardiomyozyten die Kopplung von Erregung und

Kontraktion bestimmt. In neonatalen Herzmuskelzellen wird neben diesem Mechanismus

auch anderen Prozessen, die zur Auslösung einer Kontraktion führen, Bedeutung

beigemessen. Innerhalb der ersten 5 Lebenstage führt primär der sarkolemmale

Calciumeinstrom zur Kontraktion, innerhalb der darauf folgenden 14 Tage verliert dieser

Mechanismus an Bedeutung, und die Calcium-abhängige Calciumfreisetzung spielt fortan die

1 Einleitung

8

entscheidende Rolle. Neonatale Herzmuskelzellen besitzen dennoch funktionstüchtige

Ryanodin-Rezeptoren, und auch das sarkoplasmatische Retikulum ist vollständig entwickelt

und besitzt seine volle Speicherkapazität (Seki et al. 2003). Vermutlich ist die

unterschiedliche Kopplung von Erregung und Kontraktion in neonatalen und adulten Zellen

auf Unterschiede im räumlichen Abstand zwischen L-Typ-Calciumkanälen und den

Ryanodin-Rezeptoren des sarkoplasmatischen Retikulums zurückzuführen. Bei neonatalen

Herzmuskelzellen ist dieser Abstand noch deutlich größer als bei adulten Zellen, was die

Aktivierung der Ryanodin-Rezeptoren, für die der direkte Kontakt zu den L-Typ-

Calciumkanälen erforderlich ist, deutlich erschwert (Perez et al. 2005).

1.2.3. Zelluläre und physiologische Veränderungen nach myokardialer Ischämie

Wird nach einer Ischämiephase die Durchblutung eines Organs wiederhergestellt, bezeichnet

man das als Reperfusion. Der Gewebeschaden von post-ischämischem Myokard manifestiert

sich während dieser Reperfusionsphase. Man spricht deshalb auch von einem „Ischämie-

Reperfusionsschaden“ (Roche-Lexikon 2003). Viele Untersuchungen beschäftigen sich mit

der Aufklärung der Signaltransduktionsmechanismen, die nach einer myokardialen Ischämie

in der Reperfusionsphase ablaufen und die das Myokard schädigen. Durch diese Signalwege

kommt es zu Störungen in der Herzmuskelkontraktion („kontraktile Dysfunktion“; Braunwald

und Kloner 1982, Hearse und Bolli 1992, Mielniczuk et al. 2007, Sakamoto et al. 2007).

Mittlerweile sind außerdem sehr viele Signalwege bekannt, die den post-ischämischen

Gewebeschaden während der Reperfusion vermindern, d.h. einen kardioprotektiven Effekt

zeigen. Es handelt sich hierbei um endogene Schutzmechanismen, die das Herz in der post-

ischämischen Phase während der Reperfusion schützen. Eine Reduzierung der myokardialen

Kontraktilität (negative Inotropie) durch Ischämie wird heute vielfach als kardioprotektiv

bewertet, eine post-ischämische Steigerung der Kontraktilität (positive Inotropie) meist als

Gewebe-schädigend.

Eine post-ischämische kontraktile Dysfunktion wird auf zellulärer Ebene von verschiedenen

Ereignissen begleitet. So kann in mehreren Untersuchungen eine „Überladung“ der

Kardiomyozyten mit Calciumionen insbesondere auf mitochondrialer Ebene nach Ischämie

festgestellt werden. Die Mitochondrien werden dabei zerstört, was die ATP-Synthese und

damit den zellulären Energiemetabolismus der Zelle beeinträchtigt (Crestanello et al. 2002,

Riess et al. 2002, Szenczi et al. 2005). Außerdem wird nach Ischämie eine herabgesetzte

1 Einleitung

9

Sensibilität der Myofilamente gegenüber Calcium und eine Dysfunktion des

sarkoplasmatischen Retikulums beobachtet (Kusuoka et al. 1987, Gao et al. 2006).

Eine wichtige Rolle bei der Schädigung kardialen Gewebes nach Ischämie wird der

Freisetzung von reaktiven freien Sauerstoffradikalen und cytotoxischen Enzymen

zugesprochen (Reimer et al. 1990, Moens et al. 2005, Nonomura et al. 2005, Sun 2007). Die

Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies ist eine Konsequenz des durch extrem hohe

Calciumkonzentrationen gestörten Energiemetabolismus der Mitochondrien, was zu

Störungen in der Elektronentransportkette führt. Reaktive Verbindungen, die dadurch

entstehen können, sind z.B. das Hyperoxidanion (O2-), das hochreaktive Hydroxylradikal

(OH.) und das Alkoxylradikal (LO.) von Lipiden. Diese freien Radikale zerstören Gewebe als

Bruchteile von Molekülen, indem sie als Initiator eine Kettenreaktion auslösen. Darin kann

sich ein freies Radikal mit dem Teil eines bestehenden Moleküls zu einem Molekül

verbinden. Wird der Reaktionspartner ebenfalls als freies Radikal freigesetzt, so kann er eine

analoge Reaktion verursachen. In einer solchen Kettenreaktion werden lebenswichtige

Moleküle zerstört, und es entstehen unerwünschte schädliche Moleküle.

Neben dem oxidativen Stress hat auch der „nitrosative Stress“ nach Ischämie eine Bedeutung,

der vor allem durch Peroxynitrit (ONOO-) verursacht wird (Liang et al. 2004, Tao et al. 2007,

Wang et al. 2007). Peroxynitrit entsteht durch die Reaktion des Hyperoxid-Anions mit

Stickstoffmonoxid (NO), das wiederum durch Stickstoffmonoxid-Synthasen aus der

Aminosäure L-Arginin und Sauerstoff gebildet wird. Peroxynitrit ist eine hochreaktive

Verbindung und aufgrund des hohen Redoxpotentials wesentlich aggressiver als seine

Vorläufermoleküle. Die Verbindung wirkt wie freie Sauerstoffradikale als Oxidans und kann

somit zur Schädigung von Gewebe beitragen.

Myokardiale Ischämie stimuliert außerdem die Calcium-unabhängige Phospholipase A2, was

zur Schädigung von kardialem Gewebe führt (Hazen et al. 1990, Vesterquist et al. 1996).

Hazen et al. konnten nachweisen, dass während myokardialer Ischämie das aktivierte Enzym

vom Cytosol in ein Membran-assoziiertes Kompartiment transloziert wird, wo es vermutlich

den post-ischämischen Schaden vermittelt (Hazen et al. 1990).

Die kontraktile Funktion von post-ischämischem Myokard wird auch durch Adenosin

beeinflusst (Kitakaze et al. 1993, Rose'Meyer et al. 2003, Vasara et al. 2003). Unter

1 Einleitung

10

normoxischen, nicht-ischämischen Bedingungen wird Adenosin vor allem aus Methionin

gebildet, von post-ischämischem Myokard vor allem durch die enzymatische

Dephosphorylierung von AMP durch die Membran-gebundene Ecto-5`-Nucleotidase.

Dadurch kommt es nach Ischämie zu einem starken Anstieg der Adenosinkonzentration im

Interstitium. Adenosin blockiert die Ausschüttung von aktivierenden Botenstoffen wie

Dopamin, Noradrenalin und Acethylcholin und wirkt außerdem negativ-inotrop auf

myokardiales Gewebe durch die Öffnung von Kalium(ATP)-Kanälen (Kitakaze et al. 1993).

Adenosin wird daher überwiegend als kardioprotektiv nach Ischämie verstanden (Obata

2002).

Im Gegensatz zu freien Radikalen, Peroxynitrit und der Phospholipase A2 wird die Rolle von

Arachidonsäure und Prostaglandinen nach Ischämie am Herzen wie bei Adenosin

überwiegend als protektiv verstanden. Die Cyclooxygenase (COX) und Prostaglandin-

Rezeptoren werden als Vermittler dieses kardioprotektiven Effekts diskutiert. Auch

Kalium(ATP)-Kanälen wird post-ischämisch eine protektive Bedeutung zugeschrieben. In

den folgenden Abschnitten wird die post-ischämische Bedeutung des Prostaglandin-

Stoffwechsels und der Kalium(ATP)-Kanäle im Einzelnen dargestellt.

1.2.4. Besondere Rolle des Prostaglandin-Stoffwechsels nach myokardialer Ischämie

In zahlreichen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Ischämie und Reperfusion mit

einem Anstieg der Arachidonsäure-Konzentration im Cytosol und in der Membran von

Kardiomyozyten und einer starken Veränderung in der myokardialen

Prostaglandingenerierung assoziiert ist (Schrör 1987, Chen et al. 1999).

Die Cyclooxygenase setzt ihre Substrate zu Prostaglandin H um. Prostaglandin H ist die

Vorläufersubstanz für weitere Prostaglandine und Thromboxane (Simmons et al. 2004). Die

induzierbare Isoform der Cyclooxygenase, die Cyclooxygenase-2 (COX-2), wird unter

ischämischen Bedingungen induziert (Adderley und Fitzgerald 1999, Shibata et al. 2005).

Shinmura et al. konnten einen kardioprotektiven Effekt der COX-2 in Kaninchenherzen nach

ischämischer Präkonditionierung nachweisen. Als ischämische Präkonditionierung bezeichnet

man einen Mechanismus, bei dem Sauerstoff- bzw. Nährstoffmangel durch kurzzeitige

Minderdurchblutung der Herzmuskulatur vor den Auswirkungen eines späteren Schadens

durch eine weitere, längere Ischämiephase schützen (Murry et al. 1986). Shinmura et al.

1 Einleitung

11

konnten zeigen, dass im Myokard die Expression der COX-2 durch die Präkonditionierung

induziert wird. Die Autoren wiesen den kardioprotektiven Effekt der COX-2 nach einer

weiteren Ischämie- und Reperfusionsphase anhand der Infarktgröße nach und zeigten, dass

bei Anwendung von COX-2-Inhibitoren größere Gewebeareale durch die Ischämie geschädigt

sind (Shinmura et al. 2000).

Die verschiedenen Prostaglandine und Thromboxane vermitteln ihren Effekt in der Zelle über

spezifische Rezeptoren. Eine große Bedeutung im kardiovaskulären System wird post-

ischämisch vor allem Prostaglandin E und Prostaglandin I und ihren Rezeptoren

zugeschrieben. In einer Reihe von Untersuchungen konnte beispielsweise eine wichtige Rolle

von Prostaglandin E-Rezeptor-abhängiger Signaltransduktion in der post-ischämischen Phase

festgestellt werden. Martin et al. gaben beispielsweise Hinweise auf einen kardioprotektiven

Effekt, der durch den Prostaglandin E-Rezeptor-Subtyp EP3 vermittelt wird. Eine

Überexpression von EP3 in transgenen Mäusen führte zu einer deutlichen Reduktion des

myokardialen post-ischämischen Schadens. Wildtyp-Herzen zeigten nach Ischämie einen

starken Anstieg des linksventrikulären, end-diastolischen Drucks. Bei transgenen Herzen war

dieser Anstieg um 55% reduziert und die Freisetzung von Kreatin-Kinase bzw. Lactat-

Dehydrogenase um 85 bzw. 75% vermindert und damit das Ausmaß der Zellschädigung

gesunken (Martin et al. 2005). Einen negativ-inotropen und kardioprotektiven Effekt nach

Ischämie des Prostaglandin I-Analogons Iloprost konnten Ferrari et al. an Kaninchenherzen

nachweisen. Die Autoren gingen davon aus, dass dieser Effekt über den Prostaglandin I-

Rezeptor IP vermittelt wird und schlossen daraus eine kardioprotektive Wirkung von

Prostaglandinen der Subklasse I (Ferrari et al. 1988).

1.2.5. Besondere Rolle von Kalium(ATP)-Kanälen nach myokardialer Ischämie

Eine myokardiale Ischämie zieht die Öffnung von sarkolemmalen und mitochondrialen

Kalium(ATP)-Kanälen nach sich. Dieser Effekt verbessert post-ischämisch die myokardiale

Funktion (Faivre und Findlay 1990, Dos Santos et al. 2002, Flagg und Nichols 2005).

Mehrere Signalwege führen nach Ischämie zur Aktivierung der Kanäle. Es konnte

nachgewiesen werden, dass eine Aktivierung der Proteinkinase C, von Tyrosin-Kinasen und

MAP-Kinasen zur Öffnung von Kalium(ATP)-Kanälen führt. Auch Stickstoffmonoxid-

Radikale können post-ischämisch eine Öffnung von Kalium(ATP)-Kanälen bewirken (Yellon

und Baxter 2000, Bolli 2001, Patel und Gross 2001, Schulz et al. 2001).

1 Einleitung

12

Bei sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen kommt es durch Ausstrom von Kaliumionen aus

der Zelle bei Öffnung der Kanäle zu einer Verkürzung der Depolarisation. Das führt

letztendlich zu einem schwächeren Calciumeinstrom durch spannungsgesteuerte

Calciumkanäle in die Zelle und dadurch zu einem negativ-inotropen, kardioprotektiven Effekt

(Faivre und Findlay 1990, Kantor et al. 1990, Gwilt et al. 1992). Bezüglich der

mitochondrialen Kalium(ATP)-Kanäle ist der genaue Mechanismus, der auf zellulärer Ebene

den Schutz bewirkt, noch nicht aufgeklärt. Eine Hypothese beschreibt eine direkte

Beteiligung von mitochondrialen Kalium(ATP)-Kanälen an der Kardioprotektion. Basis dafür

ist der Nachweis, dass der Einstrom von Kaliumionen in die Mitochondrien durch geöffnete

Kanäle in der inneren Mitochondrienmembran zu einer Vergrößerung des Matrixvolumens

führt. Dadurch wird die ischämiebedingte Volumenkontraktion der Mitochondrien verhindert.

Der Erhalt des Volumens ist wiederum Voraussetzung für die funktionelle Kopplung der

Adenin-Nukleotid-Translokase in der inneren Mitochondrienmembran und der Kreatin-

Kinase in der äußeren Membran, die zusammen das energiereiche Phosphat von ATP auf

Kreatin übertragen. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Aktivierung der Kalium(ATP)-

Kanäle die Kopplung der beiden Enzyme nach Ischämie während der Reperfusion

aufrechterhält und damit kardioprotektv wirkt (Garlid 2000, Laclau 2001, Kowaltowski et al.

2002).

Eine Reihe an Substanzen aus dem Arachidonsäure-Stoffwechsel, insbesondere verschiedene

Epoxyeicosatetraensäuren, wirken als Öffner von Kalium(ATP)-Kanälen (Hiraoka 1997,

Aimond et al. 2000, Nithipatikom et al. 2001). In einer neueren Studie mit Hundeherzen

konnten Nithipatikom et al. außerdem zeigen, dass die Epoxyeicosatetraensäuren 11,12-EET

und 14,15-EET über sarkolemmale und mitochondriale Kalium(ATP)-Kanäle kardioprotektiv

wirken. Der genaue zelluläre Mechanismus wurde von den Autoren nicht analysiert

(Nithipatikom et al. 2006).

1.3. Ischämie in nicht-kardialem Gewebe

In der Literatur gut beschrieben sind die physiologischen und zellbiologischen Veränderungen

nach Ischämie in Gehirn und Leber. Ähnlich wie bei der myokardialen Ischämie sind für

Gehirn und Leber unter ischämischen Bedingungen die vermehrte Bildung von reaktiven

Sauerstoff-Spezies, „nitrosativer Stress“ und die Induktion der Expression von Stress-

abhängigen Genen, wie z.B. auch der COX-2 nachgewiesen worden (Clemens 2000, Lapchak

1 Einleitung

13

et al. 2001, Jozsef und Filep 2003, Cai et al. 2007, Shi und Liu 2007). Dabei wird in der

Literatur überwiegend davon ausgegangen, dass die COX-2 in neuronalem Gewebe nach

Ischämie keinen protektiven Effekt, sondern eine schädliche Wirkung auf das post-

ischämische Gewebe während der Reperfusion hat (Lapchak et al. 2001, Lerouet et al. 2002,

Candelario-Jalil et al. 2003, Cai et al. 2007). Bei einer hepatischen Ischämie schreibt man

nach den Ergebnissen der neuesten Studien Metalloproteinasen der extrazellulären Matrix

eine große Bedeutung zu. Es wird dabei durchweg von einer schädlichen Wirkung der

Proteinasen ausgegangen. Ihre Hemmung vermindert den post-ischämischen

Reperfusionsschaden (Shirahane et al. 2006, Defamie et al. 2007).

1.4. Stoffwechsel der Prostaglandine

Wie in Abschnitt 1.2.4. erläutert wurde, geht man von einer zentralen Bedeutung von

Enzymen und Substanzen aus dem Prostaglandin-Stoffwechsel nach myokardialer Ischämie

aus. In den folgenden Abschnitten wird die Entstehung und Wirkungsweise der

Prostaglandine und Thromboxane dargestellt, die mit Leukotrienen zur Gruppe der

Eicosanoide zusammengefasst werden.

1.4.1. Arachidonsäure als Ausgangssubstanz der Prostaglandine bzw. Eicosanoide

1962 isolierten Bergström und Samuelson aus menschlichem Sperma kristallierbare Derivate,

nach ihrer Löslichkeit als Prostaglandin E - PGE (Ether-löslich) - und Prostaglandin F - PGF

(Phosphat-löslich; schwedische Schreibweise) - klassifiziert (Bergström und Samuelson

1962). Heute unterscheidet man nach Struktur, Vorkommen und Wirkung in Säugetieren

neben Prostaglandin E und F als die wichtigsten Subklassen Prostaglandin D, H, I und

Thromboxane (PGD, PGH, PGI und TX; Roche-Lexikon 2003, Simmons et al. 2004).

Arachidonsäure (AA; 5Z,8Z,11Z,14Z-Eicosatetraensäure) ist eine zentrale Ausgangssubstanz

von Eicosanoiden. Chemisch handelt es sich um eine vierfach ungesättigte Fettsäure mit 20

C-Atomen, die in jedem tierischen Organismus aus der essentiellen Omega-6-Fettsäure

Linolsäure und Dihomogammalinolensäure (DGLA) synthetisiert oder über die Nahrung

aufgenommen wird (Roche-Lexikon 2003, Simmons et al. 2004, Berg 2007).

1 Einleitung

14

Arachidonsäure wird aus Phospholipiden freigesetzt. Phospholipide sind phosphorhaltige,

amphiphile Moleküle und bilden den Hauptbestandteil der Doppelschicht von Biomembranen.

Bei Phospholipiden wird die Gruppe der Phosphoglyceride (oder Glycerolphospholipide) mit

Glycerin als Grundgerüst von den Sphingomyelinen unterschieden, die sich von Sphingosin

ableiten (Kleinig 1997, Müller-Esterl 2004). Arachidonsäure kann über die Aktivität der

Enzyme Phospholipase A2 (PLA2), Phospholipase C (PLC) und Phospholipase D (PLD) aus

Phosphoglyceriden und Sphingomyelinen freigesetzt werden. Der Phospholipase A2 schreibt

man pathophysiologisch die größte, der Phospholipase D die geringste Bedeutung zu (Exton

1994, Kleinig 1997, Simmons et al. 2004, Khanapure et al. 2007). Abb.1.4. zeigt die

Molekülstrukturen von Phosphoglyceriden und ihre Spaltung durch die Phospholipase A2. In

Phosphoglyceriden ist das Glycerolgrundgerüst am C2-Atom verestert mit der

Arachidonsäure. Die Phospholipase A2 katalysiert die hydrolytische Spaltung dieser

Esterbindung, was zur Freisetzung von Arachidonsäure und 1-Acylphosphoglycerid führt.

Abb.1.4. Freisetzung von Arachidonsäure aus Phosphoglyceriden am Beispiel der Spaltung von Phosphatidylinositol am 2. C-Atom durch die Phospholipase A2.

Arachidonsäure ist ein Substrat für die Enzyme Lipoxygenase, Cyclooxygenase

(Prostaglandin H-Synthase) und Cytochrom P450 und damit Vorläuferverbindung für die

Herstellung von weiteren Eicosatetraensäuren, Prostaglandinen, Thromboxanen und

Leukotrienen. Abb.1.5. fasst die Stoffwechselwege zusammen, für die die Arachidonsäure

Ausgangssubstanz ist. Durch die Lipoxygenase entstehen über den „linearen Zweig“

Phosphatidyl inositol

C HO

CH2O

H2C O C R1

O

CR2

O

P O

O

O-

H

H

OH

OH

HH

OH

OHH

OH H

Site of cleavage by Phospholipase A2

Site of cleavage by Phospholipase C

Spaltung durch Phospholipase A2

R2=z.B. Arachidonsäure Arachidonsäure

Arachidonsäure

+ 1-Acylphosphoglycerid

Phosphatidylinositol

1 Einleitung

15

Leukotriene über die Zwischenprodukte Hydroperoxyeicosatetraensäuren (HPETE) und

Hydroxyeicosatetraensäuren (HETE). Leukotriene spielen eine Rolle bei allergischen

Reaktionen und Entzündungen des Körpers. Durch die Cyclooxygenase, d.h. über den

„zyklischen Zweig“ entsteht durch eine Bis-Deoxygenierung das Endoperoxid Prostaglandin

H2 (PGH2). Aus Prostaglandin H2 werden die weiteren Prostaglandine und Thromboxane

über die Aktivität verschiedener Isomerasen, Synthasen und Reduktasen gebildet. Durch die

Cytochrom P450-Oxidase werden aus Arachidonsäure Epoxyeicosatetraensäuren (EET) und

Hydroxyeicosatetraensäuren gebildet (Simmons et al. 2004).

Abb.1.5. Überblick über Umsetzungswege der Arachidonsäure. Die Arachidonsäure wird aus Phospholipiden in Biomembranen freigesetzt und über die Lipoxygenase („linearer Zweig“), die Cyclooxygenase („zyklischer Zweig“) und Cytochrom P450 verstoffwechselt. Es entstehen Leukotriene, Prostaglandine/Thromboxane bzw. weitere Eicosatetraensäuren.

Prostaglandine und Thromboxane, für die Arachidonsäure Ausgangsverbindung ist, haben in

ihrer Molekülstruktur zwei Doppelbindungen und werden als bisenoische Prostanoide

bezeichnet. Man spricht auch von Eicosanoiden der Serie 2. In der Nomenklatur wird die

Serie durch eine „2“ im Namen gekennzeichnet, z.B. Prostaglandin E2 oder I2.

Arachidonsäureprodukte, die durch die 5-Lipoxygenase gebildet werden, sind durch eine „4“

kenntlich gemacht, z.B. Leukotrien A4 oder C4.

Arachidonsäure

„linearer Zweig“ Lipoxygenase

Leukotriene

„zyklischer Zweig“ Cyclooxygenase

Prostaglandin H

Prostaglandin D, E, F, I und Thromboxane

Synthasen, Isomerasen, Reduktasen

Cytochrom P450

Eicosatetraensäuren (EET bzw. HETE)

Biomembran

1 Einleitung

16

1.4.2. Weitere Ausgangssubstrate für Prostaglandine bzw. Eicosanoide

Eine weitere Ausgangssubstanz für die Biosynthese von Eicosanoiden ist die

Eicosapentaensäure (EPA). Sie ist Ausgangspunkt für die Biosynthese von Eicosanoiden der

Serie 3 (z.B. PGE3, PGI3). Chemisch handelt es sich bei Eicosapentaensäure um eine

fünffach ungesättigte Fettsäure mit 20 C-Atomen, die in Lebewesen ubiquitär verbreitet ist.

Ihre Biosynthese erfolgt über die alpha-Linolensäure. Sie kann zu Docosahexaensäure (DHA)

verstoffwechselt werden, die Bestandteil von Phospholipiden überwiegend in

Nervenzellmembranen ist (Hahn und Ströhl 2004). Für die Eicosapentaensäure ist mehrfach

eine positive Wirkung bei Herzerkrankungen, z.B. bei der koronaren Herzkrankheit

nachgewiesen (Colussi et al. 2007, Leaf et al. 2008).

Dihomogammalinolensäure ist ebenfalls Ausgangssubstanz für die Biosynthese von

Eicosanoiden, in diesem Fall von Eicosanoiden der Serie 1 (z.B. PGE1, PGI1). Es handelt

sich um eine C20-Fettsäure mit drei Doppelbindungen. Ihre Biosynthese erfolgt in jedem

tierischen Organismus aus Gamma-Linolensäure. Eine Rolle von Dihomogammalinolensäure

bei Herzerkrankungen ist nicht nachgewiesen (Kapoor und Huang 2006, Umeda-Sawada et al.

2006).

1.4.3. Physiologie der Cyclooxygenase

Die Prostaglandin H-Synthasen oder Cyclooxygenasen sind die zentralen Enzyme des

Prostaglandin-Stoffwechsels. Cyclooxygenasen sind im endoplasmatischen Retikulum,

innerhalb der Kernhülle und im Golgi-Apparat lokalisiert. Die Enzyme haften an der

Innenseite der Membran dieser Zellkompartimente. Sie kommen in Zellen von Tieren seit der

frühen Entwicklung der wirbellosen Tiere vor, z.B. bereits in Zellen der Koralle, nicht jedoch

in einzelligen Organismen, Pflanzen oder Insekten (Sanz et al. 1998, Hamberg et al. 1999,

Koeduka et al. 2000, Simmons et al. 2004). Hier existieren verwandte Enzyme aus der

übergeordneten Familie der Pathogen-induzierbaren Oxygenasen (PIOX).

Es gab bereits früh in der Evolution der Cyclooxygenasen (COX) zwei Isoformen des

Enzyms, die Cyclooxygenase-1 (COX-1) und die Cyclooxygenase-2 (COX-2), die durch

Genduplikation entstanden sind und sich dann evolutiv voneinander unabhängig entwickelt

1 Einleitung

17

haben. Die Isoformen katalysieren beide die Synthese von Prostaglandin H. Es handelt sich

um globuläre Proteine mit ca. 600 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von ca.

70 kDa. Sie lagern sich zu Proteinkomplexen aus jeweils zwei Dimeren zusammen. Mit einer

hydrophoben Region bindet der Komplex an die Innenseiten mikrosomaler Membranen.

Diese Membran-bindende Region bildet eine enge Öffnung für einen Kanal zum aktiven

Zentrum mit Cyclooxygenase-Aktivität. Die beiden Isoenzyme COX-1 und COX-2 haben

65% Homologie der Aminosäuresequenz und daher eine etwas unterschiedliche

Molekülstruktur. Ein wichtiger Unterschied in der Molekülstruktur der beiden Enzyme ist der

Austausch der Aminosäure Isoleucin gegen Valin an Position 523, wodurch der Kanal zum

aktiven Zentrum mit Cyclooxygenase-Aktivität bei der COX-2 etwas größer wird und somit

auch etwas „sperrigere“ Substrate durch diese Isoform umgesetzt werden können.

Prostaglandin H-Synthasen besitzen außerdem ein zweites aktives Zentrum mit Peroxidase-

Aktivität (Simmons et al. 2004).

Die Expression von COX-1 und COX-2 wird unterschiedlich reguliert. Während die COX-1

konstitutiv exprimiert wird und ubiquitär in den meisten Geweben vorkommt, wird die

Expression von COX-2 durch verschiedene Stressfaktoren in den meisten Zelltypen induziert.

So fördern z.B. Entzündungsmediatoren wie TNF-�, Interleukin-1� oder Lipopolysaccharide,

Wachstumsfaktoren wie TGF-� oder Onkogene die Expression der COX-2 (Kishimoto et al.

2002, Norvell et al. 2004, Oshima et al. 2005, Ishikawa und Morris 2006, Oh et al. 2007).

Dementsprechend spielt die COX-2 funktionell eine große Rolle bei Entzündungen und

Wundheilung. Die COX-1 übernimmt als konstitutiv exprimiertes Enzym verschiedene

Funktionen und hat eine große Bedeutung für den Magen-Darm-Trakt und die Blutgerinnung

(Simmons et al. 2004). Jahrelang wurde außerdem das Vorhandensein einer

Cyclooxygenase-3 (COX-3) diskutiert, die mittlerweile als Splicevariante der COX-1

identifiziert werden konnte (Warner und Mitchell 2002, Simmons et al. 2004, Snipes et al.

2005).

Am besten charakterisiert in Struktur und Synthese sind die Prostaglandine der Serie 2.

Abb.1.6. zeigt die Umwandlung der Arachidonsäure in Prostglandin H2 katalysiert durch die

Cyclooxygenase. Die Reaktion erfolgt in zwei Schritten in den zwei unterschiedlichen

Reaktionszentren. Der erste Reaktionsschritt findet im aktiven Zentrum mit Cyclooxygenase-

Aktivität statt. Hier wird durch Ringschluss zwischen den C-Atomen C8 und C12 und

Einfügen von zwei Sauerstoffatomen an C9 und C11 das Zwischenprodukt Prostaglandin G2

1 Einleitung

18

gebildet. Die eingefügten Sauerstoffatome gehen eine kovalente Bindung miteinander ein, so

dass eine Epoxidstruktur entsteht. Prostaglandin G2 diffundiert aus dem Kanal des aktiven

Zentrums. Im zweiten Schritt wird durch das zweite Reaktionszentrum mit

Peroxidaseaktivität aus Prostaglandin G2 Prostaglandin H2 gebildet. Aus Prostaglandin H2

werden durch verschiedene Synthasen die Prostaglandine der Subklassen D2, E2, F2 und I2

und Thromboxane gebildet. Die Umwandlung von Arachidonsäure zu Prostaglandin H2 durch

COX-1 oder COX-2 ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Prostaglandin-

Synthese (Simmons et al. 2004).

Abb.1.6. Umsetzung von Arachidonsäure zu Prostaglandin H2 durch die Cylooxygenase nach Simmons et al. 2004. Im ersten Schritt entsteht durch die Cyclooxygenase-Reaktion das Zwischenprodukt Prostaglandin G2, im zweiten Schritt wird Prostaglandin H2 durch eine Peroxidase-Reaktion in einem weiteren aktiven Zentrum gebildet. Beide Cylooxygenase-Isoformen COX-1 und COX-2 katalysieren diese Reaktion.

1.4.4. Prostaglandin-Subklassen und Rezeptortypen

Prostaglandine sind Gewebshormone. Die verschiedenen Subklassen der Prostaglandine

kommen im tierischen Organismus in den meisten Organen und Zelltypen vor (Roche-

Lexikon 2003, Simmons et al. 2004). Chemisches Grundgerüst der Prostaglandine ist die

Prostansäure, eine Carbonsäure mit 20 C-Atomen. Die Subklassen unterscheiden sich im

Oxidationsgrad der C-Atome C9 und C11 und sind dementsprechend Diketone, Diole oder

„Cyclooxygenase-Reaktion“

„Peroxidase-Reaktion“

1 Einleitung

19

Ketole. Abb.1.7. fasst die Verbindungen der Serie 2 zusammen, die aus Prostaglandin H2

entstehen. Thromboxane, wie z.B. Thromboxan A2, werden ebenfalls aus Prostaglandin H2

gebildet über die Thromboxan-Synthase. Sie werden aufgrund ihrer Synthese und ihrer

Strukturähnlichkeit zu den Prostaglandinen gezählt und traditionell als Prostaglandin der

Thrombozyten verstanden.

Abb.1.7. Überblick über aus Prostaglandin H2 (PGH2) gebildete Verbindungen aus Simmons et al. 2004. Über Subklassen-spezifische Synthasen entstehen Prostaglandin D2, E2, F2 und I2 (PGD2, PGE2, PGF2 und PGI2) und Thromboxan A2 (TXA2). Bei Körpertemperatur hat Thromboxan A2 eine Halbwertszeit von 30 Sekunden und wird zu biologisch-inaktivem Thromboxan B2 (TXB2) abgebaut. 6-keto-Prostaglandin F1 (6-keto-PGF1) entsteht als Abbauprodukt von Prostaglandin I2.

Die Prostaglandine der Serie 2 sind auch hinsichtlich ihrer Wirkung am besten charakterisiert

und vermutlich auch die biologisch aktivsten Eicosanoide. Die Prostaglandine D2, E2, I2 und

F2 und Thromboxane entfalten ihre Wirkung über Rezeptoren, die in Zellmembranen

vorkommen und zur Gruppe der G-Protein-gekoppelten Membranrezeptoren gehören. Für die

Prostaglandin-Subklassen existieren verschiedene Rezeptortypen, die entsprechend der

einzelnen Subklassen bezeichnet werden und teilweise zusätzlich aufgrund von

Strukturunterschieden in Untergruppen unterteilt werden können, z.B. für Prostaglandin D der

1 Einleitung

20

DP-Rezeptor mit den Subtypen DP1 und DP2 und für Prostaglandin E der EP-Rezeptor mit

den Subtypen EP1, EP2, EP3 und EP4. Tabelle 1.1. fasst Vorkommen und die wichtigsten

Funktionen bzw. Wirkungen für die verschiedenen Prostaglandine der Serie 2 zusammen und

gibt die Rezeptoren an, über die jede Subklasse ihre Wirkung vermittelt. Man geht heute

davon aus, dass im kardiovaskulären System Prostaglandin E2 und Prostaglandin I2 von allen

Prostaglandinen die wichtigste Rolle spielen. Prostaglandin E2 kann im kardiovaskulären

System entweder eine Gefäßverengung oder –erweiterung auslösen, was vor allem von der

Art des exprimierten Rezeptorsubtyps abhängt (FitzGerald et al. 1983). Prostaglandin E2 regt

außerdem die kardiale Gefäßneubildung an und hält den Ductus arteriosus über den

Rezeptorsubtyp EP4 offen (Loftin et al. 2001). Prostaglandin I2 ist das Hauptprostaglandin

der Endothelzellen von kardialen Gefäßen und hemmt die Gefäßkontraktion (FitzGerald et al.

1983). Prostaglandin I2 verhindert außerdem die Bildung von Mikrothromben und ist damit

ein funktioneller Gegenspieler von Thromboxan (Monocada et al. 1976). In einzelnen Studien

ist im Herzen auch eine funktionelle Bedeutung von Prostaglandinen der Subklassen D und F

und für Thromboxane nachgewiesen (Hattori und Levi 1986, Tanaka et al. 2003, Taniguchi et

al. 2007).

Entsprechend des ubiquitären Vorkommens der verschiedenen Prostaglandin-Subklassen im

tierischen Organismus verfügen die meisten Organe über Prostaglandin-Rezeptoren für alle

Subklassen. Prostaglandin-Rezeptoren sind G-Protein-gekoppelte Membranrezeptoren des

Rhodopsintyps (Simmons et al. 2004). Die Signaltransduktion beginnt mit der Bindung des

Agonisten an den Rezeptor, wodurch das heterotrimere G-Protein aktiviert wird. Das G-

Protein besteht aus den Untereinheiten �, � und �, die nachfolgend verschiedene Signalwege

induzieren können. Entsprechend den zellulären Effekten kann man die G-Proteine in die

verschiedenen Familien Gs, Gi und Gq einteilen. Über Gs-Proteine wird die Adenylat-

Zyklase aktiviert, was zu einem Anstieg von cAMP als Botenstoff in der Zelle führt und

nachfolgend eine Aktivierung der Proteinkinase A (PKA) bewirkt. Die Aktivierung von Gi-

Proteinen führt hingegen zu einer Inhibierung der Proteinkinase A. Über Gq-Proteine wird die

Phospholipase C aktiviert, die die Bildung der Signalmoleküle Diacylglycerol und Inositol-

1,4,5-trisphosphat vermittelt. Inositol-1,4,5-trisphosphat bewirkt in Folge eine vermehrte

Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern und eine Aktivierung der Calcium-

abhängigen Proteinkinase C (PKC; Kleinig 1997). Die verschiedenen Rezeptoren für die

einzelnen Prostaglandin-Subklassen leiten über unterschiedliche G-Proteine ihre Signale ins

Zellinnere weiter.

1 Einleitung

21

Tabelle 1.1. Übersicht über die verschiedenen Prostaglandine der Serie 2 (Monocada et al. 1976, FitzGerald et al. 1983, Loftin et al. 2001, Roche-Lexikon 2003, Simmons et al. 2004, Klinke 2005).

1.4.5. Pharmakologie von Cyclooxygenasen und Prostaglandin-Rezeptoren

Zur pharmakologischen Beeinflussung der Cyclooxygenase-Aktivität werden Substanzen aus

der Gruppe der entzündungshemmenden nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAR)

eingesetzt. Beispiele für Pharmaka aus dieser Gruppe sind Ibuprofen oder das

Indolessigsäurederivat Indomethacin. Diese unselektiven Cyclooxygenase-Hemmer gehören

zur ersten Generation der NSAR und zeigten bei der Behandlung von Rheumapatienten starke

Nebenwirkungen, die sich vor allem auf den Magen-Darm-Trakt auswirken. Man geht heute

davon aus, dass die starken Nebenwirkungen auf die Hemmung beider Cyclooxygenase-

Isoformen zurückzuführen sind und leitet daraus wichtige physiologische Funktionen der

konstitutiv exprimierten COX-1 ab. Um die Nebenwirkungen bei Einnahme der Medikamente

Subklasse Vorkommen biologische Wirkung Rezeptor Prostaglandin D2 in hohen Konzentrationen in

Mastzellen und Gehirn; in niedrigen Konzentrationen ubiquitär in sämtlichen Organen des tierischen Organismus

� Kontraktion der bronchialen Luftwege � Regulation von Körpertemperatur und Schlaf

zwei Subtypen: DP1-Rezeptor und DP2-Rezeptor

Prostaglandin E2 ubiquitär in sämtlichen Organen des tierischen Organismus; in besonders hohen Konzentrationen im Herzen und in den Nieren (Nierenrinde)

� zentrale Rolle bei Entzündungen � wichtige Funktion im kardiovaskulären System: Gefäßerverengung oder –erweiterung; Gefäßneubildung

vier Subtypen: EP1-EP4-Rezeptor

Prostaglandin F2 glatte Muskulatur von Bronchien, Gefäßen, Darm, Myometrium; Plazenta, Amnion

� Reproduktion ein Subtyp, 2 Splicevarianten: FP�-Rezeptor und FP�-Rezeptor

Prostaglandin I2 ubiquitär bei Entzündungen; Herz, Lunge

� zentrale Rolle bei Entzündungen � wichtige Funktion im kardiovaskulären System: Gefäßerweiterung � Gegenspieler von Thromboxan: hemmt Aggregation von Thrombozyten

ein Subtyp: IP-Rezeptor

Thromboxan A2 Thrombozyten; glatte Muskeln an Gefäßen und Luftwegen

� Aktivierung der Aggregation von Thrombozyten � Kontraktion von glatter Muskulatur an Gefäßen und Luftwegen

ein Subtyp, 2 Splicevarianten: TP�-Rezeptor und TP�-Rezeptor

1 Einleitung

22

zu reduzieren, wurden hochselektive COX-2-Hemmer entwickelt. Beispiele hierfür sind die

Medikamente Rofecoxib und Lumiracoxib aus der zweiten bzw. dritten Generation der

NSAR. Zur unselektiven Hemmung der Cyclooxygenase in „vitro“ wird überwiegend

Indomethacin eingesetzt (Laneuville et al. 1994, Kerkof et al. 2002, Simmons et al. 2004,

Coetzee et al. 2005). Zur selektiven Hemmung der Cyclooxygenase-Isoformen wird in „vitro“

für die Hemmung der COX-1 SC-560, aus der Gruppe der diaryl-heterozyklischen

Cyclooxygenase-Inhibitoren verwendet (Smith et al. 1998, Simmons et al. 2004, Fornai et al.

2006, Ye et al. 2006), für die selektive Inhibierung der COX-2 überwiegend NS-398 aus der

Gruppe der NSAR (Futaki et al. 1994, Rebsamen et al. 2003, Uemura et al. 2007) und

Lumiracoxib aus der jüngsten Generation der COX-2-Inhibitoren der NSAR (Tacconelli et al.

2004, Esser et al. 2005).

Die Aktivität der verschiedenen Prostaglandin-Rezeptoren kann in „vitro“ durch eine Reihe

an Antagonisten und Agonisten beeinflusst werden. Die chemische Struktur der Antagonisten

wurde aus der Struktur der jeweiligen „natürlichen Agonisten“ (endogene Agonisten), d.h. der

Prostaglandine oder Thromboxane der jeweiligen Subklassen abgeleitet. Aufgrund der

strukturellen Ähnlichkeit der Rezeptoren für die einzelnen Subklassen zeigen eine Reihe an

Antagonisten inhibierende Effekte auf mehrere Prostaglandin-Rezeptoren. Starke

Überlappungen der antagonistischen Effekte zeigen sich aus demselben Grund zudem bei der

pharmakologischen Beeinflussung der verschiedenen Subtypen der Prostaglandin D- und

Prostaglandin E-Rezeptoren. Für einzelne Antagonisten konnten außerdem pharmakologische

Unterschiede je nach Spezies nachgewiesen werden. Die DP- bzw. EP-Rezeptor-Antagonisten

BW A868C, BAY-u3405 und AH 6809 sind gute Beispiele für die Überlappung der

antagonistischen Wirkung bezüglich der Subklassen und teilweise auch für speziesabhängige

Effekte. BW A868C antagonisiert sowohl DP1- und DP2-Rezeptoren, BAY-u3405 inhibiert

nur den DP2-Subtyp und ist außerdem ein schwacher Antagonist für TP-Rezeptoren in

Mensch, Meerschweinchen und Ratte (Giles et al. 1989, Trist et al. 1989, McKennif et al.

1991, Sugimoto et al. 2003, Shiraishi et al. 2005). AH 6809 antagonisiert in Maus und Ratte

mit vergleichbarer Selektivität DP1-, EP1- und EP2-Rezeptoren, in humanen Zellen außerdem

EP3-Rezeptoren (Coleman et al. 1985, Keery und Lumley 1988, Woodward et al. 1995,

Abramovitz et al. 2000, Mendez und LaPointe 2002). Die Antagonisten SC 19220 und

AH 23848 beeinflussen ebenfalls die Aktivität von EP-Rezeptoren, sind hochselektiv für

einen EP-Rezeptor-Subtyp und reagieren speziesunabhängig. Bei SC 19220 handelt es sich

um ein Dibenzoxazepin, das selektiv den EP1-Rezeptor inhibiert (Zeng et al. 1996, Jelson et

1 Einleitung

23

al. 2003). AH 23848 inihibiert in allen getesteten Spezies den EP4-Rezeptor (Coleman et al.

1997, Davis und Sharif 2000, Waleh et al. 2004).

Die IP- bzw. TP-Rezeptor-Antagonisten CAY 10441 und SQ 29,548 zeigen ebenfalls keine

Kreuzreaktionen mit anderen Rezeptortypen. CAY 10441 ist einer der stärker affinen

Antagonisten aus einer Reihe an neueren Substanzen, die den IP-Rezeptor hemmen.

CAY 10441 wurde von Clark et al. als Antagonist für den humanen IP-Rezeptor entdeckt

(Clark et al. 2004) und wird mittlerweile als IP-Antagonist auch in Zellen der Maus und der

Ratte eingesetzt (Yamada et al. 2008, Yamada und Yoshikawa 2008). SQ 29,548 ist

hochselektiv für den TP-Rezeptor und zeigte in Studien von Ogletree und Allen die stärkste

antagonistische Wirkung auf TP-Rezeptoren aus der Ratte im Vergleich zu TP-Rezeptoren

aus Mensch und Meerschweinchen (Ogletree und Allen 1992, Dogan et al. 1997, Abramovitz

et al. 2000).

1.5. Kalium(ATP)-Kanäle

Kalium(ATP)-Kanälen schreibt man nach myokardialer Ischämie eine zentrale Rolle bei der

Vermittlung des negativ-inotropen und kardioprotektiven Effekts auf myokardiales Gewebe

zu (siehe Abschnitt 1.2.5.). Im Folgenden werden die strukturellen, funktionellen und

pharmakologischen Eigenschaften der Kanäle dargestellt.

1.5.1. Struktur und Funktionsweise von Kalium(ATP)-Kanälen

Es gibt verschiedene Kalium(ATP)-Kanäle, die sich voneinander molekularbiologisch

unterscheiden. Prinzipiell setzt sich ein Kanal zusammen aus der porenbildenden Untereinheit

Kir 6.1 oder Kir 6.2 („Kalium-inward-rectifier“, Kir) und dem Regulatorprotein, dem

Sulfonylharnstoffrezeptor („sulfonylurea receptor“, SUR). Bis heute sind die drei

Regulatorproteine SUR1 bzw. SUR2A und SUR2B bekannt, die mit Kir 6.1 oder Kir 6.2 die

unterschiedlichen Typen der Kalium(ATP)-Kanäle bilden (Kleinig 1997). Generell kommen

die Untereinheiten Kir 6.1 und SUR2B in den meisten Geweben vor, wohingegen die Kir 6.2

und SUR1 bzw. SUR2A Gewebe-spezifisch exprimiert werden. Herz und Skelettmuskel

exprimieren vor allem die sarkolemmalen Kanäle SUR2A/Kir 6.2, die glatte Muskulatur der

Gefäße den Typ SUR2B/Kir 6.1 und die pankreatischen ß-Zellen sowie Neuronen Rezeptoren

1 Einleitung

24

der Struktur SUR1/Kir 6.2 (Inagaki et al. 1995, Aguilar-Bryan et al. 1998, Fujita und Kurachi

2000).

Kalium(ATP)-Kanäle werden ATP-abhängig reguliert. Abb.1.8. zeigt schematisch die

Kalium(ATP)-Kanäle SUR2A/Kir 6.2 und die Vorgänge an der Plasmamembran unter

normoxischen und hypoxischen Bedingungen. Ist in der Zelle ausreichend ATP vorhanden

(z.B. unter normoxischen Bedingungen), sind Kalium(ATP)-Kanäle überwiegend

geschlossen. Im geschlossenen Zustand bindet ATP an Kir 6.2. Eine Depolarisation ist

möglich, wodurch spannungsabhängige Calciumkanäle geöffnet werden. Sinkt der

intrazelluläre ATP-Spiegel (z.B. unter hypoxischen Bedingungen), öffnen sich die

Kaliumkanäle und positiv geladene Kaliumionen strömen aus der Zelle, was die Ladung des

Zellinneren reduziert. Diese Negativität reduziert die Möglichkeit einer plötzlichen und

anhaltenden Depolarisation (Gögelein et al. 1999).

Abb.1.8. Schematische Darstellung der Funktionsweise von Kalium(ATP)-Kanälen unter normoxischen (A.) und hypoxischen (B.) Bedingungen am Beispiel von SUR2A/Kir 6.2 -Kanälen (nach Gögelein et al. 1999). Die Aktivität der Kanäle wird über den ATP-Spiegel in der Zelle geregelt. Normoxische ATP-Konzentrationen halten den Kanal durch direkte Bindung von ATP an Kir 6.2 geschlossen; sinkt der ATP-Spiegel, öffnen sich die Kanäle.

A. normoxische Bedingungen B. hypoxische bzw. ischämische Bedingungen

K

K

K+

K

K

K+

wenig ATP

SUR 2A

Kir 6.2.

ATP

K+

K

K

K+ K

ausreichend ATP

Kir 6.2. SUR 2A

ATP ATP

ATP ATP ATP

ATP

ATP

ATP

ATP

ATP

ATP

1 Einleitung

25

Kalium(ATP)-Kanäle konnten in der Plasmamembran und in der inneren

Mitochodrienmembran nachgewiesen werden. Traditionell ging man davon aus, dass die

innere Mitochondrienmembran relativ undurchlässig ist für Ionen. Die Empfindlichkeit

gegenüber Kalium(ATP)-Kanal-Öffnern und -Schließern führte zu der Annahme, dass

Kalium(ATP)-Kanäle gleich denen der Zelloberfläche auf der inneren

Mitochondrienmembran existieren (O’Rourke 2000 und 2007). Später konnten durch Inoue et

al. aus der Rattenleber und dem Rinderherzen mitochondriale Kalium(ATP)-Kanäle isoliert

werden. Der mitochondriale Kalium(ATP)-Kanal wurde durch eine ATP-Konzentration von

100 µmol/l geschlossen gehalten und blockiert durch Glibenclamid und 4-Aminipyridin

(Inoue et al. 1991). Die Struktur der mitochondrialen Kanäle ist bis heute noch nicht

abschließend aufgeklärt. Kir 6.1/Kir 6.2 und SUR2A sind mögliche Untereinheiten (Hu et al.

1999, Singh et al. 2003).

1.5.2. Pharmakologie von Kalium(ATP)-Kanälen

Glibenclamid ist der in „vitro“ am häufigsten eingesetzte Kalium(ATP)-Kanal-Blocker. Als

Sulfonylharnstoffderivat hemmt Glibenclamid sarkolemmale und mitochondriale

Kalium(ATP)-Kanäle. Glibenclamid wird therapeutisch unter anderem als Antidiabetikum

eingesetzt, das die Insulinfreisetzung aus den pankreatischen ß-Zellen hemmt (Couston 2007,

Moore 2007, Slingerland et al. 2008).

HMR-1098 inhibiert selektiv in myokardialem Gewebe die sarkolemalen Kalium(ATP)-

Kanäle. Es handelt sich wie bei Glibenclamid um eine Substanz aus der Gruppe der

Sulfonylthioharnstoffe (Das et al. 2006, Zhang et al. 2007, Pu et al. 2008). Grundlage zur

Entwicklung von HMR-1098 durch die Hoechst AG war der Bedarf nach einem neuen

Antiarrythmikum, das ventrikuläre Rhythmusstörungen unterbindet. Wenn durch eine

myokardiale Ischämie extrazellulär die Konzentration an Kalium ansteigt und dieser Anstieg

ventrikuläre Rhythmusstörungen auslöst, können Pharmaka, die die Akkumulation von

Kalium vermindern, den ventrikulären Rhythmusstörungen entgegenwirken. Für

Glibenclamid konnte bereits vor der Entwicklung von HMR-1098 ein solcher Effekt an

isolierten Rattenherzen gezeigt werden (Bril et al. 1992, Tosaki et al. 1993, Billman et al.

1998).

1 Einleitung

26

HMR-1098 ist das Natriumsalz von HMR-1883, einem aus Glibenclamid entwickelten

Kalium(ATP)-Kanal-Blocker. Als Inhibitor der mitochondrialen Kalium(ATP)-Kanäle wird

überwiegend 5-Hydroxydekanoat (5-HD) eingesetzt (Das et al. 2006, Gok et al. 2006,

Steensrud et al. 2006).

Kalium(ATP)-Kanäle werden durch Substanzen unterschiedlicher Substanzklassen geöffnet.

Als effektive Öffner wirken z.B. Diazoxid, Minoxidisulfat, Pinacidil und das

Benzopyranderivat Cromakalim. Diazoxid zeigt hohe Affinität zu pankreatischen, vaskulären

und mitochondrialen Kalium(ATP)-Kanälen und nur schwache Affinität zu sarkolemmalen

Kanälen (Hu et al. 1999, Pasdois et al. 2008, Sunouchi et al. 2008). Pinacidil und Cromakalim

aktivieren sarkolemmale und mitochondriale Kalium(ATP)-Kanäle (Yanagisawa et al. 1988,

Lau 1992). Die Öffner wurden zunächst gegen Bluthochdruck entwickelt und später auch

gegen Angina pectoris, myokardiale Ischämie, Asthma, Hyperaktivität der Harnblase und

Haarausfall eingesetzt (Coghlan et al. 2001).

Die verschiedenen Kanaltypen zeigen ebenfalls pharmakologische Unterschiede. Der

SUR1/Kir 6.2 wird durch den Kanalöffner Diazoxid aktiviert und durch Glibenclamid

blockiert (Hansen 2006). SUR2A/Kir 6.2 wird ebenfalls durch Glibenclamid blockiert, lässt

sich allerdings durch Diazoxid nicht aktivieren (Hu et al. 1999, Hansen 2006, Tricarico et al.

2008). Als Aktivatoren von SUR2A/Kir 6.2 wirken Pinacidil und Cromakalim (Reimann et al.

2000, Tricarico et al. 2008). SUR2B/Kir 6.2 kann durch Diazoxid und Pinacidil aktiviert und

ebenfalls durch Glibenclamid blockiert werden (Reimann et al. 2000, Tricarico et al. 2008).

Im Vergleich zu SUR1/Kir 6.2, der bei niedrigen Konzentrationen an Glibenclamid gehemmt

wird, sind SUR2A/Kir 6.2 und SUR2B/Kir 6.2 unempfindlicher gegenüber Glibenclamid

(Hambrock et al. 2002).

2 Fragestellung

27

2 Fragestellung

Eine große Bedeutung in der kardiologischen Forschung hat die Identifizierung von

Substanzen und Signalwegen im post-ischämischen Herzen, die nach einer myokardialen

Ischämie während der Reperfusion die Herzfunktion beeinflussen. Ziel der vorliegenden

Arbeit war es zu analysieren, über welche Signaltransduktionswege kardiodepressive

Faktor(en), die post-ischämisch während der Reperfusion freigesetzt werden, ihren negativ-

inotropen Effekt auf isolierte Kardiomyozyten aus der Ratte vermitteln. Zur Gewinnung

dieser Faktor(en) wurden isolierte Herzen von adulten Ratten einer 10-minütigen

Totalischämie (absoluten Ischämie) ausgesetzt und in den ersten 30 Sekunden der

Reperfusion das Koronareffluat („Ausfluss aus Koronarien (Herzkranzgefäße)“) gesammelt.

Der negativ-inotrope Effekt dieses post-ischämischen Koronareffluates wurde zunächst von

Felix et al. an isolierten Meerschweinchenherzen im Doppelherzmodell gezeigt (Felix et al.

1997). Die vorliegende Arbeit sollte einen Beitrag zu dem übergeordneten Ziel leisten, die

negativ-inotropen Mediator(en) aus dem post-ischämischen Koronareffluat zu identifizieren.

Felix et al. führten verschiedene Untersuchungen zur Charakterisierung der Mediator(en) des

post-ischämischen Effluates durch. Für diese Experimente wurde das Doppelherzmodell

verwendet, wo das Effluat aus Herz I nach einer 10-minütigen Totalischämie (absoluten

Ischämie) in Serienschaltung auf Herz II geleitet wurde und infolgedessen ein Abfall des

linksventrikulären Drucks und des Perfusionsdrucks der Koronararterien in Herz II detektiert

werden konnte. Eine Vermittlung des Effekts durch freie Sauerstoffradikale, NO oder

Adenosin, also durch ischämische Faktoren, für die eine vermehrte Bildung im post-

ischämischen Myokard und eine Modulation der Herzfunktion während der Reperfusion

vielfach gezeigt wurde, konnte ausgeschlossen werden. Außerdem konnte aus weiteren

Experimenten bezüglich der chemischen Struktur der kardiodepressiven Mediator(en) im

post-ischämischen Effluat die Schlussfolgerung gemacht werden, dass die Effekte nicht durch

Proteine, z.B. durch Cytokine, die ebenfalls die Herzfunktion post-ischämisch beeinflussen

(Staudt et al. 2002, Duncan et al. 2007, El-Ani et al. 2007), sondern vielmehr durch

niedermolekulare, hitzestabile Substanzen vermittelt werden (Felix et al. 1997).

Felix et al. konnten ferner einen negativ-inotropen Effekt des post-ischämischen Effluates auf

isolierte adulte Rattenkardiomyozyten nachweisen. Das post-ischämische Effluat reduzierte

den Calciumtransienten (von „transire“ - hinübergehen; Änderung der cytosolischen

2 Fragestellung

28

Calciumkonzentration durch Entleerung der Calciumspeicher der Zelle zur Auslösung der

Kontraktion) und dadurch bedingt die Kontraktilität der Kardiomyozyten. Dieser Effekt, der

mittels Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen wurde, war reversibel, d.h. auswaschbar, und

abhängig von der Konzentration der Effluate. Die Autoren konnten außerdem mit Hilfe der

„Patch-Clamp“-Technik zeigen, dass durch das post-ischämische Effluat der Calciumstrom an

den L-Typ-Calciumkanälen reduziert wird (Felix et al. 2001).

Bislang konnten die negativ-inotrope(n) Verbindung(en) aus dem post-ischämischen Effluat

nicht identifiziert und auch nicht die Frage geklärt werden, wie viele verschiedene Mediatoren

das post-ischämische Effluat enthält, die die Kontraktilität und den Calciumtransienten der

Kardiomyozyten beeinflussen. Die vorliegende Arbeit sollte durch Analyse der

Signaltransduktionsmechanismen von post-ischämischem Effluat Hinweise auf die Identität

der kardiodepressiv(en) Mediator(en) liefern. Jüngere Forschungsergebnisse unserer

Arbeitsgruppe führten zu der Vermutung, dass der negativ-inotrope Effekt des post-

ischämischen Effluates über Substanz(en) vermittelt wird, die aus dem Arachidonsäure-

Stoffwechsel stammen. So konnte unsere Gruppe zeigen, dass der negativ-inotrope Effekt des

Effluates aus mit Phospholipase A2–Inhibitoren vorbehandelten Rattenherzen auf die

isolierten Kardiomyozyten deutlich schwächer ist als von Effluat aus unbehandelten Herzen.

Dieses Ergebnis ließ vermuten, dass das post-ischämische Effluat verschiedene Substanzen

enthält, die durch die Aktivität der Phospholipase A2 freigesetzt werden und daher

möglicherweise Substrate sind für die Cyclooxygenase. Wie in Abschnitt 1.2.4. erläutert

wurde, werden nach Ischämie verstärkt Substanzen aus dem Arachidonsäure-Stoffwechsel

wie z.B. Prostaglandine gebildet, und ihre Rezeptoren, vor allem Rezeptoren für

Prostaglandin E, zeigen in der post-ischämischen Reperfusionsphase kardioprotektive Effekte

(Schrör 1987, Hohlfeld et al. 2000, Xiao et al. 2004, Martin et al. 2005). Für einzelne

Prostaglandine sind negativ-inotrope Effekte auf Kardiomyozyten belegt (Auclair et al. 1988,

Oriji 2000, Klein et al. 2004). Ausgangspunkt für die Analyse der Signaltransduktion der

kardiodepressiven Mediatoren im post-ischämischen Effluat war daher der Arachidonsäure-

Stoffwechsel. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich zum einen mit den folgenden

Fragestellungen:

� Charakterisierung der Effekte von post-ischämischem Effluat auf Kontraktilität und

Calciumtransient von isolierten adulten Kardiomyozyten

� Erstellen einer Dosiswirkungskurve

2 Fragestellung

29

� Langzeitwirkung von post-ischämischem Effluat

� Einfluss von �-adrenerger Stimulation auf die Wirkung von post-ischämischem Effluat

� Effekt von post-ischämischem Effluat auf Schlagfrequenz und Calciumtransient von

isolierten neonatalen Kardiomyozyten

� Rolle des Arachidonsäure-/Prostaglandin-Stoffwechsels in der Signaltransduktion von post-

ischämischem Effluat

� Metabolismus von post-ischämischem Effluat in adulten Kardiomyozyten: Rolle der

Cyclooxygenasen COX-1 und COX-2 in der negativ-inotropen Signaltransduktion von post-

ischämischem Effluat in adulten Kardiomyozyten

� Metabolismus von post-ischämischem Effluat in neonatalen Kardiomyozyten: Rolle

der Cyclooxygenasen COX-1 und COX-2 in der Signaltransduktion von post-ischämischem

Effluat in neonatalen Kardiomyozyten

� Rolle von Prostaglandin-Rezeptoren in der negativ-inotropen Signaltransduktion von

post-ischämischem Effluat in adulten Kardiomyozyten

� Effekte und Signaltransduktion von möglichen Stoffwechselintermediaten aus dem

Prostaglandin-Stoffwechsel auf adulte Kardiomyozyten

Ein negativ-inotroper Effekt auf myokardiales Gewebe wird überwiegend als kardioprotektiv

verstanden. Die Vorstellung dabei ist, dass die negativ-inotrope Wirkung zu einer Reduktion

der Herztätigkeit führt und diese Reduktion eine „Anpassung“ an post-ischämische

Bedingungen bedeutet. Die negativ-inotrope Wirkung von post-ischämischem Effluat war

daher ein wichtiger Hinweis auf eine kardioprotektive Funktion der post-ischämisch

freigesetzten Substanzen im Effluat. Wie in Abschnitt 1.2.5. dargestellt wurde, spielen

Kalium(ATP)-Kanäle eine protektive Rolle nach myokardialer Ischämie. Eine Öffnung von

sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen zieht einen negativ-inotropen Effekt nach sich. Um die

Substanzen im post-ischämischen Effluat funktionell zu charakterisieren, standen daher

außerdem die folgenden Fragestellungen im Vordergrund:

� Kardioprotektion durch post-ischämisches Effluat

� Wirkung von post-ischämischem Effluat auf Kardiomyozyten bei Überladung mit

Calcium

� Rolle von Kalium(ATP)-Kanälen in der Vermittlung des negativ-inotropen Effekts

von post-ischämischem Effluat

3 Material

30

3 Material

3.1. Versuchstiere

Für die Isolation von adulten Kardiomyozyten und die Gewinnung von post-ischämischem

und nicht-ischämischem Effluat wurden weibliche Albino-Ratten des Wistar-Stammes der

Firma Harlan, Borchen, BRD verwendet. Zum Zeitpunkt der Herzentnahme hatten die Tiere

ein Alter von 49-56 Tagen und ein Gewicht von 180-200 g. Die neugeborenen Ratten waren

Nachkommen von weiblichen und männlichen Albino-Ratten des Wistar-Stammes der Firma

Harlan. Die Tiere waren zum Zeitpunkt der Herzentnahme 2-4 Tage alt und wogen 50-60 g.

3.2. Chemikalien, Enzyme, Zellkulturmedien, Kits und weitere Reagenzien

Acrylamid/N,N`-Methylenbisacrylamid-

Lösung (29:1)……………………………………...

Serva Elektrophoresis, Heidelberg, BRD

2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol

(TRIS)……………………………………………...

Merck, Darmstadt, BRD

Ammoniumperoxodisulfat (APS)…………………. Carl Roth, Karlsruhe, BRD

Aqua dest. (steril)…………………………………. Labor

Aqua dest………………………………………….. Labor

AraC (1-(�-D-Arabino-furanosyl)-cytosin-

hydrochlorid)……………………………………....

Sigma, Deisenhofen, BRD

BCA (Bicinchoninic Acid)-Protein-Assay-Kit…… Pierce Biotechnology, USA

Bovines Serumalbumin (BSA)……………………. Merck, Darmstadt, BRD

Calciumchlorid (CaCl2)…………………………… Merck, Darmstadt, BRD

Chlorwasserstoffsäure (HCl)……………………… Merck, Darmstadt, BRD

Coomassie Blue R-250……………………………. Santa Cruz Biotechnology, USA

Cyclic AMP Assay………………………………... R&D Systems, USA

DAPI (4’,-6’-Diamidino-2-phenylindoldilactat)….. Sigma, Deisenhofen, BRD

Dimethylsulfoxid (DMSO)………………………... Merck, Darmstadt, BRD

Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)…………. Merck, Darmstadt, BRD

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)…... Invitrogen, Karlsruhe, BRD

3 Material

31

Entwickler-und Fixierlösung für Western Blot-

Filme………………………………………………

Kodak, USA

Ethanol (35%, zum Einlegen der Schläuche der

Peristaltikpumpen)…………………………………


Ethanol (70%, zur Desinfektion)………………….. Merck, Darmstadt, BRD

Ethanol (99,8%)…………………………………… Merck, Darmstadt, BRD

Fibronectin………………………………………… Biochrom, Berlin, BRD

Fötales Kälberserum (FKS)……………………….. Biochrom, Berlin, BRD

Fura-2-Acetoxymethylester (Fura-2AM)…………. Sigma, Deisenhofen, BRD

0,02%-ige Gelatine………………………………... Sigma, Deisenhofen, BRD

Glucose……………………………………………. Merck, Darmstadt, BRD

Glycin……………………………………………... Merck, Darmstadt, BRD

4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-

ethansolfonsäure (HEPES)………………………...


Immersionsöl (Immersol 518N)…………………... Carl Zeiss, Wetzlar, BRD

Isopropanol………………………………………... Sigma, Deisenhofen, BRD

Kaliumchlorid (KCl)……………………………… Merck, Darmstadt, BRD

Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)…………… Merck, Darmstadt, BRD

Kohlendioxid (CO2)………………………………. Praxair, USA

Kollagenase (collagenase type II)………………… Cell Systems, USA

Laminin…………………………………………… Harbor Bio-Products, USA oder Sigma,

Deisenhofen, BRD

Lipopolysaccharid (LPS)………………………….. Sigma, Deisenhofen, BRD

Lysepuffer (Kit aus RIPA-Puffer und den

Zusätzen “Protease-Inhibitor-Cocktail”,

Natriumorthovanadat, Phenylmethylsulfonyl-

fluorid (PMSF))……………………………………

Santa Cruz Biotechnology, USA

Magnesiumchlorid (MgCl2)………………………. Sigma, Deisenhofen, BRD

Magnesiumsulfat (MgSO4)……………………….. Merck, Darmstadt, BRD

Marker für Gelelektrophorese (BenchMarkTM

Pre-Stained Protein Ladder)……………………….

Invitrogen, Karlsruhe, BRD

Medium 199 (neonatale Kardiomyozyten)………... Invitrogen, Karlsruhe, BRD

Methanol…………………………………………... Merck, Darmstadt, BRD

3 Material

32

Milchpulver (Frema reform)……………………… Reformhaus

Mounting Medium………………………………… Sigma, Deisenhofen, BRD

Natriumchlorid (NaCl)……………………………. Merck, Darmstadt, BRD

Natriumdodecylsulfat (SDS)……………………… Merck, Darmstadt, BRD

Natriumhydroxid (NaOH)………………………… Merck, Darmstadt, BRD

New Born Calf Serum (NBCS)…………………… Invitrogen, Karlsruhe, BRD

Paraformaldehyd (PFA)…………………………... Merck, Darmstadt, BRD

Penicillin/Streptomycin…………………………… Biochrom, Berlin, BRD

physiologische (0,9%-ige-) NaCl-Lösung………… Carl Roth, Karlsruhe, BRD

Ponceau-S…………………………………………. Santa Cruz Biotechnology, USA

Probenpuffer für Gelelektrophorese

(Eletrophoresis Sample Buffer, 2x)………………..


Sauerstoff (O2)…………………………………….. Praxair, USA

(flüssiger) Stickstoff (N2)…………………………. Praxair, USA

Substratlösung für Membranfärbung

(Super Signal West Pico Substrate für

Western Blot)……………………………………...

Pierce Biotechnology, USA

N,N,N`,N´-Tetramethylethylendiamin,

1,2-Bis(dimethylamino)-ethan (TEMED)…………

Carl Roth, Karlsruhe, BRD

Thiopental………………………………………….

Triton-X100………………………………………..

Byk Gulden, Konstanz, BRD

ICN Biomedicals, Frankfurt am Main,

BRD

Trypanblaulösung (0,4%)…………………………. Sigma, Deisenhofen, BRD

Trypsin……………………………………………. Invitrogen, Karlsruhe, BRD

Trypsin/EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)…... Invitrogen, Karlsruhe, BRD

Tween 20 (Polyoxyethylen-Sorbitanmonolaureat).. Carl Roth, Karlsruhe, BRD

3.3. Puffer

Tabelle 3.1. fasst die Puffer zusammen, die für die Gewinnung der post- und nicht-

ischämischen Effluate, für die Kardiomyozytenisolation und für die Messung von

Kontraktilität und Calciumtransient verwendet wurden. Die Puffer wurden vor der

Anwendung steril-filtriert.

3 Material

33

Substanz Konzentration

in mmol/l

Lösungsmittel pH-Wert Anwendung

Krebs-Henseleit-Lösung (KH-Puffer)

CaCl2 1,3

Glucose 10

HEPES 7

KCl 2,6

KH2PO4 1,2

MgSO4 1,2

NaCl 116

NaHCO3 25

Aqua dest. 7,4 Perfusion von

Langendorffherzen zur

Effluatgewinnung; regt

isoliertes Herz zu

Kontraktionen an

Isolierpuffer

Glucose 11

HEPES 25

KCl 2,6

KH2PO4 1,2

MgSO4 1,2

NaCl 110

Aqua dest. 7,4 Perfusion von

Langendorffherzen zur

Isolation von adulten

Rattenkardiomyozyten

Versuchspuffer

CaCl2 1,2

Glucose 20

HEPES 10

KCl 2,8

KH2PO4 1,2

MgCl2 0,6

NaCl 117

Aqua dest. 7,3 Durchführung der

Messung von

Kontraktilität/

Calciumtransient

Tabelle 3.1. Übersicht über die Puffer, die für die Perfusion der Langendorff-Herzen und zur Durchführung der fluoreszenzmikroskopischen Messungen verwendet wurden.

Tabelle 3.2. fasst weitere verwendete Puffer zusammen. Alle in der vorliegenden Arbeit

verwendeten Puffer wurden bei 2-4°C gelagert.

3 Material

34

Substanz Konzentration

in mol/l

Lösungsmittel pH-Wert Anwendung

PBS (Phosphate Buffered Saline)

KCl 0,005

KH2PO4 0,0004

NaCl 0,094

Na2HPO4 0,0004

Aqua dest. 7,4 Isolation von neonatalen

Kardiomyozyten;

Zellkultur;

Immunfluoreszenzfärbung

TBS (Tris Buffered Saline, 10x)

NaCl 1,4

TRIS 0,2

Aqua dest. 7,6 Western Blot

Gelelektrophorese-Puffer („Lauf-Puffer“,10x)

Glycin 1,9

SDS 0,04

TRIS 0,25

Aqua dest. 8,3 Gelelektrophorese

Transfer-Puffer (10x)

Glycin 1,9

TRIS 0,25

Aqua dest. 8,3 Transfer der Proteine von

Gel auf Membran

Tabelle 3.2. Übersicht über weitere Puffer, die in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden.

3.4. Enzyminhibitoren

Tabelle 3.3. fasst die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Inhibitoren für die

Cycloxygenase (COX) und ihre Isoformen (COX-1 bzw. COX-2) bzw. die Proteinkinase A

und C (PKA bzw. PKC), ihre Löslichkeit, Selektivität, experimentelle Konzentration und

Inkubationszeit (Zeit zur Vorbehandlung der Kardiomyozyten) zusammen. Für alle

Inhibitoren wurde zunächst in organischen Lösungsmitteln oder Aqua dest. eine Stammlösung

hergestellt, die für die Vorbehandlung der adulten Kardiomyozyten mit Versuchspuffer bzw.

zur Vorinkubation der neonatalen Kardiomyozyten mit Kulturmedium so verdünnt wurde,

dass das organische Lösungsmittel bzw. Aqua dest. mindestens 1:1000 verdünnt war.

3 Material

35

Tabelle 3.3. Zusammenfassung der eingesetzten Enzyminhibitoren. Die experimentellen Konzentrationen und die Inkubationszeiten wurden aus vergleichbaren Anwendungen ermittelt (Laneuville et al. 1994, Kerkhof et al. 2002, Coetzee et al. 2005 (Indomethacin); Smith et al. 1998, Ye et al. 2006 (SC-560); Futaki et al. 1994, Uemura et al. 2007 (NS-398); Tacconelli et al. 2004, Esser et al. 2005, Klein et al. 2007 (Lumiracoxib); Staudt et al. 2001 (Rp-cAMPS); Eichholtz et al. 1993 (Myr-PKC[19-27])).

3.5. Rezeptorantagonisten

Tabelle 3.4. fasst die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Antagonisten für die

verschiedenen Prostaglandin-Rezeptoren und die Kalium(ATP)-Kanäle, ihre

Anwendungskonzentration und Inkubationszeit zusammen. Für alle Antagonisten wurde

entsprechend der Vorgehensweise bei den Enzyminhibitoren in organischen Lösungsmitteln

(DMSO/Ethanol) oder Aqua dest. eine Stammlösung hergestellt, die für die Vorbehandlung

der adulten Kardiomyozyten mit Versuchspuffer verdünnt wurde.

Bezeichnung IUPAC-Name Löslichkeit/ Lagerung (in Lösung)

im Versuch (Konz./ Inkubation)

Selektivität Firma

Hemmen von Cyclooxygenasen Indomethacin 1-(4-Chlorobenzoyl)-5-

methoxy-2-methyl-3-indolessigsäure

1g in 50 ml Ethanol/ 2-4°C

5 µmol/l 15 min

COX-1/ COX-2

Sigma-Aldrich, USA

SC-560 5-(4-Chlorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-3-trifluoromethyl-pyrazol

30 mg in 1 ml DMSO/2-4°C

0,25 µmol/l 15 min

COX-1 Sigma-Aldrich, USA

NS-398 N-[2-(Cyclohexyloxy)-4-nitrophenyl]-methansulfonamid

5 mg in 1 ml DMSO/2-4°C

0,25 µmol/l 15 min

COX-2 Sigma-Aldrich, USA

Lumiracoxib 2-((2-Chlor-6-fluor-phenyl)amino)-5-methyl-phenylessigsäure

10 mg in 3 ml Ethanol/2-4°C

0,1 µmol/l 15 min

COX-2 Novartis, CH

Hemmen von Proteinkinasen Rp-cAMPS Rp-Adenosin-3’,5’-zyklisches

monophosphoro-thioat-triethylamin-Salz

25 mg in 1 ml H2O/ -20°C

100 µmol/l 30 min

PKA Biomol, Hamburg, BRD

Myr-PKC[19-27]

Myristoyl-Phe-Ala-Arg-Lys-Gly-Ala-Leu-Arg-Gln

10 mg in 1 ml DMSO/-20°C

50 µmol/l 30 min

PKC Sigma-Aldrich, USA

3 Material

36

Tabelle 3.4. Zusammenfassung der eingesetzten Rezeptorantagonisten. Die experimentellen Konzentrationen und die Inkubationszeiten wurden aus vergleichbaren Anwendungen ermittelt (McKenniff et al. 1991, Sugimoto et al. 2003, Shiraihashi et al. 2005 (Bay-u3405); Giles et al. 1989, Trist et al. 1989 (BW A868C); Zeng et al. 1996, Jelson et al. 2003 (SC 19220); Coleman et al. 1985 und 1994, Abramovitz et al. 2000, Mendez und LaPointe 2002 (AH 6809); Coleman et al. 1997, Waleh et al. 2004 (AH 23848); Clark et al. 2004, Yamada et al. 2008, Yamada und Yoshikawa 2008 (CAY 10441); Ogletree und Allen 1992, Dogan et al. 1997 (SQ 29,548); Steensrud et al. 2006, Gok et al. 2006 (Glibenclamid); Das et al. 2006, Zhang et al. 2007, Pu et al. 2008 (HMR-1098); Plosker und Clissold 1992 (Metoprolol)).



Selektivität Firma

Blockieren von Prostaglandin-Rezeptoren BAY-u3405 3R-[[4-fluorophenyl)sulfonyl]

amino]-1,2,3,4-tetrahydro-9H-carbazol-9-propansäure

30 mg in 1ml DMSO/-20°C

1 µmol/l 10 min

DP2/TP-Rezeptor

Cayman Chemical, USA

BW A868C 3-[(2-Cyclohexyl-2-hydroxyethyl)amino]-2,5-dioxo-1-(phenylmethyl)-4-imidazolidin-heptansäure


1 µmol/l 10 min

DP1/DP2-Rezeptor

Sigma-Aldrich, USA

SC 19220 8-Chloro-dibenzyl[b,f][1,4]oxazepin-10(11H)carboxy-(2-acetyl) hydrazid


1 µmol/l 10 min

EP1-Rezeptor Sigma-Aldrich, USA

AH 6809 6-Isopropoxy-9-oxoxanthen-2-carboxylsäure

2,5 mg in 1ml Ethanol/-20°C

5 µmol/l 7 min

DP1/EP1/EP2-Rezeptor; EP3-Rezeptor (human)

Sigma-Aldrich, USA

AH 23848 (4Z)-7-[(rel-1S,2S,5R)-5-((1,1'-Biphenyl-4-yl)methoxy)-2-(4-morpholinyl)-3-oxocyclopentyl]- 4-heptansäure-hemicalciumsalz


5 µmol/l 7 min

EP4-Rezeptor Sigma-Aldrich, USA

CAY 10441 4,5-Dihydro-N-[4-[[4-(1-methylethoxy)phenyl]methyl] phenyl]-1H-imadazol-2-amin


1 µmol/l 10 min

IP-Rezeptor Cayman Chemical, USA

SQ 29,548 [1S-[1�,2�(Z),3�,4�]]-7-[3-[[2-[(Phenylamino)carbonyl] hydrazino]methyl]-7-oxabicyclo [2,2,1]hept-2-yl]-5-heptansäure

900 µg in 1ml Ethanol/-20°C

1 µmol/l 10 min

TP-Rezeptor Cayman Chemical

Blockieren von Kalium(ATP)-Kanälen Glibenclamid 5-Chloro-N-[4-(cyclohexylureido-

sulfonyl)phenethyl]-2-methoxybenzamid

2 mg in 1ml Ethanol/-20°C

1 µmol/l 5 min

mitochon./ sarkolem. Kalium(ATP)-Kanäle

Sigma-Aldrich, USA

HMR-1098 1-[[5-[2–(5–Chloro–o–anisamido)ethyl]–2-methoxyphenyl]-sulfonyl]- 3-methylthiourea

1 mg in 1ml Ethanol/ 2-4°C

5 µmol/l 5 min

sarkolem. Kalium(ATP)-Kanäle

Höchst, Frankfurt, BRD

Blockieren von �-adrenergen Rezeptoren Metoprolol (±)1-(Isopropylamino)-3-[p-(�-

methoxyethyl)phenoxy]-2-propanol-tartrat-Salz

50 mg in 1 ml H2O/-20°C

3 µmol/l 5 min

�-adrenerge Rezeptoren

Sigma-Aldrich, USA

3 Material

37

3.6. Rezeptoragonisten

Tabelle 3.5. gibt die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Rezeptoragonisten, ihre

Anwendungskonzentration und Inkubationszeit wieder. Für alle Agonisten wurde

entsprechend der Vorgehensweise bei den Enzyminhibitoren bzw. Rezeptorantagonisten in

organischen Lösungsmitteln (DMSO/Ethanol) eine Stammlösung hergestellt, die für die

Inkubation der adulten Kardiomyozyten mit Versuchspuffer verdünnt wurde.

Tabelle 3.5. Zusammenfassung der eingesetzten Rezeptoragonisten. Die experimentellen Konzentrationen und die Inkubationszeiten wurden aus vergleichbaren Anwendungen ermittelt (Hattori und Levi 1986 (Prostaglandin D2); Auclair et al. 1988, Orita et al. 1994, Oriji 2000, Tanaka et al. 2003, Klein et al. 2004, Shinmura et al. 2005 (Prostaglandin E2/I2); Yanagisawa et al. 1988, Lau 1992 (Cromakalim); Franciosa 1999 (Isoptoterenol).

3.7. Antikörper

Auf den folgenden Seiten sind die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Primärantikörper

und entsprechenden Kontrollen tabellarisch aufgeführt (Tabelle 3.6. und 3.7.). Als

Sekundärantikörper wurden im Western Blot die HRPO („Horse Radish Peroxidase“)-

markierten Antikörper anti-Kaninchen-IgG-, anti-Ziege-IgG- bzw. anti-Maus-IgG von Santa

Cruz Biotechnology, USA verwendet. Alle Sekundärantikörper für Western Blot wurden in



Selektivität Firma

Aktivieren von Prostaglandin-Rezeptoren Prostaglandin D2

9,15-Dihydroxy-11-oxo(5Z,9 �,13E,15S)-prosta-5,13-dien-1-carboxylsäure


100 µmol/l 7 min

DP-Rezeptoren


Prostaglandin E2

9-Oxo-11�,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-carboxylsäure


100 µmol/l 7 min

EP-Rezeptoren Cayman Chemical, USA

Prostaglandin I2

6,9�-Epoxy-11�,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-carboxylsäure


100 µmol/l 7 min

IP-Rezeptoren Cayman Chemical, USA

Aktivieren von Kalium (ATP)-Kanälen Cromakalim (±)-trans-6-Cyano-3,4-

dihydro-2,2-dimethyl-4-(2-oxopyrrolidin-1-yl)-2H-1-benzopyran-3-ol

20 mg in 2ml DMSO/2-4°C

100 µmol/l 7 min

mitochon./ sarkolem. Kalium(ATP)-Kanäle

Sigma-Aldrich, USA

Blockieren von �-adrenergen Rezeptoren Isoproterenol 4-[1-Hydroxy-2-(1-

methylethylamino) ethyl]benzene-1,2-diol

20 mg in 2ml DMSO/2-4°C

12,5 nmol/l 5 min

�-adrenerge Rezeptoren

Sigma-Aldrich, USA

3 Material

38

einer Konzentration von 0,1 µg/ml eingesetzt. Für Immunfluoreszenzfärbungen wurden die

Zellen mit anti-Kaninchen- bzw. anti-Maus-IgG-Antikörpern angefärbt, die mit Rhodamin

markiert waren. Alle Sekundärantikörper für Immunfluoreszenzfärbungen wurden in einer

Konzentration von 1 µg/ml eingesetzt und stammten von Santa Cruz Biotechnology, USA.

Tabelle 3.6. Übersicht über die in Western Blot (WB) und Immunfluoreszenzfärbungen (IF) verwendeten Antikörper.

Bezeichnung Antigen Isotyp Wirtsspezies im WB/IF eingesetzte Menge

Firma

Nachweis der Cyclooxygenase-Isoformen COX-1 Monoclonal Antibody

COX-1 IgG2b Maus 2,5 µg/ml (WB) Cayman Chemical, USA

Polyclonal Anti-COX-2

COX-2 IgG Ziege 0,5 µg/ml (WB) Upstate, USA

Polyclonal Anti-COX-2 (C-20)

COX-2 IgG Ziege 0,4 µg/ml (IF) Santa Cruz Biotechnology, USA

Nachweis der Prostaglandin-Rezeptoren DP1 Receptor Polyclonal Antibody

DP1-Rezeptor IgG Kaninchen

6 µg/ml (WB) Cayman Chemical, USA

DP2 Receptor Polyclonal Antibody

DP2-Rezeptor IgG Kaninchen

0,75 µg/ml (WB) Cayman Chemical, USA

EP1 Receptor Polyclonal Antibody

EP1-Rezeptor IgG Kaninchen 0,8 µg/ml (WB) Cayman Chemical, USA


EP2-Rezeptor IgG Kaninchen 1 µg/ml (WB/IF) Cayman Chemical, USA

Mouse monoclonal [3E6] to prostaglandin E receptor EP2

EP2-Rezeptor IgG Maus 1 µg/ml (IF) Abcam, USA


EP3-Rezeptor IgG Kaninchen 1 µg/ml (WB) Cayman Chemical, USA


EP4-Rezeptor IgG Kaninchen 0,7 µg/ml (WB/IF) Cayman Chemical, USA

FP Receptor Polyclonal Antibody

FP-Rezeptor IgG Kaninchen 2,5 µg/ml (WB) Cayman Chemical, USA

IP Receptor Polyclonal Antibody

IP-Rezeptor IgG Kaninchen


TP Receptor Polyclonal Antibody

TP-Rezeptor IgG Kaninchen


3 Material

39

Tabelle 3.7. Übersicht über die in Western Blot und Immunfluoreszenzfärbungen verwendeten Positiv- und Negativ-Kontrollen.

3.8. Geräte

Langendorff-Anlage

Auffangbecher (Quarzglas)……………………………………… Medizinisch-technische

Werkstätte, Berlin, BRD

Kanüle zum Aufhängen der Herzen……………………………...

oberes Reservoir (Quarzglas)…………………………………….

Universitätsapotheke Greifswald

Medizinisch-technische


Peristaltikpumpen………………………………………………... Ismatec, Wertheim-Mondfeld,

BRD

Bezeichnung Art der Kontrolle Antigen Firma RAW264.7-Lysat Gesamtzelllysat aus mit LPS-

stimulierten RAW264.7-Zellen (murine Makrophagen)

COX-2 DP1/DP2-Rezeptor EP1-4-Rezeptor IP-Rezeptor TP-Rezeptor


RSV (Ram Seminal Vesicle) microsomal immunoblot control

Protein aus Mikrosomenpräparationen von Samenzellen des Schafbocks in Probenpuffer (ready-to-use-control)

COX-1 EP3-Rezeptor FP-Rezeptor TP-Rezeptor


Murine macrophage microsomal immunoblot control

Protein aus Mikrosomenpräparation von murinen Makrophagen in Probenpuffer (ready-to-use-control)


COX-2 antibody blocking peptide

C-terminales Peptid: Antikörper blockierend

COX-2 Santa Cruz Biotechnology, USA

DP1 receptor blocking peptide


DP1-Rezeptor Cayman Chemical, USA

DP2 receptor blocking peptide

N-terminales Peptid: Antikörper blockierend

DP2-Rezeptor Cayman Chemical, USA

EP1 receptor blocking peptide


EP1-Rezeptor Cayman Chemical, USA










FP receptor blocking peptide N-terminales Peptid: Antikörper blockierend

FP-Rezeptor Cayman Chemical, USA

IP receptor blocking peptide C-terminales Peptid: Antikörper blockierend


TP receptor blocking peptide C-terminales Peptid: Antikörper blockierend

TP-Rezeptor Cayman Chemical, USA

3 Material

40

Thermostate…………………………………………………….... Julabo, Seelbach, BRD

Wendelsäule mit integrierter Blasenfalle (Quarzglas)…………… Medizinisch-technische


Anlage zur Bestimmung von Calciumtransient/Kontraktilität bei adulten und

Calciumtransient/Schlagfrequenz bei neonatalen Kardiomyozyten

elektrischer Stimulator (Myopacer) mit Elektrode………………. Ionoptix, USA

Filtersystem (Stepper Switch Light Source)……………………... Ionoptix, USA

Heizplatte (HT-200)……………………………………………... Minitüb, Tiefenbach, BRD

Interfacebox (Fluorescence System Interface)…………………... Ionoptix, USA

Kamera (Myocam)……………………………………………….. Ionoptix, USA

Mikroskop (DMIRB)…………………………………………….. Leica Microsystems, Wetzlar,

BRD

Photomultiplier…………………………………………………... Ionoptix, USA

Xenonlampe…………………………………………………….... Ushio, Japan

(Immunfluoreszenz-)Mikroskopie

Fuchs-Rosenthal-Kammer……………………………………….. Brand, Wertheim, BRD

Kamera (Axiocam)………………………………………………. Carl Zeiss, Jena, BRD

Mikroskop (DMLB)……………………………………………... Leica Microsystems, Wetzlar,

BRD

Neubauer-Zählkammer…………………………………………...

Brand, Wertheim, BRD

SDS-PAGE und Western Blot

Filmkassette……………………………………………………….

Gießvorrichtung für Gele (Ständer, Glasplatten, Kämme)……….

Kodak, USA

Biorad, München, BRD

Gel-Elektrophoresekammer…………………………………….... Biorad, München, BRD

Homogenisator…………………………………………………… IUL, Königswinter, BRD

Mörser……………………………………………………………. VWR, Wiesbaden, BRD

Photometer (GeneQuant)……………………………………….... Amersham Biosciences, UK

3 Material

41

Spannungsgerät…………………………………………………... Biorad, München, BRD

Transferkammer (Schwämme, Einsätze)………………………… Biorad, München, BRD

weitere Geräte

Anlage zur Herstellung von Aqua dest. (TKA-GenPure)………... TKA, Niederelbert, BRD

Autoklav (2340EV)…………………………………………….... Tuttnauer, NL

Brutschrank (BBD 6220)……………………………………….... Heraeus, Hanau, BRD

ELISA-Reader…………………………………………………… SLT Labinstruments, BRD

Feinwaage (Adventurer)…………………………………………. Ohaus, USA

Magnetrührer (MR 3000)………………………………………... Heidolph, Schwabach, BRD

pH-Meter (pH 100)………………………………………………. VWR, Darmstadt, BRD

Pipettierhilfen……………………………………………………. Gilson, UK

Eppendorff, Hamburg, BRD

Schwenktisch (Duomax 1030)………………………………….... Heidolph, Schwabach, BRD

Sterilbank (Hera Safe)………………………………………….... Heraeus, Hanau, BRD

Vortexer (Reax 2000)……………………………………………. Heidolph, Schwabach, BRD

Waage (440-33)………………………………………………….. Kern, Balingen, BRD

Wasserbad………………………………………………………... Memmert, Schwabach, BRD

Julabo, Seelbach, BRD

Zentrifugen (Rotina 46R, Mikro 200R)…………………………..

Hettich Zentrifugen, Tuttlingen,

BRD

3.9. Verbrauchsmaterialien

Zellkultur

Petrischalen………………………………………………………. Nunc, Wiesbaden, BRD

6-well-Platten…………………………………………………….. Nunc, Wiesbaden, BRD

Zellkulturflaschen………………………………………………... Nunc, Wiesbaden, BRD

Zellschaber……………………………………………………….. Nunc, Wiesbaden, BRD

3 Material

42

Mikroskopie

Deckgläschen…………………………………………………….. Menzel-Gläser, Braunschweig,

BRD

Objektträger…………………………………………………….... Menzel-Gläser, Braunschweig,

BRD

Versuchskammern für Fluoreszenzmikroskopie (2-Kammer-und

4-Kammer-System)………………………………………………

Nunc, Wiesbaden, BRD

Western Blot und sonstige Verbrauchsmaterialien

Eppendorffröhrchen (2 ml)……………………………………….

Falconröhrchen (50 ml)…………………………………………..

Filme für Western Blot (Hyperfilm)……………………………...

Eppendorff, Hamburg, BRD

Becton Dickinson, USA

Amersham Biosciences, UK

Klarsichtfolien für Western Blot…………………………………

Nitrocellulosemembran…………………………………………...

Pipetten…………………………………………………………...



Sarstedt, Nümbrecht, BRD

Pipettenspitzen………………………………………………….... Sarstedt, Nümbrecht, BRD

Sterilfilter…………………………………………………………. Sarstedt, Nümbrecht, BRD

weitere Röhrchen……………………………………………….... Sarstedt, Nümbrecht, BRD

Whatmann-Papier………………………………………………... Schleicher&Schuell, Dassel, BRD

3.10. Glaswaren

Bechergläser……………………………………………………... Merck, Darmstadt, BRD

Flaschen………………………………………………………….. Merck, Darmstadt, BRD

Schott, Mainz, BRD

Messzylinder……………………………………………………... Kartell, Italien

4 Methoden

43

4 Methoden

4.1. Tierexperimentelle Arbeiten nach Langendorff

4.1.1. Prinzip und Aufbau des Langendorff-Modells

Das Modell wurde 1895 von Oscar Langendorff zur Registrierung der kontraktilen Funktion

am isoliert schlagenden Herzen entwickelt. Das Prinzip besteht darin, eine zur Erhaltung der

Herztätigkeit geeignete, mit Sauerstoff angereicherte Lösung retrograd in die Aorta ascedens

(von linker Herzkammer aufsteigende Aorta) fließen zu lassen. Dabei schließt sich die

Aortenklappe und das Perfusat fließt anterograd durch die Koronararterien. Die

Koronararterien, die aus der Aorta abzweigen, versorgen den Herzmuskel mit Sauerstoff und

Nährstoffen. Der Abfluß des Perfusats ist über den Sinus coronarius (mündet in rechten

Vorhof, Verbindung zu Koronarvenen) und den eröffneten rechten Vorhof gewährleistet,

wobei die Herzhöhlen weitgehend leer bleiben. Die zur Perfusion isolierter Herzen

entworfene Apparatur wird als Langendorff-Anlage bezeichnet. Entsprechend des

Versuchsprotokolls und der verwendeten Tierspezies kommen verschiedene Varianten der

Anlage zur Anwendung.

In der vorliegenden Arbeit wurden die Isolation von Kardiomyozyten und die Gewinnung von

post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat aus adulten Rattenherzen an einer

Langendorff-Anlage nach Powell et al. durchgeführt (Powell et al. 1980). Abb. 4.1. zeigt den

Aufbau der verwendeten Anlage bestehend aus einem oberen Reservoir, einer ca. 90 cm

hohen Säule (Wassersäule) mit einer Wendel als Wärmetauscher und einem Auffangbecher.

Die isolierten Herzen sind über die Aorta, die über eine Kanüle zur Perfusion gestreift wird,

mit einem Faden an der Anlage befestigt. Die Kanüle steht über die Wassersäule mit dem

oberen Reservoir in Verbindung. Die Höhe der auf dem Herzen stehenden Säule bestimmt

den Perfusionsdruck. Die Perfusion mit salinen Lösungen führt auf Dauer zu einer

Ödembildung im Myokard und somit unter anderem zur langsam fortschreitenden Abnahme

der Kontraktionskraft (Millart et al. 1993). Aus diesem Grund sollte der Perfusionsdruck, der

von der verwendeten Tiergattung abhängt, so gering wie möglich eingestellt werden. Bei

Rattenherzen reichen 70-80 mmHg (1 mm Hg = Druck von 1 mm Quecksilbersäule; 1 mm Hg

= 0,00133 bar), weshalb in der vorliegenden Versuchsanordnung die Wassersäule eine

Gesamthöhe von 900 mm aufweist. In die Wendel der Wassersäule ist eine Blasenfalle

4 Methoden

44

integriert, die zur Vorbeugung von Luftembolien während der Perfusion der Kanüle

vorgeschaltet ist. Über die Pufferlösung im oberen Reservoir können dem Herzen Lösungen

verschiedener Substanzen zugeführt werden, wie z.B. eine Enzymlösung zur Isolation der

Kardiomyozyten. Das Reservoir verfügt außerdem über einen Anschluss zur Begasung mit

Carbogen (5% CO2, 95% O2). Unter dem aufgehängten Herzen befindet sich der

Auffangbecher, über dessen Ableitung der Perfusionskreislauf geschlossen werden kann und

Substanzen rezirkulieren können.

Abb.4.1. Übersicht über die verwendete Langendorff-Anlage nach Powell et al. 1980. Die Anlage wurde zur Isolation von adulten Kardiomyozyten und zur Gewinnung von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat aus adulten Rattenherzen eingesetzt.

gesc

hlos

sene

r K

reis

lauf

Begasung

Kanüle zum Aufhängen der Herzen

Peristaltikpumpe Z =Zulauf A =Ablauf

Wendelsäule mit integrierter Blasenfalle (Wassersäule)

oberes Reservoir

Auffangbecher

4 Methoden

45

Oberes Reservoir, Wassersäule und Auffangbecher verfügen jeweils über einen Zulauf und

einen Ablauf, die an Peristaltikpumpen und Thermostate angeschlossen sind. Durch diese

Anordnung werden konstante Flussbedingungen mit konstanter Flussgeschwindigkeit

geschaffen. Durch diese flusskonstanten Messbedingungen können in den Perfusatstrom

applizierte Substanzen genau dosiert und die Substratversorgung des Myokards genau

eingestellt werden. Außerdem wird auf diese Art und Weise eine konstante

Umgebungstemperatur von 37°C erzeugt. Um die Temperatur konstant zu halten, sind das

Auffanggefäß und das obere Reservoir zusätzlich mit Parafilm verschlossen. Der

Auffangbecher stellt damit eine Art „Klimakammer“ für das Herz dar.

4.1.2. Entnahme und Präparation von adulten Rattenherzen

Zur Organentnahme wurden die Ratten intraperitoneal mit Thiopental (50 mg/kg

Körpergewicht) betäubt. Das Fell der Tiere wurde mit 70%-igem Ethanol gereinigt, rasiert,

mit einer großen Pinzette angehoben und danach die Haut vom Processus Xyphoideus

(Fortsatz des Brustbeins) bis zum Hals mit einer Schere eingeschnitten und abpräpariert. Die

Eröffnung des Brustkorbes erfolgte zügig entlang des Sternums (Brustbein). Das Herz wurde

freigelegt, aus dem umgebenden Bindegewebe gelöst und sofort in kalte (4°C) physiologische

NaCl-Lösung transferiert. Das Herz schlug dabei kräftig und pumpte dadurch das Blut aus

den Ventrikeln. Die Herztätigkeit stoppte in der kalten NaCl-Lösung nach einigen Sekunden.

Anschließend wurde die Aorta freipräpariert.

4.1.3. Vorbereitung der Langendorff-Anlage

Vor Beginn des Experiments wurde die Anlage mit 2 l Aqua dest. gespült und anschließend

mit 50-70 ml Isolierpuffer (siehe Tabelle 3.1.) gewaschen. Für das Experiment wurde die

Anlage mit 75 ml Isolierpuffer befüllt, der mit Carbogen begast und auf 37°C erwärmt wurde.

4.1.4. Anschluss des Rattenherzens an der Langendorff-Anlage

Die Perfusion der Anlage wurde mit einem Tropfen pro Sekunde gestartet und das Herz an

der Anlage fixiert. Dies gewährleistete den Anschluss des Herzens unter sofortiger Zufuhr

von Nährstoffen und ausreichender Sauerstoffversorgung und verhinderte auch eine

Luftembolisation durch die Kanüle.

4 Methoden

46

Für den Anschluss des Herzens wurde das Lumen der Aorta soweit eröffnet, dass diese über

die Kanüle an der Anlage gestreift werden konnte. Dabei musste die Kanüle so zu liegen

kommen, dass die Gefäße des Aortenbogens verschlossen wurden, ohne die Koronararterien

zu verlegen oder die Aortenklappe zu penetrieren (Abb. 4.2.). Das Herz wurde mittels eines

Fadens in dieser Position fixiert und für 3 Minuten mit Isolierpuffer präperfundiert. In dieser

Phase der Präperfusion wurden noch vorhandene Blutbestandteile aus dem Herzen entfernt

und die extrazelluäre Calciumkonzentration gesenkt.

Abb.4.2. Das aufgehängte Langendorff-Herz (schematisch aus Bramlage 1999 (oben) und Fotografie (unten)). Das Herz wurde retrograd über die Aorta angeschlossen. Die Kanüle wurde so positioniert, dass die Gefäße des Aortenbogens verschlossen waren, die Koronararterien frei blieben und die Aortenklappe nicht penetriert wurde.

Aorta

Aortenbogen mit abzweigenden Gefäßen

Koronararterien

4 Methoden

47

4.1.5. Isolation von adulten, ventrikulären Kardiomyozyten

Die Isolation der Kardiomyozyten erfolgte enzymatisch, um die Muskelzellen aus dem

Gewebeverband zu lösen. Dazu wurde eine Kollagenaselösung (355 U/ml in Isolierpuffer mit

Zusatz von 30 µmolar CaCl2) in das obere Reservoir der Perfusionsapparatur gegeben und für

27 Minuten auf Rezirkulation umgestellt mit einer Tropfgeschwindigkeit von einem Tropfen

pro Sekunde. Eine homogene Färbung des Herzens deutete auf eine gleichmäßige Perfusion

des Gewebes hin. Im Anschluss wurde das Herz von der Anlage genommen und in eine

Petrischale mit 10 ml Kollagenaselösung gegeben. Mit einer feinen Schere wurden die

Vorhöfe an der Ventilebene entfernt und die Ventrikel mit zwei Skalpellen in ca. 1 mm3

große Stücke zerkleinert. Die entstandene Zellsuspension wurde in den Auffangbecher

gegeben, wo sie mit der restlichen Kollagenaselösung für 10 Minuten mit Carbogen begast

wurde. Das ermöglichte zum einen eine gute Sauerstoffversorgung, zum anderen wurde die

enzymatische Isolation durch die Verwirbelung mechanisch unterstützt. Anschließend wurde

die Suspension gefiltert (Nylonsieb mit Maschenweite von 200 µm) und in drei Schritten bei

43 rcf für 2 Minuten abzentrifugiert. Bei der Zentrifugation wurden die Kardiomyozyten von

anderen myokardialen Zellen getrennt; die Kardiomyozyten setzten sich ab, so dass der

Überstand verworfen werden konnte. Um die Zellen in calciumhaltiges Medium zu

überführen, wurde das Pellet in Puffer mit steigender Calciumkonzentration resuspendiert (1.

Schritt: Puffer mit 200 µmolar Calcium, 2. Schritt: Puffer mit 500 µmolar Calcium).

Die isolierten Kardiomyozyten wurden unter dem Mikroskop unter Zuhilfenahme einer

Fuchs-Rosenthal-Kammer bei 40x Vergrößerung gezählt und qualitativ beurteilt.

Kardiomyozyten gelten als intakt, wenn sie die für kardiale Muskelzellen typische längliche

Form haben („rod-shaped“), als nicht intakt bzw. durch die Isolation beschädigt gelten

abgerundete Zellen und Zelltrümmer. Die Anzahl der intakten Kardiomyozyten, die

Gesamtzellzahl an Kardiomyozyten und das Verhältnis der Anzahl intakter Zellen zur

Gesamtzellzahl wurden bestimmt. Durchschnittlich lag die Gesamtzellzahl pro Herz bei

3-4x106 Kardiomyozyten und der Anteil der intakten Muskelzellen bei ca. 70-90%.

4 Methoden

48

4.1.6. Gewinnung von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat aus adulten

Rattenherzen

Für die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimente wurde post-ischämisches

Effluat und nicht-ischämisches Effluat als Kontrolle aus adulten Rattenherzen gewonnen. Zur

Vorbereitung wurde der KH-Puffer (siehe Tabelle 3.1.), mit dem das Herz an der

Langendorff-Anlage perfundiert werden sollte, für 30 Minuten im oberen Reservoir der

Anlage mit Carbogen begast. Nach Anschluss an der Langendorff-Anlage (genauere

Ausführungen siehe Abschnitte 4.1.4.) wurde das Herz für 30 Minuten mit einer

Flussgeschwindigkeit von 10 ml pro Minute perfundiert. Durch den KH-Puffer wurde das

isolierte Herz zu regelmäßigen Kontraktionen angeregt. Innerhalb der letzten 30 Sekunden

dieser Perfusionsphase wurde das nicht-ischämische Effluat (ca. 5 ml) gesammelt. In

direktem Anschluss an die Perfusionsphase wurde das Herz für 10 Minuten in den Zustand

einer globalen Ischämie versetzt, indem die Perfusion an der Langendorff-Anlage

unterbrochen wurde („stop-flow“-Ischämie; Abb.4.3.). In den ersten 30 Sekunden der

folgenden Reperfusionsphase wurde das post-ischämische Effluat (ca. 5 ml) gewonnen.

Abb.4.3. Schematische Darstellung des perfundierten Langendorff-Herzens. Zur Gewinnung der Effluate wurde das Herz zunächst für 30 Minuten perfundiert und in den letzten 30 Sekunden dieser Perfusionsphase nicht-ischämisches Effluat (Kontrolle) gesammelt. Durch Unterbrechung der Perfusion wurde eine 10-minütige Totalischämie („stop-flow“-Ischämie) erzeugt. Nach diesen 10 Minuten wurde das Herz wieder perfundiert und in den ersten 30 Sekunden dieser Reperfusionsphase das post-ischämische Effluat gesammelt.

4 Methoden

49

4.2. Isolation und Kultivierung von neonatalen Kardiomyozyten

4.2.1. Entnahme und Präparation von neonatalen Rattenherzen

Zwei bis maximal vier Tage alte Ratten wurden mit Hilfe einer chirurgischen Klemme durch

Genickbruch getötet. Unter sterilen Bedingungen wurde das Herz zügig durch Sternotomie

(Längsdurchtrennung des Brustbeins) freigelegt und aus dem Situs isoliert. Die Herzen von

mindestens fünf Ratten wurden in PBS/PBS-Antibiotikum (1:1-Lösung aus sterilem PBS und

PBS-Antibiotikum (Penicillin/Streptomycin, 1:100 in sterilem PBS)) gesammelt, gewaschen

und schließlich in einer Petrischale präpariert. Hierzu wurden mit zwei sterilen Skalpellen

Gefäße, Vorhöfe und restliches Bindegewebe entfernt. Die so präparierten Herzen wurden in

eine neue Petrischale überführt.

4.2.2. Isolation von neonatalen Kardiomyozyten

Die Herzen wurden in einer Petrischale in PBS/PBS-Antibiotikum mit dem Skalpell in sehr

kleine Stücke zerteilt. Die Suspension wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die

Gewebestücke mit Hilfe eines Magnetrührgerätes (200 Umdrehungen pro Minute) bei 37°C

im Wasserbad mechanisch weiter zerkleinert.

Trypsinierung. Um die Kardiomyozyten aus dem Gewebeverband zu lösen, wurden die

entstandenen Muskelfragmente sofort mit einer Lösung aus Trypsin (2 mg/ml in sterilem

PBS) enzymatisch behandelt. Diese „Vortrypsinierung“ wurde unter Rühren (200

Umdrehungen pro Minute) für 3 Minuten bei 37°C durchgeführt. Die Zellsuspension wurde in

mindestens drei Fraktionen geteilt und in Trypsinlösung aufgenommen (1. Fraktion: 2x 10

Minuten mit je 20 ml Trypsinlösung; 2. Fraktion: wie 1. Fraktion; 3. Fraktion: 1x 10 Minuten

mit je 20 ml Trypsinlösung und zusätzlich 2x 10 Minuten mit je 10 ml Trypsinlösung). Nach

enzymatischer Behandlung wurde jede Fraktion gesammelt und in 10 ml NBCS die

Enzymreaktion abgestoppt. Die abgestoppten Fraktionen wurden bei 900 rpm für 8 Minuten

zentrifugiert. Die Zellpellets wurden gewaschen in NBCS/Medium199 (Mischungsverhältnis

1:2), mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer gezählt und mit 0,4%-iger Trypanblaulösung

(20 µl Trypanblaulösung/180 µl Zellsuspension) auf Vitalität getestet. Schließlich wurden die

Kardiomyozyten in Zellkulturmedium (Medium 199 mit Penicillin/Streptomycin (10%)/AraC

(10 µmolar in Aqua dest.; anti-mitotisch)/NBCS (10%)) aufgenommen.

4 Methoden

50

4.2.3. Kultivierung von isolierten neonatalen Kardiomyozyten

Die neonatalen Kardiomyozyten wurden in Zwei-Kammer-Kulturgefäßen mit

Borsilikatboden, einem Gesamtvolumen von 3 ml und einer Grundfläche von 3,6 cm2

ausgesät. Die Kammern wurden mit 50 µg/cm2 Fibronectin in sterilem PBS und 0,02%-iger

Gelatine beschichtet und für mindestens 2 h bei 37°C inkubiert. Pro Kammer wurden

anschließend 5x105 Zellen ausgesät. Die Zellen wurden für ca. 7 Tage bei 37°C und 95%

O2/5% CO2 kultiviert.

4.3. Mikroskopische Techniken

4.3.1. Bestimmung von Kontraktilität und Calciumtransient an adulten

Kardiomyozyten

In der vorliegenden Arbeit wurden adulte Kardiomyozyten auf Veränderungen in den

Parametern Kontraktilität (systolische Zellverkürzung) und Calciumtransient (Anstieg der

cytosolischen Calciumkonzentration zur Auslösung der Kontraktion) in verschiedenen

Versuchsansätzen mit Hilfe einer speziellen Form der Fluoreszenzmikroskopie untersucht, die

eine gleichzeitige Analyse beider Parameter ermöglichte.

4.3.1.1. Vorbereitungen

Adhärieren der Kardiomyozyten („Laminieren der Kardiomyozyten“). Für die

Untersuchungen von Kontraktilität und Calciumtransient wurden die frisch isolierten

Kardiomyozyten auf dem Boden der Versuchskammer mit Hilfe von Laminin adhäriert. Es

wurde ein Vier-Kammer-System mit Borsilikatboden verwendet, wobei jede Kammer ein

Gesamtvolumen von 1,5 ml und eine Grundfläche von 1,8 cm2 hatte. Die Versuchskammern

wurden mit 8 µg/cm2 Laminin in Versuchspuffer beschichtet und für mindestens 1 h bei 4°C

inkubiert. Anschließend wurden die Kammern mit 5x103 Zellen in 600 µl Versuchspuffer

befüllt und für 2 h bei 4°C adhäriert.

Färben der Kardiomyozyten mit Fura-2AM. Zur Messung von Veränderungen im

Calciumhaushalt der Kardiomyozyten wurden die Zellen mit dem Calcium-sensitiven

Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 gefärbt. Fura-2 ist ein Calciumchelator, der mit vier

4 Methoden

51

Carboxylgruppen Calcium (Ca++) bindet (Abb.4.4.). Die Stilbengruppe dient als Chromophor

des Moleküls. Fura-2 ist hochselektiv für Calcium und unempfindlich gegenüber pH-

Schwankungen im physiologischen Bereich. Die Dissoziationskonstante für Calcium beträgt

etwa 0,25 µmol/l und liegt damit im Bereich zellulärer Calciumsignale (0,01-1 µmol/l). Zur

Färbung wurde der Acetoxymethylester von Fura-2 Fura-2AM eingesetzt. Als

Acetoxymethylester ist Fura-2 lipophil und damit membranpermeabel. Intrazellulär werden

von Fura-2AM durch Esterasen hydrolytisch die fünf Estergruppen abgespalten. Das dadurch

freigesetzte Fura-2 kann als hydrophile Verbindung die Zellmembran nicht mehr passieren

und bindet Calcium über seine Carboxylgruppen.

Abb.4.4. Strukturformel von Fura-2 nach Grynkiewicz et al. 1985. Mit den vier Carboxylgruppen bindet Fura-2 an Calcium (Ca++); die Stilbengruppe dient als Chromophor.

Die „laminierten“ Kardiomyozyten wurden für 10 Minuten bei Raumtemperatur

lichtgeschützt unter Schwenken (20 rpm) in 500 µl der 5 µmolaren Lösung von Fura-2AM in

Versuchspuffer pro Kammer inkubiert. In einem weiteren Schritt wurde die Färbelösung

entfernt und die Zellen einmal mit Puffer gewaschen. In direktem Anschluss wurden die

Zellen in 500 µl Versuchspuffer pro Kammer unter dem Mikroskop auf Veränderungen von

Kontraktilität und Calciumtransient in verschiedenen Versuchsansätzen untersucht.

Calcium (Ca++)-Chelator

Stilbengruppe als Chromophor

4 Methoden

52

4.3.1.2. Messung von Kontraktilität und Calciumtransient am

Fluoreszenzmikroskop

Kontraktilität und Calciumtransient der Kardiomyozyten wurden an einem inversen

Mikroskop untersucht, welches mit einer Fluoreszenzlichtanlage (Stepper Switch Light

Source, Fluorescence System Interface, Ionoptix, USA) und einer hochauflösenden Kamera

(Myocam, Ionoptix, USA) ausgestattet war. Mit einem Zellstimulator (Myopacer, Ionoptix,

USA) wurden die Zellen während des Experiments zur Kontraktion angeregt. Die

Stimulationsbedingungen wurden während des gesamten Versuchs konstant auf eine

Frequenz von 1 Hz, einer Impulsdauer von 5 ms und einer Spannung von 12 V gehalten. Das

hier angewandte System ermöglichte parallel zur Analyse des Kontraktionsverhaltens die

Aufzeichnung des Calciumtransienten.

Grundlagen für die Bestimmung des Calciumtransienten. Für die Messung des

Calciumtransienten wurden die spektralen Fluoreszenzeigenschaften von Fura-2 ausgenutzt.

Die Fluoreszenz von Fura-2, die durch ultraviolettes Licht hervorgerufen wird, ändert sich

sowohl mit der Calciumkonzentration als auch mit der Anregungswellenlänge. Die maximale

Fluoreszenzintensität wird in Calcium-freier Lösung bei einer Anregungswellenlänge von

360 nm gemessen. Erhöht sich die Calciumkonzentration und bindet Fura-2 an Calcium,

ergeben sich zwei gegenläufige Änderungen der emittierten Fluoreszenzintensität: Eine

Zunahme bei einer Anregungswellenlänge von 340 nm und eine Abnahme bei 380 nm. Die

emittierte Fluoreszenz liegt bei einer Wellenlänge von 510 nm. Man spricht daher auch von

einem „dual excitation-single emission“–System. Bei einer Anregungswellenlänge von

360 nm ist die Fluoreszenzintensität von Fura-2 unabhängig von der Calciumkonzentration.

Die Intensität der Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 340 nm (F340) wird

bestimmt durch die Konzentration des Farbstoffs (C), die Dicke der Zelle (D) und eine

Konstante (K), die die optischen Eigenschaften der Messapparatur zusammenfasst, und sie ist

eine Funktion der Calciumkonzentration f([Ca++]):

F340 = C x D x K x f([Ca++])

Da die Parameter C, D und K unbekannt sind, kann über die Fluoreszenzintensität F340 alleine

nicht die Calciumkonzentration berechnet werden. Führt man zwei Fluoreszenzmessungen

hintereinander durch, und zwar zuerst mit einem Anregungslicht von 340 nm und dann bei

4 Methoden

53

380 nm, kann man annehmen, dass sich weder C noch D oder K zwischen den beiden

Messungen ändern. Wenn man die beiden gemessenen Fluoreszenzintensitäten F340 und F380

in Relation zueinander setzt, entfallen die drei unbekannten Größen C, D und K:

F340 = C * D * K * f([Ca++])

_______________________

F380 = C * D * K * f([Ca++])

Durch diese mathematische Operation erhält man eine experimentell bestimmbare Messgröße

(den Quotienten F340/F380), die nur von der Calciumkonzentration abhängt. Der Quotient

F340/F380 wird als „ratio“ bezeichnet. Diese Messgröße wurde in der vorliegenden Arbeit zur

Bestimmung des Calciumtransienten genutzt. Kontrahiert die Muskelzelle (Systole), steigt die

cytosolische Calciumkonzentration aufgrund der Entleerung der Calciumspeicher in der Zelle

stark an. In der gefärbten Zelle bindet infolgedessen Fura-2 an das aus den Speichern

freigesetzte Calcium. Der cytosolische Gehalt an Calcium-gebundenem Fura-2 steigt also an,

während die Konzentration an nicht-gebundenem Fura-2 („freies Fura-2“) sinkt. Der „ratio“-

Quotient F340/F380 wird bei der Kontraktion der Zelle größer und kleiner, wenn sich die Zelle

wieder entspannt (Diastole).

Messung der Kontraktilität (als systolische Zellverkürzung) und des Calciumtransienten (als

Änderung der„ratio“) am Fluoreszenzmikroskop der Firma Ionoptix. Die Messungen wurden

jeweils an einer einzelnen Kardiomyozyte durchgeführt. Abb.4.5.a. zeigt den Aufbau des in

der vorliegenden Arbeit verwendeten optischen Systems. Die Änderung der cytosolischen

Calciumkonzentration wird in diesem System durch die sequentielle Aufzeichnung der

Fluoreszenz des Calcium-gebundenen Fura-2 und des nichtgebundenen, „freien“ Fura-2

erfasst. Zu Beginn und zum Ende der Kontraktion der Zelle wird die Fluoreszenz bei einer

Anregungswellenlänge von 340 nm für jeweils 0,1 Sekunden gemessen. Die Aufzeichnung

der Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 380 nm erfolgt kontinuierlich. In dem

verwendeten optischen System wird Licht einer 100 Watt Xenonlampe mit Hilfe eines

Parabolspiegels, der sich im Lampengehäuse befindet, gebündelt. Ein Spiegel reflektiert das

gebündelte Licht und lenkt den Strahl auf einen Filter. In geöffneter Stellung kann Licht der

gewünschten Wellenlänge (340 oder 380 nm) den Filter passieren, in der geschlossenen

Position wird der Durchtritt von Licht verhindert, um zwischen zwei Messungen das

Ausbleichen der gefärbten Zellpräparate zu verhindern. Bei geöffnetem Filter wird Licht einer

4 Methoden

54

bestimmten Wellenlänge mit Hilfe einer Sammellinse auf einen Lichtleiter fokussiert, der

über einen Adapter mit dem Mikroskop verbunden ist. Über das Objektiv gelangt Licht mit

der entsprechenden Anregungswellenlänge (340 oder 380 nm) auf die Versuchskammer. Das

in Folge der Anregung vom Zellpräparat emittierte Licht von ca. 500 nm wird über einen

Rotlichtfilter auf einen dichromatischen Spiegel gelenkt, der wiederum das Fluoreszenzlicht

auf den Photomultiplier reflektiert. Durch den Photomultiplier wird das Lichtsignal in ein

elektrisches Signal umgewandelt. Das umgewandelte Signal wird an eine Interfacebox

(Fluorescence System Interface) weitergeleitet, die die Daten an den Computer sendet.

Die hochauflösende Kamera nimmt Bilder der fluoreszierenden Kardiomyozyten mit einer

Frequenz von 60 Bildern pro Sekunde auf. Die Kamera steht in Verbindung mit dem

Mikroskop und der Interfacebox, die die übermittelten Daten an den Computer weiterleitet.

Mit Hilfe des Programms Aquire von Ionoptix werden Kontraktilität (Zellverkürzung in µm)

und „ratio“ grafisch als Amplitude dargestellt (siehe Abb.4.5.b.). Mit Hilfe des Programms

Analyze von Ionoptix werden die diastolischen und systolischen Messwerte für

Zellverkürzung und „ratio“ außerdem tabellarisch wiedergegeben.

Versuchsablauf. An die vorbereiteten Versuchskammern wurde für die Messung eine

Elektrode für die elektrische Stimulation angeschlossen, die mit einem zu- und einem

abführenden Schlauch ausgestattet war. Die Kardiomyozyten wurden während der gesamten

Messung mit 1 ml Puffer pro Minute umspült und elektrisch mit 12 V und 1 Hz stimuliert.

Während des Experiments waren die Versuchskammern immer mit 500 µl Puffer gefüllt.

Kontraktilität und Calciumtansient wurden an einer Zelle pro Versuchskammer bestimmt. Die

Kardiomyozyten wurden zunächst durch ein 40x Immersionsölobjektiv hinsichtlich ihrer

Form und ihres Kontraktionsverhaltens beurteilt. Für die Messungen wurden Zellen gewählt,

die die für Kardiomyozyten typische rechteckige stäbchenartige Morphologie aufwiesen und

gleichmäßig und gut erkennbar kontrahierten. Die ausgewählte Zelle wurde durch Bewegen

des Objekttisches und der frei schwenkbaren Myocam mit horizontaler Längsachse im

Messfeld ausgerichtet. Die Zellränder wurden scharf gestellt, damit sie als schwarze, scharfe

Umrandung der Zelle erkennbar waren. Die verwendete Software ermöglichte es die

Zellgrenzen mit Hilfe des Mauszeigers „abzutasten“ und den Zeiger so zu positionieren, dass

die Verkürzung der Zelle während der Kontraktion als Amplitude erfasst werden konnte.

4 Methoden

55

Abb.4.5.a. Übersicht über das verwendete optische System zur Bestimmung von Kontraktilität (systolische Zellverkürzung) und Calciumtransient (als „ratio“) von Kardiomyozyten. Licht einer Xenonlampe (weißes Licht �) trifft auf einen Filter, der je nach Position Licht von 340 oder 380 nm (�) passieren lässt. Kürzerwelliges Licht regt Fura-2 zur Fluoreszenz im längerwelligen Bereich (ca. 510 nm �) an. Ein Photomultiplier wandelt letztendlich das vom Präparat abgegebene Lichtsignal in ein elektrisches Signal um, das von der Interfacebox verarbeitet und an den Computer weitergeleitet wird. Mit der beweglichen Kamera kann das Präparat in einem vorgegebenen Feld ausgerichtet und parallel zur Fluoreszenzanalyse Bilder der Zellen aufgenommen werden.

Für jede ausgewählte Kardiomyozyte wurden zu Beginn jeder Messreihe die basalen Werte

für Kontraktilität und Calciumtransient über ein Zeitintervall von 10 Sekunden bestimmt

(„Baseline“). Die Zelle ist für eine Messung geeignet, wenn sie sich bei der Kontraktion um

10-15% verkürzt und der Calciumtransient dabei um ca. 25-30% ansteigt (entspricht einem

Calciumanstieg von ca. 70 auf ca. 100 nmolar). Post-ischämisches und nicht-ischämisches

Effluat wurden über den zuführenden Schlauch auf die Zellen gegeben. Die Kardiomyozyten

wurden für ca. 2 Minuten mit den Effluaten umspült, dann die Peristaltikpumpe gestoppt, so

dass die Zellen in 500 µl des jeweiligen Effluates (entsprechend in Versuchspuffer verdünnt)

inkubierten. Nach dem Stoppen der Pumpen wurde eine Messung durchgeführt („Akutwert“),

die nach 110 Sekunden („2-Minutenwert“), nach weiteren 170 Sekunden („5-Minutenwert“)

und gegebenenfalls nach weiteren 290 Sekunden („10-Minutenwert“) wiederholt wurde. Eine

Messung erfolgte über 10 Sekunden, d.h. es wurden für die Kontraktilität und den

Calciumtransienten jeweils 10 Amplituden aufgezeichnet.

Xenonlampe

Parabolspiegel

Spiegel zur Reflexion

Linse zur Bündelung

Filtersystem

Motor für Filter- steuerung Linse zur

Bündelung

Lichtleiter/Verbindung zum Mikroskop

Rotlichtfilter

fluoreszierendes Präparat

Photomultiplier

Gehäuse mit dichromatischem Spiegel

Kamera

Interfacebox

Steuerungselement für Kamera

Computer

elektrisches Signal Objektiv

4 Methoden

56

Auswertung der Messergebnisse. Die für eine Zelle aufgenommenen Messwerte wurden mit

Hilfe des Programms Analyze von Ionoptix ausgewertet, das, wie bereits erläutert wurde, den

Verlauf der Kontraktilität als systolische Zellverkürzung in µm und des Calciumtransienten

als „ratio“ graphisch (Abb.4.5.b.) und tabellarisch darstellt. Das Programm berechnet die

prozentuale Änderung der Zelllänge und der „ratio“ bei Kontraktion der Zelle. Das heißt, es

wird die diastolische und systolische Zelllänge in µm und der diastolische und systolische

Wert für die „ratio“ ermittelt und diastolischer und systolischer Wert für die beiden Parameter

zueinander in Beziehung gesetzt. Die berechneten Werte wurden in Microsoft-Excel

transferiert. Aus den 10 einzelnen Werten einer Messung von Zellverkürzung bzw. „ratio“

wurden Mittelwerte berechnet und die prozentuale Änderung direkt nach Zugabe von post-

ischämischem oder nicht-ischämischem Effluat und nach weiteren 2, 5 und 10 Minuten relativ

zur „Baseline“ bestimmt. Die graphische Darstellung der Messergebnisse erfolgte mit

Microsoft-Powerpoint.

Abb.4.5.b. Zusammenfassung der experimentellen Vorgehensweise zur Messung von systolischer Zellverkürzung und „ratio“. Aus adulten Wistar-Ratten wurden enzymatisch Kardiomyozyten isoliert, die für die Durchführung der Fluoreszenzmikroskopie laminiert und mit Fura-2AM gefärbt wurden. Die fluoreszenzmikroskopischen Messungen wurden an der isolierten Einzelzelle durchgeführt. Zur Auswertung der Messergebnisse wurden die diastolischen und systolischen Werte für Zellverkürzung und „ratio“ prozentual in Beziehung gesetzt.

enzymatische Isolation

adulte Kardiomyozyte

Wistar-Ratte

Zel

lläng

e in

µm

20

40

60

80

„rat

io“

0,30

0,35

0,40

0,45

Fluoreszenzmikroskopie von laminierten und mit Fura-2AM gefärbten Kardiomyozyten

4 Methoden

57

4.3.2. Bestimmung von Schlagfrequenz und Calciumtransient an kultivierten

neonatalen Kardiomyozyten

4.3.2.1. Voraussetzungen

Aktivitätsprüfung. Für die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Messreihen war

Voraussetzung, dass die Zellverbände regelmäßig mit einer Frequenz von mindestens 100

Schlägen pro Minute kontrahierten. Diese Voraussetzung war nach ca. 7 Kulturtagen erfüllt.

Färben der Kardiomyozyten mit Fura-2AM. Die Färbung der neonatalen Kardiomyozyten

wurde analog den Ausführungen zur Färbung der adulten Kardiomyozyten durchgeführt

(siehe Abschnitt 4.3.1.1.). Wegen des größeren Kammervolumens wurden die neonatalen

Zellen mit 1 ml der 5 µmolaren Fura-2AM-Lösung gefärbt.

4.3.2.2. Messung von Schlagfrequenz und Calciumtransient am

Fluoreszenzmikroskop von Ionoptix

Schlagfrequenz und Calciumtransient wurden an einem Zellverband pro Versuchskammer

bestimmt. Während der gesamten Messung wurde der Objekttisch auf 37°C erwärmt. Die

Einzelverbände in einer Versuchskammer wurden durch ein 40x Immersionsölobjektiv

betrachtet. Der ausgewählte Zellverband wurde im Messfeld ausgerichtet. Für Schlagfrequenz

und Calciumtransient wurde die „Baseline“ über ein Zeitintervall von 10 Sekunden

aufgenommen. Wie bei den entsprechenden Experimenten mit adulten Zellen sollte die

Calciumkonzentration während der Kontraktion cytosolisch um 25-30% ansteigen. Post-

ischämisches und nicht-ischämisches Effluat wurden auf die Zellen gegeben, so dass in der

Versuchskammer die Effluate 1:4 konzentriert waren. Der „Akutwert“ und die „2-, 5- und 10

Minutenwerte“ wurden entsprechend der Experimente mit adulten Kardiomyozyten über eine

Zeitspanne von 10 Sekunden aufgenommen. Zusätzlich wurde ein „15-Minutenwert“

aufgezeichnet. Die Schlagfrequenz wurde auf Schläge pro Minute umgerechnet. Die

Auswertung der Messergebnisse für den Calciumtransienten erfolgte entsprechend der

Ergebnisauswertung bei adulten Kardiomyozyten mit der Software von Ionoptix und

Microsoft Excel. Die graphische Darstellung der Messergebnisse erfolgte mit Microsoft

Powerpoint.

4 Methoden

58

4.3.3. Fluoreszenzmikroskopische Messreihen mit Inhibitoren und Antagonisten/

Agonisten

Die adhärierten und mit Fura-2AM-gefärbten adulten oder neonatalen Kardiomyozyten

wurden mit den verschiedenen Inhibitoren bzw. Antagonisten in den entsprechenden

Konzentrationen für die jeweilige Inkubationszeit vorinkubiert. Anschließend wurde pro

Versuchskammer eine Zelle bzw. ein „Zellcluster“ ausgewählt. Nach Aufzeichnung der

„Baseline“ für Kontraktilität bzw. Schlagfrequenz und Calciumtransient wurde mit post-

ischämischem oder nicht-ischämischem Effluat oder einem Agonisten inkubiert und die

prozentuale Änderung von Kontraktilität bzw. Schlagfrequenz und des Calciumtransienten im

Vergleich zur „Baseline“ detektiert. Bei den in der vorliegenden Arbeit eingesetzten

Substanzen handelt es sich um gängige Enzyminhibitoren bzw. Antagonisten/Agonisten für

Rezeptoren, die in verschiedenen Forschungsbereichen in in-„vitro“-Experimenten eingesetzt

werden. Die Inkubationszeiten und die Inhibitor- bzw. Antagonisten-/Agonisten-

Konzentrationen wurden daher aus vergleichbaren Anwendungen ermittelt (siehe Tabelle

3.3.-3.5.). In zusätzlichen Messreihen wurde außerdem getestet, ob die angewandte Substanz

in der experimentellen Konzentration die basalen Werte von Kontraktilität bzw.

Schlagfrequenz und den Calciumtransienten der Kardiomyozyten beeinflusst, also eine

Eigenwirkung auf die isolierten Zellen hat.

4.3.4. Immunfluoreszenzfärbung von adulten Kardiomyozyten

Zur Aussaat der Kardiomyozyten wurden Zellkulturplatten mit jeweils 6 Vertiefungen („6-

well-plates“) verwendet, die mit Deckgläschen ausgelegt wurden. Die Deckgläschen wurden

jeweils mit 15 µg Laminin beschichtet und für mindestens 20 Minuten bei 4°C inkubiert. Im

Anschluss wurden die Deckgläschen einmal mit PBS gespült und 5x105 Zellen pro

Deckgläschen ausgesät. Zur Adhäsion der Kardiomyozyten wurden die Zellkulturplatten für

ca. 2 h bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde der Überstand von jedem „well“ abgenommen

und eine Immunfluoreszenzfärbung der adhärierten Zellen durchgeführt. Es handelte sich

dabei um eine indirekte Immunfluoreszenz, da die Zellen zunächst mit einem gegen das zu

detektierende Antigen gerichteten Primärantikörper inkubiert und in einem weiteren Schritt

mit einem Fluoreszenz-markierten sekundären Antikörper gefärbt wurden.

4 Methoden

59

Die adhärenten Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und für 10 Minuten bei

Raumtemperatur unter Schwenken mit 4%-iger Paraformaldehydlösung in PBS fixiert. Bei

Nachweis von intrazellulären Antigenen wurden die Zellen nach dreimaligem Waschen in

PBS (3x 5 Minuten) mit einer Lösung aus 0,2% Triton-X100 in PBS für 4 Minuten

permeabilisiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS (3x 5 Minuten) wurden die Zellen in 3%-

iger BSA-Lösung in PBS/0,05% Tween 20 für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf dem

Schwenktisch inkubiert. Dieser Schritt diente der Blockierung von unspezifischen

Bindungsstellen auf der Zelloberfläche der Kardiomyozyten, um Hintergrundfluoreszenz

durch unspezifische Bindung des primären und des Fluoreszenz-markierten sekundären

Antikörpers zu minimieren. Nach dreimaligem Waschen mit PBS/0,05% Tween 20 (3x 5

Minuten) wurde mit dem primären Antikörper, der gegen das zu detektierende Protein

gerichtet war, für 2 h bei Raumtemperatur in feuchter Kammer inkubiert. Hierzu wurde der

Deckel der Zellkulturplatte mit gereinigtem Parafilm überspannt, jeweils 80 µl der

entsprechend konzentrierten Antikörperlösung in einem Tropfen auf den Parafilm gesetzt und

die Deckgläschen mit der Zellseite nach unten vorsichtig auf den Tropfen gelegt. Der

Antikörper war in 3%-iger BSA-Lösung in PBS/0,05% Tween 20 verdünnt. Nach Ablauf der

Inkubationszeit wurden die Zellen 3x 5 Minuten mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Im

Anschluss erfolgte die Inkubation der Zellen mit dem sekundären Antikörper in 3%-iger

BSA-Lösung in PBS/0,05% Tween 20, der Fluoreszenz markiert war. Aufgrund einer starken

Eigenfluoreszenz der Kardiomyozyten im Grünbereich wurden in der vorliegenden Arbeit

ausschließlich sekundäre Antikörper verwendet, die mit dem Farbstoff Rhodamin markiert

waren. Die Zellen wurden über Nacht bei 4°C in feuchter Kammer mit dem sekundären

Antikörper inkubiert und nach Ablauf der Inkubationszeit 3x 5 Minuten in PBS/0,05% Tween

20 gewaschen. In einzelnen Ansätzen wurden außerdem die Zellkerne mit DAPI angefärbt.

Hierzu wurden die Zellen mit DAPI-Lösung (1µg/ml in PBS) für 2 min bei Raumtemperatur

inkubiert. Schließlich wurden die Deckgläschen auf Objektträger mit der Zellseite nach unten

in einen Tropfen Mounting Medium gelegt und für 3-4 Stunden bei Raumtemperatur

inkubiert. Das Medium wurde während der Inkubation bei Raumtemperatur fest und

befestigte so die Deckgläschen am Objektträger. Es diente außerdem der Konservierung der

Fluoreszenz für 2-3 Monate. Die Präparate wurden unter dem Mikroskop (aufrechtes

Mikroskop) mit einem 40x oder 100x Objektiv betrachtet. Mit Hilfe der an das Mikroskop

angeschlossenen Kamera und der Software AxioVision Rel 4.3. wurden die Zellen

fotografiert (Belichtungszeit für Rhodamin-Antikörper 10 Sekunden, für DAPI 50 ms). Die

Bilder wurden mit dem Programm AxioVision LE Rel.4.3. bearbeitet.

4 Methoden

60

Kontrollen für Immunfluoreszenz. Als Positivkontrolle wurden RAW264.7-Zellen gefärbt, die

auf ihrer Zelloberfläche die verschiedenen Subtypen der Prostaglandin-Rezeptoren und nach

Stimulation mit LPS (10 µg/ml für 24 h) die COX-2 exprimierten. RAW264.7-Zellen sind

murine Makrophagen, die in DMEM-Medium mit 10% FKS kultiviert wurden. Die Zellen

wachsen adhärent und wurden deshalb durch Inkubation mit Trypsin/EDTA-Lösung (0,25%

Trypsin, 1mM EDTAx4Na) für 5 Minuten vom Boden der Kulturflaschen abgelöst. Die

Antikörper gegen COX-2, EP2 und EP4 wurden durch Einsatz spezifischer Peptide

entsprechend der Vorgehensweise bei Western Blot auf spezifische Bindung der

Antigenbindungsregion getestet.

4.4. Proteinbiochemische Techniken

4.4.1. Herstellung von Kardiomyozytenlysaten

In der vorliegenden Arbeit wurden Lysate von adulten Kardiomyozyten hergestellt, die

entsprechend der Vorbereitungen für die Fluoreszenzmikroskopie vorbehandelt wurden. Zur

Vorbereitung wurden daher „6-well-plates“ mit Laminin (25 µg) beschichtet und die

beschichteten Platten für 1 h bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden für 2 Minuten bei 43 rcf

und eingestellter Bremse abzentrifugiert und das Pellet in Puffer resuspendiert. Pro „well“ der

Zellkulturplatte wurden ca. 5x105 Zellen ausgesät. Die Zellen adhärierten für 2 h bei 4°C

(„Laminierung“). Anschließend wurde der Überstand an „nicht-laminierten“ Zellen von

jedem „well“ abgenommen und die Zellen gegebenenfalls mit Fura-2AM gefärbt. Zur

Herstellung der Lysate wurden die adhärenten Zellen mit 100 µl Lysepuffer (RIPA-Puffer

(1xTBS, 1% Nonidet P-40, 0,5% Natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 0,004% Natriumazid nach

Herstellerangaben); Zugabe von 10µl der Zusätze „Proteinase-Inhibitor-Cocktail“,

Natriumorthovanadat und PMSF pro ml RIPA-Puffer) pro „well“ versetzt und nach 10

Minuten Inkubationszeit die Zellen abgeschabt. Die in jedem „well“ entstandene Suspension

wurde abgesaugt und vereinigt. Zur Entfernung von Zellresten wurde in einem weiteren

Schritt für 15 Minuten bei 14.000 rpm und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde

abgenommen und bei -20°C eingefroren. Bei der Herstellung von Lysaten neonataler

Kardiomyozyten wurde entsprechend vorgegangen, wobei die Zellen zu Beginn auf mit

Fibronectin beschichteten Platten ausgesät wurden.

4 Methoden

61

4.4.2. Herstellung von Proteinextrakten aus Rattenherzen

Adulte Rattenherzen wurden zerkleinert und für 2-3 Tage bei -80°C eingefroren. In flüssigem

Stickstoff wurden die eingefrorenen Stücke in einem weiteren Schritt mit einem Mörser

weiter zerkleinert und mit einem Homogenisator in Lysepuffer eine Suspension hergestellt.

Die Suspension wurde für 15 Minuten bei 14.000 rpm und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand

wurde abgenommen und bei -20°C eingefroren.

4.4.3. Proteinbestimmung von Lysaten und Extrakten

Mit Hilfe des BCA-Protein-Assay Kits von Pierce Biotechnology, USA wurde die

Proteinkonzentration in Kardiomyozytenlysaten und in den Extrakten aus den ganzen

Rattenherzen bestimmt. Hierbei wurden mittels BCA die Proteine photometrisch detektiert

und anhand einer Standardreihe das Gesamtprotein in einer Probe in µg/µl bestimmt. Die

Methode beruht auf der Reduktion von Cu++ zu Cu+ durch Proteine in alkalischem Milieu

(„Biuret-Reaktion“). Die Cu+-Ionen werden durch BCA chelatiert, wodurch ein farbiges

Produkt mit einer starken Adsorption bei 562 nm entsteht. In einem Konzentrationsbereich

von 20-2000 µg/ml verhält sich die Adsorption linear zur Proteinkonzentration.

Es wurde entsprechend dem Herstellerprotokoll vorgegangen. Als Referenzsubstanz wurde

BSA verwendet und Einzelproben von 0-1000 µg/ml angesetzt. Alle Einzelproben

einschließlich der zu untersuchenden Lysate und Extrakte in Verdünnungen von 1:10, 1:20

und 1:50 in Doppelwerten wurden photometrisch ausgewertet und die Werte für die optische

Dichte in Konzentrationsangaben für das Gesamtprotein in µg/µl umgerechnet.

4.4.4. Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

In der vorliegenden Arbeit wurden Proteingemische über SDS-PAGE („sodium-

dodecylsulfate polyacrylamide gel elektrophoresis“) elektrophoretisch nach ihrem

Molekulargewicht aufgetrennt. SDS bindet an die denaturierten Polypeptidketten der

Proteine, wodurch Polyanionen entstehen. Das elektrophoretische Laufverhalten dieser

Polyanionen ist dann proportional zu ihrem Molekulargewicht. Bei der Methode werden die

Proteine in einem großporigen Sammelgel fokussiert und in einem kleinporigen Trenngel

getrennt.

4 Methoden

62

Die folgenden Arbeitsschritte wurden mit Handschuhen durchgeführt, um Verunreinigungen

zu vermeiden. Zunächst wurden die Glasplatten und der Kamm für die Taschenbildung mit

70%-igem Ethanol gereinigt. Die Abstandhalter („Spacer“) sind als Vorsprung auf einer der

verwendeten Platten („Spacer-Platte“) vorhanden. Die Platten wurden in die Gießvorrichtung

eingespannt. In Tabelle 4.1. sind die Komponenten und ihre jeweiligen Mengen in Sammel-

und Trenngel für die Gelelektrophorese zusammengefasst. Für alle Experimente wurden Gele

mit 10%-iger SDS-Lösung verwendet (10%-ige Gele). Die Mengenangaben in Tabelle 4.1.

sind für jeweils zwei Gele von 1,5 mm Dicke.

Komponente Menge in ml Anwendung

Sammelgel (2x)

Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung 3,3

Aqua dest. 4,1

0,5 molare Tris-HCl-Lösung in Aqua dest. (pH 6,8 mit

HCl)

2,5

10%-ige SDS-Lösung in Aqua dest. 0,1

APS-Lösung in Aqua dest. (100 mg/ml) 0,05

TEMED 0,001

Fokussierung („Sammeln“) der Proben

Trenngel (2x)

Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung 6,6

Aqua dest. 8,2

1,5 molare Tris-HCl-Lösung in Aqua dest. (pH 8,8 mit

HCl)

5

10%-ige SDS-Lösung in Aqua dest. 0,2

APS-Lösung in Aqua dest. (100 mg/ml) 0,1

TEMED 0,001

Auftrennung der Proteine

Tabelle 4.1. Zusammensetzung der Gele für die SDS-Gelelektrophorese.

Das Trenngel wurde möglichst luftblasenfrei und zügig gegossen und sofort mit Isopropanol

überschichtet. Nach ca. 30 Minuten Polymerisationszeit wurde das Isopropanol entfernt und

die Trenngeloberfläche mit sterilem Wasser gut gespült und schließlich mit Papier getrocknet.

Im Anschluss wurde das Sammelgel ebenfalls lutblasenfrei gegossen und der Kamm zügig

zwischen die Platten in das Sammelgel eingeführt. Die verwendeten Kämme bildeten die

Taschen zum Auftragen der Proteine und konnten jeweils mit einem Probenvolumen von

4 Methoden

63

60 µl beladen werden. Nach 10 Minuten Polymerisationszeit wurde die Gießvorrichtung mit

dem Gel in die Elektrophoresekammer gesetzt und in beide Puffer gefüllt. Der Kamm wurde

vorsichtig aus dem Sammelgel entfernt und die Taschen mit Elektrophoresepuffer (1x)

ausgespült, um eventuell vorhandene Gelreste zu beseitigen. In allen Experimenten wurde

eine Proteinmenge von 40 µg pro Spur aufgetragen. Die Proben setzten sich jeweils aus 30 µl

Analyseansatz (Kardiomyozytenlysat oder Proteinextrakt aus ganzem Herz) verdünnt in

sterilem Aqua dest. und 30 µl eines 2x-Probenpuffers zusammen. Vor dem Auftragen auf das

Gel wurden die einzelnen Analyseansätze für 5 Minuten auf 95°C erhitzt. Das DTT des

Probenpuffers reduziert die Disulfidbrücken, die sich als kovalente Bindungen innerhalb der

Polypeptidketten ausbilden, und das Erhitzen auf 95°C führt zum Aufbrechen von

Wasserstoffbrücken, die als elekrostatische Wechselwirkung von zwei Aminosäureresten

innerhalb der Polypeptidketten entstehen. Bei der SDS-PAGE werden daher denaturierte

Polypeptidketten aufgetrennt. Um später den aufgetrennten Proteinen die entsprechenden

Molekulargewichte zuordnen zu können, wurde bei jedem Experiment ein Proteinstandard

mit bekannten Molekulargewichten (BenchMarkTM (50mM Tris-HCl, pH 6,8; 5mM EDTA;

10 mM DTT; 1% SDS; 10% Glycerol)) parallel zu den Analyseansätzen aufgetragen. Die

Proteine wurden bei 80 V im Sammelgel konzentriert und schließlich bei 120 V aufgetrennt.

Kontrollen für Western Blot. Als Positivkontrolle wurden Zelllysate von Zelllinien verwendet,

die das zu detektierende Protein exprimieren. Von den Kontrolllysaten wurden jeweils 40 µg

pro Spur aufgetragen. Außerdem wurden die Antikörper gegen die verschiedenen

Prostaglandin-Rezeptoren auf spezifische Bindung der Antigenbindungsregion getestet.

Hierzu wurde der jeweilige Antikörper mit einem Peptid inkubiert, das spezifisch die

Antigenbindungsregion blockiert. Das Peptid wurde entsprechend den Herstellerangaben in

sterilem Aqua dest. gelöst (Konzentration 0,5 mg/ml), mit dem Antikörper für 1 h bei

Raumtemperatur inkubiert (Mischungsverhältnis Antikörper/Peptid 1:1) und die Mischung in

der entsprechenden Konzentration auf die Membran gegeben.

4.4.5. Western Blot

Die über SDS-PAGE aufgetrennten Proteine wurden im Western Blot auf eine

Nitrocellulosemembran transferiert und dort mit Hilfe von Antikörpern, die spezifisch an die

transferierten Proteine binden, nachgewiesen.

4 Methoden

64

Alle Arbeitsschritte wurden mit Handschuhen durchgeführt. Nach der elektrophoretischen

Auftrennung wurde das Sammelgel vom Trenngel abgeschnitten und verworfen. Zur

Kontrolle wurden die Gele mit Coomassie Blue angefärbt. Auf diese Art und Weise konnten

die aufgetrennten Proteine im Gel als Banden sichtbar gemacht werden. Das Trenngel wurde

in Transferpuffer (1x; mit 20% Methanol) feuchtgehalten und mit einer luftblasenfrei

aufgelegten Nitrocellulosemembran zwischen je zwei Lagen Whatman-Papier und je einen

Schwamm in die Blotvorrichtung geklemmt. Nitrocellulosemembran, Whatman-Papier und

Schwamm wurden zuvor in Transferpuffer angefeuchtet. Die Blotvorrichtung wurde dann in

eine eisgekühlte, mit Transferpuffer gefüllte Transferkammer gesetzt und die Proteine 1 h und

10 Minuten bei 100 V auf die Nitrocellulosemembran transferiert. Zur Kontrolle des

Transfers der Proteine vom Gel auf die Membran wurde die Membran nach dem Blotten mit

Ponceau-S angefärbt.

Die mit Protein beladene Membran wurde für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei

4°C in Milchpulverlösung (5%-ige Lösung in 1xTBS/0,1% Tween 20) inkubiert, um

unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die Membran wurde für 3x 10 Minuten in

Waschpuffer (1xTBS/0,1% Tween 20) unter Schütteln gewaschen. Wurden verschiedene

Primärantikörper eingesetzt, wurde die Membran in Streifen geschnitten. Die komplette

Membran bzw. die einzelnen Streifen wurden in kleinen Schalen mit Antikörperlösung

(Antikörper in 5%-iger BSA-Lösung in 1xTBS/0,1% Tween 20) jeweils für 1 h bei

Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C bei leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend

wurde die Membran erneut für 3x 10 Minuten gewaschen. Die Detektion der Proteine erfolgte

chemolumineszent. In einem weiteren Schritt wurden daher die Membran bzw. die einzelnen

Streifen mit einer Lösung des HRPO-markierten Sekundärantikörpers (Antikörper in 5%-iger

BSA-Lösung in 1xTBS/0,1% Tween 20) für 90 Minuten inkubiert. Nach erneutem

dreimaligem Waschen wurde die Membran für 5 Minuten mit dem Substrat (Super Signal

West Pico Substrate; Anwendung gemäß Herstellerprotokoll) überschichtet und unter

Schütteln inkubiert. Die gefärbte Membran wurde dann zwischen zwei Folien ohne

überschüssiges Substrat in eine Filmkassette gelegt und in der Dunkelkammer unter Rotlicht

ein Film aufgelegt. Nach 5 Minuten wurde der Film entwickelt und fixiert. Je nach Ergebnis

des ersten entwickelten Filmes wurde anschließend ein weiterer Film kürzer oder länger

aufgelegt. Dieser Vorgang wurde solange wiederholt, bis ein befriedigendes Ergebnis erzielt

werden konnte. Die Membran wurde in der Folie bei -20°C eingefroren.

4 Methoden

65

4.4.6. Densitometrische Auswertung

Zur quantitativen Analyse wurde die Farbdichte einzelner Banden mit Hilfe des Programms

SigmaGel bestimmt. Die ermittelten Werte wurden zum Wert für die Positivkontrolle

prozentual in Beziehung gesetzt, wobei die Positivkontrolle auf 100% festgesetzt wurde.

4.5. „Enzyme-Linked Immunosorbend Assay (ELISA)“ zur cAMP-Bestimmung in

Kardiomyozytenlysaten

Zur Bestimmung der cAMP-Konzentration in adulten Kardiomyozyten wurde der cAMP-

Assay von R&D Systems, USA durchgeführt. Bei diesem Testsystem handelt es sich um

einen kompetitiven ELISA, bei dem cAMP in der zu bestimmenden Probe mit einer

bestimmten Menge an HRPO-markiertem cAMP um die Bindung an einen monoklonalen

anti-cAMP-Antikörper aus der Maus konkurriert. Der Test wurde entsprechend dem

Herstellerprotokoll durchgeführt. Die Kardiomyozytenlysate wurden mit dem von R&D

Systems zur Verfügung gestellten Lysepuffer hergestellt. Da die cAMP-Menge in mol/mg

Gesamtprotein bestimmt wurde, wurde die Proteinkonzentration in den Lysaten entsprechend

den Ausführungen in Abschnitt 4.4.3. mittels BCA-Protein-Assay Kit ermittelt. Im Test

wurden Lysate mit Konzentrationen von mindestens 2 µg/µl eingesetzt. Der Test beinhaltet

eine mit polyklonalem anti-Maus-Antikörper aus der Ziege beladene Mikrotiterplatte, die mit

den verschiedenen Proben (Lysate, Kontrolle, Standard) befüllt wurde. Nach Zugabe der

Primärantikörper-Lösung (monoklonaler Maus-Antikörper gegen cAMP) und des an HRPO-

gekoppelten cAMP-Konjugats wurde für 3 h unter Schütteln inkubiert. Nach viermaligem

Waschen wurde lichtgeschützt die Substratlösung zugegeben und für 30 Minuten inkubiert.

Durch Zugabe von Stopplösung wurde die HRPO-Reaktion abgestoppt. Innerhalb von

30 Minuten wurde die Adsorption bei 450 nm gemessen.

4.6. Statistische Auswertung

Die Ergebnisse werden als arithmetrischer Mittelwert ± Standardfehler dargestellt. Die

Anzahl der Experimente wird mit „n“ angegeben. Zur statistischen Analyse der Ergebnisse

bezüglich Zellverkürzung und „ratio“ aus den fluoreszenzmikroskopischen Messreihen kam

der nicht-parametrische t-Rangsummentest nach Mann-Whitney für unverbundene

Stichproben zur Anwendung (Programm: SigmaStat). Dabei wurde die maximale

4 Methoden

66

Irrtumswahrscheinlichkeit auf � = 0,05 festgelegt. Bei den Messreihen mit post-ischämischem

Effluat bezieht sich die in den Grafiken angegebene Signifikanz (als p-Wert (p)) auf die

Kontrollgruppen, die mit nicht-ischämischem Effluat vorinkubiert wurden (post-ischämisches

Effluat (IF) versus (vs.) nicht-ischämisches Effluat (KF)). Dabei wurden pharmakologisch

vorbehandelte Gruppen auf Signifikanz zur vorbehandelten Kontrollgruppe und nicht

vorbehandelte Gruppen auf Signifikanz zur unbehandelten Kontrollgruppe geprüft. Bei den

Gruppen, die mit Agonisten (z.B. Cromakalim) vorbehandelt waren, wurde die Signifikanz zu

der Gruppe geprüft, die mit dem entsprechenden Inhibitor/Antagonisten (Kontrollgruppe)

vorinkubiert war.

5 Ergebnisse

67

5 Ergebnisse

Die Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat auf isolierte adulte und

neonatale Kardiomyozyten wurden mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie untersucht.

Elektrisch stimulierte adulte Kardiomyozyten wurden dabei hinsichtlich Veränderungen in

Kontraktilität und Calciumtransienten, spontan schlagende neonatale Zellen hinsichtlich

Veränderungen in Schlagfrequenz und Calciumtransienten analysiert. In der vorliegenden

Arbeit wurde zur Bestimmung des Calciumtransienten die „ratio“ als Verhältnis der

Fluoreszenzintensitäten von an Calcium gebundenem zu ungebundenem Fluoreszenzfarbstoff

ermittelt. Folgender Zusammenhang ist dabei die Grundlage für die durchgeführten

Messungen: Durch Entleerung der Calciumspeicher der Kardiomyozyte kommt es zum

Anstieg der „ratio“, und die Kontraktion der Zelle wird ausgelöst; steigt die „ratio“ nach

Zugabe bestimmter Substanzen stärker bzw. schwächer an, kontrahiert die Zelle stärker bzw.

schwächer. Die Kontraktilität wurde als prozentuale systolische Zellverkürzung gemessen.

Die Messergebnisse für Kontraktilität und „ratio“ nach Zugabe bestimmter Substanzen

wurden prozentual zu den Basalwerten („Baseline“), die für unbehandelte Zellen ermittelt

wurden, in Beziehung gesetzt. Post-ischämisches Effluat wird im Folgenden als IF, nicht-

ischämisches Effluat als KF (Kontrolleffluat) bezeichnet.

5.1. Charakterisierung des Effekts von post-ischämischem und nicht-ischämischem

Effluat auf adulte Kardiomyozyten

Die reduzierende Wirkung von IF und KF auf die Kontraktilität und den Calciumtransienten

von isolierten adulten Kardiomyozyten wurde als erstes von Felix et al. 2001 dargestellt

(Felix et al. 2001). In der vorliegenden Arbeit sollten zunächst die Effekte der Effluate

reproduziert werden. Hierzu wurden die Effekte von IF und KF aus insgesamt drei

Rattenherzen bestimmt. Die Effluate wurden in verschiedenen Verdünnungsstufen eingesetzt

und so für jedes Herz eine Dosiswirkungskurve erstellt. Abb.5.1.a. und b. zeigen die

Ergebnisse der Messreihe. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen unserer

Arbeitsgruppe, in denen ebenfalls das Kontraktionsverhalten und der Calciumtransient von

adulten Kardiomyozyten analysiert wurde, zeigten, dass die Effekte verschiedener Substanzen

ca. 5 Minuten nach ihrer Zugabe stabil detektiert und eine Überlagerung durch andere

Akuteffekte (z.B. Stoppen der zuführenden Pumpen, siehe Abschnitt 4.3.1.2.) ausgeschlossen

werden kann. Für die Auswertung des Effekts von IF und KF auf adulte Kardiomyozyten

5 Ergebnisse

68

waren in der vorliegenden Arbeit daher die „5-Minutenwerte“ (5 Minuten nach

„Akutmessung“) maßgeblich. Bei einer Verdünnung von 1:4 zeigte IF aus allen drei Herzen

im „5-Minutenwert“ eine Reduzierung von ca. 17-21% bezüglich Zellverkürzung und ca. 10-

12% bezüglich „ratio“ der isolierten Kardiomyozyten. KF hatte keinen wesentlichen Einfluss

auf Zellverkürzung und „ratio“ der Zellen, d.h. die maximale Reduzierung von

Zellverkürzung und „ratio“ durch KF lag bei -1,5 bzw. -0,5%. Die Wirkung einer Substanz

auf adulte Kardiomyozyten wurde als negativ-inotrop ausgewertet, wenn sie die

Zellverkürzung und die „ratio“ um mehr als 5% reduzierte. IF wirkte demnach in allen drei

Ansätzen im Gegensatz zu dem entsprechenden KF negativ-inotrop auf die isolierten

Kardiomyozyten. Die Wirkung von IF auf Zellverkürzung und „ratio“ war

konzentrationsabhängig und ging bei einer Verdünnung der Effluate von 1:4 in die Sättigung

über. Im Folgenden wurden daher IF und KF in allen Experimenten in einer Verdünnung von

1:4 eingesetzt.

Abb.5.1.c. zeigt die Wirkung von IF und KF aus Herz I einschließlich der Ergebnisse

bezüglich Zellverkürzung und „ratio“ der „akuten“, der „2-Minuten-Messung“ und außer der

„5-Minuten-Messung“ einer zusätzlichen „10-Minuten-Messung“ nach weiteren 290

Sekunden. Nach einer „akuten“ Reduktion von Zellverkürzung und „ratio“ um 25 bzw. 20%

stabilisierte sich die negativ-inotrope Wirkung von IF im Vergleich zu KF nach 5 Minuten auf

Werte von -21% bezüglich Zellverkürzung und -12% bezüglich „ratio“. Der „akut“

reduzierende Effekt von KF hingegen ging nach 2 Minuten auf Werte von -1,5% bezüglich

Zellverkürzung und -0,5% bezüglich „ratio“ zurück.

5 Ergebnisse

69

Abb.5.1.a. und b. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf die basalen Werte von Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten in verschiedenen Verdünnungsstufen (Dosiswirkungskurve). Die Daten sind für jede Verdünnungsstufe und jedes Effluat dargestellt als Mittelwerte der prozentualen Änderung von Zellverkürzung und „ratio“ ± Standardfehler („5-Minutenwerte“) für n=6 Kardiomyozyten aus verschiedenen Zellisolationen.

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

Baseline 1:32 1:16 1:8 1:4 1:2

IF aus Herz IIF aus Herz IIIF aus Herz IIIKF aus Herz IKF aus Herz IIKF aus Herz III

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Baseline 1:32 1:16 1:8 1:4 1:2

IF aus Herz IIF aus Herz IIIF aus Herz IIIKF aus Herz IKF aus Herz IIKF aus Herz III

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kürz

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im V

ergl

eich

zur

Bas

elin

e in

%

A. Wirkung von IF/KF auf die Zellverkürzung

B. Wirkung von IF/KF auf die „ratio“

5 Ergebnisse

70

Abb.5.1.c. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf die basalen Werte von Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten in „Akutmessung“ und 2 Minuten, 5 Minuten und 10 Minuten nach „Akutmessung“. Mittels Fluoreszenzmikroskopie wurde zu jedem Zeitpunkt die prozentuale Änderung von Zellverkürzung und „ratio“ nach Zugabe der Effluate bestimmt. Für jede Messreihe sind die Daten als Mittelwerte ± Standardfehler für n=6 Kardiomyozyten aus verschiedenen Zellisolationen dargestellt. In der Abbildung sind beispielhaft die Ergebnisse mit IF bzw. KF aus einem Rattenherzen (Herz I; siehe Abb.5.1.a. und b.) dargestellt.

Um weitere Eigenschaften der Effluate zu erfassen, wurde ihre Langzeitwirkung getestet.

Dazu wurden IF und KF aus verschiedenen Herzen für mehrere Tage bei 2-4°C und alternativ

bei -20°C gelagert und nach verschiedenen Lagerungszeiten auf negativ-inotrope Wirkung

getestet. Abb.5.2. fasst die verschiedenen Messreihen zusammen. Bei 2-4°C gelagerte post-

ischämische Effluate zeigten nach zwei Tagen keine negativ-inotrope Wirkung mehr auf die

isolierten Kardiomyozyten (Abb.5.2.a). Bei post-ischämischen Effluaten, die bei -20°C

gelagert waren, konnte bis zu einer Lagerungszeit von 72 h ein Effekt von ca. 18% Reduktion

bezüglich Zellverkürzung und 12% Reduktion bezüglich „ratio“ detektiert werden

(Abb.5.2.b.). Nach 96 h war der negativ-inotrope Effekt deutlich abgeschwächt und nach

weiteren 24 h nicht mehr detektierbar.

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5Baseline akut 2 min 5 min 10 min

Zellverkürzung nach IF ausHerz IRatio nach IF aus Herz I

Zellverkürzung nach KFaus Herz IRatio nach KF aus Herz I

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

Wirkung von IF/KF auf Zellverkürzung/„ratio“

5 Ergebnisse

71

Abb.5.2.a. und b. Messung der Langzeitwirkung von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF). a. Messreihen mit IF bzw. KF, das direkt nach Gewinnung zur Messung verwendet wurde (0 h) oder für 24 h, 48 h oder 72 h bei 2-4°C gelagert und anschließend zur Messung eingesetzt wurde. b. Messreihen mit IF bzw. KF, das direkt nach Gewinnung (0 h) verwendet oder 24 h, 48 h, 72 h, 96 h oder 5 Tage bei -20°C aufbewahrt wurde und dann zur Messung eingesetzt wurde. Mittels Fluoreszenzmikroskopie wurde die prozentuale Änderung der Basalwerte von Zellverkürzung und „ratio“ nach Zugabe der unterschiedlich gelagerten Effluate bestimmt. Die Daten sind für jede Messreihe als Mittelwerte der „5-Minutenwerte“ ± Standardfehler für jeweils n=6 Kardiomyozyten aus verschiedenen Zellisolationen dargestellt. Den Ergebnissen liegen Messreihen mit IF und KF aus verschiedenen Rattenherzen für jede Lagerungsbedingung zugrunde.

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5Baseline 0h 24h 48h 72h

Zellverkürzung nach IF Ratio nach IF Zellverkürzung nach KFRatio nach KF

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

A. Langzeitwirkung von IF: Lagerung bei 2-4°C

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5Baseline 0h 24h 48h 72h 96 h 5 Tage

Zellverkürzung nach IF Ratio nach IF Zellverkürzung nach KFRatio nach KF

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

B. Langzeitwirkung von IF: Lagerung bei -20°C

5 Ergebnisse

72

Zur weiteren Charakterisierung der Wirkung von IF und KF wurden Kardiomyozyten nach

Aufzeichnung der Basalwerte für Zellverkürzung und „ratio“ mit Isoproterenol vorinkubiert

und nach 5 Minuten Inkubationszeit die Änderungen von Zellverkürzung und „ratio“

aufgenommen. Bei Isoproterenol handelt es sich um einen Agonisten für �1- und �2-

adrenerge Rezeptoren, der eine positiv-inotrope Wirkung auf die Kardiomyozyten zeigte

(Abb.5.3.a.), die durch die Anwendung des �-Blockers Metoprolol aufgehoben wurde. Die

Zellverkürzung wurde durch Isoproterenol um 18%, die „ratio“ um 12% gesteigert.

Metoprolol zeigte in Testreihen keine Effekte auf die Basalwerte von Zellverkürzung und

„ratio“ der isolierten Kardiomyozyten.

Abb.5.3.a. Wirkung von 12,5 nmolar Isoproterenol auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten, die entweder nicht vorbehandelt oder mit Metoprolol, einem Antagonisten für �-adrenerge Rezeptoren, vorinkubiert waren. Zellverkürzung und „ratio“ wurden basal und 5 Minuten nach Zugabe von Isoproterenol bestimmt. Die Ergebnisse sind für beide Messreihen dargestellt als Mittelwerte der prozentualen Änderung der basalen Werte von Zellverkürzung und „ratio“ ± Standardfehler für n=6 Kardiomyozyten aus verschiedenen Zellisolationen.

Auf mit Isoproterenol vorbehandelte Zellen wirkte IF stärker negativ-inotrop als auf

unbehandelte Zellen - die Zellverkürzung wurde im „5-Minutenwert“ um 25%, die „ratio“ um

17% reduziert. Die Inkubation mit KF hatte keinen Einfluss auf Zellverkürzung und „ratio“

der mit Isoproterenol vorbehandelten Kardiomyozyten.

Isoproterenol Isoproterenol/Metoprolol

-5

0

5

10

15

20

25

Ratio Zellverkürzung

Ände

rung

im V

ergl

eich

zur

Bas

elin

e in

%

p<0,001 Isoproterenol vs. Isoproterenol/Metoprolol

Wirkung von Isoproterenol auf die „Baseline“

5 Ergebnisse

73

Abb.5.3.b. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten, die mit Isoproterenol (Isoprot) vorbehandelt oder unbehandelt waren. Mittels Fluoreszenzmikroskopie wurde die prozentuale Änderung der basalen Werte („Baseline“) von Zellverkürzung und „ratio“ nach Zugabe der Effluate bestimmt. Für jede Messreihe mit IF bzw. KF sind die Daten als Mittelwerte der „5-Minutenwerte“ (5 Minuten nach „Akutmessung“) ± Standardfehler für jeweils n=6 Kardiomyozyten aus verschiedenen Zellisolationen dargestellt. Den Ergebnissen liegen Messreihen mit IF und KF aus mindestens 3 verschiedenen Rattenherzen zugrunde.

5.2. Metabolismus der negativ-inotropen Mediatoren des post-ischämischen Effluates

in adulten Kardiomyozyten: Rolle der Cyclooxygenasen COX-1 und COX-2

In der vorliegenden Arbeit sollten im Folgenden die zellulären Mechanismen aufgeklärt

werden, über die IF den negativ-inotropen Effekt auf die isolierten adulten Kardiomyozyten

vermittelt. Hierzu wurden die Zellen mit verschiedenen Inhibitoren vorbehandelt und die

Effekte von IF und KF auf die vorbehandelten Zellen untersucht. Die Vermutung, die negativ-

inotropen Substanzen im post-ischämischen Effluat stammen aus dem Arachidonsäure-

Stoffwechsel, führte zu der Überlegung, dass die Faktoren über die Cyclooxygenase in den

isolierten Kardiomyozyten metabolisiert werden. Wie bereits in Abschnitt 1.4.3. ausführlich

dargestellt wurde, existieren von der Cyclooxygenase die zwei Isoformen COX-1 und

COX-2. Die beiden Isoformen katalysieren die Synthese von Prostaglandin H, die

Ausgangsverbindung für weitere Prostaglandine und Thromboxane.

KF IF KF/Isoprot IF/Isoprot

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5


Änd

erun

g im

Ver

glei

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ur B

asel

ine

ohne

bzw

. mit

Isop

rote

reno

l in

%

p<0,001 IF vs. KF p<0,001 IF/Isoprot vs. KF/Isoprot p<0,01 IF vs. IF/Isoprot

Wirkung von IF/Isoproterenol

5 Ergebnisse

74

5.2.1. Expression von COX-1 und COX-2 in adulten Kardiomyozyten

Vor der Durchführung von Experimenten mit verschiedenen Inhibitoren wurden adulte

Kardiomyozyten auf Expression der beiden Cyclooxygenase-Isoformen im Western Blot

getestet. Dafür wurden Lysate von Zellen verwendet, die entsprechend den Vorbereitungen

für die Fluoreszenzmikroskopie vorbehandelt waren, d.h. an Laminin adhäriert („laminiert“)

und mit Fura-2AM gefärbt wurden (siehe Abschnitt 4.4.1.). Abb. 5.4. zeigt die Ergebnisse der

Western Blot-Analyse. Im Lysat der vorbehandelten Kardiomyozyten konnten sowohl

COX-1, wie auch die induzierte Isoform COX-2 nachgewiesen werden.

Abb.5.4.A. und B. Western Blot-Analyse der Expression von COX-1 (A) und COX-2 (B) in Lysaten isolierter adulter Kardiomyozyten. Für die Analyse wurden Lysate von Kardiomyozyten verwendet, die laminiert und mit Fura-2AM gefärbt waren entsprechend den Vorbereitungen für die Fluoreszenzmikroskopie. A. COX-1 in RSV-Lysat (Positivkontrolle, Spur 1), COX-1 in Lysaten aus zwei verschiedenen Kardiomyozytenisolationen (Spur 2 und 3). B. COX-2 in Lysat von RAW264.7-Zellen (Positivkontrolle, Spur 1), COX-2 in Lysaten aus zwei verschiedenen Kardiomyozytenisolationen (Spur 2 und 3). Die Abbildung zeigt beispielhaft jeweils eine repräsentative Western Blot-Analyse für jeden Antikörper von n=3 Experimenten mit verschiedenen Lysaten.

COX-2 wird z.B. durch UV-Strahlung und verschiedene Formen von mechanischem Stress

induziert. Diese Isoform der Cyclooxygenase war in laminierten und mit Fura-2AM gefärbten

Kardiomyozyten exprimiert. Im Folgenden wurde getestet, ob Kardiomyozyten COX-2

exprimieren, die nicht laminiert und nicht mit Fura-2AM gefärbt, nur laminiert oder nur

gefärbt waren. Abb.5.5. fasst die Ergebnisse der Western Blot-Analyse für die verschiedenen

Zelllysate zusammen. Kardiomyozyten, die nicht laminiert und nicht gefärbt waren, zeigten

im Western Blot eine weniger starke COX-2-Expression als Zellen, die laminiert und gefärbt

A. B. COX-2

(72 kDa)

1 2 3

COX-1 (ca. 70 kDa)

1 2 3

5 Ergebnisse

75

oder nur laminiert waren. Auch in nur gefärbten und nicht-laminierten Kardiomyozyten war

COX-2 weniger stark exprimiert. Zur Laminierung wurden die Zellen bei 4°C für ca. 2 h

inkubiert. Nach den Ergebnissen der Western Blot-Analyse wurde die Expression der COX-2

während dieser Prozedur zur Vorbereitung der Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie

intensiviert. COX-2 konnte in laminierten Kardiomyozyten außerdem mittels

Immunfluoreszenzfärbungen detektiert werden (Abb.5.6.).

Abb.5.5.a. Western Blot-Analyse der COX-2-Expression in Lysaten von Kardiomyozyten, die laminiert und mit Fura-2AM gefärbt wurden (Spur 5), nur laminiert (Spur 3), nur gefärbt (Spur 4) oder weder gefärbt noch laminiert waren (Spur 2). Als Positivkontrolle wurde Lysat von RAW264.7-Zellen verwendet (Spur 1). Die Abbildung zeigt die Ergebnisse von einem repräsentativen Western Blot von n=3 Experimenten mit verschiedenen Lysaten.

Abb.5.5.b. Densitometrische Auswertung der COX-2-Analyse aus Abb.5.5.a.. Die Farbdichte der Banden wurde mit Hilfe des Programms SigmaGel ermittelt. Die Daten für die Kardiomyozytenlysate wurden prozentual zur Farbdichte der Positivkontrolle (COX-2 in Lysat von RAW264.7-Zellen) in Beziehung gesetzt. In die Darstellung sind die Ergebnisse von n=3 Western Blots mit verschiedenen Lysaten einbezogen (Mittelwerte±Standardfehler).

0

30

60

90

120

nicht gefärbt laminiert gefärbt laminiert nicht laminiert gefärbt

%

Pos

itivk

ontr

olle

1 2 3 4 5

COX-2 (72 kDa)

5 Ergebnisse

76

Abb.5.6.A. und B. Nachweis der COX-2 durch cytoplasmatische Immunfluoreszenzfärbung von laminierten Kardiomyozyten (40x Vergrößerung in Bild B (1,2)). Als Positivkontrolle wurden RAW264.7-Zellen verwendet, die mit LPS stimuliert waren (40x Vergrößerung in Bild A (1); 100x Vergrößerung in Bild A (2,3)). Als Negativkontrolle für die anti-COX-2-Färbung wurden die Kardiomyozyten mit inhibiertem Primärantikörper (Antikörper-Peptid-Komplex) gefärbt (40x Vergrößerung in Bild B (3a) und im Durchlichtbild (3b)). Dargestellt sind repräsentative Färbeergebnisse ausgewählt aus insgesamt n=3 Experimenten für jeden Färbeansatz.

5.2.2. Reagiert IF in isolierten adulten Kardiomyozyten Cyclooxygenase-abhängig?

In einer Messreihe wurde die Wirkung von IF und KF auf Kardiomyozyten getestet, die mit

dem unselektiven Cyclooxygenase-Inhibitor Indomethacin vorinkubiert wurden.

Indomethacin hemmt beide Isoformen der Cyclooxygenase. Abb.5.7. zeigt die Ergebnisse der

Messreihe. Nach Vorinkubation mit Indomethacin war der Effekt von IF auf die

Kardiomyozyten sehr viel schwächer ausgeprägt als auf unbehandelte Zellen.

(1)

(3a)

(2)

(3b)

A. B. COX-2 in Kardiomyozyten (1,2), Kontrollfärbung (3a) auch im Durchlicht (3b)

ca.30 µm ca.20 µm

(1) (2)

(3)

COX-2 in LPS-stimulierten RAW264.7-Zellen (Positivkontrolle)

ca.7µm

ca. 5 µm

5 Ergebnisse

77

Abb.5.7. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten, die mit dem COX-Inhibitor Indomethacin (Indo) vorbehandelt oder unbehandelt waren. Mittels Fluoreszenzmikroskopie wurde die prozentuale Änderung der basalen Werte („Baseline“) von Zellverkürzung und „ratio“ nach Zugabe der Effluate bestimmt. Für jede Messreihe sind die Daten als Mittelwerte der „5-Minutenwerte“ (5 Minuten nach „Akutmessung“) ± Standardfehler für jeweils n=6 Kardiomyozyten aus verschiedenen Zellisolationen dargestellt. Den Ergebnissen liegen Messreihen mit IF bzw. KF aus mindestens 3 verschiedenen Rattenherzen zugrunde.

Indomethacin wurde in einer Konzentration von 5 µmol/l eingesetzt. Um Eigenwirkungen von

Indomethacin auf isolierte adulte Kardiomyozyten ausschließen zu können, wurden in einer

Testreihe die Zellen nach Aufnahme der Basalwerte über die gesamte Versuchszeit mit dem

Inhibitor in der Anwendungskonzentration inkubiert. Zellverkürzung und „ratio“ wurden nach

der Vorinkubationszeit und nach weiteren 7 Minuten aufgezeichnet, was der Gesamtmesszeit

aus den Messreihen mit den Effluaten entspricht (2 Minuten umspülen und 5 Minuten

Inkubation mit den Effluaten). Es zeigte sich, dass Indomethacin in einer Konzentration von

5 µmol/l über die gesamte Versuchszeit die Basalwerte nicht beeinflusste (Abb.5.8.).

KF IF KF/Indo IF/Indo Än

deru

ng im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

p<0,001 IF vs. KF

Hemmung der Cyclooxygenase durch Indomethacin

-25

-20

-15

-10

-5

0

5


5 Ergebnisse

78

Abb.5.8. Wirkung von 5 µmolar Indomethacin auf die basalen Werte für Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten. Zellverkürzung und „ratio“ wurden basal und nach 15 Minuten (Vorinkubationszeit) bzw. 22 Minuten nach Zugabe des Inhibitors (Gesamtmesszeit entsprechend der Messreihen mit Indomethacin/IF bzw. KF) aufgenommen. Die Ergebnisse sind für jede Messreihe dargestellt als Mittelwerte der prozentualen Änderung der basalen Werte von Zellverkürzung und „ratio“ ± Standardfehler für n=6 Kardiomyozyten aus verschiedenen Zellisolationen.

Wie in Abschnitt 5.2.1. gezeigt wurde, exprimierten adulte Kardiomyozyten, die für die

Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet waren, die induzierte und die konstitutive Isoform der

Cyclooxygenase. In einer weiteren Messreihe wurden die Kardiomyozyten daher mit dem

selektiven COX-1-Inhibitor SC-560 und den selektiven COX-2-Inhibitoren NS-398 und

Lumiracoxib vorbehandelt. Die Ergebnisse der Messreihen sind in Abb.5.9. und Abb.5.10.a.

und b. dargestellt. Vorinkubation der Zellen mit SC-560 beeinflusste den Effekt von IF nicht.

-25

-15

-5

5


Ände

rung

im V

ergl

eich

zur

Bas

elin

e in

%

nach 15 Minuten nach 22 Minuten

Wirkung von Indomethacin auf die „Baseline“

5 Ergebnisse

79

Abb.5.9. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten, die mit dem COX-1-Inhibitor SC-560 vorbehandelt oder unbehandelt waren. Die Daten sind entsprechend der Darstellung der Messergebnisse mit Indomethacin/IF bzw. KF zusammengefasst. (Mittelwerte der „5-Minutenwerte“ für Zellverkürzung bzw. „ratio“ ± Standardfehler für n=6 Kardiomyozyten; IF bzw. KF aus mindestens 3 verschiedenen Herzen).

Im Gegensatz dazu reagierten die Kardiomyozyten nach Vorinkubation mit NS-398 und

Lumiracoxib und Zugabe von IF nicht negativ-inotrop, d.h. der Effekt von IF wurde durch die

COX-2-Inhibitoren aufgehoben. Der Effekt von IF in isolierten adulten Kardiomyozyten ist

daher vermutlich abhängig von der COX-2.

SC-560, NS-398 und Lumiracoxib wurden entsprechend der Vorgehensweise mit

Indomethacin (siehe Abb.5.8.) auf Eigenwirkung auf die Kardiomyozyten getestet. Die

Inhibitoren zeigten in den experimentell eingesetzten Konzentrationen keine Beeinflussung

der Basalwerte von Zellverkürzung und „ratio“.

-25

-20

-15

-10

-5

0

5


KF IF KF/ IF/ SC-560 SC-560

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

p<0,001 IF vs. KF p<0,001 IF/SC-560 vs. KF/SC-560

Hemmung der COX-1 durch SC-560

5 Ergebnisse

80

Abb.5.10.a. und b. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten, die mit den COX-2-Inhibitoren NS-398 und Lumiracoxib (Lum) vorbehandelt oder unbehandelt waren. Die Daten sind für beide Inhibitoren entsprechend der Darstellung der Messergebnisse mit Indomethacin/IF bzw. KF zusammengefasst (Mittelwerte der „5-Minutenwerte“ für Zellverkürzung bzw. „ratio“ ± Standardfehler für n=6 Kardiomyozyten; IF bzw. KF aus mindestens 3 verschiedenen Herzen).

KF IF KF/ IF/ NS-398 NS-398

-25

-20

-15

-10

-5

0

5


Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

p<0,001 IF vs. KF

A. Hemmung der COX-2 durch NS-398

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

KF IF KF/Lum IF/Lum

p<0,001 IF vs. KF

B. Hemmung der COX-2 durch Lumiracoxib

5 Ergebnisse

81

5.2.3. COX-2-Expression im ganzen Herzen der adulten Ratte: Verstärkt eine

10-minütige „stop-flow“-Ischämie die Expression der COX-2?

Die Expression der COX-2 in isolierten Kardiomyozyten wurde während der Laminierung der

Zellen zur Vorbereitung der Mikroskopie intensiviert. Lysate von nicht-laminierten und nicht-

gefärbten Zellen, die direkt nach der Zellisolation hergestellt wurden, zeigten im Western Blot

eine weniger starke Expression der COX-2 (siehe Abschnitt 5.2.1. und Abb.5.5.). Im

Folgenden wurde außerdem die COX-2-Expression in ganzen Rattenherzen untersucht. Dabei

stand die Frage im Vordergrund, ob durch eine 10-minütige „stop-flow“-Ischämie eine

verstärkte COX-2-Expression induziert wird. Dazu wurden Proteinextrakte aus Herzen

hergestellt, die bezüglich der Dauer der Reperfusion nach Ischämie unterschiedlich

vorbehandelt waren. Da die COX-2 frühestens ca. 2-3 h nach ihrer Induktion auf Proteinebene

nachgewiesen werden kann (Bezugla et al. 2005), wurden die Herzen nach Ischämie für 3 h

oder 5 h reperfundiert. Tabelle 5.1. fasst die verschiedenen Ansätze und die entsprechenden

Kontrollen bezüglich der Perfusions- bzw. Reperfusionsdauer zusammen.

Ansatz Dauer der

Reperfusion nach

Ischämie

Dauer der Perfusion

insgesamt

(Vorperfusion und

Reperfusion)

Perfusion von

Kontrollherz (ohne

Ischämie)

0 h Perfusion --- --- 0 h

30 min Perfusion 0 h 30 min 30 min

3 h Reperfusion 3 h 30 min und 3 h 3 ½ h

5 h Reperfusion 5 h 30 min und 5 h 5 ½ h

Tabelle 5.1. Perfusions-und Reperfusionsdauer bei Vorbehandlung der Herzen zur COX-2-Expressionsanalyse. Aus den Rattenherzen wurden Proteinextrakte gewonnen, die im Western Blot auf Expression der COX-2 analysiert wurden.

Abb.5.11.a. und b. zeigt die Ergebnisse der Western Blot-Analyse der verschiedenen

Extrakte. Die Rattenherzen exprimierten die COX-2 im Western Blot basal auf niedrigem

Level (Ansatz „0 h Perfusion“), nach 30 Minuten Vorperfusion und 0 h oder 3 h Reperfusion

konnte im Western Blot eine stärkere COX-2-Expression in den ischämischen Herzen

nachgewiesen werden. Die nicht-ischämischen Kontrollherzen zeigten ein ähnliches Bild.

Nach einer Reperfusionsphase von 5 h war die COX-2-Expression noch stärker als nach der

5 Ergebnisse

82

3-stündigen Reperfusionsphase. Dieser Anstieg konnte wiederum auch in den nicht-

ischämischen Kontrollherzen nachgewiesen werden.

Abb.5.11a. Western Blot-Analyse der Expression von COX-2 in adulten Rattenherzen. Als Positivkontrolle diente der Nachweis von COX-2 in Lysat von RAW264.7-Zellen (Spur 1). Die Herzen wurden für 30 Minuten perfundiert und für 10 Minuten in den Zustand einer Totalischämie versetzt (Spur 3). Als Kontrolle dienten Herzen, die gar nicht oder für 30 Minuten perfundiert wurden (Spur 2 und 4). Die COX-2-Expression wurde außerdem in Herzen untersucht, die für 3 h und 5 h reperfundiert wurden (Spur 5 und 7). Die entsprechenden Kontrollen ohne 10-minütige Ischämie sind in Spur 6 (3 ½ h Gesamtperfusion) und 8 (5 ½ h Gesamtperfusion) gezeigt. Die Grafik zeigt beispielhaft einen repräsentativen Western Blot von n=3 Experimenten mit verschiedenen Extrakten.

Abb.5.11.b. Densitometrische Auswertung der COX-2-Analyse aus Abb.5.11.a.. Die Farbdichte der Banden wurde mit Hilfe des Programms SigmaGel ermittelt. Die Daten für die verschiedenen Extrakte wurden prozentual zur Farbdichte der Positivkontrolle (COX-2 in Lysat von RAW264.7-Zellen) in Beziehung gesetzt. In die Darstellung sind die Ergebnisse von n=3 Western Blots mit verschiedenen Extrakten einbezogen (Mittelwerte±Standardfehler). Abkürzungen: I=Ischämisches Herz; K=nicht-ischämisches Kontrollherz.

0

30

60

90

120

%

Pos

itivk

ontr

olle

0 ½ ½ 3 ½ 3 ½ 5 ½ 5 ½ h Perfusion

K

I K I K

I K

1 2 3 4 5 6 7 8

COX-2 (72 kDa)

5 Ergebnisse

83

Für die Analysen in Abb.5.11.a. und b. wurden Extrakte aus den kompletten Rattenherzen

verwendet, da aus ischämischen Herzen keine intakten Kardiomyozyten isoliert werden

konnten. Die COX-2-Expression in diesen Extrakten kann damit nicht allein den

Kardiomyozyten zugeordnet werden. Das warf die Frage auf, ob auch die anderen Zelltypen

in den Herzen COX-2 exprimieren. Während der Zellisolation wurden die Kardiomyozyten

durch Zentrifugation von anderen Zelltypen im Herzen (z.B. Fibroblasten) abgetrennt.

Aufgrund ihrer Größe im Vergleich zu anderen Zellen setzten sich die Kardiomyozyten schon

bei niedriger Drehzahl ab, der Überstand enthielt den „Nicht-Kardiomyozyten-Zellanteil“.

Dieser Überstand wurde lysiert und auf Expression der COX-2 getestet. Abb.5.11.c. zeigt die

Ergebnisse der Analyse. Die COX-2 konnte auch im „Nicht-Kardiomyozyten-Anteil“

nachgewiesen werden.

Abb.5.11.c. Western Blot-Analyse der Expression von COX-2 im „Nicht-Kardiomyozyten-Zellanteil“ adulter Rattenherzen. COX-2 in RAW264.7-Zellen (Positivkontrolle, Spur 1), COX-2 im „Nicht-Kardiomyozyten-Zellanteil“ aus zwei verschiedenen Zellisolationen (Spur 2 und 3). Die Abbildung zeigt beispielhaft eine repräsentative Western Blot-Analyse von n=3 Experimenten mit verschiedenen Lysaten.

5.3. Metabolismus von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat in

neonatalen Kardiomyozyten

Neonatale Kardiomyozyten sind direkt nach ihrer Isolation klein und kugelförmig. In Kultur

nehmen sie vor allem an Länge, weniger an Breite zu und bilden Ausläufer, über die sie Zell-

Zell-Kontakt zu ihren Nachbarzellen aufnehmen (Abb.5.12.). Einzelne Zellen können spontan

depolarisieren und Schrittmacherfunktion übernehmen. Über die Zell-Zell-Kontakte werden

Nachbarzellen zur Kontraktion angeregt. Innerhalb weniger Kulturtage bilden sich so

„Zellcluster“ aus, die spontan und autonom regelmäßig kontrahieren.

Eine Kultur von spontan kontrahierenden neonatalen Kardiomyozyten stellt ein

„natürlicheres“ System dar verglichen mit isolierten adulten Zellen, die nicht spontan

1 2 3

COX-2 (72 kDa)

5 Ergebnisse

84

kontrahieren und deshalb während der Messungen elektrisch stimuliert wurden. In weiteren

Messreihen wurde daher die Wirkung von IF und KF aus adulten Rattenherzen auf die

spontan schlagenden neonatalen Kardiomyozyten analysiert.

Abb.5.12. Neonatale Kardiomyozyten im Kulturverlauf. Direkt nach Isolation sind die Zellen kugelförmig. Am 3. Kulturtag haben einige Zellen bereits längliche Form und haben Ausläufer zu Nachbarzellen ausgebildet. Es sind noch kugelförmige Zellen zu erkennen. Am 7. Kulturtag sind überwiegend längliche Zellen vorhanden. Es haben sich autonom kontrahierende „Zellcluster“ ausgebildet.

5.3.1. Wirkung von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat auf

Schlagfrequenz und Calciummetabolismus

In den folgenden Messreihen wurden die Effekte der Effluate auf Schlagfrequenz und „ratio“

der isolierten neonatalen Kardiomyozyten detektiert. Im Lichtmikroskop sind die Zellränder

von neonatalen Kardiomyozyten nicht als schwarze, deutliche Umgrenzung zu erkennen wie

bei den adulten Zellen. Daher ist eine Analyse der Kontraktilität der neonatalen Zellen mit der

vorliegenden Messmethode nicht möglich.

Für die Messungen wurden Kardiomyozyten verwendet, die nach ca. 7-8 Kulturtagen

regelmäßig kontrahierten und eine Schlagfrequenz von mindestens 100 Schlägen pro Minute

aufwiesen. Die Zellen wurden nach Messung der Basalwerte von Schlagfrequenz und „ratio“

mit IF und KF inkubiert. Wie bei den adulten Zellen wurde die Schlagfrequenz und die

„ratio“ „akut“, 2 Minuten, 5 Minuten und 10 Minuten nach Zugabe der Effluate gemessen.

Bei den neonatalen Kardiomyozyten wurde zusätzlich eine Messung 15 Minuten nach Zugabe

der Effluate durchgeführt, um sicher zu gehen, dass die Kontraktion der spontan und autonom

kontrahierenden Zellen über den gesamten Messzeitraum stabil ist. Im Vergleich zu den

direkt nach Isolation 7. Kulturtag 3. Kulturtag

5 µm

40 µm

40 µm

5 Ergebnisse

85

adulten Zellen streuen bei neonatalen Zellen die Messergebnisse für die Schlagfrequenz und

die „ratio“ aus den verschiedenen Messzeitpunkten auch jenseits der „5-Minuten-Messung“

stärker. Für die Auswertung in Abb.5.13.a. und allen folgenden Experimenten wurden daher

Mittelwerte aus den Messergebnissen für die Schlagfrequenz und die „ratio“ aus allen

Messzeitpunkten gebildet und der Effekt der Effluate als reduzierend bewertet, wenn beide

Parameter um mindestens 10% gesenkt wurden. Nach Inkubation mit IF waren die

Schlagfrequenz und die „ratio“ der neonatalen Zellen deutlich reduziert. Eine Inkubation mit

KF beeinflusste die Schlagfrequenz und die „ratio“ hingegen nicht (Abb.5.13.a. und b.).

Abb.5.13.a. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Schlagfrequenz und „ratio“ von „Zellclustern“ aus neonatalen Kardiomyozyten. Mittels Fluoreszenzmikroskopie wurde die prozentuale Änderung von Schlagfrequenz und „ratio“ nach Zugabe der Effluate bestimmt. Aus den „Akut-, den 2-, 5-, 10- und 15-Minutenwerten“ wurden für jeden „Zellcluster“ Mittelwerte für die Schlagfrequenz und die „ratio“ berechnet. In die Darstellung sind die Messergebnisse von n=6 „Zellclustern“ (Mittelwerte ± Standardfehler) einbezogen. Den Ergebnissen liegen Messreihen mit IF und KF aus mindestens 3 verschiedenen Rattenherzen zugrunde.

nicht-ischämisches Effluat post-ischämisches Effluat

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

Ratio Schlagfrequenz

Ände

rung

im V

ergl

eich

zur

Bas

elin

e in

%

p<0,005 IF vs. KF

Wirkung der Effluate auf neonatale Kardiomyozyten

5 Ergebnisse

86

Abb.5.13.b. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Schlagfrequenz und „ratio“ von „Zellclustern“ aus neonatalen Kardiomyozyten „akut“, nach 2, 5, 10 und 15 Minuten. Die Daten sind als Mittelwerte für die prozentuale Änderung der basalen Werte („Baseline“) von Schlagfrequenz und „ratio“ ± Standardfehler für jeweils n=6 „Zellcluster“ dargestellt. In der Abbildung sind beispielhaft die Ergebnisse mit IF bzw. KF aus einem Rattenherzen dargestellt.

5.3.2. Rolle der Cyclooxygenase

Da IF auf neonatale Zellen reduzierend bezüglich Schlagfrequenz und „ratio“ wirkte, lag vor

dem Hintergrund der mit adulten Kardiomyozyten erzielten Ergebnisse die Vermutung nahe,

dass diese kardiodepressive Wirkung von IF über die Cyclooxygenase vermittelt wird. Im

Folgenden wurden daher neonatale Kardiomyozyten wie die adulten Zellen zunächst auf

Expression beider Cyclooxygenase-Isoformen COX-1 und COX-2 im Western Blot

untersucht. Für die Analyse wurden Zellen verwendet, die für 7 Tage in Kultur und

entsprechend den Vorbereitungen für die Fluoreszenzmikroskopie in Kulturgefäßen ausgesät

waren, die mit Fibronectin beschichtet wurden (siehe Abschnitt 4.2.3.). Abb.5.14. zeigt die

Ergebnisse der Analyse. Neonatale Kardiomyozyten exprimierten wie adulte Zellen beide

Isoformen der Cyclooxygenase.

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5Baseline akut 2 min 5 min 10 min 15 min

Schlagfrequenz nach IF Ratio nach IF Schlagfrequenz nach KF Ratio nach KF

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

Wirkung von IF

5 Ergebnisse

87

Abb.5.14.A. und B. Western Blot-Analyse der COX-1 und COX-2 in Lysaten von isolierten neonatalen Kardiomyozyten. Für die Analyse wurden Lysate von Kardiomyozyten verwendet, die entsprechend den Vorbereitungen für die Fluoreszenzmikroskopie 7 Kulturtage auf mit Fibronectin beschichteten Kulturplatten kultiviert waren. A. COX-1 in RSV-Lysat (Positivkontrolle, Spur 1), COX-1 in Lysat von neonatalen Kardiomyozyten (Spur 2). B. COX-2 in RAW264.7-Zellen (Positivkontrolle, Spur 1), COX-2 in Lysat von neonatalen Kardiomyozyten (Spur 2). Die Abbildung zeigt beispielhaft jeweils eine repräsentative Western Blot-Analyse von n=3 Experimenten für jeden Antikörper mit verschiedenen Lysaten.

Daher wurden im Folgenden neonatale Kardiomyozyten wie die adulten Zellen mit dem

unselektiven Cyclooxygenase-Inhibitor Indomethacin vorinkubiert und der Effekt von IF und

KF auf die vorbehandelten Zellen getestet. Abb.5.15. zeigt die Ergebnisse dieser Messreihe

für Schlagfrequenz und „ratio“ der neonatalen Kardiomyozyten. IF zeigte keine Wirkung auf

mit Indomethacin vorbehandelte Zellen, d.h. sowohl die Schlagfrequenz als auch die „ratio“

wurden nach Inkubation mit IF nicht reduziert.

Abb.5.15. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf die Schlagfrequenz und die „ratio“ von „Zellclustern“ aus neonatalen Kardiomyozyten, die mit Indomethacin (Indo) vorbehandelt oder unbehandelt waren. Mittels Fluoreszenzmikroskopie wurde die prozentuale Änderung der basalen Werte für Schlagfrequenz und „ratio“ nach Zugabe der Effluate bestimmt. Aus den „Akut-, den 2-, 5-, 10- und 15-Minutenwerten“ wurden für jeden „Zellcluster“ Mittelwerte für die Schlagfrequenz und die „ratio“ berechnet. In die Darstellung sind die Messergebnisse von n=6 „Zellclustern“ (Mittelwerte ± Standardfehler) einbezogen. Den Ergebnissen liegen Messreihen mit IF und KF aus mindestens 3 verschiedenen Rattenherzen zugrunde.

KF IF KF/Indo IF/Indo

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


Ände

rung

im V

ergl

eich

zur

Bas

elin

e in

%

p<0,005 IF vs. KF

COX-1 (ca. 70 kDa)

A. B.

1 2

COX-2 (72 kDa)

1 2

Hemmung der Cyclooxygenase durch Indomethacin

5 Ergebnisse

88

Um wie bei den adulten Zellen zwischen den Cyclooxygenase-Isoformen COX-1 und COX-2

differenzieren zu können, wurden die neonatalen Zellen wie die adulten mit dem selektiven

COX-1-Inhibitor SC-560 und den selekiven COX-2-Inhibitoren NS-398 und Lumiracoxib

vorbehandelt. Abb.5.16. und Abb.5.17.a. und b. zeigen die Ergebnisse der Messreihen. Nach

Vorbehandlung der neonatalen Kardiomyozyten mit dem COX-1-Inhibitor SC-560 wurden

die Schlagfrequenz und die „ratio“ der Kardiomyozyten durch Inkubation mit IF reduziert.

Abb.5.16. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Schlagfrequenz und „ratio“ von „Zellclustern“ neonataler Kardiomyozyten, die mit dem COX-1-Inhibitor SC-560 vorbehandelt oder unbehandelt waren. Die Daten sind entsprechend der Darstellung der Messergebnisse mit Indomethacin/IF bzw. KF (Abb.5.15.) zusammengefasst (Mittelwerte für Schlagfrequenz bzw. „ratio“ aus allen Messzeitpunkten für jeden „Zellcluster“; Mittelwerte ± Standardfehler für n=6 „Zellcluster“; mindestens 3 verschiedene IF bzw. KF).

Bei Vorbehandlung der Zellen mit den COX-2-Inhibitoren NS-398 und Lumiracoxib

hingegen war die reduzierende Wirkung von IF blockiert. Die reduzierende Wirkung von IF

ist somit vermutlich bei neonatalen Kardiomyozyten wie bei adulten Zellen abhängig von der

Cyclooxygenase-Isoform COX-2.

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


KF IF KF/ IF/ SC-560 SC-560

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

p<0,005 IF vs. KF p<0,005 IF/SC-560 vs. KF/SC-560

Hemmung der COX-1 durch SC-560

5 Ergebnisse

89

Abb.5.17.a. und b. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Schlagfrequenz und „ratio“ von neonatalen Kardiomyozyten, die mit den COX-2-Inhibitoren NS-398 und Lumiracoxib (Lum) vorbehandelt oder unbehandelt waren. Die Daten sind für beide Inhibitoren entsprechend der Darstellung der Messergebnisse mit Indomethacin/IF bzw. KF (Abb.5.15.) zusammengefasst (Mittelwerte für Schlagfrequenz bzw. „ratio“ aus allen Messzeitpunkten für jeden „Zellcluster“; Mittelwerte ± Standardfehler für n=6 „Zellcluster“; mindestens 3 verschiedene IF bzw. KF).

KF IF KF/ IF/ NS-398 NS-398

p<0,005 IF vs. KF

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


A. Hemmung der COX-2 durch NS-398

Ände

rung

im V

ergl

eich

zur

Bas

elin

e in

%

KF IF KF/Lum IF/Lum

p<0,005 IF vs. KF

B. Hemmung der COX-2 durch Lumiracoxib

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


5 Ergebnisse

90

Wie bei adulten Kardiomyozyten wurde für die Auswertung der Ergebnisse gestestet, ob die

verwendeten Inhibitoren eine Eigenwirkung auf Schlagfrequenz und „ratio“ der neonatalen

Zellen in den angewandten Konzentrationen zeigen. Hierzu wurden die neonatalen Zellen

nach Detektion der Basalwerte mit dem entsprechenden Inhibitor vorbehandelt und nach der

Vorinkubationszeit sowie nach Ablauf der Gesamtmesszeit die Schlagfrequenz und die

„ratio“ aufgenommen. Abb.5.18. zeigt die Ergebnisse der Testreihe am Beispiel von

Lumiracoxib. Wie Lumiracoxib zeigten auch Indomethacin, NS-398 und SC-560 keine

Eigenwirkung auf Schlagfrequenz und „ratio“ der neonatalen Zellen.

Abb.5.18. Wirkung von 0,1 µmolar Lumiracoxib auf Schlagfrequenz und „ratio“ von neonatalen Kardiomyozyten. Schlagfrequenz und „ratio“ wurden basal und nach 15 Minuten (Vorinkubationszeit) bzw. 30 Minuten nach Zugabe von Lumiracoxib (Gesamtmesszeit entsprechend der Messreihen mit Lum/IF bzw. KF) aufgenommen. Die Ergebnisse sind für jede Messreihe dargestellt als Mittelwerte der prozentualen Änderung der basalen Werte von Schlagfrequenz und „ratio“ ± Standardfehler für n=6 „Zellcluster“.

5.4. Signaltransduktion „downstream“ der COX-2 in adulten Kardiomyozyten

IF reduzierte im Gegensatz zu KF die Zellverkürzung und die „ratio“ bei adulten Zellen und

die Schlagfrequenz und die „ratio“ bei neonatalen Kardiomyozyten. Die Reduktion zeigte sich

bei adulten wie bei neonatalen Kardiomyozyten abhängig von der COX-2. Wie bereits in

Abschnitt 1.4.3. ausführlich erläutert wurde, katalysiert die COX-2 die Umsetzung von

Arachidonsäure oder analogen Verbindungen zu Prostaglandin H, das als kurzlebiges

nach 15 Minuten nach 30 Minuten

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


Ände

rung

im V

ergl

eich

zur

Bas

elin

e in

%

Wirkung von Lumiracoxib auf die „Baseline“

5 Ergebnisse

91

Zwischenprodukt über Subklassen-spezifische Synthasen zu den Prostaglandinen der Klassen

D, E, F und I und Thromboxanen umgesetzt wird. Die Prostaglandine vermitteln ihre

Wirkung über Subklassen-spezifische Rezeptoren. Abb.5.19. fasst die möglichen Signalwege

„downstream“ der COX-2 zusammen und zeigt die mögliche intrazelluläre Umsetzung von IF

auf. Als mögliche Mediatoren „downstream“ der COX-2 kommen die Prostaglandin-

Rezeptoren der verschiedenen Subklassen und der Thromboxan-Rezeptor in Betracht. Deren

Rolle in Reduktion von Zellverkürzung und „ratio“ von adulten Kardiomyozyten wurde daher

im Folgenden untersucht.

Abb.5.19. Schematische Darstellung der möglichen Stoffwechsel- und Signalwege „downstream“ der COX-2 für Arachidonsäure oder analoge Verbindungen bzw. für das post-ischämische Effluat (IF).

5.4.1. Expression von Prostaglandin-Rezeptoren in adulten Kardiomyozyten

Vor der Durchführung der funktionellen Versuche wurden adulte Kardiomyozyten auf

Expression der Rezeptortypen im Western Blot untersucht. Hierzu wurden Lysate von

Kardiomyozyten hergestellt, die wie bei den Untersuchungen zur Expression der

Cyclooxygenase entsprechend den Vorbereitungen für die Mikroskopie laminiert waren

Arachidonsäure (AA) oder analoge Verbindung

Prostaglandin H

Spezifische Synthasen: Prostaglandin D-, E-, F-, I- und Thromboxan-Synthase

Prostaglandin D, E, F, I und Thromboxane

Prostaglandin-Rezeptoren DP1/DP2, EP1-4, FP, IP, TP

COX-2

Post-ischämisches Effluat (IF)

COX-2

5 Ergebnisse

92

(siehe Abschnitt 4.4.1.). Abb.5.20.A.-I. zeigt die Ergebnisse der Western Blot-Analyse. Für

jeden Rezeptorsubtyp wurden Lysate aus verschiedenen Zellisolationen auf Expression

getestet. In allen getesteten Lysaten waren der DP1- und DP2-Subtyp der Rezeptoren für

Prostglandin D, für Prostaglandin E die Subtypen EP1-4, der IP- und der TP-Rezeptor

exprimiert. Der FP-Rezeptor konnte in allen untersuchten Lysaten im Western Blot nicht

nachgewiesen werden. Der Nachweis des DP2-, EP1- und TP-Rezeptors zeigte sich im

Western Blot als „Doppelbande“. Nach Herstellerangaben von Cayman Chemical reagiert der

Antikörper mit verschiedenen Varianten der Rezeptoren, die unterschiedlich posttranslational

z.B. durch Glykosylierungen modifiziert sind.

Abb.5.20.A. und B. Analyse der Expression von Prostaglandin-Rezeptoren in Lysaten von adulten Kardiomyozyten. A. Expression des Prostaglandin D-Rezeptors DP1 in Lysat von RAW264.7-Zellen (Spur 1), in Lysaten aus zwei verschiedenen Kardiomyozytenisolationen (Spur 2 und 3) und anti-DP1-Negativkontrolle für Spur 2 und 3 (Antikörper mit Peptid blockiert in Spur 4 und 5); B. Expression des Prostaglandin D-Rezeptors DP2 in Lysat von RAW264.7-Zellen (Spur 1), in Lysaten aus zwei verschiedenen Kardiomyozytenisolationen (Spur 2 und 3) und anti-DP2-Negativkontrolle für Spur 2 und 3 (Antikörper mit Peptid blockiert in Spur 4 und 5). Die Abbildung zeigt beispielhaft jeweils eine repräsentative Western Blot-Analyse von n=3 Experimenten mit verschiedenen Lysaten für jeden Antikörper.

Abb.5.20.C.-F. Analyse der Expression von Prostaglandin-Rezeptoren in Lysaten von adulten Kardiomyozyten. C. Expression des Prostaglandin E-Rezeptors EP1 in Lysat von RAW264.7-Zellen (Spur 1), in Lysaten aus zwei verschiedenen Kardiomyozytenisolationen (Spur 2 und 3) und anti-EP1-Negativkontrolle für Spur 2 und 3 (Antikörper mit Peptid blockiert in Spur 4 und 5); D. Expression des Prostaglandin E-Rezeptors EP2 in Lysat von RAW264.7-Zellen (Spur 1), in Lysaten aus zwei verschiedenen Kardiomyozytenisolationen (Spur 2 und 3) und anti-EP2-Negativkontrolle für Spur 2 und 3 (Antikörper mit Peptid blockiert in Spur 4 und 5); E. Expression des Prostaglandin E-Rezeptors EP3 in Lysat von RAW264.7-Zellen (Spur 1), in RSV-Lysat (Spur 2), in Lysaten aus zwei verschiedenen Kardiomyozytenisolationen (Spur 3 und 4) und anti-EP3-Negativkontrolle für Spur 3 und 4 (Antikörper mit Peptid blockiert in Spur 5 und 6); F. Expression des Prostaglandin E-Rezeptors EP4 in RAW264.7-Lysat (Spur 1),in Lysaten aus zwei verschiedenen Kardiomyozytenisolationen (Spur 2 und 3) und anti-EP4-Negativkontrolle für Spur 2 und 3 (Antikörper mit Peptid blockiert in Spur 4 und 5). Die Abbildung zeigt beispielhaft jeweils eine repräsentative Western Blot-Analyse von n=3 Experimenten mit verschiedenen Lysaten für jeden Antikörper.

1 2 3 4 5

DP2 (ca. 35 kDa)

A.

B.

1 2 3 4 5

DP1 (43 kDa)

1 2 3 4 5

EP1 (ca. 40 kDa)

1 2 3 4 5 6

EP3 (53 kDa)

1 2 3 4 5

EP2 (52 kDa)

EP4 (52 kDa)

C.

D.

E.

F.

1 2 3 4 5

5 Ergebnisse

93

Abb.5.20.G. Analyse der Expression von Prostaglandin-Rezeptoren in Lysaten von adulten Kardiomyozyten. G. Expression des Prostaglandin I-Rezeptors IP in RAW264.7-Lysat (Spur 1), in Mikrosomenpräparationen von murinen Makrophagen (Spur 2), in Lysaten aus zwei verschiedenen Kardiomyozytenisolationen (Spur 3 und 4) und anti-IP-Negativkontrolle für Spur 3 und 4 (Antikörper mit Peptid blockiert in Spur 5 und 6). Die Abbildung zeigt beispielhaft eine repräsentative Western Blot-Analyse von n=3 Experimenten mit verschiedenen Lysaten.

Abb.5.20.H. Analyse der Expression von Prostaglandin-Rezeptoren in Lysaten von adulten Kardiomyozyten. H. Expression des Prostaglandin F-Rezeptors FP in RSV-Lysat (Spur 1), in Lysaten aus zwei verschiedenen Kardiomyozytenisolationen (Spur 2 und 3) und anti-FP-Negativkontrolle für Spur 2 und 3 (Antikörper mit Peptid blockiert in Spur 4 und 5). Die Abbildung zeigt beispielhaft eine repräsentative Western Blot-Analyse von n=3 Experimenten mit verschiedenen Lysaten.

Abb.5.20.I. Analyse der Expression von Prostaglandin-Rezeptoren in Lysaten von adulten Kardiomyozyten. I. Expression des Thromboxan-Rezeptors TP in Lysat von RAW264.7-Zellen (Spur 1), in RSV-Lysat (Spur 2), in Lysaten aus zwei verschiedenen Kardiomyozytenisolationen (Spur 3 und 4) und anti-TP-Negativkontrolle für Spur 3 und 4 (Antikörper mit Peptid blockiert in Spur 5 und 6). Die Abbildung zeigt beispielhaft eine repräsentative Western Blot-Analyse von n=3 Experimenten mit verschiedenen Lysaten.

5.4.2. Rolle von Prostaglandin-Rezeptoren in der Wirkung von post-ischämischem

Effluat

Der Effekt von IF und KF auf die isolierten Kardiomyozyten wurde nach Vorbehandlung der

Zellen mit Antagonisten untersucht, die selektiv die Prostaglandin-Rezeptoren der

Prostaglandin-Subklassen D, E, I und den Thromboxan-Rezeptor blockieren. Die isolierten

Kardiomyozyten wurden hierzu mit den verschiedenen Antagonisten vorinkubiert und der

Effekt von IF und KF auf Zellverkürzung und „ratio“ der vorinkubierten Zellen getestet.

BW A868C antagonisiert DP1- und DP2-Rezeptoren. Auf Zellen, die mit diesem

Antagonisten vorbehandelt wurden, wirkte IF im Gegensatz zu KF negativ-inotrop. Das

Ergebnis bezüglich der DP2-Rezeptoren konnte mit dem Antagonisten BAY-u3405 bestätigt

werden, der hochselektiv den DP2-Subtyp inhibiert. Abb.5.21.a. und b. zeigen die Ergebnisse

1 2 3 4 5 6

TP (64 kDa)

I.

1 2 3 4 5

FP (ca. 64 kDa)

H.

1 2 3 4 5 6

IP (40 kDa)

G.

5 Ergebnisse

94

der Messreihen für die beiden Antagonisten. Für BAY-u3405 konnten auch inhibierende

Effekte auf TP-Rezeptoren nachgewiesen werden.

Abb.5.21.a. und b. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten, die mit dem DP-Rezeptor-Antagonisten BW A868C oder dem DP2-/TP-Antagonisten BAY-u3405 vorbehandelt oder unbehandelt waren. Mittels Fluoreszenzmikroskopie wurde die prozentuale Änderung der basalen Werte („Baseline“) von Zellverkürzung und „ratio“ nach Zugabe der Effluate bestimmt. Für jede Messreihe mit IF bzw. KF sind die Daten als Mittelwerte der „5-Minutenwerte“ (5 Minuten nach „Akutmessung“) ± Standardfehler für jeweils n=6 Kardiomyozyten aus veschiedenen Zellisolationen dargestellt. Den Ergebnissen liegen Messreihen mit IF und KF aus mindestens 3 verschiedenen Rattenherzen zugrunde.

KF IF KF/ IF/ BAY-u3405 BAY-u3405

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

p<0,001 IF vs. KF p<0,001 IF/BAY-u3405 vs. KF/BAY-u3405

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


KF IF KF/ IF/ BW A868C BW A868C

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

p<0,001 IF vs. KF p<0,001 IF/BW A868C vs. KF/BW A868C

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


A. Blockieren von DP-Rezeptoren

B. Blockieren von DP2-/TP-Rezeptoren

5 Ergebnisse

95

Da BAY-u3405 aber nur ein nieder-affiner Antagonist für TP-Rezeptoren ist und nur in

einzelnen Studien als Antagonist für diese Rezeptoren nachgewiesen werden konnte, wurden

außerdem Messreihen mit dem hochselektiven TP-Rezeptor-Antagonisten SQ 29,548

durchgeführt. Abb.5.22. fasst die Ergebnisse der Messreihe zusammen. SQ 29,548

beeinflusste wie BAY-u3405 die negativ-inotrope Wirkung von IF nicht.

Abb.5.22. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten, die mit dem TP-Rezeptor-Antagonisten SQ 29,548 vorbehandelt oder unbehandelt waren. Die Daten sind entsprechend der Darstellung der Messergebnisse mit den Antagonisten BW A868C/BAY-u3405/IF bzw. KF zusammengefasst (Mittelwerte der „5-Minutenwerte“ für Zellverkürzung bzw. „ratio“ ± Standardfehler für n=6 Kardiomyozyten; mindestens 3 verschiedene IF bzw. KF).

AH 6809 inhibiert in Zellen der Ratte DP1-, EP1- und EP2-Rezeptoren. Kardiomyozyten, die

mit AH 6809 vorbehandelt waren, reagierten auf die Inkubation mit IF nur schwach negativ-

inotrop. Die Zellverkürzung wurde nach Inkubation mit IF um ca. 9% und die „ratio“ um ca.

6% reduziert (Abb.5.23.a.). Um zwischen EP1- und EP2-Rezeptoren differenzieren zu

können, wurden Messreihen mit dem Antagonisten SC 19220 durchgeführt, der selektiv EP1-

Rezeptoren inhibiert. Mit SC 19220 vorbehandelte Zellen reagierten im Gegensatz zu

unbehandelten Zellen auf die Inkubation mit IF deutlich negativ-inotrop (Abb.5.23.b.).

KF IF KF/ IF/ SQ 29,548 SQ 29,548

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

p<0,001 IF vs. KF p<0,001 IF/SQ 29,548 vs. KF/SQ 29,548

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5


Blockieren von TP-Rezeptoren

5 Ergebnisse

96

Abb.5.23.a. und b. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten, die mit dem DP1-/EP1-/EP2-Rezeptor-Antagonisten AH 6809 oder dem EP1-selektiven Antagonisten SC 19220 vorbehandelt oder unbehandelt waren. Die Daten sind entsprechend der Darstellung der Messergebnisse mit den Antagonisten BW A868C/BAY-u3405/IF bzw. KF zusammengefasst (Mittelwerte der „5-Minutenwerte“ für Zellverkürzung bzw. „ratio“ ± Standardfehler für n=6 Kardiomyozyten; mindestens 3 verschiedene IF bzw. KF).

KF IF KF/ IF/ SC 19220 SC 19220

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

p<0,001 IF vs. KF p<0,001 IF/SC 19220 vs. KF/SC 19220

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


B. Blockieren von EP1-Rezeptoren

KF IF KF/ IF/ AH 6809 AH 6809

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

p<0,001 IF vs. KF p<0,01 IF/AH 6809 vs. KF/AH 6809 p<0,01 IF vs. IF mit AH 6809

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5


A. Blockieren von DP1-/EP1-/EP2-Rezeptoren

5 Ergebnisse

97

Nach aktuellem Stand der Literatur gibt es neben den Antagonisten für EP1- und EP2-

Rezeptoren mit AH 23848 einen Antagonisten für EP4-Rezeptoren. Isolierte Kardiomyozyten

wurden daher mit AH 23848 vorinkubiert und die Wirkung von IF und KF auf

Zellverkürzung und „ratio“ dieser Zellen getestet. In Abb.5.24. sind die Ergebnisse der

Messreihe mit diesem Antagonisten dargestellt. Bei dieser Messreihe zeigten sich ähnliche

Ergebnisse wie bei den Experimenten mit AH 6809. IF wirkte im Gegensatz zu KF auf mit

AH 23848 vorbehandelte Zellen nur schwach negativ-inotrop. Die Zellverkürzung wurde um

10% und die „ratio“ um ca. 7% im Vergleich zu den Basalwerten reduziert.

Abb.5.24. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten, die mit dem EP4-Rezeptor-Antagonisten AH 23848 vorbehandelt oder unbehandelt waren. Die Daten sind entsprechend der Darstellung der Messergebnisse mit den Antagonisten BW A868C/BAY-u3405/IF bzw. KF zusammengefasst (Mittelwerte der „5-Minutenwerte“ für Zellverkürzung bzw. „ratio“ ± Standardfehler für n=6 Kardiomyozyten; mindestens 3 verschiedene IF bzw. KF).

Außer dem DP1-, DP2-, dem EP1-4- und dem TP-Rezeptor konnte in Kardiomyozytenlysaten

im Western Blot auch der IP-Rezeptor nachgewiesen werden (siehe Abb.5.20.G.). Daher

wurden in einer weiteren Messreihe Kardiomyozyten mit dem IP-Rezeptor-Antagonisten

CAY 10441 vorinkubiert und die Effekte von IF und KF auf die vorbehandelten Zellen

untersucht. Abb.5.25. fasst die Ergebnisse der Messreihe zusammen.Vorinkubation mit

CAY 10441 beeinflusste die negativ-inotrope Wirkung von IF nicht.

KF IF KF/ IF/ AH 23848 AH 23848

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


Blockieren von EP4-Rezeptoren

p<0,001 IF vs. KF p<0,01 IF/AH 23848 vs. KF/AH 23848 p<0,01 IF vs. IF mit AH 23848

5 Ergebnisse

98

Abb.5.25. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten, die mit dem IP-Rezeptor-Antagonisten CAY 10441 vorbehandelt oder unbehandelt waren. Die Daten sind entsprechend der Darstellung der Messergebnisse mit den Antagonisten BW A868C/BAY-u3405/IF bzw. KF zusammengefasst (Mittelwerte der „5-Minutenwerte“ für Zellverkürzung bzw. „ratio“ ± Standardfehler für n=6 Kardiomyozyten; mindestens 3 verschiedene IF bzw. KF).

Der negativ-inotrope Effekt von IF wurde durch Vorbehandlung der Zellen mit AH 6809 oder

AH 23848 deutlich reduziert, aber nicht vollständig inhibiert. Wurden die Zellen in einer

weiteren Messreihe mit AH 6808 und AH 23848 vorbehandelt, zeigte IF keine Auswirkungen

auf Zellverkürzung und „ratio“ der Kardiomyozyten (Abb.5.26.).

Alle in der vorliegenden Arbeit eingesetzten selektiven Prostaglandin-Rezeptor-Antagonisten

wurden entsprechend der Testreihen mit Indomethacin auf Effekte auf die Basalwerte der

isolierten Kardiomyozyten getestet. Alle verwendeten Antagonisten zeigten keine

Beeinflussung der basalen Messwerte für Zellverkürzung und „ratio“.

KF IF KF/ IF/ CAY 10441 CAY 10441

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

p<0,001 IF vs. KF p<0,001 IF/CAY 10441 vs. KF/CAY 10441

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


Blockieren von IP-Rezeptoren

5 Ergebnisse

99

Abb.5.26. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten, die mit den DP1-/EP1-/EP2-Rezeptor-Antagonisten AH 6809 und dem EP4-Antagonisten AH 23848 vorbehandelt oder unbehandelt waren. Die Daten sind entsprechend der Darstellung der Messergebnisse mit den Antagonisten BW A868C/BAY-u3405/IF bzw. KF zusammengefasst (Mittelwerte der „5-Minutenwerte“ für Zellverkürzung bzw. „ratio“ ± Standardfehler für n=6 Kardiomyozyten; mindestens 3 verschiedene IF bzw. KF).

Die Rezeptoren für die Prostaglandine und für Thromboxane sind in der

Cytoplasmanmembran lokalisiert und weisen eine unterschiedliche Signaltransduktion auf.

Sie vermitteln Signale über eine Aktivierung/Inhibierung der Proteinkinase A und/oder eine

Aktivierung der Proteinkinase C (Abb.5.27.A. und B.). Nach den Ergebnissen aus den

Messreihen mit den verschiedenen Prostaglandin-Rezeptor-Antagonisten wird der Effekt von

IF vermutlich über die Rezeptoren EP2 und EP4 vermittelt. Beide Rezeptorsubtypen

vermitteln nach aktuellem Stand der Literatur ihre Signale über Gs-Proteine, d.h. über eine

Aktivierung der Proteinkinase A.

KF IF KF/ IF/ AH6809+AH23848 AH6809+AH23848

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

p<0,001 IF vs. KF -30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5


Blockieren von EP2- und EP4-Rezeptoren

5 Ergebnisse

100

Abb.5.27.A. und B. Schematische Darstellung der möglichen Signaltransduktion von G-Protein-gekoppelten Prostaglandin-Rezeptoren DP1 und DP2, EP1-4, FP, IP und TP in der Cytoplasma-Membran nach Waldner 2002 (Okuda-Ashitaka et al. 1994, Nagata und Hirai 2003, Simmons et al. 2004, Xiao et al. 2004, Hara et al. 2005, Wang und Klein 2007). A. Signaltransduktion über Aktivierung oder Inhibierung der Proteinkinase A (PKA). B. Signaltransduktion über Aktivierung der Proteinkinase C (PKC). Abkürzungen: in A. ATP- Adenosintriphosphat; cAMP- zyklisches Adenosinmonophosphat; AC- Adenylat-Zyklase; Gi, Gs, Gq- PKA-inhibierendes, PKA-stimulierendes oder PKC-stimulierendes G-Protein. in B. PIP2- Phosphoinositoldiphosphat; PLC�- Phospholipase C�; IP3- Inositol-1,4,5-trisphosphat; DAG- Diacylglycerol.

In weiteren Messreihen wurden daher außerdem isolierte adulte Kardiomyozyten mit dem

Proteinkinase A-Inhibitor Rp-cAMPS vorbehandelt und die Wirkung von IF und KF auf die

vorbehandelten Kardiomyozyten getestet. Abb.5.28. zeigt die Ergebnisse der Messreihe mit

diesem Inhibitor. Nach Vorbehandlung der Kardiomyozyten mit Rp-cAMPS wurden

Zellverkürzung und „ratio“ der Zellen durch IF wie durch KF nicht reduziert.

DP1, EP2, EP4, IP DP2, EP3, IP

DP2, EP1, EP3, IP, FP, TP

A.

B.

5 Ergebnisse

101

Abb.5.28. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten, die mit dem Proteinkinase A-Inhibitor Rp-cAMPS vorbehandelt oder unbehandelt waren. Mittels Fluoreszenzmikroskopie wurde die prozentuale Änderung der basalen Werte („Baseline“) von Zellverkürzung und „ratio“ nach Zugabe der Effluate bestimmt. Für jede Messreihe mit IF bzw. KF sind die Daten als Mittelwerte der „5-Minutenwerte“ (5 Minuten nach „Akutmessung“) ± Standardfehler für jeweils n=6 Kardiomyozyten aus verschiedenen Zellisolationen dargestellt. Den Ergebnissen liegen Messreihen mit IF und KF aus mindestens 3 verschiedenen Rattenherzen zugrunde.

Nach Vorinkubation der Zellen mit dem Proteinkinase C-Inhibitor Myr-PKC[19-27] zeigte IF

im Gegensatz zu KF eine negativ-inotrope Wirkung auf die Kardiomyozyten (Abb.5.29).

Folglich konnte durch Inhibierung der Proteinkinase A und nicht durch Inhibierung der

Proteinkinase C die reduzierende Wirkung von IF auf Zellverkürzung und „ratio“ der

Kardiomyozyten aufgehoben werden. Demnach wird der negativ-inotrope Effekt von IF

vermutlich über eine Aktivierung der Proteinkinase A vermittelt.

Rp-cAMPS und Myr-PKC[19-27] zeigten in Testreihen keine Eigenwirkung auf die

„Baseline“ der Zellen bezüglich Zellverkürzung und „ratio“.

KF IF KF/ IF/ Rp-cAMPS Rp-cAMPS

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

p<0,001 IF vs. KF

Hemmung der Proteinkinase A

5 Ergebnisse

102

Abb.5.29. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten, die mit dem Proteinkinase C-Inhibitor Myr-PKC[19-27] vorbehandelt oder unbehandelt waren. Die Daten sind entsprechend der Darstellung der Messergebnisse mit Rp-cAMPS/IF bzw. KF zusammengefasst (Mittelwerte der „5-Minutenwerte“ für Zellverkürzung bzw. „ratio“ ± Standardfehler für n=6 Kardiomyozyten; mindestens 3 verschiedene IF bzw. KF).

Die Proteinkinase A wird durch cAMP aktiviert. Um die Ergebnisse aus den Messreihen mit

den Inhibitoren zu bestätigen, wurden daher in weiteren Experimenten laminierte

Kardiomyozyten mit den Effluaten für 5 Minuten in einer Verdünnung von 1:4 in

Versuchspuffer vorinkubiert, Lysate von den vorinkubierten Zellen hergestellt und im ELISA

die Konzentration an cAMP in den Lysaten bestimmt. Abb.5.30. zeigt die Ergebnisse der

Konzentrationsbestimmungen. Die Konzentration an cAMP in Lysaten von Zellen, die mit IF

vorinkubiert wurden, war deutlich erhöht im Vergleich zu Lysaten von Kardiomyozyten, die

mit KF vorinkubiert wurden. Die cAMP-Konzentration in den mit IF vorbehandelten Lysaten

war vergleichbar mit der Konzentration an cAMP in mit Isoproterenol vorinkubierten Zellen,

die als Positivkontrolle verwendet wurden. Dieses Ergebnis bestätigt wiederum die Resultate

aus den Messreihen mit den Proteinkinase-Inhibitoren und des weiteren das Ergebnis, dass

Proteinkinase A-abhängige EP2- und EP4-Rezeptoren an der Vermittlung des negativ-

inotropen Effekts von IF beteiligt sind.

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5


Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

KF IF KF/ IF/ Myr-PKC[19-27] Myr-PKC[19-27]

p<0,001 IF vs. KF p<0,001 IF/Myr-PKC[19-27] vs. KF/Myr-PKC[19-27]

Hemmung der Proteinkinase C

5 Ergebnisse

103

Abb.5.30. Bestimmung der cAMP-Konzentration in adulten Kardiomyozyten, die für 5 Minuten mit post-ischämischem Effluat (Verdünnung 1:4 in Versuchspuffer), nicht-ischämischem Effluat (Verdünnung 1:4 in Versuchspuffer) oder als Positivkontrolle mit Isoproterenol (5 µmolar) inkubiert wurden oder unbehandelt waren (Basalwert). Die cAMP-Konzentration wurde in pmol/mg Zellprotein bestimmt. Die Daten sind dargestellt als Mittelwerte ± Standardfehler für n=3 Experimente mit verschiedenen Lysaten.

Tabelle 5.2. fasst die Ergebnisse der Messreihen mit den verschiedenen Prostaglandin-

Rezeptor-Antagonisten und die mögliche Signaltransduktion der Prostaglandin-Rezeptoren

über die Proteinkinase A oder die Proteinkinase C zusammen (siehe auch Abb.5.27.). Der

negativ-inotrope Effekt von IF war nach Vorbehandlung der Kardiomyozyten mit dem

Antagonisten AH 6809 für DP1-/EP1-/EP2-Rezeptoren oder mit AH 23848 für EP4-

Rezeptoren deutlich abgeschwächt und durch gleichzeitige Anwendung beider Antagonisten

komplett aufgehoben. Für DP1-, EP2- und EP4-Rezeptoren konnte bislang ausschließlich eine

Signaltransduktion über eine Aktivierung der Proteinkinase A nachgewiesen werden, bei

EP1-Rezeptoren hingegen ausschließlich eine Signaltransduktion über eine Aktivierung der

Proteinkinase C. Auch TP-Rezeptoren zeigen eine Signaltransduktion über eine Aktivierung

der Proteinkinase C. Eine Sonderstellung in der Signaltransduktion nehmen DP2-, EP3- und

IP-Rezeptoren ein. Für DP2- und EP3-Rezeptoren konnten außer einer Proteinkinase C-

Aktivierung in Signalwegen eine Proteinkinase A-Inhibierung und für IP-Rezeptoren außer

einer Aktivierung der Proteinkinase C eine Aktivierung oder Inhibierung der Proteinkinase A

gezeigt werden. Die Wirkung von IF auf Zellverkürzung und „ratio“ der Kardiomyozyten

wird nach den vorliegenden Ergebnissen vermutlich über Aktivierung der Proteinkinase A

vermittelt (siehe Abb.5.28. und 5.30.), weshalb der EP3-Rezeptor, für den es keinen

pm

ol z

yklis

ches

AM

P/m

g Z

ellp

rote

in

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

KF IF Isoproterenol Basalwert

Effekt der Effluate auf die cAMP-Konzentration

5 Ergebnisse

104

kommerziell erhältlichen Antagonisten gibt, als Vermittler ausgeschlossen werden kann. Das

Ergebnis aus den Messreihen mit dem Proteinkinase A-Inhibitor Rp-cAMPS wurde außerdem

durch die Messreihen mit den Antagonisten BAY-u3405, SC 19220 und SQ 29,548 gegen

DP2-, EP1- und TP-Rezeptoren, die Proteinkinase C-abhängig bzw. über eine Inhibierung der

Proteinkinase A reagieren, bestätigt. Diese Antagonisten beeinflussten nämlich den Effekt

von IF nicht. Die Antagonisten CAY 10441 und BW A868C gegen IP- bzw. DP1-/DP2-

Rezeptoren beeinflussten den Effekt von IF im Gegensatz zu den Antagonisten AH 6809 und

AH 23848 ebenfalls nicht. Eine funktionelle Bedeutung des IP- und des DP1-Rezeptors kann

daher außerdem ausgeschlosen werden, und das Effluat vermittelt daher seine Wirkung auf

die isolierten Kardiomyozyten vermutlich über die Prostaglandin-Rezeptoren EP2 und EP4

abhängig von der Proteinkinase A.

Antagonist Selektivität in Ratte (Signalweg)

Änderung Zellverkürzung nach IF in % Änderung „ratio“ nach IF in %

Änderung Zellverkürzung nach KF in % Änderung „ratio“ nach KF in %

BW A868C DP1 (PKA-Aktivierung) DP2 (PKA-Inhibierung, PKC-Aktivierung)

-17 ± 3,4 -10 ± 2

2,8 ± 0,6 3,3 ± 0,7

BAY-u3405 DP2 (PKA-Inhibierung, PKC-Aktivierung) TP (PKC-Aktivierung, nieder-affiner Antagonist)

-17 ± 3,4 -10 ± 2

-0,4 ± 0,1 4 ± 0,8

SC 19220 EP1 (PKC-Aktivierung) -17,5 ± 3,5 -11 ± 2,2

2,8 ± 0,6 3,6 ± 0,7

AH 6809 DP1 (PKA-Aktivierung) EP1 (PKC-Aktivierung) EP2 (PKA-Aktivierung)

-9,5 ± 2 -5,8 ± 1,2

2,5 ± 1,3 1,5 ± 0,3

AH 23848 EP4 (PKA-Aktivierung) -10 ± 2 -6,7 ± 1,3

4,5 ± 0,9 3,3 ± 0,7

AH6809+AH23848 DP1 (PKA-Aktivierung) EP1 (PKC-Aktivierung) EP2 (PKA-Aktivierung) EP4 (PKA-Aktivierung)

-1,7 ± 0,3 1,4 ± 0,3

1,4 ± 0,3 1,8 ± 0,4

CAY 10441 IP (PKA-Aktivierung, PKA-Inhibierung, PKC-Aktivierung)

-22 ± 4,4 -10 ± 2

1,3 ± 0,3 5 ± 1

SQ 29,548 TP (PKC-Aktivierung) -21 ± 4,2 -12,8 ± 2,6

2,7 ± 0,5 2,9 ± 0,6

Tabelle 5.2. Zusammenfassung der Messergebnisse aus den Messreihen mit den verschiedenen Prostaglandin-Rezeptor-Antagonisten.

In der vorliegenden Arbeit wurden mit isolierten laminierten Kardiomyozyten

Immunfluoreszenzfärbungen gegen EP2- und EP4-Rezeptoren auf der Zelloberfläche

5 Ergebnisse

105

durchgeführt. Abb.5.31.A. und B. zeigen die Ergebnisse der Färbung. Beide Rezeptoren

konnten mittels Immunfluoreszenz auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden.

A.

B. Abb.5.31. A. und B. Nachweis der Prostaglandin-Rezeptoren EP2 und EP4 durch Immunfluoreszenzfärbung auf der Zelloberfläche von laminierten Kardiomyozyten. A. anti-EP2-Färbung von RAW264.7-Zellen (Bild A (1) 100x Vergrößerung, mit Kaninchenantikörper), von Kardiomyozyten (40x Vergrößerung in Bild A (2) mit DAPI-Kernfärbung und Kaninchenantikörper, in Bild A (3) ohne DAPI-Kernfärbung und mit Kaninchenantikörper, in Bild A (4) ohne DAPI-Kernfärbung und mit Mausantikörper) und entsprechende Kontrollfärbungen mit blockierten Antikörpern in Bild A (2a, 3a, 4a). B. anti-EP4-Färbung von RAW264.7-Zellen (Bild B (1) 100x Vergrößerung), von Kardiomyozyten (40x Vergrößerung in Bild B (2) mit DAPI-Kernfärbung, in Bild B (3) ohne DAPI-Kernfärbung und Kontrollfärbungen mit blockierten Antikörpern in Bild B (2a, 3a). Dargestellt sind repräsentative Färbeergebnisse ausgewählt aus insgesamt n=3 Experimenten für jeden Färbeansatz.

5.4.3. Wirkung von Prostaglandinen auf isolierte adulte Kardiomyozyten

Abb.5.32. fasst zusammen, wie nach den Ergebnissen aus den Abschnitten 5.2.-5.4. IF seine

Signaltransduktion in isolierten Kardiomyozyten vermittelt. Aus den Ergebnissen lässt sich

ableiten, dass die kardiodepressiven Mediatoren aus dem Effluat durch die COX-2 umgesetzt

werden und die COX-2-Produkte durch Aktivierung der Prostaglandin E-Rezeptoren EP2 und

EP4 über eine Aktivierung der Proteinkinase A ihre Signaltransduktion vermitteln. Endogener

Agonist für EP2 und EP4 ist primär Prostaglandin E, für Prostaglandin D und I ist ebenfalls

EP2 auf RAW264.7-Zellen (Positivkontrolle)

EP2 auf Kardiomyozyten (2,3,4) und Kontrollfärbungen (2a,3a,4a) (2) (3) (4)

(2a) (3a) (4a)

EP4 auf RAW264.7-Zellen (Positivkontrolle)

EP4 auf Kardiomyozyten (2,3) und Kontrollfärbungen (2a,3a) (2) (3)

(2a) (3a)

ca.25 µm

5 µm

ca.30 µm 5 µm

ca.30 µm ca.30 µm

ca.30 µm

(1)

(1)

5 Ergebnisse

106

eine Aktivierung von EP-Rezeptoren nachgewiesen worden (Tanaka et al. 2003, Shinmura et

al. 2005). Prostaglandin D, E und I sind Produkte der Cyclooxygenase und spezifischer

Isomerasen und kommen nach den bisherigen Ergebnissen als in den Kardiomyozyten aus IF

gebildete Mediatoren in Frage.

Abb.5.32. Schematische Zusammenfassung der Signaltransduktion des post-ischämischen Effluates entsprechend den Ergebnissen aus den Abschnitten 5.2.-5.4. und mögliche Zwischenprodukte im Signalweg. Außer für Prostaglandin E konnte auch für Prostaglandin D und I agonistische Wirkung auf EP-Rezeptoren nachgewiesen werden (Tanaka et al. 2003, Shinmura et al. 2005).

Vor diesem Hintergrund wurden in der vorliegenden Arbeit die Effekte der Prostglandine D2,

E2 und I2 auf Zellverkürzung und „ratio“ isolierter adulter Kardiomyozyten untersucht.

Hierzu wurden die Kardiomyozyten mit synthetisch hergestellten Prostaglandinen inkubiert

und die Änderungen im Vergleich zu den basalen Werten detektiert. Abb.5.33.-5.35. zeigen

die Ergebnisse der Messreihen mit den verschiedenen Prostaglandinen. Kardiomyozyten, die

Post-ischämisches Effluat (IF)

Prostaglandin H

Spezifische Synthasen: Prostaglandin D-, -E- und -I-Synthase

Prostaglandin D, E und I

Prostaglandin-Rezeptoren EP2 und EP4

COX-2

5 Ergebnisse

107

mit Prostaglandin D2 inkubiert wurden, zeigten keine Änderung bezüglich Zellverkürzung

und „ratio“ (Abb.5.33). Mit Prostaglandin E2 oder Prostaglandin I2 inkubierte Zellen

hingegen reagierten negativ-inotrop.

Abb.5.33. Effekt von Prostaglandin D2 auf die basalen Werte von Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten. Zellverkürzung und „ratio“ wurden nach 7 Minuten Inkubation mit Prostaglandin D2 aufgezeichnet (7 Minuten entsprechend der gesamten Inkubationszeit mit den Effluaten (2 Minuten Umspülung der Zellen + 5 Minuten Inkubation nach Stoppen der Pumpen zur Überleitung der Effluate)). Die Daten sind als Mittelwerte der prozentualen Änderung der basalen Werte von Zellverkürzung und „ratio“ ± Standardfehler für n=6 Kardiomyozyten aus verschiedenen Zellisolationen dargestellt.

Um außerdem bestimmen zu können, über welchen Rezeptor die negativ-inotrope

Signaltransduktion der Prostaglandine E2 und I2 in den Kardiomyozyten vermittelt wird,

wurden die Zellen mit den Antagonisten AH 6809 gegen DP1-/EP1-/EP2-Rezeptoren und

AH 23848 gegen EP4-Rezeptoren sowie CAY 10441 gegen IP-Rezeptoren und Rp-cAMPS

als Inhibitor der Proteinkinase A vorinkubiert. Der negativ-inotrope Effekt von Prostaglandin

E2 ließ sich durch Vorbehandlung der Kardiomyozyten mit AH6809 und AH 23848 oder

durch Vorinkubation mit Rp-cAMPS blockieren. Kardiomyozyten, die entweder mit AH 6809

oder AH 23848 vorinkubiert wurden, reagierten deutlich schwächer negativ-inotrop nach

Inkubation mit Prostaglandin E2 als Zellen, die mit keinem Antagonisten vorbehandelt waren

(Abb.5.34.a. und b.). Aus diesen Experimenten lässt sich ableiten, dass der Effekt von

Prostaglandin E2 auf die Kardiomyozyten vermutlich durch die Rezeptoren EP2 und EP4

vermittelt wird und somit Prostaglandin E2 eine dem post-ischämischem Effluat analoge

Signaltransduktion in isolierten adulten Kardiomyozyten aufweist. AH 6809 inhibiert außer

EP1-/EP2-Rezeptoren DP1-Rezeptoren, die auch abhängig von der Proteinkinase A reagieren.

Da Prostaglandin D2 als Agonist von DP-Rezeptoren auf isolierte Kardiomyozyten aber keine

-30

-20

-10

0

10


Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

Wirkung von Prostaglandin D2

5 Ergebnisse

108

Wirkung zeigte, ist eine Vermittlung des negativ-inotropen Effekts von Prostaglandin E2 über

DP1-Rezeptoren unwahrscheinlich.

Abb.5.34.a und b. Effekt von Prostaglandin E2 (PGE2) auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten. Die Zellen waren unbehandelt oder mit Rp-cAMPS, mit AH 6809 oder AH 23848 oder mit AH 6809 und AH 23848 vorinkubiert. Zellverkürzung und „ratio“ wurden nach 7 Minuten Inkubation mit Prostaglandin E2 aufgezeichnet (7 Minuten entsprechend der gesamten Inkubationszeit mit den Effluaten (2 Minuten Umspülung der Zellen + 5 Minuten Inkubation nach Stoppen der Pumpen zur Überleitung der Effluate)). Die Daten sind für jede Messreihe als Mittelwerte der prozentualen Änderung von Zellverkürzung und „ratio“ ± Standardfehler für n=6 Kardiomyozyten aus verschiedenen Isolationen dargestellt. Die Inhibitoren wurden entsprechend der Anwendung in den Messreihen mit IF bzw. KF eingesetzt (siehe Tabelle 3.3. bzw. 3.4.).

PGE2 PGE2/ PGE2/ PGE2/ AH 6809 AH23848 AH6809+AH23848

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


p<0,005 PGE2 vs. PGE2/AH 6809 oder PGE2 vs. PGE2/AH 23848 p<0,001 PGE2 vs. PGE2/AH6809+AH23848

B.

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0


Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

PGE2 PGE2/Rp-cAMPS

p<0,001 PGE2 vs. PGE2/Rp-cAMPS

A.

Effekt und Signalwege von Prostaglandin E2

5 Ergebnisse

109

Der negativ-inotrope Effekt von Prostaglandin I2 wurde durch Anwendung von AH 23848

und Rp-cAMPS blockiert. Wurden die Kardiomyozyten mit CAY 10441 oder AH 6809

vorbehandelt, ließ sich der negativ-inotrope Effekt nicht hemmen und die Zellverkürzung und

die „ratio“ der Kardiomyozyten wurden um ca. 20 bzw. ca. 12% reduziert (Abb.5.35.a. und

b.). Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass der negativ-inotrope Effekt von Prostaglandin I2

nicht über IP-Rezeptoren vermittelt wird, sondern vermutlich durch Proteinkinase A-

abhängige EP4-Rezeptoren.

Abb.5.35.a und b. Effekt von Prostaglandin I2 (PGI2) auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten. Die Zellen waren unbehandelt oder mit Rp-cAMPS, mit AH 6809 oder AH 23848 vorbehandelt. Zellverkürzung und „ratio“ wurden nach 7 Minuten Inkubation mit Prostaglandin I2 aufgezeichnet (7 Minuten entsprechend der gesamten Inkubationszeit mit den Effluaten (2 Minuten Umspülung der Zellen + 5 Minuten Inkubation nach Stoppen der Pumpen zur Überleitung der Effluate)). Die Daten sind für jede Messreihe als Mittelwerte der prozentualen Änderung von Zellverkürzung und „ratio“ ± Standardfehler für n=6 Kardiomyozyten aus verschiedenen Zellisolationen dargestellt. Die Inhibitoren wurden entsprechend der Anwendung in den Messreihen mit IF bzw. KF eingesetzt (siehe Tabelle 3.3. bzw. 3.4.).

PGI2 PGI2/ PGI2/ PGI2/ CAY 10441 AH 6809 AH 23848

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


p<0,001 PGI2 vs. PGI2/AH 23848

B.

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0


Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

PGI2 PGI2/Rp-cAMPS

p<0,001 PGI2 vs. PGI2/Rp-cAMPS

A.

Effekt und Signalwege von Prostaglandin I2

5 Ergebnisse

110

5.5. Funktionelle Charakterisierung der kardiodepressiven Mediatoren im post-

ischämischen Effluat

Die COX-2, die Prostaglandine der unterschiedlichen Subklassen und ihre spezifischen

Rezeptoren werden vielfach als kardioprotektive Mediatoren diskutiert (siehe Abschnitt

1.2.4.). Die Abhängigkeit der negativ-inotropen Wirkung von IF von der COX-2 und den

EP2-/EP4-Rezeptoren deutet auf eine kardioprotektive Funktion des Effluates hin. Um IF und

KF funktionell zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Arbeit Messreihen mit

Kardiomyozyten in Puffer mit doppelter Calciumkonzentration durchgeführt. Diese

Messreihen beruhen auf der Überlegung, dass Kardiomyozyten in einem extrazellulären

Milieu mit mehr Calcium auch mehr Calcium aufnehmen und infolgedessen die intrazelluläre,

cytoplasmatische (diastolische) Calciumkonzentration ansteigt. Die Zellen reagieren auf diese

Erhöhung positiv-inotrop. Ischämische Bedingungen führen oft zu einer Calciumüberladung

von Kardiomyozyten, was Störungen im Kontraktionsverlauf der Kardiomyozyten zur Folge

hat ((Ferrari 1996, Wang et al. 2001, Szenczi et al. 2005).

Die durch erhöhte extrazelluläre Calciumkonzentration (Erhöhung von 1,2 auf 2,4 mmolar)

„gestressten“ Kardiomyozyten wurden mit IF und KF inkubiert und die Änderung von

Zellverkürzung, „ratio“ und der diastolischen Calciumkonzentration im Vergleich zu den

basalen Werten aufgenommen, die bei einer extrazellulären Calciumkonzentration von 1,2

mmolar bestimmt wurden. Abb.5.36. zeigt die Ergebnisse dieser Messreihe. Eine Erhöhung

der extrazellulären Calciumkonzentration wirkte positiv-inotrop auf die Kardiomyozyten.

Zellverkürzung, „ratio“ und diastolische Calciumkonzentration wurden um 40, 20 bzw. 10%

gesteigert im Vergleich zu den basalen Werten. Durch Inkubation der Zellen mit IF wurde die

positiv-inotrope Wirkung durch Calciumerhöhung teilweise aufgehoben. Inkubation der

Kardiomyozyten mit KF beeinflusste die Steigerung der basalen Werte nicht. IF wirkt

vermutlich dem „Stress-Effekt“ auf die Zellen, der durch die Erhöhung der extrazellulären

Calciumkonzentration entsteht, entgegen. Dieses Ergebnis lässt den Rückschluss auf eine

„Gewebe-schützende“, d.h. kardioprotektive Wirkung von IF zu.

5 Ergebnisse

111

Abb.5.36. Effekt von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf isolierte adulte Kardiomyozyten in Milieu mit erhöhter Calciumionenkonzentration. Die extrazelluläre Calciumkonzentration wurde nach Aufnahme der „Baseline“ von 1,2 auf 2,4 mmolar verdoppelt und die Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat getestet. Die Daten sind dargestellt als Mittelwerte für die prozentuale Änderung der basalen Werte (bei 1,2 mmolar aufgenommen) von Zellverkürzung, „ratio“ und diastolischer Calciumkonzentration („5-Minutenwerte“) ± Standardfehler für jeweils n=6 Kardiomyozyten aus verschiedenen Zellisolationen und für jeweils n=3 verschiedene Effluate.

Die Öffnung von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen führt zu einer negativen Inotropie

und wirkt einer Calciumüberladung von Kardiomyozyten entgegen (Lau 1992, Müller-

Ehmsen et al. 1996, Wang et al. 2001). Für Substanzen aus dem Cyclooxygenase-

Stoffwechsel konnten aktivierende Effekte auf sarkolemmale Kalium(ATP)-Kanäle gezeigt

werden, die auch mit kardioprotektiver Wirkung und einem negativ-inotropen Effekt

assoziiert waren (Aimond et al. 2000, Lu et al. 2001). Vor diesem Hintergrund wurde in der

vorliegenden Arbeit die Rolle von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen in der Wirkung von

IF auf die isolierten Kardiomyozyten untersucht. Die Überlegung war, dass IF letztendlich

durch agonistische Wirkung auf Kalium(ATP)-Kanäle den protektiven und negativ-inotropen

Effekt an der isolierten einzelnen Kardiomyozyte vermittelt. Eine Inkubation der isolierten

Kardiomyozyten mit Cromakalim, einem Kalium(ATP)-Kanal-Öffner für sarkolemmale und

0

10

20

30

40

50

Diastolische Calciumkonzentration Ratio Zellverkürzung

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

Nicht-ischämisches Effluat post-ischämisches Effluat

p<0,01 IF vs. KF

Wirkung von IF/KF: Verdopplung der Calciumkonzentration

5 Ergebnisse

112

mitochondriale Kanäle, wirkte auf die Zellen negativ-inotrop (Abb.5.37.). Dieser negativ-

inotrope Effekt konnte durch Vorbehandlung der Zellen mit dem Kalium(ATP)-Kanal-

Blocker Glibenclamid blockiert werden.

Abb.5.37. Effekt des Kalium(ATP)-Kanal-Öffners Cromakalim auf die basalen Werte für Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten. Die Zellen waren unbehandelt oder mit Glibenclamid vorinkubiert. Zellverkürzung und „ratio“ wurden nach 7 Minuten Inkubation mit Cromakalim aufgezeichnet (7 Minuten entsprechend der gesamten Inkubationszeit (2 Minuten Umspülung der Zellen + 5 Minuten Inkubation nach Stoppen der Pumpen zur Überleitung der Effluate)). Die Daten sind für jede Messreihe als Mittelwerte der prozentualen Änderung von Zellverkürzung und „ratio“ ± Standardfehler für n=6 Kardiomyozyten aus verschiedenen Zellisolationen dargestellt. Glibenclamid wurde entsprechend der Anwendung in den Messreihen mit IF bzw. KF eingesetzt (siehe Tabelle 3.4.).

Im Folgenden wurde der Effekt von IF und KF auf isolierte Kardiomyozyten getestet, die mit

Glibenclamid vorbehandelt waren. Abb.5.38. zeigt die Ergebnisse der Messreihe.

Glibenclamid blockierte als Inhibitor für sarkolemmale und mitochondriale Kalium(ATP)-

Kanäle den negativ-inotropen Effekt von IF.

Cromakalim Cromakalim/Glibenclamid

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


Ände

rung

im V

ergl

eich

zur

Bas

elin

e in

%

p<0,001 Cromakalim vs. Cromakalim/Glibenclamid

Wirkung von Cromakalim

5 Ergebnisse

113

Abb.5.38. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten, die mit dem Antagonisten für mitochondriale und sarkolemmale Kalium(ATP)-Kanäle Glibenclamid vorbehandelt oder unbehandelt waren. Mittels Fluoreszenzmikroskopie wurde die prozentuale Änderung der basalen Werte („Baseline“) von Zellverkürzung und „ratio“ nach Zugabe der Effluate bestimmt. Für jede Messreihe mit IF bzw. KF sind die Daten als Mittelwerte der „5-Minutenwerte“ (5 Minuten nach „Akutmessung“) ± Standardfehler für jeweils n=6 Kardiomyozyten aus verschiedenen Zellisolationen dargestellt. Den Ergebnissen liegen Messreihen mit IF und KF aus mindestens 3 verschiedenen Rattenherzen zugrunde.

Um dieses Ergebnis zu bestätigen, wurden die Kardiomyozyten mit HMR-1098, einem

Inhibitor für sarkolemmale Kalium(ATP)-Kanäle, vorbehandelt und die Effekte von IF und

KF auf die vorbehandelten Zellen getestet. Die Ergebnisse dieser Messreihen sind in

Abb.5.39. dargestellt. Es zeigte sich, dass die Anwendung von HMR-1098 den negativ-

inotropen Effekt von IF aufhob. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass sarkolemmale

Kalium(ATP)-Kanäle an der Vermittlung des negativ-inotropen Effekts von IF beteiligt sind.

Glibenclamid und HMR-1098 wurden entsprechend der Vorgehensweise mit Indomethacin

auf Eigenwirkung auf die Basalwerte getestet. Beide Antagonisten zeigten keine

Eigenwirkung auf Zellverkürzung und „ratio“ der Kardiomyozyten.

KF IF KF/Glib IF/Glib Ä

nder

ung

im V

ergl

eich

zur

Bas

elin

e in

%

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


Hemmen von sarkolemmalen/mitochondrialen Kalium(ATP)-Kanälen

p<0,001 IF vs. KF

5 Ergebnisse

114

Abb.5.39. Effekte von post-ischämischem und nicht-ischämischem Effluat (IF und KF) auf Zellverkürzung und „ratio“ von isolierten adulten Kardiomyozyten, die mit dem Antagonisten für sarkolemmale Kalium(ATP)-Kanäle HMR-1098 vorbehandelt oder unbehandelt waren. Die Daten sind entsprechend der Darstellung der Messergebnisse mit dem Antagonisten Glibenclamid und IF bzw. KF zusammengefasst (Mittelwerte der „5-Minutenwerte“ für Zellverkürzung bzw. „ratio“ ± Standardfehler für n=6 Kardiomyozyten; mindestens 3 verschiedene IF bzw. KF).

KF IF KF/ IF/ HMR-1098 HMR-1098

Änd

erun

g im

Ver

glei

ch z

ur B

asel

ine

in %

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


Hemmen von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen

p<0,001 IF vs. KF

6 Diskussion

115

6 Diskussion

Felix et al. konnten 2001 erstmals nachweisen, dass Substanzen aus post-ischämischem

Effluat, die nach einer Ischämie während der frühen Reperfusionsphase aus dem Myokard der

Ratte freigesetzt werden, die Kontraktilität und den Calciumtransienten von isolierten adulten

Rattenkardiomyozyten reduzieren (Felix et al. 2001). Die vorliegende Arbeit gibt weitere

Einblicke in die Signaltransduktionsprozesse und die Funktion dieser kardiodepressiven

Substanzen sowie Hinweise auf ihre chemische Identität.

Nach den vorliegenden Ergebnissen reduziert post-ischämisches Effluat im Gegensatz zu

nicht-ischämischem Effluat die Kontraktilität und den Calciumtransienten von isolierten

adulten Kardiomyozyten der Ratte um ca. 20 bzw. ca. 12%. Der kardiodepressive Effekt des

Effluates ließ sich stabil reproduzieren, und post-ischämische Effluate aus verschiedenen

Rattenherzen zeigten einen ähnlich starken negativ-inotropen Effekt auf die Zellen. Der

Effekt des Effluates ging bei einer Verdünnung von 1:4 in Versuchspuffer in die Sättigung

über, d.h. die Wirkung war bei dieser Verdünnung maximal, und das Effluat zeigte bei einer

Verdünnung von 1:2 ähnlich starke Effekte.

Die vorliegenden Ergebnisse deuten daraufhin, dass die post-ischämisch freigesetzten

Substanzen Produkte des Arachidonsäure-Stoffwechsels darstellen und es sich um relativ

kurzlebige Verbindungen handelt. Die Ergebnisse führen zu der Hypothese, dass die negativ-

inotropen Mediatoren aus dem post-ischämischen Effluat durch die COX-2 umgesetzt werden

und ihren Effekt über die Prostaglandin E-Rezeptoren EP2 und EP4 vermitteln. Durch eine

Aktivierung der beiden Prostaglandin-Rezeptoren kommt es vermutlich zu einer Aktivierung

der Proteinkinase A und als weiterem Glied in der Kette zu einer Öffnung von sarkolemmalen

Kalium(ATP)-Kanälen, was vermutlich den negativ-inotropen Effekt auslöst. Die Substanzen

aus dem post-ischämischen Effluat schützen die Kardiomyozyten vor zu hohen

extrazellulären Calciumkonzentrationen und damit vor einer Calciumüberladung. Abb.6.1.

fasst die vorliegenden Ergebnisse zusammen.

6 Diskussion

116

Abb.6.1. Zusammenfassung der Signaltransduktion von post-ischämischem Effluat nach den vorliegenden Ergebnissen.

6.1. Besonderheiten des vorliegenden Untersuchungsmodells

Die Durchführung von Studien, die die funktionelle Bedeutung von Substanzen analysieren,

die während oder nach einer Ischämiephase gebildet werden, ist aufgrund des post-

ischämischen Gewebeschadens und der dadurch bedingten Herabsetzung der

Kontraktionskraft des Herzens erschwert. Felix et al. entwickelten 1997 vor diesem

Hintergrund das Modell der Doppelherzanlage. Ziel war es, mit Hilfe dieses Modells

Substanzen zu identifizieren, die endogen die Myokardkontraktilität nach Ischämie

beeinflussen. Das Prinzip des Modells besteht darin, zwei isolierte Herzen an einer

Langendorff-Anlage in Serie zu perfundieren und das Effluat nach einer 10-minütigen

Totalischämie in Herz I unmittelbar auf Herz II überzuleiten und die Effekte des Effluates auf

Post-ischämisches Effluat

Prostaglandin H

Spezifische Synthasen: PGE- und PGI-Synthase

Prostaglandin E und I

Prostaglandin-Rezeptoren EP2 und EP4

Cyclooxygenase-2

cAMP-Erhöhung PKA-Aktivierung

Aktivierung von K(ATP)-Kanälen

6 Diskussion

117

Herz II zu untersuchen. Das Besondere an diesem Modell im Vergleich zu anderen Modellen

zur Erforschung post-ischämischer Signaltransduktion ist neben der Serienschaltung zweier

isoliert perfundierter Herzen die Untersuchung der Effekte des post-ischämischen

Koronareffluates aus einem isoliert perfundierten Herzen auf ein weiteres isoliert

perfundiertes Herz, das nicht ischämisch war. Felix et al. detektierten einen negativ-inotropen

Effekt auf Herz II nach Überleiten des Effluates von Herz I (Felix et al. 1997). Um die Effekte

auf Einzelzellebene zu untersuchen, wurde von Felix et al. 2001 das in der vorliegenden

Arbeit verwendete Modell entwickelt. Eine Reihe an Studien analysieren die Freisetzung

bestimmter Substanzen, wie z.B. Adenosin oder NO ins Interstitium nach Ischämie und

vergleichen hierzu die Koronareffluate vor und nach Ischämie. Hierbei konnte beispielsweise

eine vermehrte Freisetzung sowohl von NO wie auch von Adenosin nach Ischämie festgestellt

werden. Diese Studien analysieren nicht die Effekte der gewonnen Effluate auf isolierte

Kardiomyozyten oder auch nicht auf isolierte Herzen (Kitakaze et al. 1993, Maulik et al.

1995, Pisarenko et al. 2007).

Die meisten gängigen Ischämiemodelle untersuchen Signaltransduktionsmechanismen nicht

auf Einzelzellebene, sondern entweder am isoliert perfundierten Herzen oder z.B. auch am

narkotisierten, intubierten Tier. Am isoliert perfundierten Herzen wird die Ischämie entweder

wie im vorliegenden Modell durch „stop-flow“ erzeugt in Form einer Totalischämie oder

durch Verschluss einzelner Gefäße, wodurch nur Teile des Herzens in den Zustand einer

Ischämie versetzt werden (Xuan et al. 2003, Krieg et al. 2004, Wang et al. 2004). Am

intubierten Tier können einzelne Gefäße durch sog. Okkluder, Implantate, die über einen

Katheter positioniert und aktiviert werden können, verschlossen werden. Außerdem variieren

die Ischämie- und die Reperfusionszeiten zwischen den einzelnen Ansätzen. Ein häufig

angewandtes Modell legt den Analysen z.B. eine 30- oder 60-minütige Ischämie und eine 30-

minütige Reperfusionsphase zugrunde (Borutaite et al. 2003, Krieg et al. 2004, Morkuniene et

al. 2006). Das Besondere an dem vorliegenden Modell ist daher die relativ kurze

Ischämiephase von 10 Minuten und vor allem die sehr kurze Reperfusionsphase von 30

Sekunden, in der das post-ischämische Effluat gesammelt wurde. Durch Anwendung dieses

Modells wurden frühe Signaltransduktionsmechanismen nach Ischämie analysiert.

Vereinzelte Studien, die post-ischämische Signaltransduktionsmechanismen auf

Einzelzellebene untersuchen, simulieren die Auswirkung einzelner ischämischer Faktoren auf

zellulärer Ebene. Förster et al. behandelten beispielsweise für ihre Analysen adulte

6 Diskussion

118

Rattenkardiomyozyten mit H2O2 vor, um die post-ischämische Aufhebung des

mitochondrialen Membranpotentials zu simulieren (Förster et al. 2006). Adderley und

Fitzgerald simulierten durch die Vorbehandlung von neonatalen Kardiomyozyten mit H2O2

die oxidative Schädigung der Zellen nach Ischämie (Adderley und Fitzgerald 1999). Das

vorliegende Modell simuliert vergleichbar mit den genannten Studien durch Inkubation mit

post-ischämischem Effluat, d.h. mit Substanzen, die unmittelbar nach Ischämie freigesetzt

werden, post-ischämische Bedingungen und ermöglicht die Analyse von

Signaltransduktionsmechanismen nach Ischämie in der frühen Reperfusionsphase auf

Einzelzellebene.

6.2. Zentrale Rolle der Cyclooxygenase bei der Vermittlung des negativ-inotropen

Effekts in adulten und neonatalen Kardiomyozyten der Ratte

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit geben Hinweise auf eine zentrale Rolle der COX-2

bei der Wirkung von post-ischämischem Effluat auf Kardiomyozyten. Die Abhängigkeit des

Effekts von der COX-2 zeigte sich sowohl bei adulten als auch bei neonatalen

Kardiomyozyten. Es ist bekannt, dass die COX-2 aufgrund der Molekülstruktur ein breiteres

Substratspektrum umsetzen kann als die COX-1. Das heißt, dass außer Arachidonsäure z.B.

verschiedene Arachidonsäurederivate durch die COX-2 verstoffwechselt werden können

(Kozak et al. 2003, Simmons et al. 2004, Rouzer und Marnett 2008). Die vorliegenden

Ergebnisse deuten auf einen komplexen Signaltransduktionsprozess hin, bei dem vermutlich

verschiedene Ausgangssubstanzen („Ausgangsmediatoren“) aus dem post-ischämischen

Effluat durch die COX-2 zu einem oder mehreren „aktiven“ Verbindungen umgesetzt werden,

die den negativ-inotropen Effekt auf die Kardiomyozyten vermitteln. Die Möglichkeit, dass es

sich bei den negativ-inotropen Mediatoren im post-ischämischen Effluat um freie

Sauerstoffradikale, NO, Adenosin oder Proteine wie z.B. Cytokine handelt, für die eine

kardiodepressorische Wirkung belegt ist (Guillen et al. 1995, Obata 2002, Staudt et al. 2002,

Duncan et al. 2007, El-Ani et al. 2007), konnte bereits in früheren Untersuchungen

ausgeschlossen werden. Eine Vorbehandlung des post-ischämischen Effluates mit Superoxid-

Dismutase und Katalase wie auch mit verschiedenen Proteasen und Adenosin-Deaminasen

beeinflussten den Effekt des post-ischämischen Effluates nicht. Der negativ-inotrope Effekt

des Effluates konnte außerdem nicht durch Anwendung von NO-Synthase-Inhibitoren bei der

Gewinnung von Effluat gehemmt werden (Felix et al. 1997).

6 Diskussion

119

6.2.1. Abhängigkeit des negativ-inotropen Effekts von post-ischämischem Effluat von

der Cyclooxygenase-2 in adulten Kardiomyozyten

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der negativ-inotrope Effekt des post-

ischämischen Effluates durch Vorbehandlung der Kardiomyozyten mit dem unselektiven

COX-Inhibitor Indomethacin und den COX-2-Inhibitoren NS-398 und Lumiracoxib

aufgehoben wird. Indomethacin hemmt die COX-1 und die COX-2. In Zellkultur-

Experimenten zeigt Indomethacin im nmolaren Bereich eine Präferenz für COX-1 (Kato et al.

2001). In einer Konzentration von 5 µmolar, die in der vorliegenden Arbeit eingesetzt wurde,

hemmt Indomethacin im Myokard beide Isoformen der Cyclooxygenase (Kerkhof et al.

2002). Der Inhibitor zeigte in dieser Konzentration keine Eigenwirkung auf Zellverkürzung

und „ratio“ der Kardiomyozyten (siehe Abb. 5.8.). NS-398 und Lumiracoxib inhibieren

selektiv die COX-2. Lumiracoxib zeigt als Vertreter der neueren Generation der COX-2-

Inhibitoren eine höhere Selektivität für COX-2 gegenüber COX-1 als NS-398 (Tacconelli et

al. 2004, Esser et al. 2005), weshalb Lumiracoxib in der vorliegenden Arbeit zur Bestätigung

der Ergebnisse aus den Experimenten mit NS-398 eingesetzt wurde. Der Effekt wurde

außerdem nicht blockiert durch die Anwendung des COX-1-Inhibitors SC-560. Der Inhibitor

zeigt bei der angewandten Konzentration von 0,25 µmolar eine hohe Selektivität von COX-1

gegenüber COX-2 (Smith et al. 1998, Fornai et al. 2006, Ye et al. 2006).

Nach diesen Ergebnissen werden die Mediatoren des post-ischämischen Effluates in den

isolierten Kardiomyozyten durch die COX-2 umgesetzt. Der COX-2, die traditionell mit

Entzündungsreaktionen in Verbindung gebracht wird, wird heute durchweg eine große

Bedeutung bei der Verminderung des post-ischämischen myokardialen Reperfusionsschadens

beigemessen. Die Studien analysieren überwiegend die Signaltransduktionsmechanismen, die

im Rahmen einer ischämischen Präkonditionierung ablaufen und schreiben der COX-2 eine

protektive Rolle in der späten Phase der ischämischen Präkonditionierung zu, d.h. nach einer

längeren Reperfusionsphase nach der Präkonditionierung. Wie bereits erläutert wurde,

konnten Shinmura et al. zeigen, dass in Kaninchenherzen, die durch mehrmaligen

Gefäßverschluss ischämischen Bedingungen ausgesetzt waren, die COX-2 nach 24 h auf

Proteinebene exprimiert wird und eine Hemmung der COX-2 durch NS-398 zu einem

stärkeren Gewebeschaden nach einer weiteren Ischämiephase führt (Shinmura et al. 2000).

Xuan et al. belegten ebenfalls in ihrer Studie einen kardioprotektiven Effekt der COX-2 und

zeigten außerdem, dass für die Aktivität und die Kardioprotektion der COX-2 nach einer

6 Diskussion

120

ischämischen Präkonditionierung die Expression der induzierbaren NO-Synthase erforderlich

ist. Die Autoren konnten nachweisen, dass die beiden Enzyme einen Komplex bilden, also

direkt interagieren (Xuan et al. 2003). Wang et al. zeigten außerdem, dass die Verbindung von

COX-2 und NO-Synthase in der späten Phase der ischämischen Präkonditionierung eine Rolle

bei der Vermittlung des kardioprotektiven Effekts spielt (Wang et al. 2004). Die vorliegenden

Ergebnisse zeigen im Gegensatz zu den Studien der ischämischen Präkonditionierung, dass in

der sehr frühen Reperfusionsphase Substrate für die COX-2 freigesetzt werden, die

vermutlich kardioprotektiv wirken. Das deutet eine funktionelle Bedeutung der COX-2 in der

sehr frühen Reperfusionsphase an, die nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit in den

Kardiomyozyten vermutlich basal exprimiert wird. In den Studien zur ischämischen

Präkonditionierung konnte keine basale, sondern eine nach längerer Reperfusionphase

induzierte Expression der COX-2 nachgewiesen werden, was die Autoren auf eine

funktionelle Bedeutung des Enzyms in der späten Reperfusionsphase schließen lässt. Eine

Rolle der COX-2 und ihrer Substrate in der sehr frühen myokardialen Reperfusionsphase ist

bislang wenig belegt. Szekeres et al. belegten z.B. eine protektive Bedeutung von

Prostaglandin I2 in der sehr frühen Reperfusionsphase (Szekeres et al. 1991).

Die Studien von Xuan et al. und Wang et al. sind außerdem gute Beispiele dafür, dass man

der COX-2 nicht nur eine protektive Wirkung über ihre Produkte zuschreibt, sondern auch

noch andere protektive Wirkungsmechanismen vermutet. Die Studien, die die Bedeutung der

COX-2 im Rahmen einer ischämischen Präkonditionierung untersuchen, analysieren daher

nicht die Signalwege der durch die COX-2 gebildeten Prostaglandine, sondern zeigen

allenfalls ihre Bildung als Aktivitätsnachweis für die COX-2. Die Bedeutung der

Prostaglandin-Rezeptoren nach Ischämie als Mediatoren des protektiven Effekts

„downstream“ der COX-2 wird in diesen Forschungsarbeiten nicht untersucht, weshalb auch

in der vorliegenden Arbeit die post-ischämische Bedeutung der Rezeptoren und ihrer

Agonisten an anderer Stelle diskutiert wird.

6.2.2. Basale Expression von COX-1 und COX-2 in isolierten adulten Kardiomyozyten

Wie bereits erläutert wurde, ist die COX-1 in vielen Zelltypen und Geweben konstitutiv

exprimiert und konnte z.B. im Gehirn, vor allem im Frontalhirn, in der Nierenrinde und im

Nierenmark und in Endothelzellen normaler Blutgefäße nachgewiesen werden (Simmons et

al. 2004). Die COX-1 ist außerdem die Cyclooxygenase-Isoform, die in Blutplättchen

6 Diskussion

121

vorkommt (Simmons et al. 2004, Tailor et al. 2007, Takahashi et al. 2008). Die COX-2 wird

im Gegensatz zur COX-1 überwiegend nicht konstitutiv, sondern Stress-induziert exprimiert

(Simmons et al. 2004, Colleselli et al. 2006, Ishikawa und Morris 2006, Lima-Rodriguez et al.

2008).

In der vorliegenden Arbeit konnte sowohl die COX-1 wie auch die COX-2 auf Proteinebene

im Western Blot in adulten Kardiomyozyten nachgewiesen werden, die für die Mikroskopie

laminiert und mit Fura-2AM gefärbt waren. Die COX-2 konnte zudem in frisch isolierten

Kardiomyozyten nachgewiesen werden, die nicht laminiert und nicht gefärbt waren. Dieses

Ergebnis deutet auf eine basale Expression beider Cyclooxygenase-Isoformen in isolierten

adulten Kardiomyozyten hin. Die Expression der beiden Cyclooxygenase-Isoformen ist in

isolierten adulten Kardiomyozyten bislang nicht untersucht. Bezüglich der Expression beider

Isoformen im myokardialen Gewebeverband ergibt sich nach Auswertung der Literatur kein

eindeutiges Bild. Der Nachweis der COX-1-Expression untermauert die Ergebnisse von

Warner et al. und Testa et al. Die Forschergruppen konnten die COX-1 auf RNA- und

Proteinebene basal in Ratten- und Mausmyokard detektieren (Warner et al. 2004, Testa et al.

2007). Eine myokardiale COX-2-Expression konnte herkömmlich von vielen

Forschergruppen nur im post-ischämischen oder pharmakologisch präkonditionierten, d.h. mit

Pharmaka vorbehandelten Herzen nachgewiesen werden (Shinmura et al. 2000, Kodani et al.

2001, Bolli 2002, Wang et al. 2004). Okamoto und Hino untersuchten die COX-2-Expression

in verschiedenen Organen der Ratte. Die Autoren konnten im Gegensatz zu anderen

Forschergruppen eine basale Expression der COX-2-mRNA in unbehandelten Herzen zeigen.

Die COX-1 konnte in dieser Studie nicht nachgewiesen werden. Die Autoren postulierten eine

differentielle basale mRNA-Expression in verschiedenen Geweben der Ratte und leiteten

daraus ab, dass beide Cyclooxygenase-Isoformen Organ-spezifisch exprimiert werden und

Gewebe-spezifisch ihre Funktion ausüben (Okomoto und Hino 2000). Eine vorhandene,

basale COX-2-Expression, aber fehlende COX-1-Expression konnte auch in einer neueren

Arbeit von Zidar et al. in humanen Myokardbiopsien bestätigt werden (Zidar et al. 2007). In

der vorliegenden Arbeit wurden beide Cyclooxygenase-Isoformen auf Proteinebene in

isolierten Rattenkardiomyozyten nachgewiesen, die keiner Ischämie ausgesetzt und auch nicht

präkonditioniert waren. Das untermauert die Ergebnisse von Testa et al., die in ihrer Studie

eine basale Expression beider Cyclooxygenase-Isoformen auf Proteinebene in nicht-

ischämischem Rattenmyokard nachwiesen (Testa et al. 2007).

6 Diskussion

122

Frisch isolierte und nicht-laminierte Kardiomyozyten exprimierten die COX-2. Geht man wie

die herkömmliche Literatur von einer Induktion der COX-2-Expression durch Stressfaktoren

aus, könnte möglicherweise der mechanische Stress während der Prozedur zur Isolation der

Kardiomyozyten zum Auslösen der Genexpression in den frisch isolierten Kardiomyozyten

beigetragen haben. In der Literatur wurden in den letzten Jahren auch mechanische

Stressfaktoren als Auslöser der COX-2-Expression diskutiert. Ogasawara et al. beispielsweise

konnten eine Induktion der COX-2 in der Osteoblasten Zell-Linie MC3T3-E1 durch

Scherkräfte nachweisen, die durch Flüssigkeitszirkulation erzeugt wurden und Prozesse bei

der Knochenbildung simulieren sollten (Ogasawara et al. 2001). Eine schwache COX-2-

Expression konnte in der vorliegenden Arbeit jedoch auch in Proteinextrakten von

Rattenherzen direkt nach Isolation im Western Blot detektiert werden. Da für die Analysen

Extrakte aus den kompletten Rattenherzen verwendet wurden, kann die nachgewiesene, im

Western Blot relativ schwache COX-2-Expression nicht allein den Kardiomyozyten

zugeordnet werden. Im „Nicht-Kardiomyozyten“-Anteil des Herzens, der durch

Zentrifugation von den Kardiomyozyten während der Zellisolation abgetrennt wurde, konnte

ebenfalls COX-2 mittels Western Blot nachgewiesen werden (siehe Abb.5.11.c.). Da jedoch

eine COX-2-Expression auf Proteinebene nach dem aktuellen Stand der Literatur frühestens

3 h nach ihrer Induktion nachgewiesen werden kann und die Kardiomyozytenisolation aber

maximal 2 h dauerte, wurde die Expression der COX-2 vermutlich nicht erst durch die

Isolationsprozedur induziert und exprimierten die frisch isolierten Kardiomyozyten basal die

COX-2.

6.2.3. Erhöhte COX-2-Expression nach Laminierung

Während der Laminierung der Kardiomyozyten für die Fluoreszenzmikroskopie wurde die

basale COX-2-Expression verstärkt (siehe Abb.5.5.a.). Die Laminierung diente bei der

Vorbereitung der Fluoreszenzmikroskopie der Adhäsion der isolierten Kardiomyozyten am

Boden der Versuchskammer, um die Aufzeichnung der Kontraktilität und des

Calciumtransienten einer einzelnen Zelle zu ermöglichen. Bei Lamininen handelt es sich um

Glykoproteine, die Bestandteil der extrazellulären Matrix sind. Lamininmoleküle weisen

Bindungsstellen für Zelloberflächenrezeptoren auf (Kleinig 1997). Glykoproteine der

extrazellulären Matrix wie Laminin oder Fibronectin spielen nachweislich eine wichtige Rolle

bei der Entstehung und dem Wachstum von Tumoren. In diesem Zusammenhang wurde in

Studien von Ito et al. und Zaric und Rüegg eine Induktion der COX-2 durch Fibronectin bzw.

6 Diskussion

123

Laminin nachgewiesen. Ito et al. zeigten eine Verstärkung der COX-2-Expression auf

Proteinebene nach Anhaftung verschiedener Rhabdomyosarcoma-Zelllinien an Fibronectin

(Ito et al. 2004). Zaric und Rüegg konnten eine Intensivierung der COX-2-Expression in

Endothelzellen nach Adhäsion an Laminin nachweisen. Die Autoren zeigten einen schnellen

Anstieg der COX-2-Expression auf Proteinebene nach Adhäsion, die ihren „peak“ schon

innerhalb von 1 ½ h erreicht hatte (Zaric und Rüegg 2005). Möglicherweise trug auch die

Laminierung der Kardiomyozyten, die den letzten Vorbereitungsschritt vor der Durchführung

der Fluoreszenzmikroskopie darstellte und ca. 2 h dauerte, zur Hochregulierung der COX-2-

Expression bei.

Auf der anderen Seite könnte auch die Zellisolation als mechanischer Stressfaktor für die

Intensivierung der basalen COX-2-Expression während der Laminierung ursächlich sein.

Möglich ist, dass mechanische Ursachen zur Verstärkung der COX-2-Expression führten, die

nach der Laminierung detektiert werden konnte. Für die Durchführung der

Kardiomyozytenisolation war es notwendig, die isolierten Rattenherzen an der Langendorff-

Anlage unter konstanten Flussbedingungen, die dem natürlichen Kreislaufsystem

nachempfunden waren, zu perfundieren (siehe Abschnitt 4.1.5.). Diese Perfusion außerhalb

des natürlichen Kreislaufs stellte eine erhöhte mechanische Beanspruchung des Gewebes dar.

Die Erfahrung der Arbeitsgruppen, die die Langendorff-Technik anwenden, zeigt, dass bei

mehrstündiger Perfusion von isolierten Herzen sich beispielweise Ödeme in den Herzen

bilden und dadurch die myokardiale Stressbelastung steigt. Ferner wurden während der

Zellisolation die Kardiomyozyten zusätzlich zur enzymatischen Isolation durch Verwirbelung

mechanisch aus dem Gewebeverband gelöst. Doroudi et al. untersuchten beispielsweise die

Effekte von Scherbeanspruchung auf Endothelzellen in einem vaskulären Modell, das eine

Perfusion von Gefäßen bei hoher und niedriger Scherbeanspruchung und konstantem

Gefäßinnendruck für unterschiedliche Perfusionszeiten ermöglichte (Doroudi et al. 2000). Die

Autoren detektierten einen „peak“ in der COX-2-Expression der Endothelzellen nach 1,5 und

6 h Perfusion der Gefäße bei hoher Scherbeanspruchung. Inoue et al. konnten eine erhöhte

COX-2-Expression in vaskulären Endothelzellen zeigen, die in einer speziellen Apparatur

einer dem natürlichen Blutstrom ähnlichen Strömung ausgesetzt wurden (Inoue et al. 2002).

Das mechanische „Herauslösen“ der Kardiomyozyten während der Zellisolation könnte somit

ein weiterer Faktor sein, der zu einer Verstärkung der COX-2-Expression während der

Laminierung beitrug.

6 Diskussion

124

Durch die Isolation aus den adulten Rattenherzen wurden die Kardiomyozyten aus ihrer

natürlichen Umgebung entfernt. Eine generelle, dadurch bedingte Veränderung der

Genexpression in den Kardiomyozyten, so z.B. auch der COX-2-Expression ist denkbar.

Adulte Kardiomyozyten sind außerhalb des Herzens bzw. ihres natürlichen Gewebeverbands

nur relativ kurze Zeit (ca. 48 h) überlebensfähig und daher nur zeitlich begrenzt kultivierbar.

Die Zellen sind ausdifferenziert, teilen sich im adulten Stadium nicht mehr und können auch

nicht in Kultur zur Teilung angeregt werden. Die Erfahrung unserer und weiterer

kardiologischer Arbeitsgruppen aus der experimentellen Arbeit mit adulten Kardiomyozyten

zeigt, dass die isolierten Zellen außerdem nur für sehr kurze Zeit funktionsfähig sind. Eine

Anregung der isolierten Kardiomyozyte zur Kontraktion durch elektrische Stimulation ist nur

bis zu 4 h nach der Isolation aus dem Myokard mit hohen Voltzahlen möglich. Im natürlichen

myokardialen Zellverband regen sog. Schrittmacherzellen, die spontan depolarisieren können,

die anderen Kardiomyozyten zur Kontraktion an. Dabei dienen Zell-Zell-Verbindungen der

Weiterleitung der elektrischen Erregung (Kleinig 1997, Klinke 2005). In „vivo“ ist somit für

die Kontraktion der Kardiomyozyten und damit für die Funktionsfähigkeit der Zellen der

Zellverband notwendig. Möglicherweise führt eine Isolation der auf den myokardialen

Gewebeverband „angewiesenen“ Kardiomyozyte aus dem Myokard zur verstärkten

Expression von Stress-induzierten Genen, wie z.B. der COX-2, um ein kurzfristiges

Überleben der Einzelzelle zu ermöglichen. Dies könnte unter anderem die Intensivierung der

COX-2-Expression während der Laminierung erklären.

6.2.4. COX-2-Expression im kompletten Rattenherzen vor und nach Ischämie

Nach Auswertung der aktuellen Literatur kann man schlussfolgern, dass die isolierten adulten

Rattenkardiomyozyten vermutlich basal beide Isoformen der Cyclooxygenase exprimieren.

Für die Intensivierung der COX-2-Expression während der Laminierung können mehrere

Faktoren ursächlich sein. Denkbar als mögliche Ursachen ist die mechanische Beanspruchung

der Kardiomyozyten bei der Zellisolation, die Adhäsion der Zellen durch Laminin oder die

Auswirkungen der Isolation aus dem myokardialen Gewebeverband auf die Genexpression

der Zelle.

In der vorliegenden Arbeit wurden außerdem Proteinextrakte aus kompletten Rattenherzen

hergestellt, die ischämisch oder nicht-ischämisch waren und unterschiedlich lang an der

Langendorff-Anlage reperfundiert wurden. Eine Reihe an Forschungsarbeiten belegen einen

6 Diskussion

125

Anstieg der COX-2-Expression in der post-ischämischen Phase. Adderley und Fitzgerald

konnten beispielsweise einen Anstieg der COX-2-Expression auf RNA-und Proteinebene in

neonatalen Rattenkardiomyozyten nachweisen, die zur Simulation der oxidativen Schädigung

durch Ischämie mit H2O2 behandelt wurden (Adderley und Fitzgerald 1999). Shibata et al.

konnten zeigen, dass das Hormon Adiponectin nach Ischämie abhängig von der COX-2 seine

kardioprotektive Wirkung entfaltet und hierzu die Expression der COX-2 ansteigt (Shibata et

al. 2005). Wie bereits erläutert wurde, untersuchen der überwiegende Teil der kardiologischen

Studien, die sich mit der post-ischämischen COX-2-Expression befassen, die Expression des

Enzyms im durch Ischämie präkonditionierten Herzen. In diesen Untersuchungen werden

Herzen aus Kaninchen oder Mäusen durch meist kurze, direkt aufeinander folgende

Ischämiephasen vorbehandelt und die COX-2-Expression in der post-ischämischen

Reperfusionsphase analysiert. Bolli et al. und Shinmura et al. konnten beispielsweise in

präkonditionierten Herzen eine Induktion der COX-2-Expression auf mRNA- und

Proteinebene in der späten Phase der ischämischen Präkonditionierung detektieren (Shinmura

et al. 2000, Bolli 2002).

Die Western Blot-Analyse der COX-2-Expression ergab, dass nicht-ischämische und nicht-

perfundierte Herzen basal COX-2 auf relativ niedrigem Level exprimieren. Diese Expression

wurde nach einer Vorperfusionsphase von 30 Minuten intensiviert. Eine 10-minütige „stop-

flow“-Ischämie nach der Vorperfusion beeinflusste die COX-2-Expression im Vergleich zur

nicht-ischämischen Kontrolle nicht. Die Zeitspanne, bis eine Veränderung der COX-2-

Expression auf Proteinebene detektierbar ist, hängt vom auslösenden Reiz ab und außerdem

davon, ob die Expression induziert oder eine basale COX-2-Expression verstärkt wird.

Bezugla et al. konnten in Makrophagen der Leber 3 h nach Induktion durch LPS COX-2 auf

Proteinebene detektieren (Bezugla et al. 2005). Zaric und Rüegg konnten eine Verstärkung

basaler COX-2-Expression in Endothelzellen, die an Laminin adhärierten, innerhalb von

1 ½ h nachweisen (Zaric und Rüegg 2005). Dupouy et al. detektierten die COX-2 4 h nach

einer Induktion durch Ischämie in Skelettmuskelzellen während der Reperfusion (Dupouy et

al. 2006). Die Auswertung der Literatur ergibt, dass eine Verstärkung der COX-2-Expression

bei vorhandener basaler Expression generell früher nach dem auslösenden Reiz auf

Proteinebene detektierbar ist als eine Induktion der Expression ohne vorherige basale

Expression des Enzyms. Danach wäre eine Verstärkung basaler COX-2-Expression nach 3 h

auf Proteinebene nach Ischämie detektierbar. Aufgrund dieser Forschungsergebnisse wurden

in der vorliegenden Arbeit in weiteren Ansätzen die Rattenherzen für 3 h und 5 h an der

6 Diskussion

126

Langendorff-Anlage reperfundiert und die COX-2-Expression der Proteinextrakte aus diesen

Herzen im Western Blot analysiert.

Betrachtet man die COX-2-Expression im zeitlichen Verlauf, kann man zusammenfassen,

dass die Expression in den Rattenherzen nach einer 30-minütigen Vorperfusionsphase im

Vergleich zum nicht-perfundierten Kontrollherz anstieg, bis zu einer Perfusionsdauer von

3 ½ h konstant blieb und bei einer Perfusionsdauer von 5 ½ h wieder anstieg. Dabei zeigten

ischämische und nicht-ischämische Herzen (Kontrollen) für jeden Analysezeitpunkt im

Western Blot ein ähnliches Bild. Eine 10-minütige „stop-flow“-Ischämie führte somit nicht zu

einer Erhöhung der COX-2-Expression in den ischämischen Herzen im Vergleich zu den

Kontrollherzen innerhalb einer post-ischämischen Reperfusionsphase von 3 h oder 5 h. Der

Anstieg der COX-2-Expression in den nicht-ischämischen Kontrollherzen nach 5 h deutet

daraufhin, dass andere Faktoren für die Verstärkung der COX-2-Expression ursächlich sind.

Denkbar ist, dass für die Intensivierung der Expression eine erhöhte Belastung des Gewebes

durch die Perfusion der Herzen an der Langendorff-Anlage ähnlich wie bei isolierten

Kardiomyozyten verantwortlich ist. Millart et al. konnten beispielsweise zeigen, dass sich im

Langendorff-Herz durch die Krebs-Henseleit-Lösung, die auch in der vorliegenden Arbeit zur

Perfusion der Herzen verwendet wurde, bei mehrstündiger Perfusion der Herzen unter

anderem Ödeme bilden. Die Studie zeigt deutlich, dass die Perfusion von Herzen nach

Langendorff nur zeitlich begrenzt möglich und eine Perfusion, die länger dauert als 5 h, daher

nicht praktikabel ist (Millart et al. 1993). Die Ergebnisse der Expressionsanalyse in der

vorliegenden Arbeit lassen vermuten, dass die COX-2-Expression in den Rattenherzen durch

Perfusionsstress abhängig von der Perfusionszeit kontinuierlich ansteigt. Nach aktueller

Literatur kann eine Verstärkung der COX-2-Expression durch Ischämie 5 h später auf

Proteinebene detektiert werden (Choi et al. 2006, Dupouy et al. 2006). Nach 5 h Perfusion

konnte in der vorliegenden Arbeit im Western Blot aber kein Unterschied in der COX-2-

Expression zwischen ischämischen und nicht-ischämischen Herzen nachgewiesen werden.

Somit ist davon auszugehen, dass eine 10-minütige „stop-flow“-Ischämie nicht zu einer

Erhöhung der COX-2-Expression geführt hat.

6 Diskussion

127

6.2.5. Rückschlüsse aus der COX-2-Abhängigkeit auf die Identität der Mediatoren aus

dem post-ischämischen Effluat

Nach den vorliegenden Ergebnissen werden die Mediatoren aus dem post-ischämischen

Effluat durch die COX-2 in den Kardiomyozyten umgesetzt. Substrate für die COX-2 sind

außer der Arachidonsäure auch weitere Eikosatetraensäuren oder Eicosapentaensäure

(Simmons et al. 2004). Wie bereits erläutert wurde, werden aus Arachidonsäure über COX-2

Prostaglandine der Serie 2 synthetisiert. Über die Lipoxygenase entstehen aus Arachidonsäure

Hydroxyeicosatetraensäuren, die wiederum mehrfach als Substrat für die COX-2

nachgewiesen werden konnten (Rowlinson et al. 2000, Ciccolli et al. 2005). Durch Oxidation

von Arachidonsäure durch Cytochrom P450 entstehen verschiedene

Epoxyeicosatetraensäuren. Für einzelne Vertreter der Epoxyeicosatetraensäuren ist eine

Umsetzung durch die COX-2 gezeigt worden (Fulton et al. 1996). Aus Eikosapentaensäure

entstehen über die COX-2 Eikosanoide der Serie 3. COX-2 setzt außerdem aufgrund der

Struktur des aktiven Zentrums im Gegensatz zu COX-1 auch Vertreter der Endocannabinoide

um wie z.B. Anadamid, das Ethanolaminderivat der Arachidonsäure, oder 2-

Arachidonylglycerol (Simmons et al. 2004). Man weiß mittlerweile, dass diese Substanzen

ihre Wirkung über Cannabinoid-Rezeptoren vermitteln. Über die funktionelle Bedeutung des

Endocannabinoidsystems ist bis heute nur wenig bekannt. Man vermutet Funktionen im

Zentralnervensystem bei Lern-und Fortbewegungsprozessen und bei der Regulation des

Immunsystems (Simmons et al. 2004). Abb.6.2. fasst die möglichen Substrate für die COX-2

zusammen.

Von den genannten möglichen Substraten für die COX-2 schreibt man der Arachidonsäure

und den von ihr abgeleiteten Epoxyeicosatetraensäuren und Hydroxyeicosatetraensäuren

sowie der Eikosapentaensäure und ihren Signalwegen in der post-ischämischen

Reperfusionsphase im Myokard eine große Bedeutung zu. Dabei wird die Rolle der

Eikosapentaensäure in der Literatur durchweg als kardioprotektiv angesehen, wohingegen die

Bedeutung der Arachidonsäure hinsichtlich ihrer Umsetzung durch die Lipoxygenase

kontrovers diskutiert wird. Sexton et al. konnten beispielsweise zeigen, dass der Ischämie-

Reperfusionsschaden nach Vorbehandlung von isolierten Langendorff-Herzen aus der Ratte

mit einem „Cocktail“ aus 12-Lipoxygenase und Arachidonsäure signifikant vermindert wird.

Die Autoren vermuteten, dass aus Arachidonsäure über die 12-Lipoxygenase 12(S)-HPETE

gebildet wird, das über spezielle Rezeptoren die kardioprotektive Wirkung vermittelt (Sexton

6 Diskussion

128

et al. 2007). Fukuda et al. hingegen konnten für den Radikalfänger Edaravon einen

protektiven Effekt in der post-ischämischen Reperfusionsphase nachweisen, der die

Umsetzung von Arachidonsäure durch die Lipoxygenase inhibiert und die Produktion von

Prostaglandin I2 stimuliert (Fukuda et al. 2006). Die Verstoffwechselung der Arachidonsäure

durch Cytochrom P450 zu Epoxyeicosatetraensäuren wird durchweg als kardioprotektiv

nachgewiesen. Dabei wird überwiegend die aktivierende Wirkung von

Epoxyeicosatetraensäuren auf sarkolemmale und mitochondriale Kalium(ATP)-Kanäle als

Mechanismus der protektiven Wirkung postuliert. Nithipatikom et al. und Gross et al. konnten

einen kardioprotektiven Effekt von 11,12-EET und 14,15-EET nachweisen, der durch die

Anwendung von HMR-1098 und 5-HD aufgehoben werden konnte (Nithipatikom et al. 2001

und 2006, Gross et al. 2006). Gross et al. konnten den protektiven Effekt außerdem durch 2-

Mercaptopropionylglycin, einem Radikalfänger, blockieren und schlossen daraus, dass

Eicosatetraensäuren die Synthese von freien Radikalen zunächst verstärken und in Folge

Kalium(ATP)-Kanäle aktivieren. Die Autoren vermuteten daher einen Redox-abhängigen

Signaltransdunktionsmechanismus (Gross et al. 2006).

Abb.6.2. Übersicht über die möglichen Substrate der COX-2.

Hydroxyeicosatetraensäuren, Hydroperoxyeicosatetraensäuren

Biomembran

Arachidonsäure

Cyclooxygenase-2

Cytochrom P450

Epoxyeicosatetraensäuren

Lipoxygenase

Eicosapentaensäure

Endocannabinoide Dihomogammalinolensäure

6 Diskussion

129

Eine Verminderung des myokardialen post-ischämischen Reperfusionsschadens und damit

einen kardioprotektiven Effekt für Eicosapentaensäure konnten beispielsweise Ogita et al.

nachweisen. Ogita et al. zeigten eine Verminderung der Infarktgröße und führten den

protektiven Effekt von Eicospentaensäure auf die Aktivierung von Calcium-abhängigen

Kalium-Kanälen zurück (Ogita et al. 2003). Izuoka et al. zeigten außerdem, dass eine Infusion

von Eicosapentaensäuren die Bildung von pulmonaren Ödemen, die häufig als Komplikation

bei myokardialen Ischämien auftreten, teilweise unterbindet (Izuoka et al. 1997). Für

Dihomogammalinolensäure und Endocannabinoide konnte bislang keine Bedeutung nach

Ischämie nachgewiesen werden.

In der vorliegenden Arbeit wurde post-ischämisches Effluat nach einer 10-minütigen

Ischämiephase gewonnen. Durch Ischämie werden Zellen geschädigt und Biomembranen

abgebaut, wodurch z.B. Arachidonsäure freigesetzt wird (Van der Vusse et al. 1997,

Muralikrishna Adhibatla und Hatcher 2006). Arachidonsäure kann z.B. in Folge zu weiteren

Eicosatetraensäuren umgesetzt werden. Wie oben erläutert wurde, geht man nach aktuellem

Stand der Literatur von einer protektiven Bedeutung der Arachidonsäure und ihrer Metabolite

nach Ischämie aus. Es könnte sich bei den Mediatoren im post-ischämischen Effluat

möglicherweise um solche post-ischämisch freigesetzten Abbauprodukte von Biomembranen

wie Arachidonsäure und ihre Metabolite halten. Diese Mediatoren werden bei Inkubation des

Effluates durch die COX-2 in den isolierten Kardiomyozyten weiter verstoffwechselt und

stellen als „Ausgangsmediatoren“ vermutlich den Ausgangspunkt der negativ-inotropen

Signaltransduktion dar.

Post-ischämisches Effluat wurde in der vorliegenden Arbeit in den ersten 30 Sekunden der

Reperfusion gewonnen. Nach den bisherigen Ergebnissen ist die COX-2 in den Herzen

exprimiert, aus denen das post-ischämische Effluat generiert wird. Die Ergebnisse der

vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass die während der 30 Sekunden Reperfusion

freigesetzten „Ausgangsmediatoren“ durch die COX-2 erst in den isolierten Kardiomyozyten

zu negativ-inotropen Faktoren umgesetzt werden. Das wiederum bedeutet, dass die „fertigen“

negativ-inotropen Faktoren in der post-ischämischen Reperfusionsphase entweder nicht durch

die COX-2 im Herzen gebildet werden oder zwar im Herzen gebildet, aber nicht in Folge

ihrer Bildung aus dem Herzen freigesetzt werden, und daher im post-ischämischen Effluat

nicht enthalten sind.

6 Diskussion

130

Überträgt man diese Überlegungen auf das Langendorff-Herz bei der Herstellung des post-

ischämischen Effluates, werden möglicherweise in den ersten 30 Sekunden der Reperfusion

überwiegend Abbauprodukte von Zellmembranen aus dem Herzen „ausgeschwemmt“, die

dann in einem weiteren Schritt durch die COX-2 in der isolierten Kardiomyozyte umgesetzt

werden. Diese aus dem Herzen „ausgeschwemmten“ Mediatoren werden nach den

Ergebnissen der vorliegenden Arbeit nicht durch die COX-2 in den Kardiomyozyten des

Langendorff-Herzens zu Prostaglandinen umgesetzt, die bei der Herstellung von post-

ischämischem Effluat mit „ausgeschwemmt“ werden. Das steht im Einklang mit HPLC-

Analysen von post-ischämischem Effluat, die in unserer Arbeitsgruppe durchgeführt wurden.

In diesen HPLC-Analysen konnten keine Prostaglandine, d.h. COX-2-Produkte, detektiert

werden. Da die COX-2 in den Herzen basal exprimiert ist, werden vermutlich auch COX-2-

Produkte in den Herzen gebildet. Diese Produkte werden aber nicht bei der Herstellung des

Effluates aus dem Herzen freigesetzt. Prostaglandine werden von den Zellen, in denen sie

synthetisiert wurden, normalerweise sekretiert, verbleiben aber in der Regel in unmittelbarer

Nähe ihres Bildungsortes und vermitteln dort ihre Wirkung. Möglicherweise werden daher im

Herzen gebildete Prostaglandine bei der Reperfusion nicht in das post-ischämische Effluat

freigesetzt und konnten daher im Effluat nicht nachgewiesen werden.

6.2.6. Rückschlüsse auf die zelluläre Herkunft der Mediatoren aus dem post-

ischämischen Effluat

Stangl et al. untersuchten die Rolle von koronaren Endothelzellen bei der Bildung der

Mediatoren im Doppelherzmodel. Die Autoren konnten nachweisen, dass der

kardiodepressive Effekt von post-ischämischem Effluat auf Herz II weiterhin vorhanden ist,

wenn das koronare Endothel von Herz I entfernt wird. Stangl et al. zogen aus diesem Befund

die Schlussfolgerung, dass die Mediatoren aus dem Effluat nicht aus dem Stoffwechsel

koronarer Endothelzellen stammen (Stangl et al. 1997). Wie bereits erläutert wurde, handelt

es sich bei den Mediatoren im post-ischämischen Effluat eventuell um Abbauprodukte von

Biomembranen, die die „Ausgangsverbindungen“ der negativ-inotropen Signaltransduktion

darstellen. Damit ist die Bildung der Substanzen aus dem post-ischämischen Effluat

vermutlich nicht einem bestimmten Zelltyp zuzuordnen. Diese Hypothese steht im Einklang

mit den experimentellen Ergebnissen von Stangl et al., führt aber nicht zur Schlussfolgerung,

dass die Endothelzellen nicht an der Bildung der „Ausgangsmediatoren“ des post-

ischämischen Effluates beteiligt sind.

6 Diskussion

131

6.2.7. Bestätigung des reduzierenden Effekts und der COX-2-Abhängigkeit von post-

ischämischem Effluat an neonatalen Kardiomyozyten

An den neonatalen Zellen konnten der reduzierende Effekt bezüglich Calciumtransient und

die COX-2-Abhängigkeit des post-ischämischen Effluates, die bei adulten Kardiomyozyten

gezeigt werden konnte, reproduziert werden. Wie bereits erläutert wurde, führt bei neonatalen

Zellen der sarkolemmale Calciumeinstrom unmittelbar zur Kontraktion, d.h. der

Calciumtransient kommt nicht durch Calciumausstrom aus dem sarkoplasmatischen

Retikulum wie bei adulten Zellen zustande. Eventuell beeinflussen andere Mediatoren aus

dem Effluat den Calciumtransienten bei neonatalen Zellen als bei den adulten

Kardiomyozyten über weitere molekulare Mechanismen. Desweiteren konnte eine

Reduzierung der Schlagfrequenz durch das Effluat nachgewiesen werden, die ebenfalls durch

Vorbehandlung der Zellen mit NS-398 und Lumiracoxib aufgehoben wurde. Die Mediatoren

aus dem post-ischämischen Effluat beeinflussen somit mit der Schlagfrequenz COX-2-

abhängig einen weiteren Parameter. Die COX-2-Abhängigkeit gibt dennoch Hinweise auf

ähnliche Signaltransduktionsprozesse in neonatalen und adulten Kardiomyozyten, die zu den

kardiodepressiven Effekten führen.

In den neonatalen Kardiomyozyten konnten wie in den adulten Zellen beide Isoformen der

Cyclooxygenase mittels Western Blot nachgewiesen werden. Da die COX-2-Expression nur

am 7. Kulturtag untersucht wurde, kann lediglich die Aussage getroffen werden, dass nach 7

Kulturtagen die neonatalen Zellen die COX-2 exprimieren. Ob die COX-2 auch basal in den

Herzen exprimiert wird wie vermutlich bei den adulten Zellen und/oder ob die

Isolationsprozedur die Expression beeinflusst, bleibt daher offen. Generell muss davon

ausgegangen werden, dass in neonatalen Kardiomyozyten die COX-2-Expression durch

Stressfaktoren induziert wird. Im Gegensatz zum adulten Myokard konnte bislang in

neonatalen Kardiomyozyten keine basale Expression nachgewiesen werden (Adderley und

Fitzgerald 1999). Da die neonatalen Zellen in mit Fibronectin beschichteten Gefäßen

kultiviert wurden, ist eine Beeinflussung der Expression ähnlich wie durch Laminin bei den

adulten Zellen denkbar.

Die Reduzierung des Calciumtransienten bedingt eine verminderte Kontraktitlität. Das heißt,

bei adulten Kardiomyozyten führt die COX-2-abhängige Reduzierung des Calciumtransienten

zu einer reduzierten Kontraktilität. Die Schlagfrequenz ist nicht unmittelbar abhängig vom

6 Diskussion

132

Calciumtransienten (Yin et al. 2004). Das heißt, bei neonatalen Kardiomyozyten führt die

COX-2-abhängige Reduktion des Calciumtransienten nicht unmittelbar zu einer verminderten

Schlagfrequenz. Diese Ergebnisse geben Hinweise auf zusätzliche

Signaltransduktionsprozesse der Mediatoren des post-ischämischen Effluates, die ihren

Ursprung im COX-2-Metabolismus haben und zur Verminderung der Schlagfrequenz in

neonatalen Kardiomyozyten führen. Für Eicosapentaensäure, die ein Substrat für die COX-2

darstellt, sind beispielsweise Wirkungen auf die Herzschlagfrequenz beschrieben worden.

Kinoshita et al. konnten an Hundeherzen zeigen, dass Eicosapentaensäure anti-arrhythmische

Effekte während eines Myokardinfarktes hat. Die Autoren postulierten einen Mechanismus

über eine Aktivierung der Calcium-Magnesium-ATPase. Hierdurch wird letztendlich eine

Calciumüberladung des Myokards unterbunden und damit eine pathologisch bedingte

Steigerung der Herzfrequenz verhindert (Kinoshita et al. 1994). Möglicherweise sind

verschiedene Ausgangssubstanzen im post-ischämischen Effluat für die Beeinflussung des

Calciumtransienten und der Schlagfrequenz verantwortlich.

6.3. Vermittlung des Effekts von post-ischämischem Effluat auf adulte

Kardiomyozyten „downstream“ der COX-2 über Prostaglandin-Rezeptoren

Die vorliegenden Ergebnisse lassen vermuten, dass die intrazellulär gebildeten COX-2-

Produkte Prostaglandine und Thromboxane den negativ-inotropen Effekt auf die isolierten

Kardiomyozyten vermitteln. Prostaglandine und Thromboxane werden aufgrund ihrer

lipophilen Struktur ohne spezifischen Transport aus der Zelle sekretiert und binden an der

Zelloberfläche an ihre Subklassen-spezifischen Rezeptoren. Nach den vorliegenden

Ergebnissen wird der Effekt des post-ischämischen Effluates abhängig von der Proteinkinase

A durch die Prostaglandin E-Rezeptoren EP2 und EP4 vermittelt, da der negativ-inotrope

Effekt auf die Kardiomyozyten durch Hemmung beider Rezeptorsubtypen komplett

aufgehoben werden konnte. Durch Hemmung eines der beiden Subtypen war der Effekt

geschwächt. Möglicherweise binden verschiedene Intermediate an die beiden Subtypen, deren

Wirkung sich zu einem Gesamteffekt addiert.

6.3.1. Expression von Prostaglandin-Rezeptoren in adulten Kardiomyozyten

Vor der Durchführung der funktionellen Untersuchungen wurden Kardiomyozyten, die für die

Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet waren, im Western Blot auf Expression der

6 Diskussion

133

verschiedenen Prostaglandin-Rezeptoren und des Thromboxan-Rezeptors untersucht. In den

laminierten Kardiomyozyten konnten außer dem FP-Rezeptor alle Rezeptoren einschließlich

aller DP- und EP-Subtypen mittels Western Blot nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse

wurden bezüglich des EP2- und EP4-Rezeptors in Immunfluoreszenzfärbungen bestätigt.

Prostaglandin-Rezeptoren der Prostaglandin-Subklassen werden nach aktuellem Stand der

Literatur in den meisten Zelltypen und Organen auf einem mehr oder weniger hohen basalen

Level exprimiert. Über die Regulation ihrer Expression ist bis heute wenig bekannt. Eine

Reihe an Studien geben Hinweise darauf, dass die Expression abhängig von der COX-2-

Expression reguliert wird. Dabei induzieren bzw. verstärken vermutlich ähnliche Stimuli die

Prostaglandin-Rezeptor-Expression, die auch die COX-2-Expression induzieren. Shoji et al.

konnten zeigen, dass in Osteoblasten nach Vorbehandlung mit LPS nicht nur die COX-2-

Expression steigt, sondern auch die EP4-Rezeptor-Expression stimuliert wird (Shoji et al.

2006). Harizi et al. konnten eine verstärkte Expression des EP2- und des EP4-Rezeptors nach

Induktion der COX-2-Expression mit LPS nachweisen (Harizi et al. 2003). Ein solcher

Zusammenhang wurde auch für den IP-Rezeptor nachgewiesen (Coleman et al. 1994). In der

vorliegenden Arbeit konnten in den laminierten Kardiomyozyten die COX-2 und außer dem

FP-Rezeptor alle weiteren Prostaglandin-Rezeptoren im Western Blot nachgewiesen werden.

Die COX-2-Expression wurde während der Laminierung der Zellen zusätzlich verstärkt.

Denkbar ist, dass die Verstärkung der COX-2-Expression zusätzlich die Expression der

verschiedenen Prostaglandin-Rezeptoren förderte.

Organ- bzw. Gewebe-spezifische Unterschiede in der Expression konnten vorwiegend bei den

Subtypen der Prostaglandin-Rezeptoren nachgewiesen werden. So wurde z.B. die mRNA des

DP2-Rezeptors in Leber, Lunge, Niere, Herz, Thymus, Milz und Gehirn nachgewiesen, die

mRNA für den DP1-Rezeptor außer in diesen Organen in Haut, Knochenmark, Magen-Darm-

System und in hohen Konzentrationen in Mastzellen (Hirata et al. 1994, Boie et al. 1995,

Narumiya et al. 1999). Die mRNAs für die Rezeptoren EP1-EP4 sind in niedrigen

Konzentrationen ubiquitär in den meisten Geweben exprimiert (Sugimoto et al. 1992, An et

al. 1993, Funk et al. 1993, Bastien et al. 1994, Kotani et al. 1995, Breyer et al. 1996, Nemoto

et al. 1997, Cosme et al. 2000, Southall und Vasko 2001). In großen Mengen konnte der EP1-

Rezeptor in der Niere und der EP3-Rezeptor in Pankreas und Uterus detektiert werden

(Sugimoto et al. 1992, Kotani et al. 1995, Breyer et al. 1996), der EP2-und EP4-Rezeptor in

6 Diskussion

134

höheren Konzentrationen vor allem in Lunge und den Organen des Magen-Darm-Systems

(An et al. 1993, Bastien et al. 1994, Cosme et al. 2000, Southall und Vasko 2001).

In kardialem Gewebe konnten bisher alle Rezeptoren für die verschiedenen Prostaglandin-

Subklassen nachgewiesen werden. Bezüglich der Subtypen-Expression im Myokard ergibt

sich aus der aktuellen Literatur kein einheitliches Bild. Xiao et al. untersuchten beispielsweise

die Expression von EP1-4 in Ventrikeln der adulten Maus und konnten auf mRNA-Ebene den

EP2-, EP3-, und EP4-, aber nicht den EP1-Rezeptor detektieren (Xiao et al. 2004). Qian et al.

konnten hingegen in Mäuseherzen alle vier Subtypen EP1-4 auf mRNA-Ebene detektieren

(Qian et al. 2008). Javanovic et al. konnten in Extrakten aus Rattenmyokard ebenfalls alle vier

Subtypen des EP-Rezeptors auf mRNA-Ebene nachweisen. Die Expression des DP-Rezeptors

und der Subtypen ist im Herzen wenig untersucht. Javanovic et al. detektierten in ihrer Studie

in analogen Experimenten auch die mRNA des DP-Rezeptors im Rattenmyokard, wobei nicht

nach Subtypen unterschieden wurde (Javanovic et al. 2006). Hara et al. konnten in

Mäuseherzen keinen DP-Subtyp auf mRNA-Ebene nachweisen (Hara et al. 2005). Die

Studien, die die Expression von Prostaglandin-Rezeptoren im Säugetierherzen untersuchen,

analysieren die Expression auf mRNA-Ebene. In der vorliegenden Arbeit wurden daher nach

aktuellem Stand der Literatur erstmals auf Proteinebene alle DP- und EP-Subtypen in

isolierten adulten Kardiomyozyten nachgewiesen. Da über die Regulation von Prostaglandin-

Rezeptoren bis heute wenig bekannt ist, ist unklar, warum eine Zelle mehrere Subtypen der

DP- oder EP-Rezeptoren exprimiert. Eine mögliche Vorstellung ist, dass von einzelnen

Subtypen bestimmte Funktionen in der Zelle übernommen werden und daher die Zelle

mehrere Subtypen konstitutiv exprimiert. Die einzelnen Subtypen der DP- und EP-Rezeptoren

unterscheiden sich in ihrer Signaltransduktion und können daher in der Zelle auch

verschiedene Funktionen übernehmen. So schreiben Xiao et al. beispielsweise auch die

kardioprotektive Wirkung von Prostaglandin E2 nach Ischämie ausschließlich dem EP4-

Subtyp zu (Xiao et al. 2004). Martin et al. gehen wiederum davon aus, dass die protektive

Wirkung von Prostaglandin E1 über den EP3-Rezeptor vermittelt wird und dabei kein

weiterer EP-Subtyp eine Rolle spielt (Martin et al. 2005).

IP- und TP-Rezeptoren, von denen keine Subtypen bekannt sind, konnten durchweg in

mRNA-Analysen von kardialem Gewebe nachgewiesen werden. Die stärkste Expression des

TP-Rezeptors konnte bislang in den Blutplättchen detektiert werden, wohingegen eine Reihe

anderer Organe wie Gehirn, Lunge, Nieren und Thymus nur geringe Mengen aufweisen (Mais

6 Diskussion

135

et al. 1992, Namba et al. 1992, Takahashi et al. 1996, Batshake et al. 1999, Simmons et al.

2004). Der IP-Rezeptor ist ubiquitär in den meisten Organen exprimiert (McLaughlin et al.

1998, Southall und Vasko 2001, Cheng et al. 2002, Simmons et al. 2004).

Der FP-Rezeptor konnte in der vorliegenden Arbeit auf Proteinebene in isolierten

Kardiomyozyten mittels Western Blot nicht nachgewiesen werden. Studien, die die

Expression des FP-Rezeptors im Herzen analysieren, zeigen auf mRNA-Ebene durchweg

andere Ergebnisse. Jovanovic et al. konnten sogar zeigen, dass die mRNA für den FP-

Rezeptor im Vergleich zu allen anderen Rezeptoren im Rattenmyokard am stärksten

exprimiert vorliegt (Jovanovic et al. 2006). Da in der vorliegenden Arbeit keine mRNA-

Analysen durchgeführt wurden, kann über die Expression des FP-Rezeptors in den

Kardiomyozyten keine abschließende Aussage getroffen werden. Mittels RT (Reverse

Transkriptase)-PCR (=„Polymerase Chain Reaction“)-Technik können sehr geringe mRNA-

Mengen nachgewiesen werden. Die PCR-Technik ist aufgrund der Möglichkeit zur

Amplifizierung der Fragmente eine sensiblere Methode als der Nachweis auf Proteinebene

mittels Western Blot. Möglicherweise lag die FP-Rezeptor-Menge auf Proteinebene unter der

Nachweisgrenze der Western Blot-Analyse. In jedem Fall spricht der fehlende Nachweis des

FP-Rezeptors im Western Blot gegen eine funktionelle Bedeutung des Rezeptors in den

Kardiomyozyten.

6.3.2. Abhängigkeit des negativ-inotropen Effekts von den Prostaglandin E-Rezeptoren

EP2 und EP4

Prostaglandine und ihre Rezeptoren kommen, wie bereits erläutert wurde, in den meisten

Organen vor und üben vielfältige biologische Funktionen aus. In der Literatur wird vor allem

den Prostaglandinen E und I und den EP-Rezeptoren eine Rolle in der post-ischämischen

Reperfusionsphase im Herzen zugeschrieben. Vereinzelte Studien zeigen aber auch die

Wirkung von Prostaglandinen anderer Subklassen und ihrer Rezeptoren auf myokardiales

Gewebe. So konnte z.B. für Prostaglandin D eine positiv-inotrope Wirkung auf den isolierten

linken Ventrikel aus Maus und Meerschweinchen nachgewiesen werden (Hattori und Levi

1986, Tanaka et al. 2003). Taniguchi et al. gaben außerdem Hinweise auf eine FP- und TP-

Rezeptor-abhängige Hypertrophie in Kardiomyozyten (Taniguchi et al. 2007). In der

vorliegenden Arbeit wurden daher Antagonisten gegen Prostaglandin-Rezeptoren aller

Subklassen und gegen den Thromboxan-Rezeptor eingesetzt.

6 Diskussion

136

Der Effekt des post-ischämischen Effluates konnte durch Vorbehandlung der

Kardiomyozyten mit AH 6809 und AH 23848 komplett aufgehoben werden. AH 23848 ist

hochselektiv für EP4-Rezeptoren, speziesabhängige Effekte sind nicht nachgewiesen

(Coleman et al. 1997, Coleman 2000, Davis und Sharif 2000). AH 6809 ist in Ratte für DP1-,

EP1- und EP2-Rezeptoren selektiv, was den Einsatz weiterer Antagonisten notwendig machte

(Coleman et al. 1985, Abramovitz et al. 2000, Mendez und LaPointe 2002). Durch

Anwendung von SC 19220 konnte die intrazelluläre Signaltransduktion von post-

ischämischem Effluat weiter eingegrenzt und eine Signaltransduktion über EP1-Rezeptoren

ausgeschlossen werden. Durch zusätzliche Anwendung von BW A868C und BAY-u3405

konnte außerdem nachgewiesen werden, dass DP-Rezeptoren keine Rolle bei der Vermittlung

des Effekts von post-ischämischem Effluat spielen. Der Effekt von post-ischämischem Effluat

wurde außerdem durch die hochselektiven und speziesunabhängigen IP- bzw. TP-

Antagonisten CAY 10441 und SQ 29,548 nicht beeinflusst. Die Ergebnisse aus den

Messreihen mit SQ 29,548 stehen im Einklang mit den Ergebnissen der Messreihen mit BAY-

u3405, der den Effekt des post-ischämischen Effluates ebenfalls nicht blockierte. Nach

McKenniff et al. hat BAY-u3405 nämlich eine antagonistische Wirkung auf TP-Rezeptoren in

glatten Muskelzellen von Mensch, Meerschweinchen und Ratte, die allerdings deutlich

schwächer ist als die Wirkung auf den DP2-Rezeptor. Die IC 50 (Inhibitorkonzentration mit

50% blockiertem Rezeptor) von BAY-u3405 liegt bezüglich des TP-Rezeptors bei ca. 200

nmolar für in-„vitro“-Anwendungen (McKenniff et al. 1991). Das heißt, dass nach McKenniff

et al. bei einer experimentellen Konzentration von 1 µmolar, die in der vorliegenden Arbeit

eingesetzt wurde, von einer Inhibierung des TP-Rezeptors durch BAY-u3405 ausgegangen

werden kann.

Nach Auswertung der Literatur über die angewandten Antagonisten lässt sich als

Gesamtergebnis aus den Messreihen zusammenfassen, dass vermutlich der EP2- und der EP4-

Rezeptor die Signaltransduktion „downstream“ der COX-2 vermitteln. DP-, FP-, IP- und TP-

Rezeptoren spielen bei der Vermittlung des negativ-inotropen Effekts vermutlich keine Rolle.

Da der FP-Rezeptor im Western Blot in den Kardiomyozyten nicht nachgewiesen werden

konnte und daher eine funktionelle Bedeutung des FP-Rezeptors ohnehin unwahrscheinlich

ist, wurde in der vorliegenden Arbeit kein FP-Antagonist eingesetzt. FP-Rezeptoren leiten

zudem ihre Signale über die Proteinkinase C ins Zellinnere weiter. Nach den vorliegenden

Ergebnissen wird der Effekt von post-ischämischem Effluat aber über eine Aktivierung der

Proteinkinase A vermittelt. Für den EP3-Rezeptor aus der Ratte gibt es, wie bereits erläutert

6 Diskussion

137

wurde, keinen kommerziell erhältlichen Antagonisten. Für diesen Rezeptor ist eine Kopplung

an Gi- und an Gq-Proteine und damit eine Signaltransduktion über eine Proteinkinase A-

Inhibierung oder Proteinkinase C-Aktivierung nachgewiesen (siehe Abb.5.27.). Eine Gs-

Kopplung, die zu einer Aktivierung der Proteinkinase A führt, konnte für den Rezeptor

bislang nicht gezeigt werden. Die Abhängigkeit des Effekts von der Aktivierung der

Proteinkinase A schließt somit den EP3-Rezeptor als mögliche Komponente der

Signaltransduktion von post-ischämischem Effluat aus.

Die post-ischämische Bedeutung von EP-Rezeptoren ist an verschiedenen Organen vielfach

untersucht und wird in der Literatur intensiv diskutiert. Bei den Untersuchungen wird

durchweg von einer Aktivierung der Rezeptoren nach einer längeren Reperfusionsphase durch

Prostaglandin E1 oder E2 ausgegangen und die Gewebeprotektion anhand des Ausmaßes der

Zellschädigung bestimmt, z.B. im Herzen anhand der Infarktgröße. Der Effekt des EP3- und

EP4-Rezeptors wird in diesen Untersuchungen durchweg als Gewebe-protektiv verstanden,

eine Funktion des EP1-Rezeptors ist in diesem Zusammenhang bislang nicht nachgewiesen

worden. Für den EP2-Rezeptor ist sowohl eine protektive als auch eine schädliche Wirkung

nach Ischämie belegt. Generell ist die funktionelle Bedeutung des EP2-Rezeptors in der post-

ischämischen Reperfusionphase bislang nur in neuronalem Gewebe und nicht in

myokardialem Gewebe untersucht. Liu et al. konnten z.B. einen protektiven Effekt von EP2

bei einer länger andauernden Ischämie in einem Model von Gehirnschnitten der Ratte

nachweisen (Liu et al. 2008). Die Studie von Takadera und Ohyashiki gibt hingegen Hinweise

auf schädigende Effekte von EP2-vermittelter Signaltransduktion in kortikalen Nervenzellen

(Takadera und Ohyshiki 2006). Die funktionelle Bedeutung des EP4-Rezeptors nach Ischämie

ist in Neuronen, der Leber, dem Darm und im Herzen untersucht (Blikslager et al. 2001, Xiao

et al. 2004, Kuzumoto et al. 2005, Choi und Lee 2006). Kuzumoto et al. konnten durch

Anwendung von hochselektiven Agonisten zeigen, dass der PGE2-EP4-Signalweg eine Rolle

spielt bei der Eindämmung des Ischämie-Reperfusionsschadens in der murinen Leber

(Kuzumoto et al. 2005). Xiao et al. untersuchten die Wirkung des spezifischen EP4-Rezeptor-

Agonisten 4819-CD auf myokardiales Gewebe der Maus. Die Autoren arbeiteten mit EP4-

„Knockout“-Tieren und konnten zeigen, dass Mäuse, die den Prostaglandin E-Rezeptorsubtyp

EP4 exprimieren, post-ischämisch eine reduzierte Infarktgröße aufweisen im Vergleich zu

EP4-„Knockout“-Mäusen. Eine Vorbehandlung von Wildtyp-Mäusen mit 4819-CD reduzierte

ebenfalls signifikant die Infarktgröße (Xiao et al. 2004).

6 Diskussion

138

Die „Knockout“-Studie von Xiao et al. gibt deutliche Hinweise auf eine EP4-vermittelte

Reduzierung der Infarktgröße nach Ischämie und damit auf einen kardioprotektiven Effekt

von EP4-vermittelter Signaltransduktion in der post-ischämischen Phase nach einer längeren

Reperfusion von 24 h. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen ebenfalls auf eine

protektive Bedeutung von EP4-vermittelter Signaltransduktion nach Ischämie schließen,

wobei aber die Kardioprotektion vermutlich durch negativ-inotrope Wirkung von Substanzen

zustande kommt, die in der frühen Reperfusionsphase freigesetzt werden. Die vorliegenden

Ergebnisse liefern außerdem Hinweise auf eine funktionelle Bedeutung von EP2-Rezeptoren

nach einer myokardialen Ischämie.

6.3.3. Rückschlüsse auf die Identität der in den Kardiomyozyten gebildeten

Intermediate

Endogene Agonisten für EP2- und EP4-Rezeptoren sind Prostaglandine der Subklasse E. Die

vorliegenden Ergebnisse lassen daher vermuten, dass in den Kardiomyozyten aus den

Substanzen des post-ischämischen Effluates Prostaglandin E gebildet wird, das durch

Bindung an die Rezeptoren EP2 und EP4 den negativ-inotropen Effekt vermittelt. Denkbar ist

außer einer Bindung von Prostaglandin E eine Kreuzreaktion von EP2 und EP4 mit einem

Prostaglandin einer anderen Subklasse. Solche Reaktionen sind bislang für Prostaglandin D2

und Prostaglandin I2 nachgewiesen worden (Tanaka et al. 2003, Shinmura et al. 2005). Für

Prostaglandin F und Thromboxane sind bislang keine Kreuzreaktionen bekannt, die

vermutlich durch die ähnliche Molekülstruktur der Subklassen-Prostaglandine und ihrer

Rezeptoren zustande kommen. In jedem Fall vermitteln die in den Kardiomyozyten

gebildeten Intermediärprodukte den negativ-inotropen Effekt auf die Zellen, d.h. die

Intermediate sind die „aktiven“ Mediatoren, die aus den „Ausgangsmediatoren“ in post-

ischämischem Effluat gebildet werden.

Synthetisch hergestellte Prostaglandine dienten in der vorliegenden Arbeit dazu, den Effekt

der möglichen Intermediärprodukte zu simulieren und ihre Signaltransduktion mit Hilfe

derselben Rezeptor-Antagonisten zu analysieren, mit denen die Signalwirkung von post-

ischämischem Effluat untersucht wurde. Das übergeordnete Ziel dabei war, die Anzahl der

möglichen Intermediärverbindungen weiter einzugrenzen. Synthetisch hergestelltes

Prostaglandin E2 und I2 wirkte auf isolierte adulte Kardiomyozyten negativ-inotrop,

wohingegen Prostaglandin D2 die Basalwerte von Kontraktilität und Calciumtransient nicht

6 Diskussion

139

beeinflusste. Prostaglandin E2 zeigte eine dem post-ischämischen Effluat analoge

Signaltransduktion über EP2- und EP4-Rezeptoren und abhängig von der Proteinkinase A.

Prostaglandin I2 vermittelt nach den vorliegenden Ergebnissen den negativ-inotropen Effekt

ebenfalls abhängig von der Proteinkinase A. Der EP2-Rezeptor spielt nach den vorliegenden

Ergebnissen bei der Wirkung von Prostaglandin I2 auf die isolierten Kardiomyozyten

vermutlich keine Rolle. Nach diesen Ergebnissen kommen sowohl Prostaglandin E2 als auch

Prostaglandin I2 als aus dem post-ischämischem Effluat gebildete Intermediate in Frage. Eine

Rolle von Prostaglandin D2 ist aufgrund der vorliegenden Ergebnisse unwahrscheinlich.

Für beide in Frage kommenden Prostaglandine sind die Effekte auf myokardiales Gewebe gut

untersucht und die negativ-inotrope Wirkung gezeigt. Für Prostaglandin E2 ist der Effekt auf

isolierte adulte Rattenkardiomyozyten, für Prostaglandin I2 auf neonatale und adulte

Kardiomyozyten aus der Ratte und auf das adulte gesamte Herz belegt (Auclair et al. 1988,

Oriji 2000, Klein et al. 2004). Der Mechanismus der negativ-inotropen Signaltransduktion

von Prostaglandin E2 auf adulte Kardiomyozyten wurde bislang nicht weiter analysiert. Die

vorliegende Arbeit belegt daher erstmals eine Rolle von EP2- und EP4-Rezeptoren bei der

negativ-inotropen Wirkung von Prostaglandin E2. Die Wirkung von Prostaglandin E2 über

EP2-Rezeptoren ist im Herzen bislang nicht untersucht. Eine PGE2-EP4-vermittelte

Signaltransduktion wird in der kardiologischen Forschung häufig funktionell mit der

Entwicklung von kardialer Hypertrophie, aber auch, wie bereits erläutert wurde, in der Studie

von Xiao et al. mit einer Verminderung des Ischämie-Reperfusions-Schadens in Verbindung

gebracht, die sich in einer Reduzierung der Infarktgröße äußert (Xiao et al. 2004, Frias et al.

2007). Die genauen zellulären Mechanismen, die post-ischämisch zum Schutz von

myokardialem Gewebe durch PGE2-EP4-Signaltransduktion führen, wurden von Xiao et al.

nicht analysiert. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit vermittelt möglicherweise

Prostaglandin E2 als Intermediat durch negativ-inotrope Wirkung über die beiden Rezeptoren

EP2 und EP4 den kardioprotektiven Effekt. Für Prostaglandin I2 wird bei der Verminderung

der Kontraktilität durchweg eine Aktivierung des IP-Rezeptors angenommen (Auclair et al.

1988, Oriji 2000). Shinmura et al. konnten außerdem zeigen, dass Prostaglandin I2 über den

EP3-Rezeptor in adulten Kardiomyozyten wirkt, die mit H2O2 vorbehandelt wurden. Die

Autoren untersuchten nicht, ob Prostaglandin I2 eine negativ-inotrope Wirkung auf die Zellen

hat, konnten aber zeigen, dass Prostaglandin I2 protektiv auf die Zellen durch die Aktivierung

von Kalium(ATP)-Kanälen wirkt (Shinmura et al. 2005). Damit ist für Prostaglandin I2 eine

protektive Wirkung auf Kardiomyozyten durch Bindung an einen EP-Rezeptorsubtyp und

6 Diskussion

140

„downstream“-Aktivierung von Kalium(ATP)-Kanälen, in diesem Fall von mitochondrialen

Kanälen, belegt. Die Studie von Shinmura et al. untermauert die Ergebnisse der vorliegenden

Arbeit und unterstützt die Hypothese, dass es sich bei einem der Intermediate, die aus dem

post-ischämischen Effluat gebildet werden, um Prostaglandin I2 handeln könnte. Der

protektive Effekt von Prostaglandin I2 ist im Allgemeinen in der Literatur häufiger untersucht

und belegt als die Kardioprotektion durch Prostaglandin E2. Szekeres et al. schreiben

Prostaglandin I2 gerade in der frühen post-ischämischen Phase eine protektive Wirkung zu,

die sich in einer geringeren Zellschädigung und anti-arrhythmischen Effekten zeigt (Szekeres

et al. 1991). Eine protektive Wirkung von Prostaglandin I1 oder I3, die aus

Dihomogammlinolensäure bzw. Eicosapentaensäure entstehen, ist nicht bekannt. Hohlfeld et

al. und Martin et al. konnten allerdings für Prostaglandin E1 einen protektiven Effekt post-

ischämisch auf myokardiales Gewebe nachweisen. Beide Studien konnten einen protektiven

Effekt von Prostaglandin E1 in Mäuse- bzw. Schweineherzen zeigen, der über den EP3-

Rezeptor vermittelt wird (Hohlfeld et al. 2000, Martin et al. 2005). Für Prostaglandin E3, das

aus der kardioprotektiven Eicosapentaensäure entsteht, ist bislang kein Effekt nach Ischämie

nachgewiesen worden.

Wie in Abschnitt 6.2.5. bereits ausführlich dargestellt wurde, kann über die chemische

Identität der Ausgangsverbindungen im post-ischämischen Effluat nach den vorliegenden

Untersuchungen nur spekuliert werden. Daher kommen prinzipiell als Intermediate

Prostaglandin E und Prostaglandin I aller drei Serien in Frage. Nach Auswertung der

aktuellen Literatur und den vorliegenden Ergebnissen liegt jedoch die Vermutung nahe, dass

aus den Verbindungen im post-ischämischen Effluat als Intermediate in den Kardiomyozyten

Prostaglandin E2 und Prostaglandin I2 gebildet werden. Nach den Studien von Hohlfeld et al.

und Martin et al. ist außerdem eine Rolle von Prostaglandin E1 bei der Vermittlung des

negativ-inotropen Effekts von post-ischämischem Effluat denkbar.

6.4. Abhängigkeit des negativ-inotropen Effekts von der Proteinkinase A

Bei Rp-cAMPS handelt es sich um ein zyklisches cAMP-Analogon, das membranpermeabel

ist und kompetitiv die Proteinkinase A inhibiert (Staudt et al. 2001). Myr-PKC[19-27] ist ein

myristyliertes, Zellmembran-permeables Nonapeptid, das als Pseudosubstrat die

Proteinkinase C hemmt (Eichholtz et al. 1993). Rp-cAMPS blockierte im Gegensatz zu Myr-

PKC[19-27] den Effekt von post-ischämischem Efluat auf die Kardiomyozyten.

6 Diskussion

141

Kardiomyozyten, die mit Proteinkinase A-stimulierendem Isoproterenol vorbehandelt waren,

reagierten stärker negativ-inotrop als unbehandelte Zellen. Eine Inkubation von

Kardiomyozyten mit post-ischämischem Effluat ergab außerdem eine Steigerung der cAMP-

Konzentration. Aus diesen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass der negativ-inotrope Effekt

von post-ischämischem Effluat über eine Aktivierung der Proteinkinase A vermittelt wird.

Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit den Ergebnissen aus der Anwendung der

verschiedenen Prostaglandin-Rezeptor-Antagonisten, da EP2- und EP4-Rezeptoren ihre

Signaltransduktion über die Proteinkinase A vermitteln (Simmons et al. 2004, Xiao et al.

2004, Wang und Klein 2007). Vermutlich kommt es durch Gs-Proteine, die an EP2- und EP4-

Rezeptoren koppeln, zur Aktivierung der Proteinkinase A und „downstream“ zum negativ-

inotropen Effekt.

Felix et al. untersuchten den Effekt von post-ischämischem Effluat auf die cAMP-

Konzentration und die Proteinkinase A-Aktivität in Rattenherzen. Die Autoren konnten nur

einen minimalen Anstieg der cAMP-Konzentration in den Herzen detektieren und schlossen

daraus, dass cAMP und die Proteinkinase A keine Rolle bei der Vermittlung des negativ-

inotropen Effekts von post-ischämischem Effluat spielen. Die Autoren setzten zur weiteren

Analyse ihrer Ergebnisse keine Enzyminhibitoren ein (Felix et al. 2001). Nach den

Ergebnissen der vorliegenden Arbeit hingegen ist von einer Aktivierung der Proteinkinase A

„downstream“ von EP2 und EP4 auszugehen. Die Ergebnisse beruhen zum einen auf cAMP-

Analysen und zum anderen aber auch auf Experimenten mit Inhibitoren und Antagonisten.

Diese Ergebnisse zeigen eindeutig eine Aufhebung des Effekts von post-ischämischem

Effluat durch Rp-cAMPS und AH 6809/AH 23848.

Es konnte bislang sowohl eine positiv- als auch eine negativ-inotrope Wirkung von

Proteinkinase A-abhängiger Signaltransduktion auf myokardiales Gewebe nachgewiesen

werden, wobei die positiv-inotrope Wirkung der herkömmlichen Vorstellung der

Proteinkinase A-Wirkung entspricht (Layland et al. 2004, Collis et al. 2007). Dabei wird

davon ausgegangen, dass die Proteinkinase A Kanaluntereinheiten von L-Typ-

Calciumkanälen phosphoryliert, was durch die Öffnung der Kanäle positiv-inotrop auf die

Kardiomyozyten wirkt. Die Proteinkinase A-Signaltransduktion wird vor allem im Rahmen

der Erforschung der Signalwirkung an �-adrenergen Rezeptoren untersucht. Eine neuere

Arbeit von Faucher et al. weist die Beteiligung der Proteinkinase A an einer negativ-inotropen

Signaltransduktion nach. Faucher et al. konnten an Papillarmuskelzellen von

6 Diskussion

142

Meerschweinchen zeigen, dass Salbutamol, ein Agonist von �-adrenergen Rezeptoren, über

eine Proteinkinase A-Aktivierung einen negativ-inotropen Effekt hat (Faucher et al. 2007).

Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit wird der Effekt von post-ischämischem

Effluat vermutlich auf die Kardiomyozyten über die Aktivierung von sarkolemmalen

Kalium(ATP)-Kanälen vermittelt. Das heißt, die vorliegenden Ergebnisse deuten nicht, wie

von Felix et al. 2001 untersucht wurde, auf eine Verbindung zwischen der Proteinkinase A

und Calciumkanälen hin, sondern auf eine Verbindung zu Kalium(ATP)-Kanälen. Aus der

Literatur gibt es Hinweise darauf, dass die Proteinkinase A dabei möglicherweise

„Verbindungsglied“ zwischen EP-Rezeptoren und sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen ist.

Eguchi et al. konnten beispielsweise nachweisen, dass Prostaglandin E1 über eine

Aktivierung des Enzyms eine Öffnung von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen in glatten

Gefäßmuskelzellen und damit eine Entspannung der Gefäße bewirkt. Die Autoren

analysierten nicht, über welchen Rezeptortyp der Effekt vermittelt wird (Eguchi et al. 2007).

Eine Verbindung zwischen der Proteinkinase A und Kalium(ATP)-Kanälen konnte außerdem

von Hudman et al. gezeigt werden. Die Autoren konnten an Muskelzellen der Blase von

Ratten belegen, dass eine Aktivierung der Proteinkinase A über �-adrenerge Rezeptoren zur

Öffnung von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen und dadurch letztendlich zur Reduktion

der Kontraktilität der Zellen führt. Den genauen molekularen Mechanismus ließen die

Autoren offen (Hudman et al. 2000). Shi et al. konnten wie auch eine Reihe anderer

Forschergruppen zeigen, dass in vaskulären glatten Muskelzellen die Proteinkinase A durch

direkte Modulation, d.h. durch Phosphorylierung von Kanaluntereinheiten die Öffnung der

Kanäle bewirkt (Shi et al. 2007). In Kardiomyozyten sind solche Zusammenhänge weniger

untersucht. Xu et al. konnten jedoch beispielsweise eine Aktivierung von Kalium(ATP)-

Kanälen durch das kardioprotektive Peptid Urocortin in adulten Kardiomyozyten der Ratte

nachweisen. Dieser Effekt konnte durch die Anwendung von Rp-cAMPS blockiert werden.

Der genaue Mechanismus der Aktivierung blieb offen (Xu et al. 2006).

Die Proteinkinase A ist eine zentrale Schaltstelle in der Vermittlung von

Signaltransduktionsmechanismen. Daher wird auch ihre Rolle in der post-ischämischen

Reperfusionsphase intensiv untersucht. Im Rahmen der ischämischen Präkonditionierung am

Herzen wird der Proteinkinase A eine zentrale Rolle bei der Vermittlung von protektiven

Effekten beigemessen. Dabei konnten unterschiedliche Mechanismen mit unterschiedlichen

Komponenten „upstream“ und „downstream“ des Enzyms identifiziert werden (Lan et al.

2005, Robinet et al. 2005, Peart und Gross 2006). Verbindungen zu Kalium(ATP)-Kanälen

6 Diskussion

143

und negativ-inotrope Effekte sind in diesem Zusammenhang bislang nicht nachgewiesen

worden. In der vorliegenden Arbeit ist die Proteinkinase A vermutlich als Vermittler

zwischen EP2-/EP4-Rezeptoren und sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen einzuordnen.

Möglicherweise modifiziert die Proteinkinase A in der Signaltransduktionskette

Kanaluntereinheiten, was zur Öffnung der Kanäle führt und dadurch den negativ-inotropen

Effekt bewirkt.

6.5. Nachweis des kardioprotektiven Effekts von post-ischämischem Effluat

Der negativ-inotrope Effekt der Substanzen im post-ischämischen Effluat deutete ihre

kardioprotektive Wirkung an. Die Öffnung von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen und

der Schutz der Kardiomyozyten vor einer Überladung mit Calcium werden ebenfalls als

wichtige Mechanismen der Kardioprotektion verstanden. Für die funktionelle

Charakterisierung von post-ischämischem Effluat wurde daher die Rolle von sarkolemmalen

Kalium(ATP)-Kanälen in der Signaltransduktion des Effluates untersucht und außerdem die

Wirkung des Effluates auf Kardiomyozyten analysiert, die erhöhten extrazellulären

Calciumkonzentrationen ausgesetzt waren. Die aktivierende Wirkung von Substanzen aus

dem Arachidonsäure-Stoffwechsel auf Kalium(ATP)-Kanäle, die in zahlreichen

Forschungsarbeiten nachgewiesen werden konnte, lieferte einen zusätzlichen Hinweis auf

eine Beteiligung von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen bei der Vermittlung des negativ-

inotropen Effekts von post-ischämischem Effluat.

6.5.1. Schutz vor Überladung der Kardiomyozyten mit Calcium

In zahlreichen Studien konnte gezeigt werden, dass eine Ischämie zu einer Überladung der

Kardiomyozyten mit Calcium („calcium-overload“) führt (Ferrari et al. 1996, Wang et al.

2001, Szenczi et al. 2005, Halestrap 2006). Das bedeutet, dass die Calciumkonzentration in

der Zelle cytoplasmatisch und mitochondrial drastisch ansteigt. Eine erhöhte cytoplasmatische

Calciumkonzentration zieht eine Steigerung des Calciumtransienten und damit der

Kontraktilität nach sich und kann daher eine kontraktile Dysfunktion auslösen. Um einen

solchen „calcium-overload“ zu simulieren, wurde die Wirkung von post-ischämischem

Effluat im Vergleich zu nicht-ischämischem Effluat auf die Kardiomyozyten in Puffer mit

doppelter Calciumkonzentration untersucht. Die Steigerung von Calciumtransient und

Kontraktilität wurde durch post-ischämisches Effluat im Gegensatz zu nicht-ischämischem

6 Diskussion

144

Effluat vermindert. Eine Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration führt zu einer

verstärkten Aufnahme von Calcium durch die Zelle und damit zu einer höheren diastolischen

Calciumkonzentration im Cytoplasma. Das steigert den Calciumtransienten und damit die

Kontraktilität der Zelle. Die Öffnung von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen wirkt der

Depolarisation der Zelle entgegen (siehe auch Abschnitt 1.2.5. und 1.5.1.), d.h. die

Depolarisation wird verkürzt (Faivre und Findlay 1990). Das führt wiederum zu einer

verkürzten Öffnung von spannungsgesteuerten L-Typ-Calciumkanälen in der

Cytoplasmamembran der Muskelzelle. Das verringert die Aufnahme von Calcium in die Zelle

durch die Calciumkanäle und führt dadurch zu einer reduzierten Aktivierung von

sarkoplasmatischen Ryanodin-Rezeptoren und deshalb zu einer verminderten

Calciumfreisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum. Somit wird der Calciumtransient

und in Folge davon die Kontraktilität reduziert. Letztendlich bewirkt post-ischämisches

Effluat vermutlich über die Öffnung von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen die

verminderte Aufnahme von Calcium in die Zelle und schützt die Zelle dadurch vor einer

Überladung mit Calcium. Der Schutz von Kardiomyozyten vor Calciumüberladung durch die

Aktivierung von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen wurde beispielsweise von Baumann

et al. belegt (Baumann et al. 2002).

In der kardiologischen Forschung sind die Zusammenhänge bei der mitochondrialen

Calciumüberladung nach Ischämie intensiv untersucht. Dabei wird den mitochondrialen

Kalium(ATP)-Kanälen eine protektive Bedeutung beigemessen, die letztendlich die durch

Calciumüberladung hervorgerufene Dysfunktion der Mitochondrien vermindern (Riess et al.

2002). Der genaue molekulare Mechanismus der Protektion ist bislang nicht bekannt. In der

vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von post-ischämischem Effluat auf mitochondriale

Kalium(ATP)-Kanäle nicht untersucht. Daher können zusätzliche protektive Mechanismen

von post-ischämischem Effluat, die über mitochondriale Kalium(ATP)-Kanäle vermittelt

werden, nicht ausgeschlossen werden.

6.5.2. Beeinflussung von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen

Der Effekt von post-ischämischem Effluat wurde durch Glibenclamid, einem in der

Kardiologie häufig angewandten Antagonisten für sarkolemmale und mitochondriale

Kalium(ATP)-Kanäle, und HMR-1098, einem gängigen Antagonisten für sarkolemmale

Kalium(ATP)-Kanäle, aufgehoben. Während Felix et al. 2001 noch von einer direkten

6 Diskussion

145

Interaktion der Substanzen aus dem post-ischämische Effluat mit L-Typ-Calciumkanälen

ausgingen, spielt nach den vorliegenden Ergebnissen die Öffnung von sarkolemmalen

Kalium(ATP)-Kanälen eine zentrale Rolle bei der Vermittlung des Effekts von post-

ischämischem Effluat. Die Anwendung von Cromakalim, einem Öffner von sarkolemmalen,

myokardialen Kalium(ATP)-Kanälen, bewirkte einen negativ-inotropen Effekt auf die

Kardiomyozyten.

Zahlreiche Studien belegen, dass Substanzen aus dem Arachidonsäure-Stoffwechsel

aktivierende Wirkung auf Kalium(ATP)-Kanäle haben. Bislang konnten aktivierende Effekte

sowohl auf mitochondriale als auch auf sarkolemmale Kalium(ATP)-Kanäle nachgewiesen

werden. Aimond et al. postulierten eine neue Gruppe von sarkolemmalen Kalium(ATP)-

Kanälen in Kardiomyozyten, die unter anderem durch Arachidonsäure aktiviert werden

(Aimond et al. 2000). Lu et al. lieferten durch ihre Studie außerdem Hinweise auf eine

Aktivierung der Kanäle durch Epoxyeicosatetraensäuren in adulten Kardiomyozyten der

Ratte. Die Autoren zeigten, dass die Kanäle durch direkte Bindung der Säuren aktiviert

werden, vermutlich durch Herabsetzung der Sensibilität der Kanäle für ATP (Lu et al. 2001).

Wie bereits ausführlich in Abschnitt 6.3.3. erläutert wurde, kommen Arachidonsäure und

Epoxyeicosatetraensäuren als Ausgangsverbindungen im post-ischämischen Effluat in Frage.

Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit vermitteln diese Ausgangssubstanzen nicht

direkt den negativ-inotropen Effekt auf die Kardiomyozyten, sondern werden in den Zellen

durch die COX-2 zu Intermediärprodukten wie z.B. Prostaglandin E2 oder Prostaglandin I2

umgesetzt, die an EP2-/EP4-Rezeptoren binden und letztendlich sarkolemmale Kalium(ATP)-

Kanäle aktivieren. Choi et al. zeigten eine Aktivierung von sarkolemmalen Kalium(ATP)-

Kanälen über eine Bindung von Prostaglandin E2 an EP2-Rezeptoren in kultivierten Zellen

aus dem Dünndarm von Mäusen (Choi und Jun 2006). In kardialem Gewebe ist nach aktueller

Literatur ein solcher Zusammenhang nicht gezeigt.

Wie bereits erläutert wurde, kommt es durch die Öffnung von sarkolemmalen Kalium(ATP)-

Kanälen zu einer verkürzten Depolarisation der Kardiomyozyten und dadurch letztendlich zu

einem Schutz der Zellen vor Calciumüberladung. Die Öffnung der Kanäle während einer

Ischämie und der dadurch entstandene kardioprotektive Effekt bleibt in der

Reperfusionsphase erhalten (Fryer et al. 2001). Epoxyeicosatetraensäuren wie 11,12-EET und

14,15-EET zeigen protektive Effekte in der post-ischämischen Reperfusionsphase, die sie

über Kalium(ATP)-Kanäle vermitteln. Vermutlich wirken sowohl 11,12-EET als auch 14,15-

6 Diskussion

146

EET aktivierend auf mitochondriale und sarkolemmale Kalium(ATP)-Kanäle durch direkte

Bindung. Der Wirkungsmechanismus ist unklar, schließt aber bei Beteiligung der

mitochondrialen Kalium(ATP)-Kanäle die Bildung von freien Sauerstoffradikalen ein

(Nithipatikom et al. 2006). Ein kardioprotektiver Effekt durch Prostaglandine, der über EP-

Rezeptoren und Kalium(ATP)-Kanäle vermittelt wird, ist bislang nur für mitochondriale

Kanäle nachgewiesen und wird vermutlich über den EP3-Subtyp vermittelt (Zacharowski et

al. 1999, Shinmura et al. 2005). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit untermauern diese

Forschungsergebnisse und geben Hinweise auf einen protektiven

Signaltransduktionsmechanismus, der post-ischämisch über EP-Rezeptoren in Verbindung

mit sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen vermittelt wird, deren Aktivierung negativ-inotrop

auf die Muskelzellen wirkt.

6.5.3. Kardioprotektion durch COX-2, Prostaglandin E/I und EP-Rezeptoren

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit geben Hinweise auf eine post-ischämische

Signaltransduktion, bei der während der frühen Reperfusionsphase Mediatoren freigesetzt

werden, die in isolierten Kardiomyozyten durch die COX-2 zu Intermediaten, vermutlich zu

Prostaglandinen der Subklassen E oder I, umgesetzt werden, die über EP2-/EP4-Rezeptoren

durch die Aktivierung von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen negativ-inotrop und

kardioprotektiv wirken. In vorangehenden Abschnitten wurde bereits ausführlich dargestellt,

dass der COX-2, den Prostaglandinen E und I und EP-Rezeptoren post-ischämisch eine

kardioprotektive Bedeutung beigemessen werden. Die Forschungsarbeiten, die die

kardioprotektive Funktion belegen, analysieren die Rolle und Effekte der COX-2 oder der

Prostaglandine bzw. ihrer Rezeptoren. Die kardioprotektive Funktion wurde in diesen

Arbeiten in der Regel aus der Verminderung der Infarktgröße während der Reperfusion

abgeleitet. Bislang wurde keine Signaltransduktionskette nachgewiesen, bei der COX-2-

Produkte über EP-Rezeptoren, über eine Aktivierung der Proteinkinase A und eine

Aktivierung von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen in Kardiomyozyten negativ-inotrop

bzw. kardioprotektiv wirken. In der Literatur sind Teile dieser Signalkette als protektiv nach

Ischämie belegt. Die Arbeiten von Shinmura et al. und Xiao et al. zeigten Zusammenhänge

zwischen einzelnen Komponenten der Signalkette. Shinmura et al. gaben Hinweise auf eine

Signalkette über COX-2, Prostaglandin I, EP-Rezeptoren und mitochondrialen Kalium(ATP)-

Kanälen, die kardioprotektiv ist, Xiao et al. auf eine post-ischämische Signalkette, die über

6 Diskussion

147

Prostaglandin E2, EP4-Rezeptoren und der Proteinkinase A protektive Wirkung hat (Xiao et

al. 2004, Shinmura et al. 2005).

6.6. Schlussfolgerungen für das post-ischämische, reperfundierte Herz in „vivo“

Überträgt man die Zusammenhänge aus den vorliegenden Ergebnissen auf das Herz unter in-

„vivo“-Bedingungen führen die Ergebnisse zu der Hypothese, dass im Herzen während der

frühen Reperfusionsphase Mediatoren freigesetzt werden, die von den Kardiomyozyten

gebildet und/oder aufgenommen werden und in den Kardiomyozyten durch die basal

exprimierte COX-2 in negativ-inotrope Faktoren, vermutlich Prostaglandine, umgesetzt

werden. Die Intermediate werden lokal sekretiert und reduzieren über EP-Rezeptoren den

Calciumtransienten und die Kontraktilität der Kardiomyozyten. Der negativ-inotrope Effekt

wird durch die Öffnung von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen bewirkt. Dadurch wird

das Myokard vor einer nach Ischämie auftretenden Calciumüberladung geschützt, die

Mediatoren wirken kardioprotektiv.

Eine Besonderheit des vorliegenden Untersuchungsmodells ist, wie bereits erläutert wurde,

die Verwendung von nicht-ischämischen Kardiomyozyten zur Analyse post-ischämischer

Signaltransduktion. Die Wirkung von post-ischämischem Effluat auf post-ischämische

Kardiomyozyten wurde in der vorliegenden Arbeit nicht untersucht. In unserer Arbeitsgruppe

konnten keine intakten Kardiomyozyten aus post-ischämischen Herzen isoliert werden.

Ischämische Bedingungen führen auf zellulärer Ebene zu zahlreichen physiologischen und

molekularbiologischen Veränderungen, z.B. Dysfunktion von Mitochondrien und dem

sarkoplasmatischen Retikulum oder eine reduzierte Sensibilität der Myofilamente für

Calcium. Quantitative und qualitative Unterschiede in der Reaktion post-ischämischer

Kardiomyozyten auf das post-ischämische Effluat im Vergleich zu nicht-ischämischen Zellen

können daher nicht ausgeschlossen werden.

7 Ausblick

148

7 Ausblick

Durch Anwendung verschiedener Inhibitoren wurden in der vorliegenden Arbeit die

„Ausgangsmediatoren“ in post-ischämischem Effluat physiologisch an isolierten

Kardiomyozyten charakterisiert. Nach den vorliegenden Ergebnissen werden die

„Ausgangsmediatoren“ im post-ischämischem Effluat vermutlich aus dem Arachidonsäure-

Stoffwechsel freigesetzt und in isolierten Kardiomyozyten durch die COX-2 in negativ-

inotrope Intermediate, vermutlich Prostaglandin E oder I, umgesetzt. Bislang wurde keine

Verbindung, die ein Substrat für die COX-2 darstellt, aus dem post-ischämischen Effluat oder

einzelne Intermediate chemisch identifiziert.

Vermutlich werden bei Gewinnung des post-ischämischen Effluates Abbauprodukte von

Biomembranen freigesetzt, wie z.B. Arachidonsäure oder andere Eicosatetraensäuren, die den

Ausgangspunkt der negativ-inotropen Signaltransduktion in den isolierten Kardiomyozyten

darstellen. Die vorliegende Arbeit konzentrierte sich auf die Verstoffwechselung der

„Ausgangsmediatoren“ in den isolierten Kardiomyozyten. Ein Anknüpfungspunkt an die

vorliegenden Ergebnisse wäre die Durchführung von Experimenten, die die Bildung der

Mediatoren analysieren. Durch Vorbehandlung der Rattenherzen mit Inhibitoren z.B. für die

Phospholipasen A2, C oder D oder Cytochrom P450 vor der Gewinnung des post-

ischämischen Effluates könnten Bildungswege der „Ausgangsmediatoren“ identifiziert

werden. Aus diesen Experimenten könnten weitere Rückschlüsse auf die Identität der

Substanzen gezogen werden. Die Experimente würden damit auch der Vorbereitung von

HPLC-Fraktionierungen von post-ischämischem Effluat und anschließenden

massenspektrometrischen Analysen der Fraktionen dienen. In diesen Analysen könnte post-

ischämisches Effluat gezielt auf ausgewählte Inhaltsstoffe getestet werden und einzelne

Verbindungen chemisch identifiziert werden.

In den isolierten Kardiomyozyten werden vermutlich Prostaglandin E oder Prostaglandin I als

Intermediate gebildet, die durch Bindung an EP2-/EP4-Rezeptoren auf der Zelloberfläche den

negativ-inotropen Effekt vermitteln. Voraussetzung für die Bildung der Prostaglandine der

verschiedenen Subklassen und Serien ist außer der COX-2-Expression die Expression der

Subklassen-spezifischen Synthasen. Ein experimenteller Anknüpfungspunkt wäre daher die

Analyse der Synthasen-Expression im Western Blot. Ein weiterer Anknüpfungspunkt wäre

der Test von Lysaten adulter Kardiomyozyten, die mit post-ischämischem Effluat

7 Ausblick

149

vorbehandelt wurden, auf Bildung von Prostaglandinen, z.B. im ELISA oder durch

Gaschromatografie. Die Bestätigung der COX-2-Abängigkeit von post-ischämischem Effluat

an neonatalen Kardiomyozyten eröffnet weitere experimentelle Perspektiven, da neonatale im

Vergleich zu den adulten Zellen über mehrere Wochen kultivierbar sind. Es wäre daher

möglich, Kardiomyozyten über längere Zeit mit den Effluaten vorzuinkubieren und dann

beispielsweise zu testen, ob die neonatalen Kardiomyozyten Prostaglandine sekretieren, die

im Kulturüberstand nachgewiesen werden können. Außerdem sollte geklärt werden, ob

„downstream“ der COX-2 in neonatalen Kardiomyozyten die Signaltransduktion von post-

ischämischem Effluat wie bei den adulten Zellen über EP2-/EP4-Rezeptoren vermittelt wird.

Der negativ-inotrope Effekt auf die isolierten adulten Kardiomyozyten kommt nach den

vorliegenden Ergebnissen vermutlich durch die Aktivierung von sarkolemmalen

Kalium(ATP)-Kanälen zustande. Felix et al. konnten mittels „Patch-Clamp“-Technik

nachweisen, dass der Calciumstrom an den L-Typ-Calciumkanälen reduziert wurde. Die

Autoren postulierten einen Mechanismus, bei welchem sich die Öffnungsdauer des

Calciumkanals nach Inkubation mit post-ischämischem Effluat nicht verändert, dennoch

weniger Calcium in die Zelle aufgenommen wird. Die Autoren vermuteten eine direkte

Interaktion der Substanzen aus dem Effluat mit dem Calciumkanal. Eine Öffnung von

Kalium(ATP)-Kanälen beeinflusst die Öffnungsdauer der spannungsabhängigen

Calciumkanäle, was letztendlich auch zu einer verringerten Aufnahme von Calcium führt.

Messungen der Kaliumionen-Ströme an den sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen mittels

„Patch-Clamp“-Technik nach Vorinkubation der Kardiomyozyten mit post-ischämischem

Effluat würden die vorliegenden Ergebnisse mit den Inhibitoren Glibenclamid und HMR-

1098 sinnvoll ergänzen.

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Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der Mathematisch-

Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch an

einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht wurde.

Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die darin

angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.

Unterschrift des Promovenden

Publikationen aus der vorliegenden Arbeit

Publikationen in Fachzeitschriften

K. Birkenmeier, I. Janke, W. H. Schunck, C. Trimpert, T. Krieg, M. Landsberger, U.

Voelker, S. B. Felix, A. Staudt. Prostaglandin receptors mediate effects of substances released

after ischemia. Eur J Clin Invest [eingereicht Juli 2008].

K. Birkenmeier, A. Staudt, W. H. Schunck, I. Janke, C. Labitzke, T. Prange, C. Trimpert, T.

Krieg, M. Landsberger, V. Stangl, S. B. Felix. COX-2-dependent and potentially

cardioprotective effects of negative inotropic substances released after ischemia. Am J

Physiol Heart Circ Physiol 2007 Oct; 293:2148-2154.

Kongressbeiträge

Vorträge:

K. Birkenmeier, M. Schmelzle, C. Trimpert, S.B. Felix, A. Staudt. Characterization of post-

ischaemically released mediators in neonatal cardiomyocytes. 74rd Annual Meeting of the

German Society of Cardiology 2008.

K. Birkenmeier, A. Staudt, W. H. Schunck, I. Janke, C. Labitzke, C. Trimpert, S.B. Felix.

Inotropic effects of substances released after ischaemia on isolated cardiomyocytes. World

Congress of Cardiology 2006.

Posterbeiträge:


Mechanisms and pathophysiological relevance of negative inotropic substances released after

ischaemia. 73rd Annual Meeting of the German Society of Cardiology 2007.


Role of prostaglandin-receptors in the effect of negative inotropic substances released after

ischaemia. 73rd Annual Meeting of the German Society of Cardiology 2007.

Weitere Publikationen

Publikationen in Fachzeitschriften

A. Staudt, A. Hummel, J. Ruppert, M. Dorr, C. Trimpert, K. Birkenmeier, T. Krieg, Y.

Staudt, S. B. Felix. Immunoadsorption in dilated cardiomyopathy: 6-month results from a

randomized study. Am Heart J 2006 Oct; 152:712-716.

A. Staudt, Y. Staudt, A. Hummel, K. Empen, M. Dorr, C. Trimpert, K. Birkenmeier, U.

Kuhl, M. Noutsias, D. Russ, S. B. Felix. Effect of immunoadsorption on the nt-BNP and the

nt-ANP plasma levels of patients suffering from dilated cardiomyopathy. Ther Apher Dial

2006 Feb; 10:42-48.

Y. Staudt, C. Trimpert, K. Birkenmeier, T. Bemmann, D. Beug, S. B. Felix, A. Staudt.

Effects of antibodies obtained from patients with dilated cardiomyopathy on the function of

isolated rat hearts. Eur J Clin Invest 2006 Feb; 36:85-90.

Kongressbeiträge

Vorträge:

A. Staudt, C. Trimpert, Y. Staudt, A. G. Kieback, K. Empen, A. Hummel, K. Birkenmeier,

S. B. Felix. Immunoadsorption in dilated cardiomyopathy. 73rd Annual Meeting of the

German Society of Cardiology 2007.

Posterbeiträge:

C. Trimpert, L. R. Herda, M. Landsberger, L. Lubenow, K. Birkenmeier, Y. Staudt, D. Beug,

A. Greinacher, S. B. Felix, A. Staudt. Genepolymorphism of FcgammaIIa receptors

influences the response of DCM-patients to the immunoadsorptiontherapy. 74rd Annual

Meeting of the German Society of Cardiology 2008.

C. Trimpert, S. B. Felix, A. Greinacher, K. Birkenmeier, A. Staudt. The Fcgamma II

receptor on cardiomyocytes. ESC (European Society of Cardiology)-Congress 2007.

C. Trimpert, F. Wehr, Y. Staudt, K. Birkenmeier, S. B. Felix, A. Staudt. Prevalence of

cardiac autoantibodies in DCM. ESC (European Society of Cardiology)-Congress 2007.

C. Trimpert, K. Birkenmeier, A. Greinacher, S. B. Felix, A. Staudt. Fcgamma receptor II on

cardiomyocytes. Scientific sessions of the American Heart Association 2007.

Danksagung

Ich möchte allen danken, die zum Gelingen der vorliegenden Doktorarbeit beigetragen haben.

Mein besonderer Dank gilt:

PD Dr.med. Alexander Staudt für die Bereitstellung des Themas, die hilfreiche Betreuung der

praktischen Durchführung und wissenschaftlichen Ausarbeitung der Dissertation und die sehr

gute Zusammenarbeit in den letzten drei Jahren.

Prof. Dr.med. Stephan Felix für sein großes, immerwährendes Interesse an der Ausarbeitung

der Dissertation und die wertvollen wissenschaftlichen Ratschläge, die wesentlich zum

Gelingen der Arbeit beigetragen haben.

Prof. Dr.rer.nat. Uwe Völker für die Bereitschaft, die Betreuung der Arbeit von Seiten der

mathematisch-naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Greifswald zu übernehmen.

Dr.rer.nat. Wolf-Hagen Schunck für die ausführlichen Gespräche zu Beginn der praktischen

Ausführung der Dissertation, die mir den Einstieg in die Thematik wesentlich erleichtert

haben.

Meinen Kollegen Christiane Trimpert, Dr.med. Lars-Roman Herda, Brita Püschel, Claudia

Zymelka und Sandra Grugel für ein gutes Arbeitsklima und eine gute Zusammenarbeit; Brita

Püschel insbesondere für die hochmotivierte Unterstützung bei der experimentellen

Durchführung der Dissertation.

Allen meinen Freunden für die große Unterstützung in den letzten drei Jahren; insbesondere

Irka Janke, die mir das Einleben in Greifswald wesentlich erleichtert und anfängliches

Heimweh vertrieben hat, Mandy Kaatz für schöne lange Gespräche und schöne

Unternehmungen, Stefanie Fahrner und Barbara Sebastiani für eine langjährige Freundschaft.

Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Familie und meinem Freund Marcus Kaltwasser für

ihre Unterstützung; meinen Eltern, die mir das Studium ermöglicht und mir auf meinem Weg

immer mit Rat und Tat zur Seite gestanden haben und Marcus für viele lange Gespräche

(teilweise auch über die Arbeit) und seine Geduld mit mir in den letzten beiden Jahren.

Lebenslauf

Name Birkenmeier

Vornamen Katrin, Simone

Geburtsdatum 15.08.1976

Geburtsort Freiburg i.Br.

Staatsangehörigkeit deutsch

Familienstand ledig

Schulbildung

Grundschule von 1983-1987 in Freiburg

Gymnasium von 1987-1996 in Freiburg

Abschluß Abitur, allgemeine Hochschulreife

Schwerpunktfächer: Latein/Biologie

Studium

Studium – Jura von WS 1996/1997 bis SS 1997 in Freiburg

Prüfungen Rechts- und Staatsphilosophie im WS

1996/1997

Kleiner Strafrechtsschein im SS 1997

Studium – Biologie von WS 1997/1998 bis WS 2003/2004 in

Freiburg

Grundstudium von WS 1997/1998 bis SS 1999

Prüfungen Vordiplom SS 1999

Hauptstudium von WS 1999/2000 bis WS 2003/2004

Fächer Mikrobiologie (Hauptfach)

Biochemie (1. Nebenfach)

Zellbiologie (2. Nebenfach)

Virologie (nicht-biologisches Nebenfach)

Abschluß

mündliche Diplomprüfung im WS 2002/2003

Diplomarbeit in der klinischen

Forschergruppe für Rheumatologie,

Universitätsklinikum Freiburg

März 2003 bis April 2004

Thema: Untersuchungen zur

Zelloberflächenexpression von Mitgliedern

der Chaperonfamilie HSP70

Fachbereich: Zellbiologie, Immunologie

Beschäftigung Mai 2004-Oktober 2004 Beschäftigung als wissenschaftliche

Mitarbeiterin in der

immunologischen Abteilung des

interfakultären Instituts für Zellbiologie der

Universität Tübingen

Derzeitige Beschäftigung seit Februar 2005 Beschäftigung als wissenschaftliche

Mitarbeiterin zum Zwecke der Promotion

zum Dr.rer.nat. in der Klinik für Innere

Medizin B (Kardiologie) der Universität

Greifswald

Fachbereich: Zellbiologie, Physiologie

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