Protein-Interaktionsanalysen mittels

Yeast-Two-Hybrid Assay

Grundpraktikum Genetik

Analyse von Protein-Protein Interaktionen

• In vitro Methoden:– (Co-)Immunpräzipitation (zwei interagierenden Proteinen im Lysat)– Affinitätschromatographie (potentieller Interaktionspartner ist

immobilisiert)– Cross-linking (chemische Verknüpfung von Partnern)– Protein-probing (markiertes Protein beweist eine Bindung)– Phage-display (Suche nach Partner in einer Bibliothek)– Protein-Chip

• In vivo Methoden:– Fluorescence energy transfer (FRET)– Hefe-Zwei-Hybrid– Hefe-Tribrid-System– Split-YFP

Saccharomyces cerevisiae

• 1996 Genomsequenz – 1. sequenzierter eukaryotischer Organismus~ 12 Mb, 16 Chromosomen~ 6000 Gene

• biotechnologische Nutzung

• Modellorganismus- Genetik, Biochemie, Molekularbiologie

Zellbiologie- schnelles Wachstum, leicht zu

kultivieren- leichte Isolierbarkeit, Charakterisierung

von Mutanten- nicht pathogen- stabiler haploider Zyklus- transformierbar

Yeast-Two-Hybrid: GAL4 Transkriptionsfaktor

keine Galaktose im Medium: Galaktose im Medium:

GAL80 bindet an AD von GAL4

GAL80/GAL4 Komplex bindet an UAS bindet an den Promtor

Transkription der GAL-Geneunterdrückt

GAL4 bindet an Promotor

Transkription der GAL-Gene aktiviert

Yeast-Two-Hybrid: Prinzip

X = Bait =Protein für Identifikation von Bindungs-partner

X = Prey =Target für Baitz.b. Bibliothek

!!!! Verwendete Hefe-Stämme haben ein mutiertes (defektes) Gal4 !!!!

Yeast-Two-Hybrid: Prinzip

β-Galactosidase

• ins Hefe-Genom integriert

Auxotrophie und Prototrophie

• auxotroph: bezeichnet Organismen, die bestimmte essentielle Substanzen nicht selbstständig synthetisieren können

• prototroph: bezeichnet Organismen, die alle benötigten organischen Wachstumsfaktoren (Aminosäuren, Nukleotide,…) selbst synthetisieren können

Yeast-Two-Hybrid: Hefestämme

a-Zelle → a-factor, α-Rezeptor

α-Zelle → α-factor, a-Rezeptor

Klassische(genetische) Nomenklatur:

ARG 2 Wildtyp Gen arg2 Mutiertes Genarg2-9 Spezifische Mutation in Genarg2-Δ DeletionsmutanteARG2::LEU2 DisruptionsmutanteArg2p ProteinArg+ Arg prototrophArg- Arg auxotroph

Yeast-Two-Hybrid: Plasmide

Yeast-Two-Hybrid: Transformation

• Transformation: Hitzeschock bei 42°C

• LiAC: erhöht Permeabilität und DNA-Bindekapazität der Zellwand

• carrier DNA: bindet an die Zellwand (einzelsträngige DNA bindet effektiver als doppelsträngige DNA)

• PEG: vermittelt Anlagerung des Plasmids und der carrier-DNA an Hefezellen

Yeast-Two-Hybrid: Transformation

Wichtig: Unter der Cleanbench arbeiten Alle Lösungen und Platten nur unter der Bench öffnen

Berechnung der Plasmidmenge (1 µg für Trafo)

Bsp.: 129 ng/µl = Miniprep

1000 ng129 ng/µl

!! SD-Trp für Stamm AH109 und pGBKT7-constructs !! SD-Leu für Stamm Y187 und GADT7-constructs

= 7,75 µl

Mating und Selecting

1 2 3 45 6 7 89 10 11 1213 14 15 16

Testen auf Protein-Protein Interaktion

Testen auf Protein-Protein Interaktion• Mangelmedium

– SD-Leu-Trp-His: low stringency medium

• Galaktosidase-Assay– α-Galaktosidase (MEL1): wird ins Medium sekretiert

MEL1 UAS schwacher Promotor

– β-Galaktosidase (lacZ): wird nicht sekretiert GAL1 UAS starker Promotor

Testen auf Protein-Protein Interaktion• HIS3 Gen wurde in AH109 und Y187 durch eine spezifische Mutation

ausgeschaltet

• aber: schwache Hintergrundexpression von HIS3 → falsch Positive

• 3AT: 3 Amino-1,2,4 triazol kompetiver Inhibitor des HIS3 Genproduktes

(Imidazolglycerol-Phosphat Dehydratase)

!!! Selektives Medium ohne Histidin nötig !!!

Analyse von Protein-Protein Interaktionen

Yeast-Two-Hybrid Analyse in S. cerevisiae

Anwendungen:

• Interaktion zwischen Protein 1 und Protein 2 • Interaktion zwischen Proteindomänen• Rolle einzelner Aminosäurereste für Interaktion• Identifizierung von neuen Interaktionspartnern

Vorteile/Nachteile des Yeast-Two-HybridVorteile• hoch sensitiv • in vivo (keine biochemische Reinigung der Proteine nötig, postranslationale Modifizierungen)• billig, robust• Screening

Nachteile• Interaktionsstelle durch AD/BD Domäne verdeckt• kann nur im Zellkern der Hefe stattfinden• richtige Faltung, Stabilität der Proteine in der Hefezelle• abweichende posttranslationale Modifizierungen in Hefe• Protein ist toxisch für Hefe• BD-Fusionprotein zeigen Interaktion (falsch Positive)• zeitliche und räumliche Expression der Proteine

MADS-BOX Domain Proteine

MADS I K C

DNA-binding

Protein-protein interaction Transcriptional activation

ABC Modell – Arabidopsis thaliana

A

ABCDE Modell – Arabidopsis thaliana

Liriodendron tulipifera (tulip tree)

• Family: Magnoliaceae

• Flower: – Monoecious– 9 tepals

• small genom size (784 Mbp)

• Habitat: Eastern North America

Amborella trichopoda• most basal angiosperm

• Family: Amborellaceae

• small, evergreen

• unisexual flower :– tiny, typically about 4-8 mm– 5 – 8 tepals– wind and insect pollination

• Habitat: New Caledonia

A B

A: female flowerB: male flower

zu untersuchende Proteine

Amborella trichopoda(AMTR)

AMTR-AGL2AMTR-PIAMTR-AG

E functionB function (GLO)C function

Liriodendron tulipifera(LITU)

LITU-DEF1LITU-AGL2LITU-PI

B functionE functionB function (GLO)

Evolution des ABC-Models in Abhängigkeit von der Speziation der Blütenpflanzen.

se-Sepalen, pe-Petalen, st-Stamina, ca-Carpell

Protein-Interaktionsanalysen mittels

Yeast-Two-Hybrid Assay

2. Tag

2. Tag

• Auswertung 1. Tag• ß-Galactosidase Assay• Kolonie-PCR

Auswertung 1. Tag

Kolonien zählen

Wachstum?

Wachstum?

Wachstum?

Was ist auffällig, anders als die Erwartung?

Kolonie-PCR

Primer fwd

Primer rv PCR

PCR-Produkt

Gel

Zellaufschluss mit NaOH

Mastermix

1 x 5,5 x (oder 6 x)

Puffer 10 x 5 µl 27,5 µl

dNTPs 2mM 5 µl 27,5 µl

ddH2O 34 µl 187 µl

Taq 1 µl 5,5 µl

45 µl (final 50 µl)

Mischung enthält alle Komponenten um mehrere Reaktionen anzusetzen. Reduktion der Pipettierarbeit und des Fehlers!Bsp: 5 Reaktionen

ß-Galactosidase Assay

Indigo Farbstoff

• wird nicht sekretiert• Zellaufschluss mit Chloroform!!

ß-Galactosidase Assay

Agarplatte

Alufolie

Chloroform

Chloroform Abdampfen lassen !!!

+ Agar mit X-Gal3h – 24 h

Organisatorische Infos

!!!!! Arbeiten mit Chloroform und EtBr !!!!!• 3 Freiwillige zum Gele gießen• Mittagspause nach dem X-Gal Test• Praktikum Do und Fr

• Start pünktlich 8 Uhr• Bitte das Skript runterladen und

LESEN!! Fragen beantworten!!!• Klausur am Freitag 15 Uhr – 16 Uhr