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Prof. Dr. R. G. Berger/ PD Dr. Ulrich Krings

Callinstr. 5

30167 Hannover

++49-511-762-4583

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krings@lci.uni-hannover.de

Praktikum Bioanalytik im Studiengang Life Science zur Vorlesung Bioanalytik

Das Praktikum findet im Raum 317 statt.

Erarbeitung analytischer Grundbegriffe anhand einer praktischen Einführung

in die Gaschromatographie

Praktikumsleiter: PD Dr. U. Krings

Betreuer: Daniel Sandner, Miriam Meyer, Sanaz Khaligi, Mareike Siebert

Inhalt:

I) Einführung in die Bedienung eines Gaschromatographen und des

zugehörigen Datenverarbeitungssystems [Seminare an den Geräten]

II) GC-Injektionstechniken und GC-Detektoren (s. Vorlesung)

[Kolloquien während der Versuche]

III) Messprinzip

In der Gaschromatographie werden verschiedene Gase als Trägergase eingesetzt. Neben

hohen Reinheitsanforderungen stellen insbesondere niedrige Viskosität, chemische Inertheit

und vernachlässigbare Wechselwirkung mit Analyten und stationärer Phase wichtige

Anforderungen an ein Trägergas dar. Aus den genannten, sowie aus Kostengründen, finden

daher hauptsächlich He, N2 und H2 in der Gaschromatographie Verwendung. Helium eignet

sich aufgrund seines hohen Ionisierungspotenzials insbesondere als Trägergas bei der

Kopplung der Gaschromatographie mit einem massenselektiven Detektor (GC-MS).

Der Einfluss des verwendeten Trägergases auf die Trennleistung bei unterschiedlichen

Trägergasgeschwindigkeiten wird anhand der zugehörigen Van-Deemter-Kurven deutlich.

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Abb.: Van-Deemter-Kurven für verschiedene Gase

Aufgabe: Die Trägergasgeschwindigkeit ist nicht nur vom Säulenvordruck und der

Säulendimensionierung, sondern auch von der Temperatur abhängig, nämlich wie?

a) Parameter des Gaschromatographen

Retentionszeit

Die Zeit, die nicht retardierte Substanzen bis zur Detektion benötigen (z. B. Methan)

bezeichnet man als Totzeit (chromatographisch tote Zeit). Um die Totzeit zu messen, injiziert

man eine Substanz, die von der Säule nicht zurückgehalten wird. Aus der gemessenen Totzeit

und der Länge des chromatographischen Systems kann die mittlere

Strömungsgeschwindigkeit des Trägergases oder des Eluenten ermittelt werden.

Tt

Lv ]s [m 1-

Die Gesamtzeit, die von der Injektion bis zur Detektion vergeht, nennt man

Bruttoretentionszeit. Die Differenz zwischen Bruttoretentionszeit und Totzeit bezeichnet man

als Nettoretentionszeit.

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b) Trennleistung: Trennzahl, Theoretische Böden, Auflösung, Retentionsindex

Eine wichtige Kenngröße zweier benachbarter Peaks ist die Auflösung (Resolution, R). R

beschreibt, in wie weit zwei Peaks überlappen. Von zwei benachbarten Peaks wird jeweils die

Peakbreite auf halber Peakhöhe gemessen („Halbwertsbreite“). Nach Ermittlung der

Nettoretentionszeiten von Peak 1 und Peak 2 kann die Auflösung R wie folgt berechnet

werden:

(1) 2

1(2)

2

1

176,1

bb

tR N

Für eine Auflösung von R = 1 überlappen zwei Peaks um 3 %. Etwa mit dem Wert R = 1,3 sind

zwei Peaks bis zur Grundlinie voneinander getrennt („basisliniengetrennt“).

Zur Beurteilung der Qualität eines Trennsystems dienen die Trennstufenzahl Nth und die

Bodenhöhe HETP (high equivalent to a theoretical plate). Diese Größen sind der Theorie der

fraktionierten Destillation entnommen. Man kann sich vorstellen, dass die Säule in kleine

Zonen eingeteilt ist, in denen Austausch passiert und die Substanz von Zone zu Zone weiter

transportiert wird. Eine solche Zone nennt man theoretischen Boden. Die Anzahl der Böden

ergibt die theoretische Bodenzahl (Trennstufenzahl). Da die Trennung ein dynamischer

Prozess ist, gibt die Trennstufenzahl letztendlich die Zahl der Gleichgewichtseinstellungen in

der Säule wieder. Die Trennstufenzahl ist unter anderem abhängig von

den Abmessungen der Säule

der Art der stationären Phase

den äußeren Bedingungen (z.B. Fluss der mobilen Phase)

den Prüfsubstanzen

Je mehr theoretische Böden in einer Säule vorhanden sind, umso öfter können Sorptions- und

Desorptionsprozesse erfolgen. Daher wird die Trennstufenzahl als Maß für die

Leistungsfähigkeit eines Systems verwendet. Zur Bestimmung der Trennstufenzahl wird eine

Substanz bei konstanter Ofentemperatur injiziert. Der Peak sollte mit k > 5 im Chromatogramm

aufgezeichnet werden.

k errechnet sich nach:

T

TB

T

N

t

tt

t

tk

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Aus der Halbwertsbreite und der Bruttoretentionszeit kann die Bodenzahl ermittelt werden:

2

2

1

54,5

b

tN B

th

Um die Länge einer Säule mit in die Bewertung einzubeziehen, kann man die Höhe eines

theoretischen Bodens berechnen. Dieser Parameter Bodenhöhe H oder HETP errechnet sich

nach:

thN

LH

Je kleiner die Bodenhöhe H ist, umso besser die theoretische Trennleistung einer Säule.

Eine weitere Größe zur Charakterisierung einer Säule ist die Trennzahl TZ. Sie gibt an, wie

viele Substanzen maximal zwischen zwei aufeinander folgenden n-Alkanen (in diesem Fall

zwischen zwei Carbonsäuremethylestern) mit einer Auflösung von R = 1 eluieren können.

t = Nettoretentionszeit, b0,5 = Peakbreite in halber Höhe

Um geräteunabhängige vergleichbare Retentionsdaten für eine gegebene Trennphase zu

erhalten, wurden Retentionsindices eingeführt. Ein solches System wurde von Kováts

(Kováts-Index) eingeführt. Der Kováts-Index I gibt die relative Lage eines Substanzpeaks zu

zwei aufeinanderfolgenden homologen n-Alkanen in einem Chromatogramm an.

zRzR

zRxR

tt

ttzI

'1'

''

lglg

lglg100100

z = Anzahl der C-Atome des vorher eluierenden Alkans, tR’x = Nettoretentionszeit der Substanz, tR’z =

Nettoretentionszeit des vorher eluierenden Alkans, tR’z+1 = Nettoretentionszeit des nachher eluierenden Alkans

1

)2()1(

12

5,05,0

bb

ttTZ

RR

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c) Reproduzierbarkeit von manuellen Injektionen: Varianz, Standardabweichung relative

Standardabweichung

Die häufigste Streuungsgröße in Verteilungen ist die Varianz var (x) bzw. (2

xs ) und die

Standardabweichung sx der Einzelwerte. Zur Berechnung der Varianz var werden die

Abweichungen jedes Wertes ix einer Datenreihe vom Mittelwert [( ix - x )] quadriert [( ix - x )]2

und aufsummiert [ ( ix - x )2]. Jede „quadrierte Abweichung“ ist ein Maß für die Abweichung

des Messwertes vom Mittelwert. Die Summe der Abweichungsquadrate wird durch den

Freiheitsgrad f dividiert.

2

)var( f

)x - (xx i

Der Freiheitsgrad f ist in Datenreihen die Anzahl N der Daten, vermindert um 1. Vereinfacht

gibt der Freiheitsgrad f die Anzahl der Wiederholungsmessungen an. Beträgt die Gesamtzahl

der Messungen z.B. N = 5, wird eine Messung als „Grundmessung“ betrachtet, die anderen 4

Messungen dienen zur Wiederholung.

Die Varianz var gibt die Streuung der Messwerte um ihren Mittelwert x an. Dabei geht man

vom Quadrat der charakterisierten Größe aus. Um das Ergebnis auf die ursprüngliche Einheit

zurückzuführen, zieht man aus der Varianz die Quadratwurzel )( var x . Als Ergebnis erhält

man die Standardabweichung s(x) der Einzelmessung vom Mittelwert. Die

Standardabweichung kann also mit Hilfe der folgenden Gleichungen berechnet werden:

(x)var xs

1 - N

)x (x

2

i xs

Vorsicht ist beim Berechnen dieser Kennzahlen mit dem Taschenrechner bzw. mit

Tabellenkalkulationsprogrammen angebracht. Oftmals wird zur Berechnung der

Standardabweichung nicht die „Stichprobenstandardabweichung“ eingesetzt sondern die

Formel:

N

)x (x

2

i xs

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Beim Vergleich von Datenreihen mit verschiedenen Größenordnungen ist die

Standardabweichung als Maß für die Präzision (Streuung) alleine noch nicht sehr

aussagekräftig. Daher wird die Standardabweichung auf den Mittelwert bezogen. Diese Größe

wird als Variationskoeffizient V oder „relative Standardabweichung“ (CV coefficient of

variation) bezeichnet (angegeben meistens in %).

% 100 x

s V

Beim Ausreißertest nach Nalimov müssen mindestens drei Daten (N>2) vorliegen. Die

Kontrolle erfolgt auf den kleinsten und den größten Wert. Anschließend wird eine Prüfgröße

nach Nalimov berechnet und mit einem Tabellenwert verglichen.

Die Prüfgröße nach Nalimov berechnet sich nach

1 - N

N

s

x - x

x

*

PG

mit: *x = ausreißerverdächtiger Wert

x = Mittelwert

xs = Standardabweichung

N = Anzahl der Stichproben

Prüfgrößen zum Ausreißertest nach Nalimov (Ausschnitt):

Freiheitsgrad f Statistische Sicherheit

95 % 99% 99,9%

1 1,409 1,414 1,414

2 1,645 1,715 1,730

3 1,757 1,918 1,982

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d) Detektor: Linearität und Empfindlichkeit (Kalibration, Blindwert, NWG)

Beim Einsatz einer Analysenmethode ist es wichtig zu wissen, bis zu welcher unteren Grenze

die Methode verwertbare Werte liefert. Das kann zum einen derart geschehen, dass Proben

immer geringerer Konzentration gemessen werden, bis kein Signal mehr erkannt werden kann.

Abgeschätzt kann die Nachweisgrenze aus dem Vergleich des Messsignals des Analyten im

Vergleich zum Rauschen. Dabei muss das Messsignal mindestens das Dreifache des

Rauschens betragen (95% Sicherheit zum Substanznachweis).

Der statistisch sichere Weg geht über die Kalibrierfunktion und den Prognosebereich. Es

existieren verschiedene Vorschläge zur Ermittlung von Nachweis- und Bestimmungsgrenzen

(z.B. nach DIN 32 634 (Schnellschätzung) oder DFG). Allgemein gilt die Nachweisgrenze als

die geringste Analytmenge in einer Messprobe, die detektiert, aber nicht quantifiziert werden

kann. Die Nachweisgrenze xNG nach DIN 32 645 ist eine Entscheidungsgrenze. Die

Bestimmungsgrenze ist die geringste Analytmenge, die mit der geforderten Präzision und

Richtigkeit quantifiziert wird. Für die Ermittlung der Grenzwerte kann eine Blindprobe

(Leerprobe) notwendig sein. Sie ist eine Probe, die den Analyten nicht enthält, ansonsten aber

mit der Probe identisch ist. Mehrere unabhängig hergestellte Blindproben werden vermessen,

der Mittelwert ist als Blindwert anzusehen. Eine andere Möglichkeit zur Bestimmung des

Blindwertes ist die Berechnung des Ordinatenabschnitts b in einer linearen Kalibrierfunktion

mit Hilfe der linearen Regression ("Kalibrationkurvenverfahren"). Der Ordinatenabschnitt b ist

die Größe des Signals y bei der Konzentration 0, was definitionsgemäß mit dem Blindwert

identisch ist.

Voraussetzung für die Anwendbarkeit des Kalibrationskurvenverfahrens:

Alle Kalibrationsproben müssen voneinander unabhängig sein, d.h. entweder aus unabhängigen Einwaagen oder zumindest aus unabhängigen Verdünnungen aus ein und derselben Stammlösung stammen,

die Kalibrierfunktion muss linear sein,

die Varianzen müssen im interessierenden Arbeitsbereich konstant sein,

die Konzentrationen der Kalibrierlösungen müssen genau bekannt sein und "richtig" sein,

der gewählte Arbeitsbereich schließt die Bestimmungsgrenze mit ein.

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Ermittlung der Nachweisgrenze aus Kalibrierkenndaten - Graphische Bestimmung der

Nachweisgrenze nach DIN 32645:

Mathematische Bestimmung der Nachweisgrenze nach DIN 32645:

(t = 1,86, einseitige Fragestellung, f = N – 2, P = 95%)

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IV) Praktischer Teil

Alle zur Verfügung stehende Gaschromatographen sind mit Kapillarsäulen ausgestattet, die

als stationäre Phase WAX oder HP-5 besitzen (was bedeutet das?). Die Temperatur für den

S/SL-Injektor wird auf 275°C und die für den Detektor wird auf 325 °C gesetzt. Die weiteren

Parameter sind der folgenden Tabelle zu entnehmen:

GC Säulenparameter

Phase Länge Innendurchmesser Filmdicke

TRACE (S/SL-GC-

FID) CP-WAX 52 CB 30 m 0,32 mm 0,25 µm

HP 6890 (Alekto)

(KAS-GC-FID) VF-5MS 30 m 0,25 mm 0,25 µm

Agilent 7890A (OC-

GC-FID/O) HP-5 30 m 0,32 mm 0,25 µm

Agilent 7890A (Diva)

(OC-GC-FID) CP-WAX 52 CB 30 m 0,32 mm 0,25 µm

Agilent 7890B (Xena)

(OC-GC-FID) HP-5 30 m 0,32 mm 0,25 µm

1.) Bestimmung der mittleren Strömungsgeschwindigkeit, der Totzeit und des

Splitverhältnisses

Mittlere Trägergasströmungsgeschwindigkeit/Splitverhältnis:

Als Trägergas wird Wasserstoff verwendet. Zunächst wird der Durchfluss des geöffneten Splits

(Gesamtfluss) mit einem Blasenzähler für kleine Volumina am Splitausgang bestimmt

(Wiederholung mind. 3x)

Aufgabe: Die mittlere Trägergasströmungsgeschwindigkeit soll bei 100 °C und

geöffnetem Split auf 40 cm sec-1 eingestellt sein: Berechnen Sie hierzu den

Trägergasfluss in mL min-1 aus der Säulendimensionierung für die angestrebte

Trägergasströmungsgeschwindigkeit.

Berechnen sie nun unter Berücksichtigung der berechneten

Trägergasströmungsgeschwindigkeit und des gemessenen Gesamtflusses das

aktuell bestehende Splitverhältnis.

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Anschließend wird das Splitverhältnis auf 10:1/20:1/50:1 gestellt und wiederum der Gasfluss

mit dem Blasenzähler (für große Volumina) bestimmt (Wiederholung 3x).

Überprüfen sie nun unter Berücksichtigung der berechneten

Trägergasströmungsgeschwindigkeit und des gemessenen Gesamtflusses das aktuell

bestehende Splitverhältnis von 10:1/20:1/50:1.

Totzeit:

Die Temperatur des Säulenofens wird auf 100 °C gesetzt. Ein 4-mL-Probenfläschchen mit

Schraubverschluss wird mit Erdgas gefüllt und verschlossen. Mit Hilfe einer Injektionsspritze

werden bei geöffnetem Split ca. 10 µL Gas in den Split/Splitless-Injektor injiziert und

gleichzeitig die computergestützte Aufzeichnung gestartet. Die Ofentemperatur bleibt isotherm

bei 100 °C. Da diese Alkane bei 100 °C von der stationären Phase nicht retardiert werden, ist

die ermittelte Retentionszeit die Totzeit des chromatographischen Systems unter diesen

Bedingungen. Die Messung ist mindestens dreimal durchzuführen.

2.) Trennleistung: Trennzahl, theoretische Böden, Auflösung; Retentionsindex

Die ausgegebene Testmischung enthält folgende Substanzen:

2-Octanon, n-Tetradecan, 1-Octanol, Decansäuremethylester, Undecansäuremethylester,

Naphthalen, 1-Decanol, Dodecansäuremethylester, 2,6-Dimethylanilin, 2,6-Dimethylphenol in

n-Hexan.

Zur Bestimmung der Trennleistung des vorliegenden GC-Systems (Auflösung, Bodenzahl,

Trennstufenhöhe, Trennzahl) wird 1 µL der Testmischung bei geöffnetem Split zuerst isotherm

bei 150 °C und anschließend mit nachstehend aufgeführtem Ofentemperaturprogramm

injiziert. Zum Vergleich der Split-Injektion mit einer Splitless-Injektion wird die Testmischung

nochmals bei geschlossenem Split injiziert und mit dem Gradientenprogramm aufgetrennt.

Die erforderlichen Messdaten zu Berechnung der Trennleistung sind dem

Datenverarbeitungssystem zu entnehmen. Die Trennzahl wird aus den Elutionsdaten für

Decan- und Undecansäuremethylester bestimmt.

Zur Berechnung der Kováts-Indices der im Säulentest vorhandenen Substanzen wird je 1µL

einer Alkanreihe (C10 bis C 25, c = 100 ng/µL bzw. C8-C20, c = 40 ng/µL) isotherm und mit

dem Gradientenprogramm injiziert.

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Nach der Berechnung der einzelnen Parameter ist eine Diskussion/Interpretation der

erhaltenen Werte anzuschließen und das bevorzugte Programm mit der besten Trennleistung

zu benennen.

Ofentemperaturprogramm:

60 °C (3 min)//6 °C min-1/220 °C (10 min)

3.) Reproduzierbarkeit von manuellen Einspritzungen: Varianz, Standardabweichung,

relative Standardabweichung

Möglichst genau 1 µL der obigen Testmischung ist mindestens dreimal manuell zu injizieren.

Die Einspritzung erfolgt isotherm bei 150 °C und geöffneten Split. Es werden der Mittelwert mit

Varianz und Standardabweichung sowie der Median für alle Substanzen berechnet.

Die Peakflächenberechnungen werden dann erneut unter der Annahme, dass

Decansäuremethylester als Normierungsstandard zugesetzt wurde, berechnet. Danach sind

erneut die Mittelwerte mit Varianz und Standardabweichungen sowie der Median für alle

Substanzen zu berechnen. In beiden Messreihen ist für die Substanzen mit der größten

relativen Standardabweichung ein Ausreißertest nach Nalimov durchzuführen.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in einer Diskussion/Interpretation zusammenzufassen.

4.) FID: Linearität und Empfindlichkeit (Kalibration, Blindwert, NWG)

Es wird je eine Stammlösung der Testsubstanzen 1-Octanol und des "internen Standards"

Dodecansäuremethylester hergestellt. Von der 1-Octanol-Lösung sind folgende

Verdünnungen herzustellen: 10 µg µL-1, 1 µg µL-1, sowie 100, 50, 10, 8, 6, 4, 2, 1 ng µL-1; diese

sind so mit Dodecansäuremethylester zu versetzen, dass dessen Konzentration in jeder

Kalibrierlösung 200 ng µL-1 beträgt. Beginnend mit der geringsten Konzentration sind jeweils

1 µL dieser Lösungen einzuspritzen. Die Ofentemperatur bleibt isotherm bei 150 °C. Für 1-

Octanol wird nach Korrektur der Peakflächen eine Kalibrationsgerade gezeichnet und die

zugehörige Kalibrierfunktion mit Hilfe der linearen Regression berechnet. Mit Hilfe der

Kalibrationsgeraden ist der Blindwert abzuschätzen. Eine statistische Auswertung der

Kalibriergerade ermöglicht die mathematische Bestimmung der Nachweisgrenze.

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Literatur Cammann K (2001) Instrumentelle analytische Chemie : Verfahren, Anwendungen und

Qualitätssicherung. Spektrum Akad. Verl., Heidelberg u.a. Gey MH (2008) Instrumentelle Analytik und Bioanalytik : Biosubstanzen, Trennmethoden,

Strukturanalytik, Applikationen, Ed 2. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg Kolb B (2006) Gaschromatographie in Bildern : eine Einführung, Ed 2. Wiley-VCH, Weinheim Lohninger H (2003) Teach/Me - instrumentelle Analytik. In Springer-electronic-Media, Ed

Elektronische Ressource. Springer, Berlin u.a., pp 1 CD-ROM Lottspeich F, Engels JW (2006) Bioanalytik. Elsevier (Spektrum Akademischer Verlag), Heidelberg Rücker G, Neugebauer M, Willems GG (2008) Instrumentelle Analytik für Pharmazeuten.

Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart Schwedt G, Schreiber J (2007) Taschenatlas der Analytik, Ed 3., überarb. und erw. Aufl. WILEY-

VCH, Weinheim Schwedt G (1995) Analytische Chemie: Grundlagen, Methoden und Praxis. Thieme, Stuttgart u.a. Skoog DA, Leary JJ (1996) Instrumentelle Analytik. Springer, Berlin, Heidelberg

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Allgemeine Angaben zu Versuchsprotokollen – Institut für

Lebensmittelchemie

Prinzip In 2-3 Sätzen darstellen, worum es bei dem Versuch geht und was das Versuchsziel ist

Durchführung Die Durchführung des Versuches ist bereits im Skript angegeben. Stellen Sie hier nur

wesentliche Abweichungen dar. Die Abweichungen sollten nachvollziehbar sein und

begründet werden.

Rohdaten Hier sind sämtliche experimentellen Daten wie Einwaagen, Verbrauch an Maßlösung,

Verdünnungen, Chromatogramme, Spektren etc. anzugeben bzw. darauf zu verweisen

(Chromatogramme können auch in einen Anhang gegeben werden)

Auswertung und Berechnung Hier muss schlüssig aus den Rohdaten das Ergebnis abgeleitet werden (ggf. mit

Strukturformeln und Reaktionsgleichungen). Insbesondere sind sämtliche Berechnungen, die

zum Ergebnis geführt haben, nachvollziehbar darzustellen!

Ergebnis/Schlussfolgerung/Diskussion Was ist das Versuchsergebnis und wie ist diese zu bewerten? Fallen beim Vergleich mit

literaturbekannten Werten Unterschiede auf? Wie kommen die Unterschiede zustande?

Literatur Angabe der verwendeten Literatur. Bitte verwenden Sie nur vertrauenswürdige Quellen;

ausschließliches Googlen bzw. Kopieren von Wikipedia-Artikeln oder von Seiten, die

Wikipedia spiegeln, wird nicht akzeptiert! Verwenden Sie die im Praktikumsskript

angegebene Literatur bzw. Literatur aus der TIB!

Anhang Hier kommen evtl. Chromatogramme, Spektren, exportierte Gerätedaten wie

Peakflächentabellen o. Ä. rein.

Anmerkung Quellen müssen korrekt zitiert werden! Achten Sie beim Protokoll auf eine kurze und

prägnante Darstellung von Sachverhalten (keine ‚Ich‘-form, keine seitenlangen

Diskussionen)