1246 H. WE~CKSg u. K. HVmWSTOCK: Proteingebundene Kohlenhydrat-Komponenten bei Paraprotein~mien Klinische WochenschrL~g

Nach unseren al lerdings zahlenm/igig noeh beschr/~nk- t en Belas tungsversuchen m i t Lactose und Xthanol , die Aufschlug fiber die Resorpt ionskapazi t /~t des gesamten Df inndarmes ergeben, b i lden die In to leranzfgl le e in yon der Kon t ro l l g ruppe k la r abgegrenztes Kol lek t iv , das zur Lae tosespa l tung n ieh t mehr befah ig t ist .

CUATRECASAS U. Mitarb . ~4 fanden einen Zusammen- hang zwisehen Milchabst inenz und Lactose in to leranz . Sic d i sku t ie r t cn daher die Frage , ob die Da rmlac t a se ein induz ie rbares F e r m e n t sei, konn t en aber bei einigen Intoleranzf/~llen d a r c h lgngere Verabre iehung yon Lactose die Resorp t ion n icht nachweisbar ver- bessern. Zahlreiche Tierversuche sprechen m i t e iner Ausnahme ~s gegen die I n d u z i e r b a r k e i t des Fe rmen te s d a r e h Lac tose ~s-2~. Unser Un te r suchungsgu t 1/~Bt zw-ischen Mi lch t r inkgewohnhe i ten und Lactose in to le- ranz keine Beziehnng erkennen. Ohne Einf lu$ auf die D a r m l a c t a s e a k t i v i t ~ t i s t in U b e r e i n s t i m m u n g m i t Tierversuehen 22 auch der endogene Lactosespiegel w/~hrend der sp/~ten Gravid i t / t t und Lac ta t ionsper iode . Das famili / ire Auf t re ten , das aus unseren Unte r - suehungen hervorgeht , 1/~Bt an eine genet ische Ursache denken. Bei der H/ iuf igkei t de r e rworbenen Lactose- into]eranz kSnnte dieser Be~und jedoch auch rein zu- f/illiger ]X~atur sein, so dai~ zur Ktg, rung dieser F r a g e weitere Fami l i enun te r suchungen no twendig sind.

Zwsammen/assung. Ffinf F/~lle yon erworbener Lac tose in to leranz werden beschrieben. Drei d a v o n w a r d e n in e inem n ich t se lek t ie r ten Un te r suchungsgu t yon 12 gesunden P r o b a n d e n gefunden.

Zur E rkennung der ges t5r ten Lac tose resorp t ion wurde naeh oraler Lac tosebe las tung auger dem Blut - glueosespiegel der Blu tga lak tosesp iege l herangezogen. Die s iehers ten Ergebnisse l iefer t der Galaktosespiegel , wenn der Umsa t z der resorbier ten Ga lak tose im Stoff- weehsel dnrch Xthano l b loekier t wird.

Die Resorp t ionss tSrung w a r d e d u t c h ha lb j~hr ige Beobach tung als D a u e r z u s t a n d e rkannt . Sic wird du tch Schwangerschaf t a n d Lac~aVion n ich t beemflul~t. Das famih/~re Auf t r e t en weist raSglicherweise auf eine genet ische Ursaehe kin.

Summary. Five cases of acquired lactose intolerance are described. Three of them were found among 12 not selected healthy volunteers.

Beside the blood glucose concentration, the blood level of galactese was examined after oral load of lactose for the detection of the disturbed absorption of the disaccharide. The blood galactose yields the most certain results when the catabolism of absorbed galactose is blocked by ethanol.

The disturbance of absorption was recognized as a per- manent condition through a half-year's observance. I t is not influenced by pregnancy and lactation. The familiar ~ppearance possibly points to a genetic cause.

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Anschrifl: Dr. W. F~scH~ Physiologisch- chemisches Institut 8520 Erlangen, Wasserturmstr. 3

Proteingebundene Kohlenhydrat-Komponenten bei Paraprotein~imien* H. WEIC~:E~ und K. HUENSTOCX

Aus der Abteilung ffir Stoffwechselforschung (Leiter: Prof. Dr. I{. Y~rEIOKER) der Medizinischen Universit/~ts-Polildinik Heidelberg (Direktor: Prof. Dr. H. PLI~GGE)

Die Isol ierung immunologisch und st/ irkegel- E r m i t t l u n g d e r K o h l e n h y d r a t - K o m p o n e n t e n i s o l i e r t e r e l ek t rophore t i sch re ine r P a r a p r o t e i n f r a k t i o n e n i s t r e c h t Pa rap ro te ine fiir die g o n t i n e u n t e r s u c h u n g yon Pa ra - ze i t r aubend u n d a p p a r a t i v aufwendig, so da~ die protein&mien me thod i sch meis t n ich t durehf i ih rba r

* ~[it Unterstatzung der Deutschen Forschungsgemein- ist . Der Naehweis dcr p ro te ingebundencn Kohlen- schaft, h y d r a t e a n d ihre Differenzierung in p ro te ingebundene

gg. 43, Heft 23 H. WE[CKEt~ U. K, I-IUKNSTOeK: Prote ingebundene Kohlenhydrat-Kompor~engen bei Parapro~eingmien 1217 1. Dezember 1965

Hexosen, Hexosamine, Fucose und Neuraminsgure im Gesamtserum ist jedoch ~echniseh einfach und stellt neben der zonen- und immunoelektrophoretisehen Untersuchung some der Ultrazentrifugation eine dia- gnostisehe Bereicherung in der Beurteilung yon Para- proteinamien dar. Die yon LAURELL U. Mitarb. ~s, HIgh,HANS U. Mitarb. ~°, KA¢CZOW u. Mitarb. ~ publi- zierten Methoden wurden in nnseren Un~ersuehungen rnodifiziert nnd dureh die Bestimmung der Fusose, Neuraminsaure und ttexosamine im Serum vor und nach Dialyse gegen physiologisehe KochsalzlSsung soMe dutch die elektrophoretisehe Untersushung des Serums vor und nach enzymatissher Abspaltung der Neuramins/~ure erganzt, l~bsr die Ergebnisse dieser einfaeh durehf~hrbaren I{ou- tineuntersuchung soll nach- stehend berichte~ werden.

gmien n vor. Die Makrogtobulingmien konnten dursh Ultrazentrifugen-Analyse bei allen Fgllen mit S 19 bis 24-Werten von fiber 15 rel.-% gesichert werden.

Im Vergleich zu diesen Paraprotein/imie-Seren warden die gleichen Analysen aueh bei 15 Seren dursh- geftihrt, welche papierelektrophoretiseh eine Alpha r und Alph%-Globulin-Vermehrung im Sinne der akuten Entzfindung oder einer Tumor-Dysproteingmie zeigten und bei denen mit den iibliehen Kriterien keine Para- protein/~mie nachzuweisen war.

Als Kontrollgruppe wurden dartiber hinaus zehn Seren gesunder Versuehspersonen mit papierelektro- phoretiseh normaler Verteilung der Eiwsig-Fraktionen nntersucht.

Tabelle. Mittelwerte (in g- % bzw. rag- %) der Kohtenhy&'at/wmponenten in den. ver~chiedenen Para/proteingruppen im Vergleich zu Normalserum und Alpha-Globulin-Verr~hrungen

Methodik -

0,5 ml Patientenserum NormMe 15 wurde in einer Collodiumhfilse Alpha-Globulin- 24 Std gegen 0,9%ige Koch- Vermehrung 11 salzlSsung bei ± 0°C erschSpf- Gamma s s - 19 Iich dialysiert. Die Verwen- Gamma ss + 20

Gamm~ 1A 10 dung yon Aqua desk. Ms Gamma]~ 7 Dialysefliissigkeit ist zu vet- Ggmma 1M meiden, da hierbei die Makro- globuline im Dialyseriickstand ansfallen. Das Serum wurdc ansch]ieBsnd mit 0,9%iger NaC1 auf 10 ml aufgeffillt, sodann aus aliquoten Teilen die proteingebundenen Kohlenhydrate ermitte]t. Folgende Analysen wurden jeweils ve t and naeh Dialyse im Doppslversueh durehgsfiihrt :

1. Gesamthexosen mit der Anthron- und Orein- Reaktion,

2. Itexosamine nach ELSoN-MORGAN,

3. Fueose naeh DISO~E und S~ETTL~S, 4. Neuramins/~ure nach SVE~]~ROr~M, Resoreinol-

Methode.

Ferner wurde die freie Neuramins/£ure naeh W A~R~ mit der Thiobarbiturs£ure-Methode vor und naeh Inkubation des Serums mit Neuraminidase (Behring-}¥erke, Marburg) in einer Enzym-Substrat- Konzentration yon 1 : 10 bei einer Inkubationszsit yon 24 Std bei 350 C und pH 5,8 bestimmt. Vor und naeh Inkubation mit Neuraminidase warden die Seren papier- some immunoelektrophoretiseh naeh den fibtiehen Teehniken yon HANNIG und SCIIEIDEGG]~R getrennt (zu Einzelheiten der Methoden s. 15).

Material

Die Untersuehungen wurden bei insgesamt 66 Para- proteinose-F/~llen ausgefiihrt. N~eh der immuno- elektrophoretischen Typeneinteilung handelte es sieh hierbei um 30 Gamma ss-, 20 Gamma 1 A-, 6 Gamma Mikromolekular- m~d l0 Gamma 1M-F/~lle. Bei den Gamma. ss-Paraproteinfi,mien war die Diagnose neben den immunoeIektrophoretischen Xriterien in 25 Fallen auch morphologiseh gesiehert, bei den Gamma 1A- Typen in zwSlf F/£11en und bei der Gamma Mikro- molekular-Gruppe in ffinf F/~llen. Bei einem Teil der Patienten lagen somit sog. ,essentielle" Paraprotein-

7,5

7,1 6,1 8,7

11,2 9,2

8 12,5

Ges. x n ttex

500 220

642 282 355 147,1 502,7 218,3 643,1 291,8 447,0 167,4 737,6 349,7

~UC

93

121

93. 661

105:

ttexa

11o

154 95,7

129,4 167,0 113,1 180,0

77,2

107 51,1 76,3 89,4 73,7 94,2

pro~. K]~ Prozent

lO,O

12 6,2 8,7

10,9 10,0 11,4

n = Zahl der F~lle; GE = GesamteiweiB in g-% ; Ges. KH = Gesamtkohlenhydrate; Hex. = Hexosen; Fuc. = ]Pucose; Hexa = Hexosamin; NANA = N-acetyl-Neuramin- s~ure; prot. KH Prozent = Prozent proteingebundener Kohlenhydrate, aus Gesamt- globulinen berechnet.

Ergebnisse

In der Tabelle sind die Mittelwerte far die protein- gebnndenen Kohlenhydrate innerhalb der jeweiligen Gruppen (versehiedene Typen der Paraproteingmien, AIpha-Globulin-Vermehrungen und Normalseren) zu- sammenge~aBt. Diese Ubsrsichtstabe]le zeigt zungchst, dab die }Verte der einzelnen Koh]enhydratkomponen- ten bei Paraproteingmien grundsgtzlieh nisht h6hsr liegen als bei den Seren yon Patienten mit Alpha- Globulin-Vermehrung, da bei letzteren durch Glyko- protein-Zunahme im Alpha-Globulin-Bereieh ebenfalls sin Anstieg der proteingebundenen Kohlenhydrate entsteht. Dies gilt sowoht fiir die gesamten Kohlen- hydrate als aush ffir die Einzelkomponenten (Hexosen, Itexosamine, Fucose, Nsuraminsgure). Eine isoIierte Beurtsilung der Kohlenhydrat-Analyse erlaubt somit keine diagnostischen l~ficksehliisse auf das VorHegen einer Paraproteingmie. Zusammen mit der Zonen- nnd Immunoelektrophorese erm6glichen die Unter- suchungsergebnisse der proteingebundenen Kohlen- hydrate jedoeh eine Differenzierung der Paraprotein- Typen. In Zweifelsfgllen k6nnen nash immunoslektro- phoretischer Trennung die ehemisch ermittelten Daten die Interpretation der Prgeipitationslinien erleichtern :

1. Der Gamma-Mikromolekular-Typ unterscheidet sich erwartungsgemgB bei fehlendem M-Gradienten in der Papierelektrophorese quanti tat iv nicht yon den ~¥erten des Normalserums.

2. In der Gamma 7S-Gruppe fanden Mr papier- elektrophoretisch differente WanderungsgesshMndig- keiten dieser M-Gradienten, die aueh in der Lage der atypischen Praeipitationslinien bei immunoelektro- phoretischer Untersuehung zum Ausdruck kamen: bei

1248 H. WEICKEt¢ U. K. HUttNSTOOK: Probe ingebundene K o h l e n h y d r a t - K o m p o n e n ~ e n be i P a r a p r o t e i n g m i e n Klinische Wochenschriit

den Gamma 7 S-Paraproteinen bei niedrigen Gesamt- kohlenhydratwerten und relativ geringer Neuramin- sgure-Konzen~ration meistens eine kathodische Loka- lisation des M-Gradienten. Bei schneller anodisch wandernden 7S-Paraproteinen (in der Tabelle als

3. Die h6chste Gesamtkohlenhydrat-Konzentra- tion fanden wir bei den Gamma 1A-Paraprotein- /~mien und bei tier Makroglobulin/~mie Waldenstr6m. Die Gesamthexosen und alas Hexosamin Iagen bei der Makroglobulini~mie h6her als bei den Gamma 1A-

6'50

55O

5OO

4~50

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Abb. 1, Einzeluntersuchungen der proteingebundenen Kohlenhydrate bei Gamma as-, Gamma 1A-, Garmna /~- und Gamma ll~I-Paraprotein~mien, Normalpersonen und Patientea mit Alpha: and Alpha2-Globulin-Vermehrung. A) Werbe der proteingebundenen Hexosen. B) Werte tier protein-

gebundenen Fucosen, C) Werte der proteingebundenen tIexosamine. D) Werte der proteingebundenen NANA. E) Werte der proteingebundenen Gesamtkohlenhydrate

Gamma-? bezeichnet) hingegen lag die Konzentra- tion der proteingebundenen Kohlenhydrate und der Neuramins~ure relativ both. Diese Werte unterschie- den sich nur geringgradig yon denjenigen, die wir in der Gamma 1 A-Gruppe und Gamma 1M- Gruppe ermitteln konnten. Auch die Fucose war bei den anodisch wandernden Gamma 1M-Paraprotein/imien um 25% h6her als bei kathodiseher Lokalisation der Parapro- ~eine,

Plasmocytomen. Die Neuramins£ure lie$ jedooh keine mel3baren Differenzen z,~dschen diesen beiden Para- proteingmie-Typen erkennen. Der im Vergleich zur Makroglobuliniimie wesentlich geringeren Molekiil- gr6Be der Gamma 1A-Paraproteine entspricht somit auch ein relativ h6herer Neuramins/iuregehalt, so dab die negative Ladung pro Molekfil fiir die meier sehr ausgeprggte anodische Bewegliehkeit des M-Gradien- ten der Gamma 1A-Plasmocytome entscheidend sein

Jg. 48, Heft 23 H . W EICKEg U . K . HUHNSTOCK: Proteingebundene KohlenhydraL-Komponenten bei Parapro~eingmien 1249 I . Dezember 1965

dfirfte. Die Streuung der tabellarisch erfaBten Mittel- werte ist aus den graphischen Dars~e]]ungen der ein- zelnen Untersuahungen bei den verschiedenen Para- protein-Typen zu ersehen (Abb. 1).

Der Einflul3 des jeweiligen Neuramins/~uregehaltes endst~tndig gebundener Neuramins~ure auf die elek~ro- phoretische Wanderungsgeschwindigkeit des Para- proteins ~drd durch die Untersuchung mittels des NeuramiMdase-Abbaus deutlieh :

Der Neuramins~nre-Release nach Inkubation mit Neuraminidase ist yon der Ausgangskonzentration der Neuramins~ure abhgngig nnd kommt in der ver- minderten Wanderungsgeschwindigkeit des M- Gradien- ten naeh durehgefi~hrter Inkubation des Serums zum Ausdi'uck (Abb. 2). Bei den Gamma 1A-Paraprotein- ~mien war diase Reduktion der Wanderungsgesahwin- digkeit nach enzymatischer Abspaltung der Neuramin- s~ure am st~rksten ausgepr/~gt. In der Gamma 7 S- Gruppe war die Reduktion bei den anodisah lokali- sierten M-Gradienten bedeutend st/trker als bei kathodischer LokMisa~ion des Paraproteins.

Die Gesamtkohlenhydrate waren vor Dialyse um 40--50% hSher als naeh DiMyse der Seren gegen physiologisehe KoehsalzlSsung. Diese Differenz kam besonders durah die Bestimmungen der Hexosen mit der Orcin- nnd Anthron-Reaktion zum Ausdruak, da in dem niehtdialysierten Serum mit diesen Methoden auch die nicht kohlenhydratgebundenen tIexosen er- faBt werden. Geringe Untersahiede waren auch in dem Fucosegehalt nachweisbar, woraus zu erkennen ist, dag nicht die gesamte Fuaose des Serums protein- gebunden zu sein scheint, ttingegen wiesen die Hexes- amin- and Neuramins~ure-Konzentrationen vorund naeh DiMyse keine Differenzen auf, da freie Neuramin- s/~ure und Aminozueker in mal3baren Mengen niaht im Serum vorliegen.

Diskussion

W/~hrand Untersuehungen der Kohlenhydrat-Kom- ponenten bei dem rela±,iv leich~ durch Aqua dest. zu isolierenden Paraprotein der Makroglobulin/~mie WM- denstr6m bereits relativ frfih durehgefiihrt wur- den s, 1~, ~s sind genaue Kohtenhydrat-AnMysen bei den verschiedenen immunoelektrophoretisahen Typen des Plasmoeytoms bislang nut vereinzelt erfolgt. 1961 ha- ben LAURELL und HEI~EMANS 10 fiber 300 Seren mi~ M-Komponenten in bezug auf papierelektrophoretisahe Wanderungsges ahwindigkeit, immunoelektrophoreti- sahen Typ and HexosegehMt miteinander verglichen. Sie fanden keine d_h-ekte Beziehung zwisahen der elaktrophoretischen Beweglichkeit und dam protein- gebundenen HexosegehMt, jedoeh fiel auf, dab hohe Hexosewerte bei den langsam wandernden Gamma- Paraproteinen extrem se]ten waren. Bei anodiseher LokMisation des M-Gradienten nahm der Hexose- gehalt zu, ohne jedoah im Gegensatz zu den Befunden yon FAIrly und HO~ETT ~ sine statistische Signifikanz zu zeigen. In der Gruppe der Gamma 1 A-Paraproteine zeigte sieh eine weitere Zunahme, wobei jedoeh die Mittelwerte in dieser Gruppe nur knapp 50% der Mittelwerte bei dem Gamma ]M-Typ aufwiesen. Naeh Ansieht der Autoren erlaubt die Kenntnis des proteingebundenen HexosegehMtes und die papier- elektrophoretisehe Wanderungsgesehwindigkeit nur selten Rfieksehl/isse auf den immunologisehen Typ. Am ehesten k6nnte noah die Unterseheidung zwisehen

einer Gamma 7 S- nnd einer Gamma i M-Komponente erm6glicht werden.

KANZOW u. Mitarb. 1~ ffihrten 1961 bei 24 para- proteinamisehen Seren (14 Makrog]obulinamien, seehs G&mma 7 S- und vier Gamma 1 A-Plasmoeytome) Be- stimmungen der Hexosen, des ttexosamins und der Neuraminsaure durch, und stellten lest, dab sich Gamma 7 S- and Gamma 1 A-Paraprotein-Typen durch den KohlenhydratgehMt untersaheiden. Eine Diffe- renzierung innerhalb der Gamma 7 S-Typen nach der Lage des M-Gradienten wurde jedoeh yon den Autoren rfieht vorgenommen, obgleich die quantitativen Kohlen- hydrat-Werte Differenzen bis 100 % aufwiesen, welahe

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Abb. 2. Zonenelektrophorese-Diagramm ~or und naeh Inkuba~ion mit Neuraminidase; vor .... , naeh . . . . . . . . . (1geuraminidase Behring- Werke, ~Iarburg; Inkubation: °4 S~d, 87 o C, p t I 5,7, Enzyra: Substrat 1:10)

sieh vermutlieh dureh die unterschiedliche Lags des M-Gradienten erklaren lassen. Untersuehungen yon CtIYttl~K-Bot~oWSKA und DEPTULSKI 2 an protein- gebundenen Kohlenhydraten bei elf Myelom-Falten erfolgten ohne Differenzierung das immunoelektro- phoretisahen Typs oder Bezugnahme auf die papier- elek~rophoretische Lokalisation des M-Gradienten, so dab die im Verg]eiah zu anderen h/hnatologisehen Erkrankungen (lymphatisehe Leukamie, Lympho- granulomatose) maximal erh6hten Kohlenhydrat- werte der Myelom-Seren niaht in bezug auf den immunologisahen Typ bewertet warden k6nnen. Axlaloges gilt auch fiir die Untersuehung der Kohlen- hydrat-Komponenten yon FRSHLICH 6 an 38 Plasmo- cytom-Seren, we]che zwar deut]iche Untersahiede des Kohlenhydratgehaltes, insbesondere hierbei der Neur- aminsaure, in Beziehung zur elektrophoretisehen Wanderungsgesahwindigkeit ergaben, bei denen jedoah ebenfalls keine immunoelektrophoretisehen Typen- Differenzierungen vorgenommen wurden.

Faint man die Ergebnisse der angeffihrtenArbeiten zusammen, so wird aus ihnen die jeweils unfersehied- liche Kohlenhydrat-Zusammensetzung verschiedener

1250 H.WEICI{ER u. K. I{UK31STOCK: Proteingebundene Kohlenhydrat-Komponenten bet Paraprotein~mien Klinische Wochenschrift

Paraprotein-Typen und die davon abhgngige Beein- flussung der elektrophoretisehen Wanderungsgesehwin- digkeit deutlich. Diese Arbeiten gestat ten jedoch noch keine eindeu~ige Kl£rung der Zusammenh/~nge, weft entweder die immunoelektrophoretische Differen- zierung fehl~ bzw. die AnaIysen der Kohtenhydrat- Komponengen nieht detaflliert erfolgten. Aus den hier mitgeteilten Ergebnissen ist zu ersehen, dal3 mit Er- mitt lung der proteingebundenen Kohlenhydrate und ihrer einzelnen Komponenten im dialysierten Serum die Daten in Kombinat ion mit der zonenelektro- phoretisehen Lokalisation des 1V[-Gradienten Aussagen fiber den immunologischen Paraprotein-Typ erlauben und zur Differenzierung nicht eindeutiger Praeipi- tationslinien in der Immunoelektrophorese jederzeit herangezogen werden kSnnen. Sowohl die chemisehe Bestimmung Ms auch ve t allem die Zonen- and Immunoelektrophorese vor und nach Inkubat ion mit Neuraminidase demonstrieren, dug die Neuramin- sgure-Konzentration pro Molekiil ffir die Wanderungs- geschwindigkeit des Paraproteins eines der entschei- denden Faktoren darstellt. Neben tier Neuraminsiiure- Konzentration, die besonders bet der Gamma 1A- und Gamma 1M-Paraprotein-Gruppe und dem ano- disch wandernden Gamma ss-Paraprotein relativ hoch ist, rind jedoch aueh die fibrigen Kohlenhydrat- Komponenten wie Gesamthexosen, Hexosamin und Fucose in die Bewertung der atypisehen Immun- globuline miteinzubeziehen. Die ermittelte Protein- Kohlenhydrat-Relation aus dem Gesamtserum zeigte weitgehende 1)bereinstimmung mit den Protein. Kohlenhydi 'at-Komponenten, die Mr bei Makro- globulinen and einem Gamma 7 S- und Gamma 1 A- Paraprotein naeh Isolierung mit tr~geffreier Elektro- phorese* aus dem Serum van Plasmoeytom-Pat ienten untersucht hatten. Die van HEIm3~T~GER U. Mitarb. s bet physiologischen Immunglobulinen best immten Kohlenhydratwer te . zeig~en bei dem Gamma 7 S-, Gamma 1 A- und Gamma 1 M-Typ eine Verteilung, die den einzelnen Paraprotein-Typen entspraeh. Die bet den Gamma 7S-Plasmocytomen beobachteten Diffe- renzen in den Gesamtkohlenhydraten and besonders der Neuramins'gure, die ffir die Wanderungsgesehwin- digkeit des M-Gradienten in der Zonenelektrophorese verantwortlich rein diirfte, konnten naeh Unter- suehungen van FAH~¥ u. Mitarb. 4 G~EY und KUN- K;EL 7 s o w i e FRANKLIN 5 dadurch erkl/~rt werden, dab trotz immunologiseher Identit/~t des gesamten Gamma 7 S-Globulins eine Variabilit/~t der Kohlenhydrat-Kon- zentration in den I t -Ke t t en des Gamma-Globulins be- steht, da diese H-Ket ten naeh Untersuehung yon F~Aa~J:~ s aus kohlenhydratreichen und kohlen- hydra tarmen Fragmenten aufgebaut rind. Die Kom- bination van kohlenhydratreichen oder kohlenhydrat- armen Fragmenten kSnnte zu der Differenz in dem yon uns beobaehteten Gesamtkohlenhydratgehalt and der Neuramins/~ure-Konzen~ration ffihren, die rich in tier Wanderungsgesehwindigkeit des M-Gradienten be- merkbar macht. Eine immunologische Differenzierung dieser Fragmente scheint nach Aufspaltung dutch Papain-Hydi'olyse mSglieh. G ~ ¥ und KUNKEL 7 some B E ~ I E ~ und P U ~ A ~ ~ nehmen an, dab die prosthetische Kohlenhydratgruppe - - vor allem auch

* Fi i r die I so l ie rung de r P a r a p r o t e i n e d a n k e n wir a u c h an dieser Stelle tferm Dr. chem. B. AD]~L~ANN, Max-Planck- Institut ftir EiweilL und Lederforschung, 3/Iiinchen.

die Neuramins~ure - - fiir die immunologisehe Deter- minierung tier t t -Ke t t en bedeutungsvoll ist. Auf Grund dieser Untersuehungen w ~ d e demnach die prosthetisehe Kohlenhydratgruppe nicht nur die physiko-chemischen, sondern aueh die immunologi- sehen Eigcnsehaften des Immm~oglobulins beeinflussen kSnnen.

Zusammen/assung. Bei 66 Paraproteinosen (30 Gam- ma ss, 20 Gamma 1 A, 6 Gamma # und 10 Gamma 1 M) warden im Serum die proteingebundenen Kohlen- hydrate ermittelt. Vor und naeh Dialyse des Serums wurden die proteingebundenen Hexosen, Neuramin- s~ure, Hexosamine, Fucose bet diesen F/illen best immt und auf den Globulingehalt prozentual bereehnet. Mit der gleiehen Methodik warden zehn Normalper- sonen and 15F/~lle, bet denen Alpha1-, Alph%- Globulin-Vermehrungen infolge akuter Entzfindungen oder maligner Tumoren vorlagen, untersueht. Die Er- gebnisse lassen erkennen, dug die Bestimmung der proteingebundenen Kohtenhydrat-Komponenten keine isolierte diagnostische Bedeutung hat, jedoch zusam- men mit der Zonenelektrophorese den Paraprotein- Typ charakterisieren lassen und in tier Identifizierung immunoelektrophoretiseh nieht ganz klarer Fglle wert- yell ist. Den h6ehsten Kohlenhydrat-Gehalt fanden wir bet Gamma 1A- and Gamma 1M-Paraprotein- /~mien. Bet den Gamma ss-Paraprotein/~mien konnten wir bet den anodiseh lokalisierten M-Gradienten signifikant h6here Kohlenhydratwerte feststellen als bet den wetter kathodiseh liegenden M-Gradienten. Durch die elektrophoretisehe Untersuchung vor und naeh Inkubat ion mit Neuraminidase konnte gezeigt werden, dug ffir die Wanderungsgeschwindigkeit des M-Gradienten der Gehalt an Neuramins£ure pro Molek/il bedeutungsvolI ist. VergMchsuntersuchungen vor und nach Dialyse lassen erkennen, dal3 die Neur- aminsgure und Hexosamine nut proteingebunden im Serum vorkommen. Zur exakten Ermit t lung der proteingebundenen Hexosen und Fucose-Werte hin- gegen ist eine ausftihrliche Dialyse unbedingt erforder- lieh, da diese Kohlenhydrate aueh nicht protein- gebunden im Serum vorliegen. Die Beurteilung der proteingebundenen Hexosen ist ohne Dialyse un- m6glieh.

Summary. In 66 cases of paraproteinemia (30 gamma ss-, 20 gamma 1A-, 6 gamma s- and 10 g~mma 1M-types) the serum protein bound carbohydrates were analysed. Before and a~ter dialysis of the serum the protein bound hexoses, neur- aminic acid, hexosamine and fucose were measured and ea~lcu- lated in percentage of the serum globulin content. The s~me measurements wm~ performed in l0 controls snd 15 cases with alpha 1- and alphas-globulin increase caused by acute inflammation or cancer. The results show no specifie diagnostic criteria of the protein bound carbohydrate content, but in combination with pgpereleetrophoresis these carbohydrate analyses may be helpful in identifying the types of para- proteinemia and the immunoelectrophoretic patterns of doubtful cases. - - The highest carbohydrate content was found in gamma 1A- and gamma 1M-types. In gamm~ ss- types of paraproteinemi~ there was a significant difference in the carbohydrate content according to the localisation of the M-gradient in electrophoresis: the carbohydrate values were lower, the more cathodically the gradient was localized. Incubation of the serum with neuraminidase made evident that the content of neuraminic acid is important for the electrophoretical mobility of M-gradients. Neuraminie acids and hexose are only present in the serum in the protein bound form, as could be proved by dialysis. Dialysis of the serum is necessary in evaluating the hexose and fucose values, because also free components of these carbohydrates are present in

Jg. 43, Heft 23 1. Dezember 1965 W. P~Ermwrrz: Die Ver~inderungen der Michaelis-Konstanten des Pepsins and Trypsins 1251

the serum. The determination of protein bound hexoses without dialysis is impossible.

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Anschri/t: Prof. Dr. H. W~tCKE~ Med. Univ.-Poliklinik 69 Heidelberg, HospitalstraBe 3

Die Veriinderungen der Michaelis-Konstanten des Pepsins und Trypsins mit verschiedenen bestrahlten Proteinen und die chromatographische und elektrophoretische

Trennung der proteolytisch entstandenen Spaltprodukte W. PRELLWITZ

husder II. ~Iedizinisehen Universit~tsklinik und Poliklinik (Direktor: Prof. DL P. ScHOLI~IERICH) und dem Physiologisch-Chemischen Institut (Direktor: Prof. Dr. Dr. IL L~a) der Universit~t 3fainz

I n t ier L i t e r a t u r ] iegen zah l re i che A r b e i t e n vor , die sieh m i t de r A k t i v i t a t s / ~ n d e r u n g v e r s c h i e d e n be- s t r a h l t e r E n z y m e beseh / i f t igen ~, 2,4-~, 15-47, ~9, 20. E s fin- d e n s ich j e d o e h ke ine A n g a b e n darf iber , ob die Af f in i t / i i best~rahlter S u b s t r a t e zu d e n u n b e h a n d e l t e n F e r m e n t e n b e e i n t r g e h t i g t wi rd . E i n z e l n e I n f o r m a t i o - n e n l iegen a l le rd ings f iber M i e h a e l i s - K o n s t a n t e n y o n E n z y m e n m i t e r t f i t z ten ode r e h e m i s e h d e n a t u r i e r t e n S u b s t r a t e n vorlZ,15, is.

N a e h d e m wi r uns in e ther v o r a n g e g a n g e n e n A r b e i t t3 m i t den e h e m i s c h e n u n d p h y s i k a l i s e h e n V e r / i n d e r u n g e n b e s t r a h l t e r P r o t e i n e beseh~f t ig t en , wol len wi r n u n die F r a g e u n t e r s u c h e n , ob s ieh die A f f i n i t g t b e s t r a h l t e r Subs t ra~e zu i h r e n E n z y m e n fi.ndert. Z u d i e s e m Z w e e k b e s t i r n m t e n wir die M i e h a e l i s - K o n s t a n t e n (Km-Werte) des Peps in s u n d T r y p s i n s m i t b e s t r a h l t e n EiweiBen . D a n e b e n w o l l t e n wi r ve r suehen , die d u r e h P e p s i n en t s t a ,ndenen B r u c h s t f i e k e e l e k t r o p h o r e t i s e h u n d chro- m a t o g r a p h i s e h an S e p h a d e x G 25 zu t r e n n e n .

Melhodik Die Bestrahlung der vier verschiedenen Proteine, Human-

und Rinderalbumin, y-Globnlin vom Rind (Behri~g-Werke Marburg) and Ovalbmnin (Hoffmann-La Roche) wurden im Elektronenaccelerator naeh wts: DE GI~AFI~ Typ I S in der Weise vorgenommen, wie sie in der vorangehenden Arbeit la beschrieben wurde.

Fiir die Untersuehung tier Michaelis-Konstanten wurden die mit 0,1--10 5Irad bestrahtten EiweiBl6sungen mit 0,2 m Na-eitrat-Puffer pH 2,0 und 0,4 m Tris-HC1-Puffer pH 7,5

o/ auf 1,7 ~o, die mit 20 und 30 Mrad behandelten auf 1,3 % ver- diinnt. Ausgehend yon diesen Stamml6sungen wurden jeweils ffinf verschiedene Konzentrationen dureh Zugabe mit den entsprechenden Pufiern hergestellt.

AIs Fermente dienten kristallisiertes Pepsin (Serva Heidel- berg) und Trypsin (Boehringer Mannheim). Ffir Human- und Rinderalbumin nnd y-Globulin vom Rind benutzten wit eine 0,02%ige, fiir Ovalbumin eine O,04%ige Pepsinl6sung in

Kith. Wschr., 43. Jahrg,

Na~citrat-Puffer pH 2,0. Fiir Humanalbmnin setzt~n wir eine 0,02%ige, fiir Rinderalbumin eine 0,048%ige, fiir y-Globulin eine 0,12%ige und fiir OvMbumin eine 0,1%ige L6sung yon Trypsin in Tris-HC1-Puffer pH 7,5 an, der zur Aktivierung 40 mg CaCI~ pro 100 ml zugegeben wurde.

Je 1 ml der EiweiB16sungen ,~mrden im Wasserbad bet 38°C mit 0,1 ml der Fermentl6sung versetzt; es wurden Doppelbestimmungen durchgefiihrt.

Die Fermentreaktion wurde in bestimmten Zeitabstgnden zwischen 5 und 30 rain durch 3 ml 2 n Perehlorsiiure gesteppt, das gef~llte Eiweil3 abzentrifugiert and der klare ~berstand, d.h. die in Perehlorsiiure 16sliehen and bet 280 m# absorbieren- den Abbauprodukte im Spektralphotometer gemessen. Die Michaelis-Konstanten wurden nach dem Verfahren yon LI~-E- WAJ~VEa und B t r~9 ermittelt. Zur Untersuehung der dutch Pepsin entstandenen Bruchstficke an Sephadex G 25 wurden je 4 m l ether l%igen EiweiB16sung dureh Verd/irmen mit 0,2 m Na-eitrat-Puffer pH 2,0 hergestellt. Dazu pipettierten wit je 1 ml ether 0,05%igen L6sung yon Pepsin in dem oben beschriebenen Puffer. Wit inkubierten 24 Std im Brutschrank bet 38 o C. Danach wurden die R6hrchen bis zur weiteren Verarbeitung bet - -15 ° C eingefroren. 3,5 ml jeder L6sung wurden fiir die Chromatographic verwandt. Von diesen mit Pepsin verdauten Eiweigen fiihrten wit daneben eine Agar- elektrophorese im Veronal-Na-Puffer pH 8,4 durch. Die Lauf- zeit betrug 50 min bet 40 Volt Spannung. Nach deln Troeknen wurden die Elektrophoresen mi(~ Amindosehwarz 10 B gef~rbt.

Das Sephadex G 25 wurde mit 0,01 m Tris-tICLPuffer pH 8,0 fiber Nacht gquilibriert and dann in gew6hnlieher Weise in Sgulen yon 40 em H6he und einem Durchmesser yon 2 cm geffillt. Eluiert wurde mit 0,03 m Tris-HC-Puffer pH 8,0. Das Eluat wurde in einem Fraktionensammler zu Portionen yon je 3,5 ml aufgefangen. Die gesamte Chroma.to- graphie wurde im Xfihlraum bet 4°C durehgeiiihrt. Der EiweiBgehalg der einzelnen Fraktionen wurde nach Biuret, die entstandenen Peptide mit Ninhydrin nach Moo~E and ST~IS bestimmt.

Die ernfittelten Werte der einzelnen Fraktionen wnrden graphisch dargestettt. Da (lurch Sephadex G 25 Bruchst~eke mit einem i~folekulargewieht von 3 5 0 0 ~ 5 0 0 dutch Eindringen in das Netzwerk der Dextrank6rper zur/ickgehalten and damit verz6gert eluiert werden k6nnen, 15~Bt sich dutch diese Chro- matographie eine Aussage fiber die Gr6ge der dutch Pepsin entstandenen Bruchstiicke machen. Um gMchzeitig einen

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