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1 ZENTRUM ANGEWANDTE CHEMIE INSTITUT FÜR LEBENSMITTELCHEMIE Prof. Dr. R. G. Berger/PD Dr. Ulrich Krings Callinstr. 5 30167 Hannover ++49-511-762-4583 ++49-511-762-4547 [email protected] Praktikum Bioprozesstechnik (Flüssigchromatographische Trennverfahren HPLC) Zeitraum: 22.08.2013 bis 30.08.2013 Praktikum jeweils geöffnet: 9.00 Uhr bis 17.00 Uhr Empfohlene Literatur Handbücher über Carotinoide Britton, G. (2004) Carotenoids: Handbook. Basel u.a.: Birkhäuser, pp.XI, [ca. 600 S.]. Britton, G., Liaaen-Jensen, S., and Pfander, H. (1995) Carotenoids. Volume 1B: Spectroscopy. Basel u.a.: Birkhäuser, pp.XVI, 360 S. HPLC-Lehrbücher Kromidas, S. (1997) HPLC-Tipps-Band 1. Darmstadt: Hoppenstedt Bonnier Zeitschriften, pp.170 S. Kromidas, S. (2003) HPLC-Tipps-Band 2. Darmstadt: Hoppenstedt Bonnier Zeitschriften, pp.352 S. Lottspeich, F., and Engels, J.W. (2006) Bioanalytik. Heidelberg: Elsevier (Spektrum Akademischer Verlag). Meyer, V.R. (2006) Praxis der Hochleistungs-Flüssigchromatographie. Weinheim: Wiley-VCH, pp.XII, 354 S. Rücker, G., Neugebauer, M., and Willems, G.G. (2008) Instrumentelle Analytik für Pharmazeuten. Stuttgart: Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft. Skoog, D.A., and Leary, J.J. (1996) Instrumentelle Analytik. Berlin, Heidelberg: Springer.

Praktikum Bioprozesstechnik … · Abb.: Schematischer Aufbau einer HPLC-Anlage Kernstück der HPLC-Apparatur ist die chromatographische Trennsäule. Alle anderen ... Diese Methode

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ZENTRUM ANGEWANDTE CHEMIE

INSTITUT FÜR LEBENSMITTELCHEMIE

Prof. Dr. R. G. Berger/PD Dr. Ulrich Krings

Callinstr. 5

30167 Hannover

++49-511-762-4583

++49-511-762-4547

[email protected]

Praktikum Bioprozesstechnik (Flüssigchromatographische

Trennverfahren HPLC)

Zeitraum: 22.08.2013 bis 30.08.2013

Praktikum jeweils geöffnet: 9.00 Uhr bis 17.00 Uhr

Empfohlene Literatur

Handbücher über Carotinoide Britton, G. (2004) Carotenoids: Handbook. Basel u.a.: Birkhäuser, pp.XI, [ca. 600 S.]. Britton, G., Liaaen-Jensen, S., and Pfander, H. (1995) Carotenoids. Volume 1B:

Spectroscopy. Basel u.a.: Birkhäuser, pp.XVI, 360 S. HPLC-Lehrbücher Kromidas, S. (1997) HPLC-Tipps-Band 1. Darmstadt: Hoppenstedt Bonnier

Zeitschriften, pp.170 S. Kromidas, S. (2003) HPLC-Tipps-Band 2. Darmstadt: Hoppenstedt Bonnier

Zeitschriften, pp.352 S. Lottspeich, F., and Engels, J.W. (2006) Bioanalytik. Heidelberg: Elsevier (Spektrum

Akademischer Verlag). Meyer, V.R. (2006) Praxis der Hochleistungs-Flüssigchromatographie. Weinheim:

Wiley-VCH, pp.XII, 354 S. Rücker, G., Neugebauer, M., and Willems, G.G. (2008) Instrumentelle Analytik für

Pharmazeuten. Stuttgart: Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft. Skoog, D.A., and Leary, J.J. (1996) Instrumentelle Analytik. Berlin, Heidelberg:

Springer.

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1 THEORETISCHE GRUNDLAGEN

Eingesetzt werden flüssigchromatographische Verfahren zur Trennung

nicht oder schwerflüchtiger Substanzen (PAH, PCB)

stark polarer oder ionischer Substanzen (Ester, Aminosäuren, Nukleinsäuren)

von Substanzen mit hohem Molekulargewicht (M > 500, Proteine, Nukleinsäuren)

thermisch instabiler oder leicht zersetzlicher Substanzen (Biopolymere)

Prinzipschema einer HPLC-Apparatur

Abb.: Schematischer Aufbau einer HPLC-Anlage

Kernstück der HPLC-Apparatur ist die chromatographische Trennsäule. Alle anderen

Bauteile dienen der Erzeugung bzw. der Kontrolle der Bedingungen, der Detektion,

der Datenauswertung und der Automatisierung des Prozesses. Am einfachsten ist

ein „isokratisches“ System (konstante Fließmittelzusammensetzung), bestehend aus

Eluentenreservoir, Pumpe(n) Injektionsventil („Rheodyne“) zur drucklosen

Probenaufgabe Vorsäule und Trennsäule Detektor Abfallreservoir PC mit

Auswertesoftware bzw. Integrator

Hinzu kommen ggf.: Autosampler (automatischer Probengeber) Entgaser

Säulenofen Mischkammer (Gradientenmodus) Fraktionensammler (präparatives

Arbeiten) zusätzliche Detektoren.

1 Vorratsflaschen mit Solvens 2 Mischkammer 3 Hochdruckpumpe 4 Probenaufgabeventil 5 Spritze 6 Probenschleife 7 Trennsäule (evtl. mit Vorsäule) 8 Detektor 9 Computer zur Steuerung und Auswertung

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Pumpen: Am gebräuchlichsten sind Kolbenpumpen (Ein- bzw.

Doppelkolbenpumpe). Die Förderung wird durch periodische Vor- und

Rückwärtsbewegung des Kolbens (Saphir) bewirkt. Wichtigstes Qualitätskriterium ist

eine möglichst hohe Flusskonstanz ( 2 %) bei einem Druck von bis zu 250 bar.

Arbeitet man mit einem Gradienten (kontinuierliche oder diskontinuierliche Variation

der Fließmittelzusammensetzung), werden diese meistens direkt aus den

Komponenten gemischt. Dies kann in einer Mischkammer vor der Pumpe (auf der

Niederdruckseite Niederdruckgradient) oder nach den Pumpen (Hochdruckseite

Hochdruckgradient) erfolgen.

Probenaufgabesysteme

Standard ist die Probenapplikation über eine drucklose Dosierschleife (1 – 250 µL).

Meist ist die Schleife über ein 6-Wegeventil direkt mit der Säule verbunden

(RheodyneTM).

Vorsäulen

Eine Vorsäule dient dem Schutz der Trennsäule vor mechanischer und chemischer

Verunreinigung (verhindert Verstopfung der Trennsäule). Üblicherweise wird das

gleiche Trennmaterial wie für Hauptsäule eingesetzt (Dimension bis ca. 20 % der

Hauptsäulenlänge).

Grundsatz: nur filtrierte oder zentrifugierte Proben injizieren!

Pumpe

Abfall

all

Säule

Probenschleife

„LOAD“ „INJECT“

Pumpe

Säule

Abfall

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Trennsäulen

Analytische Trennsäulen dienen dem qualitativen und quantitativen Stoffnachweis,

präparative Säulen der Isolierung oder Reinigung von Substanzen. Die Hülle der

Säulen besteht aus Edelstahl. Anhand der verschiedenen Materialien der stationären

Phase unterscheidet man verschiedene Trennmethoden:

Normalphasen-Chromatographie Umkehrphasen-Chromatographie (Reversed

Phase, RP) Größenausschlusschromatographie (GPC, SEC) Hydrophobe

Interaktionschromatographie (HIC) Ionenaustauschchromatographie (IEC)

Affinitätschromatographie

Normalphasen- und RP-Chromatographie (Adsorptionschromatographie)

Ist die stationäre Phase polar, spricht man von Normalphasenchromatographie, bei

unpolaren Trennphasen von Umkehrphasen-Chromatographie (Reversed Phase).

Als Faustregel gilt:

„Die chemische Struktur der stationären Phase soll der Struktur der zu

trennenden Analyten möglichst ähnlich sein“

Als Normalphasenmaterial finden vorrangig Kieselgel (poröses Siliciumdioxid,

Silicagel) und Aluminiumoxid (porös) Verwendung. Die Silanolgruppen stellen die

Adsorptionszentren dar. Mittels NP-Chromatographie werden mäßig polare, in

organischen Lösungsmitteln gut lösliche Analyten getrennt. Je polarer der Analyt,

desto größer seine Retentionszeit.

Bei chemisch modifizierten Trägermaterialien sind die Hydroxygruppen an der

Oberfläche des Kieselgels durch andere Funktionalitäten ersetzt (Aminophase,

Diolphase, Cyanophase).

Bei der RP-Chromatographie ist die stationäre Phase (modifiziertes Kieselgel)

unpolar, die mobile Phase polar (Methanol, Acetonitril, H2O, Puffer).

Si O Si

CH3

CH3

(CH2)n CH3

5

n = 7 Octylphase (RP8)

n = 17 Octadecylphase (RP18/ODS)

n = 29 RP30

Ca. 60 - 70 % aller HPLC-Analysen werden auf RP-Materialien durchgeführt. Je

länger die unpolaren Reste sind, desto unpolarer wird die Phase und desto höher ist

ihre Hydrolysestabilität. Tendenzen für die RP-HPLC:

Je apolarer ein Analyt ist, desto höher ist im Umkehrphasen-Modus seine

Retentionszeit. Je höher der H2O-Gehalt im Eluenten, desto länger werden die

Retentionszeiten, da Wasser nicht mit den „Kohlenstoffbürsten“ wechselwirkt. Mit

zunehmendem Gehalt an organischen Lösungsmitteln im Eluenten nimmt die

Polarität des Eluenten ab, die Retentionszeiten sinken.

Größenausschluss-Chromatographie (Size Exclusion Chromatographie)

Die Größenausschlusschromatographie trennt gelöste Moleküle nach ihrer Größe;

sie basiert auf der unterschiedlichen Permeation der Analyten in ein poröses

Trägermaterial mit kontrollierter Porengröße. Die Trenngele sind durch einen

wirkungsvollen Einsatzbereich charakterisiert, bei dem die Molekülgröße in einem

kritischen Verhältnis zum Porendurchmesser steht. Moleküle ab einer bestimmten

Größe können nicht in die Poren des Trenngels eindringen und eluieren zusammen

mit der Lösungsmittelfront im Ausschlussvolumen V0. Kleinere Moleküle bewegen

sich nicht nur ungehindert zwischen den einzelnen Teilchen der stationären Phase

sondern dringen außerdem auch in ihre Poren ein. Dadurch erfahren sie eine

Verzögerung und ihr Elutionsvolumen entspricht der Summe des jeweils

zugänglichen internen Porenvolumens und des Partikelzwischenraums. Die kleinsten

Komponenten haben somit die längste Aufenthaltsdauer in den Poren und eluieren

zuletzt. Die mobile Phase dient ausschließlich als Lösungsmittel und hat keinen

unmittelbaren Einfluss auf die Trennung.

Die Ausschlusschromatographie wird zur Trennung komplexer Proteinmischungen

oder auch zur Abtrennung von niedermolekularen Bestandteilen, etwa bei einer

Entsalzung, einem Pufferwechsel oder der Reinigung eines synthetischen Peptids,

eingesetzt.

Gel-Permeations-Chromatograhie (GPC): organische Eluenten

Gel-Filtrationschromatographie (GFC): wässrige Eluenten

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Affinitätschromatographie

Bei der Affinitätschromatographie handelt es sich um eine Variante der

Adsorptionschromatographie. Sie ist die Trennmethode mit der größten Spezifität

und Selektivität für die Isolierung, Reinigung und Anreicherung von Biomolekülen.

Genutzt werden primär maßgeschneiderte chemisch modifizierte stationäre Phasen

und wässrige Eluenten. Typische Bindungspaare sind beispielsweise

Antigene/Antikörper (Immuno-Affinitätschromatographie), Glykoproteine/Lektine oder

Enzyme/Coenzyme. Ein Spezialfall der Affinitätschromatographie ist die

immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC). Häufigstes

Einatzgebiet der IMAC ist die Aufreinigung rekombinanter Proteine mit Polyhistidin-

Schwanz (His-Tag)

Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)

Unpolare Oberflächenregionen eines Proteins adsorbieren bei hohen

Salzkonzentrationen an die schwach hydrophoben Liganden einer stationären

Phase. Die Elution der Proteine erfolgt durch Verringerung der Salzkonzentration; die

native Konformation und die biologische Aktivität der Proteine bleiben erhalten. Als

stationäre Phase für die HIC dienen synthetische Polymere bzw. Biopolymere, deren

Oberfläche mit unterschiedlich hydrophoben Liganden (Alkyl-/Phenylgruppen)

modifiziert wurde.

Ionenaustauschchromatographie (IEC)

Elektrostatische Wechselwirkungen beeinflussen die Retention der Analyten

gegenüber der stationären Phase. Je stärker die Bindung der Analytionen an die

jeweilige Austauscherfunktion ist, desto stärker wird das Ion retardiert. Stark

verzögert werden Ionen mit hoher Ladung und, bei gleicher Ladung, leichter

polarisierbare Ionen (deformierbare Elektronenhülle).

Detektoren

HPLC-Detektoren sollen möglichst unempfindlich gegen Umgebungsänderungen

(Temperatur) sein und kurze Ansprechzeiten, eine hohe Messempfindlichkeit,

Basislinienkonstanz und geringes Rauschen aufweisen. Man unterscheidet Bulk-

Detektoren, welche die Änderung einer physikalischen Messgröße des gesamten

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Eluentenstroms (= Bulk) messen von den selektiven Detektoren, welche die

Eigenschaften eines gelösten Stoffes messen.

Die am häufigsten eingesetzten HPLC-Detektoren sind:

UV-Vis-Detektoren (Festwellenlängendetektor FWD, variable Wellenlängendetektor

VWD, Diodenarray-Detektor DAD)

Das Messprinzip beruht auf der Schwächung von eingestrahltem Licht in einer

Durchflusszelle (Photometer). Die Absorption bei der Wellenlänge folgt dem

Lambert-Beer’schen Gesetz (konzentrationsabhängiges Signal), E = c d. Zu

beachten ist die Durchlässigkeit des Eluenten bzw. des Elutionsgemisches sowie die

Mischbarkeit der Eluenten.

Lösungsmittel Cut-off; [nm]

Acetonitril 190

Wasser 200

Methanol 205

Chloroform 245

Dichlormethan 260

Aceton 330

Hexan 200

Der RI-Detektor (Refractive Index, Brechungsindex, Differentialrefraktometer) ist

ein typischer Bulk-Detektor. Verwendung findet der RI-Detektor u.a. in der Zucker-,

Fett- und Polymeranalytik.

Fluoreszenzdetektor (FD)

Der FD ist geeignet für fluoreszierende oder für derivatisierbare Substanzen. UV-

Licht einer bestimmten Wellenlänge wird in die Küvette eingestrahlt ( excitation) und

das längerwellige Emissionslicht ( emission) wird in einem Winkel von 90 ° gemessen.

Elektrochemischer Detektor (ECD)

Bestimmt wird der Stromfluss der auftritt, wenn eine Substanz umgesetzt (d.h.

oxidiert bzw. reduziert) wird als Funktion der Zeit. Der Detektor ist sehr empfindlich,

allerdings nicht gradiententauglich.

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Lichtstreudetektor (ELSD, evaporative light scattering detector)

Der ELSD dient zur Detektion UV-inaktiver Verbindungen (Kohlenhydrate, Lipide,

Steroide). Im Gegensatz zum RI-Detektor sind ELSDs gradientenfähig. Das HPLC-

Eluat wird mit Stickstoff vernebelt und in einem Verdampferrohr in ein Aerosol

umgewandelt. Die Partikelkonzentration wird über eine Streulichtmessung bestimmt.

Kopplungstechniken

Definition: 2 unterschiedliche Geräte, die auch für sich alleine analytische Aufgaben

durchführen können, werden über ein „Interface“ miteinander verbunden. Am

gebräuchlichsten ist die

LC/MS-Kopplung

Die LC/MS-Kopplung ist technisch schwieriger zu realisieren als die GC/MS-

Kopplung, da hohe Massenströme der mobilen Phase bewältigt werden müssen. Ein

Fluss von 1 mL pro min liefert 100 – 1000 mL Dampf (Gas). Für das

Massenspektrometer sind maximal 20 mL Dampf pro min tolerierbar, d.h.,

Hauptaufgabe des Interfaces ist die Abtrennung überschüssigen

Lösungsmitteldampfes. Alternativ kann mit extrem niedrigen Flussraten

chromatographiert werden. Im Direkteinlassverfahren (direct liquid introduction) wird

mit Flussraten von ~ 20 µL min-1 und Säulendurchmessern von 0,5 mm (Mikro-

HPLC) gearbeitet. Bei den Interface-Systemen dominieren aktuell 2 Typen:

Elektrospray-Interface (ESI) Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI)

Weitere Kopplungstechniken:

LC/IR: Nur in Kombination mit Fourier-Transformation. Problem: Küvettenmaterial ist

meist nicht beständig; die meisten Lösungsmittel zeigen IR-Banden im analytisch

relevanten Bereich.

LC/NMR: Früher: Problem der deuterierten Lösungsmittel (z.B. D2O) oder

protonenfreier Eluenten (CCl4). Heute ist die automatische Unterdrückung der

Lösungsmittelsignale möglich; man unterscheidet „on-flow“ und „stopped-flow“-

Verfahren.

LC/GC: Anwendung nur in der Normalphasen-LC, da hier wasserfreie

Eluentensysteme Verwendung finden; ungeeignet für ionische oder schwer flüchtige

Analyten.

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Chromatogramm/Säulenparameter

Als Maß für die Leistungsfähigkeit einer HPLC-Säule dient die Trennstufenzahl N

(„theoretische Böden“). Sie wird aus der Gleichung

2

16w

tN R berechnet, wobei w1/2 die Breite des Peaks auf halber Höhe

bezeichnet und tR die Retentionszeit der betreffenden Substanz angibt.

Die Peaksymmetrie (bzw. Asymmetrie) AS errechnet sich gemäß A

BAS

bei 10 %

Peakhöhe. Eine wichtige Kenngröße für das chromatographische Verhalten eines

Analyten ist der sogenannte Retentions- oder Kapazitätsfaktor k. Dieser kann direkt

aus der gemessenen chromatographischen Totzeit und der jeweiligen Retentionszeit

bestimmt werden: 0

0

t

ttk R . Ein Maß für die Trennung zweier benachbarter Peaks

ist die Auflösung (Resolution) R. R beschreibt, in wie weit zwei Peaks überlappen.

Nach Ermittlung der Nettoretentionszeiten (tN = tR – t0) und der Halbwertsbreiten

kann die Auflösung R wie folgt berechnet werden:

(1) 1/2(2) 1/2

176,1

ww

tR N

Für eine Auflösung von R = 1 überlappen zwei Peaks um 3 %. Etwa mit dem Wert

R = 1,3 sind zwei Peaks bis zur Grundlinie voneinander getrennt

(„basisliniengetrennt“). Neben der Auflösung kann auch das Verhältnis der

W1/2

A B

Injektion

t0 tR1

tR2

Peak 1 Peak 2

10 % Peakhöhe

10

Kapazitätsfaktoren zweier benachbarter Peaks („Selektivität“ 1

2

k

k) Auskunft über

das erzielte Trennergebnis geben.

2 PRAKTISCHE AUFGABEN

Geräte und Hilfsmittel

Messzylinder

Stoppuhr

2.1 Flusskonstanz (Vorversuch für alle)

Mittels Messzylinder und Stoppuhr wird der Fluss unter den Bedingungen des

jeweiligen Versuches (isokratischer Modus) bei zwei unterschiedlichen Flussraten

(z.B. 0,2 und 1 mL min-1, 10 min) bestimmt.

2.2 Bestimmung von Konservierungsstoffen

Bestimmung von Konservierungsstoffen

Grundlagen

Diese Methode gestattet die Bestimmung der Konservierungsstoffe Benzoesäure,

Sorbinsäure, pHB-Methylester, pHB-Ethylester und pHB-Propylester in fettarmen

Lebensmitteln.

Prinzip der Methode

Die Konservierungsstoffe werden mit einer Extraktionslösung – bestehend aus

Ammoniumacetat-Lösung, Essigsäure und Methanol, - deren pH-Wert so eingestellt

ist, dass eine mögliche Dissoziation zurück-gedrängt wird (warum?), im

Ultraschallbad aus dem Lebensmittel extrahiert. Trübe Extrakte werden geklärt; bei

nicht trüben Extrakten ist eine Membranfiltration anstelle der Klärung ausreichend.

Nach Trennung an einer RP-C18-Phase mit Hilfe der HPLC erfolgt die Bestimmung

mittels UV-Detektion simultan bei 235 nm.

Geräte und Hilfsmittel

Flüssigchromatograph mit UV-Detektor und Auswerteeinheit

Trennsäule: RP-18 monolithische Säule, 5 µm, 100 x 4 mm

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Autosampler

Membranfilter: Porenweite 0,45 µm

Ultraschallbad

Becherglas: 50 mL

Messkolben: 100 mL

Vollpipetten: 1 mL, 5 mL, 10 mL

Faltenfilter

pH-Papier oder pH-Messgerät

Glasstab

Chemikalien (p. a.)

Methanol (HPLC grade)

Essigsäure: 96%ig (Eisessig)

Ammoniumacetat CH3COONH4

Ammoniumacetat/Essigsäure-Pufferlösung:

1000 mL Ammoniumacetat-Lösung (0,01 mol L-1) mit Eisessig pH-Wert von

4,5 - 4,6 einstellen

Extraktionslösung:

60 Volumenanteile Ammoniumacetat/Essigsäure-Pufferlösung mit 40

Volumenteilen Methanol mischen.

Carrez-Reagenz I und II

Carrez-Reagenz I: 1,5 g Kaliumhexacyanferrat (II) in VE Wasser lösen und auf

10 mL auffüllen.

Carrez-Reagenz II: 2,3 g Zinkacetat in VE Wasser lösen und auf 10 mL

auffüllen.

Benzoesäure

Sorbinsäure

pHB- Methylester, pHB-Ethylester, pHB-Propylester

Obstsaft

Durchführung

a) Methodenoptimierung

Bereiten Sie jeweils folgende Stammlösungen: Benzoesäure, Sorbinsäure und

p-Hydroxybenzoesäure-Methylester (pHB-Methylester) (jeweils 200 mg L-1 in

40 %igem (v/v) Methanol).

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Bereiten Sie aus den Stammlösungen eine Referenz-Mischung mit c =

50 mg L-1 (pro Konservierungsstoff) und chromatographieren Sie die Mischung

mit den Elutionsgemischen 1-3 (s.u.) und beurteilen Sie die jeweilige

Trennleistung.

Als Eluenten (isokratisch) dienen:

Methanol (HPLC grade)

Ammoniumacetatlösung, wobei der pH-Wert mit Eisessig exakt auf 4,5-4,6

einzustellen ist.

Versuch 0,01 M Ammoniumacetatlösung (VT) Methanol (VT)

1 40 80

2 50 40

3 90 40

VT = Volumenteile

Flussrate: 1,2 mL min-1; Detektionswellenlänge: = 235 und 259 nm

Injektionsvolumen: 20 µL;

b) Qualitative Bestimmung

Bereiten Sie für jeden Konservierungsstoff jeweils eine 50 mg L-1 Lösung vor,

welche zur Bestimmung der Retentionszeit des jeweiligen Analyten dient. Nach

der Probenaufarbeitung bestimmen Sie den Konservierungsstoff in Ihrem

jeweiligen Obstsaft (s.u.).

c) Probenaufarbeitung und quantitative Bestimmung

Bei flüssigen Proben (wie z. B. Obstsäften) werden 10 mL direkt in einen

100 mL-Messkolben pipettiert und mit Extraktionslösung auf ein Volumen von

etwa 80 mL ergänzt. Der Kolbeninhalt wird zur Klärung mit je 1 mL der Carrez-

Reagenzien I und II versetzt, nach jeder Zugabe gut gemischt und mit

Extraktionslösung bis zur Marke aufgefüllt. Nach dem Durchmischen wird die

Lösung durch ein Faltenfilter filtriert (Vorlauf verwerfen!) und – falls erforderlich

nach Membranfiltration – zur HPLC-Analyse eingesetzt.

Bereiten Sie aus den Stammlösungen des unter b) qualifizierten

Konservierungsstoffs in der Saftprobe, jeweils 10 mL Standardlösungen der

folgenden Konzentrationen vor:

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10 mg, 15 mg, 25 mg, 35 mg und 50 mg L-1 in Methanol/Wasser-Gemisch (40

+ 60, v/v). Geben Sie die Ausgleichsgerade und den Regressionskoeffizienten

an.

Überprüfen Sie die Reproduzierbarkeit (besten Eluenten, s.o. verwenden) der

Einzelwerte und der Ausgleichsgeraden anhand von 3 Wiederholmessungen.

Verwenden Sie die gemittelten Einzelwerte zur Erstellung Ihrer

Kalibriergeraden.

Auswertung

Ermitteln Sie anhand Ihrer Kalibriergeraden den Konservierungsstoffgehalt der

Saftprobe!

Beurteilen und diskutieren Sie den Einfluss des Elutionsgemisches auf die

Trennleistung! Was würden Sie tun wenn zwei Substanzen coeluieren?

Geben Sie alle nötigen Parameter zur Beurteilung der Methode und

Trennleistung (A, B, w1/2, t0, tR, N, As, k, R, α) für alle drei verschiedenen

Konservierungsstoffe und die drei Eluenten tabellarisch an.

2.3 Carotinoidbestimmung

Grundlagen

Diese Methode gestattet die Bestimmung von ß,ß-Carotin in Tomaten- oder

Paprikamark und dient zur Untersuchung der Unterschiede vor und nach Verseifung.

Geräte und Hilfsmittel

Flüssigchromatograph mit UV-Detektor und Auswerteeinheit

Trennsäule: RP-18, 5 µm, 250 x 4 mm

Mixer

Küchenmesser

Scheidetrichter (250 mL)

Rotationsverdampfer

Stehrundkolben (250 mL)

250 mL oder 500 mL Rundkolben

Korkring

Messkolben

Faltenfilter

Glaswolle

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Chemikalien (p. a.)

, -Carotin

Dichlormethan (HPLC grade)

Methanol (HPLC grade)

Ethanol

Pentan/Ether

Diethylether

Butylhydroxytoluol (BHT)

Natriumsulfat

30% ige Methanolische Kaliumhydoxidlösung

Natriumchlorid

Tomatenmark, Paprikamark

Bereiten Sie eine , -Carotin-Stammlösung (c = 50 µg mL-1) im

Lösungsmittelgemisch Methanol/Dichlormethan (1/1 v/v) mit 0,1 g L-1 BHT

(tert. Butylhydroxytoluol) vor.

Kontrollieren Sie den -Carotin-Gehalt Ihrer Stammlösung anhand einer

photometrischen Messung in einem geeigneten Lösungsmittel (Einführung

durch den Assistenten)! Für die Berechnung verwenden Sie das Lambert-

Beersche Gesetz. Der molare Extinktionskoeffizient für -Carotin beträgt

140.400 L mol-1 cm-1 (Ethanol, 450 nm).

Bereiten Sie aus der Stammlösung Standardlösungen mit jeweils 1, 5, 10, 15

und 20 µg mL-1 im Lösungsmittelgemisch Methanol/Dichlormethan/BHT

1/1/0,1 (v/v/w). Geben Sie die Ausgleichsgerade und den Regressions-

koeffizienten an.

HPLC-Analyse (Nucleodur 100-5 ec C18-Phase, 5 µm, 250 x 4mm)

Die Elution des -Carotins erfolgt mit folgenden Eluentengemischen:

(v/v) Methanol Dichlormethan n-Hexan

Eluent A 95 2,5 2,5

Eluent B 55 22,5 22,5

15

im Gradientenmodus:

Zeit [min] % A % B

0 100 0

5 100 0

40 0 100

45 100 0

Injektionsvolumen: 20 µL, = 450 nm, Flussrate: 1,0 mL min-1.

Diskutieren Sie ihre Kalibrierung hinsichtlich Linearität und Aussagekraft (für

diese Analytik) und statistische Signifikanz. Können Sie aus der ermittelten

Kalibrierfunktion die Nachweisgrenze für -Carotin abschätzen?

Extraktion eines Obst/Gemüse-Mixes

Je 2 g Tomaten- oder Paprikamark mit ca. 20 mL H2O gelöst. Das Gemisch wird in

einem Scheidetrichter zweimal mit je 100 mL Pentan/Ether (1:1,12) ausgeschüttelt.

Die vereinigten Extrakte werden über Glaswolle filtriert, über Natriumsulfat getrocknet

und durch ein Faltenfilter in einen Rundkolben filtriert. Nach weitgehender Entfernung

des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer (Einführung durch Assistenten) werden

letzte Reste mit Stickstoff abgeblasen. Der ölige Rückstand wird in 2 mL Ethanol abs.

gelöst, mit Stickstoff erneut bis fast zur Trockene eingeengt und schließlich in 20 mL

Diethylether aufgenommen.

a) Verseifung

10 mL der etherischen Carotinoidlösung werden in einem Stehrundkolben mit

Diethylether auf 100 mL aufgefüllt und mit 10 mL methanolischer KOH-Lösung

(30 %ig w/w) versetzt. Man lässt über Nacht stehen und wäscht anschließend in

einem Scheidetrichter 3 mal mit je 100 mL H2O (beim ersten mal nur vorsichtig

schwenken, zur Phasentrennung ggf. Ethanol oder Kochsalz zugeben). Der Extrakt

wird über Na2SO4 getrocknet, filtriert und am Rotationsverdampfer fast bis zur

Trockene eingeengt. Reste des Lösungsmittels werden im Stickstoffstrom entfernt

und der Rückstand in 2 mL Methanol/Dichlormethan/BHT 1/1/0,1 (v/v/w)

aufgenommen.

16

b)

Die 10 mL der etherischen Carotinoidlösung, die nicht zur Verseifung eingesetzt

wurden, werden zur Trockene eingeengt. Reste des Lösungsmittels werden im

Stickstoffstrom entfernt und der Rückstand in 2 mL Methanol/Dichlormethan/BHT

1/1/0,1 (v/v/w) aufgenommen.

Auswertung

Führen Sie die HPLC-UV-Analyse des verseiften und unverseiften Carotinoid-

Extraktes unter o.g. Bedingungen durch. Analysieren Sie anschließend interessante

Peaks anhand der parallel aufgenommenen DAD-Spektren und identifizieren Sie

diese mit Hilfe der Literatur (Britton).

Schätzen Sie die jeweiligen Gehalte anhand der für β,β-Carotin ermittelten

Kalibrierfunktion ab und beurteilen Sie die „Richtigkeit“ dieses Verfahrens über

Vergleiche mit erwarteten Carotingehalten.

2.4 Tocopherolbestimmung

Grundlagen

Diese Methode dient zur Beurteilung der -Tocopherol Konzentration in zwei

verschiedenen Speiseölen mittels Standardaddition.

Geräte und Hilfsmittel

Flüssigchromatograph mit Floureszenzdetektor und Auswerteeinheit

Trennsäule: Nucleosil 100-5 (Machery-Nagel), 5 µm, 250 x 4 mm

Messkolben (10 mL)

Chemikalien (p. a.)

-Tocopherol

Methanol/Ameisensäure (99,5 %/0,5 %) (v/v))

Diethylether

Speiseöl

Durchführung

40 mg -Tocopherol werden in einem 10 mL Messkolben in

Methanol/Ameisensäure (99,5 %/0,5 %) (v/v) gelöst und bis zur Marke

aufgefüllt (Stammlösung). Aus der Stammlösung werden verschiedene

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Kalibrierpunkte (1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 mg/mL) in Methanol/Ameisensäure

(99,5 %/0,5 %) (v/v) Referenzlösung hergestellt:

Die HPLC-Analyse erfolgt an einer Kieselgelphase mit

Methanol/Ameisensäure (99,5 %/0,5 %) (v/v) als Fließmittel (isokratisch);

Injektionsvolumen: 20 µL; Fluss: 1,0 mL min-1, em = 289 nm, ex = 331 nm,

25 °C. Zwischen den Messungen wird erst mit Methanol/Ameisensäure (99,5

%/0,5 %) (v/v) 5 min lang gespült und im Anschluss die Säule 15 min lang

mit Methanol/Ameisensäure (99,5 %/0,5 %) (v/v) equilibriert.

Zur Bestimmung des -Tocopherolgehaltes in zwei verschiedenen Speiseölen

werden jeweils ~ 1 g des zu untersuchenden Öls genau in einen 10 mL

Messkolben eingewogen und mit n-Hexan bis zur Marke aufgefüllt. Diese

Lösung wird direkt zur HPLC-Bestimmung unter o.g. Bedingungen verwendet.

Zur Identifizierung des -Tocopherolpeaks werden dem 500 µl des Öls mit je

500 µl Referenzlösung (a) 4,0 mg/mL und b) 8,0 mg/mL) vermischt und mittels

HPLC analysiert.

Es sollen Dreifachbestimmungen durchgeführt werden.

Auswertung

Die Quantifizierung erfolgt über ein Standard-Additionsverfahren. Hierbei

werden unterschiedliche Mengen von einer Tocopherol-Standardlösung zu

einer konstant gehaltenen Menge Öl-Lösung zudosiert.

Welche alternative Quantifizierung könnte man verwenden? Wie ließe sich die

Sicherheit der Identifizierung von -Tocopherol erhöhen?

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Allgemeine Angaben zu Versuchsprotokollen – Institut für Lebensmittelchemie Prinzip

In 2-3 Sätzen darstellen, worum es bei dem Versuch geht und was das Versuchsziel ist Durchführung

Die Durchführung des Versuches ist bereits im Skript angegeben. Stellen Sie hier nur wesentliche Abweichungen dar. Die Abweichungen sollten nachvollziehbar sein und begründet werden. Rohdaten

Hier sind sämtlich experimentellen Daten wie Einwaagen, Verbrauch an Maßlösung, Verdünnungen, Chromatogramme, Spektren etc. anzugeben bzw. darauf zu verweisen (Chromatogramme können auch in einen Anhang gegeben werden) Auswertung und Berechnung

Hier muss schlüssig aus den Rohdaten das Ergebnis abgeleitet werden (ggf. mit Strukturformeln und Reaktionsgleichungen). Insbesondere sind sämtliche Berechnungen, die zum Ergebnis geführt haben, nachvollziehbar darzustellen! Ergebnis/Schlussfolgerung/Diskussion

Was ist das Versuchsergebnis und wie ist diese zu Bewerten? Fallen beim Vergleich mit literaturbekannten Werten Unterschiede auf? Wie kommen die Unterschiede zustande? Literatur

Angabe der verwendeten Literatur. Bitte verwenden Sie vertrauenswürdige Quellen; ausschließliches ‚googlen‘, bzw. kopieren von ‚Wikipiedia‘ Artikeln wird nicht akzeptiert! Verwenden Sie die im Praktikumsskript angegebene Literatur, bzw. Literatur aus der TIB! Anhang

Hier kommen evtl. Chromatogramme, Spektren o. ä. rein Anmerkung

Quellen müssen korrekt zitiert werden! Achten Sie beim Protokoll auf eine kurze und prägnante Darstellung von Sachverhalten (keine ‚Ich‘-form, keine seitenlangen Diskussionen)