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Gaschromatographie (GC) Bestimmung von Kovats-Indices
Stichworte: Retentionszeit, Retention, Kovats-Indices, Trennfaktoren
Es sollen die Kovats-Indices IK der drei Verbindungen Ethylbenzol, Benzol und Toluol bestimmt werden.
Zur Durchführung des Versuchs werden von der ausstehenden Mischung der n-Alkane (Pentan, Hexan,
Heptan, Octan, Nonan und Dekan) je 3 mal 1 µl bei 70 °C injiziert. Die Mischung Ethylbenzol, Benzol
und Toluol in Trichlortrifluorethan wird bei dieser Temperatur ebenfalls 1.0 µl 3 mal injiziert.
Für die Zuordnung der aromatischen Verbindungen können Sie die Messungen zur quantitativen GC
verwenden.
Die Analysenzeit beträgt bei 70 °C etwa 10 min.
Geräteeinstellungen
Fluss 1 ml/min Stickstoff
Split 1:200
Injektor SPL 270 °C konstant
Säule Varian Vf-5ms, 30 m
Ofentemperatur: 70 °C
Durch die Wahl eines geeigneten Temperaturprogramms sollen Sie nach diesen Messungen die
Analysenzeit für die n-Alkane minimieren.
Auswertung
1) Stellen sie die Funktion log tr = f (IK) dar und bestimmen Sie die Kovats-Indices der aromatischen
Verbindungen
2) Diskutieren Sie die Ergebnisse der Analysenoptimierung
Quantitative GC
Stichworte: Responsefaktoren, Interner und externer Standard, Standardaddition
Von den ausstehenden Lösungen (a. Toluol/Benzol, b. Ethylbenzol/Benzol je 0,5 ml Aromat in 100 ml
Trichlortrifluorethan) werden jeweils drei Chromatogramme bei 70 °C aufgenommen. Die
Einspritzmenge soll 1.0 µl betragen. Die unbekannte Mischung haben Sie schon zur Bestimmung der
Kovats-Indices injiziert (Die Messwerte daraus könnnen Sie hier verwenden). Anschließend werden 0.5
ml der unbekannten Mischung (Benzol, Toluol, Ethylbenzol in Trichlortrifluorethan) mit 0.5 ml der
Benzollösung (4 ml Benzol in 100 ml Trichlortrifluorethan) gemischt. Von dieser Mischung werden
dreimal 1.0 µl injiziert.
Geräteeinstellungen
Fluss 1 ml/min Stickstoff
Split 1:200
Injektor SPL 270 °C konstant
Säule Varian Vf-5ms, 30 m
Ofentemperatur: 70 °C
a) Ermitteln Sie die Responsefaktoren von Ethylbenzol und Toluol gegenüber Benzol
b) Berechnen Sie mit diesen Faktoren die Konzentrationen der Verbindungen Benzol, Toluol und
Ethylbenzol in der Aromatenprobe
c) Berechnen Sie die Konzentrationen von Benzol in der unbekannten Mischung durch Anwendung des
Aufstockverfahrens
Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)
Bestimmung von Aromaten in Speiseöl
Stichworte: Gaschromatographie, Massenspektrometrie, Elektronenstoßionisation, Fragmentierung,
Headspace-Sampling, Aufstockverfahren
Durchführung: Am Beispiel eines Speiseöls sollen unbekannte aromatische Verbindungen in einer
komplexen Matrix untersucht werden.
Folgende Randbedingungen sind eingestellt:
Headspace-Sample Dani HSS 1000:
Probenofen: 120 °C
Probenaufenthalt: 15 min
Probenschleife: 1 ml
Transfer Tube: 130 °C
Gaschromatograph HP:
Trägergas: 1,0 bar Helium
Injektionsblock: Gerstel-PTV 70 °C (const.)
Ofen: 50 °C / 1 min / 6 °C min-1 / 80 °C / 25 °C min-1 / 150 °C
Massenspektrometer HP:
Solvent Delay: 1 min
Scan-Modus: 30 – 550 amu
Die Einstellungen an den Geräten werden vom Assistenten durchgeführt und sind nicht zu
verändern!
Bestimmung der Aromaten: Zu Beginn des Versuchs werden 2 ml eines bereitgestellten Speiseöls (mit Aromaten) in ein 20 ml Head-Space Gefäß pipettiert
und mittels GC-MS analysiert. Die aromatischen Inhaltsstoffe des Speiseöls können mit Hilfe einer MS-Datenbank aus dem
TIC (total ion current) identifiziert werden.
Quantitative Bestimmung der Aromaten:
Für diesen Versuchteil bedient man sich des Aufstockverfahrens. Hierzu wird eine Standardlösung angesetzt, bei der man 10
ml reinen Öls in ein Becherglas pipettiert und je 25 µl der Aromaten 1 - 4 (stehen am Arbeitsplatz aus) hinzugibt. Nach kurzer
Rührzeit mit einem Magnetrührer werden dann folgende Proben hergestellt und in ein Head-Space Gefäß pipettiert:
Öl (mit Aromat) Öl (rein) Standardlösung
1. Aufstockung 1,0 ml 1,0 ml 0,0 ml
2. Aufstockung 1,0 ml 0,8 ml 0,2 ml
3. Aufstockung 1,0 ml 0,6 ml 0,4 ml
4. Aufstockung 1,0 ml 0,4 ml 0,6 ml
5. Aufstockung 1,0 ml 0,2 ml 0,8 ml
Danach erfolgt für die fünf Aufstockungen die gleiche GC-MS Bestimmung, wie zu Beginn für die mit Aromaten versetzte
Ölprobe.
Auswertung:
1.) Stellen Sie die Analysenfunktion FE = F(cAromat [mg/2ml]) graphisch dar und erläutern Sie den Verlauf der Funktion.
2.) Berechnen Sie aus dem negativen Schnittpunkt der Regressionsgerade auf der Abzisse die Aromatenkonzentration des
Speiseöls.
3.) Diskutieren Sie die von den identifizierten Aromaten aufgenommenen Massenspektren und ordnen Sie den
intensitätsreichsten Signalen die entsprechenden Fragmente zu.
4.) Welchen Vorteil besitzt das Aufstockverfahren gegenüber der Kalibrierung?
Atom-Absorptions-Spektrometrie (AAS)
Bestimmung von Kupfer und Eisen in einer Wasserprobe
Stichworte: Grundzustand, Atomisierung, Spektrallinien, Absorption, Hohlkathodenlampe,
Untergrundkompensation, Unabhängigkeit von Messungen, Verfahrenskenngrößen
Durchführung: Am Beispiel des Absorptionsvermögens von Kupfer sollen die erreichbare
Nachweisgrenze, die Reproduzierbarkeit und Standardabweichung des Verfahrens nach Kalibriergeraden-
und Leerwertmethode bestimmt werden.
Am Beispiel von Eisen soll das Aufstockverfahren als alternatives Analysenverfahren untersucht werden.
Folgende Randbedingungen werden eingestellt:
Gerät: Varian Spektra AA (ohne D2-Untergrundkorrektur)
Trägergas: Luft (3.5 l/min)
Brenngas: Acetylen (1.5 l/min)
Multielementhohlkathodenlampe: Cu, Fe
Lampenstrom: 5 mA (Cu), 5 mA (Fe)
Spaltbreite: 0.5 nm (Cu), 0.2 nm (Fe)
Wellenlänge: 324.8 nm (Cu), 248.3 nm (Fe)
Die Einstellung der Geräteparameter am Spektrometer erfolgt durch den Assistenten!
Kupfer – Kalibrierverfahren:
Ausgehend von der Fixanal-Lösung (10 g/l Cu) werden die folgenden 10 Verdünnungen hergestellt:
lfd. Nr. Konz. Kupfer lfd. Nr. Konz. Kupfer
1 0,02 mg/l 6 0,5 mg/l
2 0,03 mg/l 7 1,0 mg/l
3 0,05 mg/l 8 2,0 mg/l
4 0,10 mg/l 9 3,0 mg/l
5 0,25 mg/l 10 5,0 mg/l
Alle Lösungen werden mit 0,65 %iger Salpetersäure (10 ml 65 %ige HNO3 pro Liter) aufgefüllt!!
Die Extinktion wird folgendermaßen bestimmt:
Die Leerwert-Lösung (0,65 % HNO3) wird vor jeder Messreihe einmal benutzt, um den Leerwert des
Gerätes (Autozero-Taste) auf 0,000 einzustellen. Die Extinktion jeder Kalibrierlösung wird fünfmal nach
folgender Messreihe bestimmt, die die Unabhängigkeit der Messungen sicherstellt:
Messreihe 1: Lösung 1 – 10
Messreihe 2: Lösung 1 – 10
Messreihe 3: Lösung 1 – 10
Messreihe 4: Lösung 1 – 10
Messreihe 5: Lösung 1 – 10
Im Anschluss nach jeder Messreihe wird die kupferhaltige, unbekannte Wasserprobe gemessen.
Kupfer – Leerwertmethode:
Für die Bestimmung der Nachweisgrenze nach der Leerwertmethode werden 10 Leerwert-Lösungen (0,65
% HNO3) neu hergestellt. Pro Leerwert-Lösung werden jeweils fünf Extinktionen bestimmt. Als
Empfindlichkeit des Verfahrens wird die Steigung b vom Kalibrierverfahren übernommen.
Eisen – Additionsverfahren:
Ausgehend von der Fixanal-Lösung (10000 mg/l Fe) wird eine Standardlösung von 10 mg/l Eisen
hergestellt, wobei alle Lösungen mit 0,65 %iger Salpetersäure aufgefüllt werden.
Dann werden in 4 Messkolben, Nennvolumen 50 ml, jeweils 25 ml der unbekannten Eisenprobe gegeben.
In diese Messkolben werden folgende Volumina der Eisen-Standardlösung pipettiert: 0 ml, 5 ml, 10 ml
und 15 ml. Die Messkolben werden anschließend mit 0,65 %iger Salpetersäure bis zur Marke aufgefüllt.
Als Blindwert-Lösung dient die 0,65 %iger Salpetersäure.
Die Zugaben von Eisen-Standardlösung ergeben folgende Eisengehalte:
0 ml 0 mg/l unbekannte Messlösung
5 ml 2 mg/l 1. Aufstockung
10 ml 4 mg/l 2. Aufstockung
15 ml 6 mg/l 3. Aufstockung
bezogen auf das eingesetzte Volumen der Messlösung von 25 ml. Die Verdünnung, die durch das
Auffüllen auf 50 ml bedingt ist, geht nicht in die Berechnung ein.
Die Leerwert-Lösung (0,65 % HNO3) wird einmal benutzt, um den Leerwert des Gerätes (Autozero-
Taste) auf 0,000 einzustellen. Jede Messlösung mindestens dreimal messen.
Auswertung:
Kupfer
1.) Stellen Sie die Analysenfunktion Ext. = F(cCu [mg/l]) grafisch dar und erläutern Sie den Verlauf der
Funktion.
2.) Berechnen Sie aus der Analysenfunktion die Kupferkonzentration der unbekannten Wasserprobe.
3.) Berechnen Sie die Standardabweichung des Verfahrens.
4.) Berechnen Sie die Nachweis-, die Bestimmungs- und Erfassungsgrenze des Verfahrens gemäß der
Kalibriergeraden- und Leerwertmethode nach DIN 32645 (Mai 1994).
Eisen
1.) Stellen Sie die Analysenfunktion Ext. = F(cFe [mg/l]) graphisch dar und erläutern Sie den Verlauf der
Funktion.
2.) Berechnen Sie aus dem negativen Schnittpunkt der Regressionsgerade auf der Abszisse die
Eisenkonzentration der unbekannten Wasserprobe.
3.) Welchen Vorteil besitzt das Aufstockverfahren gegenüber der Kalibrierung?
Literatur:
Wachter, G., Kleiner, J., Lernhardt, U., „Statistik in der Analytischen Qualitätssicherung – Teil 1 bis 9",
Chemie in Labor und Biotechik 49 (1998), 84-86, 128-132, 180-183, 217-220, 258-262, 297-299, 336-
341, 380-384, 421-424
Polarographie
Der Versuch: Ascorbinsäure (Vitamin C) in flüssigen Lebensmitteln wird durch oxidative differentiale
Pulspolarographie sowohl mit dem Kalibrier- als mit dem Standardaufstock- verfahren bestimmt.
Stichworte: Arbeits-, Gegen- und Bezugselektrode; Kapazitätsstrom; Diffusionsstrom;
Halbstufenpotential; Gleichstrom- und Pulspolarographie; polarographische Auswerteverfahren; Ilkovič-
Gleichung; Matrixeffekte; Entgasen von Lösungen
Literatur: (Theorie)
1. D. A. Skoog und J. J. Leary, Instrumentelle Analytik, Springer, Berlin, 1996, S. 515-525,
576-588, 592-603
2. Harris, Daniel C., Lehrbuch der Quantitativen Analysis, Vieweg, Braunschweig, 1998, S. 572-
577, 601-625
3. Schwedt, G., Analytische Chemie, Thieme, Stuttgart, 1995, S. 146-159
Gebrauchte Reagenzien: 1. Eine ca. 0,1 %ige Oxalsäure-Lösung (ca. 1 g in 1 L Reinstwasser).
2. Eine Standardlösung von 100,0 mg Ascorbinsäure in 100,0 mL Oxalsäure-Lösung. Die
Ascorbinsäure wird in einem 100-mL-Messkolben in wenig 0,1 %iger Oxalsäure-
Lösung gelöst und auf die Marke aufgefüllt.
2. Leitelektrolyt, pH ca. 4,5: Ammoniumacetat (3,85 g) und Eisessig (3 mL) in einem
500-mL-Messkolben werden mit der 0,1 %igen Oxalsäure auf die Marke aufgefüllt.
Vorsicht:
Quecksilber und seine Salze sind hochgiftig. Sie sind in die dafür vorgesehenen Behälter zu geben. Nie
in den Abguss!
Probenvorbereitung: Normaler Fruchtsaft braucht keine Vorbereitung, außer Filtrieren und eventueller
Verdünnung, um eine Endkonzentration im Polarographiegefäß von 0,5 bis 5 mg/20 mL zu erhalten.
Limonade muss mittels Ultraschall von Kohlensäure befreit werden.
Geräte Parameter: Folgende Parameter sind beim Metrohm 646 VA schon eingestellt.
Startpotential: ca. – 150 mV
Endpotential: ca. + 100 mV
Potentialschritte: 4 mV
Stromachse: 0 bis 1,6 ×10-6 A
Durchführung
Der Metrohm 646 VA-Prozessor ist vorprogrammiert für beide Bestimmungen. Die Bedienung des
Instruments ist unten beschrieben.
1. Das Kalibrierverfahren
In ein Polarographiegefäß werden 20,0 mL Leitelektrolyt und 0,1 mL Kalibrierlösung gegeben. Die im
Instrument gespeicherte Methode 10 wird dann aufgerufen und durchgeführt:
Auf der ersten Dialogseite (PAGE 1) wird die Methode mit der Tastenfolge me10 Eingabe (↵)
aufgerufen. PAGE 4 der Methode 10 erscheint auf dem Bildschirm.
Mit der Tastenkombination ne ↵ wird die Dialogseite PAGE 7 erreicht. Die
Anzeige blinkt „READY“.
Mit der Taste START wird das Programm gestartet.
Gleich danach wird die Taste HOLD gedrückt, um das Programm anzuhalten. Über die nächsten
fünf Minuten wird die Lösung mit Stickstoff gespült (warum?).
Die Taste Start wird erneut gedrückt, das Programm läuft von sich jetzt weiter.
Im Programm ist vorgesehen, dass zwei Polarogramme für jede der drei Lösungen aufgenommen werden.
Erst danach wird das Messprotokoll mit Kurven und berechneten Werten (Ströme) ausgedrückt.
In das Polarographiegefäß wird noch 0,1 mL Kalibrierlösung gegeben und unter den gleichen
Bedingungen erneut polarographiert. Insgesamt werden fünf solche Kalibriermessungen durchgeführt,
jedes Mal mit Stickstoffspülung.
Im Anschluss werden in ein sauberes Polarographiegefäß wieder 20,0 mL Leitelektrolyt sowie 0,5 mL
des CO2-freien Fruchtsafts vorgelegt. Das Programm wird wie vorher ablaufen lassen. Bei diesem
Verfahren berechnet der Computer keine Konzentration für die unbekannte Probe.
2. Das Standardaufstockverfahren
In ein sauberes Polarographiegefäß werden wieder 20,0 mL Leitelektrolyt sowie 0,5 mL des CO2-freien
Fruchtsafts vorgelegt. Die im Instrument gespeicherte Methode 9 wird dann wie beim Kalibrierverfahren
aufgerufen und gestartet.
Das Programm und die zweimalige Aufnahme des Polarogramms laufen wie vorher ab.
Danach erscheint diesmal allerdings die Anzeige „ADD“ auf dem Bildschirm.
An dieser Stelle werden 0,05 mL der Kalibrierlösung hinzugegeben und die Lösung noch
ca. 1 Minute mit Stickstoff gespült. Nach Drücken der START-Taste wird das Polarogramm
zweimal aufgenommen.
Bei diesem Verfahren wird das Protokoll noch nicht ausgedrückt. Es werden zuerst wieder 0,05
mL der Kalibrierlösung hinzugegeben und das Polarogramm nach drücken der START-Taste
noch zweimal aufgenommen.
Danach ist das Programm zu Ende. Das Protokoll mit Konzentration der unbekannten Probe
wird automatisch ausgedrückt.
Auswertung Aus den erhaltenen Werten beider Verfahren wird der Gehalt an Ascorbinsäure in der Fruchtsaft-probe
berechnet. Der Computer druckt Ergebnisse nur für das Kalibrierverfahren aus. Er geht davon aus, dass
die Kalibrierlösung aus genau 100,0 mg Ascorbinsäure / 100,0 mL Wasser besteht. Wenn nicht genau
100,0 mg Ascorbinsäure abgewogen wurden, muss die Abweichung berücksichtigt werden.
Beim Kalibrierverfahren stellen Sie eine Kalibriergerade durch lineare Regression auf (Sie haben
zwei Messpunkte für jede Konzentration). Die Konzentration der Ascorbinsäure im Fruchtsaft wird
daraus berechnet.
Beim Standardaufstockverfahren wird auch eine Gerade durch lineare Regression erstellt (Sie haben jetzt
nur sechs Messdaten). Die Konzentration der Ascorbinsäure im Fruchtsaft wird durch den negativen
Achsenschnitt gegeben. Sie sollten dasselbe bekommen, wie der Computer.
Auswertung fürs Protokoll Das Protokoll zu diesem Versuch sollte alle oben angegebene Stichworte erklären und dazu folgendes
enthalten:
Eine Einleitung: Beschreibung des Aufbaus einer polarographischen Messzelle
Prinzipien der Polarographie
das Polarographie-Verfahren, das hier angewendet wird
Die Messergebnisse: vollständige numerische Daten
angehängte Polarogramme und ausgedrückte Ergebnisse
Berechnungen des Ascorbinsäuregehälts des Fruchtsaftes nach beiden Methoden
Diskussion: Vergleich der beiden Ergebnisse
Schwierigkeiten des Versuchs
Abweichungen der Ergebnisse vom Erwarteten
Dünnschichtchromatographie (DC, engl. TLC) Stichworte: Rf -Wert, Laufmittel, Polarität, eluotrope Reihe, Umkehrphase, zweidimensionale
Entwicklung, Visualisieren (Detektion), Computergesteuerte Auswertung einer DC-Platte
Teil 1: Eluotrope Reihe
Der Einfluss von Laufmittelpolarität auf den Rf-Wert wird untersucht. Normalphasen- und
Umkehrphasendünnschichtplatten werden verglichen.
Aufgabe:
1.1. Auf jede von zwei Kieselgel-60-Dünnschichtplatten (5 × 10 cm) wird ein leichter
Bleistiftstrich (auf der kurzen Seite, ca. 1,2 cm vom unteren Rand) gezogen. Zwei Startpunkte
werden auf der Linie markiert. Auf jede Platte werden 1) Resorcin und 2) der Methylester von p-
Hydroxyphenylessigsäure (je 2 µL) aufgetragen. Die Platten werden mit Di-iso-propylether (ε =
0,28) und Ethylacetat (ε = 0,58) entwickelt.
1.2. Auf derselben Weise werden auf drei RP-18-Platten Thymolblau und Thymolphthalein (je 2
µL) aufgetragen. Die Platten werden mit Methanol (ε = 0,95), 2:1 Methanol/Wasser (ε bei
Wasser ist „sehr groß“), sowie 1:1 Methanol/Wasser entwickelt. Dieser Teil ist relativ langsam.
Warum?
Das Trocknen der Platten wird immer im Abzug durchgeführt .
Teil 2: Retentionsverhalten und Trennung von Analyten
Die Phenole in einer unbekannten Mischung sollen anhand ihres Retentionsverhaltens
identifiziert werden; dazu wird sowohl die ein- als auch die zweidimensionale
Entwicklungstechnik angewendet. Die reinen Phenole (Brenzkatechin, Resorcin, 2,5-, 2,6- und
3,4-Xylenol und der Methylester von p-Hydroxyphenylessigsäure) in Di-iso-propylether dienen
als Vergleich.
Aufgabe:
2.1. Eindimensionale Entwicklung: Auf je zwei Kieselgel-60-Dünnschichtplatten (10 × 10 cm)
wird ein leichter Bleistiftstrich ca. 1 cm vom Rand gezogen. Ca. 1,5 cm vom linken Rand
beginnend werden acht Punkte mit 1-cm-Abstand markiert. Auf jede Platte werden die sechs
reinen Phenole, eine Mischung dieser sechs und eine unbekannte Mischung getragen (je 2 µL);
eine Platte wird mit Dichlormethan, die andere mit Di-iso-propylether entwickelt.
2.2. Zweidimensionale Entwicklung: An einer Ecke einer dritten Platte (ca. 1,2 cm von beiden
Rändern) wird das Gemisch der sechs Phenole (2 µL) getragen. Diese Platte wird zuerst mit
Dichlormethan, dann nach dem Trocknen in die andere Richtung mit Di-iso-propylether
entwickelt.
Eine Platte mit der unbekannten Probe wird auch zweidimensional chromatographiert.
Teil 3: Detektion:
Verschiedene Methoden zur Visualisierung der Substanzflecke werden untersucht (z. T.
Demoversuch).
Teil 3.1. Die Flecke sind schon sichtbar.
Teil 3.2. Chemische Reaktion: Die Phenole werden durch Besprühen zuerst mit 0,1 M NaOH
dann mit diazotierter p-Nitroanilin-Lösung sichtbar gemacht.
Das Besprühen der Plat ten wird immer im Abzug durchgeführt .
Herstellung der diazotierten p-Nitroanilin-Lösung: Die Stammlösung von p-Nitroanilin (ca. 440
mg p-Nitroanilin in 100 ml 1 M HCl wird, wenn notwendig, am ersten Praktikumstag hergestellt;
sie ist stabil. Für das Reagenz werden ca. 5 ml dieser Stammlösung mit Wasser auf ca. 30 ml
verdünnt. Dazu werden, kurz bevor die erste Platte zu besprühen ist, ein paar Milliliter einer
NaNO2–Lösung (5 g in 100 ml) gegeben (Entfärbung beim Rühren). Die diazotierte Lösung ist
einige Stunden haltbar.
Teil 3.3. Die Fluoreszenz der DC-Platten oder der Substanzen selber macht gewisse Analyten
unter UV-Licht sichtbar.
Aufgabe:
Auf eine Kieselgel-60-Dünnschichtplatte (5 × 10 cm) werden eine Anthracen- und zwei
Tetralinproben aufgetragen (je 2 µL). Der Abstand der Startflecke voneinander sollte ca. 1 cm
sein. Nachdem die Platte sich in Hexan entwickelt hat, wird sie unter UV-Licht bei 350 nm und
254 nm beobachtet.
Teil 3.4. Die Platte aus Teil 3.3. wird dann in die Jodkammer gestellt.
Teil 4: Halbquantitative DC-Analyse mit
Computerauswertung Am Beispiel von Resorcin wird der Einfluss von der Menge an aufgetragenem Analyt auf den Rf-
Wert und die Größe des Substanzflecks untersucht.
Aufgabe:
Eine Kieselgel-60-Dünnschichtplatte (10 × 10 cm) wird mit einer Startlinie ca. 1,2 cm vom
unteren Rand versehen. Fünf Startpunkte mit ähnlichem Abstand (mindestens 1,5 cm vom
Plattenrand und von einander) werden auf der Linie markiert. Eine Stammlösung von 30 mg
Resorcin in 25 ml Di-iso-propylether wird verdünnt, um eine Eichreihe mit fünf Konzentrationen
herzustellen. (Die Verdünnungsreihe 0,24 bis 2,4 µg/mL dürfte schon vorhanden sein.) Von
diesen Lösungen werden je 2 µl auf die Startpunkte der Dünnschichtplatte aufgetragen. Die Platte
wird mit Di-iso-propylether entwickelt, die Detektion erfolgt wie in Teil 3.2
Ein Bild der DC-Platte wird mittels eines handelsüblichen Scanners aufgenommen und die
Lichtabsorption der fünf Flecke vom Computer ausgemessen. Der genaue Ablauf dieses Schritts
wird sich nach Entwicklungsstadium des Computerprogramms DCSCAN variieren, eine
Vorschrift für die jetzige Version wird ausgegeben.
Literatur: 1. F. Dietz, J. Traud, P. Koppe und C. Rübelt, „Systeme für die Identifizierung von Phenolen
mittels DC“ Chromatographia 9 (1976) S. 380-396
2. E. Hahn-Deinstrop, Dünnschicht-Chromatographie, Wiley-VCH, Weinheim, 1998
3. D. A. Skoog und J. J. Leary, Instrumentelle Analytik, Springer, Berlin, 1996, S. 714-719
Computerauswertung der DC-Platten von Teil 4
Die DC-Platte aus Teil 4 wird in den Computer eingescannt. Der Scanner misst, wie viel rotes, blaues und
grünes Licht an jeder Stelle auf der Oberfläche absorbiert wird, und gibt die Werte an den Computer
weiter.
1. Die DC-Platte wird dazu auf eine Schablone so gelegt, dass die Flecke untereinander (vertikal)
liegen; die Schablone schützt den Scanner vor Chemikalien, dient zur Positionierung der Platte
(so dass immer dieselbe kleine Fläche aufgenommen werden muss) und enthält auch
einen Weißstandard, den der Scanner braucht, um eine Basislinie zu erzeugen.
Unsere Flecke sind gelb, d. h., sie absorbieren bevorzugt blaues Licht; wir können die
Flecke deshalb am besten untersuchen, wenn wir die Absorption des blauen Lichts
bewerten.
2. Der Scanner wird gestartet. Für den Scanner HP Scanjet 2300c wird das Programm
HP Director vom Desktop eingeschaltet. Aufnahme/Scannen vom Menü wählen. Das
Aufwärmen der Lampe dauert etwas. Wenn der Scanner bereit ist, wird eine Vorschau von
sich gemacht. Der erwünschte Bereich wird ausgewählt and Akzeptieren angeklickt.
3. Ein richtiges Bild von der Platte wird eingescannt. Das Bild wird aber als Scannen.jpg
gespeichert. Das Programm zeigt alle gespeicherte Bilder. Markieren Sie das neue und rufen
Sie es mit Doppelklick auf. Mit DATEI, SPEICHERN UNTER speichern sie das
eingescannte Bild in Bitmap-Format (Name.BMP) unter dem Namen eines der Studenten in
der Gruppe: z.B.
SCHMIDT.BMP. Das Bildbearbeitungsprogram darf jetzt geschlossen werden.
4. Öffnen Sie das DC-Bearbeitungsprogramm DCSCAN.exe, in dem sie auf dem Desktop darauf
klicken.
5. Rufen Sie das gespeicherte Bild auf: DATEI, ÖFFNEN, dann auf den Studentennamen
klicken.
6. Das Bild wird mit den Scrollbars so zentriert, dass die gelben Flecke sichtbar sind. Wenn Sie
den Cursor auf das Bild tun und mit der Maustaste klicken, erscheint eine senkrechte Linie.
Stellen Sie sich vor, Sie wollen eine Säule mit zwei solchen Linien bilden, um alle Flecke
einzuschließen: klicken Sie einmal links und einmal rechts der Flecke, um diese Säule zu
bilden. Schauen Sie, dass alle Flecke zwischen den senkrechten Linien liegen.
7. Jetzt wird die Absorption der Flecke automatisch ausgemessen. Angenommen, Sie haben eine
Säule mit einem Fleck darin. Sie sieht wie in Abb. a aus. Der Scanner hat diese Säule in viele
enge Banden geteilt, wie in Abb. b, und die gesamte Absorption in jedem Band gemessen,
wie in Abb. c. (Der Scanner macht natürlich viel mehr Banden, als hier angezeigt, die Peaks
sind dann ziemlich Gaußförmig.) Diese Absorptionen werden in eine Datei gespeichert und als
eine neue Art von Chromatogramm abgebildet, wo die X-Achse Distanz und die Y-Achse
Absorption darstellt. RECHNEN, (auf Blau klicken)
AUSWERTEN
Weil unsere Säule fünf Flecke enthielt, sehen Sie ein Chromatogramm mit fünf Peaks.
Computerauswertung der DC-Platten von Teil 4
8. Mit R-O-KURVE, GLÄTTUNG wird das Rauschen z. T. unterdrückt.
9. Rufen Sie das Protokollfenster auf: DATEI, PROTOKOLL ANZEIGEN.
10. Jetzt werden die Peakhöhen und –flecke ausgemessen. Gehen Sie mit dem Cursor auf die
Basislinie links des ersten Peaks und klicken Sie. Es erscheint eine vertikale, rote Linie.
Tun Sie dasselbe rechts des Peaks. Jetzt sind sowohl eine zweite vertikale Linie als eine
Basislinie für die zu messende Fläche zu sehen.
Die Peakhöhe und die Fläche werden im Protokollfenster („Integration“) gezeigt.
Dieser Vorgang wird für jeden Peak wiederholt. Das Protokollfenster zeigt alle Werte an.
11. Drucken Sie die Ergebnisse aus: DATEI, PROTOKOLL DRUCKEN.
12. Drucken Sie das Chromatogramm aus, mit Rechtsklicken auf das Bild selbst, dann
DRUCKEN.
Auswertung fürs Protokoll:
Die Antworten zu den Fragen, die am Ende stehen (eventuell korrigiert!), sollten mit dem Protokoll
abgegeben werden.
Teil 1: Die Rf-Werte der Flecke werden abgemessen und anhand der Eluotropenreihe diskutiert.
Teil 2:
1. Bestimmen Sie den Rf-Wert jeder Komponente für jeden Trennungsschritt. Die Trennung ist
in diesem Teilversuch nicht wichtig, ignorieren Sie eventuelle Flecke von Verunreinigungen.
2. Vergleichen Sie die Stellung der Laufmittel Di-isopropylether und Dichlormethan in der
eluotropen Reihe. Wie erklären Sie die Rf-Werte Ihrer Phenole mit den beiden Laufmitteln?
3. Identifizieren Sie die Phenole in Ihrer unbekannten Mischung anhand der Rf-Werte, und
begründen Sie die Elutionsreihenfolge auf die unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften
der Phenole. Vgl. den Artikel von F. Dietz et al. (1976). Wenn die von Ihnen abgemessenen
Rf-Werte von denen in der Literatur abweichen, bieten Sie eine Erklärung dafür an.
4. Welche Reaktion läuft hier bei der Detektion ab? Schreiben Sie einige Strukturen.
5. Wie effektiv ist die Trennung, wenn nur Di-iso-propylether oder Dichlormethan als Laufmittel
eindimensional verwendet wird?
6. Skizzieren Sie eine zweidimensionale DC-Trennung der sechs Phenole dieses Versuchs,
wenn zuerst mit Di-iso-propylether, dann mit Dichlormethan entwickelt wird.
7. Wie dürfte man durch HPLC oder Säulenchromatographie bei Einsatz einer Kieselgelsäule
eine brauchbare Trennung dieser Komponenten erzielen?
Teil 3:
Diskutieren Sie die verschiedenen Methoden zur Visualisierung, die Sie benutzt oder beobachtet haben.
Für welche Substanzklassen gelten sie?
Teil 4:
1. Welche absoluten Mengen an Resorcin wurden hier auf die DC-Platte aufgetragen?
2. Wie ändert sich der Rf-Wert mit der aufgetragenen Substanzmenge?
3. Begründen Sie eventuelles Tailing bzw. Fronting der Flecke.
4. Dünnschichtchromatographie wird nicht nur für analytische Zwecke eingesetzt, sondern
auch für präparative Trennung. Beschreiben Sie, wie das geschieht.
5. Ihr Protokoll sollte eine ungefähre Beschreibung der computergesteuerten Auswertung
enthalten.
6. Versuchen Sie, eine einfache Eichfunktion zwischen der aufgetragenen Substanzmenge und
der Fleckengröße (Fläche, Lichtabsorption, usw.) zu erstellen.
7. Berechnen Sie anhand eines Ihrer Chromatogramme die Anzahl von theoretischen Böden
(vgl. Skoog und Leary), den Retentionsfaktor und den Kapazitätsfaktor.
Kontrollfragen Sie haben die Vorlesungen über Chromatographie gehört. Bevor Sie die Versuche dazu unternehmen,
sollten Sie in der Lage sein, folgende Fragen zu beantworten. Jeder Praktikant hat die Antworten
schriftlich vor dem Versuch extra abzugeben.
1. Ist Kieselgel als polar oder unpolar einzustufen? Was bringt diese Eigenschaft, chemisch
betrachtet?
2. Wie heißt die Reihenfolge der Laufmittel nach Elutionskraft? Wie polar ist Wasser im
Vergleich mit den meisten organischen Laufmitteln? Wie macht man Wasser noch polarer?
3. Welche Laufmittel eluieren adsorbierte Analyten weiter auf Kieselgel — polarere
Laufmittel oder weniger polare? Erklären Sie, warum.
4. Wenn Sie mehrere Analyten auf Kieselgel mit einem organischen Laufmittel
trennen, welcher Analyt hat den größten Rf -Wert — die polarste Substanz oder die am
wenigsten polare?
5. Was bedeutet „Umkehrphase“? Beschreiben Sie diese Phasen chemisch und nach ihrer
Polarität.
6. Welche Laufmittel eluieren absorbierte Analyten weiter auf Umkehrphasen — polarere Lösungsmittel
oder weniger polare? Erklären Sie, warum.
7. Wenn Sie mehrere Analyten auf Umkehrphasen mit einem organischen Laufmittel
trennen, welche Substanz hat den größten Rf -Wert — die polarste Substanz oder die am
wenigsten polare?
8. Warum entwickelt man zweidimensional?
Spektrophotometrie
Die Wirkung vom pH-Wert auf das Gleichgewicht von Chromat/Dichromat wird anhand von Spektren im
sichtbaren und UV-Bereich untersucht. Mittels Messungen der Extinktion (Absorbanz) am
Extinktionsmaximum bei verschiedenen Konzentrationen und in Küvetten unterschiedlicher Länge wird
das Lambert-Beersches Gesetz verifiziert.
Stichworte (Kolloq im Voraus): UV- und sichtbares Licht, Nah-UV, Vakuum-UV, usw., Quarz,
optisches Glas, Lichtquellen, Wechselwirkung von Materie mit Licht verschiedener Energien, Lambert-
Beersches Gesetz, Additivität von Extinktionen, isosbestischer Punkt, Gleichgewichtskonstante,
Grenzkonzentration, Aktivität
1 Herstellung der gebrauchten Stammlösungen. Gut geschlossen sind alle drei über zwei bis drei
Wochen stabil. Alle werden mit entgastem VE-Wasser hergestellt (warum?).
1.1 Eine Stammlösung von Cr(VI) (20 mg/L, als Chrom, nicht als Chromat) wird ausgegeben.
1.2 Stammlösung von 0,1-M-NaOH: Titrisol-Ampullen sollten vorhanden sein. Der Inhalt wird auf genau
ein Liter verdünnt und in einer Kunststoffflasche aufbewahrt.
1.3 Stammlösung von 0,1 M Essigsäure: wenn keine Titrisol-Ampullen da sind, wird jeweils ein Liter
Lösung durch Verdünnung von konz. Essigsäure hergestellt.
2 Wirkung vom pH-Wert auf das Chromat/Dichromat-Gleichgewicht
2.1 Es werden elf Messlösungen folgender Zusammensetzung in 50-mL-Messkolben hergestellt. Jeder
Kolben bekommt
15 mL einer Lösung von 20 mg Cr(VI)/L (15-mL-Vollpipette)
und 5 mL 0,1 M NaOH (5 mL Vollpipette oder schneller mit Eppendorf).
Dazu kommen unterschiedliche Volumina von 0,1 M Essigsäure:
0,0; 2,0; 4,0; 5,0; 5,2; 5,3; 5,4; 5,6; 6,0; 8,0; 10 mL
Entgastes VE-Wasser ad 50 mL
2.2 Die UV/VIS-Spektren der elf Messlösungen in 10-mm-Küvetten (Quarz oder optisches Spezialglas
OS) werden nach steigender Konzentration an Essigsäure mit einem registrie-renden Spektrophotometer
(zurzeit Specord 205 von Analytik Jena) im Wellenlängenbereich 330 – 550 nm aufgenommen. Als
Vergleichslösung wird VE-Wasser eingesetzt. Die Spektren werden zuerst extra dann übereinander
(überlappend) registriert. Eine Tabelle mit allen Extinktionswerten wird für Excel gespeichert.
2.3 Die Spektren mit der Essigsäurezugabe 0,0 bzw. 10 mL sollten denen der reinen Chromat- bzw.
Dichromatlösung entsprechen.
3 Wirkung der Konzentration (c) auf die Extinktion
3.1 Es werden zehn Lösungen folgender Zusammensetzung in 50-mL-Messkolben hergestellt:
0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10; 20; 30; 40 mL einer Lösung von 20 mg Cr(VI)/L
Jeder Kolben bekommt 5 mL 0,1 M NaOH und entgastes VE-H2O ad 50 mL.
3.2 Die Extinktion für jede dieser basischen Lösungen wird am Extinktionsmaximum
(vgl. Teil 2.3) dreimal gemessen. Als Vergleichslösung wird entgastes VE-Wasser eingesetzt. Keine
weiteren Spektren werden aufgenommen. Die Messwerte werden in einer Datei gespeichert.
4 Wirkung der Absorptionsstrecke
4.1 Wenn nicht vorhanden wird folgende Lösung hergestellt.
20 mL der Lösung von 20 mg Cr(VI)/L
20 mL 0,1 M NaOH
Entgastes VE-Wasser ad 200 mL
4.2 Die Extinktion dieser Chromatlösung (2 mg Cr(VI)/L) in Glasküvetten von verschiedenen
Schichtlängen wird bei λmax aufgenommen. So viele Küvetten werden genommen, wie wir sie haben,
solange sie derselben Sorte (Quarz, OS, OG) sind. Diese Messwerte werden auch in einer Datei
gespeichert.
5 Auswertung
5.1 Zu jedem Protokoll gehören ein einleitender Theorieteil (für diesen Versuch zwei bis drei Seiten)
sowie eine abschließende Diskussion. Der Theorieteil muss in Ihren eigenen Worten sein, nicht etwas,
das Sie aus dem Internet oder aus Datenbanken kopiert haben. Ihre Quellen dafür sind anzugeben.
5.2 Tragen Sie die in Teilen 3.2 und 4.2 gemessenen Extinktionen gegen die Konzentration sowie gegen
die Schichtdicke auf. Berechnen Sie bei beiden Teilen lineare Regressionen. Bestimmen Sie anhand
beider Datensätze den Extinktionskoeffizienten. Kommentieren Sie bei der abschließenden Diskussion
die Linearität der Messungen bei der Konzentrationsreihe und erklären Sie, ob es hier zu Abweichungen
vom Lambert-Beerschen Gesetz gekommen ist.
5.3 Berechnen Sie die Konzentrationen von Chromat, Dichromat und H+ in allen Lösungen der pH-Reihe
in Teil 2.1. Benutzen Sie Messungen bei zwei Wellenlängen für die Berechnung dieser Konzentrationen.
(Sie kennen die λmax-Werte aus den Spektren der Lösungen von reinem Chromat bzw. Dichromat.
Vergessen Sie nicht dabei die Stöchiometrie des Chromat/Dichromatgleichgewichts.)
5.4 Berechnen Sie im pH-Bereich, wo erhebliche Anteile von Chromat sowie Dichromat vorliegen, die
Gleichgewichtskonstante für Chromat/Dichromat.
5.5 Jetzt unter Berücksichtigung der Aktivität berechnen Sie die Gleichgewichts-konstante wieder. Die
Debye-Hückel-Formeln für Aktivitätskoeffizienten gelten nicht in diesem hohen Konzentrationsbereich,
Sie müssen Aktivitätskoeffizienten für H+, Chromat und Dichromat aus Tabellen nehmen (nehmen Sie an,
fChromat = fDichromat). Vgl. Harris (engl. Version, 1995), S. 188.
5.6 Kommentieren Sie bei der abschließenden Diskussion eventuelle Abweichungen oder Diskrepanzen
in Ihren Ergebnissen. Vergleichen Sie Ihre Werte für λmax sowie für K mit Angaben der Literatur.
5.7 Beobachten Sie isosbestische Punkte bei Ihren Spektren? Was sagen solche Punkte aus? Vergessen
Sie die Stöchiometrie in Ihrem Spezialfall nicht.
6 Bedienung des Specord 205 UV-VIS-Spektrophotometers von Analytik Jena
6.1 Aufnahme der Spektren der Proben der pH-Reihe
6.1.1 Vom Desktop das Programm WinAspect öffnen
6.1.2 Oben im Menü: „Messung“---„Gerätinitialisieren“
Es dauert einen Moment. Die Parameter, die erscheinen, sind die Defaultparameter, nicht die, die man für
den Versuch braucht.
6.1.3 „Messung“---„Parametersatz auswählen“ „pH-Reihe“ wählen
6.1.4 VE-Wasser in OS 1000-Küvetten in beide Kanäle des Spectrophotometers stellen. Die Küvette
hinten wird während aller Messungen dort bleiben. Auf „Referenz“ rechts im Messung-Menü klicken.
Das macht einen Ausgleich der beiden Kanäle. Das Referenzspektrum wird in Echtzeit gezeigt.
6.1.5 Die Messprobe in einer OS 1000-Küvette in den Küvettenhälter vorne ganz rechts einstellen. Die
Beschriftung auf den Küvetten sollte immer auf derselben Seite stehen.
6.1.6 „Messung“---„Start Messung“ Das Spektrum der Messprobe wird aufgenommen und in Echtzeit
gezeigt.
6.1.7 „Datei“---„Speichern als“ Jede Gruppe hat Ordner unter den drei Teilversuchen für sich. Desktop
Arbeitsplatz
Lokaler Datenträger
Instru Daten
Gruppe 1 usw.
pH-Reihe Geben Sie ihrer Probe einen Namen, der sie tatsächlich beschreibt, so wie „0 mL Säure“ oder,
wenn das Spektrum wiederholt werden muss, 0 mL Säure-2
6.1.8 Jetzt müssen Sie alle Spektren dieser Reihe auf einem Bild darstellen, also
„Datei“---„Überlagern“
6.1.9 Unter „Zieldatei“ einen Namen wie „Alle Spektren pH“ eintragen. Dann im selben Fenster
„Hinzufügen“ klicken und die gespeicherten Spektren auswählen. Mehrere können gleichzeitig
ausgewählt werden. „OK“
6.1.10 Jetzt haben Sie ein Fenster mit den überlagernden Spektren. Das Bild kann auf den vollen
Bildschirm expandiert werden, und die einzelnen Spektren können ihre eigene Farbe bekommen.
Drucken Sie jetzt das Bild. „Datei“---„Drucken“ „Querformat“ wählen.
6.1.11 Wählen Sie „Tabelle“. Sie haben eine große Tabelle, eventuell elf Spalten mit 210 Zeilen. Zur
späteren Bearbeitung als Excel-Datei müssen Sie die Daten anders speichern. „Datei“---„Export“---
„ASCII“
Sie brauchen wieder einen Namen, der allerdings derselbe sein darf wie der von den überlagernden
Spektren: wie „Alle Spektren pH“
Der Computer bittet um Eingaben: „Absorption“---„Komma“---„4 Dezimalstellen“
6.1.12 Die Excel-Tabelle wird im selben Ordner sein, wie all Ihre Daten zur pH-Reihe. Alle Dateien
können jetzt auf z.B. einen Speicherstick übertragen werden. Alternativ dürfen Sie sich die Daten als
Email-Attachments schicken.
6.2 Messung der Extinktionen der Proben der Konzentrationsreihe und jener mit unterschiedlichen
Küvettenlängen
6.2.1 Die Prozedur dieser beiden Teilversuche ist gleich; es spielt keine Rolle, welchen Parametersatz sie
aufrufen, „Küvettenlänge“ oder „Konzentrationsreihe“. Jede Messung wird extra in eine Tabelle
aufgenommen, und die Tabelle wird in der Ordner Ihrer Gruppe unter den entsprechenden Teilversuchen
gespeichert.
6.2.2 Alle Proben dieser Reihen sind basisch, also haben Sie nur Chromat vorhanden. Aus der Tabelle mit
den Extinktionswerten für das Spektrum der Lösung mit der Essigsäurezugabe 0,0 mL im Teil 1 wird die
Wellenlänge beim Extinktionsmaximum genommen. Der neue Parametersatz sollte diese Wellenlänge
schon gespeichert haben.
6.2.3 Vom Desktop das Programm WinAspect öffnen
6.2.4 Oben im Menü: „Messung“---„Gerätinitialisieren“
6.2.5 „Messung“---„Parametersatz auswählen“ „Küvettenlänge“ wählen
6.2.6 „Messung“---„Parametersatz Einstellen“
„Allgemein“ Zyklus: kein
Anzeige: Absorption
Korrektur: Referenz
„Modus“ Messmodus: Wellenlängen: 372 nm steht da; falls das nicht
richtig ist, dann die richtige Wellenlänge eingeben („Ändern“)
Integrationszeit: 1,0 Sekunde
OK
6.2.7 VE-Wasser in OS 1000-Küvetten in beide Kanäle des Spectrophotometers stellen. Die Küvette
hinten wird während aller Messungen dort bleiben.
6.2.8 „Messung“---„Referenz“
6.2.9 „Messung“---„Serienmessung“
6.2.10 „Bearbeiten“---„Einstellungen“---„Proben“
Probenzahl auf 50 ändern
„Probentabelle“ wählen
6.2.11 „Start“ Die Messproben werden nacheinander eingesetzt. Jedes Mal auf OK klicken. Es dauert
jedes Mal ein paar Sekunden. Die Absorptionen werden in einer Tabelle gespeichert, die hinter dem
„Nächste Probe-Fenster“ steht.
6.2.12 Wenn alle Proben der Reihe, „Küvettenlänge“ oder „Konzentrationsreihe“ aufgenommen wurden,
wird die Tabelle gespeichert.
6.2.13 Die Tabelle wird dann in Dokumentform umgewandelt und als ASCII-Datei gespeichert: „In
Dokument“. Wie in Teilen 6.1.11 -6.1.12 oben.
6.2.14 „Beenden“
Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC)
Aufgaben: Das Retentionsverhalten verschiedener polycyclischer aromatischer Kohlen-wasserstoffe soll
mittels HPLC ermittelt und anschließend quantifiziert werden.
Stichworte: Aufbau einer HPLC-Anlage; Entgasen von Eluenten; Detektoren; NP-, RP-
Chromatographie; Säulenmaterialien; fast-, micro-bore, narrow-bore HPLC;
Bodenhöhe, -zahl; Peakbreite
Säule: Merck ODS Länge 250 × ID 4 mm, 5 µ
- Eluent: Methanol 100 %
- Eluentenfluss: 1 ml/min
- Detektor: UV, bei 254 nm; Thioharnstoff 240 nm
- Integrator Attenuation 5
- Chart Speed 5 mm/min, Ausnahme Aromatenmischung !
Im ersten Teil des Versuches soll eine Mischung der Verbindungen Pyren, 1-Methylnaphthalin, Fluoranthen,
Toluol und Phenanthren dreimal injiziert werden. Weichen die ermittelten Retentionszeiten bei der
Dreifachinjektion zu stark voneinander ab, ist eine weitere Injektion erforderlich! Das Chromatogramm kann bei
einem Chart-Speed von 10,0 erneut ausgedruckt werden, falls die einzelnen Peakzeiten nicht genau gelesen werden
können.
Zur Bestimmung der Totzeit wird Thioharnstoff dreimal injiziert. (λ=240 nm).
Die Totzeit wird auch über die Injektion von homologen aromatischen Kohlenwasserstoffen bestimmt. Dazu wird
die Lösung, welche Ethylbenzol, Butylbenzol und Hexylbenzol enthält, dreimal injiziert. Nach jeder Injektion der
Aromatenmischung wird folgender Schritt durchgeführt:
Wurde das Chromatogramm fehlerfrei aufgenommen, wird der Chartspeed auf 60 mm/min gestellt
(Chartspeed-Wert-Enter), die Plotattenuation so gewählt, dass die Peaks nicht anschlagen (Plottatt-Wert-Enter)
und durch Drücken von Recalc ein neuer Chromatogrammausdruck erstellt.
Im zweiten Teil des Versuches soll die Konzentration der Mischung aus dem ersten Teil quantifiziert werden.
Hierzu muss eine Eichgerade von derselben Mischung mit bekannter Konzentration erstellt werden. Jede der
Mischungen wird hierzu ebenfalls dreimal vermessen. Das Chromatogramm kann bei einem Chart-Speed von 10,0
erneut ausgedruckt werden, falls die einzelnen Peakzeiten nicht genau gelesen werden können.
Auswertung:
a) Ordnen Sie jeder der 6 Verbindungen des ersten Versuchsteils die entsprechende
Retentionszeit aufgrund ihrer Struktur zu.
b) Bestimmen Sie die Standardabweichungen der gemessenen Zeiten für jede Substanz.
c) Ermitteln Sie die Totzeit der beiden Säulen nach folgenden drei Methoden:
Begründen Sie die Unterschiede der nach den verschiedenen Verfahren bestimmten
Totzeiten. Wie würden sich die Retentionszeiten ändern, wenn Sie eine Säule der
Dimensionen 250 x 2 mm ID, 5µ verwenden würden?
- Berechnung der Totzeit aus der equidistantiellen Reihe erfolgt über:
tt t t
t t td =⋅ −
+ −1 3 2
2
1 3 22
- Bestimmung über Thioharnstoff
- Berechnung aus Säulenabmessungen und Flüssen
d) Berechnen Sie die Packungsdichte der Säule
e) Berechnen Sie die Zahl und Höhe der theoretischen Böden der drei Aromaten für die
Säule. Diskutieren Sie die unterschiedlichen Bodenhöhen in Abhängigkeit von der
Substanz.
f) Berechnen Sie Stoffkonzentration der Mischung für jede Substanz mittels einer
Eichgeraden.
High Performance Ionenchromatographie (HPIC)
Aufgaben: Mit Hilfe der Ionenaustauschchromatographie sollen verschiedene Anionen in Wasserproben
untersucht werden
Stichworte: Aufbau einer HPIC-Anlage, Ionenaustausch-, Ionenausschluss- und Ionenpaar-
Chromatographie, Eluenten für Anionen- und Kationen-Chromatographie,
Leitfähigkeitsdetektion, weitere Detektionsarten in der IC, Suppressor-Technik, Reaktionen,
Bodenhöhe, -zahl; Peakbreite
Säule: Dionex AG4A, AS4A, AMMS-1
Einstellungen - Eluent: Natriumcarbonat/-hydrogencarbonat 1.8/1.7 mM (aus der Stammlösung (180/170
mM) 20ml auf 2000ml mit Reinstwasser verdünnen)
- Eluentenfluss: 1 ml/min
- Suppressorlösung: 0,0125 M Schwefelsäure (aus der Stammlösung 25ml auf 2000ml mit Reinstwasser
verdünnen)
- Fluss über Vordruck, etwa 0.2 bar
- Detektor: Leitfähigkeitdetektor 300 µS
- Integrator Leitfähigkeit HP 3390 A:
Attenuation 6; Chart Speed 0.5 mm/min, PKWD 0.04, ARREJ 1000, ZERO 5
1) Zur Erstellung der Eichfunktion werden von den ausstehenden Stammlösungen folgende
Verdünnungen mit Tridest hergestellt.
Stammlösung I enthält: F- 192 mg/l
Cl- 599 mg/l
NO3- 1009 mg/l
SO42- 2001 mg/l
Lösung Ia: Stammlösung I wird 1:40 mit Tridest verdünnt
Lösung Ib: Lösung Ia wird 1:2 mit Tridest verdünnt
Lösung Ic: Lösung Ia wird 1:4 mit Tridest verdünnt
Stammlösung II enthält: NO2- 404 mg/l
Lösung IIa: Stammlösung II wird 1:20 mit Tridest verdünnt
Lösung IIb: Lösung IIa wird 1:2 mit Tridest verdünnt
Lösung IIc: Lösung IIa wird 1:4 mit Tridest verdünnt
Stammlösung III enthält: Br- 413 mg/l
PO43- 525 mg/l
Lösung IIIa: Stammlösung III wird 1:20 mit Tridest verdünnt
Lösung IIIb: Lösung IIIa wird 1:2 mit Tridest verdünnt
Lösung IIIc: Lösung IIIa wird 1:4 mit Tridest verdünnt
Berechnen Sie die Konzentration der Anionen in den Verdünnungen !!
Injizieren Sie jede Lösung zweimal (stimmen Fläche und Zeit gut überein, ansonsten weitere Injektion !!).
Mit der bereitgestellten HPLC-Spritze wird in Stellung Load die Probeschleife gespült (keine Luftblasen
!!) und bei steckender Spritze schnell auf Injekt gedreht. Gleichzeitig der Detektor zu starten.
Verfahren Sie ebenso mit der bereitgestellten Probe, vergessen Sie nicht diese soweit zu verdünnen, dass
sie in die Kalibriergeraden passt.
Notieren Sie den Wert der Grundleitfähigkeit !!
2) Lassen Sie sich vom Assistenten den Suppressor ausbauen. Injizieren Sie die Lösung Ia und I b einmal
bei ausgestellter Untergrundkompensation und einmal bei eingestellter Untergrundkompensation.
Notieren Sie die Werte der Grundleitfähigkeit !!
Versuchsauswertung:
- Erstellen Sie Kalibriergeraden für alle gemessenen Komponenten
- Identifizieren und Quantifizieren Sie die Komponenten der Wasserprobe; zeichnen Sie die Messwerte
unter Berücksichtigung der Verdünnung in die Kalibriergeraden ein. Berücksichtigen Sie zur
Quantifizierung nur die Werte, die in der Kalibrierung liegen !
- Wie kommt es zur Ausbildung des Systempeaks ?
- Erklären Sie die Unterschiede, die bei Messung mit und ohne Suppressor auftreten.
- Wie lässt sich die Elution in der Ionenchromatographie beeinflussen?
CZE/MEKC
CZE
Allgemeines:
Die verschiedenen Spielarten der Kapillarelektrophorese erlauben die Analyse unterschiedlichster
Substanzen. Dabei muss lediglich der Elektrolyt und gegebenenfalls die Kapillare gewechselt werden.
Das Basisgerät ist identisch.
Stichworte:
Kapillarelektrophorese, CZE
Durchführung:
a) Herstellung des Elektrolyten
b) Versuch
Eine Mischung aus p-Methoxyphenylessigsäure, p-Hydroxybenzoesäure,
p-Hydroxyphenylessigsäuremethylester, p-Hydroxybenzoesäuremethylester und 4-Hydroxy-
benzoesäureethylester wird dreimal injiziert. Als interner Standard wird p-
Hydroxyphenylessigsäure der Mischung beigefügt.
Temperatur: 20 °C; Spannung: 25 kV; Detektor: DAD; Injektion: 2.5 psi x s
c) Auswertung
Anhand der Ladungsdichten sollen die analysierten Verbindungen den entsprechenden Signalen
zugeordnet werden. Mit dem internen Standard sollen die Migrationszeiten normiert und der
Mittelwert + Standardabweichung für jeden Analyten bestimmt werden. Die Fläche des internen
Standards wird zur Flächennormierung der zeitnormierten Peakflächen verwendet (ebenfalls
Mittelwert + Standardabweichung).
Darüber sollten Sie sich auch Gedanken machen:
Wie sehen die Strukturen der zu analysierenden Substanzen aus?
Was versteht man unter dem Elektroosmotischen Fluss?
Erklären Sie das Prinzip der kapillarelektrophoretischen Trennung.
Warum werden in der CE die Flächen über der Migrationszeit normiert?
Warum normiert man diese Flächen dann nochmals mit der zeitnormierten Peakfläche des internen
Standards?
Warum normiert man in der CE häufig die Migrationszeiten der Analyten mit der Migrationszeit eines
internen Standards?
MEKC
Stichworte:
Kapillarelektrophorese, MEKC
Allgemeines:
In diesem Versuch sollen die bei der CZE untersuchten Komponenten mittels MEKC voneinander
getrennt werden.
Durchführung:
d) Probenvorbereitung
Es werden Elektrolytmischungen hergestellt.
e) Versuch
Die Elektrolytzusammensetzung wird solange variiert bis eine vollständige Trennung der
Analyten erzielt wurde.
f) Auswertung
Diskutieren Sie die beobachteten Änderungen aufgrund der unterschiedlichen
Elektrolytzusammensetzung.
Darüber sollten Sie sich auch Gedanken machen:
Prinzip der MEKC?
Welchen Einfluss hat die Elektrolytzusammensetzung?
Demonstrationsversuch (LC-MS)
Unter dem Begriff LC-MS versteht man die Kopplung einer HPLC-Anlage mit einem
Massenspektrometer. Diese Kopplungstechnik ergänzt die GC-MS, da hier die Trennung und
massenspektroskopische Bestimmung schwer flüchtiger Substanzen möglich ist.
Für die Kopplung der HPLC mit dem Massenspektrometer wird ein Interface eingesetzt. Das Interface
hat die Aufgabe den Eluentenstrom der HPLC in die Gasphase zu überführen und wenn möglich, die
Probe zu ionisieren. Bei der LC-MS ist dies nicht so leicht zu erreichen wie bei der GC-MS, da ein
wesentlich größeres Volumen an Gas gebildet bzw. abgeführt werden muss. Problematisch ist zudem,
dass man ausgehend vom Atmosphärendruck in der Ionenquelle ein Hochvakuum im Massen-
spektrometer (~10-7mbar) aufrechterhalten muss.
Es gibt verschiedene Techniken zur Ionisierung. Am weitesten verbreitet ist derzeit ESI (electrospray-
ionisation) und APCI (atmospheric-pressure-chemical-ionisation). Beides sind weiche Ionisations-
techniken, bei der in den Massenspektren vorwiegend nicht fragmentierte Molekülpeaks beobachtet
werden ([M+H]+ bei ESI+ und APCI+, [M-H]- bei ESI- und APCI-). Bei der neuerdings in Kombination
mit ESI- bzw. APCI-Quellen erhältlichen APPI-Ionisation (atmospheric-pressure-photo-ionisation),
findet man als Molekülpeak auch Radikalkationen.
Der Aufbau des Electrospray-Interfaces der Firma Micromass (Z-Spray) ist schematisch in Abbildung 1
dargestellt. Das flüssige Eluat wird über eine Edelstahlkapillare, an der eine Spannung von bis zu 3,5 kV
anliegt, in die Gasphase versprüht. Gleichzeitig wird bei der Verdampfung die Probe ionisiert. Es bilden
sich zuerst kleine geladene Tröpfchen, die durch den Verdampfungsprozess zunehmend kleiner werden,
wobei die Oberflächenspannung der Tröpfchen durch die zusätzliche Ladung schließlich so groß wird,
dass es zu einer sogenannten Coulumb-Explosion kommt. Unterstützt wird dieser Prozess durch ein
Nebulizer-Gas, das ein besseres Spray erzeugt, sowie durch ein heißes Desolvation-Gas, das die
Überführung des Eluats in die Gasphase erleichtert. Das Eluat wird so vollständig in die Gasphase
überführt.
Für eine effizientere Ionisierung werden dem Eluenten zusätzlich flüchtige Ionisierungsreagenzien
hinzugegeben (z.B. Ameisensäure, Ammoniumacetat oder Trifluoressigsäure).
Es können verschiedene Massenspektrometer mit der HPLC gekoppelt werden. Am weitesten verbreitet
sind Quadrupolgeräte (Q), die verhältnismäßig günstig sind und für die meisten Anwendungen
ausreichen. Nachteilig sind der eingeschränkte messbare Massenbereich und die geringe Auflösung.
Die Flugzeitmassenspektrometer (kurz TOF, time of flight) erfreuen sich immer noch wachsender
Beliebtheit. Erst seit Anfang der 90’er Jahre wurde diese Technik von den Herstellern weiterentwickelt,
da nur mit Hilfe von leistungsstarken Computern die sehr großen Datenmengen, die in kurzer Zeit
anfallen, verarbeitet werden können. Die Vorteile gegenüber anderen Massenspektrometern liegen in der
sehr hohen Massengenauigkeit (Abweichung unter 5 ppm), der verhältnismäßig großen Auflösung (bis
zu 25.000; vgl. Quadrupolgeräte: ca. 3.000), der hohen Scangeschwindigkeiten und des theoretisch
unbegrenzten messbaren Massenbereiches.
Eine weitere Kopplungsvariante besteht in der Verbindung der LC mit „Ion-trap“-Massenspektrometern.
Mit diesem Gerätetyp können bestimmte Ionen über einen längeren Zeitraum gespeichert werden, so dass
MSn-Spektren aufgenommen werden können. Bei der Aufnahme von MSn-Spektren wird ein
ausgesuchtes Ion (Mutter-Ion) durch stoßinduzierte Kollision fragmentiert und ein daraus entstandenes
Fragment-Ion (Tochter-Ion) kann nochmals selektiert und fragmentiert werden. Praktischerweise kann
dies 3 bis 4 mal erfolgen. Besonders bei der Aufklärung von Peptiden werden diese Geräte eingesetzt. Die
Auflösung und Massengenauigkeit sind jedoch mäßig.
Auch die Kopplung mit Sektorfeldgeräten wird routinemäßig betrieben. Interessant ist hierbei die sehr
hohe Auflösung von bis zu 100.000.
Die Kombination verschiedener Massenanalysatoren ist inzwischen in vielen Anordnungen realisiert. Bei
den Tripelpolgeräten werden beispielsweise drei Quadrupole (Q) hintereinander geschaltet, wobei der
mittlere Quadrupol als Stoßzelle dient (d. h. hier können durch MS/MS-Experimente gezielt Mutter-
Ionen fragmentiert werden, so dass man aus den entstehenden Tochter-Ionen weitere Struktur-
Informationen gewinnen kann). Anwendung finden diese Instrumente häufig in der quantitativen
Bestimmung von nicht flüchtigen Substanzen, da sehr selektiv und empfindlich gemessen werden kann
(z.B. bestimmte Arzneimittel, Herbizide). Nachteilig sind jedoch die sehr hohen Anschaffungskosten.
Bei den sogenannten Hybridgeräten werden unterschiedliche Massenanalysatoren miteinander
verbunden. In dem Demoversuch wird ein QTOF vorgestellt. Die wesentlichen Elemente dieses Gerätes
sind die Ionisationsquelle, ein Quadrupol, eine Stoßzelle (bestehend aus einem Hexapol gefüllt mit ca.
1 mbar Ar-Gas), eine Flugröhre (mit zwei Reflektrons und zwei Detektoren) sowie eine sehr schnelle
Elektronik bzw. Datenverarbeitung (siehe Abbildung 2). Auf die Funktionsweise der einzelnen Bausteine
wird während des Versuches näher eingegangen.
Darüber sollten Sie informiert sein: Auflösung, Massengenauigkeit, Mutter-/Tochterion
Darüber sollten Sie nachgedacht haben: Scangeschwindigkeit (speziell bei TOF- und Q-Massen-
analysatoren), messbarer Massenbereich
Abbildung 1: Z-Spray-Ionenquelle der Firma Micromass
Abbildung 2: schematischer Aufbau eines QTOF-Massenspektrometers
