(Version: 2008­12­02)

Praktikumsteil: Zellkultur und Fluoreszenzmikroskopie

Darstellung und Untersuchung von Zellorganellen und Zytoskelettkomponenten

Einleitung

Der   Lokalisation   von   Proteinen   kommt   in   der   Zellbiologie   und   der   klinischen Diagnostik eine bedeutende Rolle zu. Die Verwendung von Zellkulturen oder Geweben erfordert in der Regel eine Vorbehandlung bzw. Fixierung des Materials, die sowohl die  Zellstrukturen  als  auch  die   antigenen  Eigenschaften  der  Proteine  bestmöglich erhalten   soll.   Für   die   Lokalisation   von   Proteinen   werden   häufig   mono­   und polyklonale  Antikörper   eingesetzt,  deren  Lokalisation   sich  durch  die  Kopplung  an einen Fluoreszenzfarbstoff sichtbar machen läßt. Hierbei kann das Fluorochrom (in der   Regel   Fluorescein­   oder   Rhodaminderivate)   direkt   an   den   Primärantikörper (direkte   Immunfluoreszenz)   oder   aber   an   einen   Sekundärantikörper   (indirekte Immunfluoreszenz) gekoppelt sein. Will man Fixationsartefakte ausschließen, müssen Zellen   im   lebenden   Zustand   beobachtet   werden.   Durch   die   Entwicklung   neuer Lebendfarbstoffe,   die   Kombination   von   Video­   und   Computertechnik   mit   der Lichtmikroskopie, und durch die gentechnische Nutzbarmachung von GFP kommt der in vivo Mikroskopie bei der Analyse von zellbiologischen Prozessen eine immer größere Bedeutung zu.

Aufgabenstellung

In   diesem   Praktikumsteil   sollen   unterschiedliche   Zellkompartimente   und Zytoskelettkomponenten   in   fixierten  Zellen  markiert  und  mikroskopisch  analysiert werden. 

• Teil 1 umfasst die Kultivierung und experimentelle Vorbereitung der Zellen; • Teil 2 die Herstellung der Fluoreszenzpräparate und • Teil 3 die Auswertung der Fluoreszenzpräparate. 

Hierbei   sollen   unterschiedlich   lokalisierte   Proteine,   verschiedene   Fixierungs­   und Markierungsmethoden   sowie   unterschiedliche   Fluoreszenzmarker   verwendet   und verglichen werden.

Teil 1: Zellkultur (1. Tag)

Einführung

Zur biochemischen und morphologischen Analyse einer relativ homogenen Population von   Säugerzellen   wurden   Methoden   zur   Kultivierung   und   Proliferation   einzelner Zelltypen (Zellinien) entwickelt. Die grundlegenden Methoden der Zellkulturtechnik sollen   besprochen   und   vermittelt   werden.   Die   Vorbereitung   der   Zellen   für   die nachfolgenden Versuche soll erfolgen.

Einführung in die Zellkulturtechnik

➢ Permanente Zellinien, Primärkulturen➢ Adhärente Zellen, Suspensionskulturen➢ Zellkulturmedien und Seren, serumfreie Kultur➢ Steriles Arbeiten, Antibiotika, Kontaminationen➢ Inkubation➢ Medienwechsel➢ Passagieren der Zellen➢ Auftauen/Einfrieren von Zellstocks

Versuchsdurchführung:

Zellen

➢ HeLa­Zellen (Cervix­Carcinoma)

Reagenzien

➢ PBS (phosphate buffered saline), pH 7,3, 1x konz., steril➢ DMEM (low glucose), 10% FCS, Antibiotika, L­Glutamin➢ Trypsin/EDTA­Lösung➢ 70% Ethanol zum Desinfizieren

Material

➢ Gewebekulturschalen➢ Uhrmacherpinzetten➢ Deckgläschen, steril➢ Pasteurpipetten, Glas­ und Plastikpipetten, steril➢ Sterile Werkbank mit Absaugeinrichtung➢ Inkubator (37°C, 5% CO2)

ACHTUNG ­ bei allen folgenden Arbeitsschritten darauf achten, dass die Zellen nichtkontaminiert werden! Steril arbeiten!!!

1. Kulturmedium einer 10 cm2 Schale mit einer Pasteurpipette absaugen

2. Zellen 1x mit 5 ml PBS waschen3. 1 ml Trypsin/EDTA zugeben, kurz (max. ca. 5 min) bei RT inkubieren 

(mikroskopische Kontrolle)4. abgelöste Zellen in Medium aufnehmen, in 15 ml Falconröhrchen sammeln5. Zentrifugation: 500g, 5 Min., RT6. währenddessen sterile Deckgläschen in Gewebekulturschalen legen, Medium 

zugeben7. Medium im Falconröhrchen (Überstand) absaugen, Zellpellet in frischem 

Medium8. Die Zellen vorsichtig aber gründlich resuspendieren (8­10 ml)9. Zellzahlbestimmung10. Aussaat von ca. 300.000 Zellen in die vorbereiteten Gewebekulturschalen11. Inkubation bei 37°C, 5% CO2

Teil 2: Fluoreszenzmarkierung von Zellorganellen in situ (2. Tag)

Einführung

Durch direkte und indirekte Fluoreszenzmarkierung sollen Isoformen der humanen Thioredoxine und Glutaredoxine (Proteine der Redoxhomöostase), Zellorganellen und Cytoskelett­komponenten   in   verschiedenen   Zellinien   dargestellt   werden.   Es   sollen jeweils   Mehrfach­Markierungen   mit   unterschiedlich   manipulierten,   fixierten   und permeabilisierten   Zellen   durchgeführt   werden.   Dabei   werden   unterschiedliche Fluoreszenzmarker   verwendet.   Zusätzlich   werden   in   Kontrollversuchen   die spezifischen primären Antikörper  vor  der  Inkubation  mit  den Proben mit  Antigen gesättigt um die Spezifität der Färbung zu untersuchen.

Versuchsdurchführung

Reagenzien

➢ Waschpuffer: PBS (phosphate buffered saline), pH 7,3, 1x konz.➢ Fixans: p­Formaldehyd, 4% in CMF­PBS, RT, Methanol, abs., ­20°C➢ Block­ und Permeabilisationspuffer: 10 mM HEPES, 3% BSA, 0,3 % Triton 

X­100 in PBS➢ Einbettmedium: Mowiol 4.88 in Glycerin➢ spezifische Primärantikörper➢ Fluorochrom­markierte (AlexaFlour 488) Sekundärantikörper➢ Hoechst 33342 Farbstoff (DNA Färbung)➢ Mitotracker DeepRed 633

Material

➢ Filterpapier➢ Plastikpetrischalen als feuchte Kammern➢ Uhrmacherpinzetten➢ Objektträger➢ Absaugpumpe

ACHTUNG ­ bei allen folgenden Arbeitsschritten darauf achten, dass die Zellen nichtaustrocknen!!!

I. Mitochondrienfärbung(Dieser erste Teil wird von den Betreuern vor der Fixierung durchgeführt)

1. Kulturmedium mit einer Plastik­Pasteurpipette absaugen2. Zellen 2x mit PBS (1x konz., ca. 10 ml/Schale) waschen3. Auftropfen der Mitotracker Verdünnung

II. Fixierung4. Zellen 3x mit PBS waschen5. p­Formaldehydlösung zupipettieren (1­2ml/Schale), 20 min bei 

Raumtemperatur fixieren, mit PBS waschen6. Zellen mit Block­  und Permeabilisierungspuffer permeabilisieren (1­2 

ml /Schale) für 60 min7. 3x mit PBS waschen

III. Blocken8. Antikörperverdünnungen fertigstellen

1. Antikörperverdünnungen OHNE Antigen im Eis aufbewahren2. Antikörperverdünnung MIT 30 µg/ml Antigen bei RT inkubieren

9. Feuchte Kammer herstellen: In eine Plastikpetrischale passendes Stück Filterpapier in den Deckel legen, befeuchten (nicht ertränken!)

10. PBS absaugen

IV. Primärantikörper11. Die Primärantikörpers in einem Tropfen auf das Deckglas pipettieren, Deckel 

der Feuchtekammer mit feuchtem Filter auflegen, bei RT 45­60 min inkubieren12.3x mit PBS waschen13.20 l des Sekundärantikörpers auf das Deckglas auftropfen, Deckel mitμ  

feuchtem Filter auflegen, bei RT 45­60 min lichtgeschützt inkubieren14. 3x mit PBS waschen

V. Kernfärbung15.Hoechst 33342 Verdünnung auftropfen und 5min im Dunkeln inkubieren16. 3x mit PBS waschen

VII. Eindeckeln der Präparate17. Objektträger vorbereiten: Für jedes Deckglas einen Objekttäger putzen, 

beschriften und mit einem kleinen Tropfen Mowiol versehen18. Jedes Deckgläschen mit Pinzette aus PBS nehmen, kurz in Becherglas mit dest. 

Wasser tauchen, überschüssige Flüssigkeit am Rand mit Flterpapier absaugen19.Deckgläschen umgekehrt (Zellen nach unten!!!) und möglichst luftblasenfrei auf 

Mowioltropfen auflegen und leicht andrücken20.Präparate über Nacht trocknen, danach lichtgeschützt und kühl lagern

Teil 3: Fluoreszenzmikroskopie (3. Tag)

Am dritten Tag werden die Präparate am Fluoreszenzmikroskop (Olympus oder Leica) ausgewertet und dokumentiert. Die Beobachtungen und Ergebnisse der Auswertung sollen in einem kurzen Ergebnisprotokoll zusammengefaßt werden.

Zeitplan für die Zellkulturarbeit am Dienstag (Gruppennummern)

Uhrzeit Gruppen

11.30 ­ 12.45 1 + 2

12.45 ­ 14.00 3 + 4

14.00 – 15.15 5 + 6

Zeitplan für die Fluoreszenzmikroskopie am Donnerstag (Gruppennummern)

Uhrzeit Fluoreszenzmikroskop Konfokales Mikroskop

08­11 3 + 4 1 + 2

11­14 5 + 6 3 + 4

14­17 1 + 2 5 + 6