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Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene
der Medizinischen Hochschule Hannover
Charakterisierung von zytotoxischen
Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert aus dem Respirationstrakt
von Patienten mit Cystischer Fibrose
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Doris Jordan aus Mühlacker
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung an der Tierärztlichen Hochschule:
Univ.-Prof. Dr. Gerald-Friedrich Gerlach
Wissenschaftliche Betreuung an der Medizinischen Hochschule:
Priv.-Doz. Dr. Ivo Steinmetz
1. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. Gerald-Friedrich Gerlach
2. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. Stefan Schwarz
Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2004
Gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)
In Erinnerung an meine Eltern
INHALTSVERZEICHNIS 1. Einleitung ..........................................................................................11 2. Schriftum...........................................................................................13
2.1. Taxonomie und allgemeine Eigenschaften von P. aeruginosa ................ 13
2.2. Pathogenität und Virulenzmechanismen von P. aeruginosa ................... 15
2.3. Verbreitung von P. aeruginosa bei Tieren ................................................. 20
2.4. P. aeruginosa und CF .................................................................................. 21
2.4.1. Allgemeines............................................................................................. 21
2.4.2. Phänotypische Variationen von P. aeruginosa bei CF............................. 24
2.5. Der Nematode C. elegans als Infektionsmodell ........................................ 29
2.6. Zielsetzung der Arbeit ................................................................................. 33
3. Material und Methoden ....................................................................34
3.1. Bakterien....................................................................................................... 34
3.1.1. Bakterienstämme..................................................................................... 34
3.1.2. Kulturbedingungen .................................................................................. 38
3.1.3. Bestimmung der Keimzahl....................................................................... 38
3.1.4. Kulturkonservierung................................................................................. 38
3.1.5. Charakterisierung der Motilität................................................................. 39
3.1.5.1. Motilitätstest auf Swimming-Agar...................................................... 39
3.1.5.2. Motilitätstest auf Twitching-Agar ....................................................... 39
3.1.6. Methoden zur Bestimmung von Typ III Sekretionssysten-Proteinen im
Überstand von Bakteriensuspensionen ................................................... 39
3.1.6.1. Vorbereitung der Proben................................................................... 40
3.1.6.2. SDS-Page......................................................................................... 40
3.1.6.3. Silbernitrat-Färbung .......................................................................... 41
3.1.6.4. Western Blot ..................................................................................... 41
3.2. Zellkultur....................................................................................................... 43
3.2.1. Zelllinie .................................................................................................... 43
3.2.2. Anzucht der Zellen................................................................................... 43
3.2.3. Einfrieren und Auftauen der Zellen .......................................................... 43
3.2.4. Lösen der Zellen...................................................................................... 44
3.2.5. Ermittlung der Zellzahl............................................................................. 44
3.2.6. Zytotoxizitäts-Assay................................................................................. 45
3.2.6.1. Versuchsprinzip ................................................................................ 45
3.2.6.2. Durchführung des Assays................................................................. 46
3.3. Mausmodell .................................................................................................. 48
3.3.1. Versuchstiere........................................................................................... 48
3.3.2. Infektion der Mäuse ................................................................................. 48
3.3.3. Verlaufsuntersuchungen der Infektion ..................................................... 48
3.3.4. Keimzahlbestimmung in Organen infizierter Mäuse ................................ 48
3.3.5. Histopathologische Diagnostik an Lunge und Nasopharynx infizierter
Tiere ........................................................................................................ 49
3.4. Arbeiten mit Caenorhabditis elegans......................................................... 50
3.4.1. Versuchstiere........................................................................................... 50
3.4.2. Kulturerhaltung ........................................................................................ 50
3.4.3. Herstellung der bakteriellen Nahrungsquelle........................................... 50
3.4.3.1. Futterplatten...................................................................................... 50
3.4.3.2. Pellets für Eipräparation.................................................................... 51
3.4.4. Eipräparation ........................................................................................... 51
3.4.5. Infektionsmodelle..................................................................................... 52
3.4.5.1. Slowkilling ......................................................................................... 52
3.4.5.2. Fastkilling .......................................................................................... 53
3.4.5.3. Killing in Flüssigkultur ....................................................................... 53
3.5. Molekularbiologische Arbeiten ................................................................... 54
3.5.1. Materialien............................................................................................... 54
3.5.2. Molekularbiologische Methoden .............................................................. 54
3.5.2.1. Übertragung von DNA durch Elektroporation.................................... 54
3.5.2.2. Mini-Plasmidpräparation ................................................................... 55
3.5.2.3. Präparation genomische DNA........................................................... 55
3.5.2.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR).................................................... 56
3.5.2.5. Agarose-Gelelektrophorese .............................................................. 57
4. Ergebnisse ........................................................................................58
4.1. Charakterisierung von P. aeruginosa small colony variants (SCVs) und dem jeweiligen klonalen Wildtyp (WT) im Zytotoxizitäts-Assay mit J774.A1-Makrophagen ................................................................................. 58
4.1.1. Vergleich der Zytotoxizität der autoaggregativen SCVs mit ihrem
klonalen WT ............................................................................................ 58
4.1.2. Vergleich der Zytotoxizität nicht-autoaggregativer SCVs mit ihrem
klonalen WT ............................................................................................ 60
4.2. Nachweis von Typ III-Sekretionssystem-Proteinen im Kulturüberstand von P. aeruginosa SCVs .............................................................................. 62
4.2.1. SDS-Gele mit anschließender Silbernitrat-Färbung................................. 62
4.2.2. SDS-Gele mit anschließendem Western Blot .......................................... 64
4.3. Überexpression des pvrR-Gens in P. aeruginosa SCVs........................... 66
4.3.1. Nachweis des pvrR-Gens nach Übertragung mittels Elektroporation in
den SCVs ................................................................................................ 66
4.3.2. Mikrobiologische Charakterisierung im Vergleich zu SCV und WT ......... 69
4.3.2.1. Koloniemorphologie .......................................................................... 69
4.3.2.2. Swimming motility ............................................................................. 71
4.3.2.3. Twitching motility und Autoaggregation ............................................ 73
4.3.3. Verhalten im Zytotoxizitäts-Assay im Vergleich zu SCV und WT ........... 74
4.4. Virulenzanalyse von zytotoxischen P. aeruginosa SCVs und den klonalen WT im BALB/c-Mausmodell nach intranasaler Infektion........... 77
4.4.1. Untersuchungen zur Morbidität und Mortalität ......................................... 77
4.4.2. Vergleich der Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz................................ 79
4.4.3. Vergleich der histopathologischen Veränderungen in Lunge und
Nasopharynx ........................................................................................... 81
4.5. Etablierung eines neuen C. elegans Pathogenitäts-Modells.................... 88
4.5.1. Vergleich der Abtötung von C. elegans durch SCV und WT ................... 88
4.5.2. Einfluss von exsA auf die Abtötung ......................................................... 91
4.5.3. Einfluss von ExoU auf die Abtötung ........................................................ 94
4.5.4. Abtötung von C. elegans durch P. aeruginosa CHA und ausgewählte
Mutanten ................................................................................................. 97
4.5.5. Abtötung von C. elegans durch PA 14 und PAO 1 ................................ 102
4.5.6. Vergleich der Abtötung von C. elegans durch P. aeruginosa TB und
ausgewählte Mutanten von TB .............................................................. 104
5. Diskussion ......................................................................................110
5.1. Autoaggregatives Verhalten von SCVs korreliert mit erhöhter Zytotoxizität durch erhöhte Typ III Sekretion .......................................... 110
5.2. Erhöhte Zytotoxizität von autoaggregativen SCVs korreliert mit erhöhter in vivo Pathogenität ................................................................... 114
5.3. Die Überexpression des pvrR-Gens führt zu einer teilweisen Wiederherstellung des WT-Phänotyps..................................................... 117
5.4. Eignung des neuen C. elegans-Modells als Tiermodell zum Screening bakterieller Mutanten ................................................................................. 120
5.5. Eignung des neuen C. elegans-Modells als Pathogenitätsmodell zur Messung von Typ III Sekretionssystem-vermittelter Virulenz................ 129
6. Zusammenfassung / Summary .....................................................133
7. Literaturverzeichnis .......................................................................137
8. Anhang............................................................................................168
8.1. Tabellen- und Abbildungsverzeichnis...................................................... 168
8.2. Geräte.......................................................................................................... 172
8.3. Gebrauchsmaterialien ............................................................................... 173
8.4. Medien und Zusätze................................................................................... 174
8.5. Puffer und Lösungen ................................................................................. 176
8.6. Chemikalien ................................................................................................ 178
8.7. Software...................................................................................................... 180
Danksagungen ....................................................................................................... 181
Veröffentlichung von Teilergebnissen..................................................................... 183
Abkürzungsverzeichnis........................................................................................... 184
Eidesstattliche Erklärung ........................................................................................ 186
Einleitung 11
1. Einleitung
Die Cystische Fibrose (CF, syn. Mukoviszidose) ist eine auf einem Defekt im CFTR
(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)- Gen beruhende, autosomal-
rezessiv vererbte Erkrankung. Eine der Folgen dieser Erkrankung ist eine gestörte
mukoziliäre Clearance in der Lunge und teilweise Verlegung von Atemwegen durch
Bildung eines zähen Sekrets. Dieses Habitat schafft optimale Bedingungen für eine
Kolonisation und Infektion der Lunge mit opportunistischen Keimen wie Hämophilus
influenzae und Staphylococcus aureus in frühen Krankheitsstadien, sowie
Pseudomonas aeruginosa bei älteren Patienten mit chronischen Lungeninfektionen
(GOVAN u. DERETEC, 1996). P. aeruginosa stellt den Hauptgrund für Morbidität
und Mortalität bei älteren Mukoviszidosepatienten dar.
Unterschiedliche Virulenzfaktoren werden mit dem Versagen der Lungenfunktion bei
CF-Patienten in Verbindung gebracht. Bei P. aeruginosa wird die Fähigkeit zur
Bildung von Biofilmen diskutiert, da sich im Rahmen einer chronischen Infektion in
der CF-Lunge mukoide Phänotypen bilden, die entscheidend zur Biofilmbildung
beitragen (POSCHET et al., 2001). Eine besondere Bedeutung der sogenannten
SCVs (small colony variants), kleinwüchsigen Varianten von P. aeruginosa, wird
diskutiert (HÄUSSLER et al. ,1999a; DRENKARD u. AUSUBEL, 2002). Diesen SCVs
wird eine erhöhte Resistenz gegenüber antibiotisch wirksamen Substanzen
zugeschrieben. Ihre Bedeutung in der Pathogenese der CF-Lunge ist allerdings
bisher ungeklärt. HÄUSSLER et al. beschrieben 2003 eine Subgruppe von SCVs, die
befähigt war, im Vergleich zu den jeweiligen klonalen Wildtyp-Phänotypen (WT)
vermehrt Biofilm zu produzieren, sie wiesen vermehrt Pili auf und zeigten verstärktes
autoaggregatives Verhalten und größere Adhärenz an Oberflächen. Genexpressions-
Analysen eines Vertreters dieser Subgruppe durch VON GÖTZ (2003) ergaben, dass
die untersuchte SCV im Vergleich zum WT unter anderem eine Überexpression der
Gene zeigte, die für die Struktur und Funktion eines Typ III Proteinsekretionssystems
nötig sind. Diese Typ III Sekretion stellt einen bedeutenden Virulenzfaktor von P.
aeruginosa dar. Sie befähigt die Bakterien dazu, über eine Art Nadelstruktur oder
Pore Toxine direkt in die Wirtszelle zu schleusen.
Einleitung 12
Im Rahmen dieser Studie sollte unter Verwendung eines Zellkultur-Modells zum
einen geklärt werden, ob diese verstärkte Expression der Typ III Gene eine
funktionelle Rolle spielt und zum anderen sollte untersucht werden, ob die erhöhte
Typ III Sekretion nur ein Phänomen dieses einzelnen Vertreters ist oder auch andere
SCVs ein ähnliches Expressions-Profil zeigen. Des Weiteren sollte mit einem
Mausmodell geklärt werden, in wie weit eine erhöhte Typ III Sekretion bei SCVs in
vivo eine Rolle spielt. Ein dritter Punkt dieser Studie war es, ein Caenorhabditis
elegans – Modell zu etablieren, mit dem es im Gegensatz zu den bestehenden
Modellen möglich ist, Typ III Sekretions-vermittelte Virulenz zu detektieren.
Schriftum 13
2. Schriftum
2.1. Taxonomie und allgemeine Eigenschaften von P. aeruginosa
Die Gattung Pseudomonas wurde von MIGULA 1894 zum ersten Mal beschrieben
(MIGULA 1894). Als Pseudomonaden wurden lange Zeit alle stäbchenförmigen,
polar begeißelten und gramnegativen Bakterien zusammengefasst. Aufgrund dieser
unspezifischen morphologischen Merkmale galt die Gattung Pseudomonas lange
Zeit als Auffangbecken für unvollständig charakterisierte, bewegliche Bakterien
(STANIER et al., 1966). Die zunächst ausschließlich auf phänotypischen Merkmalen
beruhende Klassifizierung wurde später durch molekularbiologische
Untersuchungsmethoden ergänzt, wodurch eine Einteilung in fünf Gruppen erfolgte.
Dabei dienten die 16S rRNA-Gene als Markermoleküle für die phylogenetische
Zugehörigkeit. Alle fünf Gruppen werden den Proteobakterien zugeordnet; die
Mitglieder der RNA-Homologiegruppe I, neben P. aeruginosa z.B. auch
P. fluorescens, P. putida und P. syringae, werden als Pseudomonaden im engeren
Sinne bezeichnet und gehören zu den γ-Proteobakterien (ANZAI et al., 2000). Die
Pseudomonaden im weiteren Sinne aus den Gruppen II bis V wurden nach und nach
unterschiedlichen Gattungen zugeordnet. So beinhalten die RNA-Gruppen II und III
heute die Gattungen Acidovorax (WILLEMS et al. 1990, 1992) und Burkholderia
(YABUUCHI et al. 1992) und einige Arten der Gruppe IV gehören zur Gattung
Brevundimonas (SEGERS et al., 1994).
P. aeruginosa gehört durch seine Vielseitigkeit in der Substratverwertung und das
lange Überleben unter extrem nährstoffarmen Bedingungen zu den
anspruchslosesten Bakterien überhaupt und kommt ubiquitär in einer Vielzahl von
Boden- und Wasserhabitaten in der freien Natur und in der direkten Umgebung des
Menschen vor (SPIERS et al., 2000). P. aeruginosa ist aber auch in der Lage,
Menschen, Tiere und Pflanzen zu besiedeln. Unter anderem können Leitungswasser,
Waschbecken, Kosmetika und Lebensmittel mögliche Infektionsquellen darstellen.
Schriftum 14
P. aeruginosa betreibt Energiegewinnung durch Oxidation organischer Substanzen
mit molekularem Sauerstoff als Elektronenakzeptor. Des Weiteren ist P. aeruginosa
in der Lage, Elektronen auf oxidierte Stickstoffverbindungen (NO2-, NO, N2O) oder
Arginin zu übertragen und so auch unter anaeroben Bedingungen zu wachsen
(STANIER et al., 1966). Insgesamt sind die Ansprüche an die Kulturbedingungen
äußerst gering, die Generationszeit beträgt bei einer idealen Temperatur von 37°C
ca. 20 min. Auch bei 42°C ist noch Wachstum möglich, jedoch nicht bei 4°C. Auf
festen Nährböden bildet P. aeruginosa charakteristische, flache, an den Rändern
leicht ausgefranste Kolonien. Neben der glatten, glänzenden S-Form kann auch die
trockene, granulierte R-Form auftreten. Bei manchen Stämmen zeigen sich
metallisch glänzende, eingesunkene Flecken, seltener kommen extrem schleimige
Varianten vor. Letzteres ist vor allem bei Isolaten aus Mukoviszidose-Lungen der
Fall. Das schleimige Aussehen entsteht durch Alginat, ein Polymer aus Mannuron-
und Guluronsäure, welches von den Bakterien zum Schutz vor äußeren Einflüssen
gebildet wird. P. aeruginosa ist sowohl Katalase- als auch Oxidase-positiv, der
typische, süßlich-aromatische, „lindenblütenartige“ Geruch wird durch o-
Aminoacetophenon verursacht. In flüssigen Nährmedien wächst der Keim
vorwiegend an der Oberfläche, wo er eine Kahmhaut bildet. Zwei Pigmente sind
charakteristisch für P. aeruginosa: das gelbgrüne, wasserlösliche Fluoreszein, auch
Pyoverdin genannt, das auch bei anderen Pseudomonaden vorkommt, und das
blaugrüne, chloroformlösliche Phenazinderivat Pyocyanin, welches ausschließlich
von P aeruginosa produziert wird. Manche Stämme bilden weitere Pigmente, wie
z.B. das rötliche Pyorubin oder das bräunliche Pyomelanin. Weiterhin verfügt P.
aeruginosa über Geißeln, Fimbrien und Pili, die ihm Motilität und Adhäsion
ermöglichen (HAHN, 1999).
Die hohe Anpassungsfähigkeit an wechselnde Umweltbedingungen sowie die
Vielseitigkeit in der Substratverwertung spiegeln sich in der Größe und
Zusammensetzung des Genoms wieder. P. aeruginosa PAO1 besitzt mit 6,3 Mb das
größte Genom sowie den mit ca. 9% höchsten Anteil an regulatorisch wirkenden
Schriftum 15
Genen unter den bisher bekannten, vollständig sequenzierten Bakteriengenomen
(STOVER et al., 2000).
2.2. Pathogenität und Virulenzmechanismen von P. aeruginosa
P. aeruginosa gilt als opportunistischer Keim mit human-, tier- und
pflanzenpathogenem Potential und gehört zu den am zweithäufigsten
vorkommenden gram-negativen Verursachern nosokomialer Infektionen nach
Escherichia coli (SCHAAL u. v. GRAEVENITZ, 1994). Liegt keine lokale oder
systemische Schwächung des Immunsystems vor, verläuft eine Kolonisation des
Menschen mit P. aeruginosa meist harmlos (AEBI et al., 2001). Es kommt jedoch zu
einer folgenschweren Infektion, wenn Patienten kolonisiert werden, die an Cystischer
Fibrose (CF) erkrankt oder immunsupprimiert sind, größere Verbrennungen erlitten
haben oder sonstige Störungen der Haut- oder Schleimhautbarriere aufweisen. Als
so genannter „Nass- oder Pfützenkeim“ besiedelt P. aeruginosa im Krankenhaus
unter anderem Waschbecken, Luftbefeuchter, Schläuche von Beatmungs- und
Infusionsgeräten, Säuglingsinkubatoren, Desinfektionsmittel (quartenäre
Ammoniumverbindungen) und Blumenvasen. P. aeruginosa ist in Europa und
Nordamerika verantwortlich für 16 % der nosokomialen Pneumonien durch künstliche
Beatmung (WIBLIN, 1997), 12% der im Hospital erworbenen Harnwegsinfektionen
durch chirurgische Eingriffe am Urogenitaltrakt oder durch Dauerkatheter (POLLACK,
1995), 8 % der Wundinfektionen nach chirurgischen Eingriffen (KLUYTMANS, 1997)
und 10 % der Sepsisfälle (GORDON et al., 1998). Patienten, die durch eine
Knochenmarkstransplantation oder ein Krebsleiden mit Neutropenie extrem
immunkompromittiert sind, zeigen sich besonders anfällig gegenüber Infektionen mit
opportunistischen Erregern. In dieser Gruppe von Patienten sind Pneumonien und
Sepsisfälle nach Infektion mit P. aeruginosa für 30 % der Todesfälle verantwortlich
(FERGIE ei al., 1994). Auf Stationen mit Verbrennungsopfern können Ausbrüche von
Infektionen mit P. aeruginosa zu 60 % Letalität führen (RICHARD et al., 1994). Hier
Schriftum 16
bietet nicht nur die lokale Zerstörung der Hautbarriere, sondern auch der begleitende
immunsuppressive Effekt einer Verbrennung dem Erreger ideale Bedingungen für
eine zunächst lokale und später systemische Ausbreitung (DERETIC, 2000).
P. aeruginosa produziert eine ganze Reihe von Virulenzfaktoren, die für die
Entstehung lokaler Gewebsläsionen, die Invasion und Verbreitung der Bakterien und
die Zerstörung verschiedener Bestandteile der Immunabwehr mit verantwortlich sind.
Zu nennen sind hier zwei Proteasen – Alkalische Protease und Elastase. Die
Beteiligung der Alkalischen Protease an Gewebsinvasion und systemischer Infektion
ist nicht geklärt, bei Infektionen der Kornea scheint sie jedoch eine zentrale Rolle zu
spielen (HOWE u. IGLEWSKI, 1984). Elastin ist ein wichtiger Bestandteil von
Lungengewebe und Blutgefäßen und bedingt in beiden Organen die Elastizität und
Widerstandsfähigkeit des Gewebes. Daher ist die Fähigkeit Elastin zu spalten ein
bedeutsamer Virulenzfaktor bei akuten Infektionen. Die beiden Elastasen LasA und
LasB wirken synergistisch (GALLOWAY, 1991), im Mausmodell wurde
nachgewiesen dass LasB-defiziente Mutanten deutlich weniger invasiv waren als der
LasB-produzierende Elternstamm (TAMURA et al., 1992). Elastase spaltet nicht nur
Elastin sondern auch Kollagen (HECK et al., 1986), inaktiviert Bestandteile des
Immunsystems wie Immunglobulin A (HECK et al., 1990), Lysozym (JACQUOT,
1985), Komplementkomponenten (HONG u. GHEBREHIWET, 1992) und
Substanzen, die am Schutz des Respirationstraktes vor Proteasen beteiligt sind, wie
den humanen Alpha1 Proteaseinhibitor (MORIHARA et al., 1979).
P. aeruginosa produziert die beiden Hämolysine Rhamnolipid und Phospholipase C.
Phospholipase C spaltet Lipide und Lecithin. Rhamnolipid ähnelt von seiner Struktur
her einem Detergenz, vermutlich löst es die Phospholipide des Lungensurfactant und
macht sie so einer Spaltung durch Phospholipase C zugänglich. Außerdem inhibiert
es den mukoziliären Transport (READ et al., 1992).
Exotoxin A ist einer der Hauptvirulenzfaktoren von P. aeruginosa. Ebenso wie andere
Exoprodukte verursacht es lokale Gewebsläsionen und trägt zur Invasivität der
Bakterien bei, aufgereinigtes Exotoxin A ist tödlich für Mäuse (WOODS u.
Schriftum 17
IGLEWSKI, 1983). Das Toxin ist verantwortlich für die Inaktivierung des
Elongationsfaktors 2 in der Proteinbiosynthese, was zu einer Unterbrechung der
Synthese im Stadium der Verlängerung der Polypeptidkette führt. Dies
Unterbrechung führt letzten Endes zum Zelltod (IGLEWSKI u. KABAT, 1975;
IGLEWSKI et al., 1977). Das Strukturgen toxA wird von RegA positiv transkriptionell
reguliert; die Menge des sezernierten Exotoxin A hängt vom jeweiligen
Bakterienstamm (BJORN et al., 1979) und, neben anderen Umweltfaktoren, von der
Eisenkonzentration in der Umgebung ab. Mehr als 5µM Eisen im Medium reduziert
die Exotoxin A-Produktion in vitro beträchtlich (BJORN et al., 1979). Die Bedeutung
von Exotoxin A bei systemischen Infektionen zeigt sich darin, dass Patienten mit
einem hohen Antikörpertiter gegen Exotoxin A eine deutlich höhere
Überlebenschance bei einer P. aeruginosa-Bakteriämie haben (CROSS et al., 1980).
Außerdem inhibiert Exotoxin A in vitro die Proliferation von B-Zellen sowie die
Produktion von Immunglobulin G und M und hat somit möglicherweise einen
immunsuppressiven Effekt (VIDAL et al., 1993).
Das Pigment Pyocyanin ist für die charakteristische blau-grüne Koloniefärbung auf
bestimmten Selektivmedien verantwortlich und wirkt toxisch auf den Fadenwurm
Caenorhabditis elegans (MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999) und induziert Apoptose bei
neutrophilen Granulozyten (USHER et al., 2002). In vitro wurden eine Vielzahl von
Auswirkungen auf humane Lungenepithelzellen nachgewiesen: so führt das redox-
aktive Pyocyanin über die Bildung von Superoxid und Wasserstoffperoxid zu
oxidativem Stress in der Zelle und somit wahrscheinlich zum Zelluntergang
(GARDNER, 1996). Es inhibiert die zelluläre Katalase-Aktivität (O’MALLEY et al.,
2003b), inaktiviert, ebenso wie Elastase, den humanen Alpha1 Proteaseinhibitor
(BRITIGAN et al. 1999), führt zu ATP-Abnahme in der Zelle (O’MALLEY et al.,
2003a) und erhöht die Freisetzung von Interleukin 8, einem Chemoattraktant für
neutrophile Granulozyten (DENNING et al., 1998). In den Luftwegen von Schafen
induzieren Pyocyanin und 1-hydroxy-Phenazin Entzündungsreaktionen mit
Neutrophilie, was vermutlich auf die erhöhte Produktion von chemoattraktiven
Substanzen zurückzuführen ist (LAUREDO et al., 1998). In pulmonalen
Schriftum 18
Arterienendothelzellen unterdrückt Pyocyanin die Freisetzung von Prostacyclin,
möglicherweise eine Erklärung dafür, dass bei einer durch P. aeruginosa
verursachten Vasculitis das Endothel relativ lange intakt bleibt, während die äußeren
Schichten der Gefäßwand bereits stark in Mitleidenschaft gezogen sind (KAMATH et
al.,1995).
Siderophore werden zu den passiven Pathogenitätsfaktoren gerechnet. Eisen ist
Bestandteil vieler essentieller Enzyme, so dass ca. 105 Eisenionen pro Bakterienzelle
benötigt werden. (BRAUN, 2001). P. aeruginosa bildet die beiden Fe(III)-Siderophore
Pyoverdin und Pyochelin, um mit hoher Affinität extrazellulär vorliegendes Eisen zu
binden und aufzunehmen (COX ,1980; COX et al., 1981), und kann so auch unter
Eisenmangelbedingungen, wie sie unter anderem im menschlichen Körper
herrschen, existieren. Zudem verwendet P. aeruginosa die beiden Systeme has und
phu, um Häm-gebundenes Eisen in die Zelle zu transportieren (OCHSNER et al.,
2000). Die verschiedenen Mechanismen zur Eisenaufnahme werden vom negativen
Regulatorprotein Fur kontrolliert (VASIL u. OCHSNER, 1999). Siderophore spielen
außerdem möglicherweise eine Rolle beim Entstehen des Entzündungsprozesses,
da pyochelingebundenes Eisen die Bildung von Hydroxylradikalen katalysiert
(COFFMAN et al., 1990).
Neben den Virulenzfaktoren, die in die Umgebung abgegeben werden, verwendet
P. aeruginosa ein Typ III Sekretionssystem, um Effektorproteine in die eukaryotische
Zielzelle zu injizieren. Der Sekretionsapparat besteht aus Translokatorproteinen, die
eine Nadelstruktur oder Pore bilden, durch die bei direktem Zellkontakt
Effektorproteine in das Zytoplasma des Wirts geschleust werden (FRANK, 1997;
GALAN u. COLLMER, 1999; CORNELIS u. VAN GIJSEGEM, 2000). Zu den
Effektorproteinen gehören Exoenzym S (ExoS) und Exoenzym T (ExoT), die von
P. aeruginosa meist als Aggregat sezerniert werden (COBURN, 1992). ExoS und
ExoT haben ebenso wie Exotoxin A ADP-ribosylierende Eigenschaften, aber andere
Zielmoleküle. In vitro werden diverse Proteine von ExoS und ExoT ribosyliert,
darunter Crk I und II, die eine Rolle in der Signaltransduktion bei der Phagozytose
von Bakterien spielen (BARBIERI, 2000). Eine ExoS-defiziente Mutante zeigt im
Schriftum 19
Tiermodell verglichen mit dem Wildtyp eine verminderte Invasivität (NICAS et al.,
1985a) sowie eine weniger umfangreiche Zerstörung von Lungengewebe (NICAS et
al., 1985b). Weitere Effektorproteine sind ExoU, ein akut wirkendes Cytotoxin,
welches Epithelläsionen verursacht (FINCK-BARBANCON et al., 1997), und die
Adenylatcyclase ExoY, die in der Zielzelle eine Anreicherung von cAMP induziert
(YAHR et al., 1998). Der eigentliche Sekretionsapparat wird durch die
Translokatorproteine PopB und PopD gebildet. Diese Translokatorproteine haben
zum einen die Funktion, Poren zur Translokation der Effektorproteine in der
Wirtszellmembran zu bilden (FRITHZ-LINDSTEN et al., 1998), andererseits wirken
sie bereits durch die Bildung dieser Pore zytotoxisch (DACHEUX et al., 2001b). Die
genaue Rolle des ebenfalls vorhandenen PcrV ist bisher nicht vollständig geklärt
(SCHOEHN et al., 2003). Versuche mit monoklonalen Antikörpern gegen PcrV in
einem Mausmodell konnten eine Protektion bei Sepsis zeigen und die Mortalitätsrate
deutlich senken (FRANK et al., 2002).
Abb. 1
periplasmatischer Raum
äußere Bakterienmembran
Zytoplasma Bakterium
innere Bakterienmembran
translozierte Effektorproteine
Zytoplasma Zielzelle
Membran der Zielzelle
Abb. 1: Schematische Darstellung des Typ III Sekretionssystems gramnegativer Bakterien (aus der Arbeit von C. Rappl, Ludwig-Maximilians-Universität München, 2001).
Schriftum 20
2.3. Verbreitung von P. aeruginosa bei Tieren
Aufgrund des breiten Wirtsspektrums von P. aeruginosa können sowohl Nutztiere als
auch Haus- und Zootiere, insbesondere Reptilien, von einer Infektion betroffen sein.
Sie treten gehäuft bei Jungtieren und als Sekundärinfektionen auf, da ebenso wie
beim Menschen eine geschwächte Abwehrlage Vorrausetzung für die Invasion des
Erregers ist (SELBITZ, 1992). P. aeruginosa ist bei Tieren an verschiedenen lokalen
Infektionen beteiligt, septische Allgemeininfektionen sind seltener und führen in der
Regel zum Tod des Tieres (MAYR et al., 2001).
Beispiele für lokale Infektionen sind Wundinfektionen bei allen Arten, Abszesse,
Infektionen des Respirationstraktes, chronisch purulente Otitis externa beim Hund,
ulzerative Keratitis bei Hund und Pferd, Stomatitiden bei Reptilien und
Genitalinfektionen mit möglichem Abort bei der Stute. Harnwegsinfektionen bei Hund
und Katze sind in der Regel die Folge tierärztlicher Manipulationen wie z.B.
Katheterisierung (ATHERTON u. PITT, 1982). Durch P. aeruginosa hervorgerufene
Mastitiden kommen bei der Ziege (BOSTEDT u. DEDIÉ, 1996), seltener beim Rind
(GRUNERT, 1996) vor. Die Erkrankung entsteht galaktogen und kann auch
enzootisch auftreten. Sie verläuft beim Rind lokal akut, (meistens) chronisch-
rezidivierend oder subklinisch, bei der Ziege in der Regel akut eitrig, manchmal
gangränös. Sie kann sich aber auch zur systemischen Infektion entwickeln und in
den schwersten Fällen tödlich enden. Beim Rind sind häufig Betriebe betroffen, die
als Desinfektionsmittel für die Melkgeräte quaternäre Ammoniumsalze benutzen
(KLASTRUP, 1994). Bei Schafen wird die sogenannte Vliesfäule durch P. aeruginosa
verursacht. Der Keim kommt bei gesunden Schafen auf der Haut und im Vlies vor.
Bleibt dieses für mehrere Tage feucht. bildet die Mischung aus abgeschilferten
Epithelzellen, Schweißdrüsenexsudat und Hautfett ein ideales Nährmedium, das den
Pseudomonaden eine rasche Vermehrung ermöglicht. Empfängliche Tiere
entwickeln eine exsudative Dermatitis, die zu einer Verfärbung der Wolle und in
dessen Folge zu wirtschaftlichen Verlusten führen kann (PLANT, 2000).
Schriftum 21
Septische Allgemeininfektionen kommen vor allem beim Geflügel, Nerz, Chinchilla
und bei Laborratten vor (GYLES, 1993). Beim Geflügel sind besonders Küken, die
sich über Tränksysteme, Brutschränke oder kontaminierte Injektionsspritzen
infizieren können, betroffen (SIEGMANN, 1993). Chinchillas können neben der akut
septikämischen auch eine mehr chronisch lokalisierte Form der Infektion entwickeln,
bei der sich die Erkrankung bevorzugt in Darm, Uterus, Harnwegen und Haut
manifestiert. Die Prognose ist in beiden Fällen zweifelhaft bis ungünstig (EGEN u.
ERNST, 1998).
2.4. P. aeruginosa und CF
2.4.1. Allgemeines Die Cystische Fibrose (CF) ist die zweithäufigste, autosomal rezessiv vererbte
Erkrankung der weißen (kaukasischen) Bevölkerung, an der weltweit über 60.000
Menschen leiden (RAJAN u. SAIMAN, 2002). In Europa und Amerika erkrankt ca. 1
Kind von 2000 bis 1 von 4500 (KOCH u. HØIBY, 1993). Die CF beruht auf einem
Gendefekt im cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR (BEAR et
al., 1992). CFTR ist ein Chlorid-ABC Transporter mit zusätzlichen Funktionen
regulatorischer Natur (TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999). Die häufigste Mutation (~ 70%)
ist die inframe 3-Basenpaar-Deletion im CFTR-Gen (F508), welche zum Verlust der
Aminosäure Phenylalanin an Position 508 führt (PIER, 1998; TÜMMLER u. KIEWITZ,
1999). Die Abwesenheit von CFTR in der apikalen Membran von Epithelzellen
bewirkt einerseits die Verringerung der Cl--Sekretion und andererseits die
beschleunigte Na+-Absorption durch die wegfallende inhibitorische Wirkung von
CFTR auf den epithelialen Na+-Kanal (ENaC) (BEAR et al., 1992; STUTTS et al.,
1995). Die dabei entstehende Dysregulation des Na+ und Cl--Haushalts bewirkt eine
erhöhte Viskosität epithelialer Sekrete. Auf klinischer Ebene sind die
Hauptcharakteristika der CF-Erkrankung – aufgrund von Obstruktionen in den
Organen durch Bildung eines wasserarmen, hoch viskösen Sekretes – Malabsorption
Schriftum 22
(entsprechend der exokrinen Pankreasinsuffizienz), Beeinträchtigung der
Lungenfunktion mit rezidivierenden bakteriellen Infektionen, zunehmender
Salzverlust im Schweiß und männliche Infertilität durch Stenose in den Vasa
deferentia (KOCH u. HØIBY, 1993). Auch das hepatobiliäre System ist betroffen
(TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999). Während die exokrine Pankreasinsuffizienz durch
Enzymsubstitution nicht mehr den limitierenden Faktor darstellt und die meisten
Patienten das Erwachsenenalter erreichen, ist und bleibt heute die CF-Lunge
aufgrund der chronischen Infektionen die Hauptrsache für die Morbidität und
Mortalität der Erkrankung (GOVAN u. DERETIC 1996; TÜMMLER u. KIEWITZ 1999;
RAJAN u. SAIMAN 2002).
Die Luftwege von CF-Patienten werden hauptsächlich mit opportunistischen Erregern
– besonders S. aureus und H. influenzae im frühen Lebensalter und P. aeruginosa
und Vertretern des Burkholderia cepacia-Komplexes im späteren Lebensalter –
besiedelt und infiziert (TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999). Neben diesen Erregern
werden weitere Mikroorganismen wie Moraxella catarrhalis, Stenotrophomonas
maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans, Burkholderia gladioli, Mitglieder der Familie
Enterobacteriaceae (KNOWLES, 2000), atypische Mykobakterien (KILBY et al.,
1992), sowie Aspergillus fumigatus (GILLIGAN, 1991) im Respirationstrakt
vorgefunden.
P. aeruginosa ist der häufigste und verbreitetste Lungeninfektionserreger in CF-
Patienten und wird deshalb auch als CF-Leitkeim bezeichnet (SMITH et al., 1996;
LYCZAK et al., 2002). Bei 75-90% der Patienten entsteht eine chronische Infektion
mit diesem Bakterium (PIER, 2000). In Krankenhäusern stellen Waschbecken,
Toiletten und Duschen, aber auch das Klinikpersonal und bereits infizierte Patienten
ein Infektionsrisiko dar (SCHAAL u. v. GRAEVENITZ, 1994). Studien von RÖMLING
et al. (1994) haben gezeigt, dass Infektionen mit P. aeruginosa beinahe überall in der
Umwelt stattfinden können. Das heißt, nicht nur das Krankenhaus stellt ein Risiko
dar, sondern auch die häusliche Umgebung der Patienten. Die meisten Patienten
werden in der Schulzeit oder der frühen Pubertät kolonisiert (TÜMMLER u. KIEWITZ,
Schriftum 23
1999). Ist die CF-Lunge chronisch infiziert, können die meisten Chemotherapeutika
die Bakterien nicht mehr vollständig eliminieren (DERETIC, 2000).
Man geht davon aus, dass eine Besiedelung der Lunge mit P. aeruginosa nach
erfolgreicher Infektion mit Erregern wie S. aureus oder H. influenzae stattfindet,
wobei P. aeruginosa diese Keime verdrängt (DERETIC, 2000).
In der CF-Lunge ist eine Senkung der mukoziliären Clearance und somit eine
Störung in der primären natürlichen Abwehr der Lunge vorzufinden. Über die
Pathogenese und die hohe Empfänglichkeit für chronische Infektionen gibt es heute
mehrere Hypothesen. Einige dieser Hypothesen stellen eine besondere Adhärenz
von P. aeruginosa an CF-Epithelzellen in den Vordergrund (de BENTZMANN et al.,
1996), eine verschlechterte Internalisierung und Abschilferung von P. aeruginosa
enthaltenden Epithelzellen durch Abwesenheit von CFTR (PIER et al., 1996) oder
eine Inaktivierung der Salz-sensiblen Defensine in der ASL (airway surface liquid)
(GOLDMANN et al., 1997). Eine neuere Hypothese geht von speziellen
Wachstumsbedingungen für die Bakterien in der CF-Lunge aus. Diese sind eng mit
der bei CF veränderten Zusammensetzung des ASL verknüpft. Es wird vermutet,
dass es zu einer Volumenabnahme der die Zilien umgebenden Flüssigkeit durch
erhöhte Absorption von Natrium-Ionen und einer Senkung in der Sekretion der
Chlorid-Ionen kommt. Die ASL, welche die Lungenoberfläche bedeckt, besteht aus
einer Mukusschicht (stark vernetzte, hoch glykosylierte Proteine) und einer
periziliären Flüssigkeitsschicht. Die periziliäre Flüssigkeitsschicht auf der
Zelloberfläche umgibt die Zilien des Flimmerepithels und ist von niedriger Viskosität,
in der sich die Zilien schnell bewegen können. Zusätzlich schützt sie die
Epithelzelloberfläche vor der darüberliegenden Mukusschicht. Besteht eine
physiologische Funktion, so fängt das mukoziliäre Clearance-System mit der
Mukusschicht fremde inhalierte Partikel und Mikroorganismen ab und transportiert
diese zum Nasopharynx, wo sie abgeschluckt oder abgehustet werden (KOCH u.
HØIBY, 1993; KNOWLES u. BOUCHER, 2002; LYCZAK, 2002). Durch die
chronische Volumenabnahme der periziliären Flüssigkeitsschicht kommt es
vermutlich zu einer Interaktion zwischen der Mukusschicht mit der
Epithelzelloberfläche und es bilden sich dicke Mucusplaques. Hierdurch kommt es
Schriftum 24
zur Störung der Zilienbewegung, was eine Reduktion der Clearancerate zur Folge
hat (KNOWLES u. BOUCHER, 2002). Da die Mucin-Sekretion unverändert bleibt,
kommt es zu einem Dickenzunahme der Mucus-Schicht.
Inhalierte P. aeruginosa gelangen aktiv (flagelläre Motilität) und/oder passiv
(Turbulenzen der Mukusoberfläche) in die Mukusmasse, bilden dort Mikrokolonien
und reduzieren hier den Sauerstoffgehalt. Beim anschließenden anaeroben
Wachstum verwenden sie vermutlich Nitrit als terminalen Elektronenakzeptor
(HASSETT et al., 1999; WORLITZSCH et al., 2002). P. aeruginosa passen sich also
den veränderten Lebensbedingungen in der CF-Lunge an, indem sie die Fähigkeiten
besitzen, Mikrokolonien in anaeroben Mukusplaques bilden zu können
(WORLITZSCH et al., 2002). Diese Hypothese wird durch Untersuchungen an
humanen Lungenpräparaten (BALTIMORE et al., 1989; WORLITZSCH et al., 2002)
sowie durch Studien an Tiermodellen (NIEDERMAN et al., 1983; MARCUS u.
BAKER, 1985) unterstützt. Dazu passen Beobachtungen, dass P. aeruginosa unter
niedrigen O2-Partialdrücken bzw. mikroaerophilen Bedingungen gut wächst und unter
anaeroben Bedingungen besonders dicke Biofilme ausbildet (YOON et al., 2002).
Biofilme schützen P. aeruginosa vor der Immunantwort ihres Wirts, da
opsonisierende Antikörper und Phagozyten wenig Angriffsfläche finden (HØIBY et
al., 2001). Außerdem vermitteln sie eine erhöhte Resistenz gegen Antibiotika
(HANCOCK, 1998).
2.4.2. Phänotypische Variationen von P. aeruginosa bei CF
Die meisten CF-Patienten sind mit einem P. aeruginosa Genotyp chronisch infiziert
(BREITENSTEIN et al., 1997), die Isolate können jedoch unterschiedliche Kolonie-
Morphologien aufweisen. Dieses Verhalten wurde von ZIERDT u. SCHMIDT bereits
1964 als “dissoziatives Verhalten“ beschrieben. CF-assoziierte Isolate sind oft
mukoid, was auf einer Überproduktion von Alginat aufgrund einer Mutation im
Regulatorprotein MucB beruht. Diese Mutation kann zum Beispiel durch
Sauerstoffradikale induziert werden, die von PMNs während der inflammatorischen
Antwort gebildet werden (GOVAN u. DERETIC, 1996). Auch sind CF-Isolate meist
nicht motil aufgrund fehlender Typ IV Pili oder Flagellen (LUZAR et al., 1985). Das
Schriftum 25
Fehlen von Typ IV Pili und Flagellen kann auch bei P. aeruginosa in Biofilmen
beobachtet werden (WHITELEY et al., 2001). Außerdem zeigen CF-Isolate eine
verminderte Virulenz bei akuten respiratorischen Infektionen im Maus-Modell
(LUZAR u. MONTIE, 1985).
Zu Beginn werden CF-Patienten mit dem nicht-mukoiden Phänotyp, wie er ubiquitär
in der Umwelt zu finden ist, kolonisiert (PIER, 1998). Im Laufe der Erkrankung
tendiert das Bakterium dazu, zum mukoiden Phänotyp zu konvertieren und so
vermutlich die chronische Infektionsphase für die CF-Patienten einzuleiten (KOCH u.
HØIBY, 1993; LYCZAK et al., 2002). Somit beherbergen die meisten Patienten den
nicht-mukoiden Phänotyp nur für eine kurze Periode und den mukoiden Phänotyp für
Jahre (PIER, 1998). Selten wird der mukoide Phänotyp von P. aeruginosa bei
anderen Infektionen als CF vorgefunden (DERETIC, 2000).
Neben dem mukoiden wurde ein weiterer Morphotyp von P. aeruginosa mit CF in
Verbindung gebracht. Dieser wird aufgrund der Bildung von extrem kleinen Kolonien
als small colony variant (SCV) beschrieben.
SCVs sind bei P. aeruginosa schon länger bekannt (BAYER, 1989). Ähnliche
Morphotypen wurden auch bei einer Reihe weiterer bakterieller Erreger, wie S.
aureus (LACEY, 1969; BULGER, 1969), Salmonella Typhimurium (SASARMAN et
al., 1970), Klebsiella pneumoniae (MURRAY u. MOELLERING, 1982), Escherichia
coli (ROGGENKAMP et al., 1998) und Burkholderia pseudomallei (HÄUSSLER et al.,
1999b) beobachtet. Für die meisten dieser SCVs wird eine Einschränkung des
aeroben respiratorischen Systems oder genauer der Häm Biosynthese angenommen
(ROGGENKAMP et al., 1998). Die SCVs von S. aureus und E. coli sind neben den
SCVs von P. aeruginosa am besten charakterisiert, ihr Auftreten korreliert ebenfalls
mit chronischen Infektionen (ROGGENKAMP et al., 1998). SCVs von E. coli und S.
aureus weisen eine Auxotrophie gegenüber Menadion oder Hämin auf, was in diesen
Arten darauf hindeutet, dass das verlangsamte Wachstum auf eine Beeinträchtigung
der Biosynthese von Menachinon und Cytochromen, beides essentielle Bestandteile
der Elektronentransport-Kette, zurückzuführen ist. In der Tat zeigte eine in vitro
Mutante des für die Häm-Biosynthese essentiellen hemB Gens in S. aureus einen
Schriftum 26
SCV-Phänotyp (VON EIFF et al., 1997; VAUDAUX et al., 2002), was ebenfalls für ein
hemB-defizientes klinisches Isolat von E. coli der Fall war (ROGGENKAMP et al.,
1998). Mutationen im hemB Gen verursachen also eine Beeinträchtigung des
Energiestoffwechsels und sind eine mögliche Ursache für das Auftreten von SCVs in
S. aureus und E. coli.
Entsprechende metabolische Beeinträchtigungen konnten für die P. aeruginosa
SCVs nicht gefunden werden, Hämin und Menadion im Medium konnten die
Koloniegröße der SCVs nicht verändern. HÄUSSLER et al. (1999a) untersuchten
Isolate von CF-Patienten, die in einem Zeitraum von 2 Jahren regelmäßig in der
Pädiatrie und CF-Klinik der Medizinischen Hochschule Hannover betreut wurden.
Von diesen 86 P. aeruginosa positiven Patienten waren 33 mit SCVs kolonisiert.
Patienten, bei denen SCVs isoliert wurden, wiesen eine stärkere Beeinträchtigung
ihrer Lungenfunktion auf als Patienten ohne SCVs. Außerdem bildeten SCVs eine 2
bis 8-fach höhere Resistenz gegenüber gebräuchlichen Antibiotika (Aminoglykoside,
Quinolone, β-Lactame, Colistin) aus, die zur Behandlung von CF-Patienten
eingesetzt werden. Der durch Antibiotikagabe verursachte selektive Druck könnte
u.a. für das Entstehen von SCVs verantwortlich sein, da diese vermehrt aus
Patienten isoliert wurden, die täglich das Aminoglykosid Tobramycin als
antipseudomonale Aerosol-Therapie anwendeten.
Abb. 2 WT
Abb. 2: Wachstum der beiden Morphotypen WT un
Columbia-Blutagar nach 48-stündiger Inkubation bei 3
SCV
d SCV von P. aeruginosa 20265 auf
7 °C.
Schriftum 27
Die vorliegende Arbeit baut auf den beschriebenen Untersuchungen von HÄUSSLER
et al. (1999a) auf. In phänotypischen Analysen von SCVs wurde von HÄUSSLER et
al. (2003) ein Pool von 12 Isolaten klonaler SCVs und Wildtypen und ihrer in vitro
generierten Revertanten untersucht. Sechs der SCVs zeigten ein stark
autoaggregatives Verhalten im Vergleich zu Wildtyp und Revertante bei Anzucht in
Vogel-Bonner-Medium. In LB-Medium war dieses autoaggregative Verhalten nicht so
stark ausgeprägt. Ausgehend von dieser Subgruppe wurden weitere Tests
durchgeführt. Alle SCVs zeigten eine verstärkte Biofilmproduktion, vier der sechs
autoaggregativen SCVs zeigten eine stärkere Assoziation mit der Pneumozyten-
Zellinie A549. Alle wiesen eine erhöhte Hydrophobizität auf und fünf zeigten in
elektronenmikroskopischen Untersuchungen vermehrt Pili im Vergleich zum Wildtyp.
Die in vitro generierten Revertanten waren durch eine noch größere Anzahl Pili
gekennzeichnet. Alle SCVs zeigten ein gegenüber dem Wildtyp und der Revertante
vermindertes Schwimmverhalten, wogegen das durch Pili vermittelte Twitching im
Vergleich zum Wildtyp erhöht war. Die Revertanten zeigten die höchste Twitching-
Motilität. Bei Kokultivierungsversuchen mit ihren Wildtypen in LB-Medium wiesen die
SCVs in der exponentiellen Phase ein geringeres Wachstum auf, wogegen die
Überlebensrate in der stationären Phase deutlich höher war.
WEHMHÖNER (2002) konnte bei der autoaggregativen SCV 20265 im Vergleich
zum WT 20265 eine verstärkte Typ I Sekretion (alkalische Protease, Hämophore
HasAp) und verstärkte Typ III Proteinsekretion (Effektorproteine ExoS und ExoT,
Porenproteine PopB, PopD, PcrV) nachweisen und zeigen, dass vermehrt Proteine
zur Eisenaufnahme gebildet werden. Außerdem zeigt diese SCV eine geringe
Expression von Strukturproteinen des Flagellen-Apparats.
VON GÖTZ (2003) führte zur gleichen Zeit Transkriptom-Analysen mit SCV 20265
und klonalem WT durch und konnte feststellen, dass auch auf Transkriptom-Ebene
eine verstärkte Expression der Gene auftrat, die für die Struktur und Funktion eines
Typ III Sekretionsapparats nötig sind. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die
SCV 20265 eine geringere Expression von Genen aufwies, die der Motilität dienen,
sowie eine Erhöhung von Genen, die für eine Eisenaquirierung nötig sind.
Schriftum 28
Das Auftreten von SCVs in vitro konnte auch in anderen Arbeitsgruppen festgestellt
werden. DEZIEL et al. (2001) konnten zeigen, dass P. aeruginosa 57RP SCVs
gegenüber dem Wildtyp eine Hyperpilierung der Typ IV Pili auf der Zelloberfläche
aufwiesen, jedoch trotzdem eine verminderte twitching-Motilität besaßen. Außerdem
waren die Flagellen-abhängigen Fortbewegungsarten Schwimmen und Schwärmen,
sowie die allgemeine chemotaktische Orientierung der Bakterien beeinträchtigt.
57RP SCVs zeigten eine gesteigerte Fähigkeit zur Initiierung von Biofilmen, die mit
einer starken Adhärenz zu abiotischen Oberflächen, erhöhter Hydrophobizität und
Autoaggregation einherging. Es zeigten sich auch Unterschiede in der Sezernierung
von Exoprodukten. So war der Gehalt von Pyocyanin und Pyoverdin erhöht, die
Menge an Elastase im Vergleich zum Wildtyp erniedrigt. Die 57RP SCVs wiesen
darüber hinaus eine höhere Sensitivität gegenüber H2O2 auf.
DRENKARD u. AUSUBEL (2002) bestätigten die guten Biofilm-
Bildungseigenschaften und die erhöhte Resistenz von SCVs gegenüber Antibiotika
(HÄUSSLER et al., 1999a). Sie stellten fest, dass die Anzahl aus dem Wildtyp
gebildeter SCVs von den in vitro Kulturbedingungen abhing. Daraus zogen sie den
Schluss, dass das Auftreten von SCVs ein von den Umweltbedingungen induzierter
Prozess sei und schlugen wie vor ihnen auch DÉZIEL et al. (2001) als Mechanismus
eine gerichtete Phasenvariation vor. DRENKARD u. AUSUBEL (2002) identifizierten
mit pvrR ein Gen, das, wenn es in PA14 SCVs überexprimiert wurde, diesen SCVs
Wildtyp-Eigenschaften verlieh. Eine Mutagenese im Wildtyp führte nicht zu einem
ausschließlichen SCV-Phänotyp, sondern lediglich zu einem gehäuften Auftreten von
SCVs in der WT-Population. Daraus ist zu schließen, dass pvrR vermutlich eine
Rolle in der Morphotyp-Konversion spielt, jedoch nicht allein dafür verantwortlich zu
sein scheint. Dieses Gen konnte in der Mehrzahl von getesteten CF- und Klinik-
Isolaten sowie Standard-Laborstämmen nachgewiesen werden. In P. aeruginosa
PAO1 konnte jedoch kein homologes Gen gefunden werden.
Schriftum 29
2.5. Der Nematode C. elegans als Infektionsmodell
C. elegans ist ein freilebender, anspruchsloser Bodennematode der meisten
gemäßigten Zonen. Er lebt im Erdreich und ernährt sich von den dort vorkommenden
Mikroorganismen. Außerdem benötigt er für Wachstum und Reproduktion lediglich
eine feuchte Umgebung mit gemäßigten Temperaturen und ausreichend Sauerstoff.
Aufgrund dieser Anspruchslosigkeit ist C. elegans problemlos im Labor auf
Agarplatten mit E. coli als Nahrungsquelle zu halten. Aufgrund seiner geringen
Größe von etwa 2 mm ist die Kultivierung einer großen Anzahl von Würmern auf
kleinstem Raum möglich. Die Dauer der Entwicklung vom Ei bis zum
reproduktionsfähigen adulten Wurm beträgt temperaturabhängig etwa drei (25 °C)
bis sechs (15 °C) Tage, wobei sich diese Entwicklung über vier Larvenstadien (L1
bis L4) erstreckt. Die maximale Lebenszeit des adulten Wurms beträgt etwa vier
Wochen, bei Nahrungsmangel oder zu hoher Populationsdichte ist die Entstehung
eines resistenteren Dauerstadiums möglich (RIDDLE et al., 1997).
Abb. 3
Aa
v
A
bb. 3: Der Nematode Caenorhabditis elega
dulten Wurms. (B) ist ein Ausschnitt aus ei
erschiedenen Entwicklungsstufen sowie adult
B
ns. (A) zeigt den anatomischen Aufbau einen
ner Mischkulturplatte. Es sind Eier, Larven in
e Würmer zu sehen.
Schriftum 30
Jeder adulte, selbstbefruchtende Hermaphrodit legt in einem Zeitraum von 4 Tagen
bis zu 300 Eier. Ebenfalls existierende männliche Würmer – weibliche Tiere gibt es
nicht – lassen sich beliebig mit diesen Hermaphroditen paaren, was für die
genetische Forschung von Bedeutung ist.
Der Wurm ist mechanisch sehr robust: er lässt sich schütteln, zentrifugieren,
einfrieren und lebendig wieder auftauen. Die Basistechniken zur Kultivierung sind
einfach und ohne großen Aufwand durchzuführen (HOPE, 1999). Die Anatomie des
Wurms ist sehr übersichtlich – exakt 959 somatische Zellen bei Hermaphroditen,
davon 302 Nervenzellen – und die Erscheinung unter dem Durchlichtmikroskop
transparent, was für die Erforschung innerer Vorgänge von großem Vorteil ist
(RIDDLE et al., 1997).
Diese Argumente veranlassten schon 1965 den britischen Molekularbiologen
SYDNEY BRENNER, C. elegans als Modellorganismus in die Biologie einzuführen
(BRENNER, 1974). Seit dem gewann der Wurm zunehmend an Interesse. Bereits im
Jahr 1998 war das Genom von C. elegans als erstem multizellulären Organismus
vollständig sequenziert (THE C. ELEGANS SEQUENCING CONSORTIUM, 1998).
Das Genom von C. elegans umfasst etwa 19000 Gene bei einer Größe von 97 Mb,
was nach aktuellen Schätzungen mehr als halb so vielen Genen wie beim Mensch
entspricht (INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM,
2001). Die Sequenzierung hat gezeigt, dass mindestens 37% der exprimierten
Proteine von C. elegans Äquivalente in anderen Organismen wie dem Mensch und
anderen Säugern besitzen. So kann, trotz der großen evolutionären Distanz
zwischen Mensch und Nematode, C. elegans als ein gültiges, auch auf den
Säugetierwirt übertragbares Modell für infektionsbiologische Studien herangezogen
werden (MAHAJAN-MIKLOS et al., 2000).
Die bekannte Genomsequenz und die daraus resultierende Möglichkeit, diese
genetisch zu manipulieren, machen für die Aufklärung grundlegender biologischer
Vorgänge auch ein Arbeiten mit definierten Wurmmutanten möglich. Insbesondere in
Verbindung mir bakteriellen Pathogenen, deren Genom ebenfalls bekannt ist, bieten
sich optimale Bedingungen zur systematischen Analyse von Interaktionen zwischen
einem bakteriellen Pathogen und einem eukaryotischen Wirt (TAN et al., 1999a).
Schriftum 31
Viele Virulenzfaktoren werden erst durch den Wirt induziert und können nur mit Hilfe
von Techniken identifiziert werden, die den Wirt mit einbeziehen. Aus diesem Grund
stellte die Gruppe um FREDERICK AUSUBEL im Januar 1999 ein Nematoden-
Bakterien-Pathogenitätsmodell vor, welches sich mit den Einflüssen von P.
aeruginosa auf C. elegans befasst (TAN et al., 1999a; MAHAJAN-MIKLOS et al.,
1999; TAN et al., 2000), und mit dessen Hilfe Interaktionen zwischen
Virulenzfaktoren des Bakterienstammes und den Wirtsabwehrmechanismen
analysiert werden können. P. aeruginosa besitzt die Fähigkeit, Virulenzfaktoren zu
produzieren, die in so unterschiedlichen Wirten wie Pflanzen (Arabidopsis thaliana),
Nematoden und Säugern Krankheiten verursachen (RAHME et al. 1995; TAN et al.,
1999b; MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999), so dass Vergleiche zwischen seinem
Verhalten in den unterschiedlichen Wirtssystemen gezogen werden können. TAN et
al. (1999a, b; 2000) und MAHAJAN-MIKLOS et al. (1999) konnten mit ihrem Modell
Mutanten des P. aeruginosa-Stammes PA 14 isolieren, die sowohl im C. elegans- als
auch im Mausmodell attenuiert waren. Diese Tatsache zeigt die Möglichkeit,
Pathomechanismen zu detektieren, die auch für den Säugetierwirt von Bedeutung
sind.
P. aeruginosa PA 14 hat ein breites Wirtsspektrum und zeigt auf C. elegans letale
Wirkung. Es wurden zwei unterschiedliche Arten des Wurmsterbens beschrieben:
das durch Infektion ausgelöste langsame Sterben slowkilling und das schnellere
Sterben fastkilling, das durch die Ausschüttung von Toxinen bedingt ist. Der
unterschiedliche Sterbeverlauf ist von der Zusammensetzung des Kulturmediums
abhängig.
Eine dritte Art des Sterbens von C. elegans durch PA 14 wurde wenige Monate
später als letale Paralyse beschrieben (DARBY et al., 1999), die auf einer Cyanid-
Produktion durch P. aeruginosa beruht.
Es sollte jedoch auch in Betracht gezogen werden, dass das C. elegans-Bakterien-
Modell einige Einschränkungen aufweist. So wird das System zum Beispiel dadurch
limitiert, dass nicht alle Bakterien C. elegans unter Laborbedingungen infizieren
können. Bisher ist eine letale Wirkung auf C. elegans nur für folgende Bakterien
Schriftum 32
beschrieben: die gramnegativen Pathogene P. aeruginosa, P. fluorescens, B.
cepacia (TAN et al., 1999a, 2000), B. pseudomallei, B. thailandensis (O’QUINN et
al., 2001), S. Thyphimurium (ABALLAY et al., 2000), Serratia marcescens (KURZ et
al., 2000) und Yersinia spp. (DARBY u. FALKOW, 1999) sowie die grampositiven
Pathogene Bacillus megaterium (ANDREW et al., 1976), Bacillus thuringiensis
(LEYNS et al., 1995), Microbacterium nematophylum (HODGKIN et al., 2000),
Enterococcus faecalis, S. aureus und Streptococcus pneumoniae (GARSIN et al.,
2001). Zudem fehlt den Nematoden ein entwickeltes (adaptives) Immunsystem; die
Aufgabe mancher Virulenzfaktoren besteht jedoch darin, die Immunantwort des
Wirtes zu neutralisieren (FINLAY et al., 1999). Des Weiteren wird die Expression
vieler Virulenzmechanismen im Säugetierwirt durch das Wirtsmillieu oder durch
spezifische Wirtsmoleküle induziert, wobei die Temperatur (in den meisten Fällen
37 °C) oftmals ein Schlüsselsignal ist. Dementsprechend könnte man einwenden,
dass einige für Säugetiere relevante Virulenzfaktoren nicht im Nematoden exprimiert
werden, da diese bei Raumtemperatur gehalten werden. Trotz dieser
Einschränkungen konnte in den oben genannten Studien von TAN et al. (1999a, b;
2000) gezeigt werden, dass es eine Vielzahl von Virulenzfaktoren gibt, die
gleichzeitig Bedeutung für Nematoden und Säuger haben.
Schriftum 33
2.6. Zielsetzung der Arbeit
Im Rahmen dieser Studie sollten unterschiedliche klinische P. aeruginosa SCVs und
ihre klonalen Wildtyp-Phänotypen charakterisiert werden. Dabei lag der Schwerpunkt
darauf, das Typ III Sekretionssystem bei SCVs im Gegensatz zu den WT näher zu
charakterisieren.
Zunächst sollte unter Verwendung eines Zellkultur-Modells zum einen geklärt
werden, ob eine verstärkte Expression von Typ III Genen, wie sie für einen Vertreter
der SCVs beschrieben wurde, eine funktionelle Rolle spielt und zum anderen sollte
untersucht werden, ob die erhöhte Typ III Sekretion nur ein Phänomen dieses
einzelnen Vertreters war oder auch andere SCVs ein ähnliches Expressions-Profil
zeigen. Durch Überexpression des Zwei-Komponenten-Regulators pvrR in den SCVs
sollte der Einfluss dieses Gens auf den SCV-Phänotyp überprüft werden.
Des Weiteren sollte mit einem Mausmodell geklärt werden, in wie weit eine erhöhte
Typ III Sekretion bei SCVs in vivo eine Rolle spielt. Ein dritter Punkt dieser Studie
war es, ein Caenorhabditis elegans – Modell zu etablieren, mit dem im Gegensatz zu
bereits bestehenden Modellen Typ III Sekretion-vermittelte Virulenz detektiert werden
kann. Dies sollte neben der Untersuchung von P. aeruginosa WT- und SCV-Isolaten
zusätzlich durch den Einsatz von P. aeruginosa-Mutanten mit Defekten im Typ III
Sekretionssystem erreicht werden.
Material und Methoden 34
3. Material und Methoden
3.1. Bakterien
3.1.1. Bakterienstämme Die in dieser Studie verwendeten Stämme von P. aeruginosa sowie verwendete
Mutanten werden im Folgenden unter Nennung ihrer relevanten phäno- oder
genotypischen Eigenschaften aufgeführt.
Die untersuchten SCVs sowie ihre klonalen Wildtypen wurden aus dem
Respirationstrakt chronisch infizierter CF-Patienten, die in der Medizinischen
Hochschule Hannover behandelt wurden, isoliert. Die Klonalität von SCV und WT
wurde mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese überprüft. Diese Prüfung erfolgte im
Bereich Krankenhaushygiene des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und
Krankenhaushygiene nach der Methode von RÖMLING et al. (1994).
Die verwendete P. aeruginosa Mutante 20265 SCVexsA wurde von I. Attree, CEA
Grenoble, Frankreich konstruiert und zur Verfügung gestellt (Tab. 1).
Tab. 1: Verwendete Isolate von P. aeruginosa SCVs und Wildtypen
Patient Stamm Relevanter Phäno- oder Genotyp
Herkunft
A 20265 WT klonal identisch mit SCV, schnell wachsender WT
MH Hannover
20265 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ 20265 SCVexsA Insertionsmutation in exsA,
Regulator für Typ III Sekretion; GmrI. Attree, CEA Grenoble
20265 SCVpED202
Komplementation des pvrR-Gens; Hypothese : Beteiligung an der SCV-Entstehung ; Cbr
F. v. Götz MH Hannover
B 52 WT klonal identisch mit 52 SCV, schnell wachsender WT
MH Hannover
52 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ
Material und Methoden 35
C 8226 WT klonal identisch mit 8226 SCV, schnell wachsender WT
MH Hannover
8226 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ D 231 WT klonal identisch mit 231 SCV,
schnell wachsender WT MH Hannover
231 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ E 29 WT klonal identisch mit 29 SCV,
schnell wachsender WT MH Hannover
29 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ 29 SCVpED202 Komplementation des pvrR-Gens;
Hypothese : Beteiligung an der SCV-Entstehung ; Cbr
F. v. Götz MH Hannover
F 10 WT klonal identisch mit 10 SCV, schnell wachsender WT
MH Hannover
10 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ G 17997 WT klonal identisch mit 17997 SCV,
schnell wachsender WT MH Hannover
17997 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ
H 18 WT klonal identisch mit 18 SCV, schnell wachsender WT
MH Hannover
18 SCV SCV, nicht autoaggregativ u. hyperpiliert
I 211 WT klonal identisch mit 211 SCV, schnell wachsender WT
MH Hannover
211 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert J 35 WT klonal identisch mit 35 SCV,
schnell wachsender WT MH Hannover
35 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert K 6998 WT klonal identisch mit 6998 SCV,
schnell wachsender WT MH Hannover
6998 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert L 50 WT klonal identisch mit 50 SCV,
schnell wachsender WT MH Hannover
50 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert M 26 WT klonal identisch mit 26 SCV,
schnell wachsender WT MH Hannover
26 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert N 4211 WT klonal identisch mit 4211 SCV,
schnell wachsender WT MH Hannover
4211 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert O 113 WT klonal identisch mit 113 SCV,
schnell wachsender WT MH Hannover
113 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert Bezeichnung der Phänotypen: WT, Wildtyp; SCV, small colony variant; Gmr, Gentamicin-
Resistenz; Cbr, Carbenicillin-Resistenz
Material und Methoden 36
P. aeruginosa TB und eine Gruppe von 65 daraus generierte Transposon-Mutanten
wurden freundlicherweise von der Klinischen Forschergruppe (L. Wiehlmann, B.
Tümmler) der Kinderklinik der MHH zur Verfügung gestellt. Sechs Mutanten konnten
zur Veröffentlichung im Rahmen dieser Arbeit verwendet werden. Außerdem wurde
die von I. Attree konstruierte Mutante TBexsA eingesetzt (Tab. 2).
Tab. 2: P. aeruginosa TB und Transposon-Mutanten
Stamm Relevanter Phäno- oder Genotyp
Herkunft
TB Klinisches Isolat CF L. Wiehlmann, MHH
9B9 intergenic region zwischen mechanosensitivem Kanal mscL und Katalase katB
L. Wiehlmann, MHH
18A8 knock out im Transkriptiosregulator RhlR, quorum sensing
L. Wiehlmann, MHH
20D1 knock out von xcpS, Protein F eines allg. Sekretionsapparats
L. Wiehlmann, MHH
25C8 knock out im Typ IV Strukturprotein für TypIV-Pili, PilY
L. Wiehlmann, MHH
D8A3 knock out im Regulator des quorum sensing, vfr
L. Wiehlmann, MHH
D10B10 knock out in mögl. Ferrichrome-Eisen-Rezeptor
L. Wiehlmann, MHH
TBexsA Insertionsmutation in exsA, Regulator für Typ III Sekretion; Gmr
I. Attree, CEA Grenoble
Bezeichnung der Phänotypen: Gmr, Gentamicin-Resistenz
Material und Methoden 37
P. aeruginosa CHA und daraus generierte Mutanten, sowie P. aeruginosa PA34 und
eine ExoU-defiziente Mutante von PA34 wurden freundlicherweise von I. Attree,
CEA, Biochimie et Biophysique des Systemes Intégrés, Grenoble, Frankreich, zur
Verfügung gestellt (Tab. 3).
Tab. 3: P. aeruginosa -Stämme aus Frankreich
Stamm Relevanter Phäno- oder Genotyp
Herkunft/Referenz
CHA CF-Isolat, Wildtyp DACHEUX et al., 1999
CHA-D1 Insertionsmutation in exsA, Regulator für Typ III Sekretion; Gmr
s.o.
CHAdsbA Defekt in Thiol-Disulfid-Oxidoreduktase; nötig für korrekte Faltung von Proteinen über Disulfid-Brücken; Tcr
FAUVARQUE et al. 2002
CHApilV knock out in einem Strukturprotein für TypIV-Pili, PilV; Tcr
FAUVARQUE et al. 2002
CHAcheZ Chemotaxis ; Gmr FAUVARQUE et al. 2002
CHAexsD knock out im TTSS-Regulator ExsD; Tcr
FAUVARQUE et al. 2002
PA 34 CF-Isolat, Wildtyp FAUVARQUE et al. 2002
PA34∆U knock out im TTSS-Effektorprotein ExoU; Gmr
FAUVARQUE et al. 2002
Bezeichnung der Phänotypen: Gmr, Gentamicin-Resistenz; Tcr, Tetracyclin-Resistenz
Außerdem wurden die Stämme P. aeruginosa PA14 – klinisches CF-Isolat – und P.
aeruginosa PAO1 – Wundisolat (DSM 1707) – eingesetzt (TAN et al., 1999; DARBY
et al., 1999).
Als Futterquelle für den Nematoden C. elegans wurde der Stamm E. coli OP50
verwendet, freundlicherweise zur Verfügung gestellt vom Caenorhabditis Genetic
Material und Methoden 38
Center (CGC), University of Minnesota, St. Paul, MN, USA. Als apathogener
Referenzkeim in den C. elegans -Assays in Flüssigkultur wurde der E. coli -Stamm
DH5α verwendet.
3.1.2. Kulturbedingungen Alle Bakterienstämme wurden zunächst auf Columbia-Agar mit 5% Schafblut oder
auf LB (Luria-Bertani)-Platten mit Antibiotikazusatz bei 37 °C angezüchtet.
Bakterienvorkulturen wurden angelegt, indem etwa 5 ml LB-Medium oder Vogel-
Bonner-Medium (einfach oder Calcium-depletiert) mit Koloniematerial von 3 bis 5
Kolonien beimpft und bei 37 °C im Schüttelinkubator bebrütet wurden.
Versuchskulturen wurden angelegt, indem von der Bakteriensuspension aus den
Vorkulturen so viel in Erlenmeyerkolben mit etwa 20 ml des entsprechenden
Mediums überführt wurde, dass die Ausgangsdichte der Versuchskulturen bei 650
nm (OD650) 0,1 betrug. Je nach Fragestellung erfolgte eine Bebrütung im
Schüttelinkubator bei 37 °C bis zu einer OD650 von 1,0 oder 0,5.
3.1.3. Bestimmung der Keimzahl Die Bakterienzelldichte erfolgte durch die Messung der optischen Dichte von
Flüssigkulturen bei 650 nm im Photometer. Die anschließende Keimzahlbestimmung
pro ml Bakteriensuspension erfolgte anhand einer für die jeweilige Bakteriespezies
angelegten Eichkurve. Als Leerwert wurde unbeimpftes Medium eingesetzt.
3.1.4. Kulturkonservierung Von allen verwendeten Bakterienstämmen wurden Tiefgefrierstammkulturen
angelegt. Dazu wurde das Koloniematerial von über Nacht bewachsenen Agarplatten
in 1 ml LB-Medium mit 10% Glycerin-Zusatz eingerieben. Diese Stammkulturen
wurden bei – 70 °C konserviert und dienten als Ausgangsmaterial zur Anzucht der
Stämme.
Material und Methoden 39
3.1.5. Charakterisierung der Motilität 3.1.5.1. Motilitätstest auf Swimming-Agar
Unter Swimming versteht man die Fähigkeit von Bakterien, sich mit Hilfe von
Flagellen fortzubewegen. Die unterschiedlichen Morphotypen (WT, SCV und SCV
mit pvrR-Vektor) wurden 24 bis 48 Stunden auf Columbia-Blutagar (WT, SCV),
beziehungsweise LB-Agar mit Carbenicillin als Antibiotikazusatz (SCV mit pvrR-
Vektor) bei 37 °C kultiviert. Mit Hilfe eines sterilen Zahnstochers wurde etwas
Koloniematerial von der Agarplatte genommen und punktförmig auf die Oberfläche
des Swimming-Agars (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 0,3% Bitek-Agar)
gegeben. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C. Die Ausdehnung der einzelnen Stämme
wurde durch die Messung des Durchmessers des Bakterienrasens nach 24 und 48
Stunden bestimmt.
3.1.5.2. Motilitätstest auf Twitching-Agar
Unter Twitching versteht man die Fähigkeit von Bakterien, sich mit Hilfe von Pili an
Oberflächen vorwärts zu bewegen. Das Twitching-Vermögen der unterschiedlichen
Morphotypen wurde auf 1%igem Agar (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl,
1% Bitek-Agar) getestet. Dabei erfolgte die Vorbereitung wie beim Swimming-
Motilitätstest. Allerdings wurde beim Twitching-Test das Koloniematerial mit dem
sterilen Zahnstocher durch den Agar auf die Platte inokuliert. Die Bebrütung erfolgte
bei 37 °C. Hatten die Bakterien ein Twitching-Vermögen, konnte dies als kreisförmige
Ausdehnung der Bakterien zwischen Agar und Boden der Petrischale festgestellt
werden. Diese Ausdehnung wurde durch Messung des Durchmessers nach 24 und
48 Stunden quantifiziert.
3.1.6. Methoden zur Bestimmung von Typ III Sekretionssystem-Proteinen im Überstand von Bakteriensuspensionen Zum Nachweis der aktiven Typ III Sekretion erfolgte eine Untersuchung der
Bakteriensuspensionen, bzw. der zellfreien Überstände auf das Vorhandensein der
einzelnen Effektor- und Translokatorproteine des Sekretionsapparats. Hierzu erfolgte
zunächst die Auftrennung der bakteriellen Proteine durch eine Polyacrylamid-
Material und Methoden 40
Gelelektrophorese (SDS-Page) und anschließend eine Sichtbarmachung der Banden
entweder mittels Silbernitrat-Färbung oder Western Blot mit spezifischen Antikörpern
gegen ExoS und PcrV (J. Heesemann, Max von Pettenkofer-Institut, München).
3.1.6.1. Vorbereitung der Proben
Die Proben wurden aus Versuchskulturen, die in den Zytotoxizitäts-Assays
eingesetzt werden sollten, entnommen. Von allen Bakteriensuspensionen wurde 1 ml
bei einer OD650 von 1,0 entnommen. Diese Proben wurden auf ein Volumen von 50
µl konzentriert (SpeedVac Concentrator, Fa. Savant) und anschließend mit
Probenpuffer (SDS; 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8; 50% Glycerin, Bromphenolblau; β-
Mercaptoethanol) versetzt und für 10 min aufgekocht. Anschließend waren die
Proben einsatzbereit.
3.1.6.2. SDS-Page
Die Auftrennung der Proteine erfolgte mit 12%igen Polyacrylamid-Gelen. Zunächst
wurden die Lösungen für das Trenngel (30% Acrylamid; 1,5 M Tris-HCl pH 8,0; 10%
SDS; Aqua dest.; Temed und 10% Ammoniumpersulfat) in entsprechender Menge
zusammenpipettiert und in die Gelkammer gefüllt. Um eine glatte Oberfläche zu
erhalten, wurde das Trenngel mit Butanol überschichtet. Nach einer
Polymerisationszeit von etwa 30 min wurde das Butanol abgespült, die Lösungen für
das Sammelgel (30% Acrylamid; 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8; 10% SDS; Aqua dest.;
Temed; 10% Ammoniumpersulfat) zusammenpipettiert und ebenfalls in die
Gelkammer auf das Trenngel gegeben. In das Sammelgel wurde ein Kamm für die
Geltaschen gesteckt. Nach einer erneuten Polymerisationszeit von etwa 30 min war
das Gel einsatzbereit. Von den vorbereiteten Proben wurden jeweils 15 µl in die
Geltaschen gefüllt, als Proteinstandard wurde der BENCHMARKTM Prestained
Protein Ladder der Fa. GIBCO BRL verwendet. Die Gelelektrophorese erfolgte in der
Gelkammer der Fa. Biometra zunächst bei 100 V. Nach dem Übertritt der Proben aus
dem Sammelgel in das Trenngel wurde die Voltzahl auf 150 erhöht. Die Dauer der
Elektrophorese betrug etwa 3 h. Nach der Elektrophorese erfolgte eine
Sichtbarmachung der Banden mittels Silbernitrat-Färbung oder Western Blot.
Material und Methoden 41
3.1.6.3. Silbernitrat-Färbung
Die Färbung der SDS-Gele erfolgte nach einem Protokoll von HAUKESHAVEN u.
DAMIK von 1986. Zunächst wurden die Gele in einem Fixierer (Ethanol 30%,
Essigsäure 10%, Aqua bidest.) für 15 min fixiert. Anschließend erfolgte für 15 min
eine Inkubation in Lösung II (Ethanol 30%, Na-Acetat 0,5 M, Glutaraldehyd 0,5%,
Na-Thiosulfat 0,2%, Aqua bidest.), dann wurde 3 mal für 10 min mit Aqua bidest.
gewaschen. Danach erfolgte eine Inkubation mit 0,1%iger Silbernitrat-Lösung, der
Formaldehyd (0,01%) beigegeben war. Hierauf folgte eine Inkubation mit Na-
Carbonat-Lösung (2,5%), dem ebenfalls Formaldehyd (0,01%) beigegeben wurde.
Die Proteinbanden wurden innerhalb von 5 bis 10 min sichtbar. Nach Erreichen der
erwünschten Färbeintensität wurde der Prozess mit 0,05 M EDTA-Lösung
abgestoppt.
3.1.6.4. Western Blot
Nach erfolgter Gelelektrophorese wurde das Gel zunächst in Blotpuffer (48 mM Tris,
39 mM Glycin, Aqua bidest.) aufgenommen. In die Blotkammer wurde zunächst ein
Stück Filterpapier gelegt, das zuvor mit Blotpuffer angefeuchtet wurde. Dieses
Filterpapier sollte an allen Seiten etwa 1 cm größer sein als das Gel. Auf dieses
Filterpapier wurde ein, ebenfalls in Blotpuffer angefeuchtet, Streifen Nitrozellulose
gelegt, dessen Größe der des Gels entsprach. Auf diese Nitrozellulose wurde das
Gel gelegt und obenauf kam ein weiteres Stück in Blotpuffer angefeuchtetes
Filterpapier. Danach wurde die Blotkammer geschlossen und der Blotvorgang
gestartet. Geblottet wurde für 1,5 h bei 140 mA (für ein Gel mit 8,5 x 8,0 cm). Im
Anschluss an den Blotvorgang wurde der Nitrozellulose-Streifen in 3%iger
Magermilch für mindestens 1 h oder ÜN abgesättigt. Danach wurde der
Nitrozellulose-Streifen mit Aqua bidest. abgespült und in 1%ige Magermilch überführt
und die entsprechenden Primär-Antikörper (Kaninchen-Antikörper Anti-ExoS, Anti-
PcrV) zugegeben. Dieser Ansatz wurde dann für 1,5 bis 2 h auf einem Schüttler
(Vari-Mix, Fa. Thermolyne) inkubiert. Anschließend wurde der Nitrozellulose-Streifen
erneut mit Aqua bidest. abgespült und dann in 1%ige Magermilch mit dem
entsprechenden Sekundär-Antikörper (α-Rabbit-Peroxidase) gegeben. Nach einer
Material und Methoden 42
weiteren Inkubationszeit von 1 h erfolgte eine Chemolumineszenz-Entwicklung mit
dem Lumi-Light Western Blotting Substrate der Fa. ROCHE BIOCHEMICALS. Dazu
wurde der Nitrozellulose-Streifen zunächst 3 mal für 10 min mit TBS-T Puffer (0,05 M
Tris, 0,15 M NaCl, 500 µl Tween 20, ad 1000 ml Aqua bidest., pH 7,5) gewaschen,
dann mit dem Substrat für 2 min inkubiert und anschließend in Folie eingeschweißt.
In der Dunkelkammer wurde ein Röntgenfilm für 2, 5 oder 10 s belichtet und
anschließend im Röntgenfilm-Entwickler entwickelt.
Material und Methoden 43
3.2. Zellkultur
3.2.1. Zelllinie Für die Infektionsversuche wurden Zellen der Makrophagenzelllinie J774.A1
(adhärente Maus-Monozyten-Makrophagen) verwendet, die von der DSMZ
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig)
stammen. Diese Makrophagenzelllinie wurde 1968 aus einem Tumor einer
weiblichen BALB/c Maus etabliert. Die Zellen synthetisieren Lysozym und Interleukin-
1 und besitzen Rezeptoren für Immunglobulin und Komplement. Gelagert wurden die
Makrophagen in Tanks mit flüssigem Stickstoff bei einer Temperatur von –196 °C.
3.2.2. Anzucht der Zellen Die Zellkulturen wurden in Dulbecco`s Modified Eagle Medium (DMEM; Fa. Biochrom
AG) unter Zusatz von 10% fötalem Kälberserum (FCS) in Zellkulturflaschen bei einer
Temperatur von 37 °C mit 5% CO2 im Brutschrank angezüchtet etwa 8 bis 10
Wochen in Kultur gehalten. Alle 3 bis 4 Tage wurden die Zellen in eine neue
Zellkulturflasche überführt und mit frischem Nährmedium versetzt. Nach 8 bis 10
Wochen wurde die Kultur aufgegeben und eine frische Kultur von den im
Stickstofftank gelagerten Zellen angesetzt. Für die Infektionsversuche wurden die
Makrophagen in Zellkulturplatten (24 wells) 24 Stunden vor Versuchsbeginn
ausgesät.
3.2.3. Einfrieren und Auftauen der Zellen Frische Zellen von der DSMZ wurden nach 3 bis 4 Tagen in Kultur zur Konservierung
eingefroren. Hierzu wurden die Zellen vom Boden der Zellkulturflaschen gelöst (siehe
3.3.4.), in ein Falcon-Röhrchen überführt und anschließend 10 min bei 150 g (1000
rpm in einer Minifuge 2, Heraeus) zentrifugiert. Der zellfreie Überstand wurde
abgenommen, das Zellpellet tröpfchenweise in Einfriermedium (DMEM mit 10%
Dimethylsulfoxid, DMSO) aufgenommen und vorsichtig resuspendiert. In
Einfriergefäße (Nunc, Roskilde, Dänemark) wurde jeweils 1 ml der Zellsuspension
pipettiert. Die Einfriergefäße mit der Zellsuspension wurde anschließend zunächst
Material und Methoden 44
bei –70 °C eingefroren und nach einer Auftaukontrolle (Sterilkontrolle) nach 3 bis 4
Tagen in Tanks mit flüssigem Stickstoff überführt und bei –196 °C gelagert.
Um die Makrophagen aufzutauen, wurden die Einfriergefäße aus dem Stickstofftank
für etwa 5 min in ein Wasserbad (37 °C) überführt, anschließend in DMEM mit 10%
FCS in einer Zellkulturflasche aufgenommen und bei 37 °C im Brutschrank mit 5%
CO2 wie oben beschrieben angezüchtet.
3.2.4. Lösen der Zellen Das Lösen der adhärenten Zellen vom Boden der Zellkulturflaschen nach Abnahme
des Nährmediums erfolgte mittels Zellschaber.
3.2.5. Ermittlung der Zellzahl Zur Ermittlung der genauen Zellzahl wurde aus der zu bestimmende Zellsuspension,
gewonnen durch Lösen der Zellen vom Boden der Zellkulturflasche, ein kleiner Teil in
0,4%iger Tryptan-Blau-Lösung verdünnt (1:5), suspendiert und auf eine Neubauer-
Zählkammer (4 Felder zu je 16 Quadrate mit einem mm2) pipettiert. Unter dem
Mikroskop wurden die nicht gefärbten Zellen ausgezählt. Zellen, die sich mit
Tryptanblau angefärbt hatten, waren nicht mehr vital und wurden deshalb nicht
mitgezählt.
Folgende Formel diente zur Berechnung der Zellzahl:
Zellzahl in 64 Quadraten x 1000
Zellen / ml = -----------------------------------------------------------------------
Höhe der Zählkammer x Fläche x Verdünnung x 64
Vereinfachte Formel:
Zellzahl x Verdünnungsfaktor
Zellzahl x 104 / ml = --------------------------------------------
Zahl der Großquadrate
Material und Methoden 45
3.2.6. Zytotoxizitäts-Assay
3.2.6.1. Versuchsprinzip
Im Zytotoxizitäts-Assay sollte die Typ III Sekretions-bedingte Zytotoxizität von P.
aeruginosa SCVs im Vergleich zu ihren klonalen Wildtyp-Phänotypen getestet
werden. Hierzu wurden Makrophagen der Zelllinie J774.A1 mit den unterschiedlichen
P. aeruginosa Isolaten infiziert. Die Freisetzung des Enzyms Laktat-Dehydrogenase
(LDH) diente dabei als Maß der Zytotoxizität. LDH ist ein zytosolisches Enzym, das
ubiquitär in allen Zellen in relativ hoher Konzentration vorkommt. Bei intakter
Zellmembran kann es nicht in die Umgebung der Zellen gelangen. Zelltod ist
assoziiert mit Zerstörung der Zellmembran, wodurch LDH in die Umgebung der
Zellen und damit in den Überstand des Mediums gelangt. Bei der Typ III Sekretion
werden durch die Translokatorproteine des Sekretionsapparats Poren in der
Wirtszellmembran gebildet, durch die LDH ebenfalls in die Umgebung gelangen
kann. Das heißt, LDH kann als Indikator für eine Zellschädigung verwendet werden,
auch wenn mikroskopisch noch keine Zerstörung der Zelle sichtbar ist.
Der LDH-Anstieg im Überstand kann mittels des „Cytotoxicity Detection Kit“ der
Firma ROCHE BIOCHEMICALS qualitativ und quantitativ bestimmt werden:
Laktat Pyruvat
Abb. 4
Formazan (rot) Tetrazolium-Salz (schwach gelb) Abb. 4: Prinzip der Substratumsetzung in Zytotoxizitäts-Assay (aus d. Anleitung d.
Firma Roche)
Material und Methoden 46
Das Testprinzip beruht auf einfachen Redox-Reaktionen, wie sie in Abb. 4 gezeigt
sind. Im ersten Schritt wird Laktat durch LDH zu Pyruvat oxidiert, wobei NAD+ zu
NADH+H+ reduziert wird. In einem zweiten Schritt wird NAD+ regeneriert (Oxidation),
indem die H+-Ionen auf das Tetrazolium-Salz übertragen werden, wodurch das
farbige Formazan entsteht (Reduktion). Dabei korreliert die Menge des umgesetzten
Formazans direkt mit der Menge an freigesetztem LDH. Das heißt, die Farbintensität
ist direkt proportional zur Zelllyse.
3.2.6.2. Durchführung des Assays
Die Zellen wurden 24 Stunden vor Versuchsbeginn mit einer Zelldichte von 5 x 105
Zellen in 300 µl DMEM pro well in 24-well-Platten ausgesät und bei 37 °C im
Brutschrank mit 5% CO2 inkubiert. Koloniematerial aus 3 bis 5 Kolonien von P.
aeruginosa wurden 24 Stunden vor Versuchsbeginn von Blutplatten genommen und
in 5 ml LB-Medium bei 37 °C und 150 rpm im Schüttelinkubator inkubiert. Etwa 6
Stunden vor Versuchsbeginn wurden aus diesen Vorkulturen Versuchskulturen
angeimpft, indem so viel Bakteriensuspension aus den Vorkulturen in
Erlenmeyerkolben mit 20 ml LB-Medium überführt wurde, dass eine optische Dichte
bei 650 nm (OD650) von 0,1 erreicht wurde. Diese Versuchskulturen wurden erneut
bei 37 °C und 150 rpm im Schüttelinkubator inkubiert bis zu einer OD650 von 1,0.
Dann wurde die Bakteriendichte auf 5 x 106 Bakterien pro 300 µl DMEM eingestellt.
Pro Bakterienstamm wurden 3 wells infiziert. Hierzu wurde das alte Medium
vollständig abpipettiert und durch das neue, bakterienhaltige Medium ersetzt.
Gleichzeitig wurde in 3 wells nur das alte Medium gegen neues, bakterienfreies
Medium als Negativkontrolle ersetzt. Als Positivkontrolle wurden 3 wells mit
0,25%igem Triton X-100 versetzt zur vollständigen Lyse der Zellen. Für die Dauer
des Versuchs wurde der Ansatz bei 37 °C und 5% CO2 bebrütet. Nach 1, 2, 3, 4 und
gegebenenfalls 5 Stunden wurden jeweils 30 µl des Überstands pro well
abgenommen und in eine 96-well-Platte überführt. Nach der letzten Probennahme
wurden diese Überstände mit dem „Cytotoxicity Detection Kit“ der Firma ROCHE
BIOCHEMICALS für eine halbe Stunde inkubiert, wobei es je nach freigesetzter und
demnach durch den Testkit umgesetzter LDH-Menge zu einer unterschiedlichen
Material und Methoden 47
Farbabstufung kam (vergleiche Testprinzip 3.2.6.1.). Die Auswertung erfolgte im
ELISA-Reader (Titertek Multiskan MCC/340, Fa. Flow Laboratories GmbH) bei einer
Wellenlänge von 492 nm. Der Wert der Triton X-100 Positivkontrolle diente dabei als
Maß für 100% Zytotoxizität, d.h. maximale LDH-Freisetzung. Die Werte der
unterschiedlichen P. aeruginosa -Stämme wurden hierzu ins Verhältnis gesetzt.
Dabei wurde von allen Werten der Basiswert an LDH-Freisetzung aus den
uninfizierten wells abgezogen.
Abb. 5
_______________
Stamm 8226
_______________
Stamm 20265
V Infektions-
dauer
unin Abb. 5: Beispielhafte min Inkubation mit demit dem ELISA-Reader
der Triton-Kontrolle ins
_________________
SC
____________________
____________________
Basis fizierte Zellen Zelll
Darstellung der Auswem Substrat des Testkit gemessen und die Wer
Verhältnis gesetzt.
___________________
WT
______________________
1,5 h 3 h 4,5 h
______________________
1,5 h 3 h 4,5 h
max. LDH yse mit Triton X-100
rtung des Zytotoxizitäts-Assays nach 30 s. Die unterschiedliche Farbintensität wurde
te von WT und SCV wurden zu den Werten
_______________________________
Material und Methoden 48
3.3. Mausmodell
3.3.1. Versuchstiere Die in dieser Studie verwendeten Mausstämme wurden von Charles River Wiga
bezogen. Es handelte sich dabei um 8 bis 10 Wochen alte, weibliche Tiere des
Stammes BALB/c (H-2d Haplotyp, Bcg/Tty/Lshs Phänotyp).
3.3.2. Infektion der Mäuse Vor der Infektion wurden alle Tiere jeweils mit 100µl einer Lösung aus 0,1%
Xylazinhydrochlorid und 1% Ketaminhydrochlorid in 0,9% NaCl narkotisiert. Jeweils
4 Tiere pro Bakterienstamm wurden bei jedem Experiment mit der gleichen Dosis
von 1 x 108 Bakterien in PBS infiziert. Die intranasale Infektion wurde mit einem
Volumen von 30 µl in beide Nasenlöcher durchgeführt. Nach der Infektion wurden die
Tiergruppen getrennt in Käfige gelegt, die mit Filterdeckel abgedichtet wurden. Zur
Bestimmung der tatsächlich eingesetzten Dosis wurde die CFU von Aliquots
mehrerer Verdünnungen der Infektionslösung nach 24 Stunden bei 37 °C
ausgewertet.
3.3.3. Verlaufsuntersuchungen der Infektion Der Krankheitsverlauf der Mäuse wurde täglich mindestens einmal kontrolliert und
protokolliert. Dabei wurde besonderes Augenmerk auf eventuelle Gewichtsreduktion
gelegt. Hierzu wurden die einzelnen Mäuse markiert und das Gewicht täglich
bestimmt. Des weiteren wurden eventuelle Dyspnoe, Konjunktivitis und das
Verhalten (Vitalität, Sozialverhalten, Nestbau) der Tiere, sowie die Mortalität
protokolliert. Die Mortalität wurde in Kaplan-Meyer-Überlebenskurven graphisch
dargestellt und mittels Kaplan-Meyer-Survival-Statistiken mit dem Programm SPSS
7.0 auf signifikante Unterschiede in den verglichenen Tiergruppen überprüft.
3.3.4. Keimzahlbestimmung in Organen infizierter Mäuse Bei einem Teil der infizierten Tiere wurden Keimzahlbestimmungen aus Lunge, Leber
und Milz durchgeführt. Dazu wurden die Tiere unmittelbar vor der Sektion mit CO2 in
Material und Methoden 49
einem verschlossenen Becherglas getötet. Nach Fixierung auf einem Styroporbrett
und oberflächlicher Desinfektion mit 70% Ethanol wurden die benötigten Organe
entnommen, gewogen und in ein definiertes Volumen sterile Tergitollösung (Lunge
und Milz 500µl, Leber 1000 µl) aufgenommen. Nach steriler Homogenisierung
(Homogenisator: Ultra-Turrax T8, Fa. IKA Labortechnik) wurde von jeder
Organsuspension eine Verdünnungsreihe in PBS hergestellt, die jeweils doppelt aus
Müller-Hinton-Platten ausplattiert wurden. Die tatsächlichen Keimzahlen in den
Organen wurden aus der Anzahl der auf den Agarplatten nach 24 Stunden bei 37 °C
gewachsenen Kolonien unter Einbeziehung des Organgewichts, der Tergitol-Menge
und der Verdünnungsstufe berechnet. Zur statistischen Bewertung der ermittelten
Unterschiede in den Mittelwerten der einzelnen Gruppen wurde ein t-Test mit Hilfe
von SigmaStat 2.0 durchgeführt.
3.3.5. Histopathologische Diagnostik an Lunge und Nasopharynx infizierter Tiere Die Sektion der Tiere erfolgte wie unter 3.4.4. beschrieben. Die Lungen wurden
entnommen und nach Tiergruppen getrennt (SCV, WT, ggf. SCVexsA) in 4%
Formalin gelegt und für mindestens 4 h fixiert. Danach wurden die Lungenlappen
getrennt (rechte Lunge 4 Lappen; linke Lunge 1 Lappen) und in Einbettkapseln
gegeben. Dabei wurde für rechte und linke Lunge jeweils eine Einbettkapsel
verwendet. Die Einbettkapseln wurden in 60% Ethanol gelegt. Die Köpfe wurden im
Bereich der ersten Halswirbel vom Rumpf getrennt, das Fell vollständig entfernt und
dann ebenfalls nach Tiergruppen getrennt in 4% Formalin gelegt und für mindestens
4 h fixiert. Danach wurden die Schädel zum Entkalken für mindestens 5 h in
Dekalzifizierer gelegt. Anschließend war es möglich, Querschnitte durch die Nase
von 2 bis 3 mm Dicke durchzuführen. Pro Schädel wurden 4 Querschnitte angelegt.
Die 4 Querschnitte wurden in eine Einbettkapsel überführt und in 60% Ethanol
gelegt. Die weitere Bearbeitung der Organe (Anfertigen der Schnitte und HE-
Färbung) erfolgte in Kooperation mit Prof. K. Kamino (Institut für Pathologie der
Medizinischen Hochschule Hannover). Die gefärbten Präparate wurden
mikroskopisch bei unterschiedlichen Vergrößerungen (x200 bis x1000) beurteilt.
Material und Methoden 50
3.4. Arbeiten mit Caenorhabditis elegans
3.4.1. Versuchstiere Die in dieser Studie verwendeten Würmer wurden freundlicherweise vom
Caenorhabditis Genetics Center (CGC), University of Minnesota, St. Paul, USA
bezogen. Es handelte sich ausschließlich um selbstbefruchtende Hermaphroditen.
Verwendet wurde der C. elegans N2 Bristol Wildtyp-Stamm, DR Subklon von CB
Original (Tc1 pattern I).
3.4.2. Kulturerhaltung Sowohl der N2-Wildtypstamm als auch die verwendeten Wurmmutanten wurden auf
mit E. coli bewachsenen NGM (Nematode Growth Medium)-Agarplatten bei 20 °C im
Nematodenschrank (Chromatographieschrank 2023, Mini Cold Lab, Fa. Pharmacia)
kultiviert. Etwa alle fünf Tagen mussten die Würmer auf neue Platten umgesetzt
werden. Hierzu wurde mit Hilfe eines sterilen Skalpells ein kleines, gut mit C. elegans
besiedeltes Agarstück aus der alten Platte herausgeschnitten und auf die neue
Platte übersetzt. Die Umsetzfrequenz wurde auf ein bis zwei Tage reduziert für
Würmer, die zu Eipräparationen dienen sollten, um eine möglichst große Ausbeute
an adulten Würmern und Eiern zu haben. Würmer, die auf Stockplatten nur zur
Erhaltung dienten, konnten auch einige Wochen aufbewahrt werden. Etwa alle sechs
Monate wurden neue Würmer vom CGC bestellt.
3.4.3. Herstellung der bakteriellen Nahrungsquelle Als Nahrungsquelle für C. elegans wurden sowohl NGM-Agarplatten mit E. coli OP50
(Futterplatten) als auch E. coli OP50-Pellets für Eipräparationen verwendet.
3.4.3.1. Futterplatten
Der verwendete E. coli OP50–Stamm wurde auf Columbia-Blutagar mit 5% Schafblut
angezüchtet. Zur Beimpfung der NGM-Platten wurde zunächst eine Vorkultur
angelegt, indem Koloniematerial von E. coli OP50 mittels eines sterilen Zahnstochers
in 5 ml LB-Medium überführt wurde und etwa 6 Stunden bei 37 °C im
Material und Methoden 51
Schüttelinkubator inkubiert wurde. Danach wurden jeweils 100 µl der
Bakteriensuspension mit einem Drigalskispatel auf den NGM-Platten ausplattiert. Die
Inkubation der Platten erfolgte bei 37 °C über 24 Stunden, die anschließende
Lagerung bei 20 °C im Nematodenschrank.
3.4.3.2. Pellets für Eipräparation
Von einer E. coli OP50-Vorkultur wurden jeweils 100 µl in 4 x 250 ml frisches LB-
Medium in großen Erlenmeyerkolben gegeben und diese für 24 Stunden bei 37 °C im
Schüttelinkubator inkubiert. Die Bakteriensuspensionen wurden anschließend für 25
min bei 4 °C und 3000 g in der Beckmann-Zentrifuge abzentrifugiert. Der Überstand
wurde abgegossen und die Pellets in einem 50 ml Falcontube gesammelt. Es folgte
eine Hitzeinaktivierung für 10 min bei 70 °C. Die Lagerung erfolgte bei 4 °C. Alle drei
bis vier Monate wurde dieses Futter ausgetauscht.
3.4.4. Eipräparation Für die Versuche sollten Würmer eines Entwicklungsstadiums verwendet werden.
Dazu war es nötig, zunächst die Population in ihrer Entwicklung zu synchronisieren.
Dies wurde mit Hilfe von Eipräparationen erreicht.
Zur Präparation waren NGM-Platten mit einer möglichst großen Zahl von Eiern und
graviden Hermaphroditen nötig. Es hat sich herausgestellt, dass dieses Ziel
zuverlässig erreicht wurde, wenn Würmer drei und einen Tag vor der Eipräparation
auf neue Futterplatten umgesetzt wurden. Diese Platten wurden mit sterilem Aqua
dest. gespült, indem das Wasser mehrmals über die Platten pipettiert wurde. Die
Flüssigkeit mit den heruntergespülten Eiern und Würmern wurde in einem 15 ml
Falcontube gesammelt, wobei das Volumen mindestens 3,5 ml betragen musste.
Falls nötig, wurde mit sterilem Aqua dest. aufgefüllt. Ein Gemisch aus 600 µl sterilem
Aqua dest. 500 µl Natriumhypochlorit (12%) und 400 µl 5 M NaOH wurde hinzugefügt
und gut vermischt. Die Würmer wurden über einen Zeitraum von 10 min vollständig
aufgelöst, wobei etwa alle 2 min gut geschüttelt wurde. Die in der Flüssigkeit
zurückgebliebenen Eier wurden gewaschen, indem sie für 30 s bei 1157 g in der
Minifuge RF zentrifugiert wurden. Die überstehende Flüssigkeit wurde bis auf etwa
Material und Methoden 52
100 µl verworfen, bevor wieder mit sterilem Aqua dest. auf das ursprüngliche
Volumen aufgefüllt wurde. Nach Wiederholung des Waschvorgangs wurden die
abzentrifugierten Eier in etwa 30 ml M9-Puffer in einen 100 ml Erlenmeyerkolben
überführt. Dazu kam eine Spatelspitze konzentrierte E. coli OP50-Pellets als
Nahrungsquelle für die schlüpfenden C. elegans -Larven. Die Eipräparation wurde im
Nematodenschrank bei 20 °C auf einem Schüttler bei 80 rpm gehalten. Nach etwa 3
Tagen hatten sich die Larven bis zum L4-Larvenstadium entwickelt, die dann für die
Versuche eingesetzt wurden.
3.4.5. Infektionsmodelle
3.4.5.1. Slowkilling
Die in diesem Modell (TAN et al., 1999a) zu untersuchenden Bakterienstämme
wurden zunächst auf Columbia-Blutagar mit 5% Schafblut bei 37 °C angezüchtet.
Anschließend wurden Vorkulturen hergestellt, indem Koloniematerial mit einem
sterilen Zahnstocher in 5 ml LB-Medium in Capsenberg-Reagenzgläser gegeben
wurde. Die Inkubation erfolgte im Schüttelinkubator bei 37 °C und 150 rpm über
Nacht. Dann wurde die OD650 bestimmt und die Bakterienzelldichte anhand einer
Eichgerade errechnet. Die Suspension wurde soweit mit LB-Medium verdünnt, dass
eine Bakterienkonzentration von etwa 1,5 x 104 Bakterien/ml erreicht wurde. Mit
jeweils 100 µl davon wurden die Slowkilling – Platten (mod. Nematode Growth
Medium: 0,3% Pepton, 0,3% NaCl, 1,7% Bitek-Agar; Zusätze siehe Anhang 8.4., S
167) beimpft und mittels Drigalskispatel gleichmäßig verteilt. Bei jedem Ansatz wurde
E. coli OP50 als Negativkontrolle eingesetzt. Die Platten wurden ÜN bei 37 °C
bebrütet. Vor Versuchsbeginn wurden die Platten noch für ein bis zwei Stunden bei
Raumtemperatur gelagert, bevor die mit Würmern besetzt wurden. Pro Platte wurde
ein Aliquot, das etwa 50 bis 60 Würmer enthielt, aus einer Eipräparation pipettiert.
Danach wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten die Anzahl der toten Würmer im
Verhältnis zur Gesamtzahl bestimmt. Alle Versuche wurden bei Raumtemperatur
durchgeführt.
Material und Methoden 53
3.4.5.2. Fastkilling
Der Fastkilling - Assay erfolgte analog zum Slowkilling – Assay (TAN et al., 1999b).
Abweichend wurde ein höher osmolares Medium, nämlich PGS-Agar (Pepton
Glucose Sorbitol: 1% Bactopepton, 1% NaCl, 1% Glukose, 0,15 M Sorbitol, 1,7%
Bactoagar; Zusätze siehe Anhang 8.4., S. 167) eingesetzt.
3.4.5.3. Killing in Flüssigkultur
Zunächst wurden die zu untersuchenden Bakterienstämme auf Columbia-Blutagar
mit 5% Schafblut oder entsprechend antibiotikahaltigen LB-Agarplatten bei 37 °C
angezüchtet. Anschließend wurden Vorkulturen hergestellt, indem Koloniematerial
mit einem sterilen Zahnstocher in 5 ml Vogel-Bonner-Medium (normal oder Calcium-
depletiert, Zusammensetzung siehe Anhang 8.4.) in Capsenberg-Reagenzgläser
gegeben wurde. Die Inkubation erfolgte im Schüttelinkubator bei 37 °C und 150 rpm
über Nacht. Aus diesen Vorkulturen wurden Versuchskulturen angeimpft, indem so
viel Bakteriensuspension aus der Vorkultur in 100 ml -Erlenmeyerkolben mit 20 ml
Vogel-Bonner-Medium überführt wurde, das eine OD650 von 0,05 vorhanden war.
Diese Versuchskulturen wurden bei 37 °C und 150 rpm im Schüttelinkubator
inkubiert, bis die Bakterien eine optische Dichte von 0,5 oder 1,0 erreicht hatten. In
24-well-Platten wurden jeweils 3 wells pro Bakterienstamm mit 1 ml
Bakteriensuspension bestückt und etwa 50 L4-Larven einer Eipräparation
zugegeben. Danach wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten die Anzahl der toten
Würmer im Verhältnis zur Gesamtzahl bestimmt. Zwischen den Zählzeitpunkten
wurden die 24-well-Platten im Wurmschrank auf einem Schüttler (Rocky, Fa. LTF
Labortechnik) mit etwa 30 rpm geschüttelt. Für die Untersuchung der Virulenz von
hitzeinaktivierten Bakterien wurden die Bakteriensuspensionen für 10 min bei 70 °C
inaktiviert. Danach wurden die Bakterien bei Raumtemperatur stehen gelassen, bis
sie abgekühlt waren. Zur Untersuchung von Kulturüberständen wurden die Bakterien
entweder sterilfiltriert oder für 10 min bei 3214 g zentrifugiert. Hitzeinaktivierte
Bakterien und Überstände wurden wie die Bakteriensuspensionen jeweils in
Dreifach-Ansätzen zu je 1 ml in 24-well-Platten gegeben und L4-Larven zugegeben.
Material und Methoden 54
3.5. Molekularbiologische Arbeiten
3.5.1. Materialien
a.) Molekularbiologische Fertigprodukte
Mini-Plasmidpräparation Kit: NucleoSpin® Plasmid, Fa. Machery- Nagel (MN)
DNeasy Tissue Kit® zur Präparation genomischer DNA, Fa. Qiagen
b.) Molekulargewichtsstandards und Enzyme
1 kb DNA Leiter, New England Biolabs
Pst I, New England Biolabs
Taq-DNA-Polymerase, Sigma
c.) Vektoren
pED202: pUCP19::pvrR
ca. 3,5 kb Pst I Fragment aus P. aeruginosa PA 14
Carbenicillin-Resistenz (Cbr)
(DRENKARD u. AUSUBEL, 2002)
d.) Primer für PCR (MWG Biotech)
pvrR (AF482691): pvr2_f 5’-CCGGAAACCGACGAGACTCC-3’
pvr2_r 5’-GCTGCATTGAGGCCGTTATCC-3’
(Fragmentlänge 597 bp; Schmelztemperatur 60 °C)
3.5.2. Molekularbiologische Methoden
3.5.2.1. Übertragung von DNA durch Elektroporation
Zur Übertragung von Plasmid-DNA wurde ein Protokoll von ENDERLE et al. (1998)
verwendet. Dazu wurden P. aeruginosa SCVs so mit einem Impfspatel auf LB-Agar-
Platten ausplattiert, dass sie nach 24 h Inkubation bei 37 °C einen konfluenten
Material und Methoden 55
Rasen bildeten. Von der Hälfte einer bewachsenen Platte wurden die Zellen mit einer
Impföse abgelöst und in 1 ml Aqua bidest. resuspendiert. Alternativ konnten auch 2
ml einer Flüssigkultur verwendet werden, aus der die Zellen mit 13000 g
abzentrifugiert und anschließend in Aqua bidest. aufgenommen wurden. Diese
Zellsuspension wurde wiederholt für jeweils 3 min bei 13000 g mit Aqua bidest.
gewaschen. Erst wenn keine helle Schicht (vermutlich Exopolysaccharid und
Zelltrümmer) mehr auf dem Zellpellet zu sehen war und der Zellüberstand keine
Färbung mehr aufwies, wurden die Zellen in 200 µl Aqua bidest. resuspendiert und
auf Eis gestellt.
Jeweils 90 µl Zellsuspension wurden mit maximal 10 µl DNA-Lösung (Konzentration
40 ng/µl) versetzt und in vorgekühlte Elektroporationsküvetten überführt (Elektroden-
Abstand 0,2 cm; Biorad). Dabei wurde darauf geachtet, dass sich am Grund der
Küvette keine Luftblasen bildeten. Anschließend wurden die Zellen in einem Gene
Pulser II (Biorad) bei 2,5 kV und 25 µF sowie 400 Ω elektroporiert. Die Zeitkonstante
für die Entladung sollte optimalerweise 5 ms betragen. Nach der Elektroporation
wurden die Zellen sofort mit 1 ml LB-Medium versetzt und in ein 1,5 ml
Reaktionsgefäß überführt. Danach erfolgte eine Inkubation für 3 h im Heizblock bei
37 °C. Anschließend wurden die Zellen auf LB-Platten mit Antibiotikum ausplattiert
und mindestens 16 h bei 37 °C inkubiert. Die Elektroporationsküvetten konnten
wiederverwendet werden, nachdem sie gut mit Aqua bidest. gespült und mit 70 %
(v/v) Ethanol gefüllt in einem Trockenschrank bei 80 °C getrocknet worden waren.
3.5.2.2. Mini-Plasmidpräparation
Die Mini-Plasmidpräparation wurde nach Anweisung des Herstellers (Fa. Machery-
Nagel) durchgeführt. Dazu wurden jeweils 5 ml einer ÜN-Kultur mit LB-Medium als
Ausgangsmaterial verwendet.
3.5.2.3. Präparation genomische DNA
Die Präparation der genomischen DNA wurde nach Anweisung des Herstellers (Fa.
Qiagen) durchgeführt. Dazu wurden jeweils 5 ml einer ÜN-Kultur mit LB-Medium als
Auisgangsmaterial verwendet.
Material und Methoden 56
3.5.2.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Zur qualitativen in vitro Amplifikation von DNA mit Hilfe der PCR wurden
Oligonukleotide (MWG Biotech) mit einer Anlagerungs-Temperatur von 60 °C als
Primer eingesetzt und mit Hilfe einer thermostabilen DNA-Polymerase
Sequenzabschnitte chromosomaler DNA vervielfältigt. Die beiden Primer für die
Initiierung der PCR sollten dabei möglichst folgende Charakteristika aufweisen:
annähernd gleiche Schmelzpunkte
am 3’-Ende ein Paar aus Guanosin oder Cytosin
keine hohen Homologien zu anderen Bereichen auf dem Genom
Die Schmelztemperatur Tm der Primer berechnete sich anhand der Formel
Tm= Σ (A+T) x 2 °C + Σ (G+C) x 4 °C Die optimale Anlagerungs-Temperatur wurde anschließend für das Primer-Paar
experimentell bestimmt.
Der Standard-Reaktionsansatz hatte folgende Zusammensetzung:
Ansatz 1:
2,0 µl DNA-Matrize (100 ng/µl)
0,3 µl Primer (+)-Strang (100pmol)
0,3 µl Primer (-)-Strang (100 pmol)
1,0 µl DMSO (100 %ig)
2,0 µl 10 x Reaktionspuffer (Sigma) mit 15 mM MgCl215,9 µl Aqua bidest.
Ansatz 2:
2,5 µl 8mM dNTPs (Amersham Pharmacia Biotech)
0,5 µl Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl)
0,5 µl 10 x Reaktionspuffer mit 15 mM MgCl2
Die Komponenten des Ansatzes 1 wurden auf Eis in ein Eppendorf-Reagiergefäß
(0,5 ml) pipettiert und mit 30 µl Paraffin überschichtet. Die Amplifikation erfolgte unter
Verwendung des nachfolgend beschriebenen Standard-PCR-Programms in einem
Material und Methoden 57
Thermocycler (Fa. Landgraf). Die Polymerase und Nukleinsäuren im Ansatz 2
wurden erst nach dem ersten Denaturierungsschritt in den Ansatz 1 eingemischt, da
sich die lange Inkubation bei hohen Temperaturen nachteilig auf deren Stabilität
auswirkt.
Reaktionsprogramm:
1. Denaturierung 10 min, 98 °C
2. Amplifikation a)Denaturierung 30 s, 98 °C
b)Anlagerung der Primer 1 min, Tm 60 °C
c) DNA-Synthese 1 min, 72 °C (Taq-Polymerase)
3. Inkubation 10 min, 72 °C
4.Aufbewahrung 4 °C
Die Anlagerungstemperatur entspricht der Schmelztemperatur Tm der verwendeten
Primer.
3.5.2.5. Agarose-Gelelektrophorese
Die elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten nach ihrem Molekulargewicht
zu analytischen Zwecken erfolgte in horizontalen Gelen mit einer Agarose-
Konzentration von 0,5 bis 1,5 % in TBE-Puffer (89 mM Tris, 89 mM H3BO3, 2 mM
EDTA, Aqua bidest., pH 8,0). Sie wurde mit einer Lauflänge von 10 cm und einer
Spannung von 80 bis 120 V durchgeführt. Die zu untersuchenden Proben mit 0,5 bis
1 µg DNA wurden mit glycerinhaltigem Laufpuffer versetzt, dessen Bromphenolanteil
gleichzeitig die Lauffront der Elektrophorese erkennen ließ. Nach der Auftrennung
wurden die Gele etwa 30 min in Ethidiumbromidlösung (2 mg/l) inkubiert. Die DNA
konnte anschließend durch Anregung des interkalierten Farbstoffs unter UV-Licht
(302 nm) sichtbar gemacht werden. Ein Größenstandard von 500 bis 104
Basenpaaren wurde grundsätzlich mitgeführt. Zur Dokumentation wurde das Easy
Enhanced Analysis System der Firma Herolab (Easy RH-3, Videokamera 429K)
verwendet.
Ergebnisse 58
4. Ergebnisse
4.1. Charakterisierung von P. aeruginosa SCVs und dem jeweiligen klonalen WT im Zytotoxizitäts-Assay mit J774.A1-Makrophagen
4.1.1. Vergleich der Zytotoxizität der autoaggregativen SCVs mit ihrem klonalen WT Der hier verwendete Zytotoxizitäts-Assay wurde von DACHEUX et al. (1999) zur
Charakterisierung der Typ III Sekretion beschrieben. In dieser Arbeit wurde unter
anderem der P. aeruginosa -Stamm CHA eingesetzt, der auch in der genannten
Studie verwendet wurde.
In der vorliegenden Arbeit sollte mit Hilfe dieses Assays festgestellt werden, ob die
bei einer genomweiten Transkriptomanalyse festgestellte erhöhte Expression von
Typ III Sekretions-Genen bei der SCV 20265 (VON GÖTZ, 2003) eine funktionelle
Bedeutung hat und ob dieses Phänomen auch bei anderen SCVs der von
HÄUSSLER et al. (2003) beschriebenen autoaggregativen Subgruppe auftritt. Die
Zytotoxizitäts-Assays wurden mit J774.A1-Makrophagen durchgeführt. Zu
bestimmten Zeitpunkten wurde die Freisetzung von LDH aus den Zellen als Maß der
Zellschädigung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Abb. 6 A – G dargestellt.
Abb. 6
B
Zyto
toxi
zitä
t (%
LD
H)
A
Zyto
toxi
zitä
t (%
LD
H)
Zeit (h)
0 1 2 3 4
0
20
40
60
80
100 20265 WT 20265 SCV 20265 SCVexsA
Zeit (h)
0 1 2 3 4
0
20
40
60
80
100 52 WT 52 SCV
Ergebnisse 59
Zyto
toxi
zitä
t (%
)
Zeit (h)
0 1 2 3 4 5
Zyto
toxi
zitä
t (%
LD
H)
0
20
40
60
80
100 8226 WT 8226 SCV
C
Zeit (h)
0 1 2 3 4 5
Zyto
toxi
zitä
t (%
LD
H)
0
20
40
60
80
100 29 WT 29 SCV
E Zy
toto
xizi
tät (
% L
DH
)
Zeit (h)
0 1 2 3 4 5
Zyto
toxi
zitä
t (%
LD
H)
0
20
40
60
80
100 17997 WT 17997 SCV
G
Abb. 6 A – G: Vergleich der Zytotoxizität vZytotoxizitäts-Assay mit J774.A1-Maktophage
D
Zeit (h)
0 1 2 3 4
0
20
40
60
80
100231 WT231 SCV
F
Zeit (h)
0 1 2 3 4 5
0
20
40
60
80
100 10 WT 10 SCV
on P. aeruginosa WT und SCV im n. Die Werte sind Mittelwerte mit
Ergebnisse 60
Standardabweichungen eines repräsentativen Versuchs mit jeweils Dreifachwerten. Alle
Stämme wurden dreimal getestet. Dargestellt ist die Freisetzung von LDH als Maß der
Zytotoxizität in Abhängigkeit von der Infektionszeit. Es wurden die Stämme 20265 (A), 52
(B), 8226 (C), 231 (D), 29 (E), 10 (F) und 17997 (G) getestet. Für den Stamm 20265 wurde
zum Nachweis der Typ III Sekretions-vermittelten Zytotoxizität eine exsA-knock-out-Mutante
eingesetzt (A).
___________________________________________________________________
Aus den Graphen ist ersichtlich, dass vier der sieben autoaggregativen SCVs eine
erhöhte Zytotoxizität gegenüber dem WT aufwiesen (A, B, C und D). Die erhöhte
Expression von Typ III Genen bei 20265 SCV erwies sich als funktional. Eine
getestete Typ III-knock-out Mutante (20265 SCVexsA) zeigte keine Zytotoxizität
mehr (A). ExsA ist einer der Hauptregulatoren der Typ III Sekretion (YAHR et al.,
1995). 8226 SCV (C) zeigte im Vergleich zu den anderen drei SCVs einen deutlich
verlangsamten Anstieg der Zytotoxizität. Die WT-Phänotypen dieser vier SCVs
reagierten uneinheitlich. Während 20265 WT (A) und 52 WT (B) ebenfalls
Zytotoxizität aufwiesen, konnte dies bei 8226 (C) und 231 WT (D) nicht festgestellt
werden. Die drei verbleibenden Stämme (E, F und G) reagierten ebenfalls
uneinheitlich. Während bei 17997 weder WT noch SCV eine ausgeprägte
Zytotoxizität aufwiesen (G), war diese bei 29 (E) und 10 (F) WT gegenüber den
jeweiligen SCVs erhöht. Dabei war der Anstieg der Zytotoxizität bei 29 WT ähnlich
dem der SCVs 20265 und 52, während 10 WT nur langsam zytotoxisch reagierte.
4.1.2. Vergleich der Zytotoxizität nicht-autoaggregativer SCVs mit ihrem klonalen WT Um festzustellen, ob die erhöhte Zytotoxizität bei einigen der SCVs der
autoaggregativen Subgruppe zu den besonderen Eigenschaften dieser Gruppe
gehört oder ein generell auftretendes Phänomen bei SCVs darstellt, wurden 8
weitere klinische Isolate im Zytotoxizitäts-Assay getestet. Auch hier wurden
Ergebnisse 61
vergleichend die klonalen WT-Phänotypen getestet. Alle Stämme wurden zweimal
getestet. Die Ergebnisse sind in Abb. 7 dargestellt.
Abb. 7
Zyto
toxi
zitä
t (%
LD
H)
0
20
40
60
80
100 WT SCV
Stamm 18 Stamm 35 Stamm 6998 Stamm 50
4 h p. i.
A
Zyto
toxi
zitä
t (%
LD
H)
0
20
40
60
80
100
Abb. 7 A u. B: Vergleich der Zytotoxizität von nicklonalen WT. Die Werte sind Mittelwerte mit Stand
Versuchs mit jeweils Dreifachwerten. Dargestellt is
Zytotoxizität 4 Stunden nach Infektion der Zellen.
Aus den Abbildungen ist zu sehen, dass au
Stämme eine nennenswerte Zytotoxizität auftritt
24 Stunden zeigten kein anderes Ergebnis.
Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse,
dem autoaggregativen Phänotyp der SCVs und
Von sieben autoaggregativen SCVs waren vie
von acht nicht-autoaggregativen SCVs keine z
von autoaggregativem Verhalten und Zytotox
werden (Chi-Square-Test; p < 0,025).
B
4 h p. i.
WT scv
Stamm 26 Stamm 4211 Stamm 113 Stamm 211
ht autoaggregativen SCVs und ihrem ardabweichungen eines repräsentativen
t die Freisetzung von LDH als Maß der
ßer bei WT 26 (B) bei keinem der
. Auch längere Infektionszeiten bis zu
dass ein Zusammenhang zwischen
einer erhöhten Zytotoxizität besteht.
r vermehrt zytotoxisch, wohingegen
ytotoxisch war. Ein Zusammenhang
izität konnte auch statistisch belegt
Ergebnisse 62
4.2. Nachweis von Typ III-Sekretionssystem-Proteinen im Kulturüberstand von P. aeruginosa SCVs 4.2.1. SDS-Gele mit anschließender Silbernitrat-Färbung Vier der sieben autoaggregativen SCVs zeigten eine erhöhte Zytotoxizität im
Vergleich zu ihrem WT. Nur von Stamm 20265 war durch die Genexpressions-
Analysen durch VON GÖTZ (2003) erwiesen, dass die SCV eine erhöhte Expression
von Typ III-Genen aufweist. Um nachzuweisen, dass die erhöhte Zytotoxizität
tatsächlich mit einer erhöhten Expression des Typ III Sekretionssystems einhergeht,
sollten die entsprechenden Typ III Proteine mit geeigneten Methoden bei allen
zytotoxischen SCVs detektiert werden. Zum Nachweis der Proteine wurden
Kulturüberstände von den Bakterien nach Anzucht in Calcium-depletierten Medium
mittels Acrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) aufgetrennt und die Proteinbanden
anschließend durch eine Silbernitrat-Färbung sichtbar gemacht. Dies wurde für alle
sieben Stämme der autoaggregativen Subgruppe und für die nicht-autoaggregativen
Stämme durchgeführt.
Bei keinem der nicht-autoaggregativen Stämme zeigte sich unter den gewählten
experimentellen Bedingungen eine Bande in der den Typ III-Proteinen
entsprechenden Höhe, weshalb auf eine Darstellung im Folgenden verzichtet wird.
Die vier autoaggregativen SCVs, die vermehrt zytotoxisch waren, sind vergleichend
mit ihrem WT in Abb. 8 aufgeführt. Bei den anderen drei autoaggregativen SCVs und
ihren WT konnten keine eindeutigen Banden gefunden werden, weshalb auch hier
auf die Darstellung verzichtet wurde.
Ergebnisse 63
Abb. 8
61,3 kD 49,0 kD 36,4 kD 24,7 kD 19,2 kD
Stan
AbW23
in
Se
Ei
all
23
kD
un
Au
(B
A
x
x x x
x x
x
x x
x
x
x x x
x x
x
ExoT
ExoS
PopB
PcrV
a
a
a
a
a
dard 20265 20265 52 WT 52 SCV 8226 8226 WT SCV WT SCV
61,3 kD 49,0 kD 36,4 kD 24,7 kD 19,2 kD
Sta
b. 8: Silbernitrat-Färbung von SDS-Gelen mit SCVs und iT. (A) zeigt von links nach rechts die Stämme 20265, 52 und
1. Zuerst wurde jeweils der WT, dann die SCV aufgetragen. Pa
der ersten Spur ein Proteinstandard aufgetragen. (x) zeigt die
kretions-Proteinbanden.
n Protein mit einem Molekulargewicht von 40 kDa, wahr
en Morphotypen der vier Stämme zu finden. 20265 SCV,
1 SCV zeigten außerdem Typ III-spezifische Banden auf
a), ExoS (47,5 kDa) und PcrV (32,2 kDa), wobei die ExoS
d 231 SCV schwach war (kann für 20265 SCV im Weste
ch die Bande auf Höhe von PcrV war bei 20265
estätigung im Blot). Von den WT dieser Stämme zeigten 5
B
x
x x x
x x
ExoT
ExoS
PopB
PcrV
a
a
a
a
a
ndard 231 WT 231 SCV
hrem jeweiligen klonalen 8226. (B) zeigt den Stamm
rallel wurde bei jedem Gel
charakteristischen Typ III
scheinlich PopB war bei
52 SCV, 8226 SCV und
Höhe von ExoT (ca. 53
-Bande bei 20265, 8226
rn Blot bestätigt werden).
und 231 nur schwach
2 WT, 8226 WT und 231
Ergebnisse 64
WT neben der Bande auf Höhe von PopB auch schwache Banden in der Höhe von
ExoT, Banden in Höhe von ExoS oder PcrV waren nicht zu erkennen.
4.2.2. SDS-Gele mit anschließendem Western Blot Mit der Silbernitrat-Färbung konnte nur festgestellt werden, ob Banden vorhanden
waren, die in ihrer Höhe denen der Typ III-Proteine entsprachen. Um die Befunde der
Silbernitrat-Färbung zu bestätigen, wurde ein Western Blot mit spezifischen
Antikörpern gegen die Typ III-Proteine ExoS und PcrV (Kaninchen-Antikörper, Anti-
ExoS und Anti-PcrV) durchgeführt. Für 20265, 52 und 231 SCV konnten spezifische
Reaktionen der Antikörper festgestellt werden, die in Abb. 9 dargestellt sind. Die
Gele für Blot und Silbernitrat-Färbung wurden zur selben Zeit angefertigt. Die
Anwesenheit von Banden auf Höhe von ExoS und PcrV bei 20265 und 231 im Blot
bestätigen daher die nur schwachen Banden in der Silbernitrat-Färbung.
Es stand nur eine begrenzte Menge Anti-ExoS zur Verfügung. Da der Stamm 231
erst nachträglich integriert wurde, konnte nur die Anwesenheit von PcrV überprüft
werden, was ein Fehlen einer ExoS-Bande im Blot erklärt. Bei 8226 konnte bei der
SCV kein spezifisches Signal festgestellt werden. Hier könnte man spekulieren, dass
die verwendeten Antikörper Epitope erkennen, die bei den Typ III-Proteinen der SCV
8226 nicht exprimiert werden.
Die jeweils zugehörigen WT zeigten keine spezifischen Signale im Blot.
Ergebnisse 65
Abb. 9
B
Abb. 9Ergeb
A
20265 20265 52 WT 52 SCV WT SCV
ExoS
PcrV
: Western Blot mit spezifischen Antinisse für die Stämme 20265 und 52, (B)
61,3 kDa
49,0 kDa
36,4 kDa
24,7 kDa
19,2 kDa
köd
231 WT 231 SCV
61,3 kDa 49,0 kDa 36,4 kDa 24,7 kDa 19 2 kDa
rpern gegen ExoS und PcrV. (A) zeigt die
ie Ergebnisse für 231.
Ergebnisse 66
4.3. Überexpression des pvrR-Gens in P. aeruginosa SCVs
4.3.1. Nachweis des pvrR-Gens nach Übertragung mittels Elektroporation in den SCVs
DRENKARD u. AUSUBEL (2002) postulierten, dass das pvrR-Gen, das einen Zwei-
Komponenten Response Regulator kodiert, eine Schlüsselrolle in der Entstehung
des SCV-Phänotyp hat. In trans Komplementation führte bei in vitro generierten
SCVs von P. aeruginosa PA 14 zu einem WT-Phänotyp. Genomische Deletion im
WT von PA 14 führte zu einer gesteigerten Frequenz des Auftretens von SCVs in der
WT-Population. Für die in dieser Studie verwendeten zytotoxischen SCVs sollte nun
die Rolle von pvrR bei in vivo entstandenen SCVs getestet werden. Die
verwendeten Isolate 20265 (VON GÖTZ, 2003), 52, 8226 und 231 (jeweils WT und
SCV) wurden mittels PCR auf das Vorhandensein von pvrR im Genom überprüft. Die
Grundlage für die eingesetzten Primer bildeten Genomsequenzen von P. aeruginosa
PA 14. Es war nicht möglich, das gesamte Gen pvrR zu amplifizieren. Nachgewiesen
wurde ein 597 bp großes, internes Fragment von pvrR. Durch Sequenzierung konnte
dies für Stamm 20265 bestätigt werden (VON GÖTZ, nicht publizierte Daten). Wie in
Abb. 10 zu sehen ist, konnte bei allen Isolaten dieses pvrR-Fragment nachgewiesen
werden.
Abb. 10
DNA- H2O PA14 PA14 20265 20265 231 231 8226 8226 52WT 52SCV Leiter WT SCV WT SCV WT SCV
1 kb
0,5 kb
597 bp
Abb. 10: Nachweis von pvrR in den P. aeruginosa-Isolaten 20265, 52, 8226 und 231. Dargestellt ist jeweils ein 597 bp großes Fragment von pvrR. PA 14 diente als
Positivkontrolle.
Ergebnisse 67
Um den Einfluss von pvrR auf den SCV-Phänotyp zu charakterisieren, wurde das
Plasmid pED202 verwendet, das freundlicherweise von E. Drenkard (Harvard
Medical School, Boston) zur Verfügung gestellt wurde. Das Plasmid pED202 besteht
aus dem Vektor pUCP19 mit einem in die PstI-Schnittstelle klonierten etwa 3,5 kb
großen DNA-Fragment, welches pvrR als einziges komplettes Gen umfasst. Dieses
Plasmid wurde mittels Elektroporation in die SCV und den zugehörigen WT von P.
aeruginosa 20265 (VON GÖTZ, 2003), 52, 8226 und 231 verbracht. Aufgrund einer
an das Plasmid gekoppelten Carbenicillin-Resistenz konnten die Klone, bei denen
die Elektroporation erfolgreich war, auf Selektivagar isoliert werden. Anschließend
wurde der Nachweis, dass das vollständige Plasmid in den Bakterien enthalten war,
durch eine Plasmidpräparation und anschließende Auftrennung der DNA in einer
Agarose-Gelelektrophorese geführt. Dazu wurde das präparierte Plasmid mit dem
Enzym PstI geschnitten, wodurch zwei Fragmente entstanden, zum einen der etwa
4500 bp große Vektor pUCP19 und zum anderen das etwa 3500 bp große Gen pvrR.
Diese Fragmente konnten bei den SCVs und WT von 20265 (VON GÖTZ, 2003),
8226 und 231nachgewiesen werden (Abb. 11).
Es war nicht möglich, das Plasmid auf diesem Weg in der komplementierten SCV
des Stammes 52 (52 SCVpED202) nachzuweisen. Daher wurde hier das pvrR-Gen
aus dem Plasmid nach Plasmidpräparation mittels PCR amplifiziert (siehe Abb. 12).
Da außerdem die Antibiotikaresistenz bei der Komplementante vorhanden war und
die phänotypische Charakterisierung (s. u.) ähnliche Ergebnisse lieferten wie die
Komplementanten von 8226 und 231, konnte davon ausgegangen werden, dass das
pvrR-Gen in 52 SCVpED202 exprimiert wurde.
Ergebnisse 68
Abb. 11
~4,5 kb ~3,5 kb
Abb. 11: Nachweis des Plasmids pED202. Dargestellt sind jeweils die
beiden Fragmente pUCP19 (~4,5 kb)
und pvrR (~3,5 kb). (A) zeigt das
Ergebnis für 8226 WT und SCV, (B)
das Ergebnis für 231 WT und SCV.
Abb.
597 bp
WT SCV DNA- Leiter
12
1 0
DNA- WT SCV Leiter
kb
,5 kb
Abb. 12: Nachweis des pvrR-Gens in 52SCVpED202. Dargestellt ist jeweils das PCR-
Produkt eines 597 bp großen internen
Fragments von pvrR in 52 WT, SCV und
SCVpED202. Bei WT und SCV war das
Ausgangsmaterial genomische DNA, bei
SCVpED202 Plasmid-DNA.
WT SCV SCV DNA-Leiter pED202A
BErgebnisse 69
Der komplementierte WT diente bei den folgenden Experimenten als Kontrolle, dass
das pvrR-Gen für eventuelle phänotypische Veränderungen in den SCVs
verantwortlich ist, den WT-Phänotyp aber nicht beeinflusst. Das heißt, der
komplementierte WT sollte in allen Experimenten dem WT gleichen.
4.3.2. Mikrobiologische Charakterisierung im Vergleich zu SCV und WT
4.3.2.1. Koloniemorphologie
Nachdem das pvrR-Gen durch Elektroporation in die SCVs verbracht wurde und das
Vorhandensein überprüft war (siehe 4.3.1.), wurden WT, SCV und Komplementanten
(SCVpED202, WTpED202) zum Vergleich der Koloniemorphologie auf Columbia-
Blutagar ausgestrichen. Die Koloniemorphologie der einzelnen Phänotypen ist in
Abb. 13 vergleichend dargestellt. Dabei wurde auf die Darstellung der
komplementierten WT verzichtet, da keine Abweichungen von der WT-Morphologie
auftraten.
Ergebnisse 70
Abb. 13
2
_______
_______
_______
Abb. 1SCVpEDColumbi
_______
Aus den
zumind
bei den
waren b
ihrer Gr
WT
_________________
_________________
_________________
3: Vergleichende D202. Dargestellt sind
a-Blutagar nach 48 h
________________
Bildern wird deutli
est teilweise im Ver
Komplementanten
ei den Komplemen
öße den SCVs ent
SCV
_______________
_______________
_______________
arstellung der jeweils die drei M
Bebrütung bei 37
_______________
ch, dass die Kol
gleich zur SCV z
von 20265 und
tanten von 8226
sprachen. Die Ko
SCVpED20
Stamm 231
Stamm 8226
Stamm 52
Stamm 20265
_____________________________________
_____________________________________
_____________________________________
Koloniemorphologie von WT, SCV und orphotypen von 20265, 52, 8226 und 231auf
°C.
____________________________________
oniegröße bei allen vier Komplementanten
unahm. Während jedoch die Morphologie
52 weitgehend den Wildtypen entsprach,
und 231 auch Kolonien zu finden, die in
mplementante von 231 wies zudem nicht
Ergebnisse 71
die mukoide Beschaffenheit auf wie der zugehörige WT. Wurden die Kolonien der
Komplementanten von 8226 und 231, die in ihrer Größe den SCVs entsprachen, auf
antibiotikahaltigem Agar ausgestrichen, waren sie in der Lage zu wachsen. Dies wies
darauf hin, dass das Plasmid mit dem pvrR-Gen noch vorhanden war. Alle
Morphotypen wiesen Hämolyse auf (teilweise bei SCVs und SCVpED202 nur
schmale Hämolyse-Höfe, daher auf einigen Bildern nicht sichtbar).
4.3.2.2. Swimming motility
HÄUSSLER et al. (2003) beschrieben eine Reduktion des Schwimmverhaltens in der
autoaggregativen Subgruppe von SCVs im Vergleich zum WT auf 0,3 %igem Agar.
Bestätigt wurden diese Ergebnisse durch WEHMHÖNER (2003) und v. GÖTZ
(2003), die eine Reduktion der Expression von Strukturproteinen bzw. der
verantwortlichen Gene für den Flagellenapparat bei einem repräsentativen Vertreter
der SCV-Subgruppe (20256 SCV) feststellten. Die Untersuchung des
Schwimmverhaltens der pvrR-Komplementanten im Vergleich zu WT und SCV diente
zur weiteren Charakterisierung möglicher Funktionen von pvrR bei der Entstehung
des SCV-Phänotyps. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Abb. 14
dargestellt. Auch hier wurde darauf verzichtet, die komplementierten WT mit
abzubilden, da es keine Abweichungen vom WT-Phänotyp gab.
Ergebnisse 72
Abb. 14
T
______
______
______
Abb. 1SCVpED0,3 %ige
Dargest
Aus de
Schwim
Komple
bereits
Phänoty
interme
Komple
gegenü
W
__________________
__________________
__________________
4: Vergleichende Da202. Dargestellt sind j
m Agar nach 48h Beb
ellt ist ein repräsentativ
r Abbildung wird
mverhalten im Ver
mentante von 231 de
auf Blutagar sichtb
p des WT zeigt. Die
diären Phänotyp,
mentante von 52
ber der SCV. Der Un
SCV
__________________
__________________
__________________
rstellung des Schweweils die drei Morph
rütung bei 37 °C. Alle
er Versuch.
deutlich, dass all
gleich zur SCV a
n Durchmesser des
ar, dass die Kom
Komplementanten
jedoch mit deut
zeigte nur ein w
terschied wurde bei
SCVpED202
Stamm 231
Stamm 8226
Stamm 52
Stamm 20265
__________________________________
__________________________________
__________________________________
immverhaltens von WT, SCV und otypen von 20265, 52, 8226 und 231auf
Morphotypen wurden dreimal getestet.
e Komplementanten ein erhöhtes
ufwiesen. Dabei erreichte nur die
WT. Allerdings wurde auch hier wie
plementante nicht den mukoiden
von 20265 und 8226 zeigten einen
licher Tendenz zum WT. Die
enig erhöhtes Schwimmverhalten
diesem Stamm deutlicher, wenn die
Ergebnisse 73
Platten für 72 h bebrütet wurden. WT und SCVpED202 hatten dann die Platte mit
einem vollständigen Rasen bedeckt, während die SCV einen geringeren
Durchmesser aufwies.
4.3.2.3. Twitching motility und Autoaggregation
HÄUSSLER et al. (2003) zeigten dass die SCVs der beschriebenen Subgruppe im
Vergleich zu ihrem klonalen WT ein erhöhtes Twitching-Vermögen hatten. Daher bot
sich dieser Test für eine weitere Charakterisierung der pvrR-Komplementanten an.
Die Komplementanten wurden vergleichend mit SCV und WT auf 1 %igem Agar in
unter 3.1.5.2. beschriebener Weise angeimpft und für 48 h bebrütet. Die Ergebnisse
sind in Tab. 4 zusammengefasst.
Tab. 4:
Durchmesser der Twitching-Höfe (mm)
Stamm
Versuch I Versuch II WT Ø Ø SCV 21,3±1,5 18,3±1,2
20265
SCVpED202 23,0±1,0 20,7±2,1 WT 11,7±1,5 15,3±0,6 SCV 16,3±1,5 19,3±0,6
52
SCVpED202 6,3±1,2 5,3±1,5 WT 3,0±1,0 3,3±0,6 SCV 10,7±0,6 11,3±1,5
8226
SCVpED202 3,0±1,7 3,3±0,6 WT 2,0±1,0 Ø SCV 9,7±1,5 7,7±0,6
231
SCVpED202 Ø 1,7±0,6 Tab. 4: Vergleich des Twitching-Vermögens von WT, SCV und SCVpED202. In der
Tabelle sind die Ergebnisse aus zwei unabhängigen Versuchen zusammengefasst. Je
Morphotyp wurden in jedem Versuch drei Platten angeimpft. Dargestellt sind Mittelwerte mit
Standardabweichung der Durchmesser (in mm) der Twitching-Höfe nach 48 h Bebrütung bei
37 °C auf 1 %igem Agar. Ø steht für ausbleibendes Twitching-Vermögen.
Ergebnisse 74
Bei drei von vier Komplementanten veränderte sich das Twitching-Vermögen im
Vergleich zur SCV. Die Komplementanten von 8226 und 231 verhielten sich dabei
genau wie der jeweilige WT, das heißt, sie zeigten ein gegenüber der SCV
vermindertes Twitching. 52 SCVpED202 war auch dem WT ähnlich, allerdings war
das Twitching-Vermögen noch weiter reduziert. Das Twitching-Vermögen von 20265
SCVpED202 glich dem der SCV. Die ebenfalls getesteten WT-Komplementanten
entsprachen wie erwartet den jeweiligen WT (Daten nicht gezeigt).
Die Subgruppe der von HÄUSSLER et al. (2003) beschriebenen SCVs war vor allem
durch ihr autoaggregatives Verhalten in bestimmten Medien auffällig. Deshalb wurde
dieser Test ebenfalls zur Charakterisierung der pvrR-Komplementanten eingesetzt.
Dazu wurden die unterschiedlichen Morphotypen in Vogel-Bonner-Medium angeimpft
und bei 37 °C im Schüttelinkubator bis zur stationären Phase kultiviert. Die SCVs
zeigten alle im Vergleich zum entsprechenden WT Klumpenbildung ab der späten
log-Phase. Wie in Tab. 5 dargestellt, konnte bei keiner der pvrR-Komplementanten
Klumpenbildung festgestellt werden. Durch pvrR wurde das autoaggregative
Verhalten der SCVs vollständig eliminiert.
Tab. 5:
Stamm WT SCV SCVpED20220265 - + - 52 - + - 8226 - + - 231 - + -
Tab. 5: Vergleich der Autoaggregation von WT, SCV und SCVpED202. Die Bakterien
wurden mit einer OD650 von 0,1 in Vogel-Bonner-Medium angeimpft und bis zur stationären
Phase kultiviert.
4.3.3. Verhalten im Zytotoxizitäts-Assay im Vergleich zu SCV und WT
Wie unter 4.1.1., Abb. 6 A - D zu sehen, zeigten SCVs von 20265, 52, 8226 und 231
im Zytotoxizitäts-Assay eine gegenüber dem zugehörigen WT deutlich erhöhte
Ergebnisse 75
Zytotoxizität. Es stellte sich die Frage, ob durch die Komplementation mit pvrR die
Zytotoxizität unbeeinflusst bleibt oder eine Reduktion der Zytotoxizität und damit der
WT-Phänotyp erreicht wird. Dazu wurden die Komplementanten vergleichend mit
WT und SCV getestet. Der Verlauf der Zytotoxizität von WT, SCV und SCVpED202
ist in der folgenden Abb. 15 A – D graphisch dargestellt.
Abb. 15
Zeit (h)
0 1 2 3 4 5
Zyto
toxi
zitä
t (%
LD
H)
0
20
40
60
80
100 20265 WT 20265 SCV 20265 SCVpED202
A
Zeit (h)
0 1 2 3 4 5
Zyto
toxi
zitä
t (%
LD
H)
0
20
40
60
80
100 52 WT52 SCV52 SCVpED202
Zyto
toxi
zitä
t (%
LD
H)
0
20
40
60
80
100
C
Zyto
toxi
zitä
t (%
LD
H)
0
20
40
60
80
100
Zeit (h)
0 1 2 3 4 5
8226 WT8226 SCV8226 SCVpED202
B
D
Zeit (h)
0 1 2 3 4 5
231 WT231 SCV231 SCVpED202
Abb. 15 A – D: Vergleich der Zytotoxizität von WT, SCV und SCVpED202 im Zytotoxizitäts-Assay mit J774.A1-Makrophagen. Die Werte sind Mittelwerte mit
Standardabweichungen eines repräsentativen Versuchs mit jeweils Dreifachwerten. Alle
Stämme wurden zweimal getestet. Dargestellt ist die Freisetzung von LDH als Maß der
Zytotoxizität in Abhängigkeit von der Infektionszeit.
Ergebnisse 76
Aus den Graphen kann abgeleitet werden, dass das pvrR-Gen bei drei der vier
Stämme keinen Einfluss auf die Zytotoxizität hatte. Die Komplementanten von
20265, 52 und 231 zeigten einen nahezu identischen Verlauf der Zytotoxizität wie die
entsprechenden SCVs. Nur die Komplementante von 8226 SCV stellte sich
abweichend dar. Hier war keine Zytotoxizität – entsprechend dem WT –
festzustellen. Die komplementierten WT zeigten den gleichen Zytotxizitätsverlauf wie
die entsprechenden WT (Daten nicht gezeigt).
Ergebnisse 77
4.4. Virulenzanalyse von zytotoxischen P. aeruginosa SCVs und den klonalen WT im BALB/c-Mausmodell nach intranasaler Infektion 4.4.1. Untersuchungen zur Morbidität und Mortalität Hier sollte untersucht werden, ob die erhöhte Zytotoxizität der SCVs 20265, 52, 8226
und 231 verglichen mit dem klonalen WT mit einer erhöhten in vivo Virulenz
korreliert. Dazu wurden Gruppen von BALB/c-Mäusen mit einer Infektionsdosis von 1
x 108 Bakterien je Morphotyp intranasal infiziert. Um festzustellen, in wie weit die
Virulenz auf das Typ III Sekretionssystem zurückgeführt werden kann, wurde eine
Gruppe von Mäusen mit der exsA-knock-out-Mutante 20265 SCVexsA infiziert. Die
Morbidität wurde täglich protokolliert. Besonders wurde auf Krankheitssymptome wie
Dyspnoe, Konjunktivitis, Beschaffenheit des Haarkleids (Struppigkeit) und Apathie
geachtet. Auch das Sozialverhalten der Tiere wurde berücksichtigt (Kontakt zwischen
den Tieren, Nestbau).Täglich wurde das Gewicht der einzelnen Tiere bestimmt. Die
Mortalität ist in den Abb. 16 A – D mit Kaplan-Meyer-Überlebenskurven vergleichend
dargestellt.
Ergebnisse 78
Abb. 16
Zeit (d)
1 2 3 4 5 6 7
lebe
nde
Tier
e
0
2
4
6
8
10
1220265 WT 20265 SCV 20265 SCVexsA-
Zeit (d)
1 2 3 4 5 6 7
lebe
nde
Tier
e
0
2
4
6
8
8226 WT 8226 SCV
lebe
nde
Tier
ele
bend
e Ti
ere
Alle SCV-infizierten Tiere verstarben signifi
Statistische Auswertungen mittels Kaplan
signifikant höhere Mortalität der SCV 20265
3; p < 0,01), der SCV 8226 (Tag 5; p < 0,01
Vergleich zu ihrem klonalen WT. Weiterhi
Krankheitsverlauf bei WT-infizierten Tieren m
B
Zeit (d)
1 2 3 4 5 6 7
0
2
4
6
8
52 WT 52 SCV
C
DA
Zeit (d)
1 2 3 4 5 6 7
0
2
4
6
8231 WT 231 SCV
Abb. 16 A – D: Vergleich der Mortalität von WT und SCV von 20265, 52, 8226 und 231. Sterbekurven nach intranasaler Infektion von BALB/c-Mäusen mit 1 x 108 Bakterien je
Morphotyp. Die Daten sind jeweils aus zwei unabhängig voneinander durchgeführten
Experimenten gepoolt. Bei Stamm 20265 wurde die Typ III Sekretions-defiziente Mutante
SCVexsA eingesetzt (A).
kant früher als die WT-infizierten Tiere.
-Meyer-Survival-Statistik ergaben eine
(Tag 3 p. i.; p = 0,01), der SCV 52 (Tag
) und der SCV 231 (Tag 3; p < 0,01) im
n konnte festgestellt werden, dass der
ilder war als bei Tieren, die mit der SCV
Ergebnisse 79
infiziert waren. Diese zeigten verstärkte Dyspnoe, purulente Konjunktivitis, struppiges
Haarkleid und Apathie. Unterschiede in der Gewichtsabnahme konnten nicht
festgestellt werden. Während die Krankheitssymptome bei den überlebenden WT-
infizierten Tieren schnell abnahmen und eine rasche Gewichtszunahme festzustellen
war, zeigten überlebende SCV-infizierte Tiere noch längere Zeit Dyspnoe und
nahmen nur langsam an Gewicht zu.
In Abb. 16 A kann man sehen, dass die exsA-knock-out-Mutante 20265 SCVexsA
eine Attenuierung gegenüber der SCV 20265, aufwies. Dabei konnte statistisch ein
signifikanter Unterschied zwischen SCV und SCVexsA am Tag 3 festgestellt werden
(p < 0,01). Auch die Krankheitssymptome waren deutlich weniger ausgeprägt –
ähnlich den WT-infizierten Tieren – als bei den SCV-infizierten Tieren. Zu späteren
Zeitpunkten waren die Unterschiede weniger deutlich. Die überlebenden SCVexsA-
infizierten Mäuse nahmen jedoch an Tag 7 bereits wieder an Gewicht zu, während
die überlebende SCV-infizierte Maus noch einige Tage Dyspnoe zeigte und erst ab
Tag 12 an Gewicht zunahm.
4.4.2. Vergleich der Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz Die Ergebnisse der Infektionsversuche führten zu der Frage, ob eine erhöhte
Morbidität und Mortalität mit einer höheren Keimzahl in der Lunge, aber auch in
anderen Organen wie Leber und Milz, einherging. Dazu wurden BALB/c-Mäuse
intranasal infiziert und nach 12 h seziert. Lunge, Leber und Milz wurden entnommen,
homogenisiert und Verdünnungen dieser Homogenate ausplattiert. Die Versuche
wurden durchgeführt für den Stamm 20265 und 52. Bei Stamm 20265 wurden auch
die Keimzahlen von Tieren bestimmt, die mit der Typ III-knock-out-Mutante 20265
SCVexsA infiziert waren. Die Ergebnisse sind für 20265 in Abb. 17 A und für 52 in
Abb. 17 B graphisch dargestellt.
Ergebnisse 80
Abb. 17
CFU
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
AbSC12
Da
Er
(AKe
wa
log
ein
für
Ve
me
0,0
de
wa
re
52
wa
Ke
A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
20265 WT20265 SCV20265 SCVexsA-
Lunge Leber Milz
CFU
b. 17: Vergleich der Keimzahlen in LungeVexsA infizierten BALB/c-Mäusen. Untersu
h nach intranasaler Infektion mit 1 x 108 Bak
ten aus zwei unabhängig voneinander du
gebnisse für 20265 WT, SCV und SCVexsA, (
) Wie erwartet, waren die Lungen a
imzahlen bei 20265 WT und SCVexsA
ren in den Lungen von SCV-infizierten T
-Stufe höher lagen als die Infektionsdos
e signifikanten Unterschied für den Verg
den Vergleich von SCV und SCVexsA (p
rgleiche der Keimzahlen in Leber und Mi
hr Bakterien in beiden Organen als WT u
01 in der Leber, p = 0,002 in der Milz; V
r Leber, p = 0,002 in der Milz). Die Lebern
ren nahezu gleich stark besiedelt, in
duzierte Besiedelung gegenüber dem WT
waren erwartungsgemäß die Lungen am
ren auch bei 52 SCV die Bakterien
imzahlen von fast einer log-Stufe mehr al
B
101
102
103
104
105
106
107
108
109
1010
52 WT 52 SCV
Lunge Leber Milz
, Leber und Milz von mit WT, SCV oder cht wurden die Keimzahlen in den Organen
terien. Dargestellt sind jeweils die gepoolten
rchgeführten Experimenten. (A) zeigt die
B) die Ergebnisse für 52 WT und SCV.
m stärksten besiedelt. Während die
im Bereich der Infektionsdosis lagen,
ieren Keimzahlen zu finden, die ca. eine
is. Eine statistische Auswertung ergab
leich von WT und SCV (p = 0,007) und
<0,001). Ähnlich verhielt sich dies für die
lz. SCV-infizierte Tiere hatten signifikant
nd SCVexsA (Vergleich SCV zu WT p <
ergleich SCV zu SCVexsA p < 0,001 in
bei WT- und SCVexsA-infizierten Tieren
der Milz konnte bei der Mutante eine
festgestellt werden. (B) Auch bei Stamm
stärksten besiedelt. Wie bei 20265 SCV
in der Lage zu replizieren, wodurch
s der Infektionsdosis festgestellt wurden.
Ergebnisse 81
52 WT konnte teilweise eliminiert werden, wodurch die Keimzahl um etwa eine log-
Stufe reduziert wurde. Auch hier wurden statistisch signifikante Unterschiede
zwischen SCV und WT festgestellt (p = 0,007). Auch die Keimzahlen in Leber und
Milz waren bei WT-infizierten Tieren signifikant niedriger (Leber: p < 0,001; Milz: p <
0,001).
4.4.3. Vergleich der histopathologischen Veränderungen in Lunge und Nasopharynx Mit den histopathologischen Untersuchungen von Lunge und Nasopharynx sollte
festgestellt werden, ob es spezifisch durch die unterschiedlichen Morphotypen
verursachte Veränderungen des Gewebes gibt. Untersucht wurden die
unterschiedlichen Morphotypen von 20265 und 52. Um festzustellen, welche
Veränderungen auf die erhöhte Typ III Sekretion zurückzuführen sind, wurden im
Vergleich zu mit 20265 SCV infizierten Tieren auch Tiere untersucht, die mit
SCVexsA von 20265 infiziert waren. Der Schwerpunkt der Untersuchung lag dabei
auf Lokalisation, Schwere und Art der Entzündungsreaktion sowie eine
Charakterisierung der anwesenden Zelltypen.
Die Herstellung der histologischen Präparate erfolgte in Zusammenarbeit mit Prof. K.
Kamino (Institut für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover).
Die Ergebnisse der Lungen-Untersuchungen sind im Folgenden in Abb. 18 und 19
für Stamm 20265 und 20 für Stamm 52 gezeigt. Abb. 18 A und 19 A zeigen
Ausschnitte aus der Lunge von mit 20265 WT infizierten Mäusen, 18 B und 19 B
Ausschnitte von mit 20265 SCV infizierten Mäusen und 18 C und 19 C Ausschnitte
von mit 20265 SCVexsA infizierten Mäusen. Abb. 20 A und B stellen die Infektion
mit dem WT, C und D die Infektion mit der SCV von Stamm 52 dar. Abb. 21 A und B
zeigen die Besonderheit der Bakterienansammlungen in den SCV-infizierten Lungen.
In Abb. 22 A – C sind die Veränderungen in Nasopharynx von WT- oder SCV-
infizierten Tieren dargestellt.
Ergebnisse 82
Abb. 18
Vergrößerung x200
A
Bronchus mit Entzündungszellen
B
Vergrößerung x200
C AhVISg
e
v
2
2
2
Bronchien frei von Entzündung
Vergrößerung x200
n
Bronchus mit Entzündungszelle
bb. 18: Vergleich der istopathologischen eränderungen in der Lunge nach
nfektion mit 20265 WT, SCV oder CVexsA. Dargestellt sind HE-
efärbte Gewebeausschnitte bei
iner mikroskopischen Vergrößerung
on x200. (A) zeigt die Infektion mit
0265 WT, (B) die Infektion mit
0265 SCV und (C) die Infektion mit
0265 SCVexsA.
Ergebnisse 83
Abb. 19
Vergrößerung x630
A
Vergrößerung x630
alveolärer Bereich mit Entzündungszellen
B
Vergrößerung x630
Zerstörung des Bronchialepithels
C
Bronchus mit Entzündungszellen im Lumen
Abb. 19: Vergleich der histopathologischen Veränderungen in der Lunge nach Infektion mit 20265 WT, SCV oder SCVexsA. Dargestellt sind HE-
gefärbte Gewebeausschnitte bei
einer mikroskopischen Vergrößerung
von x630. (A) zeigt die Infektion mit
20265 WT, (B) die Infektion mit
20265 SCV und (C) die Infektion mit
20265 SCVexsA.
Ergebnisse 84
Abb. 20 Bronchus mit Entzündungszellen
Vergrößerung x200
A B Vergrößerung x630
Bronchien frei von Entzündung
Vergrößerung x630 Vergrößerung x200
C
Alveolen mit Entzündungszellen
D
Abb. 20: Vergleich der histopathologischen Veränderungen in der Lunge nach Infektion mit 52 WT oder SCV. Dargestellt sind HE-gefärbte Gewebeausschnitte der Lunge
bei unterschiedlicher mikroskopischer Vergrößerung. (A) und (B) zeigen die Infektion mit
dem WT, (C) und (D) die Infektion mit der SCV.
Ergebnisse 85
Abb. 21
Bakterienansammlungen
A
Vergrößerung x1000
B
Vergrößerung x1000
Abb. 21: Bakterienansammlungen in den Alveolen von SCV-infizierten Mäusen. Dargestellt sind HE-gefärbte Gewebeausschnitte der Lunge. (A) zeigt die Infektion mit 20265
SCV und (B) die Infektion mit 52 SCV.
Ergebnisse 86
Abb. 22
Vergrößerung x100
A
geringgradige Schleimansammlungen im Lumen
Abb. 22: Histopathologische Veränderungen im Nasopharynx infizierter Mäuse. Dargestellt sind HE-
gefärbte Gewebeausschnitte des
Nasopharynx bei unterschiedlicher
mikroskopischer Vergrößerung. (A) ist ein
Befund bei 20265 WT, (B) ein Befund bei
20265 SCV und (C) ein Befund bei 20265
SCVexsA.
Vergrößerung x630
Entzündungszellen im Lumen
B
Vergrößerung x1000
Entzündungszellen in der Epithelschicht
C
Ergebnisse 87
Je Morphotyp wurden die Lungen und der Nasopharynx von 5 Tieren histologisch
untersucht. Die Ergebnisse der Untersuchung zeigten, dass die durch WT und SCV,
bzw. SCVexsA hervorgerufenen Veränderungen in der Lunge sich voneinander
unterschieden. Während durch WT und SCVexsA eine hochgradige
Bronchopneumonie verursacht wurde (siehe Abb. 18 A und C, Abb. 19 A und C),
waren die Bronchien bei SCV-infizierten Tieren fast frei von Entzündung (siehe Abb. 18 B und 19 B). Hier zeigte sich die Infektion vor allem in den alveolären Bereichen,
das Ausmaß war auch hier hochgradig. Bei den beteiligten Entzündungszellen
handelte es sich in erster Linie um neutrophile Granulozyten und Makrophagen. Hier
gab es keine Unterschiede zwischen WT, SCV und SCVexsA. Ähnliche Befunde
konnten auch bei Stamm 52 festgestellt werden (siehe Abb. 20 A – D).
Als Besonderheit konnte bei der Untersuchung der Lungen von SCV-infizierten
Tieren festgestellt werden, dass in den Lumina der Alveolen in allen Schnitten (5
Tiere) viele große Bakterienansammlungen zu finden waren (siehe Abb. 21 A und
B). WT und SCVexsA-infizierte Lungen wiesen dagegen nur einzelne solche
Bakterienansammlungen auf, die aber nicht in allen Schnitten zu finden waren. Durch
Gam-Färbungen von Lungenschnitten konnte dieser Befund bestätigt werden (Bilder
nicht gezeigt).
Bei den Untersuchungen des Nasopharynx ergaben sich keine unterschiedlichen
Ergebnisse. Sowohl bei WT- wie auch bei SCV-, bzw. SCVexsA-infizierten Tieren
wurden vereinzelt Entzündungsreaktionen in der Schleimhaut gefunden. Dann waren
neutrophile Granulozyten in der Epithelschicht zu finden. Sehr selten zeigte sich eine
Desquamation des Epithels mit Zelltrümmern, Entzündungszellen und Mucus im
Lumen der Nasenhöhlen. Die dargestellten Gewebeausschnitte (siehe Abb. 22 A – C) zeigen Befunde, die für alle Morphotypen gelten, auch für Stamm 52.
Ergebnisse 88
4.5. Etablierung eines neuen C. elegans Pathogenitäts-Modells 4.5.1. Vergleich der Abtötung von C. elegans durch SCV und WT Untersuchungen von ZIEGLER (2003) hatten gezeigt, dass einige der klinischen CF-
Isolate im Nematoden-Modell unter den publizierten Standardbedingungen (TAN et
al., 1999a, b; 2000; MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999) avirulent waren. Dazu gehörten
auch einige Stämme der hier untersuchten Isolate. So zeigten die Stämme 20265, 52
und 231 im Standard-Fastkilling und Standard-Slowkilling keine Virulenz. 8226 SCV
zeigte unter Fastkilling-Bedingungen eine Sterberate von 90% innerhalb von 30 h,
der WT war avirulent. Weiterhin konnten andere Autoren feststellen, dass es nicht
möglich ist, Typ III Sekretions-bedingte Virulenz in den Standard-Assays
nachzuweisen (MIYATA et al., 2003). Ein Ziel dieser Arbeit war es, ein Modell zu
etablieren, in dem es zum einen möglich ist, Virulenzfaktoren bei unter den Standard-
Bedingungen avirulenten P. aeruginosa zu detektieren, und zum anderen, Typ III
Sekretion als Virulenzfaktor auch im Nematoden-Modell festzustellen.
C. elegans L4-Larven wurden in diesem Modell mit Bakterien in Flüssigkultur infiziert.
Dazu wurde modifiziertes Calcium-depletiertes Vogel-Bonner (VB)-Medium
verwendet. Dabei diente das Calcium als Stimmulanz der Typ III Sekretion (VALLIS
et al., 1999a). Vergleichend wurden die Bakterien auch in normalem VB-Medium
angeimpft und die L4-Larven damit infiziert. Die Bakterien wurden bei einer OD650
von 1,0 geerntet. Als Kontrolle wurde in allen Versuchen E. coli DH5α verwendet. Die
Ergebnisse dieses neuen, auf einer Flüssigkultur basierenden Modells sind für die
zytotoxischen SCVs und ihrem jeweiligen WT in Abb. 23 und 24 dargestellt. Stamm
231 wurde nicht unter diesen Bedingungen getestet, da der Stamm sich in Calcium-
depletiertem VB-Medium nicht kultivieren ließ.
Ergebnisse 89
Abb. 23
tote
Wür
mer
(%)
0
20
40
60
80
100
tote
Wür
mer
(%)
0
20
40
60
80
100
AbbMedVers
Stäm
Erge
Neg
A
Zeit (h)
0 2 4 6 8 10
E. coli DH5α 20265 WT 20265 SCV
tote
Wür
mer
(%)
Zeit (h)
0 2 4 6 8 10
E. coli DH5α 8226 WT 8226 SCV
. 23: Vergleich der Abtötung durch WT unium. Die Werte sind Mittelwerte mit Standa
uchs mit jeweils Dreifachwerten zu verschiede
me wurden dreimal getestet. (A) zeigt die E
bnisse von Stamm 52 und (C) die Ergebnisse v
ativkontrolle.
B
Zeit (h)
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100 E. coli DH5α52 WT52 SCV
C
d SCV in Calcium-depletiertem VB-rdabweichungen eines repräsentativen
nen Zeitpunkten nach der Infektion. Alle
rgebnisse von Stamm 20265, (B) die
on Stamm 8226. E. coli DH5α diente als
Ergebnisse 90
Abb. 24
tote
Wür
mer
(%)
0
20
40
60
80
100
tote
Wür
mer
(%)
0
20
40
60
80
100
AbbWer
jewe
wurd
Stam
Neg
A
Zeit (h)
0 2 4 6 8 10
E. coli DH5α20265 WT20265 SCV
Zeit (h)
0 2 4 6 8 10
E. coli DH5α 8226 WT8226 SCV
to
te W
ürm
er (%
)
0
20
40
60
80
100
. 24: Vergleich der Abtötung durch WT unte sind Mittelwerte mit Standardabweichunge
ils Dreifachwerten zu verschiedenen Zeitpun
en dreimal getestet. (A) zeigt die Ergebnisse vo
m 52 und (C) die Ergebnisse von Stam
ativkontrolle.
B
Zeit (h)
0 2 4 6 8 10
E. coli DH5α52 WT52 SCV
C
d SCV in normalem VB-Medium. Die
n eines repräsentativen Versuchs mit
kten nach der Infektion. Alle Stämme
n Stamm 20265, (B) die Ergebnisse von
m 8226. E. coli DH5α diente als
Ergebnisse 91
Aus den Abbildungen wird ersichtlich, dass in diesem Modell alle Stämme für C.
elegans pathogen waren. Dabei konnte in Calcium-depletiertem Medium (Abb. 23)
ein Unterschied in der Abtötung zwischen WT und SCV festgestellt werden. Dieser
Unterschied betrug bei 20265 und 52 je nach Zeitpunkt etwa 10 bis 30 %, während
die Unterschiede bei 8226 bis zu 45 % betrugen. Dabei war jedes Mal die SCV
virulenter als der WT. In normalem Medium (Abb. 24) glichen sich die Sterbekurven
von WT und SCV an. Bei 20265 und 52 war nun die Virulenz von WT und SCV etwa
gleich, bei 8226 war die Virulenz des WT weiterhin etwas niedriger als die der SCV.
Um zu überprüfen, ob Kulturüberstände der Bakterien und hitzeinaktivierte Bakterien
ebenfalls virulent waren, wurde die Abtötung von C. elegans unter diesen
Bedingungen ebefalls getestet. Dabei zeigte sich, dass die Abtötung durch
sterilfiltrierte Kulturüberstände maximal 8 % betrug, die Abtötung durch
hitzeinaktivierte Bakterien betrug maximal 11%. Dabei gab es keinen Unterschied
zwischen WT und SCV. Auch ein Vergleich von normalem und Calcium-depletiertem
VB-Medium brachte hier keinen Unterschied (Abbildungen nicht gezeigt).
4.5.2. Einfluss von exsA auf die Abtötung Um festzustellen, ob die Abtötung auch durch Typ III verursacht wurde, wurden
Mutanten von P. aeruginosa eingesetzt, die einen Defekt im exsA-Gen trugen. ExsA,
einer der Hauptregulatoren der Typ III Sekretion, wurde in dieser Studie bereits
erfolgreich im Zellkultur- und Mausmodell getestet. Die Mutanten wurden sowohl in
Calcium-depletiertem als auch normalen VB-Medium getestet.
Die Ergebnisse sind in Abb. 25 und 26 aufgeführt.
Ergebnisse 92
Abb. 25 B
tote
Wür
mer
(%)
tote
Wür
mer
(%)
AbenSt
ve
ze
als
A
Zeit (h)
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100E. coli DH5α 20265 WT 20265 SCV 20265 SCVexsA-
Zeit (h)
0 2 4 6
0
20
40
60
80
100 E. coli DH5αTB TBexsA-
b. 25: Vergleich der Abtötung durch tsprechenden WT in Calcium-depletiertem Vandardabweichungen eines repräsentativen V
rschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion. A
igt den Stamm 20265, (B) den Stamm CHA un
Negativkontrolle.
Zeit (h)
0 2 4 6 8
tote
Wür
mer
(%)
0
20
40
60
80
100E.coli DH5α CHA CHA-D1 (exsA)
C
Typ III-defiziente Mutanten und die B-Medium. Die Werte sind Mittelwerte mit
ersuchs mit jeweils Dreifachwerten zu
lle Stämme wurden dreimal getestet. (A)
d (C) den Stamm TB. E. coli DH5α diente
Ergebnisse 93
Abb. 26
AbenSt
ve
ze
jew
Abde
die
Ve
na
A
Zeit (h)
0 2 4 6 8 10
tote
Wür
mer
(%)
0
20
40
60
80
100 E. coli DH5α20265 WT20265 SCV20265 SCVexsA
Zeit (h)
0 2 4 6
tote
Wür
mer
(%)
0
20
40
60
80
100 E. coli DH5αTB TBexsA-
to
te W
ürm
er (%
)
b. 26: Vergleich der Abtötung durch Tytsprechenden WT in normalem VB-Mediuandardabweichungen eines repräsentativen Ve
rschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion. Alle
igt den Stamm 20265, (B) den Stamm CHA und
eils als Negativkontrolle.
b. 25 zeigt das Verhalten der Mutanten und
pletiertem VB-Medium. In allen drei Fällen wa
entsprechenden WT, bzw. bei 20265 als die
rhalten wie die exsA-Mutante. Die Unterschie
ch Zeitpunkt und Stamm zwischen 10 und 30
B
Zeit (h)
0 2 4 6 8
0
20
40
60
80
100 E. coli DH5αCHA CHA-D1 (exsA)
C
p III-defiziente Mutanten und die m. Die Werte sind Mittelwerte mit
rsuchs mit jeweils Dreifachwerten zu
Stämme wurden dreimal getestet. (A)
(C) den Stamm TB. E. coli DH5α diente
der entsprechenden WT in Calcium -
ren die Mutanten weniger virulent als
SCV. WT 20265 zeigte ein ähnliches
de in der Abtötung variierten dabei je
%. Wie aus Abb. 26 hervorgeht, ist
Ergebnisse 94
diese verringerte Abtötung der exsA-Mutanten Calcium-abhängig. Bei allen drei
Stämmen konnten in normalem VB-Medium keine Unterschiede in der Abtötung
festgestellt werden.
4.5.3. Einfluss von ExoU auf die Abtötung Aus der Literatur (PUKATZKI et al., 2002) ist bekannt, dass ExoU als Virulenzfaktor
in einem Amöben-Modell (Dictyostelium discoideum) für einen Teil der Virulenz
verantwortlich ist. Hier sollte nun getestet werden, in wie weit ExoU für die Abtötung
von C. elegans in Flüssigkultur von Bedeutung ist. Zunächst wurde die ExoU-
defiziente Mutante des P. aeruginosa -Stammes PA 34 (FAUVARQUE et al., 2002)
im Vergleich zum WT unter Standard-Versuchsbedingungen im C. elegans -Modell
getestet. Die Ergebnisse sind in Abb. 27 A für das Slowkilling und in Abb. 27 B für
das Fastkilling graphisch dargestellt.
Anschließend erfolgte die Untersuchung der Virulenz im neuen C. elegans-Modell.
Abb. 27 C und D zeigen die Sterbekinetik von C. elegans im Flüssigkultur-Modell mit
Calcium-depletiertem (C) und normalem (D) Vogel-Bonner-Medium.
Abb. 27
tote
Wür
mer
(%)
0
20
40
60
80
100
A
Zeit (h)
0 10 20 30 40 50
E. coli OP50 PA 34 WT PA 34 ExoU-
tote
Wür
mer
(%)
B
Zeit (h)
0 10 20 30 40 50
0
20
40
60
80
100 E. coli OP50 PA 34 WT PA 34 ExoU-
Ergebnisse 95
tote
Wür
mer
(%)
0
20
40
60
80
100
D
Abderep
Inf
St
St
die
Slo
Ne
Im
St
de
Da
So
Ca
zu
ga
Mu
St
we
eb
ein
C
Zeit (h)
0 2 4 6 8
E.coli DH5α PA 34 WT PA 34 ExoU-
tote
Wür
mer
(%)
b. 27: Vergleich der Abtötung von C. eleg
fiziente Mutante. Dargestellt sind jeweils M
räsentativen Versuchs mit Dreifachwerten zu
ektion. Alle Versuche wurden jeweils zeimal d
andard-Slowkilling und (B) die Ergebnisse im S
erbekinetiken von C. elegans unter Flüssigkultu
Abtötung in Calcium-depletiertem und (D) die
w- und Fastkilling diente E. coli OP50 und in
gativ-Kontrolle.
Slow- und Fastkilling (Abb. 27 A und Bammes von etwa 10 % festgestellt werden
r ExoU-defizienten Mutante keine Unter
gegen war unter Flüssigkultur-Bedingung
wohl der WT als auch die Mutante waren
lcium-depletiertem Medium (Abb. 27 C) w
sehen. Die Würmer verstarben bei Kultivie
b es Unterschiede zum WT bis zu 20 %. Te
tante mehr als 24 h (etwa 5 %, Daten
erbeverhalten der Würmer konnte in norma
rden (Abb. 27 D). Es handelte sich also be
enso wie bei dem Unterschied von SCV z
en Calcium-abhängigen Prozess.
Zeit (h)
0 2 4 6 8
0
20
40
60
80
100 E. coli DH5α PA 34 WTPA 34 ExoU-
ans durch PA 34 WT und eine ExoU-ittelwerte mit Standardabweichung eines
unterschiedlichen Zeitpunkten nach der
urchgeführt. (A) zeigt die Ergebnisse im
tandard-Fastkilling. In (C) und (D) sind die
r-Bedingungen dargestellt. Dabei stellt (C)
Abtötung in normalem VB-Medium dar. Im
den Flüssigkultur-Assays E. coli DH5α als
) konnte eine maximale Virulenz des
. Dabei waren zwischen dem WT und
schiede in der Virulenz feststellbar.
en eine hohe Virulenz festzustellen.
in der Lage, C. elegans zu töten. In
ar ein Unterschied im Sterbeverhalten
rung mit der Mutante langsamer. Dabei
ilweise überlebten die Würmer mit der
nicht gezeigt). Dieser Unterschied im
lem VB-Medium nicht mehr festgestellt
i dem Unterschied von WT zu Mutante
u WT von P. aeruginosa -Isolaten um
Ergebnisse 96
Wurden nur sterilfiltrierte Kulturüberstände oder hitzeinaktivierte Bakterien
eingesetzt, wurde eine maximale Sterberate von 11 % in beiden Fällen erreicht.
Dabei war kein Unterschied zwischen WT und Mutante festzustellen (Daten nicht
gezeigt).
Wie bereits durch DACHEUX et al. (2000) beschrieben, ist die Zytotoxizität ExoU-
unabhängig. Der dort verwendete Stamm CHA ist nicht in der Lage, ExoU zu
produzieren, auch der in der vorliegenden Arbeit verwendete Stamm 20265 besitzt
kein ExoU. Versuche im Zytotoxizitäts-Assay mit PA 34 konnten bestätigen, dass die
Zytotoxizität ExoU-unabhängig war (Daten nicht gezeigt).
Bei in vivo Versuchen mit BALB/c-Mäusen konnte dagegen gezeigt werden, dass
ExoU hier für einen Teil der Virulenz verantwortlich war. Die Mortalität ist in Abb. 28
dargestellt.
Abb. 28
Zeit (d)
1 2 3 4 5 6 7
lebe
nde
Mäu
se
0
2
4
6
8
PA 34 WT PA 34 ExoU-
Abb. 28: Vergleich der Virulenz von P. aeruginosa PA 34 und einer ExoU-defizienten Mutante im BALB/c-Mausmodell. Sterbekurve nach intranasaler Infektion von Balb/c-
Mäusen mit 1 x 108 Bakterien. Dargestellt sind die gepoolten Daten aus jeweils zwei
unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.
Ergebnisse 97
Wie aus der Graphik zu sehen ist, hatte das Fehlen von ExoU eine Attenuierung zur
Folge. Auch konnte ein milderer Krankheitsverlauf bei den Tieren festgestellt werden,
die mit der ExoU-defizienten Mutante infiziert waren. Überlebende Mäuse nahmen
schnell an Gewicht zu und zeigten bereits ab Tag 5 nach der Infektion keine
Krankheitssymptome mehr. Statistisch ergab sich bei einer Auswertung mittels
Kaplan-Meyer-Survival-Statistik ein signifikanter Unterschied (p = 0,025) zwischen
dem Sterben durch Mutante, bzw. WT.
4.5.4. Abtötung von C. elegans durch P. aeruginosa CHA und ausgewählte Mutanten Durch die bisherigen Versuche konnte gezeigt werden, dass die Typ III Sekretion im
neuen Wurmmodell für einen Teil der Virulenz verantwortlich war. Dies sollte durch
den Einsatz anderer P. aeruginosa-Stämme mit funktionstüchtigem Typ III
Sekretionssystem weiter untersucht werden. P. aeruginosa CHA ist ein CF-Isolat,
das von DACHEUX et al. (1999) in einem Zytotoxizitäts-Modell verwendet wurde.
Weiterhin wurde der Stamm in einer Typ III Sekretions-Studie mit Drosophila
melanogaster (FAUVARQUE et al., 2002) charakterisiert. CHA und einige
ausgewählte Mutanten aus der Drosophila –Studie wurden von I. Attree zur
Charakterisierung im neuen C. elegans -Modell zur Verfügung gestellt. CHA-D1 trägt
eine Mutation im exsA-Gen (wurde in dieser Studie bereits bei der Charakterisierung
des neuen C. elegans -Modells unter Punkt 4.5.2. eingesetzt). CHAdsbA zeigt
aufgrund eines Defekts im dsbA-Gen eine gestörte Proteinfaltung durch Fehlen einer
Thiol-Disulfid-Oxidoreduktase, CHApilV zeigt einen Defekt im Twitching durch
mangelhafte Pili-Ausbildung. CheZ ist für die Chemotaxis verantwortlich. Die Mutante
CHAcheZ ist dementsprechend nicht chemotaktisch wirksam. CHAexsD zeigt
deutlich verringerte Typ III Sekretion durch fehlerhafte Ausbildung des
Sekretionsapparats.
Zunächst wurden die Mutanten im Vergleich zu CHA unter Standard-Bedingungen im
C. elegans -Modell getestet. Die Ergebnisse von CHA im Slow- und Fastkilling sind in
Ergebnisse 98
Abb. 29 dargestellt, Tab. 6 zeigt die Virulenz der Mutanten 30 h nach
Versuchsbeginn.
Abb. 29
Zeit (h)
0 10 20 30 40 50
tote
Wür
mer
(%)
0
20
40
60
80
100 E. coli OP50CHA WT
A
tote
Wür
mer
(%)
Abb. 29: Vergleich der Abtötung von C. e
Standard-Slow- und Fastkilling-BedingunStandardabweichung eines repräsentativen Vers
der Infektion. Die Stämme wurden jeweils zwe
Slowkillings, (B) die Ergebnisse des Fastkillin
Negativkontrolle.
Tab. 6
Slowkilling CHA WT Ø CHA-D1 Ø CHAdsbA Ø CHApilV Ø CHAcheZ Ø CHAexsD Ø
Tab. 6: Vergleich des Slow- und Fastkillings
aeruginosa CHA. Dargestellt sind Mittelwerte m
toten Würmern eines repräsentativen Versuchs
wurden jeweils zweimal durchgeführt. Ø steht fü
B
Zeit (h)
0 10 20 30 40 50
0
20
40
60
80
100 E. coli OP50 CHA WT
legans durch P. aeruginosa CHA unter gen. Dargestellt sind Mittelwerte mit
uchs zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach
imal getestet. (A) zeigt die Ergebnisse des
gs durch CHA. E. coli OP50 diente als
Fastkilling 71,2 ±3,1 75,7 ±7,7 76,8 ±4,2 90,6 ±13,6 99,2 ±0,9 64,7 ±4,7
von C. elegans durch Mutanten von P.
it Standardabweichung der Prozentzahl von
30 h nach Versuchsbeginn. Die Versuche
r avirulentes Verhalten der Bakterien.
Ergebnisse 99
Aus den Ergebnissen ist zu sehen, dass weder der WT noch eine der getesteten
Mutanten Virulenz unter Slowkilling-Bedingungen zeigte. Unter Fastkilling-
Bedingungen zeigte der WT eine deutliche Virulenz, ebenso alle getesteten
Mutanten. Unterschiede zum WT konnten nur bei den Mutanten CHApilV und
CHAcheZ festgestellt werden. Bei CHApilV zeigte sich eine um etwa 20% gesteigerte
Sterberate von C. elegans, bei CHAcheZ war eine Steigerung um etwa 30%
festzustellen. Statistisch konnte eine Signifikanz nur bei CHAcheZ im Vergleich zum
WT festgestellt werden (t-Test; p < 0,001). Aufgrund der hohen Standardabweichung
bei CHApilV ergab der t-Test im Vergleich mit dem WT p = 0,07. Auch bei dem
zweiten Versuch konnte keine Signifikanz ermittelt werden (Daten des Versuchs
nicht gezeigt). Die Mutanten CHA-D1 und CHAexsD, die eine gestörte Typ III
Sekretion aufweisen, zeigten im Vergleich mit dem WT keine Attenuierung. Auch die
Mutante CHAdsbA verhielt sich wie der WT.
Die Mutanten wurden anschließend im Vergleich zum WT unter Flüssigkultur-
Bedingungen getestet. Zunächst wurden die Versuche in Calcium-depletiertem
Medium durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abb. 30 dargestellt.
Ergebnisse 100
Abb. 30
Zeit (h)
0 2 4 6 8
tote
Wür
mer
(%)
0
20
40
60
80
100 E. coli DH5αCHACHA-D1 (exsA)CHAdsbACHApilVCHAcheZCHAexsD
Abb. 30: Vergleich der Abtötung von C. elegans durch CHA und ausgewählten Mutanten unter Flüssigkultur-Bedingungen. Dargestellt sind Mittelwerte mit
Standardabweichung eines repräsentativen Versuchs in Calcium-depletiertem Vogel-Bonner-
Medium. Die Stämme wurden jeweils dreimal getestet. Die Bakterien wurden bei einer OD650
von 1,0 geerntet. E. coli DH5α diente als Negativ-Kontrolle.
Alle Mutanten außer CHAcheZ zeigten eine gegenüber dem WT verminderte
Virulenz. CHAcheZ zeigte in keinem der Versuche eine Attenuierung gegenüber dem
WT. Überlebende Würmer bei Versuchen mit CHApilV und CHAdsbA waren deutlich
motiler als überlebende Würmer in Versuchen mit CHA-D1 und CHAexsD.
Versuche in normalem Vogel-Bonner-Medium zeigten vergleichbare Ergebnisse. Nur
CHA-D1 und CHAexsD, die beiden Typ III-defizienten Mutanten, glichen sich im
normalen Medium dem WT an (Daten nicht gezeigt).
Im Folgenden wurden neben Bakteriensuspensionen hitzeinaktivierte Bakterien und
sterilfiltrierte Kulturüberstände getestet. In Tab. 7 und 8 sind die Ergebnisse dieser
Untersuchung zusammengefasst. Dargestellt sind die Sterberaten von C. elegans
nach 8 h, d.h. zu dem Zeitpunkt, als alle Würmer in den Bakteriensuspensionen von
CHA WT tot waren. Zu späteren Zeitpunkten (bis 24 h) konnte keine weitere
Steigerung der Sterberate festgestellt werden.
Ergebnisse 101
Tab. 7
% Abtötung Standardabweichung CHA WT 18,0 ±1,2 CHA-D1 15,3 ±0,8 CHAdsbA 19,1 ±3,1 CHApilV 16,5 ±2,2 CHAcheZ 18,1 ±1,5 CHAexsD 16,9 ±1,9
Tab. 7: Vergleich der Abtötung von C. elegans durch hitzeinaktivierte Bakterien. Dargestellt sind Mittelwerte mit Standardabweichung eines repräsentativen Versuchs 8 h
nach der Infektion. Die Versuche wurden jeweils zweimal durchgeführt. Die Bakterien
wurden vor Versuchsbeginn für 10 min bei 70 °C inaktiviert.
Tab. 8
% Abtötung Standardabweichung CHA WT 16,1 ±1,7 CHA-D1 13,5 ±2,1 CHAdsbA 17,2 ±2,3 CHApilV 16,0 ±0,4 CHAcheZ 17,6 ±0,9 CHAexsD 15,8 ±3,0
Tab. 8: Vergleich der Abtötung von C. elegans durch Kulturüberstände. Dargestellt sind
Mittelwerte mit Standardabweichung eines repräsentativen Versuchs 8 h nach der Infektion.
Die Versuche wurden jeweils zweimal durchgeführt. Die Bakterien wurden vor
Versuchsbeginn sterilfiltriert.
Aus den Tabellen kann abgelesen werden, dass es keine Unterschiede in der
Abtötung durch Kulturüberstände oder hitzeinaktivierte Bakterien zwischen CHA WT
und den Mutanten gab.
Ergebnisse 102
4.5.5. Abtötung von C. elegans durch PA 14 und PAO 1 PA 14 und PAO 1 sind die in den Standard-Assays mit C. elegans am besten
charakterisierten P. aeruginosa -Stämme. Daher lag es nahe, diese Stämme im
neuen C. elegans -Modell zu charakterisieren. Beide Stämme besitzen ein
funktionstüchtiges Typ III Sekretionssystem. PA 14 ist allerdings nicht in der Lage,
ExoS zu produzieren. Im Folgenden werden die Ergebnisse der Versuche mit PA 14
und PAO 1 graphisch dargestellt. Untersucht wurde die Abtötung in Calcium-
depletiertem und normalem VB-Medium (Abb. 31 A und Abb. 32 A). Außerdem
wurden vergleichend Bakteriensuspensionen, hitzeinaktivierte Bakterien und
abzentrifugierte Überstände getestet (Abb. 31 B und Abb. 32 B).
Abb. 31
Zeit (h)
0 1 2 3 4 5 6 7
tote
Wür
mer
(%)
0
20
40
60
80
100 E. coli DH5αPA 14 Ca-depletiertes VB PA 14 normales VB
A
tote
Wür
mer
(%)
Abb. 31: Vergleich der Abtötung von C. ele
verschiedenen Bedingungen. Dargestellt sind
repräsentativen Versuchs zu unterschiedlichen Z
wurden dreimal durchgeführt. (A) zeigt die E
normalem und Calcium-depletiertem VB-Mediu
von Bakteriensuspensionen, hitzeinaktivierten B
diente als Negativ-Kontrolle.
B
Zeit (h)
0 1 2 3 4 5 6 7
0
20
40
60
80
100 E. coli DH5αPA 14 Bakterien PA 14 hitzeinaktiviertPA 14 Überstand
gans durch PA 14 in Flüssigkultur unter Mittelwerte mit Standardabweichung eines
eitpunkten nach der Infektion. Alle Versuche
rgebnisse des Vergleichs der Abtötung in
m. (B) stellt die Ergebnisse des Vergleichs
akterien und Überständen dar. E. coli DH5α
Ergebnisse 103
Abb. 32 to
te W
ürm
er (%
)
Abbversrepr
wurd
norm
von
dien
PA
der
Bei
Med
Kult
Beim
spä
A
Zeit (h)
0 1 2 3 4 5 6 7
0
20
40
60
80
100 E. coli DH5α PAO 1 Ca-depletiertes VB PAO 1 normales VB
tote
Wür
mer
(%)
. 32: Vergleich der Abtötung von C. eleg
chiedenen Bedingungen. Dargestellt sind
äsentativen Versuchs zu unterschiedlichen Z
en dreimal durchgeführt. (A) zeigt die E
alem und Calcium-depletiertem VB-Mediu
Bakteriensuspensionen, hitzeinaktivierten B
te als Negativ-Kontrolle.
14 zeigte in Calcium-depletiertem und n
Virulenz, obwohl PA 14 ein funktionstüc
PAO 1 war ein kleiner, aber reprodu
ien feststellbar, wobei die höhere Virul
urüberständen wurden bei PA 14 und PA
Einsatz von hitzeinaktivierten Bakter
ten Zeitpunkten höher (etwa 30%) als du
B
Zeit (h)
0 1 2 3 4 5 6 7
0
20
40
60
80
100 E. coli DH5α PAO 1 Bakterien PAO 1 hitzeinaktiviert PAO 1 Überstand
ans durch PAO 1 in Flüssigkultur unter Mittelwerte mit Standardabweichung eines
eitpunkten nach der Infektion. Alle Versuche
rgebnisse des Vergleichs der Abtötung in
m. (B) stellt die Ergebnisse des Vergleichs
akterien und Überständen dar. E. coli DH5α
ormalem Medium keine Unterschiede in
htiges Typ III Sekretionssystem besitzt.
zierbarer Unterschied zwischen beiden
enz im depletierten Medium auftrat. Mit
O 1 Sterberaten von etwa 40% erreicht.
ien war die Abtötung durch PAO 1 zu
rch PA14 (etwa 20%).
Ergebnisse 104
4.5.6. Vergleich der Abtötung von C. elegans durch P. aeruginosa TB und ausgewählte Mutanten von TB
Es konnte bisher durch die eingesetzten SCVs, PA 34, CHA mit seinen Mutanten
und die Stämme PA 14 und PAO 1 festgestellt werden, dass die Typ III Sekretion
einen Teil der Virulenz im C. elegans -Modell in Flüssigkultur ausmacht. Aber ein
großer Teil der Virulenz von P. aeruginosa gegenüber C. elegans in diesem System
konnte damit nicht erklärt werden. Es erschien daher notwendig, Mutanten mit
anderen Defekten in diesem System zu testen. Dazu wurde eine Gruppe von 65
Mutanten des P. aeruginosa-Stammes TB von der AG Tümmler (MH Hannover) zur
Verfügung gestellt. Mit diesen 65 Mutanten erfolgte ein Screening im neuen
Wurmmodell auf abweichende Virulenz im Vergleich mit dem WT. Sechs der
Mutanten wurden zur Veröffentlichung in dieser Arbeit zur Verfügung gestellt. In Tab. 9 sind diese sechs Mutanten mit dem entsprechenden Gendefekt aufgeführt.
Tab. 9
Gen Position Mutation 9B9 PA4613 5171725 Region zwischen dem mechanosensitiven
Kanal mscL und der Katalase katB 18A8 PA3477 3890649 Transkriptionsregulator RhlR, bakterielles
Regulatorprotein, Familie luxR 20D1 PA3102 3481913 XcpS, allgemeines Sekretionsprotein F 25C8 PA4554 5100682 Typ IV Fimbrienprotein PilY, 94%
Ähnlichkeit mit dem pilY1 Genprodukt von P. aeruginosa; 43% Ähnlichkeit mit dem C-Terminus von PilC2 von Neisseria gonorrhoeae und Neisseria menigitidis; Operon PilEY2Y1XWV
D8A3 PA0652 706672 Regulator des Quorum sensing vfr, cAMP-Rezeptor Struktur
D10B10 PA1322 1433166 Möglicher TonB-abhängiger Rezeptor, Ferrichrome-Eisen-Rezeptor (44% Ähnlichkeit mit S. paratyphi), Terminator anscheinend nicht richtig lesbar
Tab. 9: Genort und Funktion der mutierten Gene von Transposon-Mutanten von P.
aeruginosa TB. Die Angaben wurden von der AG Tümmler zur Verfügung gestellt.
Ergebnisse 105
Zunächst wurden der TB WT und die sechs Mutanten im C. elegans -Modell im
Standard-Slowkilling und - Fastkilling getestet. Für TB WT sind die Ergebnisse in
Abb. 33 graphisch dargestellt. Tab. 10 gibt die Ergebnisse der Untersuchung der
Mutanten im Vergleich zu TB WT nach 30 h wieder.
Abb. 33
tote
Wür
mer
(%)
AbDa
jew
wu
Er
A
Zeit (h)
0 10 20 30 40 50
0
20
40
60
80
100E. coli OP50TB WT
tote
Wür
mer
(%)
b. 33: Abtötung von C. elegans durch TB rgestellt sind Mittelwerte mit Standardabwe
eils Dreifachwerten zu unterschiedlichen Ze
rden jeweils zweimal durchgeführt. (A) stellt d
gebnis des Fastkilling-Assays dar. E. coli OP5
B
Zeit (h)
0 10 20 30 40 50
0
20
40
60
80
100 E. coli OP50 TB WT
WT im Slowkilling- und Fastkilling-Assay. ichung eines repräsentativen Versuchs mit
itpunkten nach der Infektion. Die Versuche
as Ergebnis des Slowkilling-Assays, (B) das
0 diente jeweils als Negativ-Kontrolle.
Ergebnisse 106
Tab. 10
Slowkilling Fastkilling TB Ø 91,0 ±3,5 9B9 Ø 90,4 ±1,4 18A8 Ø 79,7 ±4,0 20D1 Ø 94,2 ±5,4 25C8 Ø 62,4 ±2,5 D8A3 Ø 80,1 ±2,7 D10B10 Ø 27,9 ±4,9
Tab. 10: Vergleich von TB-Mutanten im Slow- und Fastkilling. Dargestellt sind
Mittelwerte mit Standardabweichung der Prozentzahl von toten Würmern nach 30 h eines
repräsentativen Versuchs. Die Stämme wurden jeweils zweimal getestet. Ø steht für
avirulentes Verhalten der Bakterien.
Aus den Ergebnissen ist zu sehen, dass weder der WT noch eine der getesteten
Mutanten Virulenz unter Slowkilling-Bedingungen zeigte. Unter Fastkilling-
Bedingungen waren sowohl der WT als auch alle Mutanten virulent. Dabei verhielten
sich die Mutanten 9B9 und 20D1 wie der WT, die Mutanten 18A8, 25C8, D8A3 und
D10B10 waren im Vergleich mit dem WT attenuiert. Eine statistische Auswertung
ergab für alle vier Mutanten, dass die Unterschiede zum TB WT signifikant waren.
18A8 (t-Test; p = 0,02) und D8A3 (t-Test; p = 0,014) führten zu einer um etwa 10%
verminderten Abtötung von C. elegans, die Mutante 25C8 (t-Test; p < 0,001) zeigte
eine um etwa 30% verminderte Abtötung. Am stärksten war die Attenuierung von
D10B10 gegenüber dem WT, hier wurde eine Reduktion der Abtötung um etwa 63%
erreicht (t-Test; p < 0,001).
Die Transposon-Mutanten wurden dann im neuen C. elegans-Modell im Vergleich
zum WT getestet. Dabei wurden unterschiedliche Bakteriendichten getestet. Es
stellte sich heraus, dass zum einen die deutlichsten Unterschiede bei einer OD650
von ca. 0,5 zu detektieren waren, also in der log-Phase, und zum anderen die
Durchführung der Versuche am praktikabelsten war (Sichtbarkeit der Würmer in der
Bakteriensuspension, Dauer des Versuch). Das Ergebnis ist in Abb. 34 dargestellt.
Ergebnisse 107
Abb. 34
Zeit (h)
0 1 2 3 4 5 6 7
tote
Wür
mer
(%)
0
20
40
60
80
100 E. coli DH5α TB WT9B9 18A8 20D1 25C8 D8A3 D10B10
Abb. 34: Vergleich der Abtötung von C. elegans durch TB und ausgewählten Mutanten unter Flüssigkultur-Bedingungen. Dargestellt sind Mittelwerte mit Standardabweichung
eines repräsentativen Versuchs in Calcium-depletiertem Vogel-Bonner-Medium zu
unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion. Alle Stämme wurden dreimal getestet. Die
Bakterien wurden bei einer OD650 von 0,5 geerntet. E. coli DH5α diente als Negativ-Kontrolle.
Wie aus der Abbildung zu sehen ist, zeigten bis auf die Mutante 18A8 alle Mutanten
eine verminderte Virulenz im Vergleich zu TB WT, auch die beiden Mutanten 9B9
und 20D1, die unter Standard-Bedingungen nicht auffällig waren.
Die Versuche wurden ebenfalls in normalem VB-Medium durchgeführt. Dabei zeigte
sich nur bei 25C8 ein Unterschied zum Calcium-depletierten Medium. In normalem
Medium glich sich die Virulenz von 25C8 dem WT an, blieb aber immer etwa 4 bis 6
% unter der Virulenz des WT. Alle anderen Mutanten verhielten sich in den
unterschiedlichen Medien gleich (Daten nicht gezeigt).
Es wurden weitere Untersuchungen mit hitzeinaktivierten Bakterien und
abzentrifugierten Kulturüberständen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Tab. 11 und 12 aufgeführt. Dargestellt sind die Sterberaten von C. elegans nach 7 h, d.h.
zu dem Zeitpunkt, als alle Würmer in den Bakteriensuspensionen von TB WT tot
waren. Zu späteren Zeitpunkten (bis 24 h) konnte keine weitere Steigerung der
Sterberate festgestellt werden.
Ergebnisse 108
Tab. 11
% Abtötung Standardabweichung TB WT 19,6 ±3,8 9B9 19,5 ±3,9 18A8 30,7 ±1,3 20D1 18,9 ±2,9 25C8 16,5 ±0,8 D8A3 23,8 ±2,6 D10B10 20,1 ±0,9
Tab. 11: Vergleich der Abtötung von C. elegans durch hitzeinaktivierte Bakterien von P. aeruginosa TB und ausgewählte Transposon-Mutanten. Dargestellt sind Mittelwerte
mit Standardabweichung eines repräsentativen Versuchs 7 h nach der Infektion. Alle
Stämme wurden zweimal getestet. Die Bakterien wurden vor Versuchsbeginn für 10 min bei
70 °C inaktiviert.
Tab. 12
% Abtötung Standardabweichung TB WT 25,8 ±2,1 9B9 23,2 ±2,0 18A8 25,3 ±1,3 20D1 25,8 ±3,9 25C8 24,4 ±2,8 D8A3 30,1 ±0,4 D10B10 16,3 ±1,3
Tab. 12: Vergleich der Abtötung von C. elegans durch Kulturüberstände von P.
aeruginosa TB und ausgewählte Transposon-Mutanten. Dargestellt sind Mittelwerte mit
Standardabweichung eines repräsentativen Versuchs 7 h nach der Infektion. Alle Stämme
wurden zweimal getestet. Die Bakterien wurden vor Versuchsbeginn für 10 min bei 3214 g
abzentrifugiert.
Ergebnisse 109
Aus den Tabellen ist ersichtlich, dass beim Einsatz von hitzeinaktivierten Bakterien
nur bei der Mutante 18A8 ein Unterschied zum TB WT festzustellen war. Diese
zeigte eine um etwa 10 % höhere Virulenz gegenüber C. elegans als der WT.
Statistisch ergab sich eine Signifikanz (t-Test; p = 0,009). Die anderen Mutanten
waren in ihrer Virulenz dem WT ähnlich.
Beim Vergleich der Abtötung durch Überstände zeigte die Mutante 18A8 keinen
Unterschied zum WT. Hier war die Mutante D10B10 durch eine um etwa 10 %
verminderte Abtötung im Vergleich zum WT auffällig, was sich bei einer statistischen
Auswertung als signifikant erwies (t-Test; p = 0,003). Die anderen Mutanten zeigten
ein dem WT ähnliches Bild.
Diskussion 110
5. Diskussion
5.1. Autoaggregatives Verhalten von SCVs korreliert mit erhöhter Zytotoxizität durch erhöhte Typ III Sekretion
Das Typ III Sekretionssystem und seine sezernierten Effektorproteine gelten als der
prominenteste Virulenzfaktor von P. aeruginosa. Effektorproteine können über das
Typ III Sekretionssystem entweder in das extrazelluläre Milieu abgegeben werden
oder aber nach Kontaktaufnahme mit eukaryontischen Wirtszellen direkt in diese
transloziert werden. Solche Sekretionssysteme sind bei einigen human- und
pflanzenpathogenen Bakterien zu finden (CORNELIS u. v. GIJSEGEM, 2000;
HUECK, 1998). Zur Injektion in die Wirtszelle werden Proteine zu Strukturen
zusammengelagert, die eine nadelähnliche Form annehmen und mit dieser eine Pore
in der Wirtszellmembran bilden. Dies ist für S. Typhimurium (KUBORI et al., 2000),
Shigella spp. (TAMANO et al., 2000) und enteropathogene E. coli (SEKIYA et al.,
2001) bereits beschrieben. Die Struktur des Translokons von P. aeruginosa ist bisher
nicht vollständig aufgeklärt. SCHOEHN et al. konnten 2003 erste Ergebnisse
bezüglich der Funktion und Interaktion der Translokatorproteine PopD und PopB bei
der Porenbildung in der Wirtszellmembran veröffentlichen. Die Rolle des Proteins
PcrV blieb dabei unklar. Die Funktion der einzelnen Effektorproteine wurde bereits
unter Punkt 2.2. erörtert.
Die Expression des Typ III Sekretionssystems und seiner Effektorproteine erfolgt
vornehmlich in der späten exponentiellen Phase des bakteriellen Wachstums
(DACHEUX et al., 2000; HA u. JIN, 2001), wenn Signale, wie der Kontakt mit einer
eukaryontischen Wirtszelle, Präsenz von Serum und Ca2+-Depletion vorhanden sind
(IGLEWSKI et al., 1978; VALLIS et al., 1999a).
Bei einer Studie zum Auftreten von Typ III Sekretion bei klinischen Isolaten von P.
aeruginosa konnte festgestellt werden, dass 73 % aller Isolate ein Typ III
Sekretionssystem hatten. Dabei stammten die Isolate von Patienten mit CF,
Pneumonie, Sepsis, Wundinfektionen und Harnwegsinfektionen (FELTMAN et al.,
Diskussion 111
2001). Eine andere klinische Studie zeigte, dass die Letalität bei Patienten mit
Infektion eines Typ III sezernierenden Pseudomonas-Isolates signifikant höher lag
als bei Patienten, die mit P. aeruginosa infiziert waren, welcher kein Typ III
Sekretionssystem besaß (ROY-BURMAN et al., 2001). Vor allem eine hohe
Sekretion des Effektorproteins ExoS in Kombination mit PcrV führte zu erhöhter
Letalität. Bei Untersuchungen dieser Isolate in einem Zytotoxizitätsversuch und in
einem Maus-Pneumonie-Modell konnten ähnliche Ergebnisse erzielt werden (ROY-
BURMAN et al., 2001).
Viele Studien berichten, dass sich Stämme von P. aeruginosa aus chronisch
infizierten CF-Lungen durch eine gegenüber Umwelt-Isolaten verringerte Virulenz
auszeichnen (BURKE et al., 1991). Insbesondere sollen CF-Isolate geringere
Mengen an Proteasen, Elastasen und Exotoxin A produzieren (BURKE et al., 1991)
und weniger Typ III sezernierte Effektorproteine, wie ExoT, ExoS, ExoY und ExoU
(ROY-BURMAN et al., 2001). So hat sich die Meinung durchgesetzt, dass das
Habitat der CF-Lunge einen Selektionsdruck zur Ausbildung eines wenig virulenten
Phänotyps darstellt.
Überraschenderweise konnte VON GÖTZ (2003) in seinen genomweiten Analysen
des klinischen WT und der SCV des Stammes 20265 feststellen, dass die SCV
während des exponentiellen Wachstumsphase 33 der 36 Gene, die für die Typ III
Sekretion verantwortlich gemacht werden, deutlich höher exprimierte als der klonale
WT. Besonders stark waren die Unterschiede bei den Effektor- und Porenproteinen.
Dabei war pcrV mit einer um das 270-fache höheren Exprimierung das am stärksten
regulierte Gen, exoS war 90-fach hochreguliert in der SCV. Die anderen Gene waren
um mehr als 30-fach höher exprimiert. WEHMHÖNER (2002) konnte mit
Proteomanalysen des Stammes 20265 die gleichen Unterschiede feststellen. Mit den
genomischen Analysen von VON GÖTZ konnte außerdem nachgewiesen werden,
dass der Stamm 20265 ExoU-defizient ist, was für die meisten CF-Isolate zutrifft
(DACHEUX et al., 2000). In der Regel ist es so, dass entweder ExoS oder ExoU
vorhanden ist (ROY-BURMAN et al., 2001)
Diskussion 112
Das Gen exsA, einer der Hauptregulatoren des Typ III Sekretionssystems (YAHR et
al., 1995; DACHEUX et al., 2001a), war in den Analysen von VON GÖTZ in der SCV
ebenfalls höher exprimiert. ExsA dient dem Typ III Sekretionssystem als Aktivator,
wobei ExsC eine unterstützende Funktion durch Inhibition von ExsD ausübt. In
Abwesenheit von ExsC wird ExsA durch Wechselwirkungen mit ExsD inhibiert
(McCAW et al., 2002; DASGUPTA et al., 2003).
Erstes Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die funktionellen Auswirkungen dieser
erhöhten Expression von Typ III Genen nachzuweisen. Dazu wurden zunächst in
vitro Zytotoxizitätsversuche mit der Maus-Makrophagen Zelllinie J774.A1 nach dem
Vorbild von DACHEUX et al. (1999) durchgeführt. Insgesamt wurden die SCVs von
15 klinischen Isolaten aus der Medizinischen Hochschule Hannover getestet. Davon
gehörten sieben SCVs der von HÄUSSLER et al. (2003) beschriebenen
autoaggregativen Subgruppe an, acht waren nicht autoaggregativ. Im Vergleich zu
den SCVs wurden jeweils die klonalen WT-Phänotypen getestet. Für den Stamm
20265 wurde von I. Attree (Grenoble, Frankreich) eine exsA-knock-out-Mutante der
SCV zur Verfügung gestellt. Die acht nicht-autoaggregativen SCVs zeigten keine
oder nur eine geringfügige Zytotoxizität, ebenso wie ihre klonalen WT (vgl.
Ergebnisse 4.1.2.). Einzige Ausnahme war der WT des Stammes 26, der ein deutlich
zytotoxisches Verhalten aufwies. Anders war die Sachlage bei den Versuchen mit
den SCVs der autoaggregativen Subgruppe (vgl. Ergebnisse 4.1.1.). Hier zeigte sich,
dass vier der sieben SCVs eine im Vergleich zum WT signifikant höhere Zytotoxizität
aufwiesen. Darunter war auch die von VON GÖTZ charakterisierte SCV 20265. Die
vergleichend getestete exsA-Mutante von SCV 20265 zeigte keine Zytotoxizität, was
als Beweis einer Typ III Sekretions-bedingten Virulenz diente. Neben der SCV 20265
waren die SCVs der Stämme 52, 8226 und 231 vermehrt zytotoxisch. Vergleicht man
die Ergebnisse der 15 getesteten Isolate mittels eines Chi-Square-Tests, erhält man
eine signifikante Korrelation zwischen dem autoaggregativen Verhalten der SCVs
und einer erhöhten Zytotoxizität (p < 0,025).
Da für die Stämme 52, 8226 und 231 keine Genom-Analysen vorlagen, wurden Typ
III Sekretions-Proteine mit Hilfe von SDS-Polyacrylamid-Gelen und Western Blots
Diskussion 113
nachgewiesen (vgl. Ergebnisse 4.2.). Hier konnte eine erhöhte Sekretion von
Proteinen des Typ III Sekretionssystems bei allen drei SCVs festgestellt werden.
Somit zeigte sich, dass auch hier die festgestellte Zytotoxizität Typ III-vermittelt war,
wobei auch hier davon ausgegangen werden kann, dass die Zytotoxizität ExoU-
unabhängig war, da keine spezifischen Banden im Gel identifiziert wurden.
Es ist sehr wahrscheinlich, dass die beobachtete, ExoU-unabhängige Zytotoxizität
auf die Bildung kleiner Poren in der Makrophagen-Membran zurückzuführen ist, wie
für den ebenfalls ExoU-defizienten und stark zytotoxischen P. aeruginosa CHA
beschrieben (DACHEUX et al., 1999). Die dabei involvierten Proteine PopB, PopD
und PcrV bilden 2,8 bis 3,5 nm große Poren, die eine schnelle Onkose (Schwellen
der Zelle und des Nukleus, Blasenbildung an der Membran und verstärkte
Vakuolisierung) der eukaryontischen Zelle zur Folge haben. Lysierte Zellen ziehen
dann durch chemotaktische Signale ,Schwärme’ von P. aeruginosa an, die
vermutlich das ausfließenden Cytosol als Nahrungsquelle nutzen (DACHEUX et al.,
2000, 2001b).
Die Ergebnisse der Studie von VON GÖTZ (2003) und die Ergebnisse der
vorliegenden Arbeit (siehe auch folgendes Kapitel) belegen, dass die Etablierung
eines wenig virulenten Phänotyps, wie es für die chronisch infizierte CF-Lunge bisher
angenommen wurde (BURKE et al., 1991; ROY-BURMAN et al., 2001), nur eine von
mehreren Möglichkeiten von P. aeruginosa ist, eine persistierende Infektion
auszubilden. Es scheint, dass es eine parallele Existenz unterschiedlich virulenter
klonaler Varianten gibt. Dieser Befund wird durch das Auffinden von Antikörpern im
Serum von chronisch infizierten Erwachsenen mit CF unterstützt, welche sich gegen
Typ III Effektorproteine richten. Dies spricht für eine Sekretion dieser Proteine auch
nach langem chronischen Infektionsverlauf (MOSS et al., 2001).
Vakzinierungsversuche mit Typ III Effektorproteinen könnten helfen, CF-Patienten
vor zytotoxischen Phänotypen von P. aeruginosa zu schützen. Aktive und passive
Immunisierung über PcrV bewirkte bei Mäusen eine hohe Überlebensrate nach
Infektion mit dem hoch zytotoxischen Stamm P. aeruginosa 103 und verminderte
Diskussion 114
durch Entzündungsprozesse vermittelte Schäden am Lungenepithel (FRANK et al.,
2002).
5.2. Erhöhte Zytotoxizität von autoaggregativen SCVs korreliert mit erhöhter in vivo Pathogenität
Im vorherigen Kapitel wurde bereits auf die Hintergründe eingegangen, die zur
Untersuchung der Virulenz der klinischen Isolate geführt hatten. Nachdem sich einige
der autoaggregativen SCVs als hoch zytotoxisch im Vergleich zum WT erwiesen
hatten, lag die Frage nahe, ob die erhöhte Typ III Sekretion auch in vivo eine Rolle
spielte. Die Ergebnisse (vgl. Ergebnisse 4.4.1.) zeigen deutlich, dass die SCVs von
20265, 52, 8226 und 231 zu einer signifikant höheren Sterblichkeit der Mäuse nach
intranasaler Infektion führten als die jeweiligen WT. Auch das Krankheitsbild der
Tiere, die mit SCVs infiziert waren, war ausgeprägter als bei mit dem WT infizierten
Tieren. Starke Dyspnoe, purulente Konjunktivitis und ausgeprägte Apathie
kennzeichneten das klinische Bild bei SCV-Infektion. Die Untersuchung der exsA-
Mutante von 20265 SCV konnte zeigen, dass eine Reduktion der Virulenz auftrat,
wenn das Typ III Sekretionssystem ausgeschaltet war (vgl. Ergebnisse 4.4.1.). Zu
späteren Zeitpunkten der Infektion waren die Unterschiede in den Mortalitätsraten
geringer, was dafür spricht, dass die Typ III Sekretions-vermittelte Virulenz sich vor
allem in der frühen Phase der Infektion äußert. Lebendkeimzahl-Bestimmungen (vgl.
Ergebnisse 4.4.2.) in den Organen infizierter Tiere mit den Stämmen 20265 und 52
konnten zeigen, dass die Gesamtkeimzahl bei SCV-infizierten Tieren signifikant
höher lag als nach Infektion mit dem jeweiligen WT. Vor allem auffällig war eine
Bakterienvermehrung gegenüber der Infektionsdosis in der Lunge, was dafür spricht,
dass die SCVs über einen Mechanismus verfügen müssen, der Phagozytose durch
die Entzündungszellen zu entgehen und damit die Möglichkeit zur Replikation zu
erhalten. Histopathologische Untersuchungen der Lungen nach Infektion mit den
Stämmen 20265 oder 52 infizierten Tieren konnten zeigen, dass der Schweregrad
Diskussion 115
der Entzündungsreaktion bei Infektion mit SCVs dem Schweregrad bei Infektion mit
WT, bzw. im Fall von Stamm 20265 der Infektion mit der exsA-Mutante der SCV
glich. Auffällig war jedoch, dass die Lokalisation der Entzündung eine andere war.
WT und SCVexsA verursachten eine akute Bronchopneumonie, während die
Lokalisation der Entzündung bei den SCVs hauptsächlich die alveolären Bereiche
betraf. Weiterhin war auffällig, dass bei SCV-infizierten Tieren massenhaft Bakterien
im Lumen der Alveolen zu sehen waren, was bei WT-, bzw. SCVexsA-infizierten
Tieren deutlich weniger ausgeprägt war (vgl. Ergebnisse 4.4.3.). Gram-Färbungen
der Lungenschnitte konnten dies weiter verdeutlichen. Dieses Ergebnis korreliert mit
den Keimzahlbestimmungen und könnte bedeuten, dass die SCVs über einen
Mechanismus verfügen, der die Phagozytose verhindert, bzw. die phagozytierenden
Zellen effektiv abtötet. Da der einzige Unterschied zwischen 20265 SCV und 20265
SCVexsA die fehlende Typ III Sekretion bei der Mutante ist, kann davon
ausgegangen werden, dass die Typ III Sekretion maßgeblich an diesen
Besonderheiten beteiligt ist.
Aus der Literatur ist bekannt, dass P. aeruginosa durch die Sezernierung von ExoS
und ExoT in der Lage ist, einer aktiven oder passiven Internalisierung
entgegenzuwirken (COWELL et al. 2000). Der Mechanismus, der dem zugrunde
liegt, scheint mit der Regulation des Quorum sensing-Systems zusammenzuhängen.
Eine Studie von COWELL et al. (2003) konnte zeigen, dass eine Interaktion
zwischen ExoS/ExoT-Produktion und lasA/lasB-Aktivität besteht. War die
ExoS/ExoT-Produktion hoch, war das las-System, das für die Invasion von P.
aeruginosa verantwortlich ist, inaktiv. Eine Aktivierung des las-Systems hatte
dagegen eine Verringerung der ExoS/ExoT-Produktion zur Folge und dies führte zu
einer Internalisierung von P. aeruginosa in die Zielzelle.
Auch der zytotoxische Effekt durch Typ III Sekretion ist in der Literatur ausführlich
beschrieben (siehe 5.1.).
Die verminderte Virulenz von exsA-defizienten Mutanten von P. aeruginosa im
akuten Mausmodell wurde bereits von anderen Gruppen beschrieben (WIENER-
Diskussion 116
KRONISH et al., 1993; KUDOH et al., 1994; HAUSER et al., 1998) und konnte hier
für die SCVexsA von 20265 bestätigt werden.
Desweiteren wurde bislang eine Invasion von P. aeruginosa in Epithelzellen als eine
mögliche Überlebensstrategie vermutet, um sich dem Immunsystem bzw. während
einer Therapie angreifenden antibiotischen Substanzen entziehen zu können. Solch
ein invasives Verhalten von P. aeruginosa wurde besonders in Zusammenhang mit
Infektionen der Augenhornhaut berichtet (FLEISZIG et al., 1994; FLEISZIG et al.,
1995). Die Invasion in Epithelzellen könnte neben der durch Typ III Sekretion
verminderte Phagozytose eine weitere Erklärung für höhere Keimzahlen bei den
SCV-infizierten Tieren sein.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es eine Korrelation zwischen den
Eigenschaften der autoaggregativen Subgruppe der von HÄUSSLER et al. (2003)
beschriebenen SCVs, einer erhöhten in vitro Zytotoxizität und einer erhöhten in vivo
Pathogenität gibt, wobei sowohl die Zytotoxizität als auch ein Großteil der in vivo
Pathogenität der Typ III Sekretion zuzuschreiben ist.
Diese gesteigerte Virulenz steht im Gegensatz zu den bisherigen Studien, die P.
aeruginosa bei chronischer Infektion bei CF eine generell verringerte Pathogenität
zuschreiben. Bisher wurde den SCVs keine besondere Bedeutung beigemessen und
ihre Rolle in der Pathogenese der CF-Lunge ist unklar. Die vorliegende Studie zeigt
jedoch im Zusammenhang mit den Arbeiten von VON GÖTZ (2003), WEHMHÖNER
(2002) und HÄUSSLER et al. (2003), dass es große Unterschiede in der Virulenz von
klonalen Varianten gibt und SCVs in Zukunft vielleicht mehr Bedeutung zugemessen
werden sollte.
Diskussion 117
5.3. Die Überexpression des pvrR-Gens führt zu einer teilweisen Wiederherstellung des WT-Phänotyps
Die Entstehung des SCV-Phänotyps aus dem WT während einer chronischen
Infektion mit P. aeruginosa ist bislang ungeklärt. DRENKARD u. AUSUBEL (2002)
identifizierten mit pvrR einen möglichen Zwei-Komponenten Response Regulator in
P. aeruginosa PA 14, welcher nach Komplementation von in vitro generierten P.
aeruginosa PA 14 SCVs und einigen anderen SCVs von klinischen Isolaten diese in
schnell wachsende Morphotypen revertierte. Die Koloniemorphologie dieser
Komplementanten und des PA 14 Wildtyps waren identisch. Genomische Deletion
von pvrR im PA 14 WT konnte jedoch keine Konversion von WT zu SCV induzieren.
Lediglich die Frequenz des Auftretens von SCVs in der WT-Population erhöhte sich
in den pvrR-Mutanten. Das Gen pvrR scheint also zwar der Auslöser für die
Reversion von SCV zum WT, bzw. einer Revertante zu sein, ist aber nicht allein
verantwortlich für die Konversion von WT zur SCV. VON GÖTZ (2003) konnte in
seiner Arbeit mittels PCR feststellen, dass das Genom der SCV 20265 ein Gen mit
sehr ähnlicher Sequenz und Länge enthielt. VON GÖTZ (2003) führte eine
Komplementierung mit dem Plasmid pED202, welches das pvrR-Gen enthielt, mit der
SCV von 20265 und zwei weiteren SCVs durch. Bei allen SCVs führte die
Komplementation zu einer großen Kolonieform, die sich deutlich von der Größe der
SCVs unterschied und denen der jeweiligen WT stark ähnelte. In vitro Kultivierungen
der komplementierten SCV 20265 in Vogel-Bonner-Minimalmedium zeigten, dass
diese keine autoaggregativen Fähigkeiten mehr aufwiesen.
In der vorliegenden Studie sollten die Beobachtungen, die DRENKARD und
AUSUBEL, sowie VON GÖTZ gemacht hatten, mit den hier untersuchten SCVs
verifiziert werden. Dazu wurden die SCVs von 52, 8226 und 231 (die alle pvrR in
ihrem Genom enthalten) durch Elektroporation mit dem Plasmid pED202, welches
das Gen pvrR trägt, transformiert (siehe Ergebnisse, 4.3.1). Außerdem wurde die
durch VON GÖTZ hergestellte SCVpED202 von 20265 verwendet.
Diskussion 118
Bei allen vier Komplementanten konnte festgestellt werden, dass die Koloniegröße
zumindest teilweise im Vergleich zur SCV zunahm (siehe Ergebnisse 4.3.2.1.).
Während jedoch die Morphologie bei den Komplementanten von 20265 und 52
weitgehend den Wildtypen entsprach, waren bei den Komplementanten von 8226
und 231 auch Kolonien zu finden, die in ihrer Größe den SCVs entsprachen.
Versuche zum Schwimmverhalten der Komplementanten (siehe Ergebnisse 4.3.2.2.)
im Vergleich zu SCV und WT zeigten, dass alle Komplementanten ein erhöhtes
Schwimmverhalten im Vergleich zur SCV aufwiesen und sich mehr oder weniger
dem WT anglichen. Bei drei von vier Komplementanten veränderte sich das
Twitching-Vermögen im Vergleich zur SCV und glich sich dem WT-Phänotyp an. Das
Twitching-Vermögen von 20265 SCVpED202 glich dem der SCV (siehe Ergebnisse
4.3.2.3.). In der vorliegenden Arbeit wurde bereits ein Phänomen der
autoaggregativen SCVs, die erhöhte Zytotoxizität gegenüber dem jeweiligen klonalen
WT, erörtert. Die pvrR-Komplementanten wurden ebenfalls auf ihre Zytotoxizität
getestet und dabei mit SCV und WT verglichen. Dabei konnte festgestellt werden,
dass pvrR keinen Einfluss auf die Zytotoxizität bei den Stämmen 20265, 52 und 231
hatte. Komplementanten und SCVs zeigten die gleiche erhöhte Zytotoxizität
gegenüber dem WT, was zu dem Schluss führte, dass die Typ III Sekretion nicht von
pvrR beeinflusst wird. Einzige Ausnahme war der Stamm 8226, wo die
Komplementante im Gegensatz zur SCV keine Zytotoxizität aufwies und sich also
dem WT anglich (siehe Ergebnisse 4.3.3.). Versuche zum autoaggregativen
Verhalten konnten zeigen, dass keine der Komplementanten Autoaggregation zeigte,
wie dies bei den SCVs der Fall war (siehe Ergebnisse 4.3.2.3.).
Auffällig ist, dass der Einfluss von pvrR auf die einzelnen SCV-Phänotypen doch
sehr unterschiedlich war. So wurde der Phänotyp von 8226 bis auf die
Koloniemorphologie nahezu vollständig komplementiert, während die anderen
Komplementanten noch deutliche SCV-Merkmale aufwiesen. Zusammenfassend
kann gesagt werden, dass pvrR mit verantwortlich ist für die Ausprägung des WT-
Phänotyps.
Diskussion 119
DRENKARD u. AUSUBEL (2002) postulieren, dass die Phänotyp-Konversion über
einen contingency locus bzw. einen phänotypischen Schalter kontrolliert wird, der
einen abrupten Wechsel vom Wildtyp- zum SCV-Phänotyp vermittelt. Je nach
verwendetem Medium und Kultivierungstemperatur konnten sie variierende
Frequenzen von 10-1 bis 10–7 Kanamycin-resistenter SCVs in vitro aus P. aeruginosa
PA14 generieren. Die höchste Frequenz erhielten sie bei der Kultivierung auf
Kanamycin-haltigen Minimalmedien, die niedrigsten auf Komplexmedien. Dies spricht
für eine umweltbedingte Regulation der Phänotyp-Konversion, wie sie im Rahmen
von Phasenvariationen bekannt sind. Das Gen pvrR scheint durch diesen
postulierten phänotypischen Schalter beeinflussbar zu sein. Um den Mechanismus
der Morphotyp-Konversion allein einer Phasenvariation zuzuordnen, müssten die aus
SCVs generierten Revertanten identisch mit den klonalen Wildtypen sein, was für die
von DRENKARD u. AUSUBEL (2002) beschriebenen, in vitro generierten
phänotypischen Varianten zutrifft. Die Ergebnisse von HÄUSSLER et al. (2003) an
der Subgruppe autoaggregativer SCVs und ihren klonalen Morphotypen aus
klinischen Isolaten von CF-Patienten können dies jedoch nicht bestätigen. Die
Genexpressions-Analysen mit SCV 20265 und ihren klonalen Morphotypen (v.
GÖTZ, 2003) bestätigen eindrucksvoll den von HÄUSSLER et al. (2003)
beschriebenen intermediären Phänotyp der Revertanten.
Zwischen der Infektion eines CF-Patienten mit dem Wildtyp bzw. seiner Isolierung
und der Ausbildung einer SCV bzw. seiner Isolierung können mehrere
Mutationsereignisse eingetreten sein, die durch eine stark selektiv wirkende Umwelt
– wie einer therapierten CF-Lunge – hervorgerufen wurden (RAINEY u.
TRAVISANO, 1998; RAINEY u. MOXON, 2000). Es ist an sequentiellen klinischen
Isolaten schwer nachzuvollziehen, wie viele mutative Ereignisse zwischen den als
Wildtyp definierten Isolaten und den SCVs liegen. Bei einer Reversion der SCV
entsteht also möglicherweise ein Phänotyp, der dem unmittelbaren Vorfahren der
SCV entspricht, jedoch nicht selbst als Isolat vorliegt.
DRENKARD u. AUSUBEL (2002) stellten ihre Hypothese der Phasenvariation als
Mechanismus der Morphotyp-Konversion in P. aeruginosa nach Arbeiten mit in vitro
Diskussion 120
generierten SCVs auf, die direkt aus ihren entsprechenden Wildtypen entstanden
waren. Vermutlich beginnt die Ausbildung morphotypischer Varianten klinischer CF-
Isolate von P. aeruginosa mit einem starken selektiven Druck durch das sich
dynamisch verändernde Habitat der CF-Lunge (RAINEY u. MOXON, 2000). Klinische
Isolate von langzeit-infizierten CF-Patienten stellen somit verschiedene Resultate
einer Vielzahl von evolutionären Prozessen dar. Die Art und Schnelligkeit einer
solchen Evolution ist vermutlich abhängig von den jeweils kolonisierenden P.
aeruginosa -Stämmen und von den besiedelten Patienten. SCVs sind somit ein
Beispiel für eine besonders augenfällige phänotypische Variation. Zwei Szenarien
zur Konversion von Wildtyp zu SCV sind also möglich: Die Konversion könnte
einerseits das Resultat einer (gesteigerten) randomisierten Mutagenese sein, wobei
die Reversion von SCV zur Revertante eine Art kompensatorische Mutation sein
könnte, die den langsam wachsenden Phänotyp wieder aufhebt. Andererseits könnte
sich dem Adaptationsprozess durch randomisierte Mutagenese und Selektion eine
Phasenvariation anschließen, welche die Bildung von SCVs aus schnell wachsenden
Wildtypen auslösen könnte.
5.4. Eignung des neuen C. elegans-Modells als Tiermodell zum Screening bakterieller Mutanten
Wichtige Voraussetzungen für den effektiven Einsatz eines Tieres als Screening-
Modell sind seine unkomplizierte, kostengünstige Haltung und Vermehrung unter
Laborbedingungen mit möglichst geringem Raumbedarf. Weiterhin sind etablierte
Basistechniken zur Kultivierung synchronisierter Kulturen und eine möglichst geringe
Generationsdauer von wenigen Tagen von Nöten. Nur so kann ein Durchsatz einer
hohen Probenzahl gewährleistet werden. Der Nematode C. elegans erfüllt alle diese
Bedingungen. Die umfassende Kenntnis der Physiologie sowie des komplexen
Genoms dieses Tieres sind weitere wesentliche Vorteile. Außerdem besteht eine
hohe genetische Homologie zu Säugern, was die Übertragbarkeit von Ergebnissen
Diskussion 121
möglich macht. Für alle Forschungsarbeiten ist jedoch auch die letale Wirkung der
Bakterien auf C. elegans eine zwingende Voraussetzung. Diese letale Wirkung
wurde für P. aeruginosa bereits gezeigt. Die Gruppe um F. Ausubel (TAN et al.,
1999a, 1999b; MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999) beschrieb vor einigen Jahren das
Pathogenitätsmodell C. elegans - P. aeruginosa. Im Zuge dieser Arbeiten gelang es,
P. aeruginosa -Mutanten mit reduzierter Virulenz zu generieren und im C. elegans -
Modell zu detektieren. Ein Großteil dieser Mutanten zeigte auch im Mausmodell eine
Attenuierung. Interessanterweise schien die Virulenz von P. aeruginosa im
Wurmmodell stark von den äußeren Bedingungen abzuhängen. Beschrieben wurde
in dem C. elegans -Modell ein Wurmsterben auf mit P. aeruginosa PA 14
bewachsenen Agarplatten, wobei bei einem niedrigen Salzgehalt ein Wurmsterben
innerhalb von wenigen Tagen – auch Slowkilling genannt – und bei hohem
Salzgehalt ein deutlich schnelleres Sterben innerhalb von 24 h – das sogenannte
Fastkilling – beobachtet wurde (TAN et al., 1999a). DARBY et al. (1999)
identifizierten zudem eine dritte Art des Wurmsterbens auf BHI-Agar; hierbei wurde
bei Kultivierung auf mit P. aeruginosa PAO1 bewachsenen Agarplatten innerhalb
weniger Stunden eine tödliche Paralyse von C. elegans herbeigeführt (DARBY et al.,
1999). Verantwortlich für diese unterschiedlichen Tötungsarten schien eine Reihe
von Virulenzfaktoren, die abhängig von den äußeren Rahmenbedingungen von P.
aeruginosa exprimiert wurden.
I. ZIEGLER führte 2003 mit CF-Isolaten von P. aeruginosa aus der Medizinischen
Hochschule Hannover Versuche mit Hilfe dieser C. elegans -Assays durch. Dabei lag
der Schwerpunkt auf dem Vergleich der Virulenz der unterschiedlichen klonalen
Morphotypen (WT, SCV und Revertanten). Einige Stämme zeigten eine dem Stamm
PA 14 vergleichbare Virulenz in den beschriebenen Assays. Interessanterweise
zeigte von den in der vorliegenden Studie verwendeten Stämmen nur die SCV von
8226 im Fastkilling Virulenz, der WT war avirulent. Die Stämme 20265 und 52
zeigten weder unter Fastkilling- noch unter Slowkilling-Bedingungen Virulenz. 8226
WT und SCV waren im Slowkilling ebenfalls avirulent. Der Stamm 231 wurde im
Rahmen dieser Studie getestet. Auch hier wurde weder im Fastkilling noch im
Slowkilling Virulenz festgestellt.
Diskussion 122
Um diese avirulenten Stämme untersuchen zu können, mussten Bedingungen
gefunden werden, unter denen es zu einer Expression von Virulenzfaktoren kommt,
die für die Abtötung von C. elegans Bedeutung haben. Durch den Einsatz des Vogel-
Bonner-Minimalmediums wurden diese Bedingungen geschaffen. Neben dem
normalen Vogel-Bonner-Medium wurde auch eine Calcium-depletierte Variante
verwendet, wodurch teilweise andere Virulenzfaktoren angeregt wurden als im
normalen Medium. Im Gegensatz zu den Standard-Assays handelte es sich bei dem
neuen Modell um ein System, das auf einer Flüssigkultur von Bakterien beruht, der
eine bestimmte Menge Würmer zugegeben wurde. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten
wurde die Anzahl der toten Würmer an der Gesamtpopulation gezählt.
Bei den Versuchen mit dem neuen C. elegans -Modell konnte bei allen eingesetzten
SCVs und WT Virulenz festgestellt werden. Die Stämme PA 14 und PAO 1, die zur
Etablierung des C. elegans -Pathogenitätsmodells verwendet wurden (TAN et al.,
1999a, 1999b; MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999; DARBY et al., 1999), zeigten
ebenfalls Virulenz unter den Bedingungen des neuen Versuchssystems. Zur
Charakterisierung dieser Virulenz und der daran beteiligten Virulenzfaktoren wurde
das P. aeruginosa CF-Isolat TB und eine Auswahl von 65 Mutanten verwendet. Eine
der charakterisierten Mutanten ist inzwischen publiziert (JUHAS et al., 2004, in
press). Sechs Mutanten wurden für die vorliegende Arbeit verwendet. Eine der hier
vorgestellten Mutanten zeigte einen Defekt in einem Eisenaufnahme-System
(D10B10), zwei weitere Mutanten wiesen Defekte in der Regulation des Quorum
sensing auf (D8A3, 18A8) und eine Mutante zeigte einen Defekt in einem Protein zur
Typ IV Pili-Bildung (25C8). Bei der Mutante 9B9 inseriert das Transposon zwischen
dem Gen für die Katalase B-Bildung und dem Gen für den mechanosensitiven Kanal
MscL. Die Mutante 20D1 konnte das Protein XcpS, ein Bestandteil des Typ II
Sekretionsapparats, nicht mehr produzieren. Fünf dieser Mutanten wiesen im C.
elegans-System unter Flüssigkultur-Bedingungen eine gegenüber dem WT
reduzierte Virulenz auf, die Mutante 18A8 war in der Virulenz dem WT ähnlich (siehe
Ergebnisse 4.5.6.). Vergleichende Untersuchungen unter Standard-Bedingungen
(Slow- und Fastkilling) zeigten für alle Mutanten und den WT keine Virulenz unter
Diskussion 123
Slowkilling-Bedingungen. Im Fastkilling waren die Mutanten 18A8 und D8A3 wenig,
die Mutanten 25C8 und D10B10 deutlich attenuiert. Die Mutanten 9B9 und 20D1
zeigten keine Unterschiede im Fastkilling beim Vergleich mit dem WT, was zu der
Schlussfolgerung führte, dass hier Virulenzfaktoren ausgeschaltet sind, die nur unter
Flüssigkultur-Bedingungen Bedeutung haben.
P. aeruginosa benötigt Eisen für die Respiration aerob wie auch unter anaeroben
Bedingungen, wobei der Bedarf bei aerobem Wachstum am höchsten ist (VASIL u.
OCHSNER, 1999). Im menschlichen Körper herrscht ein Mangel an frei verfügbarem
Eisen, da der größte Teil gebunden an Hämoglobin oder Myoglobin vorliegt.
Intrazellulär wird Eisen an Ferritin und im Serum an Transferrin gebunden (BRAUN
et al., 2001). Um trotzdem an genug Eisen zu gelangen, hat P. aeruginosa mehrere
Mechanismen entwickelt. Siderophore (Pyoverdin, Pyochelin) werden von P.
aeruginosa gebildet, um extrazellulär vorliegendes Eisen zu binden (BRAUN et al.,
2001). Neben Rezeptoren für Pyochelin und Pyoverdin gibt es noch sechs weitere
Eisen-Rezeptoren (VASIL u. OCHSNER, 1999). P. aeruginosa verwendet zudem die
Systeme has und phu, um Häm-gebundenes Eisen in die Zelle zu transportieren
(OCHSNER et al., 2000). Siderophore werden durch TonB-Proteine vom Rezeptor in
der äußeren zur inneren Bakterienmembran geschleust (POOLE et al., 1996). An der
Oberfläche von Bakterienzellen gebundenes Eisen kann zusammen mit dem
sezernierten, redox-aktiven Pyocyanin Sauerstoffradikale bilden, die direkt
zellschädigend wirken (BRITIGAN et al., 1992; BRITIGAN et al., 1999). P.
aeruginosa schützt sich selbst vor diesen Radikalen durch die Produktion von
Superoxid-Dismutase, Katalase und Peroxidase, wobei die beiden erstgenannten
Enzyme ebenfalls Eisen-abhängig reagieren (HASSETT et al., 1999).
Da P. aeruginosa ubiquitär vorkommt, mussten viele Mechanismen entwickelt
werden, um in den unterschiedlichen Habitaten das lebenswichtige Eisen
bereitstellen zu können (VASIL u. OCHSNER, 1999).
Die Mutante D10B10 trägt einen Defekt in einem TonB-abhängigen Eisenrezeptor.
Für den Virulenzfaktor Pyocyanin ist beschrieben (s. o.), dass es durch ein
Zusammenwirken von oberflächengebundenem Eisen (z. B. an einen Rezeptor
Diskussion 124
gebunden) und Pyocyanin zu Sauerstoffradikalbildung kommt, die toxische Wirkung
hat. Man könnte spekulieren, dass der bei D10B10 mutierte Eisenrezeptor für die
Bindung des Eisens verantwortlich ist, das mit Pyocyanin zusammenwirkt, oder dass
Pyozyanin selbst bei der Eisen-abhängigen Radikalbildung auch mit dem Rezeptor
assoziiert ist. Bisher ist eine Rezeptorbeteiligung hierfür nicht beschrieben. Allerdings
würde auch die deutlich verminderte Virulenz unter Fastkilling-Bedingungen (63 %
Reduktion; siehe Ergebnisse 4.5.6., Tab. 10) für eine solche Rezeptorfunktion
sprechen, da Pyocyanin einen der bedeutendsten Virulenzfaktoren im Fastkilling
darstellt (TAN et al., 1999 a, b; MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999). Allerdings gibt die
Literatur keine Hinweise, wie der Mechanismus der Abtötung durch Pyocyanin im
Fastkilling abläuft.
P. aeruginosa ist imstande, die Zelldichte seiner Population wahrzunehmen und über
Signalmoleküle zu kommunizieren. Dieses Phänomen wird Quorum sensing (QS)
genannt und ist für viele gram-negative Bakterien bekannt. Es ermöglicht den
Bakterien, statt als Individuum als Gemeinschaft zu agieren. Ist die Zelldichte niedrig,
werden geringe Mengen der Signalmoleküle, auch Autoinducer genannt, produziert
und diffundieren, vermutlich wirkungslos, ins umgebende Medium. Mit wachsender
Zelldichte steigt auch die Konzentration von Autoinducern, bis sie einen kritischen
Schwellenwert erreichen. Zu diesem Zeitpunkt binden diese Autoinducer an
spezifische Rezeptoren, die dadurch aktiviert werden und die Transkription
bestimmter Zielgene induzieren (GREENBERG, 1997). Das erste bei P. aeruginosa
gefundene QS-System wurde als Las-System bezeichnet und besteht aus LasR
(Rezeptor) und LasI (Autoinducer). LasI ist verantwortlich für die Produktion des
Signalmoleküls N-(3-oxododecanoyl)-L-Homoserinlakton. Das Las-System reguliert
die Virulenzfaktoren Elastase, Alkalische Protease und Exotoxin A (GAMBELLO et
al., 1993). P. aeruginosa verfügt noch über ein weiteres QS-System, das sogenannte
Rhl-System, bestehend aus dem Rezeptor RhlR und der Autoinducersynthase RhlI,
die für die Produktion des Signalmoleküls N-butyryl-Homoserinlakton verantwortlich
ist. Das Rhl-System reguliert die Virulenzfaktoren Rhamnolipid, Elastase, Pyocyanin
und Alkalische Protease (OCHSNER u. REISER, 1995). Das Las-System ist dem
Diskussion 125
Rhl-System übergeordnet (PESCI et al., 1997) und wird selbst durch den Regulator
Vfr reguliert (ALBUS et al. 1997).
Die Rolle des QS in der Virulenz gegenüber C. elegans wurde bereits durch TAN et
al. (1999b) und MAHAJAN-MIKLOS et al. (2000) charakterisiert. Sie konnten zeigen,
dass eine Mutation des LasR-Rezeptors bei PA 14 eine deutliche Attenuierung der
Virulenz gegenüber C. elegans unter Slowkilling-Bedingungen zur Folge hatte. Diese
Form der Virulenz entsteht durch einen Infektions-ähnlichen Prozess mit
Akkumulation der Bakterien im Wirt und erfordert lebende Bakterien. Da eine
Aktivierung des QS erst bei hohen Bakteriendichten erfolgt, ist dies eine Erklärung
für eine Attenuierung von QS-Mutanten unter Slowkilling-Bedingungen. Im Fastkilling
waren solche Mutanten kaum, bzw. gar nicht auffällig. Diese Form der Abtötung ist
toxinvermittelt und erfordert keine lebenden Bakterien (TAN et al., 1999a).
DARBY et al. (1999) konnte in Versuchen mit PAO 1 feststellen, dass die letale
Paralyse von C. elegans Las- und Rhl-abhängig ist. Entsprechende Mutanten von
PAO 1 zeigten bei C. elegans keine Virulenz. Auch in anderen Modellen konnte
bereits gezeigt werden, dass ein Teil der Virulenz QS-abhängig war. So führte eine
LasR-Mutation auch bei Versuchen mit Galleria mellonella (große Wachsmotte) zu
einer reduzierten Virulenz (JANDER et al., 2000).
Die Mutanten D8A3 und 18A8 tragen Defekte in Regulatoren des QS. In D8A3 ist
der vfr-Regulator funktionsuntüchtig, in der Mutante 18A8 liegt der Defekt im
Rezeptor RhlR. Die Versuche mit dem neuen C. elegans-System ergaben eine
Reduktion der Virulenz in D8A3, nicht aber in der Mutante 18A8. Bei Versuchen
unter Fastkilling-Bedingungen ergab sich eine geringe Attenuierung beider Mutanten
gegenüber dem WT.
Es ist nicht verwunderlich, dass ein knock-out von vfr oder rhlR hier im Fastkilling nur
wenig Auswirkung zeigte, da wie bereits erwähnt QS vor allem unter Slowkilling-
Bedingungen detektiert wird. Eine Mutation im vfr-Gen führte im neuen C. elegans-
System zu einer deutlich verminderten Virulenz, während eine rhlR-Mutation keine
Auswirkungen zeigte. Das QS-System scheint also für einen Teil der Virulenz unter
diesen Versuchsbedingungen verantwortlich zu sein, das untergeordnete RhlR-
System hat jedoch keinen Einfluss auf die Abtötung.
Diskussion 126
Die Mutante 25C8 trägt einen Defekt im pilY1-Gen, das für die Bildung des Typ IV
Pili-Proteins PilY1 verantwortlich ist. Typ IV Pili sind verantwortlich für Twitching und
Zelladhäsion, außerdem sind sie an der Biofilmproduktion beteiligt. Die Biosynthese
der Typ IV Pili ist sehr komplex und beinhaltet eine große Zahl von
Regulatorproteinen und Strukturproteinen (SUNDIN et al., 2002). Die Beteiligung von
Typ IV Pili an der Virulenz von P. aeruginosa wurde in den unterschiedlichsten
Studien beschrieben. GALLAGHER u. MANOIL (2001) fanden eine Pili-Mutante, die
nicht in der Lage war, pilW zu exprimieren und im C. elegans-Versuch (letale
Paralyse) attenuiert war. D’ARGENIO et al. (2001) fanden in Versuchen mit
Drosophila melanogaster ebenfalls Virulenz-attenuierte Pili-Mutanten, allerdings war
hier die von GALLAGHER u. MANOIL (2001) beschriebene pilW-Mutante nicht
auffällig. Auch eine Mutation im pilY1-Gen führte bei Drosophila nicht zu einer
verringerten Virulenz. FAUVARQUE et al. (2002) konnten zeigen, dass eine Mutation
im Gen pilV zu einer Attenuierung führte. Diese Mutante wurde in der vorliegenden
Studie ebenfalls im C. elegans-Versuch unter Flüssigkultur-Bedingungen untersucht
(siehe Ergebnisse 4.5.4.). Beide Pili-Mutanten zeigten unter diesen
Versuchsbedingungen eine Attenuierung. Auffällig war, dass diese Attenuierung bei
25C8 nur unter Calcium-Depletion des Versuchsmediums deutlich wurde. In
normalem Vogel-Bonner-Medium glich sich die Virulenz von 25C8 dem WT an. Die
Calcium-Depletion des Mediums in den C. elegans-Versuchen diente der Aktivierung
von Typ III Sekretion (siehe folgendes Kapitel). Da Pili für die Zelladhäsion
verantwortlich sind und für die Typ III Sekretion ein direkter Zellkontakt nötig ist,
könnte hier ein Zusammenhang bestehen. Ein durch Calcium-Depletion aktiviertes
Typ III Sekretionssystem benötigt Typ IV Pili für die Adhäsion. Bei Defekten in den
Typ IV Pili kommt es zu einer mangelhaften Anheftung an die Zielzelle und damit zu
einer verminderten Funktion des Typ III Sekretionssystems.
Auffällig war weiterhin, dass die Mutante 25C8 auch im Fastkilling zu einer
verminderten Virulenz führte. GALLAGHER u. MANOIL (2001) beschrieben für die
Mutante im pilW-Gen nicht nur eine Attenuierung unter den Versuchsbedingungen im
C. elegans-System, sondern auch eine verminderte Produktion von Cyanid,
Pyocyanin, Pyoverdin und Protease. Ähnliche Bedingungen könnten auch bei der
Diskussion 127
Mutante 25C8 bestehen. Da das Fastkilling toxinvermittelt stattfindet, würde eine
verminderte Produktion von z. B. Pyocyanin zu einer Attenuierung führen.
Bei der Mutante 9B9 inseriert das Transposon zwischen dem Gen für die Katalase
KatB und dem Gen für den mechanosensitiven Kanal MscL. Im C. elegans-Versuch
wies sie unter Flüssigkultur-Bedingungen eine Attenuierung auf, im Fastkilling glich
sie dem WT.
P. aeruginosa besitzt zwei Katalasen, KatA und KatB. Sie dienen dazu,
Sauerstoffradikale (reactive oxigene intermediates = ROIs) unschädlich zu machen.
Diese ROIs entstehen beim Stoffwechsel von P. aeruginosa, stellen aber auch einen
Virulenzfaktor dar. Zum Beispiel werden durch die Interaktion von Pyocyanin mit
Eisen Sauerstoffradikale gebildet, die zellschädigend wirken. P. aeruginosa schützt
sich selbst vor diesen ROIs durch die ständige Produktion von KatA (OCHSNER et
al., 2000). Sauerstoffradikale werden aber auch von Zellen, zum Beispiel
Makrophagen oder neutrophilen Granulozyten, als antimikrobielle Reaktion gebildet.
P. aeruginosa schützt sich vor diesen von außen stammenden ROIs durch die
Produktion von KatB (HOWELL et al., 2000). Der MscL-Kanal wurde zuerst für E. coli
beschrieben. Es handelt sich hierbei um einen mechanosensitiven Kanal, der
essentiell für den Erhalt des Zellturgors, das heißt die Osmoregulation, notwendig ist
(OKADA et al., 2003). Die Expression ist besonders hoch beim Übergang der
Bakterien in die stationäre Wachstumsphase, aber auch in der exponentiellen Phase
wird das Gen exprimiert. Wachstum in hoch osmolaren Medien bewirkt ebenfalls eine
verstärkte Expression von MscL (STOKES et al., 2003). In P. aeruginosa wird MscL
eine Beteiligung an der Proteinsekretion durch die innere Bakterienmembran
zugeschrieben (MA et al., 2003).
In der AG Tümmler konnte mit Hilfe eines H2O2-Tests festgestellt werden, dass das
Transposon keine Auswirkung auf die KatB-Produktion hatte. Der MscL-Kanal wurde
bisher im Rahmen von Virulenz nicht beschrieben. Der Grund für eine Attenuierung
der Mutante 9B9 bleibt dementsprechend unklar.
Diskussion 128
20D1, eine Mutante mit einem Defekt in der Produktion des Typ II Sekretions-
Proteins XcpS (oder Protein F genannt), zeigte unter Flüssigkultur-Bedingungen eine
Reduktion der Virulenz gegen C. elegans im Vergleich zum WT. Unter Fastkilling-
Bedingungen konnte keine Attenuierung festgestellt werden.
Typ II Sekretion ist ein allgemeiner Sekretionsweg, über den viele Proteine und
Enzyme sezerniert werden, die auch teilweise für die Virulenz des Bakteriums
verantwortlich sind (SANDKVIST 2001a). Es handelt sich dabei um einen
„Multiprotein“-Komplex, an dem je nach Organismus 12 bis 15 Proteine beteiligt sind,
bei P. aeruginosa besteht das System aus 12 Proteinen (FILLOUX et al., 1998). Die
Proteine bilden eine Art Pore zwischen der inneren und äußeren Membran. XcpS ist
assoziiert mit der inneren Membran der Bakterienzelle. Die genaue Funktion und
eventuelle Assoziation mit anderen Bestandteilen ist nicht bekannt. Zusammen mit
den Proteinen XcpD, E und O ist XcpS auch an der Bildung von Typ IV-Pili beteiligt
(SANDKVIST, 2001a). Auf die Funktion von Typ IV-Pili im Rahmen von Virulenz
wurde bereits eingegangen (Mutante 25C8).
Über die Typ II Sekretion werden Proteasen, Lipasen, Elastase, alkalische
Phosphatase, Cellulasen und Pektinasen sezerniert, außerdem ist die Exotoxin A-
Sekretion Typ II-abhängig. Die Rolle des Typ II Sekretionswegs in der Pathogenese
ist nicht im Detail geklärt. Man kann jedoch davon ausgehen, dass bei Pathogenen,
die ihre Toxine über Typ II Sekretion sezernieren, ein funktionstüchtiges Typ II
Sekretionssystem für die Virulenz mit entscheidend ist, was für Vibrio cholerae
gezeigt werden konnte (SANDKVIST, 2001b). MARTINEZ et al. (1998) stellten
individuelle xcp-Mutanten aus dem P. aeruginosa-Stamm K her (alle beteiligten Xcp-
Proteine wurden einzeln ausgeschaltet) und führten Tests zur Fähigkeit der Lipase-,
alkalische Phosphatase- und Phospholipase-Produktion, bzw. Sekretion durch. Der
Ausfall von Xcp-Proteinen führte bei allen individuellen Mutanten mit Ausnahme von
XcpQ zu einem negativen Ergebnis, das heißt, die Mutanten waren nicht mehr in der
Lage, diese Enzyme zu sezernieren.
Die durch Typ II Sekretion sezernierten Enzyme sind im Rahmen der Virulenz vor
allem beteiligt an der Zerstörung bestimmter Strukturen, wie zum Beispiel
Zellmembranen. Durch einen Mangel an diesen Enzymen durch nicht
Diskussion 129
funktionstüchtige Typ II Sekretion kann die Virulenz dementsprechend reduziert sein.
Dies könnte die Attenuierung der Mutante 20D1 im C. elegans-System erklären.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es durch dieses neue C. elegans-
System möglich ist, unterschiedlichste Virulenzmechanismen von P. aeruginosa zu
detektieren. Einige dieser Mechanismen sind bereits bekannt und können in diesem
System bestätigt werden, andere Mechanismen sind bislang ungeklärt.
5.5. Eignung des neuen C. elegans-Modells als Pathogenitätsmodell zur Messung von Typ III Sekretionssystem-vermittelter Virulenz
Wie bereits erwähnt, war ein Ziel dieser Studie, ein C. elegans -Modell zu etablieren,
in dem es möglich ist, Typ III Sekretions-bedingte Virulenz von P. aeruginosa zu
detektieren. Bisher war es nicht möglich, bei Screening-Versuchen mit C. elegans
unter Standard-Bedingungen, das heißt Slowkilling, Fastkilling oder letale Paralyse,
Mutanten zu finden, die aufgrund einer defizienten Typ III Sekretion attenuiert waren.
Auch gezielte Versuche mit definierten Typ III-Mutanten konnten keine Attenuierung
zeigen (FAUVARQUE et al., 2002; MIYATA et al., 2003). Es lag die Schlussfolgerung
nah, dass das Typ III Sekretionssystem als Virulenzfaktor bei C. elegans keine Rolle
spielt. Allerdings konnten MIYATA et al. (2003) feststellen, dass eine Typ III-
defiziente Mutante von Salmonella enterica im C. elegans-System attenuiert war,
woraus sie den Schluss zogen, dass das Typ III Sekretionssystem bei P. aeruginosa
durch die Prominenz anderer Virulenzfaktoren nur maskiert ist. Aus diesem Grund
wurden zur Charakterisierung des Typ III Sekretionssystems andere Modelle
herangezogen, wie Drosophila melanogaster (FAUVARQUE et al., 2002) oder die
Wachsmotte Galleria mellonella (MIYATA et al., 2003). Aber auch andere Systeme,
wie die Amöbe Dictyostelium discoideum (PUKATZKI et al., 2002) oder die Hefe
Saccharomyces cerevisiae (RABIN et al., 2003; SATO et al., 2003), zeigten sich
empfänglich für Typ III-bedingte Virulenz.
Diskussion 130
FAUVARQUE et al. (2002) führten ihre Untersuchung zu Typ III-vermittelter Virulenz
mit dem P. aeruginosa -Isolat CHA und einigen ausgewählten Mutanten durch, deren
Defekte Einfluss auf das Typ III Sekretionssystem nehmen. Freundlicherweise
wurden diese Mutanten zusammen mit dem Stamm CHA für Untersuchungen im C.
elegans-System unter Flüssigkultur-Bedingungen zur Verfügung gestellt.
Pseudomonas aeruginosa CHA-D1 trägt einen Gendefekt im exsA-Gen, dem
Hauptregulator der Typ III Sekretion, P. aeruginosa CHAexsD ist nicht in der Lage,
den Sekretionsapparat zu bilden. DsbA ist für eine korrekte Proteinfaltung zuständig,
so dass ein knock-out zu einer Reihe von Ausfällen bei Enzymen und Toxinen führt.
Außerdem reguliert dsbA auch den Regulator der Typ III Sekretion exsA, wobei der
Mechanismus nicht bekannt ist (HA et al., 2003). Eine Attenuierung konnte für dsbA-
Mutanten auch von anderer Seite bestätigt werden (RAHME et al., 1995; JANDER et
al., 2000). Eine weitere Mutante war die Typ IV Pili-defiziente Mutante CHApilV, auf
die bereits im vorigen Kapitel eingegangen wurde. Außerdem wurde eine
Chemotaxis-defiziente Mutante eingesetzt, P. aeruginosa CHAcheZ. Bei den
Versuchen von FAUVARQUE et al. (2002) zeigten sich alle Mutanten außer P.
aeruginosa CHAcheZ in ihrer Virulenz verringert, wobei die exsA- und exsD-
Mutanten sich ähnlich verhielten, die Mutanten CHAdsbA und CHApilV jedoch noch
stärker attenuiert waren.
In den C. elegans-Versuchen unter Flüssigkulturbedingungen in Calcium-depletierten
Vogel-Bonner-Medium konnten ähnliche Ergebnisse erzielt werden. Auch hier war
die Chemotaxis-Mutante nicht attenuiert, die anderen vier Mutanten zeigten eine
gegenüber dem WT verringerte Virulenz, wobei hier kaum Unterschiede zwischen
den einzelnen Mutanten festzustellen waren, mit Ausnahme einer stärkeren Motilität
überlebender Würmer bei CHAdsbA und CHApilV. Auffällig war, dass sich die
Virulenz der Mutanten CHA-D1 und CHAexsD in normalem Medium dem WT
anglichen (siehe Ergebnisse 4.5.4.).
Neben CHA wurden auch die bereits im Zytotoxizitäts-Assay charakterisierten P.
aeruginosa Isolate 20265, 52 und 8226 im neuen C. elegans-System auf ihre
Virulenz überprüft. Die Studie von I. ZIEGLER (2003) hatte ergeben, dass nur 8226
Diskussion 131
SCV unter Fastkilling-Bedingungen Virulenz zeigte, alle anderen SCVs und die WT
waren avirulent. Unter Slowkilling-Bedingungen waren alle SCVs und WT avirulent.
Unter Flüssigkultur-Bedingungen zeigten sich alle Morphotypen virulent, wobei sich
für alle ein Unterschied zwischen WT und SCV in Calcium-depletiertem Medium
ergab. Hier waren die SCVs virulenter. In normalem Medium glichen sich die
Sterberaten an (siehe Ergebnisse 4.5.1.). Die P. aeruginosa exsA-Mutante der SCV
20265 verhielt sich unter Calcium-Depletion wie der WT, d. h., sie war für C. elegans
weniger virulent als die SCV. In normalem Medium war zwischen SCV, WT und
SCVexsA kein Unterschied in der Abtötung feststellbar. Ähnlich verhielt es sich für
die exsA-Mutante des P. aeruginosa -Stammes TB (siehe Ergebnisse 4.5.2.).
Weiterhin wurde eine ExoU-defiziente Mutante von P. aeruginosa PA 34 im Vergleich
zum WT getestet. Auch hier konnten Unterschiede in der Abtötung unter Calcium-
Depletion festgestellt werden, die im normalen Medium nicht auftraten (siehe
Ergebnisse 4.5.3.).
Zusätzlich wurden die beiden P. aeruginosa-Stämme PA 14 und PAO 1 im neuen C.
elegans-System untersucht. Im Gegensatz zu den anderen eingesetzten Stämmen
konnten bei PA 14 keine Unterschiede zwischen normalem und Calcium-depletierten
Medium festgestellt werden. PAO 1 zeigte geringe, jedoch reproduzierbare
Unterschiede in der Abtötung in normalem oder depletierten Medium (siehe
Ergebnisse 4.5.5.).
Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass ein Teil der festgestellten Virulenz in
diesem C. elegans-System auf Typ III Sekretion zurückzuführen ist. Auffällig ist, dass
die Unterschiede in der Virulenz zwischen den SCVs und den jeweiligen WT nur
unter Calcium-Depletion nachzuweisen waren. Das gleiche galt für die Unterschiede
zwischen SCV und exsA-Mutante, bzw. WT und exsA-Mutante im Fall von CHA und
TB. Auch die Unterschiede zwischen der ExoU-Mutante und ihrem WT war nur unter
Calcium-Depletion nachzuweisen. Die Calcium-Depletion ist seit langem als ein
Stimmulator des Typ III Sekretionssystems bekannt (VALLIS et al., 1999a).
PA 14 besitzt ein funktionstüchtiges Typ III Sekretionssystem, ist jedoch nicht in der
Lage, ExoS zu produzieren (MIYATA et al., 2003). Hier könnte der Grund liegen
Diskussion 132
warum bei der Untersuchung von PA 14 keine Unterschiede zwischen dem Calcium-
depletierten und dem normalen Medium festgestellt wurden. Den Einfluss der
einzelnen Effektorproteine auf die Abtötung gilt es in zukünftige Studien zu testen.
ExoU scheint in dem neuen C. elegans-Pathogenitätsmodell von Bedeutung zu sein.
Die klinischen Isolate 20265, 52 und 8226 scheinen kein ExoU zu produzieren, auch
CHA ist ExoU-defizient. Dies ist für viele CF-Isolate der Fall. Nur etwa ein Drittel
besitzt das Gen für ExoU (FELTMANN et al., 2001). Weitere Studien haben ergeben,
dass in der Regel entweder ExoS oder ExoU vorhanden ist (ROY-BURMAN et al.,
2001). Die ExoU-defiziente Mutante von PA 34 zeigte im Vergleich mit dem WT eine
verminderte Virulenz, teilweise konnten die Würmer sogar länger als 24 h überleben
(etwa 5 %), was sonst bei keinen der getesteten Bakterien auftrat. PA 14 besitzt
ExoU und Studien mit Galleria mellonella haben ergeben, dass in diesem System
ExoU eine große Rolle in der Virulenz spielt (MIYATA et al., 2003). Auch
Untersuchungen der Typ III Sekretions-bedingten Virulenz in Dictyostelium
discoideum ergaben, dass ExoU einen großen Anteil an der pathogenen Wirkung
hatte (PUKATZKI et al., 2002). Außerdem ist die Pathogenität von ExoU in vielen
Zellkultur-Modellen (FINCK-BARBACON et al., 1997; VALLIS et al., 1999b; HAUSER
et al. 1998, 1999) und im Mausmodell (HAUSER et al., 1998) beschrieben. Auch die
ExoU-defiziente Mutante von PA 34 zeigte sich im Vergleich mit dem WT im
Mausmodell attenuiert (siehe Ergebnisse 4.5.3.). SATO et al. konnten 2003
feststellen, dass ExoU lipolytische Eigenschaften besitzt. Sie konnten eine Patatin-
ähnliche Phospholipase-Domäne in der Aminosäure-Sequenz ausmachen. Patatin ist
ein Enzym mit Esterase-, Lipd-Acyl-Hydrolase- und Acyl-Transferase-Eigenschaften.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Typ III Sekretions-bedingte Virulenz sich
in diesem neuen C. elegans-System nachweisen lässt. Den Anteil, den die einzelnen
Bestandteile dieses Sekretionsapparats an der Virulenz haben, gilt es in zukünftigen
Studien herauszufinden. Ob es möglich ist, dieses System für die Typ III Sekretion
durch Variation der Versuchsbedingungen weiter zu spezifizieren, ist abzuwarten, da
auch viele andere Virulenzfaktoren in dieses System eingreifen, wie unter Punkt 5.4.
gezeigt.
Zusammenfassung 133
6. Zusammenfassung
Doris Jordan (2004): Charakterisierung von zytotoxischen Pseudomonsa
aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert aus dem Respirationstrakt von Patienten mit Cystischer Fibrose
In der Pathogenese der Cystischen Fibrose (CF) bewirken chronische
respiratorische Infektionen mit P. aeruginosa die schwerwiegendste Komplikation.
Klinische Isolate von P. aeruginosa aus CF-Patienten bilden nach Wachstum auf
diagnostischen Festmedien verschiedenartige Kolonieformen (klonale Morphotypen).
Lange Zeit richtete sich der Fokus auf mukoide Phänotypen von P. aeruginosa, bis
1999 die small colony variants (SCVs) mit chronischen Infektionen von CF-Patienten
in Verbindung gebracht werden konnten. Diese werden in der Routine-Diagnostik
aufgrund ihrer geringen Größe leicht übersehen. Sie korrelieren aber mit einer
besonders schlechten Lungenfunktion der CF-Patienten und erhöhter antibiotischen
Resistenz. Ihre Rolle im Rahmen der Pathogenese der chronischen Infektion ist
jedoch unklar. Deren Aufklärung könnte Einfluss auf neuartige Therapien zur
Bekämpfung chronischer Infektionen mit P. aeruginosa haben. In vorangegangenen
Studien konnte bei einem repräsentativen Vertreter einer autoaggregativen
Subgruppe von SCVs festgestellt werden, dass sowohl auf Transkriptomebene als
auch auf Proteomebene die SCV im Gegensatz zum klonalen Wildtyp (WT) Gene,
bzw. Proteine des Typ III Sekretionssystems um ein Vielfaches hochreguliert hatte.
In der vorliegenden Arbeit sollte die Funktionalität dieser erhöhten Expression
von Typ III Sekretion charakterisiert werden. Dazu wurde ein Zellkultur-Modell zur
Messung Typ III-bedingter Zytotoxizität und ein akutes Pneumonie-Mausmodell
verwendet. Des Weiteren sollte versucht werden, mit Hilfe des Nematoden C.
elegans ein Modell zu etablieren, in dem es möglich ist, Typ III-bedingte Virulenz zu
detektieren. Durch Komplementation der SCVs mit dem Gen pvrR sollte dessen
Bedeutung für den SCV-Phänotyp charakterisiert werden.
Bei Zytotoxizitäts-Versuchen mit 15 klinischen Isolaten von SCVs und klonalen
WT wurde festgestellt, dass vier SCVs gegenüber ihrem WT deutlich zytotoxischer
waren. Alle vier SCVs gehörten in die Subgruppe von sieben autoaggregativen
Zusammenfassung 134
SCVs. Acht nicht-autoaggregative SCVs zeigten keine Zytotoxizität. Damit ergab sich
eine signifikante Korrelation zwischen dem Phänotyp der autoaggregativen SCVs
und erhöhter, Typ III-bedingter Zytotoxizität.
In vivo Versuche mit BALB/c-Mäusen ergaben, dass die erhöhte Zytotoxizität
der SCVs mit einer erhöhten Mortalität korrelierte, wobei auch hier die Typ III
Sekretion als wichtiger Pathomechanismus eine Rolle spielte. Erhöhte Virulenz
korrelierte zudem mit erhöhten Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz.
Histopathologische Untersuchungen ergaben unterschiedliche Lokalisationen der
Infektion in der Lunge nach Infektion mit SCVs, bzw. den klonalen WT. Durch den
Einsatz einer Mutante mit einem Knock-out im Regulator-Gen exsA der Typ III
Sekretion konnten Typ III Sekretion-spezifische Veränderungen festgestellt werden.
Die Etablierung eines neuen C. elegans-Modells brachte die Möglichkeit,
erstmals Typ III Sekretion-vermittelte Virulenz unter diesen Bedingungen
nachzuweisen und es wurde damit ein neues Screening-Modell geschaffen, mit dem
es möglich ist, unterschiedlichste Virulenzmechanismen von P. aeruginosa zu
detektieren. Die unter Standard-Bedingungen avirulenten SCVs zeigten in diesem
neuen Modell ebenfalls Virulenz, die zu einem Teil auch auf der erhöhten Typ III
Sekretion beruhte.
Versuche, der Ursache des SCV-Phänotyps auf den Grund zu gehen, wurden
mit Komplementation durch pvrR durchgeführt. Überexpression dieses Zwei-
Komponenten-Regulators führte bei allen verwendeten SCVs zu einer teilweisen
Wiederherstellung des WT-Phänotyps. Einige SCV-Eigenschaften, wie die erhöhte
Zytotoxizität, blieben jedoch erhalten, was dafür spricht, dass die Entstehung des
SCV-Phänotyps auf mikroevolutionären Prozessen in der stark selektiv wirkenden
CF-Lunge beruht, die über mehrere Schritte ablaufen.
Die hier beschriebenen SCVs zeigen deutlich, dass die bisher angenommene
verminderte Virulenz von P. aeruginosa in chronisch infizierten CF-Lungen nicht für
alle Morphotypen gilt. Letztendlich könnte das Wissen um die Existenz und die
teilweise hohe Virulenz – nicht zuletzt durch stark erhöhte Typ III Sekretion bedingt –
von SCVs die Entwicklung neuer Therapieansätze gegen chronisch infizierende P.
aeruginosa vorantreiben.
Zusammenfassung 135
Summary
Doris Jordan (2004): Characterization of cytotoxic Pseudomonas aeruginosa ‘small colony variants’ isolated from the respiratory tract of patients with cystic fibrosis
Chronic respiratory infections with P. aeruginosa are the main complications
in the pathogenesis of cystic fibrosis (CF). Clinical isolates of P. aeruginosa form
various morphotypes when grown on diagnostic solid media. For a long time there
was a focus on mucoide phenotypes, until in 1999 small colony variants (SCVs) were
associated with chronic infections of CF patients. Based on their slow growth these
morphotypes are easily ignored in routine diagnostics, but they can be correlated
with poor lung functions in the CF patients and enhanced antibiotic resistance. The
role of the P. aeruginosa SCVs in the pathogenesis of chronic infections remains
unclear. Detailed analyses may have influence on new therapeutic approaches
against chronic P. aeruginosa infections. In previous studies with one representative
strain of an autoaggregative subgroup of SCVs showed, that with both, transcriptome
and proteome analysis, the SCV showed an upregulation of genes or proteins of the
type III secretion system in comparison to the clonal wildtype (WT).
The objective of this study was to characterize the functionality of this
upregulation of type III secretion. Therefore, a cell culture model to detect type III-
mediated cytotoxicity and a mouse model of acute pneumonia were used.
Furthermore, one objective was to establish a model to detect type III-mediated
virulence by using the nematode C. elegans. By complementation of the SCVs with
the gene pvrR the function of this gene in the SCV phenotype was characterized.
In cytotoxicity experiments with 15 clinical isolates (SCVs and clonal WT) it
was found, that four SCVs showed increased cytotoxicity in comparison to their
clonal WT. All four SCVs belonged to the subgroup of seven autoaggregative SCVs.
Eight non-autoaggregative SCVs showed no cytotoxicity. So there was a significant
correlation between the phenotype of autoaggregative SCVs and increased
cytotoxicity.
Zusammenfassung 136
In vivo experiments with BALB/c mice showed, that increased cytotoxicity of
SCVs could be correlated with increased mortality of mice in an acute model of
pneumonia. In this model type III secretion was an important pathomechanism.
Increased virulence also correlated with increased bacterial numbers in lung, liver
and spleen. Hisopathological examinations showed that the localization of infection
was different after infection with SCVs or wildtypes. By using a knock out mutant of
the type III secretion regulator exsA type III secretion-dependent alterations could be
found.
In the C. elegans model established it was possible to detect type III
secretion-mediated virulence for the first time in this system. On the other hand a
new screening model was created to detect various virulence factors. Thus, the
SCVs, which were avirulent under standard assay conditions, also showed virulence
in this new model. One part of this virulence was mediated by the increased type III
secretion.
Experiments to find out the development of the SCV phenotype were done by
complementation of SCVs with pvrR as already described for other SCVs.
Overexpression of this two-component-regulator led to a partial restoration of the
wildtype phenotype in all SCVs that were used. But some SCV features, for example
the increased cytotoxicity, still remained. Thus, the development of the SCV
phenotype is likely to be based on microevolutionar processes in the CF lung that
includes several steps.
The SCVs used in this study showed, that the previous assumption of reduced
virulence of P. aeruginosa in chronic infections in the CF lung does not apply to all
morphotypes. Furthermore the knowledge of the existence and the partially
increased virulence – in part dependent on increased type III secretion – of SCVs
may further the development of new therapies against P. aeruginosa in chronic
infected patients.
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Anhang 168
8. Anhang
8.1. Tabellen- und Abbildungsverzeichnis
SeiteTab. 1 Verwendete Isolate von P. aeruginosa SCVs und WT 34/35Tab. 2 P. aeruginosa TB und Transposon-Mutanten 36Tab. 3 P. aeruginosa -Stämme aus Frankreich 37Tab. 4 Vergleich des Twitching-Vermögens von WT, SCV und
SCVpED202 73Tab. 5 Vergleich der Autoaggregation von WT, SCV und SCVpED202 74Tab. 6 Vergleich des Slow- und Fastkillings von C. elegans durch
Mutanten von P. aeruginosa CHA 98Tab. 7 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch hitzeinaktivierte
Bakterien von CHA und Mutanten 101Tab. 8 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch Kulturüberstände
von CHA und Mutanten 101Tab. 9 Genort und Funktion der mutierten Gene von Transposon-
Mutanten von P. aeruginosa TB 104Tab. 10 Vergleich von TB-Mutanten im Slow- und Fastkilling 106Tab. 11 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch hitzeinaktivierte
Bakterien von TB und ausgewählten Transposon-Mutanten 108Tab. 12 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch Kulturüberstände
von TB und ausgewählten Transposon-Mutanten 108
Anhang 169
SeiteAbb. 1 Schematische Darstellung des Typ III Sekretionssystems gram-
negativer Bakterien 19Abb. 2 Morphotypen WT und SCV von P. aeruginosa 20265 auf
Columbia-Blutagar nach 48 h Inkubation bei 37 °C 26Abb. 3 Der Nematode C. elegans 29Abb. 4 Prinzip der Substratumsetzung im Zytotoxizitäts-Assay 45Abb. 5 Beispielhafte Darstellung der Auswertung des Zytotoxizitäts-
Assays 47Abb. 6
Vergleich der Zytotoxizität von WT und autoaggregativen SCVs
im Zytotoxizitäts-Assay mit J774.A1-Maktophagen (A – G) 58/59Abb. 7 Vergleich der Zytotoxizität von nicht autoaggregativen SCVs
und ihrem klonalen WT (A, B) 61Abb. 8 Silbernitrat-Färbung von SDS-Gelen mit SCVs und ihrem
jeweiligen klonalen WT (A, B) 63Abb. 9 Western Blot mit spezifischen Antikörpern gegen ExoS und
PcrV (A, B) 65Abb. 10 Nachweis von pvrR in den P. aeruginosa-Isolaten 20265, 52,
8226 und 231
66
Abb. 11 Nachweis des Plasmids pED202 (A, B) 68Abb. 12 Nachweis des pvrR-Gens in 52 SCVpED202 68Abb. 13 Vergleichende Darstellung der Koloniemorphologie von WT,
SCV und SCVpED202 70Abb. 14 Vergleichende Darstellung des Schwimmverhaltens von WT,
SCV und SCVpED202 72Abb. 15 Vergleich der Zytotoxizität von WT, SCV und SCVpED202 im
Zytotoxizitäts-Assay mit J774.A1-Makrophagen (A – D) 75Abb. 16 Vergleich der Mortalität von WT und SCV von 20265, 52, 8226
und 231 (A – D) 78Abb. 17 Vergleich der Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz von mit WT,
SCV oder SCVexsA infizierten BALB/c-Mäusen (A, B) 80
Anhang 170
SeiteAbb. 18 Vergleich der histopathologischen Veränderungen in der Lunge
nach Infektion mit 20265 WT, SCV oder SCVexsA; x200 (A–C) 82Abb. 19 Vergleich der histopathologischen Veränderungen in der Lunge
nach Infektion mit 20265 WT, SCV oder SCVexsA; x630 (A–C) 83Abb. 20 Vergleich der histopathologischen Veränderungen in der Lunge
nach Infektion mit 52 WT oder SCV (A – D) 84Abb. 21 Bakterienansammlungen in den Alveolen von SCV-infizierten
Tieren (A, B) 85Abb. 22 Histopathologische Veränderungen im Nasopharynx infizierter
Mäuse (A – C) 86Abb. 23 Vergleich der Abtötung durch WT und SCV in Calcium-
depletiertem VB-Medium (A – C) 89Abb. 24 Vergleich der Abtötung durch WT und SCV in normalem VB-
Medium (A – C) 90Abb. 25 Vergleich der Abtötung durch Typ III-defiziente Mutanten und
die entsprechenden WT in Calcium-depletiertem VB-Medium (A
– C) 92Abb. 26 Vergleich der Abtötung durch Typ III-defiziente Mutanten und
die entsprechenden WT in normalem VB-Medium (A – C) 93Abb. 27 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch PA 34 WT und
eine ExoU-defiziente Mutante (A – D)
94/95
Abb. 28 Vergleich der Virulenz von PA 34 und einer ExoU-defizienten
Mutante im BALB/c-Mausmodell 96Abb. 29 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch P. aeruginosa
CHA unter Standard-Slow- und Fastkilling-Bedingungen (A, B) 98Abb. 30 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch CHA und
ausgewählten Mutanten unter Flüssigkultur-Bedingungen 100Abb. 31 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch PA 14 in
Flüssigkultur unter verschiedenen Bedingungen (A, B)
102
Anhang 171
SeiteAbb. 32 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch PAO 1 in
Flüssigkultur unter verschiedenen Bedingungen (A, B) 103 Abb. 33 Abtötung von C. elegans durch TB WT im Slowkilling- und
Fastkilling-Assay (A, B) 105Abb. 34 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch TB und
ausgewählten Mutanten unter Flüssigkultur-Bedingungen 107
Anhang 172
8.2. Geräte
Brutschrank, Fa. Heraeus
Brutschrank, CO2-AUTO-ZERO, Fa. Heraeus
Blotkammer B34, Fa. Biometra
Easy Enhanced Analysis System ((Easy RH-3, Videokamera 429K), Fa. Herolab
Elektrophoresekammer für SDS-Gele, Fa. Biometra
Elektrophoresekammer für Agarose-Gele, Fa. Bio-Rad
ELISA Reader Titertek Multiskan MCC/340, Fa. Flow Laboratories GmbH
Fotomikroskop Axioskop MC80DX, Modell J2-21, Fa. Zeiss
Homogenisator (Ultra-Turrax T8), Fa. IKA Labortechnik
Nematodenschrank (Chromatographieschrank) 2023, Mini Cold Lab, Fa.
Pharmacia LKB
Phasenkontrastmikroskop, Fa. Zeiss
pH-Meter 761 Calimatic, Fa. Knick
Photometer Ultrospec III, Fa. Pharmacia LKB
Schüttelinkubator (Incubator Shaker Model G 25), New Brunswick Scientific Co.
Inc. NJ, USA
Schüttelinkubator (für die Nematoden) KS 130 basic, Fa. IKA Labortechnik
Schüttler Vari-Mix M487220-33, Fa. Thermolyne
Schüttler Rocky, Fa. LTF Labortechnik
SpeedVac Concentrator, Fa. Savant
Thermocycler (PCR), Fa. Landgraf
Tischzentrifuge, Fa. Bachofer
Tischzentrifuge Biofuge 13, Fa. Heraeus
Vortexer, Fa. Heidolph REAX 2000
Zentrifuge Minifuge GL, Fa. Heraeus
Zentrifuge Modell J2-21, Fa. Beckmann
Anhang 173
8.3. Gebrauchsmaterialien Artikel Firma Best. Nr.
Einmalskalpell, Nr. 15 Feather 0399
Einmalpipetten, 5 ml Sarstedt 86.1253.001
Einmalpipetten, 10 ml Sarstedt 86.1254.001
Falcontubes, 15 ml Greiner Cellstar 188261
Falcontubes, 50 ml Greiner Cellstar 227261
Gel-Blotting-Papier Schleicher&Schuell 10426972
Gene Pulser Cuvette BIO-RAD 165-2086
Impfschlingen Sarstedt 86.1562.050
Küvetten Sarstedt 67.742
Nitrozellulose Transfer- Schleicher&Schuell 401196
Membran (Porengröße 0,45µm)
Pipettenspitzen, gelb Sarstedt 70.760.002
Pipettenspitzen, blau Sarstedt 70.762
PS-Microplatte 96K Greiner Cellstar 650101
PS-Röhrchen, 4,5 ml Greiner Cellstar 120160
PS-Röhrchen, 14 ml Greiner Cellstar 191160
Reagiergefäße, 1,5 ml Sarstedt 72.690
Röntgenfilm, 18 x 24 cm amersham pharmacia biotech RPN 2103K
(HyperfilmTMECLTM)
TC-Plate, 24 well Greiner Cellstar 662160
Wurmplatten (Ø 5 cm) Greiner Cellstar 30625
Zellkulturflasche, 250 ml Greiner Cellstar 658170
Zellschaber, 30 cm TPP 99003
Anhang 174
8.4. Medien und Zusätze
NGM (Nematode Growth Medium)-Agar 1,5 g NaCl, 8,5 g Agar (Bitek) und 1,25 g Pepton werden in 500 ml Aqua dest. gelöst
und nach Zugabe von Nystatin (5 mg/100 ml) und den unten beschriebenen
Zusätzen* sterilfiltriert.
Agar für den Slowkilling-Assay 1,5 g NaCl, 8,5 g Agar (Bitek) und 1,75 g Pepton werden in 500 ml Aqua dest. gelöst
und nach Zugabe von Nystatin (5 mg/100 ml) und den unten beschriebenen
Zusätzen* sterilfiltriert.
PGS (Pepton Glukose Sorbitol)-Agar für den Fastkilling-Assay 5 g Bactopepton, 5 g NaCl und 8,5 g Bactoagar werden in 500 ml Aqua dest. gelöst
und nach Zugabe von 5 g Glukose, 13,67 g Sorbitol, Nystatin (5 mg/100 ml) und den
unten beschriebenen Zusätzen* sterilfiltriert.
Zusätze für die oben mit * bezeichneten Nährmedien Jeweils 0,5 ml 1 M CaCl2, 0,5 ml Uracil (2 mg/ml), 0,25 ml Cholesterol in Ethanol (10
mg/ml), 12,5 ml 1 M KPO4-Puffer (pH 6,0) und 0,5 ml 1 M MgSO4 werden zu 500 ml
Agaransatz hinzugegeben.
Müller-Hinton-Agar (Difco) 2 g Rindfleischextrakt, 17,5 g Caseinhydrolysat, 1,5 g Stärke und 17 g Agar werden
in 1000 ml Aqua dest. gelöst und autoklaviert.
LB-Medium (Difco) 20 g LB-Broth-Base werden in 1000 ml Aqua dest. gelöst und autoklaviert
Anhang 175
LB-Agar (Difco) 10 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl und 15 g Bactoagar werden in 1000 ml
Aqua dest. gelöst und autoklaviert.
Modifiziertes VB-Medium 3,3 mM MgSO4
11,3 mM Citrat
27,8 mM NaNH4HPO4
37,4 mM K2HPO4
0,2 M Kaliumglukonat
wird mit 1 N NaOH auf pH 7,2 eingestellt und sterilfiltriert.
Ca-depletiertes VB-Medium s.o.
zusätzlich werden zugegeben:
5 mM EGTA
20 mM MgCl2
Swimming-Agar Bitek-Agar 0,3 %: 0,75 g / 250 ml LB
Twitching-Agar Bitek-Agar 1,0 %: 2,5 g / 250 ml LB
Anhang 176
8.5. Puffer und Lösungen
M9-Puffer 21,7 mM KH2PO4
42,3 mM Na2HPO4
86,2 mM NaCl
1 mM MgSO4
5 M NaOH-Lösung 200g NaOH werden in 1000 ml Aqua dest. gelöst und sterilfiltriert.
Puffer A, pH 6, 1 M (zur Herstellung der Zusätze zu Wurmplatten)
1 M K2HPO4 (~ pH 9)
1 M KH2PO4 (~ pH 4)
werden gemischt bis pH = 6 erreicht ist.
Elektrophoresepuffer für SDS-Page Stammlösung (5-fach konzentriert):
60,5 g Tris, 285,3 g Glycin und 100 ml 10%ige SDS-Lösung werden mit Aqua bidest.
auf 2000 ml aufgefüllt.
Gebrauchslösung:
Die Stammlösung wird 1:5 mit Aqua bidest. verdünnt.
(Endkonzentration 25 mM Tris, 190 mM Glycin, 0,1 % SDS)
Blotpuffer für Western Blot Stammlösung (10-fach konzentriert):
58,2 g Tris und 29,3 g Glycin werden mit Aqua bidest. auf 1000 ml aufgefüllt.
Anhang 177
Gebrauchslösung:
Die Stammlösung wird 1:10 mit Aqua bidest. verdünnt und autoklaviert.
(Endkonzentration 48 mM Tris, 39 mM Glycin)
TBS-T Puffer (für die Chemolumineszenz-Entwicklung von Western Blots)
6,05 g Tris, 8,76 g NaCl und 500 µl Tween 20 werden mit Aqua bidest. auf 1000 ml
aufgefüllt (Endkonzentration 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl)
Silbernitrat-Färbelösungen Fixierer: 30 ml 100% Ethanol und 10 ml 100% Essigsäure werden mit Aqua bidest.
auf 100 ml aufgefüllt (Endkonzentration: 30% Ethanol, 10% Essigsäure)
Lösung II: 30 ml 100% Ethanol, 50 ml 1 M Na-Acetat, 2 ml 25% Glutaraldehyd und 2
ml 10% Na-Thiosulfat werden mit Aqua bidest. auf 100 ml aufgefüllt
(Endkonzentration: 30% Ethanol, 0,5 M Na-Acetat, 0,5% Glutaraldehyd, 0,2%
Thiosulfat)
Silbernitratlösung (Lösung III): 0,1% Silbernitratlösung werden mit 0,01%
Formaldehyd versetzt
Lösung IV: 12,5 ml 20% Na-Carbonat (Endkonzentration 2,5%) werden mit 0,01%
Formaldehyd versetzt
Lösung V: 0,05 M EDTA-Lösung
TBE-Puffer Stammlösung (10-fach konzentriert):
216 g Tris, 110 g Borsäure (H3BO3) und 80 ml einer 0,5 M EDTA-Lösung (pH 8,0)
werden mit Aqua bidest. auf 2000 ml aufgefüllt.
Gebrauchslösung:
Die Stammlösung wird 1:10 mit Aqua bidest. verdünnt
(Endkonzentration 89 mM Tris, 89 mM H3BO3, 2 mM EDTA)
Anhang 178
8.6. Chemikalien
Substanz Firma Best.Nr.___
Acrylamid-Lösung, 30% AppliChem A 1672.0250
Agarose BioWhittaker Molekular 840.004
Applications
Bacto-Agar Difco 0140-01
Bitek-Agar Difco 0138-17
1-Butanol AppliChem A 3066.0100
Calciumchlorid Sigma C-3881
Carbenicillin Serva 15875
Cholesterol ICN Biomedicals 101381
Citrat Sigma C-1909
Cytotoxicity Detection Kit Roche Biochemicals
DMEM Biochrom AG FG 0435
Dneasy Tissue Kit Qiagen 69504
EDTA Merck 1.08421.1000
EGTA Sigma E-8145
Essigsäure Merck 100058
Ethanol J.T.Baker 8006
Formaldehyd Sigma F-1635
Gentamicin Sigma G-1397
D-(+)Glucose Sigma 50-99-7
Glutaraldehyd Sigma G-6257
Glycerin Merck 1.04093.1000
Kaliumdihydrogenphosphat Merck 1.04873.1000
Kaliumglukonat Sigma G-4500
Di-Kaliumhydrogenphosphat Merck 1.05099.10000
LB-Broth-Base Difco 12780-052
LB-Agar Difco 240110
Lumi-Light Western Blotting Substrat Roche Biochemicals
Anhang 179
Magermilch Merck 1.15363.0500
Magnesiumchlorid Sigma M-4880
Magnesiumsulfat Sigma M-9397
Mini-Plasmidpräparation Kit Machery-Nagel
(NucleoSpin® Plasmid)
Müller-Hinton-Agar Difco 225220
Natriumacetat Merck 1.06265.1000
Natriumammoniumhydrogenphosphat Fluka 71284
Natriumcarbonat Merck 1.6392.0500
Natriumchlorid Merck 106.404.5000
Di-Natriumhydrogenphosphat Merck 1.06580.1000
Natriumhydroxid Merck 1.06498.1000
Natriumhypochlorid, 10-13 % Aldrich/Sigma 42.504-4
Natriumthiosulfat Merck 1.06516.0500
Nystatin Calbiochem 475914
Pepton Merck 1.07214.2500
Proteinstandard Gibco BRL 10748-010
D-Sorbitol Sigma S-1876
SDS Merck 8.22050.1000
Silbernitrat Roth 1493
Temed AppliChem A 1148.0100
Tergitol Fluka 86452
Tetracyclin Sigma T-3383
Tris Serva 37180
Tryptan-Blau-Lösung 0,4% Sigma T-8154
Trypton Difco 0123-15
Uracil Fluka 94220
Anhang 180
8.7. Software
Zur Anfertigung dieser Dissertation wurden die Programme Microsoft Office,
SigmaPlot 2001, SigmaStat 2.0, SPSS 7.0 und Adobe PhotoShop 7.0 verwendet.
Anhang 181
Danksagungen
Mein besonderer Dank gilt Herrn PD Dr. Ivo Steinmetz für die Überlassung des Themas, die
kontinuierliche Betreuung und die vielen anregenden Diskussionen, die diese Arbeit begleitet
haben.
Herrn Prof. Dr. Gerald-Friedrich Gerlach möchte ich herzlich dafür danken, dass er sich
bereit erklärt hat, die Betreuung dieser Dissertation von Seiten der Tierärztlichen Hochschule
zu übernehmen.
Diese Arbeit wurde am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der
Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt. Darum möchte ich auch den Leitern
dieses Instituts, ehemals Herr Prof. Dr. D. Bitter-Suermann und jetzt Herr Prof. Dr. S.
Suerbaum, dafür danken, dass ich meine Arbeit in diesem Umfeld durchführen durfte.
Herrn Prof. Dr. Dr. B. Tümmler möchte ich dafür danken, dass er mich im Europäischen
Graduiertenkolleg „Pseudomonas: Pathogenicity and Biotechnology“ aufgenommen hat und
ich so die Möglichkeit erhalten habe, internationale Erfahrungen im Bereich der
Pseudomonas-Forschung zu machen.
Mein Dank gilt der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die Finanzierung der
Arbeit.
Dem Caenorhabditis Genetics Center, University of Minnesota, St. Paul, MN, USA sei
gedankt für die Überlassung von C. elegans; besonderer Dank gilt in diesem
Zusammenhang Theresa Stiernagle für die prompte und problemlose Zusendung der
bestellten Nematodenstämme.
Ohne meine Arbeitsgruppe wäre ich hoffnungslos verloren gewesen. Deshalb gilt ein ganz
besonderes Dankeschön Birgit Brenneke und Jessika Garlisch für die vielen Tipps und das
offene Ohr, wenn ich kurz vor dem Verzweifeln war. Außerdem möchte ich Torsten Jäger,
Sonja Klocke, Meike Diedrich, Sabine Pilatz, Franz von Götz, Holger Bruns, Nadine Hein und
André Strüßmann für die lustige Gemeinschaft im manchmal sehr anstrengenden Laboralltag
danken. André gilt außerdem ganz besonderer Dank für seinen Einsatz bei
Anhang 182
Formatierungsproblemen und beim Korrekturlesen dieser Arbeit. Außerdem ein herzliches
Dankeschön an alle für die vielen schönen gemeinsamen Abende.
Dr. Ina Attree und Dr. Lutz Wiehlmann möchte ich für die Überlassung der von mir
eingesetzten P. aeruginosa -Mutanten danken.
Ein weiteres Dankeschön gilt Herrn Prof. Dr. K. Kamino und Herrn Arndt aus dem Institut für
Pathologie der MHH für die Unterstützung bei der histopathologischen Bearbeitung und
Diagnostik der Mausexperimente.
Nicht zuletzt gilt mein Dank meinem Bruder Harald, seiner Frau Birgit, ihren Kindern und
dem tierischen Anhang dafür, dass sie mir für die Zeit meines Schreibens ein Zuhause
geboten haben und ich neben aller Konzentration sehr viel Spaß in der Heide hatte.
Anhang 183
Veröffentlichung von Teilergebnissen
v. Götz, F., Häußler, S., Jordan, D., Saravanamuthu, S., Wehmhöner, D., Lauber, J.,
Attree, I., Buer, J., Tümmler, B. and Steinmetz, I.
Expression analysis of a cytotoxic and biofilm forming small colony variant of
Pseudomonas aeruginosa isolated form a cystic fibrosis lung
J. Bacteriol., in press
Juhas, M., Wiehlmann, L., Huber, B., Jordan, D., Lauber, J., Salunkhe, P., Limpert,
A. S., v. Götz, F., Steinmetz, I., Eberl, L. and Tümmler, B. (2004)
Global regulation of quorum sensing and virulence by VqsR in Pseudomonas
aeruginosa
Microbiology 150: 831-841
Jordan, D., Strüßmann, A., Wiehlmann, L., Ziegler, I., Tümmler, B., Attree, I. and
Steinmetz, I.
working title: Characterization of Pseudomonas aeruginosa virulence using a new
liquid medium based Caenorhabditis elegans fast killing model
Poster: Jordan, D., v. Götz, F., Häußler, S., Tümmler, B., Attree, I. and Steinmetz, I.
Characterization of cytotoxic Pseudomonas aeruginosa ‘small colony variants’
(SCVs) isolated from the respiratory tract of cystic fibrosis patients.
Pseudomonas International Meeting 2003, Québec City, Québec, Canada
Anhang 184
Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung
ADP Adenosin-Diphosphat
AG Arbeitsgruppe
AHL N-Acyl-Homoserin-Lacton
Aqua dest. Aqua destillata
Aqua bidest. Aqua bidestillata
Bp Basenpaare
C. Caenorhabditis
°C Grad Celsius
Ca Calcium
CF Cystische Fibrose
CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator
CFU Colony Forming Unit
CGC Caenorhabditis Genetics Center
depl. depletiert
DNA Desoxyribonucleinsäure
DMSO Dimethylsulfoxid
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGTA Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraessigsäure
Fa. Firma
g mittlere Erdbeschleunigung 9,81 m/s2
h Stunde(n)
HSL Homoserin Lacton
kb Kilobasen
L Larve
LB Luria-Bertani
LDH Laktat-Dehydrogenase
M Molar
min Minute(n)
Anhang 185
MHH Medizinische Hochschule Hannover
NGM Nematode Growth Medium
OD Optische Dichte
P. Pseudomonas
PA Pseudomonas aeruginosa
PBS Phosphat-gepufferte NaCl-Lösung
PGS Pepton Glucose Sorbitol
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
s Sekunde
SCV Small Colony Variant
SDS-Page Sodiumdodecylsulfate Polyacrylamid-Gelelektrophorese
spp. Spezies
syn. synonym
Tab. Tabelle
ÜN Über Nacht
WT Wildtyp
VB Vogel-Bonner
Anhang 186
Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation "Charakterisierung von zytotoxischen
Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert aus dem Respirationstrakt von
Patienten mit Cystischer Fibrose" selbständig verfasst habe.
Bei der Anfertigung wurden keine Hilfen Dritter in Anspruch genommen.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir
unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für die Arbeiten erhalten, die im
Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene
der Medizinischen Hochschule Hannover durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für
Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover angefertigt.
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen
Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der
Wahrheit entsprechend gemacht habe.
.........................................................
Doris Jordan
Hassel, den