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Priv.-Doz. Dr. H. Berlet Pathologischcs Institut der Universit~t D-6900 Heidelberg 1, Berliner Strafle 5

4. Elektrophoretische Methoden

Z. Anal. Chem. 252, 165--169 (1970) �9 by Springer-Verlag 1970

Protein-Mapping, Schnell-Dialyse und Molekulargewichtsbestimmung im Mikrogramm-Bereich

IL ST~aEMA~N

Institut fiir Biochemie, Biologisehe Bundesanstalt, Braunschweig

Eingegangen am 19. ~ai 1970

Protein Mapping, Rapid Dialysis and Determination of Molecular Weights in the ~g-Range. For the characteriza- t ion of protein mlutures and isolation of proteins, first electrofocusing in Ampholines is performed in a rectan- gular rod followed by electrophoresis into a slab of 16 m m thickness. I n bo th cases, polyacrylamide is used as carrier. For the identification of the spots, a sheet 2 m m thick is sliced f rom the slab, stained for proteins or enzymes and layered on top of the remaining geI. The spots under investigation are cut out, extracted and dialyzed in a specially designed micro appara tus against buffer containing sodium dodecyl-sulphate for mole- cular weight determinat ion and further characterization.

Zusammen/assung. Zur Charakterisierung und Isolierung yon Prote inen wird eine Elektrofokussierung in Ampholine in einem reehteckigen Gelstab und anschlie~end eine Elektrophoresc in einem 16 m m dicken Gel- block durehgefiihrt. I n beiden F/~llen dient Polyacry lamid als Tr/~ger. Zur Identifizierung der erhaltenen Proteinfleeke wird yon dem Block eine 2 mm-Seheibe abgeschnitten, auf Proteine oder Enzyme angef/~rbt und auf den noch ungef/~rbten Restblock aufgelegt. Die markier ten Flecke werden ausgeschnitten, extrahier t und fiir die Molekulargewiehtsbest immung nnd weitere Charakterisierung in einer besonderen Mikroapparatur gegen dodecylsulfathaltige Puffer dialysiert.

166 H. Stegemann:

Trennverfahren, die zwei physikalische Parameter nacheinander in jeweils einer Dimension einer Tr~ger- fls benutzen, sind besonders aufsehlu~reich bei der Charakterisierung eines Gemisehes. So benutzt man bei der Analyse yon Peptiden die LSsliehkeitseigen- sehaft neben der elektrischen Ladung (,,Fingerprint- Methode" [6]). Bei der ,,Mapping-Teehnik" fiir die Analyse eines Proteingemisches zieht man die Ladung und die Molekiilgr5~e heran, indem man in einer Dimension elektrofokussiert und in der zweiten Dimension eine Elektrophorese durch ein Gelmedium durchfiihrt. In beiden Dimensionen dient Polyaeryl- amid als Tr~ger. Die isoelektrischen Proteine wandern an gleieher Stelle in das Elektrophorese-Gel ein, ihre Wanderungsgeschwindigkeiten sind durch die ver- schiedenen MolekiilgrSl~en bedingt [1,11].

8

6

4~

.2

h B C Abb. 1. Seitenansicht der Apparatur fiir Elektrophorese in Gelplatten yon 1--16ram Dicke. Oben: Schnitt durch Elektrodentr~ger mit Gegenhaken und Kiihlplatte (a), sowie unteren Kasten mit verstellbarem VerschluI~ und Kiihl- platte (b). Darunter: A Pri~paration yon 1 und 2 mm starken Gelen mit Teflon-Trogformen (die an den Kfihlplatten an- liegen) zum Einbringen der ProbelSsungen bzw. fiir 3 bis 6mm-Sehichten mit Kamm nach Raymond[4]. Gel- bereitung ffir alle Sehiehtdicken, besonders jedoch fib- 5 bis 16 ram (oder mehr). B GieBen eines Gelsoekels aus Poly- aerylamid zwecks Bildung einer Kammer. C Ffillen der Kammer mit Laufgel, ggfs. einem zus~tzlichem Sammelgel. ttier wird die Probe auf ganzer Fl~iehe aufgebracht oder die Polyacrylamid-Siiulchen nach Fokussierung eingelegt und einpotymerisiert. Die Elektrophorese erfolgt stets in Position C. Als unteres Elektrodengef~I3 dient ein handelsiiblicher Plastikbeh~lter 20 • 20 • 9 em

Dureh dieses Verfahren ist es mSglieh, Proteine sehr rein zu erhalten. Fiir grSBere Ausgangsmengen (ca. 20 mg; 1 g vgl. unten) fiihren wit die Elektro- fokussierung in Polyacrylamid in einer Plexiglasform unter den Bedingungen nach [11] aus. Die in diesem Gelstab elektrofokussierten Proteine werden ffir die anschlieSende Elektrophorese auf einen 16ram dieken Gelbloek gelegt und einpolymerisiert. Die Elektro- phorese erfolgt in einer einfachen Apparatur , die gleiehermaSen fiir Gelplatten zwisehen 1 und 16 mm gebraueht werden kann, und aus den Apparaturen yon Raymond [14] und Wi t tmann [7] und naeh eigenen Erfahrungen mit Plattengelelektrophore- sen [16] weiterentwiekelt wurdeL Unsere Apparatur (Abb. 1) hat solegekiihlte Plat ten zur Begrenzung des Gels, an den Schmalseiten durehgehende und wahl- weise einlegbare Abstandshalter, wobei der eine Apparateteil als oftener Kasten ausgebfldet ist, um nahezu beliebige Schiehtdieken fiir das Gel zu er- mSgliehen. Ftir 16 m m dieke Gele wird zun~chst naeh Abb. 1 B, sodann naeh Abb. 1 C verfahren.

Zur Identifizierung der nach diesem ,,Mapping" erhaltenen Proteinflecke schneider man yon dem 16 mm-Gel eine 2 mm-Seheibe mit der Vorriehtung nach Abb.2 ab 1, legt die 2 h gef~rbte und dreimal 30 min entf~rbte Referenzplatte auf den noeh un- gef~rbten, unfixierten, kalten (2~ Restblock yon 1 4 m m auf und markiert die zu extrahierenden Fleeken dureh Umsteehen des Bezirkes mit einem feinen scharfen Spatel oder einem Nagel. Die Ex- t rakt ion der ausgesehnittenen Fleeken gibt, je naeh Proteintyp, Ausbeuten zwisehen 10 und 90~ . Sie kann elektrophoretisch in ein inertes Medium er- folgen. Zuweilen verziehtet man auf die Extraktion, well Enzyme aueh in der Gelmatrix reagieren. Dazu preBt man das zu untersuchende Gelstiick dureh ein - - in einer Polys befindliches - - feines Fflterseheibehen (z. B. aus Rhovylpapier) und homogenisiert so verlustlos. Wiederholte Beob- aehtung zeigte [19], da~ die ausgezeichnete Trennung nat iver Proteine in Polyaerylamid oder anderen Tr~gers~ulen durch kontinuierliche elektrophore- tische Extrakt ion z. T. wieder verlorengeht und die Ausbeuten manehmal zu wiinsehen iibriglassen. Ein Sehneiden des Gelbloeks mit ansehlieBender Extrak- tion ist meist vorzuziehen. Die Ausbeute ist dabei nicht unbedingt besser, aber das Produkt reiner, besonders bei mi~l~ig bzw. langsam wandernden Proteinen. Das Zusatzteil zu unserer Apparatur fiir die kontinuierliehe Elution wird in Kiirze be- sehrieben.

1 Die Aploaratur ist in Kiirze im Handel erh~ltlieh.

Protein-Mapping, Schnell-Dialyse und Molekulargewiehtsbestimmung im Mikrogramm-Bereieh 167

Abb. 2. Sehneidevorrichtung fiir Polyacrylamid-Gele zur Herstellung yon 2ram starkenPlatten von st~rkeren B15eken. Naeh jedem Schnit~ ist ein weiterer Plexigias. boden yon 2 mm Stiirke einzulegen. Aufsicht und Schnitt

i•_Feiner Orabt ca.O,25mm

I

ZumEinengen des Extraktes (ira Dialysierschlauch) hat sich trockenes Carbowax 20000 bew/~hrt. Zur Molekulargewichtsbestimmung der im Retentat vor- handenen Proteine muB man die Makromolekfilc mi~ Dodecylsulfat beladen, wodurch sic ihrc individuelle Ladung verliercn und nut noch entsprechend tier MolekiilgrSBe w/~hrend einer Gelelektrophorese wan- dern [15]. Die Beladung oder ein Umpuffern sehr kleiner Mengen geschieht zweckm/~$ig und schnell in einer Mikrodialyseapparatur nach Abb.3, die aus Plexiglas verfertigt sein kann 2.

Abschlie$cnd werden die so pr/~parierten indivi- duellen Proteine in einer Plattengelapparatur (z.B. E.-C. App. Comp., Philadelphia, Cat.-No. 470 oder der eigenen Konstruktion, Plattenst/~rke 1 oder 3 ram) mit Proteinen bekannten Molekulargewichts ver- glichen. Die Wanderungsstrecken sind dem Logarith- mus des Molekulargewichtes proportional und die Werte sehr gut reproduzierbar. Im allgemeinen ist die Festlegung der kleinsten Molekulargewichtsein- heir mit einem Fehler yon ~= 50/0 mSglich, auch ffir

2 Die ApparaSur ist in Kiirze im Handel erh~Itlieh.

die l~ibonuclease (vgl. dazu [2,15]). Wit benutzten racist den vorgeschlagenen Phosphatpuffer pH 7,1 [15] in der Plattengel-Appara~ur und nicht in RShrchen, haben aber auch Tris-Boratpuffer p i t 8,9 eingesetzt, weft bier alas Gel mit Dodecylsulfat besser polymeri- siert. In diesem Puffer weichen abet die Testproteine Ovalbumin (11~ zu niedrig), y-Globulin-H-chlVfensch (9o/o zu both) und Cytochrom yore Pferd (60/0 zu hoch) yon dem mittleren Fehler ab, w/ihrend Rinder- serumalbumin, y-Globuline-L-ch, Ribonuclease, TMV- und TYMV-ttfillprotein innerhalb dieser Grenze liegen.

Man kann auch die Isolierung tier Proteine in um- gekehrter Reihenfolge beginnen und zuerst im 16mm-Block die Elektrophorese und dann die Elektrofokussierung durchffihren. Vorteflhaft ist die MSglichkeit zur st/~rkeren Beladung des Blocks (bis zu I g Proteingemisch), nachteilig ist die zweimalige Extraktion (falls man nicht die ausgeschnittene Elektrophoresezone direkt in die AmpholinelSsung mit dem zu polymerisierenden Acrylamid einbringt) und die Gegenwart yon Ampholinen im letzten Extrak~.

168 H. Stegemann:

KopElarschleuch ( Poly~thu l

$chrauben ~ (Polyamid)

B l o c k (Plexiglas)

Ring (por~ses

........ " ...... ': -~-~ [i !l Poly~fthylen)

-- membran O-Ring

b e f e s t i g t mit Sillkon -

Abb.3. Apparatur ffir kontinuierliche Mikrodialyse oder Dodecylsulfatbeladung, ProbengrSBe 0,5 ml (bei umgedrehtem Unterstfick 0,1 ml). Fiillen des Ger~tes mit 0,5 ml in der gezeigten Lage; zur Dialyse wird es auf den Kopf gestellt, um permanenten Kontakt des Retentates mit dem Durch- fluff zu gew/ihrleisten. ZufluB dutch Poly~thylenschlauch 2 mm AuBen-, 1 mm Inuen- ~ , Abflu8 durch por6sen Poly- ~thylenring. Polyamidschraube und -mutter, die yon beiden Seiten dutch die Plexigtast~ite geffihrt werden karm, I)ialy- sicrmembran lieg~ nnter I)ruck auf Silicon-O-Ring

Dos Verfahren des , ,Mapping" wurde herangezogen fiir die genet ische Ident i f iz ie rung von Kar tof fe l - p ro te inen [in Z u s a m m e n a r b e i t m i t dem Max-Blanck- I n s t i t u t f i ir Zi ieh tungsforschung (KSln); RoB, Bae- recke, :Frandsen], fi ir d ie Ident i f iz ie rung der He te ro- geni t~ t y o n Pek~inasen (mi t V. Macko), Phosphory - lasen und Pe roxydasen . Die be i l e tz te ren gewonnenen Erkenn tn i s se sollen in Ki i rze beschr ieben werden [9]. F e r n e r s tel l te sich heraus , dab ca. 90~ der 16slichen P ro te ine der Kar toffe lkno] le in dem Molekular- gewich~sbereich zwischen 20 u n d 25000 l iegen [18], m i d dab die W e r t e fiir die H/ i l lp ro te ine der K a r - to f fe l -X-Virusgruppe r ev id ie r t werden miissen [8]. Die tr / igerfreie E lek t ro fokuss ie rung yon pf lanzl ichen P ro te inen in einer Po lys m i t an- scblieBender Moleku la rgewich t sbes t immung i s t be- schr ieben [12].

Arbeitsvorsehrift

Als Ausgangsma te r i a l fi ir die Mapp ing -Techn ik eignen sieh alle P ro te ine u n d Enzymgemisehe , d ie die Einze lsehr i t t e unbeschade t i ibers tehen. Als Bei- spiele w/ihlen wir die Brotelne der Karto]]elknolte.

Nach dem Frieren und Tauen durch Pressen gewonnener Soft [10] wird unter Zusatz yon 0,2~ Sulfit im Dialysier- schlauch (Visking 8/32) durch Einlegen in Carbowax 20000 auf etwa ein F~nftel eingeengt (ca. 30 mg Protein/ml) und gegen 0,04 M Tris/~DTA/Bors/~ure-Puffer [10] pH 8,2 dia- lysiert. Zusatz yon 0,5~ iKercaptoithanol start Sulfit liefert in bezug auf dos Elektrophoresemuster ein gleiches Ergebnis. Da Carbowax ouch niedermolekulare Bestandteile enthElt, miissen diese im Rohprodukt entfernt werden, falls man dos Protein fiir ein ,,Fingerprint" einzusetzen gedenkt. Ffir eine Re-Elektrophorese des ungespaltenen Proteins ist diese Reinigung nicht notwendig.

1 ml dieses Konzentrates wird auf Polyacrylamid gegeben, dos in eincr Form aus Plexiglas (Irmenmal]e 16 • 5 • 150 ram) bereitet wurde aus umkristallisiertem Acrylamid 6~ und Methylenbisacrylamid 0,15~ in l~ Ampholine pH 5 bis 7. Nach Entgasen polymerisiert man mit 0,065 Vol-% TENIED, 0,02~ Ammoninmpersulfat und 5~ Saccharose (bereitet aus einer bakterienfrei filtrierten Kandiszucker- 15sung) und elektrofokussiert [11]. Man ochre zwecks hori- zontaler Zonen darauf, dab sowohl die Plexiglasform, in der die Elektrofokussierung durchgeffihrt wird, als ouch spEter dos ElektrophoresegerEt absolut fet~frei skid, was durch B/irs~en mit oberfl~chenaktiven Sptilmitteln und kriftiges Sp/ilen mit Wasser erreicht werden kann. Eine Referenz- Elektrofokussierung wird nach [4] in Schalen aus rostfreiem Stahl mit Supranolcyanin 6 B Bayer, C.I. 426603 oder Coo- massie Blue [3,8] gef~rbt.

UnmRtelbar nach Beendigung der Trermung durch Fo- kussierung legt man den Gelstreifen 1/2 rain in eine Puffer- 16sung pH 8,9 (s. u.) mit 0,05~ Amidoschwarz und daml mi~ der Breitseite auf den vorbereiteten Gelblock in die Apparatur nach Abb. 1 C und polymerisiert sie ein mit 15 ml 5~ Cyanogum (Acrylamid mit 5~ Mcthylenbisacryl- amid). Der Gel-Block (16•215 enthi l t 5~ Cyanogum in 0,125 1K Tris/Boratpuffer pH 8,9 (Polymeri- sation unter luftfreiem Wasser) und ruht auf einem gleichen Polyacrylamidsockel, der zuvor in 2 cm hoher Schicht in der um 30 ~ geneigten Appara~ur geformt wurde. Diese Art des Diaphragmas hat sich besser bew~hr~ als Schw~mme odor anderes por6ses Material [10,17].

Die EIektrophorese fiihren wir unter Solekfihlung yon -k 10~ bei 120 V und 35 mA ffir etwa 16 h durch. 10 W fiir 16 mm-Platten und 70 W f/ir 3 mm-Platten (Solekiihlung bei 0~ sollten nicht iiberschritten werden, weil sonst die WErmeverteilung im Gel ungleichmiBig wird und die in der Mitre der Gelschicht wandernden Proteine vorauseilen 4. Dos Ende ist durch dos Einwandern yon Amidoschwarz in den Sockel gekennzeiehnet. Da durch die Konstruktiou des Apparates dos elektrische Feld auch im untersten Bereich des Blocks homogen ist uncl wir s~att Abstandsfiil]chen mit Diehtungsgummi [14] fiber die gauze L/inge gleichbleibende Plexiglasstibe (ohne Dichtung) verwenden, kann man dos zur Startlinie parallele Einwandern des Farbstoffs in den Sockel verfolgen.

Dos Schneiden des Blocks in Schichten erfolgt in der Apparatur nach Abb. 2, wobei diese so geformt ist, dab der

3 Wir danken den Bayer-Werken, Leverkusen, fiir die Bereitstetlung dieses Farbstoffes.

4 Entgegen unseren Erwartungen gibt es sehr gute Tren- nungen in der 1 mm starken Platte bei Sole-Temperatur yon 10 ~ C, wihrend 0~ verwaschene Zonen liefer~.

Protein-Mapping, Schnell-Dialyse und Molekulargewichtsbestimmung im Mikrogramm-Bereieh 169

grSBtmSgIiche Gel-Block aus der Appara~ur nach Abb.l gerade hineinpal3t. Kleinere B15cke miissen durch Einlegen yon Plexiglasstiicken so lest in dem Rahmen sitzen, dab beim Auflegen des Deekels mit anschliel3endem Schneiden keine AusweichmSgliehkeit in eine der drei Dimensionen gegeben ist. Sehichten wesentlieh dfinner als 2 mm sind nur mit Glfick in yeller Gr5i~e zu erhalten. Man kann 8 Schichten aus einem 16 mm dicken Block gewinnen, urn sic auf ver- schiedene Weise anzuf/~rben, wenn man jeweils eine weitere 2 mm dieke Plexigtasplatte in den Apparat nach Abb. 2 einlegt und dadureh den Block in die riehtige SchlitzhShe fiir den Saitenschneider hebt.

Fiir die 1V[olekulargewichtsbestimmung yon Proteinen ist die 3 ram s~arke Gelplatte mit 8 Tr~gern sehr geeigne$. Da der Dodecylsulfatzusatz das Gel sehlfipfriger macht, muI3 hier evtl. alas Aerylamid unter Kfihlung (10~ polymerisiert werden, damit sich nicht w~hrend des Laufes (K/ihlung 0~ sein Volumen zu stark veri~ndert und es durchrutscht.

Fiir den Nachweis sehr geringer Mengen yon Proteinen (t tzg) oder Enzymen (z. B. Phosphorylasen 10pg) wi~hlt man das 1 mm starke Gel. Blasenfrei gewonnen wird es am besten dureh Einfiillen der AerylamidlSsung mit Kata- lysatoren in den waagerecht liegenden Kasten, gefolgt yon dem schri~gen Einse~zen des Oberteils under langsamer Ver- dri~ngung der Luft. Die Trogformen aus Teflon sollen 10 mm breit sein, weft dann die Bahnen seh~rfer sind als bei sehmaleren TrSgen. Die 10 mm breiten Bahnen kSnnen mit einem an einer SeRe scharfen, 5 mm starken Plexiglaslineal in 5 Streifen yon je 2 mm geschnitten werden, ohne ihre meehanische Festigkeit zu verlieren. Damit liegt der Sub- stanzbedarf pro Streifen fast in der GrSlle der Hydensehen Capillartectmik [5,13].

Ich danke sehr Fri~ulein H. Franeksen, R. Kaerger und Frau U. Sunder-Plassmann ffir ihre MitarbeR, F~ die An- fertigung der Plexiglasger~te besonders I-Ierrn Wieczorek, der Deutschen Forschungsgemeinschaf$ fiir eine Sachbeihilfe.

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Priv.-Doz. Dr. H. Stegemann Institut ffir Biochemie Biologische Bundesanstalt fiir Land- und Forstwirtschaft D-3300 Braunsehweig, Messeweg 11/12