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DNA- KLONIERUNG:
Vervielvältigung eines DNA-Moleküls
In vitro - PCR
In vivo – in unterschiedlichen Wirtszellen
POLYMERASE- KETTENREAKTION
(Polymerase Chain Reaction, PCR)
PCR (Polymerase Chain
Reaction) „Polymerase-Kettenreaktion“ zur
Vervielfältigung (Amplifizierung)
von Nukleinsäuren
Erfinder: Kary Mullis (1985)
PCR eröffnet in fast allen
Bereichen der Natur-
wissenschaft zahlreiche
neue Möglichkeiten
Nobelpreis für Mullis in 1993
PCR
Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) ist eine Möglichkeit ein Stück DNA (bis auf 40 kb) zu vervielfältigen.
Mit dieser Methode lassen sich, mit Hilfe einer hitzestabilen Variante des Enzyms DNA-Polymerase, kurze DNA-Abschnitte vervielfältigen, wobei nur sehr wenig Ausgangsmaterial benötigt wird.
Es werden nur die Moleküle verwendet die auch bei der Replikation teilnehmen.
Taq-POLYMERASE
Die Taq-Polymerase ist eine DNA-Polymerase
Durch diese thermostabile Polymerase wurde die Technik im Alltag verwendbar
Heute sind auch eine Reihe von rekombinanten Enzymen erhältlich
Thermus aquaticus DNA-Polymerase Taq Taq-Polymerase wird bei 95 °C nicht zerstört! Taq-Polymerase funktioniert bei 72 °C am besten
Taq-POLYMERASE
Die Taq-Polymerase wurde aus dem in heiβen Quellen lebenden thermophilen Bakterium Thermus aquaticus gewonnen.
NUKLEOSID-TRIPHOSPHATE (dNTP-s: dATP,
dGTP, dTTP, dCTP): die Bausteine für den neuen
DNA Strang
TEMPLATE: zu amplifizierende DNA, die
originale DNA, die man vervielfältigen möchte
PRIMER: einzelsträngige DNAs mit einer Länge von 20-30 Nukleotiden (Oligonukleotide).
Thermostabile DNA-POLYMERASE katalysiert die Synthese vom neuen DNA-Strang
Enzym-Cofaktor: Mg2+ (MgCl2)
Puffer: Erhaltung des pH-Wertes, Salzkonzentration
Die grundlegenden Komponente
Eine kleine Menge der DNA-Probe genügt.
Rein theoretisch gesehen genügt auch nur ein DNA-Molekül.
Die untersuchte Sequenz muss nicht bekannt sein, nur zwei kurze Abschnitte an beiden Enden.
Als Template kommen zB. die folgenden „Stoffe” in Frage: Geronnenes Blut / frisches Blut Haare mit einer Haarwurzel Nagelsplitter Zellen, die an einer Zahnbürste haften
TEMPLATE
PRIMER
Primer sind solche kurze Sequenzen die mit beiden Enden der zu vervielfachenden DNA komplementär sind; Ihre 3’ Enden sind sich gegenüber.
Primer müssen bei gleicher Temperatur schmelzen (Schmelztemperatur hängt vom GC-Inhalt ab)
Primer müssen im grossen Überfluss vorhanden sein
Forward Primer
Reverse Primer
Schutzhaube
Heizblöcke
Steuerungseinheit
PCR-Gerät PCR findet in
einem Gerät,
das THERMO
CYCLER genannt
wird, statt.
Diese Maschine
erhitzt und
kühlt die
Reaktions-
röhrchen in
kürzester Zeit
auf die
angegebene
Temperatur.
DENATURATION - Schmelzen bei ca. 94°C :
Zuerst wird die doppelsträngige DNA auf 94-95 ˚C erhitzt, um die Stränge voneinander zu trennen (die Wasserstoffbrücken zwischen den Basen brechen auf) und um alle enzymatische Reaktionen stillzulegen (z. B. die bei dem letzten Schritt vom vorherigen Zyklus aktiven Enzyme).
ANNEALING - Anlagerung - Primerhybridisierung bei ca. 50-60°C :
Nach der Trennung der Stränge wird die Temperatur gesenkt, so dass die Primer, die den Start- und Endpunkt des zu vervielfältigenden DNA-Abschnitts bestimmen, sich an die einzelnen DNA-Stränge anlagern können. Diese Primer sind zu den Enden des DNA-Abschnitts komplementär und werden künstlich hergestellt.
EXTENSION – Elongation - Verlängerung bei ca. 72°C :
Schliesslich ergänzt die DNA-Polymerase die fehlenden Stränge mit freien Nukleotiden (dNTPs). Sie beginnt am 3‘-Ende des Primers und folgt den DNA-Strang.
Diesen PCR-Zyklus lässt man 25- bis 50-mal ablaufen.
Die drei Hauptschritte des PCR-Zyklus
zu vermehrender DNA-Abschnitt
5’ 3’ 5’
3’
5’
3’ 5’
3’
Denaturierung (T>90°C)
5’
5’ 5’
3’ 5’
3’
3’
3’
Annealing (55 – 65 °C)
3’
5’ 3’
5’ 5’
3’ 5’
3’
DNA-Synthese (72 °C)
ZYKLUS 1.
EXPONENTIELLER ANSTIEG DER GEWÜNSCHTEN DNA
N = N0 * 2n
N = Zahl der amplifizierten Moleküle
N0 = Zahl der Startmoleküle
n = Zahl der Zyklen
n
N
N 0
Mathematische Beschreibung der PCR
Plateau-Phase
Limitierung von Reaktionskomponenten Thermische Inaktivierung der DNA-Polymerase Reassoziation der PCR-Produkte konkurriert mit
Primeranlagerung
theoretisch:
20 Zyklen: 1,048,576
30 Zyklen: 1,073,741,824
n
N
N 0
praktisch:
Vor der Entdeckung der Taq-Polymerase…
und heutzutage…
Man musste die nicht hitzestabile Polymerase in allen Zyklen wieder zugeben.
BESTÄTIGUNG VON PCR-PRODUKTEN MIT GELELEKTROPHORESE
- Agarose Gelelektrophorese ist die Methode für Separation von DNA-Fragmenten anhand der Länge der Molekülen - DNA-Fragmente sind negativ geladen, dafür wandern Sie in einem elektrischen Feld von der Katode in die Richtung der Anode - Die Wanderungsgeschwindigkeit ist abhängig von mehreren Faktoren:
- die Konzentration des Gels, die den Porendurchmesser determiniert - die Größe der DNA-Molekülen - die Konformation der DNA- Molekülen - die Zusammensetzung der Elektrolytlösung - die elektrische Feldstärke
AGAROSE GELELEKTROPHORESE
- die DNA-Fragmente werden nach Ethidiumbromid-Färbung im UV-Licht sichtbar gemacht (EtBr-gefärbte DNA Banden fluoreszieren im UV-Licht) - die Größe von beliebigen Fragmenten kann durch Kalibration mit DNAs von bekannten Größe (sogenannte Marker-DNAs) bestimmt werden - Getrennte DNAs können aus dem Gel für Sequenzierung oder Klonierung isoliert werden.
AGAROSE GELELEKTROPHORESE
OPTIMIERUNG DES PCR-PROTOCOLS
Kritische PCR-Parameter:
Konzentration der DNA-Template
Länge, Konzentration und Schmelzpunkt der Primer
Konzentration freier Nukleotiden
Konzentration divalenter Kationen (meistens Mg2+)
Art und Konzentration der Polymerase
Reaktionsbedingungen (PCR-Programm)
PRIMERPLANUNG
PRIMERLÄNGE
SCHMELZPUNKT (TM)
SPEZIFIZITÄT
KOMPLEMENTÄRE PRIMERSEQUENZEN
G/C-INHALT
SEQUENZ AM 3’-ENDE
: Richtung der DNA-Synthese
5’
5’
5’
5’ 3’ 3’
3’
3’
SCHMELZPUNKT, (TM)
DEN SCHMELZPUNKT DER PRIMER KÖNNEN WIR EINFACH BESTIMMEN:
Tm = 4x (#C+#G) + 2x (#A+#T) °C
#: DIE ANZAHL DER ENTSPRECHENDEN BASE IN DEM PRIMER
ANNEALING MUSS ZIRKA 5°C NIEDRIGER ALS TM sein
BEIDE PRIMER MÜSSEN ÄHNLICHE TM-WERTE HABEN
PRIMERPLANUNG
Medizinische Nutzung von PCR: Untersuchung auf erbbare Mutationen
Diagnose von viralen Infektionen, z. B. Erkennung von HIV,
HPV, EBV, CMV, Herpesvirus, Rotavirus, Calicivirus Diagnose von bakteriellen Infektionen ohne eine Zellkultur zu
benötigen, z.B. Erkennung von TBC (Mycobacterium tuberculosis ), Syphilis (Treponema pallidum), Lepra (Mycobacterium leprae ), Chlamydia (Chlamydia trachomatis )
Diagnose von Erbkrankheiten (Detektion von Genmutationen
durch Amplifikation, Sequenzierung), z.B. zystische Fibrose, Brustkrebs, Retinoblastom
Pränatale Diagnostik: Proben aus der amniotischen Flüssigkeit Geschlechtsbestimmung Diagnose von vererbbaren Krankheiten durch die
Detektion der verursachenden Mutationen
GERICHTSMEDIZIN
ANWENDUGEN DER PCR
- DNA-Fingerabdruck-Analyse
- STR (Short Tandem Repeats):
- Die 7-40-fache Wiederholung von 2-7 Basen
- VNTR (Variable Number of Tandem Repeats):
- Die Anzahl der Wiederholungen ist von Mensch zu Mensch unterschiedlich, was eine sichere Identifizierung ermöglicht
- Das FBI verwendet 13 polymorphische Loci. Anhand dieser Loci kann jeder Mensch durch seine DNA identifiziert werden.
GERICHTSMEDIZIN
FBI’s STR LOCI
VNTR Analyse: Die STR-s werden mit PCR vervielfacht und auf einem Gel sichtbar gemacht
DNA-Fingerabdruck Analyse in der Gerichtsmedizin
- drei untersuchte VNTR-
Loci
- DNA von drei
Verdächtigen + DNA-
Probe des Täters vom
Tatort
- multiplex PCR mit 6
Primern
- 6 Fragmente von allen
Proben
- die Muster der drei
Verdächtigen sind
unterschiedlich
- das Muster der Probe
B ist mit dem Muster
der Probe F identisch
Schwächen der PCR
Fehler der Taq-Polymerase: Es besitzt die Fähigkeit des „proof reading”
nicht. Es macht alle 2 x 104 Basenpaare einen Fehler. Die neuen rekombinanten Polymerasen sind
besser. Kontamination (mit anderer DNA)
Wenn der Primer sich am Anfang an eine schlechte
Stelle bindet, kann es vorkommen, dass nicht das gewünschte Fragment vervielfacht wird.
REKOMBINANTE DNA TECHNOLOGIE
DNA Fragmente aus verschiedenen Quellen können kovalent gekoppelt werden
REKOMBINANTE DNA TECHNOLOGIE
DNA Fragmente aus verschiedenen Quellen können kovalent gekoppelt werden
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
Enzyme, die DNA schneiden können
- Manche Bakterienstämme sind gegen Infektion mit Bakteriophagen immun, sie produzieren Enzyme, die die Phagen-DNA abbaut, noch bevor sie sich replizieren kann (Abwehrmechanismus).
- Die Entdeckung von Restriktions-Modifikations Systeme in Bakterien führte zur Entwicklung von gezielten, kontrollierten und reproduzierbaren in vitro DNA-Spaltung und Ligation.
- Das ist die Grundstrategie der DNA-Klonierung.
- Das Restriktions-Modifikations-System beruht sich auf zwei Enzyme: - 1. Restriktionsendonuklease - 2. DNA-Methylase
DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
1. Restriktionsenzyme (Restriktionsendonukleasen, Restriktasen, REs): erkennen spezifische DNA-Sequenzen und schneiden die doppelsträngige DNA innerhalb oder in der Nähe der Erkennungssequenz. - „Restriktion” deutet die
Fähigkeit von Bakterien zur Degradierung fremder DNA nach Infektion von Bakteriophagen an. (Die Wirtszelle erzeugt restriktive Umständen für die Bakteriophagen)
2. DNA-Methylase modifiziert die Bakterien-DNA mit Methylgruppen innerhalb der Erkennungssequenz von eigenen Restriktasen.
DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
- Restriktionsendonukleasen erkennen DNA-Sequenzen von vier bis acht Basenpaaren (Restriktionsstelle). - die Erkennungssequenzen sind sogenannte Palindrome: DNA-Sequenzen, die gleich sind, wenn der eine Strang von links nach rechts und der andere von rechts nach links gelesen wird - Viele Restriktionsenzyme bilden überhängende komplementäre einzelsträngige DNAs an den Enden der Restriktionsfragmenten. Die werden auch als klebrige Enden bezeichnet. Ligase kann mit hoher Effizienz DNAs mit homologen klebrigen Enden binden.
5´GAATTC 3´ 3´CTTAAG 5´
DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
- Eine zweite Gruppe von Restriktasen produziert gerade (oder glatte) Enden. Diese Enden ohne komplementäre überstehende Enden können nur schwer von Ligase gekoppelt werden. Die haben aber den Vorteil, dass sie alle anderen DNAs mit glatten Enden binden können.
DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
EcoRI spaltet die doppelsträngige DNA innerhalb der Erkennungssequenz
DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
Ein Enzym mit einer Erkennungssequenz von 4 Basenpaaren schneidet durchschnittlich alle 44 = 256 Basenpaare
Ein Enzym mit einer Erkennungssequenz von 6 Basenpaaren schneidet durch-schnittlich alle 46 = 4096 Basenpaare
Ein Enzym mit einer Erkennungssequenz von 8 Basenpaaren schneidet durch-schnittlich alle 48 = 65536 Basenpaare
DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
Enzym Quelle Erkennungsstelle Durchschnittliche Fragmentgrösse
DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
Unterschied bei der
Verdauung zirkulärer und linearer DNA
DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
Trennung von DNA-Molekülen anhand Molekulargewicht
Marker
DNA
AGAROSE GELELEKTROPHORESE
RESTRIKTIONSKARTIERUNG
Unabhängige und Parallelverdauung mit zwei oder mehreren Restriktions-endonukleasen wird gemacht um die Position der Schnittstellen zu bestimmen, eine Restriktionskarte zusammenzustellen
RE1 RE2 RE1+RE2
Unterschiede in den DNA-Sequenzen zwischen Individien können als genetische Marker in menschlicher DNA genutzt werden
Erste Markergeneration (1986): basieren auf Unterschieden in Schnittstellen für Restriktions-endonukleasen
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
RFLP Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus
RFLP Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus
Die Länge eines Restriktionsfragments wird durch Mutation beeinflusst, bei der eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym entsteht oder verloren geht.
Verwendung:
Identifizierung eines Individuums
Identifizierung rezessiv vererbter Krankheiten, pränatale Diagnose von Erbkrankheiten.
RFLP Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus
Identifizierung rezessiv vererbter Krankheiten, pränatale Diagnose von Erbkrankheiten.
Sichelzellanämie
DNA-KLONIERUNG - DNA-Klonierung: eine
Methode, bei der man eine beliebige DNA-Sequenz, z. B. ein Gen, in einen Vektor z. B. ein Plasmid integriert und dann es in lebendigen Zellen amplifiziert
- Amplifikation von einzelnen DNA Molekülen in vitro - mit PCR
- Amplifikation von einzelnen DNA Molekülen in vivo (in Zellen)
- Notwendige Komponente der DNA-Klonierung: DNA-Fragment mit kompatibelen
Restriktasen linealisierte Vektor-DNA
DNA-Ligase Kompetente Wirtszellen
- eine Wirtszelle wird mit dem Konstrukt aus dem Vektor und der integrierten, zu untersuchenden DNA transformiert und kann dann untersucht werden - die typischen Wirte in molekularbiologischen Laboratorien sind Stämme des Bakteriums Escherichia coli - für molekulare Klonierung werden nicht pathogene Stämme von E. coli benutzt - in solchen Stämmen kann fremde DNA in enormen Mengen amplifiziert werden, die fremde DNA bleibt stabil - die Stämme sind Mutanten für bestimmte Gene, die für Rekombination und das Restriktions-Modifikationssystem verantwortlich sind - E. coli hat die Vorteilen, dass es schnell und einfach kultiviert werden kann (eine Zellteilung dauert 20 Minuten) und genetisch gut charakterisiert ist - neben E. coli, viele andere prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen sind verwendet
DNA-KLONIERUNG: WIRTSZELLE
- In vitro hergestellte DNA kann in die Wirtszellen mithilfe von Vektoren eingebracht und vermehrt werden - Vektor-DNAs stammen von prokaryotischen oder eukaryotischen Plasmiden, Viren und Transposonen - als ein Vektor in die Wirtszelle gelangen ist (durch Transformation oder Transfektion)
- integriert es sich ins Genom, oder - verhält es sich als individuelles Replikon in der Zelle (Replikationsstartstelle)
- Vektor DNAs sind am meisten in vitro modifiziert und enthalten die folgenden Komponenten:
- Selektionsmarkergen (z.B. Gen für Antibiotika-Resistenz) - Unikale Restriktionsstelle(n)
- viele Vektoren wurden für speziellen Zwecken entwickelt: z.B. Expressionsvektoren ermöglichen die Produktion von Proteinen anhand der klonierten DNA
DNA-KLONIERUNG: VEKTOREN
NATÜRLICHE PLASMIDE
- Natürliche Plasmide sind kleine ringförmge DNA-Moleküle - sie können in hoher Kopienzahl in einem Bakterium vorkommen - sie werden unabhängig von dem bakteriellen Chromosom repliziert (Replikationsursprung, ori) - sie tragen oft Gene für Antibiotikaresistenz
PLASMIDVEKTOREN
- künstliche Plasmide werden als Plasmidvektoren benutzt - sie tragen Gene für Antibiotikaresistenz - Selektion - ori: Replikationsursprung, das Plasmid kann in E. coli vermehrt werden - MKS: multiple Klonierungsstelle mit einer Reihe unikalen Erkennungssequenzen von Restriktionsendonukleasen
Klonierung von Fremd-DNA in einen Plasmidvektor
- Die Vektor-DNA wird mit einem Restriktionsenzym linearisiert - die Ziel-DNA, die als Insert in den Vektor (Plasmid) integriert werden soll, wird mit dem gleichen Enzym geschnitten - komplementäre Enden entstehen an Vektor- und Ziel-DNA (überstehende Einzelstränge) - so ist es nun möglich, den Vektor und das Ziel-DNA-Stück miteinander zu verbinden (Ligase)
- DNA Ligase: ein Enzym, das DNA-Moleküle zwischen einem 5’-Phosphat-Ende und einem 3’-OH-Ende miteinander verbinden kann - DNAs mit komplementären einzelsträngigen Enden können diese Basenpaarung eingehen - die Enden werden als kohäsiv oder klebrig bezeichnet, über die können DNAs durch die DNA-Ligase fest verbunden werden - die DNA-Ligase katalysiert die Bildung neuer Phosphodiesterbrücken - die Ligation wird bei 10 bis 15ºC durchgeführt. Bei dieser relativ tiefen Temperatur ist gewährleistet, dass die beiden komplementären Enden Basenpaare ausbilden und das Enzym (Ligase) noch arbeitet.
DNA-KLONIERUNG: LIGATION
- Transformation im Zusammenhang mit rekombinanter DNA: das Einbringen von DNA in eine Zelle - das Vektor-Insert-Konstrukt wird in E. coli eingeführt - die meisten Bakterien (auch E. coli) nehmen DNA unter normalen Bedingungen nur in begrenztem Umfang auf - um diese Bakterien wirksam zu transformieren, muss man die Zellen physisch und/oder chemisch behandeln - so wird ihre Fähigkeit verstärkt, DNA aufzunehmen - Zellen, die eine solche Behandlung durchlaufen haben, bezeichnet man als kompetente Zellen - nach der Transformation erfolgt die Selektion von Bakterien, die den Plasmid mit dem Insert enthalten
- dafür kann man bei Plasmidvektoren deren Antibiotikaresistenzgene ausnutzen, oder - Vektoren benutzen, die das lacZ-Gen enthalten (Genprodukt des lacZ-Gens ist das Enzym ß-Galactosidase, es katalysiert die Hydrolyse des Substrates X-gal wodurch Blaufärbung entsteht)
DNA-KLONIERUNG: TRANSFORMATION
Selektion der Bakterienzellen mit dem rekombinanten Vektor: • Plasmide mit zwei Antibiotikaresistenz-gene • Plasmide mit dem lacZ Gen
DNA-KLONIERUNG: SELEKTION
Plasmide mit zwei Antibiotika-Resistenz Genen
Meisterplatte Replikaplatte
Replika-Platierung auf
Platte mit Antibiotikum 2
R1
R2
Plasmid
Gen von Interesse
Verdauung
mit Restriktase Ligation
Rekombinantes
Plasmid
Transformation
Verteilung der
Bakterien an der
Oberfläche von
festem Medium,
das Antibiotikum 1
enthält
Isolierung der
Antibiotikum 2
sensitiven Kolonien
von Meister Platte Nachtsüber
Wachsen
Isolierung der
Plasmid-DNA
DNA-KLONIERUNG: SELEKTION
Plasmide mit dem lacZ Gen
Gen von Interesse
R1
lacZ
Verdauung Ligation
Rekombinantes
Plasmid
Transformation
Verteilung der
Bakterien an der
Oberfläche von
festem Medium,
das Antibiotikum 1
und X-Gal enthält
Isolierung der
weißen Kolonien
Nachtsüber
Wachsen
Isolierung der
Plasmid DNA
Weiße Kolonien: keine X-gal
Abbau, rekombinantes Plasmid
DNA-KLONIERUNG: SELEKTION
EXPRESSIONSVEKTOREN
Mithilfe von Bakterien können rekombinante Proteine in grossen Mengen hergestellt werden. Das proteinkodierende Gen muss in einen Expressionsvektor mit induzierbarem bakteriellen Promoter eingebaut werden.
HERSTELLUNG REKOMBINANTER PROTEINE
HERSTELLUNG REKOMBINANTER PROTEINE
Rekombinante Proteine werden in grossen Mengen von Bakterien isoliert, z.B. mit Affinitätschromatographie.
Viele eukaryotische Proteine können in Bakterien nicht produziert werden, weil posttranslationale Modifikationen (welche essentiell für die Proteinfunktion sind) nur in Eukaryoten ablaufen. In solchen Fällen benutzt man eukaryotische Expressionssysteme.
HERSTELLUNG REKOMBINANTER PROTEINE
MEDICAL APPLICATIONS
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit
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