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Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover Charakterisierung von zytotoxischen Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert aus dem Respirationstrakt von Patienten mit Cystischer Fibrose INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von Doris Jordan aus Mühlacker Hannover 2004

Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

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Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene

der Medizinischen Hochschule Hannover

Charakterisierung von zytotoxischen

Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert aus dem Respirationstrakt

von Patienten mit Cystischer Fibrose

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von

Doris Jordan aus Mühlacker

Hannover 2004

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Wissenschaftliche Betreuung an der Tierärztlichen Hochschule:

Univ.-Prof. Dr. Gerald-Friedrich Gerlach

Wissenschaftliche Betreuung an der Medizinischen Hochschule:

Priv.-Doz. Dr. Ivo Steinmetz

1. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. Gerald-Friedrich Gerlach

2. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. Stefan Schwarz

Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2004

Gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)

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In Erinnerung an meine Eltern

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INHALTSVERZEICHNIS 1. Einleitung ..........................................................................................11 2. Schriftum...........................................................................................13

2.1. Taxonomie und allgemeine Eigenschaften von P. aeruginosa ................ 13

2.2. Pathogenität und Virulenzmechanismen von P. aeruginosa ................... 15

2.3. Verbreitung von P. aeruginosa bei Tieren ................................................. 20

2.4. P. aeruginosa und CF .................................................................................. 21

2.4.1. Allgemeines............................................................................................. 21

2.4.2. Phänotypische Variationen von P. aeruginosa bei CF............................. 24

2.5. Der Nematode C. elegans als Infektionsmodell ........................................ 29

2.6. Zielsetzung der Arbeit ................................................................................. 33

3. Material und Methoden ....................................................................34

3.1. Bakterien....................................................................................................... 34

3.1.1. Bakterienstämme..................................................................................... 34

3.1.2. Kulturbedingungen .................................................................................. 38

3.1.3. Bestimmung der Keimzahl....................................................................... 38

3.1.4. Kulturkonservierung................................................................................. 38

3.1.5. Charakterisierung der Motilität................................................................. 39

3.1.5.1. Motilitätstest auf Swimming-Agar...................................................... 39

3.1.5.2. Motilitätstest auf Twitching-Agar ....................................................... 39

3.1.6. Methoden zur Bestimmung von Typ III Sekretionssysten-Proteinen im

Überstand von Bakteriensuspensionen ................................................... 39

3.1.6.1. Vorbereitung der Proben................................................................... 40

3.1.6.2. SDS-Page......................................................................................... 40

3.1.6.3. Silbernitrat-Färbung .......................................................................... 41

3.1.6.4. Western Blot ..................................................................................... 41

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3.2. Zellkultur....................................................................................................... 43

3.2.1. Zelllinie .................................................................................................... 43

3.2.2. Anzucht der Zellen................................................................................... 43

3.2.3. Einfrieren und Auftauen der Zellen .......................................................... 43

3.2.4. Lösen der Zellen...................................................................................... 44

3.2.5. Ermittlung der Zellzahl............................................................................. 44

3.2.6. Zytotoxizitäts-Assay................................................................................. 45

3.2.6.1. Versuchsprinzip ................................................................................ 45

3.2.6.2. Durchführung des Assays................................................................. 46

3.3. Mausmodell .................................................................................................. 48

3.3.1. Versuchstiere........................................................................................... 48

3.3.2. Infektion der Mäuse ................................................................................. 48

3.3.3. Verlaufsuntersuchungen der Infektion ..................................................... 48

3.3.4. Keimzahlbestimmung in Organen infizierter Mäuse ................................ 48

3.3.5. Histopathologische Diagnostik an Lunge und Nasopharynx infizierter

Tiere ........................................................................................................ 49

3.4. Arbeiten mit Caenorhabditis elegans......................................................... 50

3.4.1. Versuchstiere........................................................................................... 50

3.4.2. Kulturerhaltung ........................................................................................ 50

3.4.3. Herstellung der bakteriellen Nahrungsquelle........................................... 50

3.4.3.1. Futterplatten...................................................................................... 50

3.4.3.2. Pellets für Eipräparation.................................................................... 51

3.4.4. Eipräparation ........................................................................................... 51

3.4.5. Infektionsmodelle..................................................................................... 52

3.4.5.1. Slowkilling ......................................................................................... 52

3.4.5.2. Fastkilling .......................................................................................... 53

3.4.5.3. Killing in Flüssigkultur ....................................................................... 53

3.5. Molekularbiologische Arbeiten ................................................................... 54

3.5.1. Materialien............................................................................................... 54

3.5.2. Molekularbiologische Methoden .............................................................. 54

3.5.2.1. Übertragung von DNA durch Elektroporation.................................... 54

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3.5.2.2. Mini-Plasmidpräparation ................................................................... 55

3.5.2.3. Präparation genomische DNA........................................................... 55

3.5.2.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR).................................................... 56

3.5.2.5. Agarose-Gelelektrophorese .............................................................. 57

4. Ergebnisse ........................................................................................58

4.1. Charakterisierung von P. aeruginosa small colony variants (SCVs) und dem jeweiligen klonalen Wildtyp (WT) im Zytotoxizitäts-Assay mit J774.A1-Makrophagen ................................................................................. 58

4.1.1. Vergleich der Zytotoxizität der autoaggregativen SCVs mit ihrem

klonalen WT ............................................................................................ 58

4.1.2. Vergleich der Zytotoxizität nicht-autoaggregativer SCVs mit ihrem

klonalen WT ............................................................................................ 60

4.2. Nachweis von Typ III-Sekretionssystem-Proteinen im Kulturüberstand von P. aeruginosa SCVs .............................................................................. 62

4.2.1. SDS-Gele mit anschließender Silbernitrat-Färbung................................. 62

4.2.2. SDS-Gele mit anschließendem Western Blot .......................................... 64

4.3. Überexpression des pvrR-Gens in P. aeruginosa SCVs........................... 66

4.3.1. Nachweis des pvrR-Gens nach Übertragung mittels Elektroporation in

den SCVs ................................................................................................ 66

4.3.2. Mikrobiologische Charakterisierung im Vergleich zu SCV und WT ......... 69

4.3.2.1. Koloniemorphologie .......................................................................... 69

4.3.2.2. Swimming motility ............................................................................. 71

4.3.2.3. Twitching motility und Autoaggregation ............................................ 73

4.3.3. Verhalten im Zytotoxizitäts-Assay im Vergleich zu SCV und WT ........... 74

4.4. Virulenzanalyse von zytotoxischen P. aeruginosa SCVs und den klonalen WT im BALB/c-Mausmodell nach intranasaler Infektion........... 77

4.4.1. Untersuchungen zur Morbidität und Mortalität ......................................... 77

4.4.2. Vergleich der Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz................................ 79

4.4.3. Vergleich der histopathologischen Veränderungen in Lunge und

Nasopharynx ........................................................................................... 81

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4.5. Etablierung eines neuen C. elegans Pathogenitäts-Modells.................... 88

4.5.1. Vergleich der Abtötung von C. elegans durch SCV und WT ................... 88

4.5.2. Einfluss von exsA auf die Abtötung ......................................................... 91

4.5.3. Einfluss von ExoU auf die Abtötung ........................................................ 94

4.5.4. Abtötung von C. elegans durch P. aeruginosa CHA und ausgewählte

Mutanten ................................................................................................. 97

4.5.5. Abtötung von C. elegans durch PA 14 und PAO 1 ................................ 102

4.5.6. Vergleich der Abtötung von C. elegans durch P. aeruginosa TB und

ausgewählte Mutanten von TB .............................................................. 104

5. Diskussion ......................................................................................110

5.1. Autoaggregatives Verhalten von SCVs korreliert mit erhöhter Zytotoxizität durch erhöhte Typ III Sekretion .......................................... 110

5.2. Erhöhte Zytotoxizität von autoaggregativen SCVs korreliert mit erhöhter in vivo Pathogenität ................................................................... 114

5.3. Die Überexpression des pvrR-Gens führt zu einer teilweisen Wiederherstellung des WT-Phänotyps..................................................... 117

5.4. Eignung des neuen C. elegans-Modells als Tiermodell zum Screening bakterieller Mutanten ................................................................................. 120

5.5. Eignung des neuen C. elegans-Modells als Pathogenitätsmodell zur Messung von Typ III Sekretionssystem-vermittelter Virulenz................ 129

6. Zusammenfassung / Summary .....................................................133

7. Literaturverzeichnis .......................................................................137

8. Anhang............................................................................................168

8.1. Tabellen- und Abbildungsverzeichnis...................................................... 168

8.2. Geräte.......................................................................................................... 172

8.3. Gebrauchsmaterialien ............................................................................... 173

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8.4. Medien und Zusätze................................................................................... 174

8.5. Puffer und Lösungen ................................................................................. 176

8.6. Chemikalien ................................................................................................ 178

8.7. Software...................................................................................................... 180

Danksagungen ....................................................................................................... 181

Veröffentlichung von Teilergebnissen..................................................................... 183

Abkürzungsverzeichnis........................................................................................... 184

Eidesstattliche Erklärung ........................................................................................ 186

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Einleitung 11

1. Einleitung

Die Cystische Fibrose (CF, syn. Mukoviszidose) ist eine auf einem Defekt im CFTR

(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)- Gen beruhende, autosomal-

rezessiv vererbte Erkrankung. Eine der Folgen dieser Erkrankung ist eine gestörte

mukoziliäre Clearance in der Lunge und teilweise Verlegung von Atemwegen durch

Bildung eines zähen Sekrets. Dieses Habitat schafft optimale Bedingungen für eine

Kolonisation und Infektion der Lunge mit opportunistischen Keimen wie Hämophilus

influenzae und Staphylococcus aureus in frühen Krankheitsstadien, sowie

Pseudomonas aeruginosa bei älteren Patienten mit chronischen Lungeninfektionen

(GOVAN u. DERETEC, 1996). P. aeruginosa stellt den Hauptgrund für Morbidität

und Mortalität bei älteren Mukoviszidosepatienten dar.

Unterschiedliche Virulenzfaktoren werden mit dem Versagen der Lungenfunktion bei

CF-Patienten in Verbindung gebracht. Bei P. aeruginosa wird die Fähigkeit zur

Bildung von Biofilmen diskutiert, da sich im Rahmen einer chronischen Infektion in

der CF-Lunge mukoide Phänotypen bilden, die entscheidend zur Biofilmbildung

beitragen (POSCHET et al., 2001). Eine besondere Bedeutung der sogenannten

SCVs (small colony variants), kleinwüchsigen Varianten von P. aeruginosa, wird

diskutiert (HÄUSSLER et al. ,1999a; DRENKARD u. AUSUBEL, 2002). Diesen SCVs

wird eine erhöhte Resistenz gegenüber antibiotisch wirksamen Substanzen

zugeschrieben. Ihre Bedeutung in der Pathogenese der CF-Lunge ist allerdings

bisher ungeklärt. HÄUSSLER et al. beschrieben 2003 eine Subgruppe von SCVs, die

befähigt war, im Vergleich zu den jeweiligen klonalen Wildtyp-Phänotypen (WT)

vermehrt Biofilm zu produzieren, sie wiesen vermehrt Pili auf und zeigten verstärktes

autoaggregatives Verhalten und größere Adhärenz an Oberflächen. Genexpressions-

Analysen eines Vertreters dieser Subgruppe durch VON GÖTZ (2003) ergaben, dass

die untersuchte SCV im Vergleich zum WT unter anderem eine Überexpression der

Gene zeigte, die für die Struktur und Funktion eines Typ III Proteinsekretionssystems

nötig sind. Diese Typ III Sekretion stellt einen bedeutenden Virulenzfaktor von P.

aeruginosa dar. Sie befähigt die Bakterien dazu, über eine Art Nadelstruktur oder

Pore Toxine direkt in die Wirtszelle zu schleusen.

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Einleitung 12

Im Rahmen dieser Studie sollte unter Verwendung eines Zellkultur-Modells zum

einen geklärt werden, ob diese verstärkte Expression der Typ III Gene eine

funktionelle Rolle spielt und zum anderen sollte untersucht werden, ob die erhöhte

Typ III Sekretion nur ein Phänomen dieses einzelnen Vertreters ist oder auch andere

SCVs ein ähnliches Expressions-Profil zeigen. Des Weiteren sollte mit einem

Mausmodell geklärt werden, in wie weit eine erhöhte Typ III Sekretion bei SCVs in

vivo eine Rolle spielt. Ein dritter Punkt dieser Studie war es, ein Caenorhabditis

elegans – Modell zu etablieren, mit dem es im Gegensatz zu den bestehenden

Modellen möglich ist, Typ III Sekretions-vermittelte Virulenz zu detektieren.

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Schriftum 13

2. Schriftum

2.1. Taxonomie und allgemeine Eigenschaften von P. aeruginosa

Die Gattung Pseudomonas wurde von MIGULA 1894 zum ersten Mal beschrieben

(MIGULA 1894). Als Pseudomonaden wurden lange Zeit alle stäbchenförmigen,

polar begeißelten und gramnegativen Bakterien zusammengefasst. Aufgrund dieser

unspezifischen morphologischen Merkmale galt die Gattung Pseudomonas lange

Zeit als Auffangbecken für unvollständig charakterisierte, bewegliche Bakterien

(STANIER et al., 1966). Die zunächst ausschließlich auf phänotypischen Merkmalen

beruhende Klassifizierung wurde später durch molekularbiologische

Untersuchungsmethoden ergänzt, wodurch eine Einteilung in fünf Gruppen erfolgte.

Dabei dienten die 16S rRNA-Gene als Markermoleküle für die phylogenetische

Zugehörigkeit. Alle fünf Gruppen werden den Proteobakterien zugeordnet; die

Mitglieder der RNA-Homologiegruppe I, neben P. aeruginosa z.B. auch

P. fluorescens, P. putida und P. syringae, werden als Pseudomonaden im engeren

Sinne bezeichnet und gehören zu den γ-Proteobakterien (ANZAI et al., 2000). Die

Pseudomonaden im weiteren Sinne aus den Gruppen II bis V wurden nach und nach

unterschiedlichen Gattungen zugeordnet. So beinhalten die RNA-Gruppen II und III

heute die Gattungen Acidovorax (WILLEMS et al. 1990, 1992) und Burkholderia

(YABUUCHI et al. 1992) und einige Arten der Gruppe IV gehören zur Gattung

Brevundimonas (SEGERS et al., 1994).

P. aeruginosa gehört durch seine Vielseitigkeit in der Substratverwertung und das

lange Überleben unter extrem nährstoffarmen Bedingungen zu den

anspruchslosesten Bakterien überhaupt und kommt ubiquitär in einer Vielzahl von

Boden- und Wasserhabitaten in der freien Natur und in der direkten Umgebung des

Menschen vor (SPIERS et al., 2000). P. aeruginosa ist aber auch in der Lage,

Menschen, Tiere und Pflanzen zu besiedeln. Unter anderem können Leitungswasser,

Waschbecken, Kosmetika und Lebensmittel mögliche Infektionsquellen darstellen.

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Schriftum 14

P. aeruginosa betreibt Energiegewinnung durch Oxidation organischer Substanzen

mit molekularem Sauerstoff als Elektronenakzeptor. Des Weiteren ist P. aeruginosa

in der Lage, Elektronen auf oxidierte Stickstoffverbindungen (NO2-, NO, N2O) oder

Arginin zu übertragen und so auch unter anaeroben Bedingungen zu wachsen

(STANIER et al., 1966). Insgesamt sind die Ansprüche an die Kulturbedingungen

äußerst gering, die Generationszeit beträgt bei einer idealen Temperatur von 37°C

ca. 20 min. Auch bei 42°C ist noch Wachstum möglich, jedoch nicht bei 4°C. Auf

festen Nährböden bildet P. aeruginosa charakteristische, flache, an den Rändern

leicht ausgefranste Kolonien. Neben der glatten, glänzenden S-Form kann auch die

trockene, granulierte R-Form auftreten. Bei manchen Stämmen zeigen sich

metallisch glänzende, eingesunkene Flecken, seltener kommen extrem schleimige

Varianten vor. Letzteres ist vor allem bei Isolaten aus Mukoviszidose-Lungen der

Fall. Das schleimige Aussehen entsteht durch Alginat, ein Polymer aus Mannuron-

und Guluronsäure, welches von den Bakterien zum Schutz vor äußeren Einflüssen

gebildet wird. P. aeruginosa ist sowohl Katalase- als auch Oxidase-positiv, der

typische, süßlich-aromatische, „lindenblütenartige“ Geruch wird durch o-

Aminoacetophenon verursacht. In flüssigen Nährmedien wächst der Keim

vorwiegend an der Oberfläche, wo er eine Kahmhaut bildet. Zwei Pigmente sind

charakteristisch für P. aeruginosa: das gelbgrüne, wasserlösliche Fluoreszein, auch

Pyoverdin genannt, das auch bei anderen Pseudomonaden vorkommt, und das

blaugrüne, chloroformlösliche Phenazinderivat Pyocyanin, welches ausschließlich

von P aeruginosa produziert wird. Manche Stämme bilden weitere Pigmente, wie

z.B. das rötliche Pyorubin oder das bräunliche Pyomelanin. Weiterhin verfügt P.

aeruginosa über Geißeln, Fimbrien und Pili, die ihm Motilität und Adhäsion

ermöglichen (HAHN, 1999).

Die hohe Anpassungsfähigkeit an wechselnde Umweltbedingungen sowie die

Vielseitigkeit in der Substratverwertung spiegeln sich in der Größe und

Zusammensetzung des Genoms wieder. P. aeruginosa PAO1 besitzt mit 6,3 Mb das

größte Genom sowie den mit ca. 9% höchsten Anteil an regulatorisch wirkenden

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Schriftum 15

Genen unter den bisher bekannten, vollständig sequenzierten Bakteriengenomen

(STOVER et al., 2000).

2.2. Pathogenität und Virulenzmechanismen von P. aeruginosa

P. aeruginosa gilt als opportunistischer Keim mit human-, tier- und

pflanzenpathogenem Potential und gehört zu den am zweithäufigsten

vorkommenden gram-negativen Verursachern nosokomialer Infektionen nach

Escherichia coli (SCHAAL u. v. GRAEVENITZ, 1994). Liegt keine lokale oder

systemische Schwächung des Immunsystems vor, verläuft eine Kolonisation des

Menschen mit P. aeruginosa meist harmlos (AEBI et al., 2001). Es kommt jedoch zu

einer folgenschweren Infektion, wenn Patienten kolonisiert werden, die an Cystischer

Fibrose (CF) erkrankt oder immunsupprimiert sind, größere Verbrennungen erlitten

haben oder sonstige Störungen der Haut- oder Schleimhautbarriere aufweisen. Als

so genannter „Nass- oder Pfützenkeim“ besiedelt P. aeruginosa im Krankenhaus

unter anderem Waschbecken, Luftbefeuchter, Schläuche von Beatmungs- und

Infusionsgeräten, Säuglingsinkubatoren, Desinfektionsmittel (quartenäre

Ammoniumverbindungen) und Blumenvasen. P. aeruginosa ist in Europa und

Nordamerika verantwortlich für 16 % der nosokomialen Pneumonien durch künstliche

Beatmung (WIBLIN, 1997), 12% der im Hospital erworbenen Harnwegsinfektionen

durch chirurgische Eingriffe am Urogenitaltrakt oder durch Dauerkatheter (POLLACK,

1995), 8 % der Wundinfektionen nach chirurgischen Eingriffen (KLUYTMANS, 1997)

und 10 % der Sepsisfälle (GORDON et al., 1998). Patienten, die durch eine

Knochenmarkstransplantation oder ein Krebsleiden mit Neutropenie extrem

immunkompromittiert sind, zeigen sich besonders anfällig gegenüber Infektionen mit

opportunistischen Erregern. In dieser Gruppe von Patienten sind Pneumonien und

Sepsisfälle nach Infektion mit P. aeruginosa für 30 % der Todesfälle verantwortlich

(FERGIE ei al., 1994). Auf Stationen mit Verbrennungsopfern können Ausbrüche von

Infektionen mit P. aeruginosa zu 60 % Letalität führen (RICHARD et al., 1994). Hier

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Schriftum 16

bietet nicht nur die lokale Zerstörung der Hautbarriere, sondern auch der begleitende

immunsuppressive Effekt einer Verbrennung dem Erreger ideale Bedingungen für

eine zunächst lokale und später systemische Ausbreitung (DERETIC, 2000).

P. aeruginosa produziert eine ganze Reihe von Virulenzfaktoren, die für die

Entstehung lokaler Gewebsläsionen, die Invasion und Verbreitung der Bakterien und

die Zerstörung verschiedener Bestandteile der Immunabwehr mit verantwortlich sind.

Zu nennen sind hier zwei Proteasen – Alkalische Protease und Elastase. Die

Beteiligung der Alkalischen Protease an Gewebsinvasion und systemischer Infektion

ist nicht geklärt, bei Infektionen der Kornea scheint sie jedoch eine zentrale Rolle zu

spielen (HOWE u. IGLEWSKI, 1984). Elastin ist ein wichtiger Bestandteil von

Lungengewebe und Blutgefäßen und bedingt in beiden Organen die Elastizität und

Widerstandsfähigkeit des Gewebes. Daher ist die Fähigkeit Elastin zu spalten ein

bedeutsamer Virulenzfaktor bei akuten Infektionen. Die beiden Elastasen LasA und

LasB wirken synergistisch (GALLOWAY, 1991), im Mausmodell wurde

nachgewiesen dass LasB-defiziente Mutanten deutlich weniger invasiv waren als der

LasB-produzierende Elternstamm (TAMURA et al., 1992). Elastase spaltet nicht nur

Elastin sondern auch Kollagen (HECK et al., 1986), inaktiviert Bestandteile des

Immunsystems wie Immunglobulin A (HECK et al., 1990), Lysozym (JACQUOT,

1985), Komplementkomponenten (HONG u. GHEBREHIWET, 1992) und

Substanzen, die am Schutz des Respirationstraktes vor Proteasen beteiligt sind, wie

den humanen Alpha1 Proteaseinhibitor (MORIHARA et al., 1979).

P. aeruginosa produziert die beiden Hämolysine Rhamnolipid und Phospholipase C.

Phospholipase C spaltet Lipide und Lecithin. Rhamnolipid ähnelt von seiner Struktur

her einem Detergenz, vermutlich löst es die Phospholipide des Lungensurfactant und

macht sie so einer Spaltung durch Phospholipase C zugänglich. Außerdem inhibiert

es den mukoziliären Transport (READ et al., 1992).

Exotoxin A ist einer der Hauptvirulenzfaktoren von P. aeruginosa. Ebenso wie andere

Exoprodukte verursacht es lokale Gewebsläsionen und trägt zur Invasivität der

Bakterien bei, aufgereinigtes Exotoxin A ist tödlich für Mäuse (WOODS u.

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Schriftum 17

IGLEWSKI, 1983). Das Toxin ist verantwortlich für die Inaktivierung des

Elongationsfaktors 2 in der Proteinbiosynthese, was zu einer Unterbrechung der

Synthese im Stadium der Verlängerung der Polypeptidkette führt. Dies

Unterbrechung führt letzten Endes zum Zelltod (IGLEWSKI u. KABAT, 1975;

IGLEWSKI et al., 1977). Das Strukturgen toxA wird von RegA positiv transkriptionell

reguliert; die Menge des sezernierten Exotoxin A hängt vom jeweiligen

Bakterienstamm (BJORN et al., 1979) und, neben anderen Umweltfaktoren, von der

Eisenkonzentration in der Umgebung ab. Mehr als 5µM Eisen im Medium reduziert

die Exotoxin A-Produktion in vitro beträchtlich (BJORN et al., 1979). Die Bedeutung

von Exotoxin A bei systemischen Infektionen zeigt sich darin, dass Patienten mit

einem hohen Antikörpertiter gegen Exotoxin A eine deutlich höhere

Überlebenschance bei einer P. aeruginosa-Bakteriämie haben (CROSS et al., 1980).

Außerdem inhibiert Exotoxin A in vitro die Proliferation von B-Zellen sowie die

Produktion von Immunglobulin G und M und hat somit möglicherweise einen

immunsuppressiven Effekt (VIDAL et al., 1993).

Das Pigment Pyocyanin ist für die charakteristische blau-grüne Koloniefärbung auf

bestimmten Selektivmedien verantwortlich und wirkt toxisch auf den Fadenwurm

Caenorhabditis elegans (MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999) und induziert Apoptose bei

neutrophilen Granulozyten (USHER et al., 2002). In vitro wurden eine Vielzahl von

Auswirkungen auf humane Lungenepithelzellen nachgewiesen: so führt das redox-

aktive Pyocyanin über die Bildung von Superoxid und Wasserstoffperoxid zu

oxidativem Stress in der Zelle und somit wahrscheinlich zum Zelluntergang

(GARDNER, 1996). Es inhibiert die zelluläre Katalase-Aktivität (O’MALLEY et al.,

2003b), inaktiviert, ebenso wie Elastase, den humanen Alpha1 Proteaseinhibitor

(BRITIGAN et al. 1999), führt zu ATP-Abnahme in der Zelle (O’MALLEY et al.,

2003a) und erhöht die Freisetzung von Interleukin 8, einem Chemoattraktant für

neutrophile Granulozyten (DENNING et al., 1998). In den Luftwegen von Schafen

induzieren Pyocyanin und 1-hydroxy-Phenazin Entzündungsreaktionen mit

Neutrophilie, was vermutlich auf die erhöhte Produktion von chemoattraktiven

Substanzen zurückzuführen ist (LAUREDO et al., 1998). In pulmonalen

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Schriftum 18

Arterienendothelzellen unterdrückt Pyocyanin die Freisetzung von Prostacyclin,

möglicherweise eine Erklärung dafür, dass bei einer durch P. aeruginosa

verursachten Vasculitis das Endothel relativ lange intakt bleibt, während die äußeren

Schichten der Gefäßwand bereits stark in Mitleidenschaft gezogen sind (KAMATH et

al.,1995).

Siderophore werden zu den passiven Pathogenitätsfaktoren gerechnet. Eisen ist

Bestandteil vieler essentieller Enzyme, so dass ca. 105 Eisenionen pro Bakterienzelle

benötigt werden. (BRAUN, 2001). P. aeruginosa bildet die beiden Fe(III)-Siderophore

Pyoverdin und Pyochelin, um mit hoher Affinität extrazellulär vorliegendes Eisen zu

binden und aufzunehmen (COX ,1980; COX et al., 1981), und kann so auch unter

Eisenmangelbedingungen, wie sie unter anderem im menschlichen Körper

herrschen, existieren. Zudem verwendet P. aeruginosa die beiden Systeme has und

phu, um Häm-gebundenes Eisen in die Zelle zu transportieren (OCHSNER et al.,

2000). Die verschiedenen Mechanismen zur Eisenaufnahme werden vom negativen

Regulatorprotein Fur kontrolliert (VASIL u. OCHSNER, 1999). Siderophore spielen

außerdem möglicherweise eine Rolle beim Entstehen des Entzündungsprozesses,

da pyochelingebundenes Eisen die Bildung von Hydroxylradikalen katalysiert

(COFFMAN et al., 1990).

Neben den Virulenzfaktoren, die in die Umgebung abgegeben werden, verwendet

P. aeruginosa ein Typ III Sekretionssystem, um Effektorproteine in die eukaryotische

Zielzelle zu injizieren. Der Sekretionsapparat besteht aus Translokatorproteinen, die

eine Nadelstruktur oder Pore bilden, durch die bei direktem Zellkontakt

Effektorproteine in das Zytoplasma des Wirts geschleust werden (FRANK, 1997;

GALAN u. COLLMER, 1999; CORNELIS u. VAN GIJSEGEM, 2000). Zu den

Effektorproteinen gehören Exoenzym S (ExoS) und Exoenzym T (ExoT), die von

P. aeruginosa meist als Aggregat sezerniert werden (COBURN, 1992). ExoS und

ExoT haben ebenso wie Exotoxin A ADP-ribosylierende Eigenschaften, aber andere

Zielmoleküle. In vitro werden diverse Proteine von ExoS und ExoT ribosyliert,

darunter Crk I und II, die eine Rolle in der Signaltransduktion bei der Phagozytose

von Bakterien spielen (BARBIERI, 2000). Eine ExoS-defiziente Mutante zeigt im

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Schriftum 19

Tiermodell verglichen mit dem Wildtyp eine verminderte Invasivität (NICAS et al.,

1985a) sowie eine weniger umfangreiche Zerstörung von Lungengewebe (NICAS et

al., 1985b). Weitere Effektorproteine sind ExoU, ein akut wirkendes Cytotoxin,

welches Epithelläsionen verursacht (FINCK-BARBANCON et al., 1997), und die

Adenylatcyclase ExoY, die in der Zielzelle eine Anreicherung von cAMP induziert

(YAHR et al., 1998). Der eigentliche Sekretionsapparat wird durch die

Translokatorproteine PopB und PopD gebildet. Diese Translokatorproteine haben

zum einen die Funktion, Poren zur Translokation der Effektorproteine in der

Wirtszellmembran zu bilden (FRITHZ-LINDSTEN et al., 1998), andererseits wirken

sie bereits durch die Bildung dieser Pore zytotoxisch (DACHEUX et al., 2001b). Die

genaue Rolle des ebenfalls vorhandenen PcrV ist bisher nicht vollständig geklärt

(SCHOEHN et al., 2003). Versuche mit monoklonalen Antikörpern gegen PcrV in

einem Mausmodell konnten eine Protektion bei Sepsis zeigen und die Mortalitätsrate

deutlich senken (FRANK et al., 2002).

Abb. 1

periplasmatischer Raum

äußere Bakterienmembran

Zytoplasma Bakterium

innere Bakterienmembran

translozierte Effektorproteine

Zytoplasma Zielzelle

Membran der Zielzelle

Abb. 1: Schematische Darstellung des Typ III Sekretionssystems gramnegativer Bakterien (aus der Arbeit von C. Rappl, Ludwig-Maximilians-Universität München, 2001).

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Schriftum 20

2.3. Verbreitung von P. aeruginosa bei Tieren

Aufgrund des breiten Wirtsspektrums von P. aeruginosa können sowohl Nutztiere als

auch Haus- und Zootiere, insbesondere Reptilien, von einer Infektion betroffen sein.

Sie treten gehäuft bei Jungtieren und als Sekundärinfektionen auf, da ebenso wie

beim Menschen eine geschwächte Abwehrlage Vorrausetzung für die Invasion des

Erregers ist (SELBITZ, 1992). P. aeruginosa ist bei Tieren an verschiedenen lokalen

Infektionen beteiligt, septische Allgemeininfektionen sind seltener und führen in der

Regel zum Tod des Tieres (MAYR et al., 2001).

Beispiele für lokale Infektionen sind Wundinfektionen bei allen Arten, Abszesse,

Infektionen des Respirationstraktes, chronisch purulente Otitis externa beim Hund,

ulzerative Keratitis bei Hund und Pferd, Stomatitiden bei Reptilien und

Genitalinfektionen mit möglichem Abort bei der Stute. Harnwegsinfektionen bei Hund

und Katze sind in der Regel die Folge tierärztlicher Manipulationen wie z.B.

Katheterisierung (ATHERTON u. PITT, 1982). Durch P. aeruginosa hervorgerufene

Mastitiden kommen bei der Ziege (BOSTEDT u. DEDIÉ, 1996), seltener beim Rind

(GRUNERT, 1996) vor. Die Erkrankung entsteht galaktogen und kann auch

enzootisch auftreten. Sie verläuft beim Rind lokal akut, (meistens) chronisch-

rezidivierend oder subklinisch, bei der Ziege in der Regel akut eitrig, manchmal

gangränös. Sie kann sich aber auch zur systemischen Infektion entwickeln und in

den schwersten Fällen tödlich enden. Beim Rind sind häufig Betriebe betroffen, die

als Desinfektionsmittel für die Melkgeräte quaternäre Ammoniumsalze benutzen

(KLASTRUP, 1994). Bei Schafen wird die sogenannte Vliesfäule durch P. aeruginosa

verursacht. Der Keim kommt bei gesunden Schafen auf der Haut und im Vlies vor.

Bleibt dieses für mehrere Tage feucht. bildet die Mischung aus abgeschilferten

Epithelzellen, Schweißdrüsenexsudat und Hautfett ein ideales Nährmedium, das den

Pseudomonaden eine rasche Vermehrung ermöglicht. Empfängliche Tiere

entwickeln eine exsudative Dermatitis, die zu einer Verfärbung der Wolle und in

dessen Folge zu wirtschaftlichen Verlusten führen kann (PLANT, 2000).

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Schriftum 21

Septische Allgemeininfektionen kommen vor allem beim Geflügel, Nerz, Chinchilla

und bei Laborratten vor (GYLES, 1993). Beim Geflügel sind besonders Küken, die

sich über Tränksysteme, Brutschränke oder kontaminierte Injektionsspritzen

infizieren können, betroffen (SIEGMANN, 1993). Chinchillas können neben der akut

septikämischen auch eine mehr chronisch lokalisierte Form der Infektion entwickeln,

bei der sich die Erkrankung bevorzugt in Darm, Uterus, Harnwegen und Haut

manifestiert. Die Prognose ist in beiden Fällen zweifelhaft bis ungünstig (EGEN u.

ERNST, 1998).

2.4. P. aeruginosa und CF

2.4.1. Allgemeines Die Cystische Fibrose (CF) ist die zweithäufigste, autosomal rezessiv vererbte

Erkrankung der weißen (kaukasischen) Bevölkerung, an der weltweit über 60.000

Menschen leiden (RAJAN u. SAIMAN, 2002). In Europa und Amerika erkrankt ca. 1

Kind von 2000 bis 1 von 4500 (KOCH u. HØIBY, 1993). Die CF beruht auf einem

Gendefekt im cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR (BEAR et

al., 1992). CFTR ist ein Chlorid-ABC Transporter mit zusätzlichen Funktionen

regulatorischer Natur (TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999). Die häufigste Mutation (~ 70%)

ist die inframe 3-Basenpaar-Deletion im CFTR-Gen (F508), welche zum Verlust der

Aminosäure Phenylalanin an Position 508 führt (PIER, 1998; TÜMMLER u. KIEWITZ,

1999). Die Abwesenheit von CFTR in der apikalen Membran von Epithelzellen

bewirkt einerseits die Verringerung der Cl--Sekretion und andererseits die

beschleunigte Na+-Absorption durch die wegfallende inhibitorische Wirkung von

CFTR auf den epithelialen Na+-Kanal (ENaC) (BEAR et al., 1992; STUTTS et al.,

1995). Die dabei entstehende Dysregulation des Na+ und Cl--Haushalts bewirkt eine

erhöhte Viskosität epithelialer Sekrete. Auf klinischer Ebene sind die

Hauptcharakteristika der CF-Erkrankung – aufgrund von Obstruktionen in den

Organen durch Bildung eines wasserarmen, hoch viskösen Sekretes – Malabsorption

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Schriftum 22

(entsprechend der exokrinen Pankreasinsuffizienz), Beeinträchtigung der

Lungenfunktion mit rezidivierenden bakteriellen Infektionen, zunehmender

Salzverlust im Schweiß und männliche Infertilität durch Stenose in den Vasa

deferentia (KOCH u. HØIBY, 1993). Auch das hepatobiliäre System ist betroffen

(TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999). Während die exokrine Pankreasinsuffizienz durch

Enzymsubstitution nicht mehr den limitierenden Faktor darstellt und die meisten

Patienten das Erwachsenenalter erreichen, ist und bleibt heute die CF-Lunge

aufgrund der chronischen Infektionen die Hauptrsache für die Morbidität und

Mortalität der Erkrankung (GOVAN u. DERETIC 1996; TÜMMLER u. KIEWITZ 1999;

RAJAN u. SAIMAN 2002).

Die Luftwege von CF-Patienten werden hauptsächlich mit opportunistischen Erregern

– besonders S. aureus und H. influenzae im frühen Lebensalter und P. aeruginosa

und Vertretern des Burkholderia cepacia-Komplexes im späteren Lebensalter –

besiedelt und infiziert (TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999). Neben diesen Erregern

werden weitere Mikroorganismen wie Moraxella catarrhalis, Stenotrophomonas

maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans, Burkholderia gladioli, Mitglieder der Familie

Enterobacteriaceae (KNOWLES, 2000), atypische Mykobakterien (KILBY et al.,

1992), sowie Aspergillus fumigatus (GILLIGAN, 1991) im Respirationstrakt

vorgefunden.

P. aeruginosa ist der häufigste und verbreitetste Lungeninfektionserreger in CF-

Patienten und wird deshalb auch als CF-Leitkeim bezeichnet (SMITH et al., 1996;

LYCZAK et al., 2002). Bei 75-90% der Patienten entsteht eine chronische Infektion

mit diesem Bakterium (PIER, 2000). In Krankenhäusern stellen Waschbecken,

Toiletten und Duschen, aber auch das Klinikpersonal und bereits infizierte Patienten

ein Infektionsrisiko dar (SCHAAL u. v. GRAEVENITZ, 1994). Studien von RÖMLING

et al. (1994) haben gezeigt, dass Infektionen mit P. aeruginosa beinahe überall in der

Umwelt stattfinden können. Das heißt, nicht nur das Krankenhaus stellt ein Risiko

dar, sondern auch die häusliche Umgebung der Patienten. Die meisten Patienten

werden in der Schulzeit oder der frühen Pubertät kolonisiert (TÜMMLER u. KIEWITZ,

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Schriftum 23

1999). Ist die CF-Lunge chronisch infiziert, können die meisten Chemotherapeutika

die Bakterien nicht mehr vollständig eliminieren (DERETIC, 2000).

Man geht davon aus, dass eine Besiedelung der Lunge mit P. aeruginosa nach

erfolgreicher Infektion mit Erregern wie S. aureus oder H. influenzae stattfindet,

wobei P. aeruginosa diese Keime verdrängt (DERETIC, 2000).

In der CF-Lunge ist eine Senkung der mukoziliären Clearance und somit eine

Störung in der primären natürlichen Abwehr der Lunge vorzufinden. Über die

Pathogenese und die hohe Empfänglichkeit für chronische Infektionen gibt es heute

mehrere Hypothesen. Einige dieser Hypothesen stellen eine besondere Adhärenz

von P. aeruginosa an CF-Epithelzellen in den Vordergrund (de BENTZMANN et al.,

1996), eine verschlechterte Internalisierung und Abschilferung von P. aeruginosa

enthaltenden Epithelzellen durch Abwesenheit von CFTR (PIER et al., 1996) oder

eine Inaktivierung der Salz-sensiblen Defensine in der ASL (airway surface liquid)

(GOLDMANN et al., 1997). Eine neuere Hypothese geht von speziellen

Wachstumsbedingungen für die Bakterien in der CF-Lunge aus. Diese sind eng mit

der bei CF veränderten Zusammensetzung des ASL verknüpft. Es wird vermutet,

dass es zu einer Volumenabnahme der die Zilien umgebenden Flüssigkeit durch

erhöhte Absorption von Natrium-Ionen und einer Senkung in der Sekretion der

Chlorid-Ionen kommt. Die ASL, welche die Lungenoberfläche bedeckt, besteht aus

einer Mukusschicht (stark vernetzte, hoch glykosylierte Proteine) und einer

periziliären Flüssigkeitsschicht. Die periziliäre Flüssigkeitsschicht auf der

Zelloberfläche umgibt die Zilien des Flimmerepithels und ist von niedriger Viskosität,

in der sich die Zilien schnell bewegen können. Zusätzlich schützt sie die

Epithelzelloberfläche vor der darüberliegenden Mukusschicht. Besteht eine

physiologische Funktion, so fängt das mukoziliäre Clearance-System mit der

Mukusschicht fremde inhalierte Partikel und Mikroorganismen ab und transportiert

diese zum Nasopharynx, wo sie abgeschluckt oder abgehustet werden (KOCH u.

HØIBY, 1993; KNOWLES u. BOUCHER, 2002; LYCZAK, 2002). Durch die

chronische Volumenabnahme der periziliären Flüssigkeitsschicht kommt es

vermutlich zu einer Interaktion zwischen der Mukusschicht mit der

Epithelzelloberfläche und es bilden sich dicke Mucusplaques. Hierdurch kommt es

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Schriftum 24

zur Störung der Zilienbewegung, was eine Reduktion der Clearancerate zur Folge

hat (KNOWLES u. BOUCHER, 2002). Da die Mucin-Sekretion unverändert bleibt,

kommt es zu einem Dickenzunahme der Mucus-Schicht.

Inhalierte P. aeruginosa gelangen aktiv (flagelläre Motilität) und/oder passiv

(Turbulenzen der Mukusoberfläche) in die Mukusmasse, bilden dort Mikrokolonien

und reduzieren hier den Sauerstoffgehalt. Beim anschließenden anaeroben

Wachstum verwenden sie vermutlich Nitrit als terminalen Elektronenakzeptor

(HASSETT et al., 1999; WORLITZSCH et al., 2002). P. aeruginosa passen sich also

den veränderten Lebensbedingungen in der CF-Lunge an, indem sie die Fähigkeiten

besitzen, Mikrokolonien in anaeroben Mukusplaques bilden zu können

(WORLITZSCH et al., 2002). Diese Hypothese wird durch Untersuchungen an

humanen Lungenpräparaten (BALTIMORE et al., 1989; WORLITZSCH et al., 2002)

sowie durch Studien an Tiermodellen (NIEDERMAN et al., 1983; MARCUS u.

BAKER, 1985) unterstützt. Dazu passen Beobachtungen, dass P. aeruginosa unter

niedrigen O2-Partialdrücken bzw. mikroaerophilen Bedingungen gut wächst und unter

anaeroben Bedingungen besonders dicke Biofilme ausbildet (YOON et al., 2002).

Biofilme schützen P. aeruginosa vor der Immunantwort ihres Wirts, da

opsonisierende Antikörper und Phagozyten wenig Angriffsfläche finden (HØIBY et

al., 2001). Außerdem vermitteln sie eine erhöhte Resistenz gegen Antibiotika

(HANCOCK, 1998).

2.4.2. Phänotypische Variationen von P. aeruginosa bei CF

Die meisten CF-Patienten sind mit einem P. aeruginosa Genotyp chronisch infiziert

(BREITENSTEIN et al., 1997), die Isolate können jedoch unterschiedliche Kolonie-

Morphologien aufweisen. Dieses Verhalten wurde von ZIERDT u. SCHMIDT bereits

1964 als “dissoziatives Verhalten“ beschrieben. CF-assoziierte Isolate sind oft

mukoid, was auf einer Überproduktion von Alginat aufgrund einer Mutation im

Regulatorprotein MucB beruht. Diese Mutation kann zum Beispiel durch

Sauerstoffradikale induziert werden, die von PMNs während der inflammatorischen

Antwort gebildet werden (GOVAN u. DERETIC, 1996). Auch sind CF-Isolate meist

nicht motil aufgrund fehlender Typ IV Pili oder Flagellen (LUZAR et al., 1985). Das

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Schriftum 25

Fehlen von Typ IV Pili und Flagellen kann auch bei P. aeruginosa in Biofilmen

beobachtet werden (WHITELEY et al., 2001). Außerdem zeigen CF-Isolate eine

verminderte Virulenz bei akuten respiratorischen Infektionen im Maus-Modell

(LUZAR u. MONTIE, 1985).

Zu Beginn werden CF-Patienten mit dem nicht-mukoiden Phänotyp, wie er ubiquitär

in der Umwelt zu finden ist, kolonisiert (PIER, 1998). Im Laufe der Erkrankung

tendiert das Bakterium dazu, zum mukoiden Phänotyp zu konvertieren und so

vermutlich die chronische Infektionsphase für die CF-Patienten einzuleiten (KOCH u.

HØIBY, 1993; LYCZAK et al., 2002). Somit beherbergen die meisten Patienten den

nicht-mukoiden Phänotyp nur für eine kurze Periode und den mukoiden Phänotyp für

Jahre (PIER, 1998). Selten wird der mukoide Phänotyp von P. aeruginosa bei

anderen Infektionen als CF vorgefunden (DERETIC, 2000).

Neben dem mukoiden wurde ein weiterer Morphotyp von P. aeruginosa mit CF in

Verbindung gebracht. Dieser wird aufgrund der Bildung von extrem kleinen Kolonien

als small colony variant (SCV) beschrieben.

SCVs sind bei P. aeruginosa schon länger bekannt (BAYER, 1989). Ähnliche

Morphotypen wurden auch bei einer Reihe weiterer bakterieller Erreger, wie S.

aureus (LACEY, 1969; BULGER, 1969), Salmonella Typhimurium (SASARMAN et

al., 1970), Klebsiella pneumoniae (MURRAY u. MOELLERING, 1982), Escherichia

coli (ROGGENKAMP et al., 1998) und Burkholderia pseudomallei (HÄUSSLER et al.,

1999b) beobachtet. Für die meisten dieser SCVs wird eine Einschränkung des

aeroben respiratorischen Systems oder genauer der Häm Biosynthese angenommen

(ROGGENKAMP et al., 1998). Die SCVs von S. aureus und E. coli sind neben den

SCVs von P. aeruginosa am besten charakterisiert, ihr Auftreten korreliert ebenfalls

mit chronischen Infektionen (ROGGENKAMP et al., 1998). SCVs von E. coli und S.

aureus weisen eine Auxotrophie gegenüber Menadion oder Hämin auf, was in diesen

Arten darauf hindeutet, dass das verlangsamte Wachstum auf eine Beeinträchtigung

der Biosynthese von Menachinon und Cytochromen, beides essentielle Bestandteile

der Elektronentransport-Kette, zurückzuführen ist. In der Tat zeigte eine in vitro

Mutante des für die Häm-Biosynthese essentiellen hemB Gens in S. aureus einen

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SCV-Phänotyp (VON EIFF et al., 1997; VAUDAUX et al., 2002), was ebenfalls für ein

hemB-defizientes klinisches Isolat von E. coli der Fall war (ROGGENKAMP et al.,

1998). Mutationen im hemB Gen verursachen also eine Beeinträchtigung des

Energiestoffwechsels und sind eine mögliche Ursache für das Auftreten von SCVs in

S. aureus und E. coli.

Entsprechende metabolische Beeinträchtigungen konnten für die P. aeruginosa

SCVs nicht gefunden werden, Hämin und Menadion im Medium konnten die

Koloniegröße der SCVs nicht verändern. HÄUSSLER et al. (1999a) untersuchten

Isolate von CF-Patienten, die in einem Zeitraum von 2 Jahren regelmäßig in der

Pädiatrie und CF-Klinik der Medizinischen Hochschule Hannover betreut wurden.

Von diesen 86 P. aeruginosa positiven Patienten waren 33 mit SCVs kolonisiert.

Patienten, bei denen SCVs isoliert wurden, wiesen eine stärkere Beeinträchtigung

ihrer Lungenfunktion auf als Patienten ohne SCVs. Außerdem bildeten SCVs eine 2

bis 8-fach höhere Resistenz gegenüber gebräuchlichen Antibiotika (Aminoglykoside,

Quinolone, β-Lactame, Colistin) aus, die zur Behandlung von CF-Patienten

eingesetzt werden. Der durch Antibiotikagabe verursachte selektive Druck könnte

u.a. für das Entstehen von SCVs verantwortlich sein, da diese vermehrt aus

Patienten isoliert wurden, die täglich das Aminoglykosid Tobramycin als

antipseudomonale Aerosol-Therapie anwendeten.

Abb. 2 WT

Abb. 2: Wachstum der beiden Morphotypen WT un

Columbia-Blutagar nach 48-stündiger Inkubation bei 3

SCV

d SCV von P. aeruginosa 20265 auf

7 °C.

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Die vorliegende Arbeit baut auf den beschriebenen Untersuchungen von HÄUSSLER

et al. (1999a) auf. In phänotypischen Analysen von SCVs wurde von HÄUSSLER et

al. (2003) ein Pool von 12 Isolaten klonaler SCVs und Wildtypen und ihrer in vitro

generierten Revertanten untersucht. Sechs der SCVs zeigten ein stark

autoaggregatives Verhalten im Vergleich zu Wildtyp und Revertante bei Anzucht in

Vogel-Bonner-Medium. In LB-Medium war dieses autoaggregative Verhalten nicht so

stark ausgeprägt. Ausgehend von dieser Subgruppe wurden weitere Tests

durchgeführt. Alle SCVs zeigten eine verstärkte Biofilmproduktion, vier der sechs

autoaggregativen SCVs zeigten eine stärkere Assoziation mit der Pneumozyten-

Zellinie A549. Alle wiesen eine erhöhte Hydrophobizität auf und fünf zeigten in

elektronenmikroskopischen Untersuchungen vermehrt Pili im Vergleich zum Wildtyp.

Die in vitro generierten Revertanten waren durch eine noch größere Anzahl Pili

gekennzeichnet. Alle SCVs zeigten ein gegenüber dem Wildtyp und der Revertante

vermindertes Schwimmverhalten, wogegen das durch Pili vermittelte Twitching im

Vergleich zum Wildtyp erhöht war. Die Revertanten zeigten die höchste Twitching-

Motilität. Bei Kokultivierungsversuchen mit ihren Wildtypen in LB-Medium wiesen die

SCVs in der exponentiellen Phase ein geringeres Wachstum auf, wogegen die

Überlebensrate in der stationären Phase deutlich höher war.

WEHMHÖNER (2002) konnte bei der autoaggregativen SCV 20265 im Vergleich

zum WT 20265 eine verstärkte Typ I Sekretion (alkalische Protease, Hämophore

HasAp) und verstärkte Typ III Proteinsekretion (Effektorproteine ExoS und ExoT,

Porenproteine PopB, PopD, PcrV) nachweisen und zeigen, dass vermehrt Proteine

zur Eisenaufnahme gebildet werden. Außerdem zeigt diese SCV eine geringe

Expression von Strukturproteinen des Flagellen-Apparats.

VON GÖTZ (2003) führte zur gleichen Zeit Transkriptom-Analysen mit SCV 20265

und klonalem WT durch und konnte feststellen, dass auch auf Transkriptom-Ebene

eine verstärkte Expression der Gene auftrat, die für die Struktur und Funktion eines

Typ III Sekretionsapparats nötig sind. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die

SCV 20265 eine geringere Expression von Genen aufwies, die der Motilität dienen,

sowie eine Erhöhung von Genen, die für eine Eisenaquirierung nötig sind.

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Das Auftreten von SCVs in vitro konnte auch in anderen Arbeitsgruppen festgestellt

werden. DEZIEL et al. (2001) konnten zeigen, dass P. aeruginosa 57RP SCVs

gegenüber dem Wildtyp eine Hyperpilierung der Typ IV Pili auf der Zelloberfläche

aufwiesen, jedoch trotzdem eine verminderte twitching-Motilität besaßen. Außerdem

waren die Flagellen-abhängigen Fortbewegungsarten Schwimmen und Schwärmen,

sowie die allgemeine chemotaktische Orientierung der Bakterien beeinträchtigt.

57RP SCVs zeigten eine gesteigerte Fähigkeit zur Initiierung von Biofilmen, die mit

einer starken Adhärenz zu abiotischen Oberflächen, erhöhter Hydrophobizität und

Autoaggregation einherging. Es zeigten sich auch Unterschiede in der Sezernierung

von Exoprodukten. So war der Gehalt von Pyocyanin und Pyoverdin erhöht, die

Menge an Elastase im Vergleich zum Wildtyp erniedrigt. Die 57RP SCVs wiesen

darüber hinaus eine höhere Sensitivität gegenüber H2O2 auf.

DRENKARD u. AUSUBEL (2002) bestätigten die guten Biofilm-

Bildungseigenschaften und die erhöhte Resistenz von SCVs gegenüber Antibiotika

(HÄUSSLER et al., 1999a). Sie stellten fest, dass die Anzahl aus dem Wildtyp

gebildeter SCVs von den in vitro Kulturbedingungen abhing. Daraus zogen sie den

Schluss, dass das Auftreten von SCVs ein von den Umweltbedingungen induzierter

Prozess sei und schlugen wie vor ihnen auch DÉZIEL et al. (2001) als Mechanismus

eine gerichtete Phasenvariation vor. DRENKARD u. AUSUBEL (2002) identifizierten

mit pvrR ein Gen, das, wenn es in PA14 SCVs überexprimiert wurde, diesen SCVs

Wildtyp-Eigenschaften verlieh. Eine Mutagenese im Wildtyp führte nicht zu einem

ausschließlichen SCV-Phänotyp, sondern lediglich zu einem gehäuften Auftreten von

SCVs in der WT-Population. Daraus ist zu schließen, dass pvrR vermutlich eine

Rolle in der Morphotyp-Konversion spielt, jedoch nicht allein dafür verantwortlich zu

sein scheint. Dieses Gen konnte in der Mehrzahl von getesteten CF- und Klinik-

Isolaten sowie Standard-Laborstämmen nachgewiesen werden. In P. aeruginosa

PAO1 konnte jedoch kein homologes Gen gefunden werden.

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2.5. Der Nematode C. elegans als Infektionsmodell

C. elegans ist ein freilebender, anspruchsloser Bodennematode der meisten

gemäßigten Zonen. Er lebt im Erdreich und ernährt sich von den dort vorkommenden

Mikroorganismen. Außerdem benötigt er für Wachstum und Reproduktion lediglich

eine feuchte Umgebung mit gemäßigten Temperaturen und ausreichend Sauerstoff.

Aufgrund dieser Anspruchslosigkeit ist C. elegans problemlos im Labor auf

Agarplatten mit E. coli als Nahrungsquelle zu halten. Aufgrund seiner geringen

Größe von etwa 2 mm ist die Kultivierung einer großen Anzahl von Würmern auf

kleinstem Raum möglich. Die Dauer der Entwicklung vom Ei bis zum

reproduktionsfähigen adulten Wurm beträgt temperaturabhängig etwa drei (25 °C)

bis sechs (15 °C) Tage, wobei sich diese Entwicklung über vier Larvenstadien (L1

bis L4) erstreckt. Die maximale Lebenszeit des adulten Wurms beträgt etwa vier

Wochen, bei Nahrungsmangel oder zu hoher Populationsdichte ist die Entstehung

eines resistenteren Dauerstadiums möglich (RIDDLE et al., 1997).

Abb. 3

Aa

v

A

bb. 3: Der Nematode Caenorhabditis elega

dulten Wurms. (B) ist ein Ausschnitt aus ei

erschiedenen Entwicklungsstufen sowie adult

B

ns. (A) zeigt den anatomischen Aufbau einen

ner Mischkulturplatte. Es sind Eier, Larven in

e Würmer zu sehen.

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Jeder adulte, selbstbefruchtende Hermaphrodit legt in einem Zeitraum von 4 Tagen

bis zu 300 Eier. Ebenfalls existierende männliche Würmer – weibliche Tiere gibt es

nicht – lassen sich beliebig mit diesen Hermaphroditen paaren, was für die

genetische Forschung von Bedeutung ist.

Der Wurm ist mechanisch sehr robust: er lässt sich schütteln, zentrifugieren,

einfrieren und lebendig wieder auftauen. Die Basistechniken zur Kultivierung sind

einfach und ohne großen Aufwand durchzuführen (HOPE, 1999). Die Anatomie des

Wurms ist sehr übersichtlich – exakt 959 somatische Zellen bei Hermaphroditen,

davon 302 Nervenzellen – und die Erscheinung unter dem Durchlichtmikroskop

transparent, was für die Erforschung innerer Vorgänge von großem Vorteil ist

(RIDDLE et al., 1997).

Diese Argumente veranlassten schon 1965 den britischen Molekularbiologen

SYDNEY BRENNER, C. elegans als Modellorganismus in die Biologie einzuführen

(BRENNER, 1974). Seit dem gewann der Wurm zunehmend an Interesse. Bereits im

Jahr 1998 war das Genom von C. elegans als erstem multizellulären Organismus

vollständig sequenziert (THE C. ELEGANS SEQUENCING CONSORTIUM, 1998).

Das Genom von C. elegans umfasst etwa 19000 Gene bei einer Größe von 97 Mb,

was nach aktuellen Schätzungen mehr als halb so vielen Genen wie beim Mensch

entspricht (INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM,

2001). Die Sequenzierung hat gezeigt, dass mindestens 37% der exprimierten

Proteine von C. elegans Äquivalente in anderen Organismen wie dem Mensch und

anderen Säugern besitzen. So kann, trotz der großen evolutionären Distanz

zwischen Mensch und Nematode, C. elegans als ein gültiges, auch auf den

Säugetierwirt übertragbares Modell für infektionsbiologische Studien herangezogen

werden (MAHAJAN-MIKLOS et al., 2000).

Die bekannte Genomsequenz und die daraus resultierende Möglichkeit, diese

genetisch zu manipulieren, machen für die Aufklärung grundlegender biologischer

Vorgänge auch ein Arbeiten mit definierten Wurmmutanten möglich. Insbesondere in

Verbindung mir bakteriellen Pathogenen, deren Genom ebenfalls bekannt ist, bieten

sich optimale Bedingungen zur systematischen Analyse von Interaktionen zwischen

einem bakteriellen Pathogen und einem eukaryotischen Wirt (TAN et al., 1999a).

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Viele Virulenzfaktoren werden erst durch den Wirt induziert und können nur mit Hilfe

von Techniken identifiziert werden, die den Wirt mit einbeziehen. Aus diesem Grund

stellte die Gruppe um FREDERICK AUSUBEL im Januar 1999 ein Nematoden-

Bakterien-Pathogenitätsmodell vor, welches sich mit den Einflüssen von P.

aeruginosa auf C. elegans befasst (TAN et al., 1999a; MAHAJAN-MIKLOS et al.,

1999; TAN et al., 2000), und mit dessen Hilfe Interaktionen zwischen

Virulenzfaktoren des Bakterienstammes und den Wirtsabwehrmechanismen

analysiert werden können. P. aeruginosa besitzt die Fähigkeit, Virulenzfaktoren zu

produzieren, die in so unterschiedlichen Wirten wie Pflanzen (Arabidopsis thaliana),

Nematoden und Säugern Krankheiten verursachen (RAHME et al. 1995; TAN et al.,

1999b; MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999), so dass Vergleiche zwischen seinem

Verhalten in den unterschiedlichen Wirtssystemen gezogen werden können. TAN et

al. (1999a, b; 2000) und MAHAJAN-MIKLOS et al. (1999) konnten mit ihrem Modell

Mutanten des P. aeruginosa-Stammes PA 14 isolieren, die sowohl im C. elegans- als

auch im Mausmodell attenuiert waren. Diese Tatsache zeigt die Möglichkeit,

Pathomechanismen zu detektieren, die auch für den Säugetierwirt von Bedeutung

sind.

P. aeruginosa PA 14 hat ein breites Wirtsspektrum und zeigt auf C. elegans letale

Wirkung. Es wurden zwei unterschiedliche Arten des Wurmsterbens beschrieben:

das durch Infektion ausgelöste langsame Sterben slowkilling und das schnellere

Sterben fastkilling, das durch die Ausschüttung von Toxinen bedingt ist. Der

unterschiedliche Sterbeverlauf ist von der Zusammensetzung des Kulturmediums

abhängig.

Eine dritte Art des Sterbens von C. elegans durch PA 14 wurde wenige Monate

später als letale Paralyse beschrieben (DARBY et al., 1999), die auf einer Cyanid-

Produktion durch P. aeruginosa beruht.

Es sollte jedoch auch in Betracht gezogen werden, dass das C. elegans-Bakterien-

Modell einige Einschränkungen aufweist. So wird das System zum Beispiel dadurch

limitiert, dass nicht alle Bakterien C. elegans unter Laborbedingungen infizieren

können. Bisher ist eine letale Wirkung auf C. elegans nur für folgende Bakterien

Page 32: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Schriftum 32

beschrieben: die gramnegativen Pathogene P. aeruginosa, P. fluorescens, B.

cepacia (TAN et al., 1999a, 2000), B. pseudomallei, B. thailandensis (O’QUINN et

al., 2001), S. Thyphimurium (ABALLAY et al., 2000), Serratia marcescens (KURZ et

al., 2000) und Yersinia spp. (DARBY u. FALKOW, 1999) sowie die grampositiven

Pathogene Bacillus megaterium (ANDREW et al., 1976), Bacillus thuringiensis

(LEYNS et al., 1995), Microbacterium nematophylum (HODGKIN et al., 2000),

Enterococcus faecalis, S. aureus und Streptococcus pneumoniae (GARSIN et al.,

2001). Zudem fehlt den Nematoden ein entwickeltes (adaptives) Immunsystem; die

Aufgabe mancher Virulenzfaktoren besteht jedoch darin, die Immunantwort des

Wirtes zu neutralisieren (FINLAY et al., 1999). Des Weiteren wird die Expression

vieler Virulenzmechanismen im Säugetierwirt durch das Wirtsmillieu oder durch

spezifische Wirtsmoleküle induziert, wobei die Temperatur (in den meisten Fällen

37 °C) oftmals ein Schlüsselsignal ist. Dementsprechend könnte man einwenden,

dass einige für Säugetiere relevante Virulenzfaktoren nicht im Nematoden exprimiert

werden, da diese bei Raumtemperatur gehalten werden. Trotz dieser

Einschränkungen konnte in den oben genannten Studien von TAN et al. (1999a, b;

2000) gezeigt werden, dass es eine Vielzahl von Virulenzfaktoren gibt, die

gleichzeitig Bedeutung für Nematoden und Säuger haben.

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Schriftum 33

2.6. Zielsetzung der Arbeit

Im Rahmen dieser Studie sollten unterschiedliche klinische P. aeruginosa SCVs und

ihre klonalen Wildtyp-Phänotypen charakterisiert werden. Dabei lag der Schwerpunkt

darauf, das Typ III Sekretionssystem bei SCVs im Gegensatz zu den WT näher zu

charakterisieren.

Zunächst sollte unter Verwendung eines Zellkultur-Modells zum einen geklärt

werden, ob eine verstärkte Expression von Typ III Genen, wie sie für einen Vertreter

der SCVs beschrieben wurde, eine funktionelle Rolle spielt und zum anderen sollte

untersucht werden, ob die erhöhte Typ III Sekretion nur ein Phänomen dieses

einzelnen Vertreters war oder auch andere SCVs ein ähnliches Expressions-Profil

zeigen. Durch Überexpression des Zwei-Komponenten-Regulators pvrR in den SCVs

sollte der Einfluss dieses Gens auf den SCV-Phänotyp überprüft werden.

Des Weiteren sollte mit einem Mausmodell geklärt werden, in wie weit eine erhöhte

Typ III Sekretion bei SCVs in vivo eine Rolle spielt. Ein dritter Punkt dieser Studie

war es, ein Caenorhabditis elegans – Modell zu etablieren, mit dem im Gegensatz zu

bereits bestehenden Modellen Typ III Sekretion-vermittelte Virulenz detektiert werden

kann. Dies sollte neben der Untersuchung von P. aeruginosa WT- und SCV-Isolaten

zusätzlich durch den Einsatz von P. aeruginosa-Mutanten mit Defekten im Typ III

Sekretionssystem erreicht werden.

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Material und Methoden 34

3. Material und Methoden

3.1. Bakterien

3.1.1. Bakterienstämme Die in dieser Studie verwendeten Stämme von P. aeruginosa sowie verwendete

Mutanten werden im Folgenden unter Nennung ihrer relevanten phäno- oder

genotypischen Eigenschaften aufgeführt.

Die untersuchten SCVs sowie ihre klonalen Wildtypen wurden aus dem

Respirationstrakt chronisch infizierter CF-Patienten, die in der Medizinischen

Hochschule Hannover behandelt wurden, isoliert. Die Klonalität von SCV und WT

wurde mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese überprüft. Diese Prüfung erfolgte im

Bereich Krankenhaushygiene des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und

Krankenhaushygiene nach der Methode von RÖMLING et al. (1994).

Die verwendete P. aeruginosa Mutante 20265 SCVexsA wurde von I. Attree, CEA

Grenoble, Frankreich konstruiert und zur Verfügung gestellt (Tab. 1).

Tab. 1: Verwendete Isolate von P. aeruginosa SCVs und Wildtypen

Patient Stamm Relevanter Phäno- oder Genotyp

Herkunft

A 20265 WT klonal identisch mit SCV, schnell wachsender WT

MH Hannover

20265 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ 20265 SCVexsA Insertionsmutation in exsA,

Regulator für Typ III Sekretion; GmrI. Attree, CEA Grenoble

20265 SCVpED202

Komplementation des pvrR-Gens; Hypothese : Beteiligung an der SCV-Entstehung ; Cbr

F. v. Götz MH Hannover

B 52 WT klonal identisch mit 52 SCV, schnell wachsender WT

MH Hannover

52 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ

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Material und Methoden 35

C 8226 WT klonal identisch mit 8226 SCV, schnell wachsender WT

MH Hannover

8226 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ D 231 WT klonal identisch mit 231 SCV,

schnell wachsender WT MH Hannover

231 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ E 29 WT klonal identisch mit 29 SCV,

schnell wachsender WT MH Hannover

29 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ 29 SCVpED202 Komplementation des pvrR-Gens;

Hypothese : Beteiligung an der SCV-Entstehung ; Cbr

F. v. Götz MH Hannover

F 10 WT klonal identisch mit 10 SCV, schnell wachsender WT

MH Hannover

10 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ G 17997 WT klonal identisch mit 17997 SCV,

schnell wachsender WT MH Hannover

17997 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ

H 18 WT klonal identisch mit 18 SCV, schnell wachsender WT

MH Hannover

18 SCV SCV, nicht autoaggregativ u. hyperpiliert

I 211 WT klonal identisch mit 211 SCV, schnell wachsender WT

MH Hannover

211 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert J 35 WT klonal identisch mit 35 SCV,

schnell wachsender WT MH Hannover

35 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert K 6998 WT klonal identisch mit 6998 SCV,

schnell wachsender WT MH Hannover

6998 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert L 50 WT klonal identisch mit 50 SCV,

schnell wachsender WT MH Hannover

50 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert M 26 WT klonal identisch mit 26 SCV,

schnell wachsender WT MH Hannover

26 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert N 4211 WT klonal identisch mit 4211 SCV,

schnell wachsender WT MH Hannover

4211 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert O 113 WT klonal identisch mit 113 SCV,

schnell wachsender WT MH Hannover

113 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert Bezeichnung der Phänotypen: WT, Wildtyp; SCV, small colony variant; Gmr, Gentamicin-

Resistenz; Cbr, Carbenicillin-Resistenz

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Material und Methoden 36

P. aeruginosa TB und eine Gruppe von 65 daraus generierte Transposon-Mutanten

wurden freundlicherweise von der Klinischen Forschergruppe (L. Wiehlmann, B.

Tümmler) der Kinderklinik der MHH zur Verfügung gestellt. Sechs Mutanten konnten

zur Veröffentlichung im Rahmen dieser Arbeit verwendet werden. Außerdem wurde

die von I. Attree konstruierte Mutante TBexsA eingesetzt (Tab. 2).

Tab. 2: P. aeruginosa TB und Transposon-Mutanten

Stamm Relevanter Phäno- oder Genotyp

Herkunft

TB Klinisches Isolat CF L. Wiehlmann, MHH

9B9 intergenic region zwischen mechanosensitivem Kanal mscL und Katalase katB

L. Wiehlmann, MHH

18A8 knock out im Transkriptiosregulator RhlR, quorum sensing

L. Wiehlmann, MHH

20D1 knock out von xcpS, Protein F eines allg. Sekretionsapparats

L. Wiehlmann, MHH

25C8 knock out im Typ IV Strukturprotein für TypIV-Pili, PilY

L. Wiehlmann, MHH

D8A3 knock out im Regulator des quorum sensing, vfr

L. Wiehlmann, MHH

D10B10 knock out in mögl. Ferrichrome-Eisen-Rezeptor

L. Wiehlmann, MHH

TBexsA Insertionsmutation in exsA, Regulator für Typ III Sekretion; Gmr

I. Attree, CEA Grenoble

Bezeichnung der Phänotypen: Gmr, Gentamicin-Resistenz

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Material und Methoden 37

P. aeruginosa CHA und daraus generierte Mutanten, sowie P. aeruginosa PA34 und

eine ExoU-defiziente Mutante von PA34 wurden freundlicherweise von I. Attree,

CEA, Biochimie et Biophysique des Systemes Intégrés, Grenoble, Frankreich, zur

Verfügung gestellt (Tab. 3).

Tab. 3: P. aeruginosa -Stämme aus Frankreich

Stamm Relevanter Phäno- oder Genotyp

Herkunft/Referenz

CHA CF-Isolat, Wildtyp DACHEUX et al., 1999

CHA-D1 Insertionsmutation in exsA, Regulator für Typ III Sekretion; Gmr

s.o.

CHAdsbA Defekt in Thiol-Disulfid-Oxidoreduktase; nötig für korrekte Faltung von Proteinen über Disulfid-Brücken; Tcr

FAUVARQUE et al. 2002

CHApilV knock out in einem Strukturprotein für TypIV-Pili, PilV; Tcr

FAUVARQUE et al. 2002

CHAcheZ Chemotaxis ; Gmr FAUVARQUE et al. 2002

CHAexsD knock out im TTSS-Regulator ExsD; Tcr

FAUVARQUE et al. 2002

PA 34 CF-Isolat, Wildtyp FAUVARQUE et al. 2002

PA34∆U knock out im TTSS-Effektorprotein ExoU; Gmr

FAUVARQUE et al. 2002

Bezeichnung der Phänotypen: Gmr, Gentamicin-Resistenz; Tcr, Tetracyclin-Resistenz

Außerdem wurden die Stämme P. aeruginosa PA14 – klinisches CF-Isolat – und P.

aeruginosa PAO1 – Wundisolat (DSM 1707) – eingesetzt (TAN et al., 1999; DARBY

et al., 1999).

Als Futterquelle für den Nematoden C. elegans wurde der Stamm E. coli OP50

verwendet, freundlicherweise zur Verfügung gestellt vom Caenorhabditis Genetic

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Material und Methoden 38

Center (CGC), University of Minnesota, St. Paul, MN, USA. Als apathogener

Referenzkeim in den C. elegans -Assays in Flüssigkultur wurde der E. coli -Stamm

DH5α verwendet.

3.1.2. Kulturbedingungen Alle Bakterienstämme wurden zunächst auf Columbia-Agar mit 5% Schafblut oder

auf LB (Luria-Bertani)-Platten mit Antibiotikazusatz bei 37 °C angezüchtet.

Bakterienvorkulturen wurden angelegt, indem etwa 5 ml LB-Medium oder Vogel-

Bonner-Medium (einfach oder Calcium-depletiert) mit Koloniematerial von 3 bis 5

Kolonien beimpft und bei 37 °C im Schüttelinkubator bebrütet wurden.

Versuchskulturen wurden angelegt, indem von der Bakteriensuspension aus den

Vorkulturen so viel in Erlenmeyerkolben mit etwa 20 ml des entsprechenden

Mediums überführt wurde, dass die Ausgangsdichte der Versuchskulturen bei 650

nm (OD650) 0,1 betrug. Je nach Fragestellung erfolgte eine Bebrütung im

Schüttelinkubator bei 37 °C bis zu einer OD650 von 1,0 oder 0,5.

3.1.3. Bestimmung der Keimzahl Die Bakterienzelldichte erfolgte durch die Messung der optischen Dichte von

Flüssigkulturen bei 650 nm im Photometer. Die anschließende Keimzahlbestimmung

pro ml Bakteriensuspension erfolgte anhand einer für die jeweilige Bakteriespezies

angelegten Eichkurve. Als Leerwert wurde unbeimpftes Medium eingesetzt.

3.1.4. Kulturkonservierung Von allen verwendeten Bakterienstämmen wurden Tiefgefrierstammkulturen

angelegt. Dazu wurde das Koloniematerial von über Nacht bewachsenen Agarplatten

in 1 ml LB-Medium mit 10% Glycerin-Zusatz eingerieben. Diese Stammkulturen

wurden bei – 70 °C konserviert und dienten als Ausgangsmaterial zur Anzucht der

Stämme.

Page 39: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Material und Methoden 39

3.1.5. Charakterisierung der Motilität 3.1.5.1. Motilitätstest auf Swimming-Agar

Unter Swimming versteht man die Fähigkeit von Bakterien, sich mit Hilfe von

Flagellen fortzubewegen. Die unterschiedlichen Morphotypen (WT, SCV und SCV

mit pvrR-Vektor) wurden 24 bis 48 Stunden auf Columbia-Blutagar (WT, SCV),

beziehungsweise LB-Agar mit Carbenicillin als Antibiotikazusatz (SCV mit pvrR-

Vektor) bei 37 °C kultiviert. Mit Hilfe eines sterilen Zahnstochers wurde etwas

Koloniematerial von der Agarplatte genommen und punktförmig auf die Oberfläche

des Swimming-Agars (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 0,3% Bitek-Agar)

gegeben. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C. Die Ausdehnung der einzelnen Stämme

wurde durch die Messung des Durchmessers des Bakterienrasens nach 24 und 48

Stunden bestimmt.

3.1.5.2. Motilitätstest auf Twitching-Agar

Unter Twitching versteht man die Fähigkeit von Bakterien, sich mit Hilfe von Pili an

Oberflächen vorwärts zu bewegen. Das Twitching-Vermögen der unterschiedlichen

Morphotypen wurde auf 1%igem Agar (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl,

1% Bitek-Agar) getestet. Dabei erfolgte die Vorbereitung wie beim Swimming-

Motilitätstest. Allerdings wurde beim Twitching-Test das Koloniematerial mit dem

sterilen Zahnstocher durch den Agar auf die Platte inokuliert. Die Bebrütung erfolgte

bei 37 °C. Hatten die Bakterien ein Twitching-Vermögen, konnte dies als kreisförmige

Ausdehnung der Bakterien zwischen Agar und Boden der Petrischale festgestellt

werden. Diese Ausdehnung wurde durch Messung des Durchmessers nach 24 und

48 Stunden quantifiziert.

3.1.6. Methoden zur Bestimmung von Typ III Sekretionssystem-Proteinen im Überstand von Bakteriensuspensionen Zum Nachweis der aktiven Typ III Sekretion erfolgte eine Untersuchung der

Bakteriensuspensionen, bzw. der zellfreien Überstände auf das Vorhandensein der

einzelnen Effektor- und Translokatorproteine des Sekretionsapparats. Hierzu erfolgte

zunächst die Auftrennung der bakteriellen Proteine durch eine Polyacrylamid-

Page 40: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Material und Methoden 40

Gelelektrophorese (SDS-Page) und anschließend eine Sichtbarmachung der Banden

entweder mittels Silbernitrat-Färbung oder Western Blot mit spezifischen Antikörpern

gegen ExoS und PcrV (J. Heesemann, Max von Pettenkofer-Institut, München).

3.1.6.1. Vorbereitung der Proben

Die Proben wurden aus Versuchskulturen, die in den Zytotoxizitäts-Assays

eingesetzt werden sollten, entnommen. Von allen Bakteriensuspensionen wurde 1 ml

bei einer OD650 von 1,0 entnommen. Diese Proben wurden auf ein Volumen von 50

µl konzentriert (SpeedVac Concentrator, Fa. Savant) und anschließend mit

Probenpuffer (SDS; 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8; 50% Glycerin, Bromphenolblau; β-

Mercaptoethanol) versetzt und für 10 min aufgekocht. Anschließend waren die

Proben einsatzbereit.

3.1.6.2. SDS-Page

Die Auftrennung der Proteine erfolgte mit 12%igen Polyacrylamid-Gelen. Zunächst

wurden die Lösungen für das Trenngel (30% Acrylamid; 1,5 M Tris-HCl pH 8,0; 10%

SDS; Aqua dest.; Temed und 10% Ammoniumpersulfat) in entsprechender Menge

zusammenpipettiert und in die Gelkammer gefüllt. Um eine glatte Oberfläche zu

erhalten, wurde das Trenngel mit Butanol überschichtet. Nach einer

Polymerisationszeit von etwa 30 min wurde das Butanol abgespült, die Lösungen für

das Sammelgel (30% Acrylamid; 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8; 10% SDS; Aqua dest.;

Temed; 10% Ammoniumpersulfat) zusammenpipettiert und ebenfalls in die

Gelkammer auf das Trenngel gegeben. In das Sammelgel wurde ein Kamm für die

Geltaschen gesteckt. Nach einer erneuten Polymerisationszeit von etwa 30 min war

das Gel einsatzbereit. Von den vorbereiteten Proben wurden jeweils 15 µl in die

Geltaschen gefüllt, als Proteinstandard wurde der BENCHMARKTM Prestained

Protein Ladder der Fa. GIBCO BRL verwendet. Die Gelelektrophorese erfolgte in der

Gelkammer der Fa. Biometra zunächst bei 100 V. Nach dem Übertritt der Proben aus

dem Sammelgel in das Trenngel wurde die Voltzahl auf 150 erhöht. Die Dauer der

Elektrophorese betrug etwa 3 h. Nach der Elektrophorese erfolgte eine

Sichtbarmachung der Banden mittels Silbernitrat-Färbung oder Western Blot.

Page 41: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Material und Methoden 41

3.1.6.3. Silbernitrat-Färbung

Die Färbung der SDS-Gele erfolgte nach einem Protokoll von HAUKESHAVEN u.

DAMIK von 1986. Zunächst wurden die Gele in einem Fixierer (Ethanol 30%,

Essigsäure 10%, Aqua bidest.) für 15 min fixiert. Anschließend erfolgte für 15 min

eine Inkubation in Lösung II (Ethanol 30%, Na-Acetat 0,5 M, Glutaraldehyd 0,5%,

Na-Thiosulfat 0,2%, Aqua bidest.), dann wurde 3 mal für 10 min mit Aqua bidest.

gewaschen. Danach erfolgte eine Inkubation mit 0,1%iger Silbernitrat-Lösung, der

Formaldehyd (0,01%) beigegeben war. Hierauf folgte eine Inkubation mit Na-

Carbonat-Lösung (2,5%), dem ebenfalls Formaldehyd (0,01%) beigegeben wurde.

Die Proteinbanden wurden innerhalb von 5 bis 10 min sichtbar. Nach Erreichen der

erwünschten Färbeintensität wurde der Prozess mit 0,05 M EDTA-Lösung

abgestoppt.

3.1.6.4. Western Blot

Nach erfolgter Gelelektrophorese wurde das Gel zunächst in Blotpuffer (48 mM Tris,

39 mM Glycin, Aqua bidest.) aufgenommen. In die Blotkammer wurde zunächst ein

Stück Filterpapier gelegt, das zuvor mit Blotpuffer angefeuchtet wurde. Dieses

Filterpapier sollte an allen Seiten etwa 1 cm größer sein als das Gel. Auf dieses

Filterpapier wurde ein, ebenfalls in Blotpuffer angefeuchtet, Streifen Nitrozellulose

gelegt, dessen Größe der des Gels entsprach. Auf diese Nitrozellulose wurde das

Gel gelegt und obenauf kam ein weiteres Stück in Blotpuffer angefeuchtetes

Filterpapier. Danach wurde die Blotkammer geschlossen und der Blotvorgang

gestartet. Geblottet wurde für 1,5 h bei 140 mA (für ein Gel mit 8,5 x 8,0 cm). Im

Anschluss an den Blotvorgang wurde der Nitrozellulose-Streifen in 3%iger

Magermilch für mindestens 1 h oder ÜN abgesättigt. Danach wurde der

Nitrozellulose-Streifen mit Aqua bidest. abgespült und in 1%ige Magermilch überführt

und die entsprechenden Primär-Antikörper (Kaninchen-Antikörper Anti-ExoS, Anti-

PcrV) zugegeben. Dieser Ansatz wurde dann für 1,5 bis 2 h auf einem Schüttler

(Vari-Mix, Fa. Thermolyne) inkubiert. Anschließend wurde der Nitrozellulose-Streifen

erneut mit Aqua bidest. abgespült und dann in 1%ige Magermilch mit dem

entsprechenden Sekundär-Antikörper (α-Rabbit-Peroxidase) gegeben. Nach einer

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Material und Methoden 42

weiteren Inkubationszeit von 1 h erfolgte eine Chemolumineszenz-Entwicklung mit

dem Lumi-Light Western Blotting Substrate der Fa. ROCHE BIOCHEMICALS. Dazu

wurde der Nitrozellulose-Streifen zunächst 3 mal für 10 min mit TBS-T Puffer (0,05 M

Tris, 0,15 M NaCl, 500 µl Tween 20, ad 1000 ml Aqua bidest., pH 7,5) gewaschen,

dann mit dem Substrat für 2 min inkubiert und anschließend in Folie eingeschweißt.

In der Dunkelkammer wurde ein Röntgenfilm für 2, 5 oder 10 s belichtet und

anschließend im Röntgenfilm-Entwickler entwickelt.

Page 43: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Material und Methoden 43

3.2. Zellkultur

3.2.1. Zelllinie Für die Infektionsversuche wurden Zellen der Makrophagenzelllinie J774.A1

(adhärente Maus-Monozyten-Makrophagen) verwendet, die von der DSMZ

(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig)

stammen. Diese Makrophagenzelllinie wurde 1968 aus einem Tumor einer

weiblichen BALB/c Maus etabliert. Die Zellen synthetisieren Lysozym und Interleukin-

1 und besitzen Rezeptoren für Immunglobulin und Komplement. Gelagert wurden die

Makrophagen in Tanks mit flüssigem Stickstoff bei einer Temperatur von –196 °C.

3.2.2. Anzucht der Zellen Die Zellkulturen wurden in Dulbecco`s Modified Eagle Medium (DMEM; Fa. Biochrom

AG) unter Zusatz von 10% fötalem Kälberserum (FCS) in Zellkulturflaschen bei einer

Temperatur von 37 °C mit 5% CO2 im Brutschrank angezüchtet etwa 8 bis 10

Wochen in Kultur gehalten. Alle 3 bis 4 Tage wurden die Zellen in eine neue

Zellkulturflasche überführt und mit frischem Nährmedium versetzt. Nach 8 bis 10

Wochen wurde die Kultur aufgegeben und eine frische Kultur von den im

Stickstofftank gelagerten Zellen angesetzt. Für die Infektionsversuche wurden die

Makrophagen in Zellkulturplatten (24 wells) 24 Stunden vor Versuchsbeginn

ausgesät.

3.2.3. Einfrieren und Auftauen der Zellen Frische Zellen von der DSMZ wurden nach 3 bis 4 Tagen in Kultur zur Konservierung

eingefroren. Hierzu wurden die Zellen vom Boden der Zellkulturflaschen gelöst (siehe

3.3.4.), in ein Falcon-Röhrchen überführt und anschließend 10 min bei 150 g (1000

rpm in einer Minifuge 2, Heraeus) zentrifugiert. Der zellfreie Überstand wurde

abgenommen, das Zellpellet tröpfchenweise in Einfriermedium (DMEM mit 10%

Dimethylsulfoxid, DMSO) aufgenommen und vorsichtig resuspendiert. In

Einfriergefäße (Nunc, Roskilde, Dänemark) wurde jeweils 1 ml der Zellsuspension

pipettiert. Die Einfriergefäße mit der Zellsuspension wurde anschließend zunächst

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Material und Methoden 44

bei –70 °C eingefroren und nach einer Auftaukontrolle (Sterilkontrolle) nach 3 bis 4

Tagen in Tanks mit flüssigem Stickstoff überführt und bei –196 °C gelagert.

Um die Makrophagen aufzutauen, wurden die Einfriergefäße aus dem Stickstofftank

für etwa 5 min in ein Wasserbad (37 °C) überführt, anschließend in DMEM mit 10%

FCS in einer Zellkulturflasche aufgenommen und bei 37 °C im Brutschrank mit 5%

CO2 wie oben beschrieben angezüchtet.

3.2.4. Lösen der Zellen Das Lösen der adhärenten Zellen vom Boden der Zellkulturflaschen nach Abnahme

des Nährmediums erfolgte mittels Zellschaber.

3.2.5. Ermittlung der Zellzahl Zur Ermittlung der genauen Zellzahl wurde aus der zu bestimmende Zellsuspension,

gewonnen durch Lösen der Zellen vom Boden der Zellkulturflasche, ein kleiner Teil in

0,4%iger Tryptan-Blau-Lösung verdünnt (1:5), suspendiert und auf eine Neubauer-

Zählkammer (4 Felder zu je 16 Quadrate mit einem mm2) pipettiert. Unter dem

Mikroskop wurden die nicht gefärbten Zellen ausgezählt. Zellen, die sich mit

Tryptanblau angefärbt hatten, waren nicht mehr vital und wurden deshalb nicht

mitgezählt.

Folgende Formel diente zur Berechnung der Zellzahl:

Zellzahl in 64 Quadraten x 1000

Zellen / ml = -----------------------------------------------------------------------

Höhe der Zählkammer x Fläche x Verdünnung x 64

Vereinfachte Formel:

Zellzahl x Verdünnungsfaktor

Zellzahl x 104 / ml = --------------------------------------------

Zahl der Großquadrate

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Material und Methoden 45

3.2.6. Zytotoxizitäts-Assay

3.2.6.1. Versuchsprinzip

Im Zytotoxizitäts-Assay sollte die Typ III Sekretions-bedingte Zytotoxizität von P.

aeruginosa SCVs im Vergleich zu ihren klonalen Wildtyp-Phänotypen getestet

werden. Hierzu wurden Makrophagen der Zelllinie J774.A1 mit den unterschiedlichen

P. aeruginosa Isolaten infiziert. Die Freisetzung des Enzyms Laktat-Dehydrogenase

(LDH) diente dabei als Maß der Zytotoxizität. LDH ist ein zytosolisches Enzym, das

ubiquitär in allen Zellen in relativ hoher Konzentration vorkommt. Bei intakter

Zellmembran kann es nicht in die Umgebung der Zellen gelangen. Zelltod ist

assoziiert mit Zerstörung der Zellmembran, wodurch LDH in die Umgebung der

Zellen und damit in den Überstand des Mediums gelangt. Bei der Typ III Sekretion

werden durch die Translokatorproteine des Sekretionsapparats Poren in der

Wirtszellmembran gebildet, durch die LDH ebenfalls in die Umgebung gelangen

kann. Das heißt, LDH kann als Indikator für eine Zellschädigung verwendet werden,

auch wenn mikroskopisch noch keine Zerstörung der Zelle sichtbar ist.

Der LDH-Anstieg im Überstand kann mittels des „Cytotoxicity Detection Kit“ der

Firma ROCHE BIOCHEMICALS qualitativ und quantitativ bestimmt werden:

Laktat Pyruvat

Abb. 4

Formazan (rot) Tetrazolium-Salz (schwach gelb) Abb. 4: Prinzip der Substratumsetzung in Zytotoxizitäts-Assay (aus d. Anleitung d.

Firma Roche)

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Material und Methoden 46

Das Testprinzip beruht auf einfachen Redox-Reaktionen, wie sie in Abb. 4 gezeigt

sind. Im ersten Schritt wird Laktat durch LDH zu Pyruvat oxidiert, wobei NAD+ zu

NADH+H+ reduziert wird. In einem zweiten Schritt wird NAD+ regeneriert (Oxidation),

indem die H+-Ionen auf das Tetrazolium-Salz übertragen werden, wodurch das

farbige Formazan entsteht (Reduktion). Dabei korreliert die Menge des umgesetzten

Formazans direkt mit der Menge an freigesetztem LDH. Das heißt, die Farbintensität

ist direkt proportional zur Zelllyse.

3.2.6.2. Durchführung des Assays

Die Zellen wurden 24 Stunden vor Versuchsbeginn mit einer Zelldichte von 5 x 105

Zellen in 300 µl DMEM pro well in 24-well-Platten ausgesät und bei 37 °C im

Brutschrank mit 5% CO2 inkubiert. Koloniematerial aus 3 bis 5 Kolonien von P.

aeruginosa wurden 24 Stunden vor Versuchsbeginn von Blutplatten genommen und

in 5 ml LB-Medium bei 37 °C und 150 rpm im Schüttelinkubator inkubiert. Etwa 6

Stunden vor Versuchsbeginn wurden aus diesen Vorkulturen Versuchskulturen

angeimpft, indem so viel Bakteriensuspension aus den Vorkulturen in

Erlenmeyerkolben mit 20 ml LB-Medium überführt wurde, dass eine optische Dichte

bei 650 nm (OD650) von 0,1 erreicht wurde. Diese Versuchskulturen wurden erneut

bei 37 °C und 150 rpm im Schüttelinkubator inkubiert bis zu einer OD650 von 1,0.

Dann wurde die Bakteriendichte auf 5 x 106 Bakterien pro 300 µl DMEM eingestellt.

Pro Bakterienstamm wurden 3 wells infiziert. Hierzu wurde das alte Medium

vollständig abpipettiert und durch das neue, bakterienhaltige Medium ersetzt.

Gleichzeitig wurde in 3 wells nur das alte Medium gegen neues, bakterienfreies

Medium als Negativkontrolle ersetzt. Als Positivkontrolle wurden 3 wells mit

0,25%igem Triton X-100 versetzt zur vollständigen Lyse der Zellen. Für die Dauer

des Versuchs wurde der Ansatz bei 37 °C und 5% CO2 bebrütet. Nach 1, 2, 3, 4 und

gegebenenfalls 5 Stunden wurden jeweils 30 µl des Überstands pro well

abgenommen und in eine 96-well-Platte überführt. Nach der letzten Probennahme

wurden diese Überstände mit dem „Cytotoxicity Detection Kit“ der Firma ROCHE

BIOCHEMICALS für eine halbe Stunde inkubiert, wobei es je nach freigesetzter und

demnach durch den Testkit umgesetzter LDH-Menge zu einer unterschiedlichen

Page 47: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Material und Methoden 47

Farbabstufung kam (vergleiche Testprinzip 3.2.6.1.). Die Auswertung erfolgte im

ELISA-Reader (Titertek Multiskan MCC/340, Fa. Flow Laboratories GmbH) bei einer

Wellenlänge von 492 nm. Der Wert der Triton X-100 Positivkontrolle diente dabei als

Maß für 100% Zytotoxizität, d.h. maximale LDH-Freisetzung. Die Werte der

unterschiedlichen P. aeruginosa -Stämme wurden hierzu ins Verhältnis gesetzt.

Dabei wurde von allen Werten der Basiswert an LDH-Freisetzung aus den

uninfizierten wells abgezogen.

Abb. 5

_______________

Stamm 8226

_______________

Stamm 20265

V Infektions-

dauer

unin Abb. 5: Beispielhafte min Inkubation mit demit dem ELISA-Reader

der Triton-Kontrolle ins

_________________

SC

____________________

____________________

Basis fizierte Zellen Zelll

Darstellung der Auswem Substrat des Testkit gemessen und die Wer

Verhältnis gesetzt.

___________________

WT

______________________

1,5 h 3 h 4,5 h

______________________

1,5 h 3 h 4,5 h

max. LDH yse mit Triton X-100

rtung des Zytotoxizitäts-Assays nach 30 s. Die unterschiedliche Farbintensität wurde

te von WT und SCV wurden zu den Werten

_______________________________

Page 48: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Material und Methoden 48

3.3. Mausmodell

3.3.1. Versuchstiere Die in dieser Studie verwendeten Mausstämme wurden von Charles River Wiga

bezogen. Es handelte sich dabei um 8 bis 10 Wochen alte, weibliche Tiere des

Stammes BALB/c (H-2d Haplotyp, Bcg/Tty/Lshs Phänotyp).

3.3.2. Infektion der Mäuse Vor der Infektion wurden alle Tiere jeweils mit 100µl einer Lösung aus 0,1%

Xylazinhydrochlorid und 1% Ketaminhydrochlorid in 0,9% NaCl narkotisiert. Jeweils

4 Tiere pro Bakterienstamm wurden bei jedem Experiment mit der gleichen Dosis

von 1 x 108 Bakterien in PBS infiziert. Die intranasale Infektion wurde mit einem

Volumen von 30 µl in beide Nasenlöcher durchgeführt. Nach der Infektion wurden die

Tiergruppen getrennt in Käfige gelegt, die mit Filterdeckel abgedichtet wurden. Zur

Bestimmung der tatsächlich eingesetzten Dosis wurde die CFU von Aliquots

mehrerer Verdünnungen der Infektionslösung nach 24 Stunden bei 37 °C

ausgewertet.

3.3.3. Verlaufsuntersuchungen der Infektion Der Krankheitsverlauf der Mäuse wurde täglich mindestens einmal kontrolliert und

protokolliert. Dabei wurde besonderes Augenmerk auf eventuelle Gewichtsreduktion

gelegt. Hierzu wurden die einzelnen Mäuse markiert und das Gewicht täglich

bestimmt. Des weiteren wurden eventuelle Dyspnoe, Konjunktivitis und das

Verhalten (Vitalität, Sozialverhalten, Nestbau) der Tiere, sowie die Mortalität

protokolliert. Die Mortalität wurde in Kaplan-Meyer-Überlebenskurven graphisch

dargestellt und mittels Kaplan-Meyer-Survival-Statistiken mit dem Programm SPSS

7.0 auf signifikante Unterschiede in den verglichenen Tiergruppen überprüft.

3.3.4. Keimzahlbestimmung in Organen infizierter Mäuse Bei einem Teil der infizierten Tiere wurden Keimzahlbestimmungen aus Lunge, Leber

und Milz durchgeführt. Dazu wurden die Tiere unmittelbar vor der Sektion mit CO2 in

Page 49: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Material und Methoden 49

einem verschlossenen Becherglas getötet. Nach Fixierung auf einem Styroporbrett

und oberflächlicher Desinfektion mit 70% Ethanol wurden die benötigten Organe

entnommen, gewogen und in ein definiertes Volumen sterile Tergitollösung (Lunge

und Milz 500µl, Leber 1000 µl) aufgenommen. Nach steriler Homogenisierung

(Homogenisator: Ultra-Turrax T8, Fa. IKA Labortechnik) wurde von jeder

Organsuspension eine Verdünnungsreihe in PBS hergestellt, die jeweils doppelt aus

Müller-Hinton-Platten ausplattiert wurden. Die tatsächlichen Keimzahlen in den

Organen wurden aus der Anzahl der auf den Agarplatten nach 24 Stunden bei 37 °C

gewachsenen Kolonien unter Einbeziehung des Organgewichts, der Tergitol-Menge

und der Verdünnungsstufe berechnet. Zur statistischen Bewertung der ermittelten

Unterschiede in den Mittelwerten der einzelnen Gruppen wurde ein t-Test mit Hilfe

von SigmaStat 2.0 durchgeführt.

3.3.5. Histopathologische Diagnostik an Lunge und Nasopharynx infizierter Tiere Die Sektion der Tiere erfolgte wie unter 3.4.4. beschrieben. Die Lungen wurden

entnommen und nach Tiergruppen getrennt (SCV, WT, ggf. SCVexsA) in 4%

Formalin gelegt und für mindestens 4 h fixiert. Danach wurden die Lungenlappen

getrennt (rechte Lunge 4 Lappen; linke Lunge 1 Lappen) und in Einbettkapseln

gegeben. Dabei wurde für rechte und linke Lunge jeweils eine Einbettkapsel

verwendet. Die Einbettkapseln wurden in 60% Ethanol gelegt. Die Köpfe wurden im

Bereich der ersten Halswirbel vom Rumpf getrennt, das Fell vollständig entfernt und

dann ebenfalls nach Tiergruppen getrennt in 4% Formalin gelegt und für mindestens

4 h fixiert. Danach wurden die Schädel zum Entkalken für mindestens 5 h in

Dekalzifizierer gelegt. Anschließend war es möglich, Querschnitte durch die Nase

von 2 bis 3 mm Dicke durchzuführen. Pro Schädel wurden 4 Querschnitte angelegt.

Die 4 Querschnitte wurden in eine Einbettkapsel überführt und in 60% Ethanol

gelegt. Die weitere Bearbeitung der Organe (Anfertigen der Schnitte und HE-

Färbung) erfolgte in Kooperation mit Prof. K. Kamino (Institut für Pathologie der

Medizinischen Hochschule Hannover). Die gefärbten Präparate wurden

mikroskopisch bei unterschiedlichen Vergrößerungen (x200 bis x1000) beurteilt.

Page 50: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Material und Methoden 50

3.4. Arbeiten mit Caenorhabditis elegans

3.4.1. Versuchstiere Die in dieser Studie verwendeten Würmer wurden freundlicherweise vom

Caenorhabditis Genetics Center (CGC), University of Minnesota, St. Paul, USA

bezogen. Es handelte sich ausschließlich um selbstbefruchtende Hermaphroditen.

Verwendet wurde der C. elegans N2 Bristol Wildtyp-Stamm, DR Subklon von CB

Original (Tc1 pattern I).

3.4.2. Kulturerhaltung Sowohl der N2-Wildtypstamm als auch die verwendeten Wurmmutanten wurden auf

mit E. coli bewachsenen NGM (Nematode Growth Medium)-Agarplatten bei 20 °C im

Nematodenschrank (Chromatographieschrank 2023, Mini Cold Lab, Fa. Pharmacia)

kultiviert. Etwa alle fünf Tagen mussten die Würmer auf neue Platten umgesetzt

werden. Hierzu wurde mit Hilfe eines sterilen Skalpells ein kleines, gut mit C. elegans

besiedeltes Agarstück aus der alten Platte herausgeschnitten und auf die neue

Platte übersetzt. Die Umsetzfrequenz wurde auf ein bis zwei Tage reduziert für

Würmer, die zu Eipräparationen dienen sollten, um eine möglichst große Ausbeute

an adulten Würmern und Eiern zu haben. Würmer, die auf Stockplatten nur zur

Erhaltung dienten, konnten auch einige Wochen aufbewahrt werden. Etwa alle sechs

Monate wurden neue Würmer vom CGC bestellt.

3.4.3. Herstellung der bakteriellen Nahrungsquelle Als Nahrungsquelle für C. elegans wurden sowohl NGM-Agarplatten mit E. coli OP50

(Futterplatten) als auch E. coli OP50-Pellets für Eipräparationen verwendet.

3.4.3.1. Futterplatten

Der verwendete E. coli OP50–Stamm wurde auf Columbia-Blutagar mit 5% Schafblut

angezüchtet. Zur Beimpfung der NGM-Platten wurde zunächst eine Vorkultur

angelegt, indem Koloniematerial von E. coli OP50 mittels eines sterilen Zahnstochers

in 5 ml LB-Medium überführt wurde und etwa 6 Stunden bei 37 °C im

Page 51: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Material und Methoden 51

Schüttelinkubator inkubiert wurde. Danach wurden jeweils 100 µl der

Bakteriensuspension mit einem Drigalskispatel auf den NGM-Platten ausplattiert. Die

Inkubation der Platten erfolgte bei 37 °C über 24 Stunden, die anschließende

Lagerung bei 20 °C im Nematodenschrank.

3.4.3.2. Pellets für Eipräparation

Von einer E. coli OP50-Vorkultur wurden jeweils 100 µl in 4 x 250 ml frisches LB-

Medium in großen Erlenmeyerkolben gegeben und diese für 24 Stunden bei 37 °C im

Schüttelinkubator inkubiert. Die Bakteriensuspensionen wurden anschließend für 25

min bei 4 °C und 3000 g in der Beckmann-Zentrifuge abzentrifugiert. Der Überstand

wurde abgegossen und die Pellets in einem 50 ml Falcontube gesammelt. Es folgte

eine Hitzeinaktivierung für 10 min bei 70 °C. Die Lagerung erfolgte bei 4 °C. Alle drei

bis vier Monate wurde dieses Futter ausgetauscht.

3.4.4. Eipräparation Für die Versuche sollten Würmer eines Entwicklungsstadiums verwendet werden.

Dazu war es nötig, zunächst die Population in ihrer Entwicklung zu synchronisieren.

Dies wurde mit Hilfe von Eipräparationen erreicht.

Zur Präparation waren NGM-Platten mit einer möglichst großen Zahl von Eiern und

graviden Hermaphroditen nötig. Es hat sich herausgestellt, dass dieses Ziel

zuverlässig erreicht wurde, wenn Würmer drei und einen Tag vor der Eipräparation

auf neue Futterplatten umgesetzt wurden. Diese Platten wurden mit sterilem Aqua

dest. gespült, indem das Wasser mehrmals über die Platten pipettiert wurde. Die

Flüssigkeit mit den heruntergespülten Eiern und Würmern wurde in einem 15 ml

Falcontube gesammelt, wobei das Volumen mindestens 3,5 ml betragen musste.

Falls nötig, wurde mit sterilem Aqua dest. aufgefüllt. Ein Gemisch aus 600 µl sterilem

Aqua dest. 500 µl Natriumhypochlorit (12%) und 400 µl 5 M NaOH wurde hinzugefügt

und gut vermischt. Die Würmer wurden über einen Zeitraum von 10 min vollständig

aufgelöst, wobei etwa alle 2 min gut geschüttelt wurde. Die in der Flüssigkeit

zurückgebliebenen Eier wurden gewaschen, indem sie für 30 s bei 1157 g in der

Minifuge RF zentrifugiert wurden. Die überstehende Flüssigkeit wurde bis auf etwa

Page 52: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Material und Methoden 52

100 µl verworfen, bevor wieder mit sterilem Aqua dest. auf das ursprüngliche

Volumen aufgefüllt wurde. Nach Wiederholung des Waschvorgangs wurden die

abzentrifugierten Eier in etwa 30 ml M9-Puffer in einen 100 ml Erlenmeyerkolben

überführt. Dazu kam eine Spatelspitze konzentrierte E. coli OP50-Pellets als

Nahrungsquelle für die schlüpfenden C. elegans -Larven. Die Eipräparation wurde im

Nematodenschrank bei 20 °C auf einem Schüttler bei 80 rpm gehalten. Nach etwa 3

Tagen hatten sich die Larven bis zum L4-Larvenstadium entwickelt, die dann für die

Versuche eingesetzt wurden.

3.4.5. Infektionsmodelle

3.4.5.1. Slowkilling

Die in diesem Modell (TAN et al., 1999a) zu untersuchenden Bakterienstämme

wurden zunächst auf Columbia-Blutagar mit 5% Schafblut bei 37 °C angezüchtet.

Anschließend wurden Vorkulturen hergestellt, indem Koloniematerial mit einem

sterilen Zahnstocher in 5 ml LB-Medium in Capsenberg-Reagenzgläser gegeben

wurde. Die Inkubation erfolgte im Schüttelinkubator bei 37 °C und 150 rpm über

Nacht. Dann wurde die OD650 bestimmt und die Bakterienzelldichte anhand einer

Eichgerade errechnet. Die Suspension wurde soweit mit LB-Medium verdünnt, dass

eine Bakterienkonzentration von etwa 1,5 x 104 Bakterien/ml erreicht wurde. Mit

jeweils 100 µl davon wurden die Slowkilling – Platten (mod. Nematode Growth

Medium: 0,3% Pepton, 0,3% NaCl, 1,7% Bitek-Agar; Zusätze siehe Anhang 8.4., S

167) beimpft und mittels Drigalskispatel gleichmäßig verteilt. Bei jedem Ansatz wurde

E. coli OP50 als Negativkontrolle eingesetzt. Die Platten wurden ÜN bei 37 °C

bebrütet. Vor Versuchsbeginn wurden die Platten noch für ein bis zwei Stunden bei

Raumtemperatur gelagert, bevor die mit Würmern besetzt wurden. Pro Platte wurde

ein Aliquot, das etwa 50 bis 60 Würmer enthielt, aus einer Eipräparation pipettiert.

Danach wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten die Anzahl der toten Würmer im

Verhältnis zur Gesamtzahl bestimmt. Alle Versuche wurden bei Raumtemperatur

durchgeführt.

Page 53: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Material und Methoden 53

3.4.5.2. Fastkilling

Der Fastkilling - Assay erfolgte analog zum Slowkilling – Assay (TAN et al., 1999b).

Abweichend wurde ein höher osmolares Medium, nämlich PGS-Agar (Pepton

Glucose Sorbitol: 1% Bactopepton, 1% NaCl, 1% Glukose, 0,15 M Sorbitol, 1,7%

Bactoagar; Zusätze siehe Anhang 8.4., S. 167) eingesetzt.

3.4.5.3. Killing in Flüssigkultur

Zunächst wurden die zu untersuchenden Bakterienstämme auf Columbia-Blutagar

mit 5% Schafblut oder entsprechend antibiotikahaltigen LB-Agarplatten bei 37 °C

angezüchtet. Anschließend wurden Vorkulturen hergestellt, indem Koloniematerial

mit einem sterilen Zahnstocher in 5 ml Vogel-Bonner-Medium (normal oder Calcium-

depletiert, Zusammensetzung siehe Anhang 8.4.) in Capsenberg-Reagenzgläser

gegeben wurde. Die Inkubation erfolgte im Schüttelinkubator bei 37 °C und 150 rpm

über Nacht. Aus diesen Vorkulturen wurden Versuchskulturen angeimpft, indem so

viel Bakteriensuspension aus der Vorkultur in 100 ml -Erlenmeyerkolben mit 20 ml

Vogel-Bonner-Medium überführt wurde, das eine OD650 von 0,05 vorhanden war.

Diese Versuchskulturen wurden bei 37 °C und 150 rpm im Schüttelinkubator

inkubiert, bis die Bakterien eine optische Dichte von 0,5 oder 1,0 erreicht hatten. In

24-well-Platten wurden jeweils 3 wells pro Bakterienstamm mit 1 ml

Bakteriensuspension bestückt und etwa 50 L4-Larven einer Eipräparation

zugegeben. Danach wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten die Anzahl der toten

Würmer im Verhältnis zur Gesamtzahl bestimmt. Zwischen den Zählzeitpunkten

wurden die 24-well-Platten im Wurmschrank auf einem Schüttler (Rocky, Fa. LTF

Labortechnik) mit etwa 30 rpm geschüttelt. Für die Untersuchung der Virulenz von

hitzeinaktivierten Bakterien wurden die Bakteriensuspensionen für 10 min bei 70 °C

inaktiviert. Danach wurden die Bakterien bei Raumtemperatur stehen gelassen, bis

sie abgekühlt waren. Zur Untersuchung von Kulturüberständen wurden die Bakterien

entweder sterilfiltriert oder für 10 min bei 3214 g zentrifugiert. Hitzeinaktivierte

Bakterien und Überstände wurden wie die Bakteriensuspensionen jeweils in

Dreifach-Ansätzen zu je 1 ml in 24-well-Platten gegeben und L4-Larven zugegeben.

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Material und Methoden 54

3.5. Molekularbiologische Arbeiten

3.5.1. Materialien

a.) Molekularbiologische Fertigprodukte

Mini-Plasmidpräparation Kit: NucleoSpin® Plasmid, Fa. Machery- Nagel (MN)

DNeasy Tissue Kit® zur Präparation genomischer DNA, Fa. Qiagen

b.) Molekulargewichtsstandards und Enzyme

1 kb DNA Leiter, New England Biolabs

Pst I, New England Biolabs

Taq-DNA-Polymerase, Sigma

c.) Vektoren

pED202: pUCP19::pvrR

ca. 3,5 kb Pst I Fragment aus P. aeruginosa PA 14

Carbenicillin-Resistenz (Cbr)

(DRENKARD u. AUSUBEL, 2002)

d.) Primer für PCR (MWG Biotech)

pvrR (AF482691): pvr2_f 5’-CCGGAAACCGACGAGACTCC-3’

pvr2_r 5’-GCTGCATTGAGGCCGTTATCC-3’

(Fragmentlänge 597 bp; Schmelztemperatur 60 °C)

3.5.2. Molekularbiologische Methoden

3.5.2.1. Übertragung von DNA durch Elektroporation

Zur Übertragung von Plasmid-DNA wurde ein Protokoll von ENDERLE et al. (1998)

verwendet. Dazu wurden P. aeruginosa SCVs so mit einem Impfspatel auf LB-Agar-

Platten ausplattiert, dass sie nach 24 h Inkubation bei 37 °C einen konfluenten

Page 55: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Material und Methoden 55

Rasen bildeten. Von der Hälfte einer bewachsenen Platte wurden die Zellen mit einer

Impföse abgelöst und in 1 ml Aqua bidest. resuspendiert. Alternativ konnten auch 2

ml einer Flüssigkultur verwendet werden, aus der die Zellen mit 13000 g

abzentrifugiert und anschließend in Aqua bidest. aufgenommen wurden. Diese

Zellsuspension wurde wiederholt für jeweils 3 min bei 13000 g mit Aqua bidest.

gewaschen. Erst wenn keine helle Schicht (vermutlich Exopolysaccharid und

Zelltrümmer) mehr auf dem Zellpellet zu sehen war und der Zellüberstand keine

Färbung mehr aufwies, wurden die Zellen in 200 µl Aqua bidest. resuspendiert und

auf Eis gestellt.

Jeweils 90 µl Zellsuspension wurden mit maximal 10 µl DNA-Lösung (Konzentration

40 ng/µl) versetzt und in vorgekühlte Elektroporationsküvetten überführt (Elektroden-

Abstand 0,2 cm; Biorad). Dabei wurde darauf geachtet, dass sich am Grund der

Küvette keine Luftblasen bildeten. Anschließend wurden die Zellen in einem Gene

Pulser II (Biorad) bei 2,5 kV und 25 µF sowie 400 Ω elektroporiert. Die Zeitkonstante

für die Entladung sollte optimalerweise 5 ms betragen. Nach der Elektroporation

wurden die Zellen sofort mit 1 ml LB-Medium versetzt und in ein 1,5 ml

Reaktionsgefäß überführt. Danach erfolgte eine Inkubation für 3 h im Heizblock bei

37 °C. Anschließend wurden die Zellen auf LB-Platten mit Antibiotikum ausplattiert

und mindestens 16 h bei 37 °C inkubiert. Die Elektroporationsküvetten konnten

wiederverwendet werden, nachdem sie gut mit Aqua bidest. gespült und mit 70 %

(v/v) Ethanol gefüllt in einem Trockenschrank bei 80 °C getrocknet worden waren.

3.5.2.2. Mini-Plasmidpräparation

Die Mini-Plasmidpräparation wurde nach Anweisung des Herstellers (Fa. Machery-

Nagel) durchgeführt. Dazu wurden jeweils 5 ml einer ÜN-Kultur mit LB-Medium als

Ausgangsmaterial verwendet.

3.5.2.3. Präparation genomische DNA

Die Präparation der genomischen DNA wurde nach Anweisung des Herstellers (Fa.

Qiagen) durchgeführt. Dazu wurden jeweils 5 ml einer ÜN-Kultur mit LB-Medium als

Auisgangsmaterial verwendet.

Page 56: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Material und Methoden 56

3.5.2.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Zur qualitativen in vitro Amplifikation von DNA mit Hilfe der PCR wurden

Oligonukleotide (MWG Biotech) mit einer Anlagerungs-Temperatur von 60 °C als

Primer eingesetzt und mit Hilfe einer thermostabilen DNA-Polymerase

Sequenzabschnitte chromosomaler DNA vervielfältigt. Die beiden Primer für die

Initiierung der PCR sollten dabei möglichst folgende Charakteristika aufweisen:

annähernd gleiche Schmelzpunkte

am 3’-Ende ein Paar aus Guanosin oder Cytosin

keine hohen Homologien zu anderen Bereichen auf dem Genom

Die Schmelztemperatur Tm der Primer berechnete sich anhand der Formel

Tm= Σ (A+T) x 2 °C + Σ (G+C) x 4 °C Die optimale Anlagerungs-Temperatur wurde anschließend für das Primer-Paar

experimentell bestimmt.

Der Standard-Reaktionsansatz hatte folgende Zusammensetzung:

Ansatz 1:

2,0 µl DNA-Matrize (100 ng/µl)

0,3 µl Primer (+)-Strang (100pmol)

0,3 µl Primer (-)-Strang (100 pmol)

1,0 µl DMSO (100 %ig)

2,0 µl 10 x Reaktionspuffer (Sigma) mit 15 mM MgCl215,9 µl Aqua bidest.

Ansatz 2:

2,5 µl 8mM dNTPs (Amersham Pharmacia Biotech)

0,5 µl Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl)

0,5 µl 10 x Reaktionspuffer mit 15 mM MgCl2

Die Komponenten des Ansatzes 1 wurden auf Eis in ein Eppendorf-Reagiergefäß

(0,5 ml) pipettiert und mit 30 µl Paraffin überschichtet. Die Amplifikation erfolgte unter

Verwendung des nachfolgend beschriebenen Standard-PCR-Programms in einem

Page 57: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Material und Methoden 57

Thermocycler (Fa. Landgraf). Die Polymerase und Nukleinsäuren im Ansatz 2

wurden erst nach dem ersten Denaturierungsschritt in den Ansatz 1 eingemischt, da

sich die lange Inkubation bei hohen Temperaturen nachteilig auf deren Stabilität

auswirkt.

Reaktionsprogramm:

1. Denaturierung 10 min, 98 °C

2. Amplifikation a)Denaturierung 30 s, 98 °C

b)Anlagerung der Primer 1 min, Tm 60 °C

c) DNA-Synthese 1 min, 72 °C (Taq-Polymerase)

3. Inkubation 10 min, 72 °C

4.Aufbewahrung 4 °C

Die Anlagerungstemperatur entspricht der Schmelztemperatur Tm der verwendeten

Primer.

3.5.2.5. Agarose-Gelelektrophorese

Die elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten nach ihrem Molekulargewicht

zu analytischen Zwecken erfolgte in horizontalen Gelen mit einer Agarose-

Konzentration von 0,5 bis 1,5 % in TBE-Puffer (89 mM Tris, 89 mM H3BO3, 2 mM

EDTA, Aqua bidest., pH 8,0). Sie wurde mit einer Lauflänge von 10 cm und einer

Spannung von 80 bis 120 V durchgeführt. Die zu untersuchenden Proben mit 0,5 bis

1 µg DNA wurden mit glycerinhaltigem Laufpuffer versetzt, dessen Bromphenolanteil

gleichzeitig die Lauffront der Elektrophorese erkennen ließ. Nach der Auftrennung

wurden die Gele etwa 30 min in Ethidiumbromidlösung (2 mg/l) inkubiert. Die DNA

konnte anschließend durch Anregung des interkalierten Farbstoffs unter UV-Licht

(302 nm) sichtbar gemacht werden. Ein Größenstandard von 500 bis 104

Basenpaaren wurde grundsätzlich mitgeführt. Zur Dokumentation wurde das Easy

Enhanced Analysis System der Firma Herolab (Easy RH-3, Videokamera 429K)

verwendet.

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Ergebnisse 58

4. Ergebnisse

4.1. Charakterisierung von P. aeruginosa SCVs und dem jeweiligen klonalen WT im Zytotoxizitäts-Assay mit J774.A1-Makrophagen

4.1.1. Vergleich der Zytotoxizität der autoaggregativen SCVs mit ihrem klonalen WT Der hier verwendete Zytotoxizitäts-Assay wurde von DACHEUX et al. (1999) zur

Charakterisierung der Typ III Sekretion beschrieben. In dieser Arbeit wurde unter

anderem der P. aeruginosa -Stamm CHA eingesetzt, der auch in der genannten

Studie verwendet wurde.

In der vorliegenden Arbeit sollte mit Hilfe dieses Assays festgestellt werden, ob die

bei einer genomweiten Transkriptomanalyse festgestellte erhöhte Expression von

Typ III Sekretions-Genen bei der SCV 20265 (VON GÖTZ, 2003) eine funktionelle

Bedeutung hat und ob dieses Phänomen auch bei anderen SCVs der von

HÄUSSLER et al. (2003) beschriebenen autoaggregativen Subgruppe auftritt. Die

Zytotoxizitäts-Assays wurden mit J774.A1-Makrophagen durchgeführt. Zu

bestimmten Zeitpunkten wurde die Freisetzung von LDH aus den Zellen als Maß der

Zellschädigung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Abb. 6 A – G dargestellt.

Abb. 6

B

Zyto

toxi

zitä

t (%

LD

H)

A

Zyto

toxi

zitä

t (%

LD

H)

Zeit (h)

0 1 2 3 4

0

20

40

60

80

100 20265 WT 20265 SCV 20265 SCVexsA

Zeit (h)

0 1 2 3 4

0

20

40

60

80

100 52 WT 52 SCV

Page 59: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 59

Zyto

toxi

zitä

t (%

)

Zeit (h)

0 1 2 3 4 5

Zyto

toxi

zitä

t (%

LD

H)

0

20

40

60

80

100 8226 WT 8226 SCV

C

Zeit (h)

0 1 2 3 4 5

Zyto

toxi

zitä

t (%

LD

H)

0

20

40

60

80

100 29 WT 29 SCV

E Zy

toto

xizi

tät (

% L

DH

)

Zeit (h)

0 1 2 3 4 5

Zyto

toxi

zitä

t (%

LD

H)

0

20

40

60

80

100 17997 WT 17997 SCV

G

Abb. 6 A – G: Vergleich der Zytotoxizität vZytotoxizitäts-Assay mit J774.A1-Maktophage

D

Zeit (h)

0 1 2 3 4

0

20

40

60

80

100231 WT231 SCV

F

Zeit (h)

0 1 2 3 4 5

0

20

40

60

80

100 10 WT 10 SCV

on P. aeruginosa WT und SCV im n. Die Werte sind Mittelwerte mit

Page 60: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 60

Standardabweichungen eines repräsentativen Versuchs mit jeweils Dreifachwerten. Alle

Stämme wurden dreimal getestet. Dargestellt ist die Freisetzung von LDH als Maß der

Zytotoxizität in Abhängigkeit von der Infektionszeit. Es wurden die Stämme 20265 (A), 52

(B), 8226 (C), 231 (D), 29 (E), 10 (F) und 17997 (G) getestet. Für den Stamm 20265 wurde

zum Nachweis der Typ III Sekretions-vermittelten Zytotoxizität eine exsA-knock-out-Mutante

eingesetzt (A).

___________________________________________________________________

Aus den Graphen ist ersichtlich, dass vier der sieben autoaggregativen SCVs eine

erhöhte Zytotoxizität gegenüber dem WT aufwiesen (A, B, C und D). Die erhöhte

Expression von Typ III Genen bei 20265 SCV erwies sich als funktional. Eine

getestete Typ III-knock-out Mutante (20265 SCVexsA) zeigte keine Zytotoxizität

mehr (A). ExsA ist einer der Hauptregulatoren der Typ III Sekretion (YAHR et al.,

1995). 8226 SCV (C) zeigte im Vergleich zu den anderen drei SCVs einen deutlich

verlangsamten Anstieg der Zytotoxizität. Die WT-Phänotypen dieser vier SCVs

reagierten uneinheitlich. Während 20265 WT (A) und 52 WT (B) ebenfalls

Zytotoxizität aufwiesen, konnte dies bei 8226 (C) und 231 WT (D) nicht festgestellt

werden. Die drei verbleibenden Stämme (E, F und G) reagierten ebenfalls

uneinheitlich. Während bei 17997 weder WT noch SCV eine ausgeprägte

Zytotoxizität aufwiesen (G), war diese bei 29 (E) und 10 (F) WT gegenüber den

jeweiligen SCVs erhöht. Dabei war der Anstieg der Zytotoxizität bei 29 WT ähnlich

dem der SCVs 20265 und 52, während 10 WT nur langsam zytotoxisch reagierte.

4.1.2. Vergleich der Zytotoxizität nicht-autoaggregativer SCVs mit ihrem klonalen WT Um festzustellen, ob die erhöhte Zytotoxizität bei einigen der SCVs der

autoaggregativen Subgruppe zu den besonderen Eigenschaften dieser Gruppe

gehört oder ein generell auftretendes Phänomen bei SCVs darstellt, wurden 8

weitere klinische Isolate im Zytotoxizitäts-Assay getestet. Auch hier wurden

Page 61: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 61

vergleichend die klonalen WT-Phänotypen getestet. Alle Stämme wurden zweimal

getestet. Die Ergebnisse sind in Abb. 7 dargestellt.

Abb. 7

Zyto

toxi

zitä

t (%

LD

H)

0

20

40

60

80

100 WT SCV

Stamm 18 Stamm 35 Stamm 6998 Stamm 50

4 h p. i.

A

Zyto

toxi

zitä

t (%

LD

H)

0

20

40

60

80

100

Abb. 7 A u. B: Vergleich der Zytotoxizität von nicklonalen WT. Die Werte sind Mittelwerte mit Stand

Versuchs mit jeweils Dreifachwerten. Dargestellt is

Zytotoxizität 4 Stunden nach Infektion der Zellen.

Aus den Abbildungen ist zu sehen, dass au

Stämme eine nennenswerte Zytotoxizität auftritt

24 Stunden zeigten kein anderes Ergebnis.

Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse,

dem autoaggregativen Phänotyp der SCVs und

Von sieben autoaggregativen SCVs waren vie

von acht nicht-autoaggregativen SCVs keine z

von autoaggregativem Verhalten und Zytotox

werden (Chi-Square-Test; p < 0,025).

B

4 h p. i.

WT scv

Stamm 26 Stamm 4211 Stamm 113 Stamm 211

ht autoaggregativen SCVs und ihrem ardabweichungen eines repräsentativen

t die Freisetzung von LDH als Maß der

ßer bei WT 26 (B) bei keinem der

. Auch längere Infektionszeiten bis zu

dass ein Zusammenhang zwischen

einer erhöhten Zytotoxizität besteht.

r vermehrt zytotoxisch, wohingegen

ytotoxisch war. Ein Zusammenhang

izität konnte auch statistisch belegt

Page 62: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 62

4.2. Nachweis von Typ III-Sekretionssystem-Proteinen im Kulturüberstand von P. aeruginosa SCVs 4.2.1. SDS-Gele mit anschließender Silbernitrat-Färbung Vier der sieben autoaggregativen SCVs zeigten eine erhöhte Zytotoxizität im

Vergleich zu ihrem WT. Nur von Stamm 20265 war durch die Genexpressions-

Analysen durch VON GÖTZ (2003) erwiesen, dass die SCV eine erhöhte Expression

von Typ III-Genen aufweist. Um nachzuweisen, dass die erhöhte Zytotoxizität

tatsächlich mit einer erhöhten Expression des Typ III Sekretionssystems einhergeht,

sollten die entsprechenden Typ III Proteine mit geeigneten Methoden bei allen

zytotoxischen SCVs detektiert werden. Zum Nachweis der Proteine wurden

Kulturüberstände von den Bakterien nach Anzucht in Calcium-depletierten Medium

mittels Acrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) aufgetrennt und die Proteinbanden

anschließend durch eine Silbernitrat-Färbung sichtbar gemacht. Dies wurde für alle

sieben Stämme der autoaggregativen Subgruppe und für die nicht-autoaggregativen

Stämme durchgeführt.

Bei keinem der nicht-autoaggregativen Stämme zeigte sich unter den gewählten

experimentellen Bedingungen eine Bande in der den Typ III-Proteinen

entsprechenden Höhe, weshalb auf eine Darstellung im Folgenden verzichtet wird.

Die vier autoaggregativen SCVs, die vermehrt zytotoxisch waren, sind vergleichend

mit ihrem WT in Abb. 8 aufgeführt. Bei den anderen drei autoaggregativen SCVs und

ihren WT konnten keine eindeutigen Banden gefunden werden, weshalb auch hier

auf die Darstellung verzichtet wurde.

Page 63: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 63

Abb. 8

61,3 kD 49,0 kD 36,4 kD 24,7 kD 19,2 kD

Stan

AbW23

in

Se

Ei

all

23

kD

un

Au

(B

A

x

x x x

x x

x

x x

x

x

x x x

x x

x

ExoT

ExoS

PopB

PcrV

a

a

a

a

a

dard 20265 20265 52 WT 52 SCV 8226 8226 WT SCV WT SCV

61,3 kD 49,0 kD 36,4 kD 24,7 kD 19,2 kD

Sta

b. 8: Silbernitrat-Färbung von SDS-Gelen mit SCVs und iT. (A) zeigt von links nach rechts die Stämme 20265, 52 und

1. Zuerst wurde jeweils der WT, dann die SCV aufgetragen. Pa

der ersten Spur ein Proteinstandard aufgetragen. (x) zeigt die

kretions-Proteinbanden.

n Protein mit einem Molekulargewicht von 40 kDa, wahr

en Morphotypen der vier Stämme zu finden. 20265 SCV,

1 SCV zeigten außerdem Typ III-spezifische Banden auf

a), ExoS (47,5 kDa) und PcrV (32,2 kDa), wobei die ExoS

d 231 SCV schwach war (kann für 20265 SCV im Weste

ch die Bande auf Höhe von PcrV war bei 20265

estätigung im Blot). Von den WT dieser Stämme zeigten 5

B

x

x x x

x x

ExoT

ExoS

PopB

PcrV

a

a

a

a

a

ndard 231 WT 231 SCV

hrem jeweiligen klonalen 8226. (B) zeigt den Stamm

rallel wurde bei jedem Gel

charakteristischen Typ III

scheinlich PopB war bei

52 SCV, 8226 SCV und

Höhe von ExoT (ca. 53

-Bande bei 20265, 8226

rn Blot bestätigt werden).

und 231 nur schwach

2 WT, 8226 WT und 231

Page 64: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 64

WT neben der Bande auf Höhe von PopB auch schwache Banden in der Höhe von

ExoT, Banden in Höhe von ExoS oder PcrV waren nicht zu erkennen.

4.2.2. SDS-Gele mit anschließendem Western Blot Mit der Silbernitrat-Färbung konnte nur festgestellt werden, ob Banden vorhanden

waren, die in ihrer Höhe denen der Typ III-Proteine entsprachen. Um die Befunde der

Silbernitrat-Färbung zu bestätigen, wurde ein Western Blot mit spezifischen

Antikörpern gegen die Typ III-Proteine ExoS und PcrV (Kaninchen-Antikörper, Anti-

ExoS und Anti-PcrV) durchgeführt. Für 20265, 52 und 231 SCV konnten spezifische

Reaktionen der Antikörper festgestellt werden, die in Abb. 9 dargestellt sind. Die

Gele für Blot und Silbernitrat-Färbung wurden zur selben Zeit angefertigt. Die

Anwesenheit von Banden auf Höhe von ExoS und PcrV bei 20265 und 231 im Blot

bestätigen daher die nur schwachen Banden in der Silbernitrat-Färbung.

Es stand nur eine begrenzte Menge Anti-ExoS zur Verfügung. Da der Stamm 231

erst nachträglich integriert wurde, konnte nur die Anwesenheit von PcrV überprüft

werden, was ein Fehlen einer ExoS-Bande im Blot erklärt. Bei 8226 konnte bei der

SCV kein spezifisches Signal festgestellt werden. Hier könnte man spekulieren, dass

die verwendeten Antikörper Epitope erkennen, die bei den Typ III-Proteinen der SCV

8226 nicht exprimiert werden.

Die jeweils zugehörigen WT zeigten keine spezifischen Signale im Blot.

Page 65: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 65

Abb. 9

B

Abb. 9Ergeb

A

20265 20265 52 WT 52 SCV WT SCV

ExoS

PcrV

: Western Blot mit spezifischen Antinisse für die Stämme 20265 und 52, (B)

61,3 kDa

49,0 kDa

36,4 kDa

24,7 kDa

19,2 kDa

köd

231 WT 231 SCV

61,3 kDa 49,0 kDa 36,4 kDa 24,7 kDa 19 2 kDa

rpern gegen ExoS und PcrV. (A) zeigt die

ie Ergebnisse für 231.

Page 66: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 66

4.3. Überexpression des pvrR-Gens in P. aeruginosa SCVs

4.3.1. Nachweis des pvrR-Gens nach Übertragung mittels Elektroporation in den SCVs

DRENKARD u. AUSUBEL (2002) postulierten, dass das pvrR-Gen, das einen Zwei-

Komponenten Response Regulator kodiert, eine Schlüsselrolle in der Entstehung

des SCV-Phänotyp hat. In trans Komplementation führte bei in vitro generierten

SCVs von P. aeruginosa PA 14 zu einem WT-Phänotyp. Genomische Deletion im

WT von PA 14 führte zu einer gesteigerten Frequenz des Auftretens von SCVs in der

WT-Population. Für die in dieser Studie verwendeten zytotoxischen SCVs sollte nun

die Rolle von pvrR bei in vivo entstandenen SCVs getestet werden. Die

verwendeten Isolate 20265 (VON GÖTZ, 2003), 52, 8226 und 231 (jeweils WT und

SCV) wurden mittels PCR auf das Vorhandensein von pvrR im Genom überprüft. Die

Grundlage für die eingesetzten Primer bildeten Genomsequenzen von P. aeruginosa

PA 14. Es war nicht möglich, das gesamte Gen pvrR zu amplifizieren. Nachgewiesen

wurde ein 597 bp großes, internes Fragment von pvrR. Durch Sequenzierung konnte

dies für Stamm 20265 bestätigt werden (VON GÖTZ, nicht publizierte Daten). Wie in

Abb. 10 zu sehen ist, konnte bei allen Isolaten dieses pvrR-Fragment nachgewiesen

werden.

Abb. 10

DNA- H2O PA14 PA14 20265 20265 231 231 8226 8226 52WT 52SCV Leiter WT SCV WT SCV WT SCV

1 kb

0,5 kb

597 bp

Abb. 10: Nachweis von pvrR in den P. aeruginosa-Isolaten 20265, 52, 8226 und 231. Dargestellt ist jeweils ein 597 bp großes Fragment von pvrR. PA 14 diente als

Positivkontrolle.

Page 67: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 67

Um den Einfluss von pvrR auf den SCV-Phänotyp zu charakterisieren, wurde das

Plasmid pED202 verwendet, das freundlicherweise von E. Drenkard (Harvard

Medical School, Boston) zur Verfügung gestellt wurde. Das Plasmid pED202 besteht

aus dem Vektor pUCP19 mit einem in die PstI-Schnittstelle klonierten etwa 3,5 kb

großen DNA-Fragment, welches pvrR als einziges komplettes Gen umfasst. Dieses

Plasmid wurde mittels Elektroporation in die SCV und den zugehörigen WT von P.

aeruginosa 20265 (VON GÖTZ, 2003), 52, 8226 und 231 verbracht. Aufgrund einer

an das Plasmid gekoppelten Carbenicillin-Resistenz konnten die Klone, bei denen

die Elektroporation erfolgreich war, auf Selektivagar isoliert werden. Anschließend

wurde der Nachweis, dass das vollständige Plasmid in den Bakterien enthalten war,

durch eine Plasmidpräparation und anschließende Auftrennung der DNA in einer

Agarose-Gelelektrophorese geführt. Dazu wurde das präparierte Plasmid mit dem

Enzym PstI geschnitten, wodurch zwei Fragmente entstanden, zum einen der etwa

4500 bp große Vektor pUCP19 und zum anderen das etwa 3500 bp große Gen pvrR.

Diese Fragmente konnten bei den SCVs und WT von 20265 (VON GÖTZ, 2003),

8226 und 231nachgewiesen werden (Abb. 11).

Es war nicht möglich, das Plasmid auf diesem Weg in der komplementierten SCV

des Stammes 52 (52 SCVpED202) nachzuweisen. Daher wurde hier das pvrR-Gen

aus dem Plasmid nach Plasmidpräparation mittels PCR amplifiziert (siehe Abb. 12).

Da außerdem die Antibiotikaresistenz bei der Komplementante vorhanden war und

die phänotypische Charakterisierung (s. u.) ähnliche Ergebnisse lieferten wie die

Komplementanten von 8226 und 231, konnte davon ausgegangen werden, dass das

pvrR-Gen in 52 SCVpED202 exprimiert wurde.

Page 68: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 68

Abb. 11

~4,5 kb ~3,5 kb

Abb. 11: Nachweis des Plasmids pED202. Dargestellt sind jeweils die

beiden Fragmente pUCP19 (~4,5 kb)

und pvrR (~3,5 kb). (A) zeigt das

Ergebnis für 8226 WT und SCV, (B)

das Ergebnis für 231 WT und SCV.

Abb.

597 bp

WT SCV DNA- Leiter

12

1 0

DNA- WT SCV Leiter

kb

,5 kb

Abb. 12: Nachweis des pvrR-Gens in 52SCVpED202. Dargestellt ist jeweils das PCR-

Produkt eines 597 bp großen internen

Fragments von pvrR in 52 WT, SCV und

SCVpED202. Bei WT und SCV war das

Ausgangsmaterial genomische DNA, bei

SCVpED202 Plasmid-DNA.

WT SCV SCV DNA-Leiter pED202

A

B
Page 69: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 69

Der komplementierte WT diente bei den folgenden Experimenten als Kontrolle, dass

das pvrR-Gen für eventuelle phänotypische Veränderungen in den SCVs

verantwortlich ist, den WT-Phänotyp aber nicht beeinflusst. Das heißt, der

komplementierte WT sollte in allen Experimenten dem WT gleichen.

4.3.2. Mikrobiologische Charakterisierung im Vergleich zu SCV und WT

4.3.2.1. Koloniemorphologie

Nachdem das pvrR-Gen durch Elektroporation in die SCVs verbracht wurde und das

Vorhandensein überprüft war (siehe 4.3.1.), wurden WT, SCV und Komplementanten

(SCVpED202, WTpED202) zum Vergleich der Koloniemorphologie auf Columbia-

Blutagar ausgestrichen. Die Koloniemorphologie der einzelnen Phänotypen ist in

Abb. 13 vergleichend dargestellt. Dabei wurde auf die Darstellung der

komplementierten WT verzichtet, da keine Abweichungen von der WT-Morphologie

auftraten.

Page 70: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 70

Abb. 13

2

_______

_______

_______

Abb. 1SCVpEDColumbi

_______

Aus den

zumind

bei den

waren b

ihrer Gr

WT

_________________

_________________

_________________

3: Vergleichende D202. Dargestellt sind

a-Blutagar nach 48 h

________________

Bildern wird deutli

est teilweise im Ver

Komplementanten

ei den Komplemen

öße den SCVs ent

SCV

_______________

_______________

_______________

arstellung der jeweils die drei M

Bebrütung bei 37

_______________

ch, dass die Kol

gleich zur SCV z

von 20265 und

tanten von 8226

sprachen. Die Ko

SCVpED20

Stamm 231

Stamm 8226

Stamm 52

Stamm 20265

_____________________________________

_____________________________________

_____________________________________

Koloniemorphologie von WT, SCV und orphotypen von 20265, 52, 8226 und 231auf

°C.

____________________________________

oniegröße bei allen vier Komplementanten

unahm. Während jedoch die Morphologie

52 weitgehend den Wildtypen entsprach,

und 231 auch Kolonien zu finden, die in

mplementante von 231 wies zudem nicht

Page 71: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 71

die mukoide Beschaffenheit auf wie der zugehörige WT. Wurden die Kolonien der

Komplementanten von 8226 und 231, die in ihrer Größe den SCVs entsprachen, auf

antibiotikahaltigem Agar ausgestrichen, waren sie in der Lage zu wachsen. Dies wies

darauf hin, dass das Plasmid mit dem pvrR-Gen noch vorhanden war. Alle

Morphotypen wiesen Hämolyse auf (teilweise bei SCVs und SCVpED202 nur

schmale Hämolyse-Höfe, daher auf einigen Bildern nicht sichtbar).

4.3.2.2. Swimming motility

HÄUSSLER et al. (2003) beschrieben eine Reduktion des Schwimmverhaltens in der

autoaggregativen Subgruppe von SCVs im Vergleich zum WT auf 0,3 %igem Agar.

Bestätigt wurden diese Ergebnisse durch WEHMHÖNER (2003) und v. GÖTZ

(2003), die eine Reduktion der Expression von Strukturproteinen bzw. der

verantwortlichen Gene für den Flagellenapparat bei einem repräsentativen Vertreter

der SCV-Subgruppe (20256 SCV) feststellten. Die Untersuchung des

Schwimmverhaltens der pvrR-Komplementanten im Vergleich zu WT und SCV diente

zur weiteren Charakterisierung möglicher Funktionen von pvrR bei der Entstehung

des SCV-Phänotyps. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Abb. 14

dargestellt. Auch hier wurde darauf verzichtet, die komplementierten WT mit

abzubilden, da es keine Abweichungen vom WT-Phänotyp gab.

Page 72: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 72

Abb. 14

T

______

______

______

Abb. 1SCVpED0,3 %ige

Dargest

Aus de

Schwim

Komple

bereits

Phänoty

interme

Komple

gegenü

W

__________________

__________________

__________________

4: Vergleichende Da202. Dargestellt sind j

m Agar nach 48h Beb

ellt ist ein repräsentativ

r Abbildung wird

mverhalten im Ver

mentante von 231 de

auf Blutagar sichtb

p des WT zeigt. Die

diären Phänotyp,

mentante von 52

ber der SCV. Der Un

SCV

__________________

__________________

__________________

rstellung des Schweweils die drei Morph

rütung bei 37 °C. Alle

er Versuch.

deutlich, dass all

gleich zur SCV a

n Durchmesser des

ar, dass die Kom

Komplementanten

jedoch mit deut

zeigte nur ein w

terschied wurde bei

SCVpED202

Stamm 231

Stamm 8226

Stamm 52

Stamm 20265

__________________________________

__________________________________

__________________________________

immverhaltens von WT, SCV und otypen von 20265, 52, 8226 und 231auf

Morphotypen wurden dreimal getestet.

e Komplementanten ein erhöhtes

ufwiesen. Dabei erreichte nur die

WT. Allerdings wurde auch hier wie

plementante nicht den mukoiden

von 20265 und 8226 zeigten einen

licher Tendenz zum WT. Die

enig erhöhtes Schwimmverhalten

diesem Stamm deutlicher, wenn die

Page 73: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 73

Platten für 72 h bebrütet wurden. WT und SCVpED202 hatten dann die Platte mit

einem vollständigen Rasen bedeckt, während die SCV einen geringeren

Durchmesser aufwies.

4.3.2.3. Twitching motility und Autoaggregation

HÄUSSLER et al. (2003) zeigten dass die SCVs der beschriebenen Subgruppe im

Vergleich zu ihrem klonalen WT ein erhöhtes Twitching-Vermögen hatten. Daher bot

sich dieser Test für eine weitere Charakterisierung der pvrR-Komplementanten an.

Die Komplementanten wurden vergleichend mit SCV und WT auf 1 %igem Agar in

unter 3.1.5.2. beschriebener Weise angeimpft und für 48 h bebrütet. Die Ergebnisse

sind in Tab. 4 zusammengefasst.

Tab. 4:

Durchmesser der Twitching-Höfe (mm)

Stamm

Versuch I Versuch II WT Ø Ø SCV 21,3±1,5 18,3±1,2

20265

SCVpED202 23,0±1,0 20,7±2,1 WT 11,7±1,5 15,3±0,6 SCV 16,3±1,5 19,3±0,6

52

SCVpED202 6,3±1,2 5,3±1,5 WT 3,0±1,0 3,3±0,6 SCV 10,7±0,6 11,3±1,5

8226

SCVpED202 3,0±1,7 3,3±0,6 WT 2,0±1,0 Ø SCV 9,7±1,5 7,7±0,6

231

SCVpED202 Ø 1,7±0,6 Tab. 4: Vergleich des Twitching-Vermögens von WT, SCV und SCVpED202. In der

Tabelle sind die Ergebnisse aus zwei unabhängigen Versuchen zusammengefasst. Je

Morphotyp wurden in jedem Versuch drei Platten angeimpft. Dargestellt sind Mittelwerte mit

Standardabweichung der Durchmesser (in mm) der Twitching-Höfe nach 48 h Bebrütung bei

37 °C auf 1 %igem Agar. Ø steht für ausbleibendes Twitching-Vermögen.

Page 74: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 74

Bei drei von vier Komplementanten veränderte sich das Twitching-Vermögen im

Vergleich zur SCV. Die Komplementanten von 8226 und 231 verhielten sich dabei

genau wie der jeweilige WT, das heißt, sie zeigten ein gegenüber der SCV

vermindertes Twitching. 52 SCVpED202 war auch dem WT ähnlich, allerdings war

das Twitching-Vermögen noch weiter reduziert. Das Twitching-Vermögen von 20265

SCVpED202 glich dem der SCV. Die ebenfalls getesteten WT-Komplementanten

entsprachen wie erwartet den jeweiligen WT (Daten nicht gezeigt).

Die Subgruppe der von HÄUSSLER et al. (2003) beschriebenen SCVs war vor allem

durch ihr autoaggregatives Verhalten in bestimmten Medien auffällig. Deshalb wurde

dieser Test ebenfalls zur Charakterisierung der pvrR-Komplementanten eingesetzt.

Dazu wurden die unterschiedlichen Morphotypen in Vogel-Bonner-Medium angeimpft

und bei 37 °C im Schüttelinkubator bis zur stationären Phase kultiviert. Die SCVs

zeigten alle im Vergleich zum entsprechenden WT Klumpenbildung ab der späten

log-Phase. Wie in Tab. 5 dargestellt, konnte bei keiner der pvrR-Komplementanten

Klumpenbildung festgestellt werden. Durch pvrR wurde das autoaggregative

Verhalten der SCVs vollständig eliminiert.

Tab. 5:

Stamm WT SCV SCVpED20220265 - + - 52 - + - 8226 - + - 231 - + -

Tab. 5: Vergleich der Autoaggregation von WT, SCV und SCVpED202. Die Bakterien

wurden mit einer OD650 von 0,1 in Vogel-Bonner-Medium angeimpft und bis zur stationären

Phase kultiviert.

4.3.3. Verhalten im Zytotoxizitäts-Assay im Vergleich zu SCV und WT

Wie unter 4.1.1., Abb. 6 A - D zu sehen, zeigten SCVs von 20265, 52, 8226 und 231

im Zytotoxizitäts-Assay eine gegenüber dem zugehörigen WT deutlich erhöhte

Page 75: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 75

Zytotoxizität. Es stellte sich die Frage, ob durch die Komplementation mit pvrR die

Zytotoxizität unbeeinflusst bleibt oder eine Reduktion der Zytotoxizität und damit der

WT-Phänotyp erreicht wird. Dazu wurden die Komplementanten vergleichend mit

WT und SCV getestet. Der Verlauf der Zytotoxizität von WT, SCV und SCVpED202

ist in der folgenden Abb. 15 A – D graphisch dargestellt.

Abb. 15

Zeit (h)

0 1 2 3 4 5

Zyto

toxi

zitä

t (%

LD

H)

0

20

40

60

80

100 20265 WT 20265 SCV 20265 SCVpED202

A

Zeit (h)

0 1 2 3 4 5

Zyto

toxi

zitä

t (%

LD

H)

0

20

40

60

80

100 52 WT52 SCV52 SCVpED202

Zyto

toxi

zitä

t (%

LD

H)

0

20

40

60

80

100

C

Zyto

toxi

zitä

t (%

LD

H)

0

20

40

60

80

100

Zeit (h)

0 1 2 3 4 5

8226 WT8226 SCV8226 SCVpED202

B

D

Zeit (h)

0 1 2 3 4 5

231 WT231 SCV231 SCVpED202

Abb. 15 A – D: Vergleich der Zytotoxizität von WT, SCV und SCVpED202 im Zytotoxizitäts-Assay mit J774.A1-Makrophagen. Die Werte sind Mittelwerte mit

Standardabweichungen eines repräsentativen Versuchs mit jeweils Dreifachwerten. Alle

Stämme wurden zweimal getestet. Dargestellt ist die Freisetzung von LDH als Maß der

Zytotoxizität in Abhängigkeit von der Infektionszeit.

Page 76: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 76

Aus den Graphen kann abgeleitet werden, dass das pvrR-Gen bei drei der vier

Stämme keinen Einfluss auf die Zytotoxizität hatte. Die Komplementanten von

20265, 52 und 231 zeigten einen nahezu identischen Verlauf der Zytotoxizität wie die

entsprechenden SCVs. Nur die Komplementante von 8226 SCV stellte sich

abweichend dar. Hier war keine Zytotoxizität – entsprechend dem WT –

festzustellen. Die komplementierten WT zeigten den gleichen Zytotxizitätsverlauf wie

die entsprechenden WT (Daten nicht gezeigt).

Page 77: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 77

4.4. Virulenzanalyse von zytotoxischen P. aeruginosa SCVs und den klonalen WT im BALB/c-Mausmodell nach intranasaler Infektion 4.4.1. Untersuchungen zur Morbidität und Mortalität Hier sollte untersucht werden, ob die erhöhte Zytotoxizität der SCVs 20265, 52, 8226

und 231 verglichen mit dem klonalen WT mit einer erhöhten in vivo Virulenz

korreliert. Dazu wurden Gruppen von BALB/c-Mäusen mit einer Infektionsdosis von 1

x 108 Bakterien je Morphotyp intranasal infiziert. Um festzustellen, in wie weit die

Virulenz auf das Typ III Sekretionssystem zurückgeführt werden kann, wurde eine

Gruppe von Mäusen mit der exsA-knock-out-Mutante 20265 SCVexsA infiziert. Die

Morbidität wurde täglich protokolliert. Besonders wurde auf Krankheitssymptome wie

Dyspnoe, Konjunktivitis, Beschaffenheit des Haarkleids (Struppigkeit) und Apathie

geachtet. Auch das Sozialverhalten der Tiere wurde berücksichtigt (Kontakt zwischen

den Tieren, Nestbau).Täglich wurde das Gewicht der einzelnen Tiere bestimmt. Die

Mortalität ist in den Abb. 16 A – D mit Kaplan-Meyer-Überlebenskurven vergleichend

dargestellt.

Page 78: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 78

Abb. 16

Zeit (d)

1 2 3 4 5 6 7

lebe

nde

Tier

e

0

2

4

6

8

10

1220265 WT 20265 SCV 20265 SCVexsA-

Zeit (d)

1 2 3 4 5 6 7

lebe

nde

Tier

e

0

2

4

6

8

8226 WT 8226 SCV

lebe

nde

Tier

ele

bend

e Ti

ere

Alle SCV-infizierten Tiere verstarben signifi

Statistische Auswertungen mittels Kaplan

signifikant höhere Mortalität der SCV 20265

3; p < 0,01), der SCV 8226 (Tag 5; p < 0,01

Vergleich zu ihrem klonalen WT. Weiterhi

Krankheitsverlauf bei WT-infizierten Tieren m

B

Zeit (d)

1 2 3 4 5 6 7

0

2

4

6

8

52 WT 52 SCV

C

D

A

Zeit (d)

1 2 3 4 5 6 7

0

2

4

6

8231 WT 231 SCV

Abb. 16 A – D: Vergleich der Mortalität von WT und SCV von 20265, 52, 8226 und 231. Sterbekurven nach intranasaler Infektion von BALB/c-Mäusen mit 1 x 108 Bakterien je

Morphotyp. Die Daten sind jeweils aus zwei unabhängig voneinander durchgeführten

Experimenten gepoolt. Bei Stamm 20265 wurde die Typ III Sekretions-defiziente Mutante

SCVexsA eingesetzt (A).

kant früher als die WT-infizierten Tiere.

-Meyer-Survival-Statistik ergaben eine

(Tag 3 p. i.; p = 0,01), der SCV 52 (Tag

) und der SCV 231 (Tag 3; p < 0,01) im

n konnte festgestellt werden, dass der

ilder war als bei Tieren, die mit der SCV

Page 79: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 79

infiziert waren. Diese zeigten verstärkte Dyspnoe, purulente Konjunktivitis, struppiges

Haarkleid und Apathie. Unterschiede in der Gewichtsabnahme konnten nicht

festgestellt werden. Während die Krankheitssymptome bei den überlebenden WT-

infizierten Tieren schnell abnahmen und eine rasche Gewichtszunahme festzustellen

war, zeigten überlebende SCV-infizierte Tiere noch längere Zeit Dyspnoe und

nahmen nur langsam an Gewicht zu.

In Abb. 16 A kann man sehen, dass die exsA-knock-out-Mutante 20265 SCVexsA

eine Attenuierung gegenüber der SCV 20265, aufwies. Dabei konnte statistisch ein

signifikanter Unterschied zwischen SCV und SCVexsA am Tag 3 festgestellt werden

(p < 0,01). Auch die Krankheitssymptome waren deutlich weniger ausgeprägt –

ähnlich den WT-infizierten Tieren – als bei den SCV-infizierten Tieren. Zu späteren

Zeitpunkten waren die Unterschiede weniger deutlich. Die überlebenden SCVexsA-

infizierten Mäuse nahmen jedoch an Tag 7 bereits wieder an Gewicht zu, während

die überlebende SCV-infizierte Maus noch einige Tage Dyspnoe zeigte und erst ab

Tag 12 an Gewicht zunahm.

4.4.2. Vergleich der Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz Die Ergebnisse der Infektionsversuche führten zu der Frage, ob eine erhöhte

Morbidität und Mortalität mit einer höheren Keimzahl in der Lunge, aber auch in

anderen Organen wie Leber und Milz, einherging. Dazu wurden BALB/c-Mäuse

intranasal infiziert und nach 12 h seziert. Lunge, Leber und Milz wurden entnommen,

homogenisiert und Verdünnungen dieser Homogenate ausplattiert. Die Versuche

wurden durchgeführt für den Stamm 20265 und 52. Bei Stamm 20265 wurden auch

die Keimzahlen von Tieren bestimmt, die mit der Typ III-knock-out-Mutante 20265

SCVexsA infiziert waren. Die Ergebnisse sind für 20265 in Abb. 17 A und für 52 in

Abb. 17 B graphisch dargestellt.

Page 80: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 80

Abb. 17

CFU

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

AbSC12

Da

Er

(AKe

wa

log

ein

für

Ve

me

0,0

de

wa

re

52

wa

Ke

A

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

20265 WT20265 SCV20265 SCVexsA-

Lunge Leber Milz

CFU

b. 17: Vergleich der Keimzahlen in LungeVexsA infizierten BALB/c-Mäusen. Untersu

h nach intranasaler Infektion mit 1 x 108 Bak

ten aus zwei unabhängig voneinander du

gebnisse für 20265 WT, SCV und SCVexsA, (

) Wie erwartet, waren die Lungen a

imzahlen bei 20265 WT und SCVexsA

ren in den Lungen von SCV-infizierten T

-Stufe höher lagen als die Infektionsdos

e signifikanten Unterschied für den Verg

den Vergleich von SCV und SCVexsA (p

rgleiche der Keimzahlen in Leber und Mi

hr Bakterien in beiden Organen als WT u

01 in der Leber, p = 0,002 in der Milz; V

r Leber, p = 0,002 in der Milz). Die Lebern

ren nahezu gleich stark besiedelt, in

duzierte Besiedelung gegenüber dem WT

waren erwartungsgemäß die Lungen am

ren auch bei 52 SCV die Bakterien

imzahlen von fast einer log-Stufe mehr al

B

101

102

103

104

105

106

107

108

109

1010

52 WT 52 SCV

Lunge Leber Milz

, Leber und Milz von mit WT, SCV oder cht wurden die Keimzahlen in den Organen

terien. Dargestellt sind jeweils die gepoolten

rchgeführten Experimenten. (A) zeigt die

B) die Ergebnisse für 52 WT und SCV.

m stärksten besiedelt. Während die

im Bereich der Infektionsdosis lagen,

ieren Keimzahlen zu finden, die ca. eine

is. Eine statistische Auswertung ergab

leich von WT und SCV (p = 0,007) und

<0,001). Ähnlich verhielt sich dies für die

lz. SCV-infizierte Tiere hatten signifikant

nd SCVexsA (Vergleich SCV zu WT p <

ergleich SCV zu SCVexsA p < 0,001 in

bei WT- und SCVexsA-infizierten Tieren

der Milz konnte bei der Mutante eine

festgestellt werden. (B) Auch bei Stamm

stärksten besiedelt. Wie bei 20265 SCV

in der Lage zu replizieren, wodurch

s der Infektionsdosis festgestellt wurden.

Page 81: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 81

52 WT konnte teilweise eliminiert werden, wodurch die Keimzahl um etwa eine log-

Stufe reduziert wurde. Auch hier wurden statistisch signifikante Unterschiede

zwischen SCV und WT festgestellt (p = 0,007). Auch die Keimzahlen in Leber und

Milz waren bei WT-infizierten Tieren signifikant niedriger (Leber: p < 0,001; Milz: p <

0,001).

4.4.3. Vergleich der histopathologischen Veränderungen in Lunge und Nasopharynx Mit den histopathologischen Untersuchungen von Lunge und Nasopharynx sollte

festgestellt werden, ob es spezifisch durch die unterschiedlichen Morphotypen

verursachte Veränderungen des Gewebes gibt. Untersucht wurden die

unterschiedlichen Morphotypen von 20265 und 52. Um festzustellen, welche

Veränderungen auf die erhöhte Typ III Sekretion zurückzuführen sind, wurden im

Vergleich zu mit 20265 SCV infizierten Tieren auch Tiere untersucht, die mit

SCVexsA von 20265 infiziert waren. Der Schwerpunkt der Untersuchung lag dabei

auf Lokalisation, Schwere und Art der Entzündungsreaktion sowie eine

Charakterisierung der anwesenden Zelltypen.

Die Herstellung der histologischen Präparate erfolgte in Zusammenarbeit mit Prof. K.

Kamino (Institut für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover).

Die Ergebnisse der Lungen-Untersuchungen sind im Folgenden in Abb. 18 und 19

für Stamm 20265 und 20 für Stamm 52 gezeigt. Abb. 18 A und 19 A zeigen

Ausschnitte aus der Lunge von mit 20265 WT infizierten Mäusen, 18 B und 19 B

Ausschnitte von mit 20265 SCV infizierten Mäusen und 18 C und 19 C Ausschnitte

von mit 20265 SCVexsA infizierten Mäusen. Abb. 20 A und B stellen die Infektion

mit dem WT, C und D die Infektion mit der SCV von Stamm 52 dar. Abb. 21 A und B

zeigen die Besonderheit der Bakterienansammlungen in den SCV-infizierten Lungen.

In Abb. 22 A – C sind die Veränderungen in Nasopharynx von WT- oder SCV-

infizierten Tieren dargestellt.

Page 82: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 82

Abb. 18

Vergrößerung x200

A

Bronchus mit Entzündungszellen

B

Vergrößerung x200

C AhVISg

e

v

2

2

2

Bronchien frei von Entzündung

Vergrößerung x200

n

Bronchus mit Entzündungszelle

bb. 18: Vergleich der istopathologischen eränderungen in der Lunge nach

nfektion mit 20265 WT, SCV oder CVexsA. Dargestellt sind HE-

efärbte Gewebeausschnitte bei

iner mikroskopischen Vergrößerung

on x200. (A) zeigt die Infektion mit

0265 WT, (B) die Infektion mit

0265 SCV und (C) die Infektion mit

0265 SCVexsA.

Page 83: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 83

Abb. 19

Vergrößerung x630

A

Vergrößerung x630

alveolärer Bereich mit Entzündungszellen

B

Vergrößerung x630

Zerstörung des Bronchialepithels

C

Bronchus mit Entzündungszellen im Lumen

Abb. 19: Vergleich der histopathologischen Veränderungen in der Lunge nach Infektion mit 20265 WT, SCV oder SCVexsA. Dargestellt sind HE-

gefärbte Gewebeausschnitte bei

einer mikroskopischen Vergrößerung

von x630. (A) zeigt die Infektion mit

20265 WT, (B) die Infektion mit

20265 SCV und (C) die Infektion mit

20265 SCVexsA.

Page 84: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 84

Abb. 20 Bronchus mit Entzündungszellen

Vergrößerung x200

A B Vergrößerung x630

Bronchien frei von Entzündung

Vergrößerung x630 Vergrößerung x200

C

Alveolen mit Entzündungszellen

D

Abb. 20: Vergleich der histopathologischen Veränderungen in der Lunge nach Infektion mit 52 WT oder SCV. Dargestellt sind HE-gefärbte Gewebeausschnitte der Lunge

bei unterschiedlicher mikroskopischer Vergrößerung. (A) und (B) zeigen die Infektion mit

dem WT, (C) und (D) die Infektion mit der SCV.

Page 85: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 85

Abb. 21

Bakterienansammlungen

A

Vergrößerung x1000

B

Vergrößerung x1000

Abb. 21: Bakterienansammlungen in den Alveolen von SCV-infizierten Mäusen. Dargestellt sind HE-gefärbte Gewebeausschnitte der Lunge. (A) zeigt die Infektion mit 20265

SCV und (B) die Infektion mit 52 SCV.

Page 86: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 86

Abb. 22

Vergrößerung x100

A

geringgradige Schleimansammlungen im Lumen

Abb. 22: Histopathologische Veränderungen im Nasopharynx infizierter Mäuse. Dargestellt sind HE-

gefärbte Gewebeausschnitte des

Nasopharynx bei unterschiedlicher

mikroskopischer Vergrößerung. (A) ist ein

Befund bei 20265 WT, (B) ein Befund bei

20265 SCV und (C) ein Befund bei 20265

SCVexsA.

Vergrößerung x630

Entzündungszellen im Lumen

B

Vergrößerung x1000

Entzündungszellen in der Epithelschicht

C

Page 87: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 87

Je Morphotyp wurden die Lungen und der Nasopharynx von 5 Tieren histologisch

untersucht. Die Ergebnisse der Untersuchung zeigten, dass die durch WT und SCV,

bzw. SCVexsA hervorgerufenen Veränderungen in der Lunge sich voneinander

unterschieden. Während durch WT und SCVexsA eine hochgradige

Bronchopneumonie verursacht wurde (siehe Abb. 18 A und C, Abb. 19 A und C),

waren die Bronchien bei SCV-infizierten Tieren fast frei von Entzündung (siehe Abb. 18 B und 19 B). Hier zeigte sich die Infektion vor allem in den alveolären Bereichen,

das Ausmaß war auch hier hochgradig. Bei den beteiligten Entzündungszellen

handelte es sich in erster Linie um neutrophile Granulozyten und Makrophagen. Hier

gab es keine Unterschiede zwischen WT, SCV und SCVexsA. Ähnliche Befunde

konnten auch bei Stamm 52 festgestellt werden (siehe Abb. 20 A – D).

Als Besonderheit konnte bei der Untersuchung der Lungen von SCV-infizierten

Tieren festgestellt werden, dass in den Lumina der Alveolen in allen Schnitten (5

Tiere) viele große Bakterienansammlungen zu finden waren (siehe Abb. 21 A und

B). WT und SCVexsA-infizierte Lungen wiesen dagegen nur einzelne solche

Bakterienansammlungen auf, die aber nicht in allen Schnitten zu finden waren. Durch

Gam-Färbungen von Lungenschnitten konnte dieser Befund bestätigt werden (Bilder

nicht gezeigt).

Bei den Untersuchungen des Nasopharynx ergaben sich keine unterschiedlichen

Ergebnisse. Sowohl bei WT- wie auch bei SCV-, bzw. SCVexsA-infizierten Tieren

wurden vereinzelt Entzündungsreaktionen in der Schleimhaut gefunden. Dann waren

neutrophile Granulozyten in der Epithelschicht zu finden. Sehr selten zeigte sich eine

Desquamation des Epithels mit Zelltrümmern, Entzündungszellen und Mucus im

Lumen der Nasenhöhlen. Die dargestellten Gewebeausschnitte (siehe Abb. 22 A – C) zeigen Befunde, die für alle Morphotypen gelten, auch für Stamm 52.

Page 88: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 88

4.5. Etablierung eines neuen C. elegans Pathogenitäts-Modells 4.5.1. Vergleich der Abtötung von C. elegans durch SCV und WT Untersuchungen von ZIEGLER (2003) hatten gezeigt, dass einige der klinischen CF-

Isolate im Nematoden-Modell unter den publizierten Standardbedingungen (TAN et

al., 1999a, b; 2000; MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999) avirulent waren. Dazu gehörten

auch einige Stämme der hier untersuchten Isolate. So zeigten die Stämme 20265, 52

und 231 im Standard-Fastkilling und Standard-Slowkilling keine Virulenz. 8226 SCV

zeigte unter Fastkilling-Bedingungen eine Sterberate von 90% innerhalb von 30 h,

der WT war avirulent. Weiterhin konnten andere Autoren feststellen, dass es nicht

möglich ist, Typ III Sekretions-bedingte Virulenz in den Standard-Assays

nachzuweisen (MIYATA et al., 2003). Ein Ziel dieser Arbeit war es, ein Modell zu

etablieren, in dem es zum einen möglich ist, Virulenzfaktoren bei unter den Standard-

Bedingungen avirulenten P. aeruginosa zu detektieren, und zum anderen, Typ III

Sekretion als Virulenzfaktor auch im Nematoden-Modell festzustellen.

C. elegans L4-Larven wurden in diesem Modell mit Bakterien in Flüssigkultur infiziert.

Dazu wurde modifiziertes Calcium-depletiertes Vogel-Bonner (VB)-Medium

verwendet. Dabei diente das Calcium als Stimmulanz der Typ III Sekretion (VALLIS

et al., 1999a). Vergleichend wurden die Bakterien auch in normalem VB-Medium

angeimpft und die L4-Larven damit infiziert. Die Bakterien wurden bei einer OD650

von 1,0 geerntet. Als Kontrolle wurde in allen Versuchen E. coli DH5α verwendet. Die

Ergebnisse dieses neuen, auf einer Flüssigkultur basierenden Modells sind für die

zytotoxischen SCVs und ihrem jeweiligen WT in Abb. 23 und 24 dargestellt. Stamm

231 wurde nicht unter diesen Bedingungen getestet, da der Stamm sich in Calcium-

depletiertem VB-Medium nicht kultivieren ließ.

Page 89: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 89

Abb. 23

tote

Wür

mer

(%)

0

20

40

60

80

100

tote

Wür

mer

(%)

0

20

40

60

80

100

AbbMedVers

Stäm

Erge

Neg

A

Zeit (h)

0 2 4 6 8 10

E. coli DH5α 20265 WT 20265 SCV

tote

Wür

mer

(%)

Zeit (h)

0 2 4 6 8 10

E. coli DH5α 8226 WT 8226 SCV

. 23: Vergleich der Abtötung durch WT unium. Die Werte sind Mittelwerte mit Standa

uchs mit jeweils Dreifachwerten zu verschiede

me wurden dreimal getestet. (A) zeigt die E

bnisse von Stamm 52 und (C) die Ergebnisse v

ativkontrolle.

B

Zeit (h)

0 2 4 6 8 10

0

20

40

60

80

100 E. coli DH5α52 WT52 SCV

C

d SCV in Calcium-depletiertem VB-rdabweichungen eines repräsentativen

nen Zeitpunkten nach der Infektion. Alle

rgebnisse von Stamm 20265, (B) die

on Stamm 8226. E. coli DH5α diente als

Page 90: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 90

Abb. 24

tote

Wür

mer

(%)

0

20

40

60

80

100

tote

Wür

mer

(%)

0

20

40

60

80

100

AbbWer

jewe

wurd

Stam

Neg

A

Zeit (h)

0 2 4 6 8 10

E. coli DH5α20265 WT20265 SCV

Zeit (h)

0 2 4 6 8 10

E. coli DH5α 8226 WT8226 SCV

to

te W

ürm

er (%

)

0

20

40

60

80

100

. 24: Vergleich der Abtötung durch WT unte sind Mittelwerte mit Standardabweichunge

ils Dreifachwerten zu verschiedenen Zeitpun

en dreimal getestet. (A) zeigt die Ergebnisse vo

m 52 und (C) die Ergebnisse von Stam

ativkontrolle.

B

Zeit (h)

0 2 4 6 8 10

E. coli DH5α52 WT52 SCV

C

d SCV in normalem VB-Medium. Die

n eines repräsentativen Versuchs mit

kten nach der Infektion. Alle Stämme

n Stamm 20265, (B) die Ergebnisse von

m 8226. E. coli DH5α diente als

Page 91: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 91

Aus den Abbildungen wird ersichtlich, dass in diesem Modell alle Stämme für C.

elegans pathogen waren. Dabei konnte in Calcium-depletiertem Medium (Abb. 23)

ein Unterschied in der Abtötung zwischen WT und SCV festgestellt werden. Dieser

Unterschied betrug bei 20265 und 52 je nach Zeitpunkt etwa 10 bis 30 %, während

die Unterschiede bei 8226 bis zu 45 % betrugen. Dabei war jedes Mal die SCV

virulenter als der WT. In normalem Medium (Abb. 24) glichen sich die Sterbekurven

von WT und SCV an. Bei 20265 und 52 war nun die Virulenz von WT und SCV etwa

gleich, bei 8226 war die Virulenz des WT weiterhin etwas niedriger als die der SCV.

Um zu überprüfen, ob Kulturüberstände der Bakterien und hitzeinaktivierte Bakterien

ebenfalls virulent waren, wurde die Abtötung von C. elegans unter diesen

Bedingungen ebefalls getestet. Dabei zeigte sich, dass die Abtötung durch

sterilfiltrierte Kulturüberstände maximal 8 % betrug, die Abtötung durch

hitzeinaktivierte Bakterien betrug maximal 11%. Dabei gab es keinen Unterschied

zwischen WT und SCV. Auch ein Vergleich von normalem und Calcium-depletiertem

VB-Medium brachte hier keinen Unterschied (Abbildungen nicht gezeigt).

4.5.2. Einfluss von exsA auf die Abtötung Um festzustellen, ob die Abtötung auch durch Typ III verursacht wurde, wurden

Mutanten von P. aeruginosa eingesetzt, die einen Defekt im exsA-Gen trugen. ExsA,

einer der Hauptregulatoren der Typ III Sekretion, wurde in dieser Studie bereits

erfolgreich im Zellkultur- und Mausmodell getestet. Die Mutanten wurden sowohl in

Calcium-depletiertem als auch normalen VB-Medium getestet.

Die Ergebnisse sind in Abb. 25 und 26 aufgeführt.

Page 92: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 92

Abb. 25 B

tote

Wür

mer

(%)

tote

Wür

mer

(%)

AbenSt

ve

ze

als

A

Zeit (h)

0 2 4 6 8 10

0

20

40

60

80

100E. coli DH5α 20265 WT 20265 SCV 20265 SCVexsA-

Zeit (h)

0 2 4 6

0

20

40

60

80

100 E. coli DH5αTB TBexsA-

b. 25: Vergleich der Abtötung durch tsprechenden WT in Calcium-depletiertem Vandardabweichungen eines repräsentativen V

rschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion. A

igt den Stamm 20265, (B) den Stamm CHA un

Negativkontrolle.

Zeit (h)

0 2 4 6 8

tote

Wür

mer

(%)

0

20

40

60

80

100E.coli DH5α CHA CHA-D1 (exsA)

C

Typ III-defiziente Mutanten und die B-Medium. Die Werte sind Mittelwerte mit

ersuchs mit jeweils Dreifachwerten zu

lle Stämme wurden dreimal getestet. (A)

d (C) den Stamm TB. E. coli DH5α diente

Page 93: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 93

Abb. 26

AbenSt

ve

ze

jew

Abde

die

Ve

na

A

Zeit (h)

0 2 4 6 8 10

tote

Wür

mer

(%)

0

20

40

60

80

100 E. coli DH5α20265 WT20265 SCV20265 SCVexsA

Zeit (h)

0 2 4 6

tote

Wür

mer

(%)

0

20

40

60

80

100 E. coli DH5αTB TBexsA-

to

te W

ürm

er (%

)

b. 26: Vergleich der Abtötung durch Tytsprechenden WT in normalem VB-Mediuandardabweichungen eines repräsentativen Ve

rschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion. Alle

igt den Stamm 20265, (B) den Stamm CHA und

eils als Negativkontrolle.

b. 25 zeigt das Verhalten der Mutanten und

pletiertem VB-Medium. In allen drei Fällen wa

entsprechenden WT, bzw. bei 20265 als die

rhalten wie die exsA-Mutante. Die Unterschie

ch Zeitpunkt und Stamm zwischen 10 und 30

B

Zeit (h)

0 2 4 6 8

0

20

40

60

80

100 E. coli DH5αCHA CHA-D1 (exsA)

C

p III-defiziente Mutanten und die m. Die Werte sind Mittelwerte mit

rsuchs mit jeweils Dreifachwerten zu

Stämme wurden dreimal getestet. (A)

(C) den Stamm TB. E. coli DH5α diente

der entsprechenden WT in Calcium -

ren die Mutanten weniger virulent als

SCV. WT 20265 zeigte ein ähnliches

de in der Abtötung variierten dabei je

%. Wie aus Abb. 26 hervorgeht, ist

Page 94: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 94

diese verringerte Abtötung der exsA-Mutanten Calcium-abhängig. Bei allen drei

Stämmen konnten in normalem VB-Medium keine Unterschiede in der Abtötung

festgestellt werden.

4.5.3. Einfluss von ExoU auf die Abtötung Aus der Literatur (PUKATZKI et al., 2002) ist bekannt, dass ExoU als Virulenzfaktor

in einem Amöben-Modell (Dictyostelium discoideum) für einen Teil der Virulenz

verantwortlich ist. Hier sollte nun getestet werden, in wie weit ExoU für die Abtötung

von C. elegans in Flüssigkultur von Bedeutung ist. Zunächst wurde die ExoU-

defiziente Mutante des P. aeruginosa -Stammes PA 34 (FAUVARQUE et al., 2002)

im Vergleich zum WT unter Standard-Versuchsbedingungen im C. elegans -Modell

getestet. Die Ergebnisse sind in Abb. 27 A für das Slowkilling und in Abb. 27 B für

das Fastkilling graphisch dargestellt.

Anschließend erfolgte die Untersuchung der Virulenz im neuen C. elegans-Modell.

Abb. 27 C und D zeigen die Sterbekinetik von C. elegans im Flüssigkultur-Modell mit

Calcium-depletiertem (C) und normalem (D) Vogel-Bonner-Medium.

Abb. 27

tote

Wür

mer

(%)

0

20

40

60

80

100

A

Zeit (h)

0 10 20 30 40 50

E. coli OP50 PA 34 WT PA 34 ExoU-

tote

Wür

mer

(%)

B

Zeit (h)

0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100 E. coli OP50 PA 34 WT PA 34 ExoU-

Page 95: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 95

tote

Wür

mer

(%)

0

20

40

60

80

100

D

Abderep

Inf

St

St

die

Slo

Ne

Im

St

de

Da

So

Ca

zu

ga

Mu

St

we

eb

ein

C

Zeit (h)

0 2 4 6 8

E.coli DH5α PA 34 WT PA 34 ExoU-

tote

Wür

mer

(%)

b. 27: Vergleich der Abtötung von C. eleg

fiziente Mutante. Dargestellt sind jeweils M

räsentativen Versuchs mit Dreifachwerten zu

ektion. Alle Versuche wurden jeweils zeimal d

andard-Slowkilling und (B) die Ergebnisse im S

erbekinetiken von C. elegans unter Flüssigkultu

Abtötung in Calcium-depletiertem und (D) die

w- und Fastkilling diente E. coli OP50 und in

gativ-Kontrolle.

Slow- und Fastkilling (Abb. 27 A und Bammes von etwa 10 % festgestellt werden

r ExoU-defizienten Mutante keine Unter

gegen war unter Flüssigkultur-Bedingung

wohl der WT als auch die Mutante waren

lcium-depletiertem Medium (Abb. 27 C) w

sehen. Die Würmer verstarben bei Kultivie

b es Unterschiede zum WT bis zu 20 %. Te

tante mehr als 24 h (etwa 5 %, Daten

erbeverhalten der Würmer konnte in norma

rden (Abb. 27 D). Es handelte sich also be

enso wie bei dem Unterschied von SCV z

en Calcium-abhängigen Prozess.

Zeit (h)

0 2 4 6 8

0

20

40

60

80

100 E. coli DH5α PA 34 WTPA 34 ExoU-

ans durch PA 34 WT und eine ExoU-ittelwerte mit Standardabweichung eines

unterschiedlichen Zeitpunkten nach der

urchgeführt. (A) zeigt die Ergebnisse im

tandard-Fastkilling. In (C) und (D) sind die

r-Bedingungen dargestellt. Dabei stellt (C)

Abtötung in normalem VB-Medium dar. Im

den Flüssigkultur-Assays E. coli DH5α als

) konnte eine maximale Virulenz des

. Dabei waren zwischen dem WT und

schiede in der Virulenz feststellbar.

en eine hohe Virulenz festzustellen.

in der Lage, C. elegans zu töten. In

ar ein Unterschied im Sterbeverhalten

rung mit der Mutante langsamer. Dabei

ilweise überlebten die Würmer mit der

nicht gezeigt). Dieser Unterschied im

lem VB-Medium nicht mehr festgestellt

i dem Unterschied von WT zu Mutante

u WT von P. aeruginosa -Isolaten um

Page 96: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 96

Wurden nur sterilfiltrierte Kulturüberstände oder hitzeinaktivierte Bakterien

eingesetzt, wurde eine maximale Sterberate von 11 % in beiden Fällen erreicht.

Dabei war kein Unterschied zwischen WT und Mutante festzustellen (Daten nicht

gezeigt).

Wie bereits durch DACHEUX et al. (2000) beschrieben, ist die Zytotoxizität ExoU-

unabhängig. Der dort verwendete Stamm CHA ist nicht in der Lage, ExoU zu

produzieren, auch der in der vorliegenden Arbeit verwendete Stamm 20265 besitzt

kein ExoU. Versuche im Zytotoxizitäts-Assay mit PA 34 konnten bestätigen, dass die

Zytotoxizität ExoU-unabhängig war (Daten nicht gezeigt).

Bei in vivo Versuchen mit BALB/c-Mäusen konnte dagegen gezeigt werden, dass

ExoU hier für einen Teil der Virulenz verantwortlich war. Die Mortalität ist in Abb. 28

dargestellt.

Abb. 28

Zeit (d)

1 2 3 4 5 6 7

lebe

nde

Mäu

se

0

2

4

6

8

PA 34 WT PA 34 ExoU-

Abb. 28: Vergleich der Virulenz von P. aeruginosa PA 34 und einer ExoU-defizienten Mutante im BALB/c-Mausmodell. Sterbekurve nach intranasaler Infektion von Balb/c-

Mäusen mit 1 x 108 Bakterien. Dargestellt sind die gepoolten Daten aus jeweils zwei

unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.

Page 97: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 97

Wie aus der Graphik zu sehen ist, hatte das Fehlen von ExoU eine Attenuierung zur

Folge. Auch konnte ein milderer Krankheitsverlauf bei den Tieren festgestellt werden,

die mit der ExoU-defizienten Mutante infiziert waren. Überlebende Mäuse nahmen

schnell an Gewicht zu und zeigten bereits ab Tag 5 nach der Infektion keine

Krankheitssymptome mehr. Statistisch ergab sich bei einer Auswertung mittels

Kaplan-Meyer-Survival-Statistik ein signifikanter Unterschied (p = 0,025) zwischen

dem Sterben durch Mutante, bzw. WT.

4.5.4. Abtötung von C. elegans durch P. aeruginosa CHA und ausgewählte Mutanten Durch die bisherigen Versuche konnte gezeigt werden, dass die Typ III Sekretion im

neuen Wurmmodell für einen Teil der Virulenz verantwortlich war. Dies sollte durch

den Einsatz anderer P. aeruginosa-Stämme mit funktionstüchtigem Typ III

Sekretionssystem weiter untersucht werden. P. aeruginosa CHA ist ein CF-Isolat,

das von DACHEUX et al. (1999) in einem Zytotoxizitäts-Modell verwendet wurde.

Weiterhin wurde der Stamm in einer Typ III Sekretions-Studie mit Drosophila

melanogaster (FAUVARQUE et al., 2002) charakterisiert. CHA und einige

ausgewählte Mutanten aus der Drosophila –Studie wurden von I. Attree zur

Charakterisierung im neuen C. elegans -Modell zur Verfügung gestellt. CHA-D1 trägt

eine Mutation im exsA-Gen (wurde in dieser Studie bereits bei der Charakterisierung

des neuen C. elegans -Modells unter Punkt 4.5.2. eingesetzt). CHAdsbA zeigt

aufgrund eines Defekts im dsbA-Gen eine gestörte Proteinfaltung durch Fehlen einer

Thiol-Disulfid-Oxidoreduktase, CHApilV zeigt einen Defekt im Twitching durch

mangelhafte Pili-Ausbildung. CheZ ist für die Chemotaxis verantwortlich. Die Mutante

CHAcheZ ist dementsprechend nicht chemotaktisch wirksam. CHAexsD zeigt

deutlich verringerte Typ III Sekretion durch fehlerhafte Ausbildung des

Sekretionsapparats.

Zunächst wurden die Mutanten im Vergleich zu CHA unter Standard-Bedingungen im

C. elegans -Modell getestet. Die Ergebnisse von CHA im Slow- und Fastkilling sind in

Page 98: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 98

Abb. 29 dargestellt, Tab. 6 zeigt die Virulenz der Mutanten 30 h nach

Versuchsbeginn.

Abb. 29

Zeit (h)

0 10 20 30 40 50

tote

Wür

mer

(%)

0

20

40

60

80

100 E. coli OP50CHA WT

A

tote

Wür

mer

(%)

Abb. 29: Vergleich der Abtötung von C. e

Standard-Slow- und Fastkilling-BedingunStandardabweichung eines repräsentativen Vers

der Infektion. Die Stämme wurden jeweils zwe

Slowkillings, (B) die Ergebnisse des Fastkillin

Negativkontrolle.

Tab. 6

Slowkilling CHA WT Ø CHA-D1 Ø CHAdsbA Ø CHApilV Ø CHAcheZ Ø CHAexsD Ø

Tab. 6: Vergleich des Slow- und Fastkillings

aeruginosa CHA. Dargestellt sind Mittelwerte m

toten Würmern eines repräsentativen Versuchs

wurden jeweils zweimal durchgeführt. Ø steht fü

B

Zeit (h)

0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100 E. coli OP50 CHA WT

legans durch P. aeruginosa CHA unter gen. Dargestellt sind Mittelwerte mit

uchs zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach

imal getestet. (A) zeigt die Ergebnisse des

gs durch CHA. E. coli OP50 diente als

Fastkilling 71,2 ±3,1 75,7 ±7,7 76,8 ±4,2 90,6 ±13,6 99,2 ±0,9 64,7 ±4,7

von C. elegans durch Mutanten von P.

it Standardabweichung der Prozentzahl von

30 h nach Versuchsbeginn. Die Versuche

r avirulentes Verhalten der Bakterien.

Page 99: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 99

Aus den Ergebnissen ist zu sehen, dass weder der WT noch eine der getesteten

Mutanten Virulenz unter Slowkilling-Bedingungen zeigte. Unter Fastkilling-

Bedingungen zeigte der WT eine deutliche Virulenz, ebenso alle getesteten

Mutanten. Unterschiede zum WT konnten nur bei den Mutanten CHApilV und

CHAcheZ festgestellt werden. Bei CHApilV zeigte sich eine um etwa 20% gesteigerte

Sterberate von C. elegans, bei CHAcheZ war eine Steigerung um etwa 30%

festzustellen. Statistisch konnte eine Signifikanz nur bei CHAcheZ im Vergleich zum

WT festgestellt werden (t-Test; p < 0,001). Aufgrund der hohen Standardabweichung

bei CHApilV ergab der t-Test im Vergleich mit dem WT p = 0,07. Auch bei dem

zweiten Versuch konnte keine Signifikanz ermittelt werden (Daten des Versuchs

nicht gezeigt). Die Mutanten CHA-D1 und CHAexsD, die eine gestörte Typ III

Sekretion aufweisen, zeigten im Vergleich mit dem WT keine Attenuierung. Auch die

Mutante CHAdsbA verhielt sich wie der WT.

Die Mutanten wurden anschließend im Vergleich zum WT unter Flüssigkultur-

Bedingungen getestet. Zunächst wurden die Versuche in Calcium-depletiertem

Medium durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abb. 30 dargestellt.

Page 100: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 100

Abb. 30

Zeit (h)

0 2 4 6 8

tote

Wür

mer

(%)

0

20

40

60

80

100 E. coli DH5αCHACHA-D1 (exsA)CHAdsbACHApilVCHAcheZCHAexsD

Abb. 30: Vergleich der Abtötung von C. elegans durch CHA und ausgewählten Mutanten unter Flüssigkultur-Bedingungen. Dargestellt sind Mittelwerte mit

Standardabweichung eines repräsentativen Versuchs in Calcium-depletiertem Vogel-Bonner-

Medium. Die Stämme wurden jeweils dreimal getestet. Die Bakterien wurden bei einer OD650

von 1,0 geerntet. E. coli DH5α diente als Negativ-Kontrolle.

Alle Mutanten außer CHAcheZ zeigten eine gegenüber dem WT verminderte

Virulenz. CHAcheZ zeigte in keinem der Versuche eine Attenuierung gegenüber dem

WT. Überlebende Würmer bei Versuchen mit CHApilV und CHAdsbA waren deutlich

motiler als überlebende Würmer in Versuchen mit CHA-D1 und CHAexsD.

Versuche in normalem Vogel-Bonner-Medium zeigten vergleichbare Ergebnisse. Nur

CHA-D1 und CHAexsD, die beiden Typ III-defizienten Mutanten, glichen sich im

normalen Medium dem WT an (Daten nicht gezeigt).

Im Folgenden wurden neben Bakteriensuspensionen hitzeinaktivierte Bakterien und

sterilfiltrierte Kulturüberstände getestet. In Tab. 7 und 8 sind die Ergebnisse dieser

Untersuchung zusammengefasst. Dargestellt sind die Sterberaten von C. elegans

nach 8 h, d.h. zu dem Zeitpunkt, als alle Würmer in den Bakteriensuspensionen von

CHA WT tot waren. Zu späteren Zeitpunkten (bis 24 h) konnte keine weitere

Steigerung der Sterberate festgestellt werden.

Page 101: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 101

Tab. 7

% Abtötung Standardabweichung CHA WT 18,0 ±1,2 CHA-D1 15,3 ±0,8 CHAdsbA 19,1 ±3,1 CHApilV 16,5 ±2,2 CHAcheZ 18,1 ±1,5 CHAexsD 16,9 ±1,9

Tab. 7: Vergleich der Abtötung von C. elegans durch hitzeinaktivierte Bakterien. Dargestellt sind Mittelwerte mit Standardabweichung eines repräsentativen Versuchs 8 h

nach der Infektion. Die Versuche wurden jeweils zweimal durchgeführt. Die Bakterien

wurden vor Versuchsbeginn für 10 min bei 70 °C inaktiviert.

Tab. 8

% Abtötung Standardabweichung CHA WT 16,1 ±1,7 CHA-D1 13,5 ±2,1 CHAdsbA 17,2 ±2,3 CHApilV 16,0 ±0,4 CHAcheZ 17,6 ±0,9 CHAexsD 15,8 ±3,0

Tab. 8: Vergleich der Abtötung von C. elegans durch Kulturüberstände. Dargestellt sind

Mittelwerte mit Standardabweichung eines repräsentativen Versuchs 8 h nach der Infektion.

Die Versuche wurden jeweils zweimal durchgeführt. Die Bakterien wurden vor

Versuchsbeginn sterilfiltriert.

Aus den Tabellen kann abgelesen werden, dass es keine Unterschiede in der

Abtötung durch Kulturüberstände oder hitzeinaktivierte Bakterien zwischen CHA WT

und den Mutanten gab.

Page 102: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 102

4.5.5. Abtötung von C. elegans durch PA 14 und PAO 1 PA 14 und PAO 1 sind die in den Standard-Assays mit C. elegans am besten

charakterisierten P. aeruginosa -Stämme. Daher lag es nahe, diese Stämme im

neuen C. elegans -Modell zu charakterisieren. Beide Stämme besitzen ein

funktionstüchtiges Typ III Sekretionssystem. PA 14 ist allerdings nicht in der Lage,

ExoS zu produzieren. Im Folgenden werden die Ergebnisse der Versuche mit PA 14

und PAO 1 graphisch dargestellt. Untersucht wurde die Abtötung in Calcium-

depletiertem und normalem VB-Medium (Abb. 31 A und Abb. 32 A). Außerdem

wurden vergleichend Bakteriensuspensionen, hitzeinaktivierte Bakterien und

abzentrifugierte Überstände getestet (Abb. 31 B und Abb. 32 B).

Abb. 31

Zeit (h)

0 1 2 3 4 5 6 7

tote

Wür

mer

(%)

0

20

40

60

80

100 E. coli DH5αPA 14 Ca-depletiertes VB PA 14 normales VB

A

tote

Wür

mer

(%)

Abb. 31: Vergleich der Abtötung von C. ele

verschiedenen Bedingungen. Dargestellt sind

repräsentativen Versuchs zu unterschiedlichen Z

wurden dreimal durchgeführt. (A) zeigt die E

normalem und Calcium-depletiertem VB-Mediu

von Bakteriensuspensionen, hitzeinaktivierten B

diente als Negativ-Kontrolle.

B

Zeit (h)

0 1 2 3 4 5 6 7

0

20

40

60

80

100 E. coli DH5αPA 14 Bakterien PA 14 hitzeinaktiviertPA 14 Überstand

gans durch PA 14 in Flüssigkultur unter Mittelwerte mit Standardabweichung eines

eitpunkten nach der Infektion. Alle Versuche

rgebnisse des Vergleichs der Abtötung in

m. (B) stellt die Ergebnisse des Vergleichs

akterien und Überständen dar. E. coli DH5α

Page 103: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 103

Abb. 32 to

te W

ürm

er (%

)

Abbversrepr

wurd

norm

von

dien

PA

der

Bei

Med

Kult

Beim

spä

A

Zeit (h)

0 1 2 3 4 5 6 7

0

20

40

60

80

100 E. coli DH5α PAO 1 Ca-depletiertes VB PAO 1 normales VB

tote

Wür

mer

(%)

. 32: Vergleich der Abtötung von C. eleg

chiedenen Bedingungen. Dargestellt sind

äsentativen Versuchs zu unterschiedlichen Z

en dreimal durchgeführt. (A) zeigt die E

alem und Calcium-depletiertem VB-Mediu

Bakteriensuspensionen, hitzeinaktivierten B

te als Negativ-Kontrolle.

14 zeigte in Calcium-depletiertem und n

Virulenz, obwohl PA 14 ein funktionstüc

PAO 1 war ein kleiner, aber reprodu

ien feststellbar, wobei die höhere Virul

urüberständen wurden bei PA 14 und PA

Einsatz von hitzeinaktivierten Bakter

ten Zeitpunkten höher (etwa 30%) als du

B

Zeit (h)

0 1 2 3 4 5 6 7

0

20

40

60

80

100 E. coli DH5α PAO 1 Bakterien PAO 1 hitzeinaktiviert PAO 1 Überstand

ans durch PAO 1 in Flüssigkultur unter Mittelwerte mit Standardabweichung eines

eitpunkten nach der Infektion. Alle Versuche

rgebnisse des Vergleichs der Abtötung in

m. (B) stellt die Ergebnisse des Vergleichs

akterien und Überständen dar. E. coli DH5α

ormalem Medium keine Unterschiede in

htiges Typ III Sekretionssystem besitzt.

zierbarer Unterschied zwischen beiden

enz im depletierten Medium auftrat. Mit

O 1 Sterberaten von etwa 40% erreicht.

ien war die Abtötung durch PAO 1 zu

rch PA14 (etwa 20%).

Page 104: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 104

4.5.6. Vergleich der Abtötung von C. elegans durch P. aeruginosa TB und ausgewählte Mutanten von TB

Es konnte bisher durch die eingesetzten SCVs, PA 34, CHA mit seinen Mutanten

und die Stämme PA 14 und PAO 1 festgestellt werden, dass die Typ III Sekretion

einen Teil der Virulenz im C. elegans -Modell in Flüssigkultur ausmacht. Aber ein

großer Teil der Virulenz von P. aeruginosa gegenüber C. elegans in diesem System

konnte damit nicht erklärt werden. Es erschien daher notwendig, Mutanten mit

anderen Defekten in diesem System zu testen. Dazu wurde eine Gruppe von 65

Mutanten des P. aeruginosa-Stammes TB von der AG Tümmler (MH Hannover) zur

Verfügung gestellt. Mit diesen 65 Mutanten erfolgte ein Screening im neuen

Wurmmodell auf abweichende Virulenz im Vergleich mit dem WT. Sechs der

Mutanten wurden zur Veröffentlichung in dieser Arbeit zur Verfügung gestellt. In Tab. 9 sind diese sechs Mutanten mit dem entsprechenden Gendefekt aufgeführt.

Tab. 9

Gen Position Mutation 9B9 PA4613 5171725 Region zwischen dem mechanosensitiven

Kanal mscL und der Katalase katB 18A8 PA3477 3890649 Transkriptionsregulator RhlR, bakterielles

Regulatorprotein, Familie luxR 20D1 PA3102 3481913 XcpS, allgemeines Sekretionsprotein F 25C8 PA4554 5100682 Typ IV Fimbrienprotein PilY, 94%

Ähnlichkeit mit dem pilY1 Genprodukt von P. aeruginosa; 43% Ähnlichkeit mit dem C-Terminus von PilC2 von Neisseria gonorrhoeae und Neisseria menigitidis; Operon PilEY2Y1XWV

D8A3 PA0652 706672 Regulator des Quorum sensing vfr, cAMP-Rezeptor Struktur

D10B10 PA1322 1433166 Möglicher TonB-abhängiger Rezeptor, Ferrichrome-Eisen-Rezeptor (44% Ähnlichkeit mit S. paratyphi), Terminator anscheinend nicht richtig lesbar

Tab. 9: Genort und Funktion der mutierten Gene von Transposon-Mutanten von P.

aeruginosa TB. Die Angaben wurden von der AG Tümmler zur Verfügung gestellt.

Page 105: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 105

Zunächst wurden der TB WT und die sechs Mutanten im C. elegans -Modell im

Standard-Slowkilling und - Fastkilling getestet. Für TB WT sind die Ergebnisse in

Abb. 33 graphisch dargestellt. Tab. 10 gibt die Ergebnisse der Untersuchung der

Mutanten im Vergleich zu TB WT nach 30 h wieder.

Abb. 33

tote

Wür

mer

(%)

AbDa

jew

wu

Er

A

Zeit (h)

0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100E. coli OP50TB WT

tote

Wür

mer

(%)

b. 33: Abtötung von C. elegans durch TB rgestellt sind Mittelwerte mit Standardabwe

eils Dreifachwerten zu unterschiedlichen Ze

rden jeweils zweimal durchgeführt. (A) stellt d

gebnis des Fastkilling-Assays dar. E. coli OP5

B

Zeit (h)

0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100 E. coli OP50 TB WT

WT im Slowkilling- und Fastkilling-Assay. ichung eines repräsentativen Versuchs mit

itpunkten nach der Infektion. Die Versuche

as Ergebnis des Slowkilling-Assays, (B) das

0 diente jeweils als Negativ-Kontrolle.

Page 106: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 106

Tab. 10

Slowkilling Fastkilling TB Ø 91,0 ±3,5 9B9 Ø 90,4 ±1,4 18A8 Ø 79,7 ±4,0 20D1 Ø 94,2 ±5,4 25C8 Ø 62,4 ±2,5 D8A3 Ø 80,1 ±2,7 D10B10 Ø 27,9 ±4,9

Tab. 10: Vergleich von TB-Mutanten im Slow- und Fastkilling. Dargestellt sind

Mittelwerte mit Standardabweichung der Prozentzahl von toten Würmern nach 30 h eines

repräsentativen Versuchs. Die Stämme wurden jeweils zweimal getestet. Ø steht für

avirulentes Verhalten der Bakterien.

Aus den Ergebnissen ist zu sehen, dass weder der WT noch eine der getesteten

Mutanten Virulenz unter Slowkilling-Bedingungen zeigte. Unter Fastkilling-

Bedingungen waren sowohl der WT als auch alle Mutanten virulent. Dabei verhielten

sich die Mutanten 9B9 und 20D1 wie der WT, die Mutanten 18A8, 25C8, D8A3 und

D10B10 waren im Vergleich mit dem WT attenuiert. Eine statistische Auswertung

ergab für alle vier Mutanten, dass die Unterschiede zum TB WT signifikant waren.

18A8 (t-Test; p = 0,02) und D8A3 (t-Test; p = 0,014) führten zu einer um etwa 10%

verminderten Abtötung von C. elegans, die Mutante 25C8 (t-Test; p < 0,001) zeigte

eine um etwa 30% verminderte Abtötung. Am stärksten war die Attenuierung von

D10B10 gegenüber dem WT, hier wurde eine Reduktion der Abtötung um etwa 63%

erreicht (t-Test; p < 0,001).

Die Transposon-Mutanten wurden dann im neuen C. elegans-Modell im Vergleich

zum WT getestet. Dabei wurden unterschiedliche Bakteriendichten getestet. Es

stellte sich heraus, dass zum einen die deutlichsten Unterschiede bei einer OD650

von ca. 0,5 zu detektieren waren, also in der log-Phase, und zum anderen die

Durchführung der Versuche am praktikabelsten war (Sichtbarkeit der Würmer in der

Bakteriensuspension, Dauer des Versuch). Das Ergebnis ist in Abb. 34 dargestellt.

Page 107: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 107

Abb. 34

Zeit (h)

0 1 2 3 4 5 6 7

tote

Wür

mer

(%)

0

20

40

60

80

100 E. coli DH5α TB WT9B9 18A8 20D1 25C8 D8A3 D10B10

Abb. 34: Vergleich der Abtötung von C. elegans durch TB und ausgewählten Mutanten unter Flüssigkultur-Bedingungen. Dargestellt sind Mittelwerte mit Standardabweichung

eines repräsentativen Versuchs in Calcium-depletiertem Vogel-Bonner-Medium zu

unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion. Alle Stämme wurden dreimal getestet. Die

Bakterien wurden bei einer OD650 von 0,5 geerntet. E. coli DH5α diente als Negativ-Kontrolle.

Wie aus der Abbildung zu sehen ist, zeigten bis auf die Mutante 18A8 alle Mutanten

eine verminderte Virulenz im Vergleich zu TB WT, auch die beiden Mutanten 9B9

und 20D1, die unter Standard-Bedingungen nicht auffällig waren.

Die Versuche wurden ebenfalls in normalem VB-Medium durchgeführt. Dabei zeigte

sich nur bei 25C8 ein Unterschied zum Calcium-depletierten Medium. In normalem

Medium glich sich die Virulenz von 25C8 dem WT an, blieb aber immer etwa 4 bis 6

% unter der Virulenz des WT. Alle anderen Mutanten verhielten sich in den

unterschiedlichen Medien gleich (Daten nicht gezeigt).

Es wurden weitere Untersuchungen mit hitzeinaktivierten Bakterien und

abzentrifugierten Kulturüberständen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Tab. 11 und 12 aufgeführt. Dargestellt sind die Sterberaten von C. elegans nach 7 h, d.h.

zu dem Zeitpunkt, als alle Würmer in den Bakteriensuspensionen von TB WT tot

waren. Zu späteren Zeitpunkten (bis 24 h) konnte keine weitere Steigerung der

Sterberate festgestellt werden.

Page 108: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 108

Tab. 11

% Abtötung Standardabweichung TB WT 19,6 ±3,8 9B9 19,5 ±3,9 18A8 30,7 ±1,3 20D1 18,9 ±2,9 25C8 16,5 ±0,8 D8A3 23,8 ±2,6 D10B10 20,1 ±0,9

Tab. 11: Vergleich der Abtötung von C. elegans durch hitzeinaktivierte Bakterien von P. aeruginosa TB und ausgewählte Transposon-Mutanten. Dargestellt sind Mittelwerte

mit Standardabweichung eines repräsentativen Versuchs 7 h nach der Infektion. Alle

Stämme wurden zweimal getestet. Die Bakterien wurden vor Versuchsbeginn für 10 min bei

70 °C inaktiviert.

Tab. 12

% Abtötung Standardabweichung TB WT 25,8 ±2,1 9B9 23,2 ±2,0 18A8 25,3 ±1,3 20D1 25,8 ±3,9 25C8 24,4 ±2,8 D8A3 30,1 ±0,4 D10B10 16,3 ±1,3

Tab. 12: Vergleich der Abtötung von C. elegans durch Kulturüberstände von P.

aeruginosa TB und ausgewählte Transposon-Mutanten. Dargestellt sind Mittelwerte mit

Standardabweichung eines repräsentativen Versuchs 7 h nach der Infektion. Alle Stämme

wurden zweimal getestet. Die Bakterien wurden vor Versuchsbeginn für 10 min bei 3214 g

abzentrifugiert.

Page 109: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Ergebnisse 109

Aus den Tabellen ist ersichtlich, dass beim Einsatz von hitzeinaktivierten Bakterien

nur bei der Mutante 18A8 ein Unterschied zum TB WT festzustellen war. Diese

zeigte eine um etwa 10 % höhere Virulenz gegenüber C. elegans als der WT.

Statistisch ergab sich eine Signifikanz (t-Test; p = 0,009). Die anderen Mutanten

waren in ihrer Virulenz dem WT ähnlich.

Beim Vergleich der Abtötung durch Überstände zeigte die Mutante 18A8 keinen

Unterschied zum WT. Hier war die Mutante D10B10 durch eine um etwa 10 %

verminderte Abtötung im Vergleich zum WT auffällig, was sich bei einer statistischen

Auswertung als signifikant erwies (t-Test; p = 0,003). Die anderen Mutanten zeigten

ein dem WT ähnliches Bild.

Page 110: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Diskussion 110

5. Diskussion

5.1. Autoaggregatives Verhalten von SCVs korreliert mit erhöhter Zytotoxizität durch erhöhte Typ III Sekretion

Das Typ III Sekretionssystem und seine sezernierten Effektorproteine gelten als der

prominenteste Virulenzfaktor von P. aeruginosa. Effektorproteine können über das

Typ III Sekretionssystem entweder in das extrazelluläre Milieu abgegeben werden

oder aber nach Kontaktaufnahme mit eukaryontischen Wirtszellen direkt in diese

transloziert werden. Solche Sekretionssysteme sind bei einigen human- und

pflanzenpathogenen Bakterien zu finden (CORNELIS u. v. GIJSEGEM, 2000;

HUECK, 1998). Zur Injektion in die Wirtszelle werden Proteine zu Strukturen

zusammengelagert, die eine nadelähnliche Form annehmen und mit dieser eine Pore

in der Wirtszellmembran bilden. Dies ist für S. Typhimurium (KUBORI et al., 2000),

Shigella spp. (TAMANO et al., 2000) und enteropathogene E. coli (SEKIYA et al.,

2001) bereits beschrieben. Die Struktur des Translokons von P. aeruginosa ist bisher

nicht vollständig aufgeklärt. SCHOEHN et al. konnten 2003 erste Ergebnisse

bezüglich der Funktion und Interaktion der Translokatorproteine PopD und PopB bei

der Porenbildung in der Wirtszellmembran veröffentlichen. Die Rolle des Proteins

PcrV blieb dabei unklar. Die Funktion der einzelnen Effektorproteine wurde bereits

unter Punkt 2.2. erörtert.

Die Expression des Typ III Sekretionssystems und seiner Effektorproteine erfolgt

vornehmlich in der späten exponentiellen Phase des bakteriellen Wachstums

(DACHEUX et al., 2000; HA u. JIN, 2001), wenn Signale, wie der Kontakt mit einer

eukaryontischen Wirtszelle, Präsenz von Serum und Ca2+-Depletion vorhanden sind

(IGLEWSKI et al., 1978; VALLIS et al., 1999a).

Bei einer Studie zum Auftreten von Typ III Sekretion bei klinischen Isolaten von P.

aeruginosa konnte festgestellt werden, dass 73 % aller Isolate ein Typ III

Sekretionssystem hatten. Dabei stammten die Isolate von Patienten mit CF,

Pneumonie, Sepsis, Wundinfektionen und Harnwegsinfektionen (FELTMAN et al.,

Page 111: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Diskussion 111

2001). Eine andere klinische Studie zeigte, dass die Letalität bei Patienten mit

Infektion eines Typ III sezernierenden Pseudomonas-Isolates signifikant höher lag

als bei Patienten, die mit P. aeruginosa infiziert waren, welcher kein Typ III

Sekretionssystem besaß (ROY-BURMAN et al., 2001). Vor allem eine hohe

Sekretion des Effektorproteins ExoS in Kombination mit PcrV führte zu erhöhter

Letalität. Bei Untersuchungen dieser Isolate in einem Zytotoxizitätsversuch und in

einem Maus-Pneumonie-Modell konnten ähnliche Ergebnisse erzielt werden (ROY-

BURMAN et al., 2001).

Viele Studien berichten, dass sich Stämme von P. aeruginosa aus chronisch

infizierten CF-Lungen durch eine gegenüber Umwelt-Isolaten verringerte Virulenz

auszeichnen (BURKE et al., 1991). Insbesondere sollen CF-Isolate geringere

Mengen an Proteasen, Elastasen und Exotoxin A produzieren (BURKE et al., 1991)

und weniger Typ III sezernierte Effektorproteine, wie ExoT, ExoS, ExoY und ExoU

(ROY-BURMAN et al., 2001). So hat sich die Meinung durchgesetzt, dass das

Habitat der CF-Lunge einen Selektionsdruck zur Ausbildung eines wenig virulenten

Phänotyps darstellt.

Überraschenderweise konnte VON GÖTZ (2003) in seinen genomweiten Analysen

des klinischen WT und der SCV des Stammes 20265 feststellen, dass die SCV

während des exponentiellen Wachstumsphase 33 der 36 Gene, die für die Typ III

Sekretion verantwortlich gemacht werden, deutlich höher exprimierte als der klonale

WT. Besonders stark waren die Unterschiede bei den Effektor- und Porenproteinen.

Dabei war pcrV mit einer um das 270-fache höheren Exprimierung das am stärksten

regulierte Gen, exoS war 90-fach hochreguliert in der SCV. Die anderen Gene waren

um mehr als 30-fach höher exprimiert. WEHMHÖNER (2002) konnte mit

Proteomanalysen des Stammes 20265 die gleichen Unterschiede feststellen. Mit den

genomischen Analysen von VON GÖTZ konnte außerdem nachgewiesen werden,

dass der Stamm 20265 ExoU-defizient ist, was für die meisten CF-Isolate zutrifft

(DACHEUX et al., 2000). In der Regel ist es so, dass entweder ExoS oder ExoU

vorhanden ist (ROY-BURMAN et al., 2001)

Page 112: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Diskussion 112

Das Gen exsA, einer der Hauptregulatoren des Typ III Sekretionssystems (YAHR et

al., 1995; DACHEUX et al., 2001a), war in den Analysen von VON GÖTZ in der SCV

ebenfalls höher exprimiert. ExsA dient dem Typ III Sekretionssystem als Aktivator,

wobei ExsC eine unterstützende Funktion durch Inhibition von ExsD ausübt. In

Abwesenheit von ExsC wird ExsA durch Wechselwirkungen mit ExsD inhibiert

(McCAW et al., 2002; DASGUPTA et al., 2003).

Erstes Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die funktionellen Auswirkungen dieser

erhöhten Expression von Typ III Genen nachzuweisen. Dazu wurden zunächst in

vitro Zytotoxizitätsversuche mit der Maus-Makrophagen Zelllinie J774.A1 nach dem

Vorbild von DACHEUX et al. (1999) durchgeführt. Insgesamt wurden die SCVs von

15 klinischen Isolaten aus der Medizinischen Hochschule Hannover getestet. Davon

gehörten sieben SCVs der von HÄUSSLER et al. (2003) beschriebenen

autoaggregativen Subgruppe an, acht waren nicht autoaggregativ. Im Vergleich zu

den SCVs wurden jeweils die klonalen WT-Phänotypen getestet. Für den Stamm

20265 wurde von I. Attree (Grenoble, Frankreich) eine exsA-knock-out-Mutante der

SCV zur Verfügung gestellt. Die acht nicht-autoaggregativen SCVs zeigten keine

oder nur eine geringfügige Zytotoxizität, ebenso wie ihre klonalen WT (vgl.

Ergebnisse 4.1.2.). Einzige Ausnahme war der WT des Stammes 26, der ein deutlich

zytotoxisches Verhalten aufwies. Anders war die Sachlage bei den Versuchen mit

den SCVs der autoaggregativen Subgruppe (vgl. Ergebnisse 4.1.1.). Hier zeigte sich,

dass vier der sieben SCVs eine im Vergleich zum WT signifikant höhere Zytotoxizität

aufwiesen. Darunter war auch die von VON GÖTZ charakterisierte SCV 20265. Die

vergleichend getestete exsA-Mutante von SCV 20265 zeigte keine Zytotoxizität, was

als Beweis einer Typ III Sekretions-bedingten Virulenz diente. Neben der SCV 20265

waren die SCVs der Stämme 52, 8226 und 231 vermehrt zytotoxisch. Vergleicht man

die Ergebnisse der 15 getesteten Isolate mittels eines Chi-Square-Tests, erhält man

eine signifikante Korrelation zwischen dem autoaggregativen Verhalten der SCVs

und einer erhöhten Zytotoxizität (p < 0,025).

Da für die Stämme 52, 8226 und 231 keine Genom-Analysen vorlagen, wurden Typ

III Sekretions-Proteine mit Hilfe von SDS-Polyacrylamid-Gelen und Western Blots

Page 113: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Diskussion 113

nachgewiesen (vgl. Ergebnisse 4.2.). Hier konnte eine erhöhte Sekretion von

Proteinen des Typ III Sekretionssystems bei allen drei SCVs festgestellt werden.

Somit zeigte sich, dass auch hier die festgestellte Zytotoxizität Typ III-vermittelt war,

wobei auch hier davon ausgegangen werden kann, dass die Zytotoxizität ExoU-

unabhängig war, da keine spezifischen Banden im Gel identifiziert wurden.

Es ist sehr wahrscheinlich, dass die beobachtete, ExoU-unabhängige Zytotoxizität

auf die Bildung kleiner Poren in der Makrophagen-Membran zurückzuführen ist, wie

für den ebenfalls ExoU-defizienten und stark zytotoxischen P. aeruginosa CHA

beschrieben (DACHEUX et al., 1999). Die dabei involvierten Proteine PopB, PopD

und PcrV bilden 2,8 bis 3,5 nm große Poren, die eine schnelle Onkose (Schwellen

der Zelle und des Nukleus, Blasenbildung an der Membran und verstärkte

Vakuolisierung) der eukaryontischen Zelle zur Folge haben. Lysierte Zellen ziehen

dann durch chemotaktische Signale ,Schwärme’ von P. aeruginosa an, die

vermutlich das ausfließenden Cytosol als Nahrungsquelle nutzen (DACHEUX et al.,

2000, 2001b).

Die Ergebnisse der Studie von VON GÖTZ (2003) und die Ergebnisse der

vorliegenden Arbeit (siehe auch folgendes Kapitel) belegen, dass die Etablierung

eines wenig virulenten Phänotyps, wie es für die chronisch infizierte CF-Lunge bisher

angenommen wurde (BURKE et al., 1991; ROY-BURMAN et al., 2001), nur eine von

mehreren Möglichkeiten von P. aeruginosa ist, eine persistierende Infektion

auszubilden. Es scheint, dass es eine parallele Existenz unterschiedlich virulenter

klonaler Varianten gibt. Dieser Befund wird durch das Auffinden von Antikörpern im

Serum von chronisch infizierten Erwachsenen mit CF unterstützt, welche sich gegen

Typ III Effektorproteine richten. Dies spricht für eine Sekretion dieser Proteine auch

nach langem chronischen Infektionsverlauf (MOSS et al., 2001).

Vakzinierungsversuche mit Typ III Effektorproteinen könnten helfen, CF-Patienten

vor zytotoxischen Phänotypen von P. aeruginosa zu schützen. Aktive und passive

Immunisierung über PcrV bewirkte bei Mäusen eine hohe Überlebensrate nach

Infektion mit dem hoch zytotoxischen Stamm P. aeruginosa 103 und verminderte

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Diskussion 114

durch Entzündungsprozesse vermittelte Schäden am Lungenepithel (FRANK et al.,

2002).

5.2. Erhöhte Zytotoxizität von autoaggregativen SCVs korreliert mit erhöhter in vivo Pathogenität

Im vorherigen Kapitel wurde bereits auf die Hintergründe eingegangen, die zur

Untersuchung der Virulenz der klinischen Isolate geführt hatten. Nachdem sich einige

der autoaggregativen SCVs als hoch zytotoxisch im Vergleich zum WT erwiesen

hatten, lag die Frage nahe, ob die erhöhte Typ III Sekretion auch in vivo eine Rolle

spielte. Die Ergebnisse (vgl. Ergebnisse 4.4.1.) zeigen deutlich, dass die SCVs von

20265, 52, 8226 und 231 zu einer signifikant höheren Sterblichkeit der Mäuse nach

intranasaler Infektion führten als die jeweiligen WT. Auch das Krankheitsbild der

Tiere, die mit SCVs infiziert waren, war ausgeprägter als bei mit dem WT infizierten

Tieren. Starke Dyspnoe, purulente Konjunktivitis und ausgeprägte Apathie

kennzeichneten das klinische Bild bei SCV-Infektion. Die Untersuchung der exsA-

Mutante von 20265 SCV konnte zeigen, dass eine Reduktion der Virulenz auftrat,

wenn das Typ III Sekretionssystem ausgeschaltet war (vgl. Ergebnisse 4.4.1.). Zu

späteren Zeitpunkten der Infektion waren die Unterschiede in den Mortalitätsraten

geringer, was dafür spricht, dass die Typ III Sekretions-vermittelte Virulenz sich vor

allem in der frühen Phase der Infektion äußert. Lebendkeimzahl-Bestimmungen (vgl.

Ergebnisse 4.4.2.) in den Organen infizierter Tiere mit den Stämmen 20265 und 52

konnten zeigen, dass die Gesamtkeimzahl bei SCV-infizierten Tieren signifikant

höher lag als nach Infektion mit dem jeweiligen WT. Vor allem auffällig war eine

Bakterienvermehrung gegenüber der Infektionsdosis in der Lunge, was dafür spricht,

dass die SCVs über einen Mechanismus verfügen müssen, der Phagozytose durch

die Entzündungszellen zu entgehen und damit die Möglichkeit zur Replikation zu

erhalten. Histopathologische Untersuchungen der Lungen nach Infektion mit den

Stämmen 20265 oder 52 infizierten Tieren konnten zeigen, dass der Schweregrad

Page 115: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Diskussion 115

der Entzündungsreaktion bei Infektion mit SCVs dem Schweregrad bei Infektion mit

WT, bzw. im Fall von Stamm 20265 der Infektion mit der exsA-Mutante der SCV

glich. Auffällig war jedoch, dass die Lokalisation der Entzündung eine andere war.

WT und SCVexsA verursachten eine akute Bronchopneumonie, während die

Lokalisation der Entzündung bei den SCVs hauptsächlich die alveolären Bereiche

betraf. Weiterhin war auffällig, dass bei SCV-infizierten Tieren massenhaft Bakterien

im Lumen der Alveolen zu sehen waren, was bei WT-, bzw. SCVexsA-infizierten

Tieren deutlich weniger ausgeprägt war (vgl. Ergebnisse 4.4.3.). Gram-Färbungen

der Lungenschnitte konnten dies weiter verdeutlichen. Dieses Ergebnis korreliert mit

den Keimzahlbestimmungen und könnte bedeuten, dass die SCVs über einen

Mechanismus verfügen, der die Phagozytose verhindert, bzw. die phagozytierenden

Zellen effektiv abtötet. Da der einzige Unterschied zwischen 20265 SCV und 20265

SCVexsA die fehlende Typ III Sekretion bei der Mutante ist, kann davon

ausgegangen werden, dass die Typ III Sekretion maßgeblich an diesen

Besonderheiten beteiligt ist.

Aus der Literatur ist bekannt, dass P. aeruginosa durch die Sezernierung von ExoS

und ExoT in der Lage ist, einer aktiven oder passiven Internalisierung

entgegenzuwirken (COWELL et al. 2000). Der Mechanismus, der dem zugrunde

liegt, scheint mit der Regulation des Quorum sensing-Systems zusammenzuhängen.

Eine Studie von COWELL et al. (2003) konnte zeigen, dass eine Interaktion

zwischen ExoS/ExoT-Produktion und lasA/lasB-Aktivität besteht. War die

ExoS/ExoT-Produktion hoch, war das las-System, das für die Invasion von P.

aeruginosa verantwortlich ist, inaktiv. Eine Aktivierung des las-Systems hatte

dagegen eine Verringerung der ExoS/ExoT-Produktion zur Folge und dies führte zu

einer Internalisierung von P. aeruginosa in die Zielzelle.

Auch der zytotoxische Effekt durch Typ III Sekretion ist in der Literatur ausführlich

beschrieben (siehe 5.1.).

Die verminderte Virulenz von exsA-defizienten Mutanten von P. aeruginosa im

akuten Mausmodell wurde bereits von anderen Gruppen beschrieben (WIENER-

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Diskussion 116

KRONISH et al., 1993; KUDOH et al., 1994; HAUSER et al., 1998) und konnte hier

für die SCVexsA von 20265 bestätigt werden.

Desweiteren wurde bislang eine Invasion von P. aeruginosa in Epithelzellen als eine

mögliche Überlebensstrategie vermutet, um sich dem Immunsystem bzw. während

einer Therapie angreifenden antibiotischen Substanzen entziehen zu können. Solch

ein invasives Verhalten von P. aeruginosa wurde besonders in Zusammenhang mit

Infektionen der Augenhornhaut berichtet (FLEISZIG et al., 1994; FLEISZIG et al.,

1995). Die Invasion in Epithelzellen könnte neben der durch Typ III Sekretion

verminderte Phagozytose eine weitere Erklärung für höhere Keimzahlen bei den

SCV-infizierten Tieren sein.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es eine Korrelation zwischen den

Eigenschaften der autoaggregativen Subgruppe der von HÄUSSLER et al. (2003)

beschriebenen SCVs, einer erhöhten in vitro Zytotoxizität und einer erhöhten in vivo

Pathogenität gibt, wobei sowohl die Zytotoxizität als auch ein Großteil der in vivo

Pathogenität der Typ III Sekretion zuzuschreiben ist.

Diese gesteigerte Virulenz steht im Gegensatz zu den bisherigen Studien, die P.

aeruginosa bei chronischer Infektion bei CF eine generell verringerte Pathogenität

zuschreiben. Bisher wurde den SCVs keine besondere Bedeutung beigemessen und

ihre Rolle in der Pathogenese der CF-Lunge ist unklar. Die vorliegende Studie zeigt

jedoch im Zusammenhang mit den Arbeiten von VON GÖTZ (2003), WEHMHÖNER

(2002) und HÄUSSLER et al. (2003), dass es große Unterschiede in der Virulenz von

klonalen Varianten gibt und SCVs in Zukunft vielleicht mehr Bedeutung zugemessen

werden sollte.

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Diskussion 117

5.3. Die Überexpression des pvrR-Gens führt zu einer teilweisen Wiederherstellung des WT-Phänotyps

Die Entstehung des SCV-Phänotyps aus dem WT während einer chronischen

Infektion mit P. aeruginosa ist bislang ungeklärt. DRENKARD u. AUSUBEL (2002)

identifizierten mit pvrR einen möglichen Zwei-Komponenten Response Regulator in

P. aeruginosa PA 14, welcher nach Komplementation von in vitro generierten P.

aeruginosa PA 14 SCVs und einigen anderen SCVs von klinischen Isolaten diese in

schnell wachsende Morphotypen revertierte. Die Koloniemorphologie dieser

Komplementanten und des PA 14 Wildtyps waren identisch. Genomische Deletion

von pvrR im PA 14 WT konnte jedoch keine Konversion von WT zu SCV induzieren.

Lediglich die Frequenz des Auftretens von SCVs in der WT-Population erhöhte sich

in den pvrR-Mutanten. Das Gen pvrR scheint also zwar der Auslöser für die

Reversion von SCV zum WT, bzw. einer Revertante zu sein, ist aber nicht allein

verantwortlich für die Konversion von WT zur SCV. VON GÖTZ (2003) konnte in

seiner Arbeit mittels PCR feststellen, dass das Genom der SCV 20265 ein Gen mit

sehr ähnlicher Sequenz und Länge enthielt. VON GÖTZ (2003) führte eine

Komplementierung mit dem Plasmid pED202, welches das pvrR-Gen enthielt, mit der

SCV von 20265 und zwei weiteren SCVs durch. Bei allen SCVs führte die

Komplementation zu einer großen Kolonieform, die sich deutlich von der Größe der

SCVs unterschied und denen der jeweiligen WT stark ähnelte. In vitro Kultivierungen

der komplementierten SCV 20265 in Vogel-Bonner-Minimalmedium zeigten, dass

diese keine autoaggregativen Fähigkeiten mehr aufwiesen.

In der vorliegenden Studie sollten die Beobachtungen, die DRENKARD und

AUSUBEL, sowie VON GÖTZ gemacht hatten, mit den hier untersuchten SCVs

verifiziert werden. Dazu wurden die SCVs von 52, 8226 und 231 (die alle pvrR in

ihrem Genom enthalten) durch Elektroporation mit dem Plasmid pED202, welches

das Gen pvrR trägt, transformiert (siehe Ergebnisse, 4.3.1). Außerdem wurde die

durch VON GÖTZ hergestellte SCVpED202 von 20265 verwendet.

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Diskussion 118

Bei allen vier Komplementanten konnte festgestellt werden, dass die Koloniegröße

zumindest teilweise im Vergleich zur SCV zunahm (siehe Ergebnisse 4.3.2.1.).

Während jedoch die Morphologie bei den Komplementanten von 20265 und 52

weitgehend den Wildtypen entsprach, waren bei den Komplementanten von 8226

und 231 auch Kolonien zu finden, die in ihrer Größe den SCVs entsprachen.

Versuche zum Schwimmverhalten der Komplementanten (siehe Ergebnisse 4.3.2.2.)

im Vergleich zu SCV und WT zeigten, dass alle Komplementanten ein erhöhtes

Schwimmverhalten im Vergleich zur SCV aufwiesen und sich mehr oder weniger

dem WT anglichen. Bei drei von vier Komplementanten veränderte sich das

Twitching-Vermögen im Vergleich zur SCV und glich sich dem WT-Phänotyp an. Das

Twitching-Vermögen von 20265 SCVpED202 glich dem der SCV (siehe Ergebnisse

4.3.2.3.). In der vorliegenden Arbeit wurde bereits ein Phänomen der

autoaggregativen SCVs, die erhöhte Zytotoxizität gegenüber dem jeweiligen klonalen

WT, erörtert. Die pvrR-Komplementanten wurden ebenfalls auf ihre Zytotoxizität

getestet und dabei mit SCV und WT verglichen. Dabei konnte festgestellt werden,

dass pvrR keinen Einfluss auf die Zytotoxizität bei den Stämmen 20265, 52 und 231

hatte. Komplementanten und SCVs zeigten die gleiche erhöhte Zytotoxizität

gegenüber dem WT, was zu dem Schluss führte, dass die Typ III Sekretion nicht von

pvrR beeinflusst wird. Einzige Ausnahme war der Stamm 8226, wo die

Komplementante im Gegensatz zur SCV keine Zytotoxizität aufwies und sich also

dem WT anglich (siehe Ergebnisse 4.3.3.). Versuche zum autoaggregativen

Verhalten konnten zeigen, dass keine der Komplementanten Autoaggregation zeigte,

wie dies bei den SCVs der Fall war (siehe Ergebnisse 4.3.2.3.).

Auffällig ist, dass der Einfluss von pvrR auf die einzelnen SCV-Phänotypen doch

sehr unterschiedlich war. So wurde der Phänotyp von 8226 bis auf die

Koloniemorphologie nahezu vollständig komplementiert, während die anderen

Komplementanten noch deutliche SCV-Merkmale aufwiesen. Zusammenfassend

kann gesagt werden, dass pvrR mit verantwortlich ist für die Ausprägung des WT-

Phänotyps.

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Diskussion 119

DRENKARD u. AUSUBEL (2002) postulieren, dass die Phänotyp-Konversion über

einen contingency locus bzw. einen phänotypischen Schalter kontrolliert wird, der

einen abrupten Wechsel vom Wildtyp- zum SCV-Phänotyp vermittelt. Je nach

verwendetem Medium und Kultivierungstemperatur konnten sie variierende

Frequenzen von 10-1 bis 10–7 Kanamycin-resistenter SCVs in vitro aus P. aeruginosa

PA14 generieren. Die höchste Frequenz erhielten sie bei der Kultivierung auf

Kanamycin-haltigen Minimalmedien, die niedrigsten auf Komplexmedien. Dies spricht

für eine umweltbedingte Regulation der Phänotyp-Konversion, wie sie im Rahmen

von Phasenvariationen bekannt sind. Das Gen pvrR scheint durch diesen

postulierten phänotypischen Schalter beeinflussbar zu sein. Um den Mechanismus

der Morphotyp-Konversion allein einer Phasenvariation zuzuordnen, müssten die aus

SCVs generierten Revertanten identisch mit den klonalen Wildtypen sein, was für die

von DRENKARD u. AUSUBEL (2002) beschriebenen, in vitro generierten

phänotypischen Varianten zutrifft. Die Ergebnisse von HÄUSSLER et al. (2003) an

der Subgruppe autoaggregativer SCVs und ihren klonalen Morphotypen aus

klinischen Isolaten von CF-Patienten können dies jedoch nicht bestätigen. Die

Genexpressions-Analysen mit SCV 20265 und ihren klonalen Morphotypen (v.

GÖTZ, 2003) bestätigen eindrucksvoll den von HÄUSSLER et al. (2003)

beschriebenen intermediären Phänotyp der Revertanten.

Zwischen der Infektion eines CF-Patienten mit dem Wildtyp bzw. seiner Isolierung

und der Ausbildung einer SCV bzw. seiner Isolierung können mehrere

Mutationsereignisse eingetreten sein, die durch eine stark selektiv wirkende Umwelt

– wie einer therapierten CF-Lunge – hervorgerufen wurden (RAINEY u.

TRAVISANO, 1998; RAINEY u. MOXON, 2000). Es ist an sequentiellen klinischen

Isolaten schwer nachzuvollziehen, wie viele mutative Ereignisse zwischen den als

Wildtyp definierten Isolaten und den SCVs liegen. Bei einer Reversion der SCV

entsteht also möglicherweise ein Phänotyp, der dem unmittelbaren Vorfahren der

SCV entspricht, jedoch nicht selbst als Isolat vorliegt.

DRENKARD u. AUSUBEL (2002) stellten ihre Hypothese der Phasenvariation als

Mechanismus der Morphotyp-Konversion in P. aeruginosa nach Arbeiten mit in vitro

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Diskussion 120

generierten SCVs auf, die direkt aus ihren entsprechenden Wildtypen entstanden

waren. Vermutlich beginnt die Ausbildung morphotypischer Varianten klinischer CF-

Isolate von P. aeruginosa mit einem starken selektiven Druck durch das sich

dynamisch verändernde Habitat der CF-Lunge (RAINEY u. MOXON, 2000). Klinische

Isolate von langzeit-infizierten CF-Patienten stellen somit verschiedene Resultate

einer Vielzahl von evolutionären Prozessen dar. Die Art und Schnelligkeit einer

solchen Evolution ist vermutlich abhängig von den jeweils kolonisierenden P.

aeruginosa -Stämmen und von den besiedelten Patienten. SCVs sind somit ein

Beispiel für eine besonders augenfällige phänotypische Variation. Zwei Szenarien

zur Konversion von Wildtyp zu SCV sind also möglich: Die Konversion könnte

einerseits das Resultat einer (gesteigerten) randomisierten Mutagenese sein, wobei

die Reversion von SCV zur Revertante eine Art kompensatorische Mutation sein

könnte, die den langsam wachsenden Phänotyp wieder aufhebt. Andererseits könnte

sich dem Adaptationsprozess durch randomisierte Mutagenese und Selektion eine

Phasenvariation anschließen, welche die Bildung von SCVs aus schnell wachsenden

Wildtypen auslösen könnte.

5.4. Eignung des neuen C. elegans-Modells als Tiermodell zum Screening bakterieller Mutanten

Wichtige Voraussetzungen für den effektiven Einsatz eines Tieres als Screening-

Modell sind seine unkomplizierte, kostengünstige Haltung und Vermehrung unter

Laborbedingungen mit möglichst geringem Raumbedarf. Weiterhin sind etablierte

Basistechniken zur Kultivierung synchronisierter Kulturen und eine möglichst geringe

Generationsdauer von wenigen Tagen von Nöten. Nur so kann ein Durchsatz einer

hohen Probenzahl gewährleistet werden. Der Nematode C. elegans erfüllt alle diese

Bedingungen. Die umfassende Kenntnis der Physiologie sowie des komplexen

Genoms dieses Tieres sind weitere wesentliche Vorteile. Außerdem besteht eine

hohe genetische Homologie zu Säugern, was die Übertragbarkeit von Ergebnissen

Page 121: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Diskussion 121

möglich macht. Für alle Forschungsarbeiten ist jedoch auch die letale Wirkung der

Bakterien auf C. elegans eine zwingende Voraussetzung. Diese letale Wirkung

wurde für P. aeruginosa bereits gezeigt. Die Gruppe um F. Ausubel (TAN et al.,

1999a, 1999b; MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999) beschrieb vor einigen Jahren das

Pathogenitätsmodell C. elegans - P. aeruginosa. Im Zuge dieser Arbeiten gelang es,

P. aeruginosa -Mutanten mit reduzierter Virulenz zu generieren und im C. elegans -

Modell zu detektieren. Ein Großteil dieser Mutanten zeigte auch im Mausmodell eine

Attenuierung. Interessanterweise schien die Virulenz von P. aeruginosa im

Wurmmodell stark von den äußeren Bedingungen abzuhängen. Beschrieben wurde

in dem C. elegans -Modell ein Wurmsterben auf mit P. aeruginosa PA 14

bewachsenen Agarplatten, wobei bei einem niedrigen Salzgehalt ein Wurmsterben

innerhalb von wenigen Tagen – auch Slowkilling genannt – und bei hohem

Salzgehalt ein deutlich schnelleres Sterben innerhalb von 24 h – das sogenannte

Fastkilling – beobachtet wurde (TAN et al., 1999a). DARBY et al. (1999)

identifizierten zudem eine dritte Art des Wurmsterbens auf BHI-Agar; hierbei wurde

bei Kultivierung auf mit P. aeruginosa PAO1 bewachsenen Agarplatten innerhalb

weniger Stunden eine tödliche Paralyse von C. elegans herbeigeführt (DARBY et al.,

1999). Verantwortlich für diese unterschiedlichen Tötungsarten schien eine Reihe

von Virulenzfaktoren, die abhängig von den äußeren Rahmenbedingungen von P.

aeruginosa exprimiert wurden.

I. ZIEGLER führte 2003 mit CF-Isolaten von P. aeruginosa aus der Medizinischen

Hochschule Hannover Versuche mit Hilfe dieser C. elegans -Assays durch. Dabei lag

der Schwerpunkt auf dem Vergleich der Virulenz der unterschiedlichen klonalen

Morphotypen (WT, SCV und Revertanten). Einige Stämme zeigten eine dem Stamm

PA 14 vergleichbare Virulenz in den beschriebenen Assays. Interessanterweise

zeigte von den in der vorliegenden Studie verwendeten Stämmen nur die SCV von

8226 im Fastkilling Virulenz, der WT war avirulent. Die Stämme 20265 und 52

zeigten weder unter Fastkilling- noch unter Slowkilling-Bedingungen Virulenz. 8226

WT und SCV waren im Slowkilling ebenfalls avirulent. Der Stamm 231 wurde im

Rahmen dieser Studie getestet. Auch hier wurde weder im Fastkilling noch im

Slowkilling Virulenz festgestellt.

Page 122: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Diskussion 122

Um diese avirulenten Stämme untersuchen zu können, mussten Bedingungen

gefunden werden, unter denen es zu einer Expression von Virulenzfaktoren kommt,

die für die Abtötung von C. elegans Bedeutung haben. Durch den Einsatz des Vogel-

Bonner-Minimalmediums wurden diese Bedingungen geschaffen. Neben dem

normalen Vogel-Bonner-Medium wurde auch eine Calcium-depletierte Variante

verwendet, wodurch teilweise andere Virulenzfaktoren angeregt wurden als im

normalen Medium. Im Gegensatz zu den Standard-Assays handelte es sich bei dem

neuen Modell um ein System, das auf einer Flüssigkultur von Bakterien beruht, der

eine bestimmte Menge Würmer zugegeben wurde. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten

wurde die Anzahl der toten Würmer an der Gesamtpopulation gezählt.

Bei den Versuchen mit dem neuen C. elegans -Modell konnte bei allen eingesetzten

SCVs und WT Virulenz festgestellt werden. Die Stämme PA 14 und PAO 1, die zur

Etablierung des C. elegans -Pathogenitätsmodells verwendet wurden (TAN et al.,

1999a, 1999b; MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999; DARBY et al., 1999), zeigten

ebenfalls Virulenz unter den Bedingungen des neuen Versuchssystems. Zur

Charakterisierung dieser Virulenz und der daran beteiligten Virulenzfaktoren wurde

das P. aeruginosa CF-Isolat TB und eine Auswahl von 65 Mutanten verwendet. Eine

der charakterisierten Mutanten ist inzwischen publiziert (JUHAS et al., 2004, in

press). Sechs Mutanten wurden für die vorliegende Arbeit verwendet. Eine der hier

vorgestellten Mutanten zeigte einen Defekt in einem Eisenaufnahme-System

(D10B10), zwei weitere Mutanten wiesen Defekte in der Regulation des Quorum

sensing auf (D8A3, 18A8) und eine Mutante zeigte einen Defekt in einem Protein zur

Typ IV Pili-Bildung (25C8). Bei der Mutante 9B9 inseriert das Transposon zwischen

dem Gen für die Katalase B-Bildung und dem Gen für den mechanosensitiven Kanal

MscL. Die Mutante 20D1 konnte das Protein XcpS, ein Bestandteil des Typ II

Sekretionsapparats, nicht mehr produzieren. Fünf dieser Mutanten wiesen im C.

elegans-System unter Flüssigkultur-Bedingungen eine gegenüber dem WT

reduzierte Virulenz auf, die Mutante 18A8 war in der Virulenz dem WT ähnlich (siehe

Ergebnisse 4.5.6.). Vergleichende Untersuchungen unter Standard-Bedingungen

(Slow- und Fastkilling) zeigten für alle Mutanten und den WT keine Virulenz unter

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Diskussion 123

Slowkilling-Bedingungen. Im Fastkilling waren die Mutanten 18A8 und D8A3 wenig,

die Mutanten 25C8 und D10B10 deutlich attenuiert. Die Mutanten 9B9 und 20D1

zeigten keine Unterschiede im Fastkilling beim Vergleich mit dem WT, was zu der

Schlussfolgerung führte, dass hier Virulenzfaktoren ausgeschaltet sind, die nur unter

Flüssigkultur-Bedingungen Bedeutung haben.

P. aeruginosa benötigt Eisen für die Respiration aerob wie auch unter anaeroben

Bedingungen, wobei der Bedarf bei aerobem Wachstum am höchsten ist (VASIL u.

OCHSNER, 1999). Im menschlichen Körper herrscht ein Mangel an frei verfügbarem

Eisen, da der größte Teil gebunden an Hämoglobin oder Myoglobin vorliegt.

Intrazellulär wird Eisen an Ferritin und im Serum an Transferrin gebunden (BRAUN

et al., 2001). Um trotzdem an genug Eisen zu gelangen, hat P. aeruginosa mehrere

Mechanismen entwickelt. Siderophore (Pyoverdin, Pyochelin) werden von P.

aeruginosa gebildet, um extrazellulär vorliegendes Eisen zu binden (BRAUN et al.,

2001). Neben Rezeptoren für Pyochelin und Pyoverdin gibt es noch sechs weitere

Eisen-Rezeptoren (VASIL u. OCHSNER, 1999). P. aeruginosa verwendet zudem die

Systeme has und phu, um Häm-gebundenes Eisen in die Zelle zu transportieren

(OCHSNER et al., 2000). Siderophore werden durch TonB-Proteine vom Rezeptor in

der äußeren zur inneren Bakterienmembran geschleust (POOLE et al., 1996). An der

Oberfläche von Bakterienzellen gebundenes Eisen kann zusammen mit dem

sezernierten, redox-aktiven Pyocyanin Sauerstoffradikale bilden, die direkt

zellschädigend wirken (BRITIGAN et al., 1992; BRITIGAN et al., 1999). P.

aeruginosa schützt sich selbst vor diesen Radikalen durch die Produktion von

Superoxid-Dismutase, Katalase und Peroxidase, wobei die beiden erstgenannten

Enzyme ebenfalls Eisen-abhängig reagieren (HASSETT et al., 1999).

Da P. aeruginosa ubiquitär vorkommt, mussten viele Mechanismen entwickelt

werden, um in den unterschiedlichen Habitaten das lebenswichtige Eisen

bereitstellen zu können (VASIL u. OCHSNER, 1999).

Die Mutante D10B10 trägt einen Defekt in einem TonB-abhängigen Eisenrezeptor.

Für den Virulenzfaktor Pyocyanin ist beschrieben (s. o.), dass es durch ein

Zusammenwirken von oberflächengebundenem Eisen (z. B. an einen Rezeptor

Page 124: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Diskussion 124

gebunden) und Pyocyanin zu Sauerstoffradikalbildung kommt, die toxische Wirkung

hat. Man könnte spekulieren, dass der bei D10B10 mutierte Eisenrezeptor für die

Bindung des Eisens verantwortlich ist, das mit Pyocyanin zusammenwirkt, oder dass

Pyozyanin selbst bei der Eisen-abhängigen Radikalbildung auch mit dem Rezeptor

assoziiert ist. Bisher ist eine Rezeptorbeteiligung hierfür nicht beschrieben. Allerdings

würde auch die deutlich verminderte Virulenz unter Fastkilling-Bedingungen (63 %

Reduktion; siehe Ergebnisse 4.5.6., Tab. 10) für eine solche Rezeptorfunktion

sprechen, da Pyocyanin einen der bedeutendsten Virulenzfaktoren im Fastkilling

darstellt (TAN et al., 1999 a, b; MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999). Allerdings gibt die

Literatur keine Hinweise, wie der Mechanismus der Abtötung durch Pyocyanin im

Fastkilling abläuft.

P. aeruginosa ist imstande, die Zelldichte seiner Population wahrzunehmen und über

Signalmoleküle zu kommunizieren. Dieses Phänomen wird Quorum sensing (QS)

genannt und ist für viele gram-negative Bakterien bekannt. Es ermöglicht den

Bakterien, statt als Individuum als Gemeinschaft zu agieren. Ist die Zelldichte niedrig,

werden geringe Mengen der Signalmoleküle, auch Autoinducer genannt, produziert

und diffundieren, vermutlich wirkungslos, ins umgebende Medium. Mit wachsender

Zelldichte steigt auch die Konzentration von Autoinducern, bis sie einen kritischen

Schwellenwert erreichen. Zu diesem Zeitpunkt binden diese Autoinducer an

spezifische Rezeptoren, die dadurch aktiviert werden und die Transkription

bestimmter Zielgene induzieren (GREENBERG, 1997). Das erste bei P. aeruginosa

gefundene QS-System wurde als Las-System bezeichnet und besteht aus LasR

(Rezeptor) und LasI (Autoinducer). LasI ist verantwortlich für die Produktion des

Signalmoleküls N-(3-oxododecanoyl)-L-Homoserinlakton. Das Las-System reguliert

die Virulenzfaktoren Elastase, Alkalische Protease und Exotoxin A (GAMBELLO et

al., 1993). P. aeruginosa verfügt noch über ein weiteres QS-System, das sogenannte

Rhl-System, bestehend aus dem Rezeptor RhlR und der Autoinducersynthase RhlI,

die für die Produktion des Signalmoleküls N-butyryl-Homoserinlakton verantwortlich

ist. Das Rhl-System reguliert die Virulenzfaktoren Rhamnolipid, Elastase, Pyocyanin

und Alkalische Protease (OCHSNER u. REISER, 1995). Das Las-System ist dem

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Diskussion 125

Rhl-System übergeordnet (PESCI et al., 1997) und wird selbst durch den Regulator

Vfr reguliert (ALBUS et al. 1997).

Die Rolle des QS in der Virulenz gegenüber C. elegans wurde bereits durch TAN et

al. (1999b) und MAHAJAN-MIKLOS et al. (2000) charakterisiert. Sie konnten zeigen,

dass eine Mutation des LasR-Rezeptors bei PA 14 eine deutliche Attenuierung der

Virulenz gegenüber C. elegans unter Slowkilling-Bedingungen zur Folge hatte. Diese

Form der Virulenz entsteht durch einen Infektions-ähnlichen Prozess mit

Akkumulation der Bakterien im Wirt und erfordert lebende Bakterien. Da eine

Aktivierung des QS erst bei hohen Bakteriendichten erfolgt, ist dies eine Erklärung

für eine Attenuierung von QS-Mutanten unter Slowkilling-Bedingungen. Im Fastkilling

waren solche Mutanten kaum, bzw. gar nicht auffällig. Diese Form der Abtötung ist

toxinvermittelt und erfordert keine lebenden Bakterien (TAN et al., 1999a).

DARBY et al. (1999) konnte in Versuchen mit PAO 1 feststellen, dass die letale

Paralyse von C. elegans Las- und Rhl-abhängig ist. Entsprechende Mutanten von

PAO 1 zeigten bei C. elegans keine Virulenz. Auch in anderen Modellen konnte

bereits gezeigt werden, dass ein Teil der Virulenz QS-abhängig war. So führte eine

LasR-Mutation auch bei Versuchen mit Galleria mellonella (große Wachsmotte) zu

einer reduzierten Virulenz (JANDER et al., 2000).

Die Mutanten D8A3 und 18A8 tragen Defekte in Regulatoren des QS. In D8A3 ist

der vfr-Regulator funktionsuntüchtig, in der Mutante 18A8 liegt der Defekt im

Rezeptor RhlR. Die Versuche mit dem neuen C. elegans-System ergaben eine

Reduktion der Virulenz in D8A3, nicht aber in der Mutante 18A8. Bei Versuchen

unter Fastkilling-Bedingungen ergab sich eine geringe Attenuierung beider Mutanten

gegenüber dem WT.

Es ist nicht verwunderlich, dass ein knock-out von vfr oder rhlR hier im Fastkilling nur

wenig Auswirkung zeigte, da wie bereits erwähnt QS vor allem unter Slowkilling-

Bedingungen detektiert wird. Eine Mutation im vfr-Gen führte im neuen C. elegans-

System zu einer deutlich verminderten Virulenz, während eine rhlR-Mutation keine

Auswirkungen zeigte. Das QS-System scheint also für einen Teil der Virulenz unter

diesen Versuchsbedingungen verantwortlich zu sein, das untergeordnete RhlR-

System hat jedoch keinen Einfluss auf die Abtötung.

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Diskussion 126

Die Mutante 25C8 trägt einen Defekt im pilY1-Gen, das für die Bildung des Typ IV

Pili-Proteins PilY1 verantwortlich ist. Typ IV Pili sind verantwortlich für Twitching und

Zelladhäsion, außerdem sind sie an der Biofilmproduktion beteiligt. Die Biosynthese

der Typ IV Pili ist sehr komplex und beinhaltet eine große Zahl von

Regulatorproteinen und Strukturproteinen (SUNDIN et al., 2002). Die Beteiligung von

Typ IV Pili an der Virulenz von P. aeruginosa wurde in den unterschiedlichsten

Studien beschrieben. GALLAGHER u. MANOIL (2001) fanden eine Pili-Mutante, die

nicht in der Lage war, pilW zu exprimieren und im C. elegans-Versuch (letale

Paralyse) attenuiert war. D’ARGENIO et al. (2001) fanden in Versuchen mit

Drosophila melanogaster ebenfalls Virulenz-attenuierte Pili-Mutanten, allerdings war

hier die von GALLAGHER u. MANOIL (2001) beschriebene pilW-Mutante nicht

auffällig. Auch eine Mutation im pilY1-Gen führte bei Drosophila nicht zu einer

verringerten Virulenz. FAUVARQUE et al. (2002) konnten zeigen, dass eine Mutation

im Gen pilV zu einer Attenuierung führte. Diese Mutante wurde in der vorliegenden

Studie ebenfalls im C. elegans-Versuch unter Flüssigkultur-Bedingungen untersucht

(siehe Ergebnisse 4.5.4.). Beide Pili-Mutanten zeigten unter diesen

Versuchsbedingungen eine Attenuierung. Auffällig war, dass diese Attenuierung bei

25C8 nur unter Calcium-Depletion des Versuchsmediums deutlich wurde. In

normalem Vogel-Bonner-Medium glich sich die Virulenz von 25C8 dem WT an. Die

Calcium-Depletion des Mediums in den C. elegans-Versuchen diente der Aktivierung

von Typ III Sekretion (siehe folgendes Kapitel). Da Pili für die Zelladhäsion

verantwortlich sind und für die Typ III Sekretion ein direkter Zellkontakt nötig ist,

könnte hier ein Zusammenhang bestehen. Ein durch Calcium-Depletion aktiviertes

Typ III Sekretionssystem benötigt Typ IV Pili für die Adhäsion. Bei Defekten in den

Typ IV Pili kommt es zu einer mangelhaften Anheftung an die Zielzelle und damit zu

einer verminderten Funktion des Typ III Sekretionssystems.

Auffällig war weiterhin, dass die Mutante 25C8 auch im Fastkilling zu einer

verminderten Virulenz führte. GALLAGHER u. MANOIL (2001) beschrieben für die

Mutante im pilW-Gen nicht nur eine Attenuierung unter den Versuchsbedingungen im

C. elegans-System, sondern auch eine verminderte Produktion von Cyanid,

Pyocyanin, Pyoverdin und Protease. Ähnliche Bedingungen könnten auch bei der

Page 127: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Diskussion 127

Mutante 25C8 bestehen. Da das Fastkilling toxinvermittelt stattfindet, würde eine

verminderte Produktion von z. B. Pyocyanin zu einer Attenuierung führen.

Bei der Mutante 9B9 inseriert das Transposon zwischen dem Gen für die Katalase

KatB und dem Gen für den mechanosensitiven Kanal MscL. Im C. elegans-Versuch

wies sie unter Flüssigkultur-Bedingungen eine Attenuierung auf, im Fastkilling glich

sie dem WT.

P. aeruginosa besitzt zwei Katalasen, KatA und KatB. Sie dienen dazu,

Sauerstoffradikale (reactive oxigene intermediates = ROIs) unschädlich zu machen.

Diese ROIs entstehen beim Stoffwechsel von P. aeruginosa, stellen aber auch einen

Virulenzfaktor dar. Zum Beispiel werden durch die Interaktion von Pyocyanin mit

Eisen Sauerstoffradikale gebildet, die zellschädigend wirken. P. aeruginosa schützt

sich selbst vor diesen ROIs durch die ständige Produktion von KatA (OCHSNER et

al., 2000). Sauerstoffradikale werden aber auch von Zellen, zum Beispiel

Makrophagen oder neutrophilen Granulozyten, als antimikrobielle Reaktion gebildet.

P. aeruginosa schützt sich vor diesen von außen stammenden ROIs durch die

Produktion von KatB (HOWELL et al., 2000). Der MscL-Kanal wurde zuerst für E. coli

beschrieben. Es handelt sich hierbei um einen mechanosensitiven Kanal, der

essentiell für den Erhalt des Zellturgors, das heißt die Osmoregulation, notwendig ist

(OKADA et al., 2003). Die Expression ist besonders hoch beim Übergang der

Bakterien in die stationäre Wachstumsphase, aber auch in der exponentiellen Phase

wird das Gen exprimiert. Wachstum in hoch osmolaren Medien bewirkt ebenfalls eine

verstärkte Expression von MscL (STOKES et al., 2003). In P. aeruginosa wird MscL

eine Beteiligung an der Proteinsekretion durch die innere Bakterienmembran

zugeschrieben (MA et al., 2003).

In der AG Tümmler konnte mit Hilfe eines H2O2-Tests festgestellt werden, dass das

Transposon keine Auswirkung auf die KatB-Produktion hatte. Der MscL-Kanal wurde

bisher im Rahmen von Virulenz nicht beschrieben. Der Grund für eine Attenuierung

der Mutante 9B9 bleibt dementsprechend unklar.

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Diskussion 128

20D1, eine Mutante mit einem Defekt in der Produktion des Typ II Sekretions-

Proteins XcpS (oder Protein F genannt), zeigte unter Flüssigkultur-Bedingungen eine

Reduktion der Virulenz gegen C. elegans im Vergleich zum WT. Unter Fastkilling-

Bedingungen konnte keine Attenuierung festgestellt werden.

Typ II Sekretion ist ein allgemeiner Sekretionsweg, über den viele Proteine und

Enzyme sezerniert werden, die auch teilweise für die Virulenz des Bakteriums

verantwortlich sind (SANDKVIST 2001a). Es handelt sich dabei um einen

„Multiprotein“-Komplex, an dem je nach Organismus 12 bis 15 Proteine beteiligt sind,

bei P. aeruginosa besteht das System aus 12 Proteinen (FILLOUX et al., 1998). Die

Proteine bilden eine Art Pore zwischen der inneren und äußeren Membran. XcpS ist

assoziiert mit der inneren Membran der Bakterienzelle. Die genaue Funktion und

eventuelle Assoziation mit anderen Bestandteilen ist nicht bekannt. Zusammen mit

den Proteinen XcpD, E und O ist XcpS auch an der Bildung von Typ IV-Pili beteiligt

(SANDKVIST, 2001a). Auf die Funktion von Typ IV-Pili im Rahmen von Virulenz

wurde bereits eingegangen (Mutante 25C8).

Über die Typ II Sekretion werden Proteasen, Lipasen, Elastase, alkalische

Phosphatase, Cellulasen und Pektinasen sezerniert, außerdem ist die Exotoxin A-

Sekretion Typ II-abhängig. Die Rolle des Typ II Sekretionswegs in der Pathogenese

ist nicht im Detail geklärt. Man kann jedoch davon ausgehen, dass bei Pathogenen,

die ihre Toxine über Typ II Sekretion sezernieren, ein funktionstüchtiges Typ II

Sekretionssystem für die Virulenz mit entscheidend ist, was für Vibrio cholerae

gezeigt werden konnte (SANDKVIST, 2001b). MARTINEZ et al. (1998) stellten

individuelle xcp-Mutanten aus dem P. aeruginosa-Stamm K her (alle beteiligten Xcp-

Proteine wurden einzeln ausgeschaltet) und führten Tests zur Fähigkeit der Lipase-,

alkalische Phosphatase- und Phospholipase-Produktion, bzw. Sekretion durch. Der

Ausfall von Xcp-Proteinen führte bei allen individuellen Mutanten mit Ausnahme von

XcpQ zu einem negativen Ergebnis, das heißt, die Mutanten waren nicht mehr in der

Lage, diese Enzyme zu sezernieren.

Die durch Typ II Sekretion sezernierten Enzyme sind im Rahmen der Virulenz vor

allem beteiligt an der Zerstörung bestimmter Strukturen, wie zum Beispiel

Zellmembranen. Durch einen Mangel an diesen Enzymen durch nicht

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Diskussion 129

funktionstüchtige Typ II Sekretion kann die Virulenz dementsprechend reduziert sein.

Dies könnte die Attenuierung der Mutante 20D1 im C. elegans-System erklären.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es durch dieses neue C. elegans-

System möglich ist, unterschiedlichste Virulenzmechanismen von P. aeruginosa zu

detektieren. Einige dieser Mechanismen sind bereits bekannt und können in diesem

System bestätigt werden, andere Mechanismen sind bislang ungeklärt.

5.5. Eignung des neuen C. elegans-Modells als Pathogenitätsmodell zur Messung von Typ III Sekretionssystem-vermittelter Virulenz

Wie bereits erwähnt, war ein Ziel dieser Studie, ein C. elegans -Modell zu etablieren,

in dem es möglich ist, Typ III Sekretions-bedingte Virulenz von P. aeruginosa zu

detektieren. Bisher war es nicht möglich, bei Screening-Versuchen mit C. elegans

unter Standard-Bedingungen, das heißt Slowkilling, Fastkilling oder letale Paralyse,

Mutanten zu finden, die aufgrund einer defizienten Typ III Sekretion attenuiert waren.

Auch gezielte Versuche mit definierten Typ III-Mutanten konnten keine Attenuierung

zeigen (FAUVARQUE et al., 2002; MIYATA et al., 2003). Es lag die Schlussfolgerung

nah, dass das Typ III Sekretionssystem als Virulenzfaktor bei C. elegans keine Rolle

spielt. Allerdings konnten MIYATA et al. (2003) feststellen, dass eine Typ III-

defiziente Mutante von Salmonella enterica im C. elegans-System attenuiert war,

woraus sie den Schluss zogen, dass das Typ III Sekretionssystem bei P. aeruginosa

durch die Prominenz anderer Virulenzfaktoren nur maskiert ist. Aus diesem Grund

wurden zur Charakterisierung des Typ III Sekretionssystems andere Modelle

herangezogen, wie Drosophila melanogaster (FAUVARQUE et al., 2002) oder die

Wachsmotte Galleria mellonella (MIYATA et al., 2003). Aber auch andere Systeme,

wie die Amöbe Dictyostelium discoideum (PUKATZKI et al., 2002) oder die Hefe

Saccharomyces cerevisiae (RABIN et al., 2003; SATO et al., 2003), zeigten sich

empfänglich für Typ III-bedingte Virulenz.

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Diskussion 130

FAUVARQUE et al. (2002) führten ihre Untersuchung zu Typ III-vermittelter Virulenz

mit dem P. aeruginosa -Isolat CHA und einigen ausgewählten Mutanten durch, deren

Defekte Einfluss auf das Typ III Sekretionssystem nehmen. Freundlicherweise

wurden diese Mutanten zusammen mit dem Stamm CHA für Untersuchungen im C.

elegans-System unter Flüssigkultur-Bedingungen zur Verfügung gestellt.

Pseudomonas aeruginosa CHA-D1 trägt einen Gendefekt im exsA-Gen, dem

Hauptregulator der Typ III Sekretion, P. aeruginosa CHAexsD ist nicht in der Lage,

den Sekretionsapparat zu bilden. DsbA ist für eine korrekte Proteinfaltung zuständig,

so dass ein knock-out zu einer Reihe von Ausfällen bei Enzymen und Toxinen führt.

Außerdem reguliert dsbA auch den Regulator der Typ III Sekretion exsA, wobei der

Mechanismus nicht bekannt ist (HA et al., 2003). Eine Attenuierung konnte für dsbA-

Mutanten auch von anderer Seite bestätigt werden (RAHME et al., 1995; JANDER et

al., 2000). Eine weitere Mutante war die Typ IV Pili-defiziente Mutante CHApilV, auf

die bereits im vorigen Kapitel eingegangen wurde. Außerdem wurde eine

Chemotaxis-defiziente Mutante eingesetzt, P. aeruginosa CHAcheZ. Bei den

Versuchen von FAUVARQUE et al. (2002) zeigten sich alle Mutanten außer P.

aeruginosa CHAcheZ in ihrer Virulenz verringert, wobei die exsA- und exsD-

Mutanten sich ähnlich verhielten, die Mutanten CHAdsbA und CHApilV jedoch noch

stärker attenuiert waren.

In den C. elegans-Versuchen unter Flüssigkulturbedingungen in Calcium-depletierten

Vogel-Bonner-Medium konnten ähnliche Ergebnisse erzielt werden. Auch hier war

die Chemotaxis-Mutante nicht attenuiert, die anderen vier Mutanten zeigten eine

gegenüber dem WT verringerte Virulenz, wobei hier kaum Unterschiede zwischen

den einzelnen Mutanten festzustellen waren, mit Ausnahme einer stärkeren Motilität

überlebender Würmer bei CHAdsbA und CHApilV. Auffällig war, dass sich die

Virulenz der Mutanten CHA-D1 und CHAexsD in normalem Medium dem WT

anglichen (siehe Ergebnisse 4.5.4.).

Neben CHA wurden auch die bereits im Zytotoxizitäts-Assay charakterisierten P.

aeruginosa Isolate 20265, 52 und 8226 im neuen C. elegans-System auf ihre

Virulenz überprüft. Die Studie von I. ZIEGLER (2003) hatte ergeben, dass nur 8226

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Diskussion 131

SCV unter Fastkilling-Bedingungen Virulenz zeigte, alle anderen SCVs und die WT

waren avirulent. Unter Slowkilling-Bedingungen waren alle SCVs und WT avirulent.

Unter Flüssigkultur-Bedingungen zeigten sich alle Morphotypen virulent, wobei sich

für alle ein Unterschied zwischen WT und SCV in Calcium-depletiertem Medium

ergab. Hier waren die SCVs virulenter. In normalem Medium glichen sich die

Sterberaten an (siehe Ergebnisse 4.5.1.). Die P. aeruginosa exsA-Mutante der SCV

20265 verhielt sich unter Calcium-Depletion wie der WT, d. h., sie war für C. elegans

weniger virulent als die SCV. In normalem Medium war zwischen SCV, WT und

SCVexsA kein Unterschied in der Abtötung feststellbar. Ähnlich verhielt es sich für

die exsA-Mutante des P. aeruginosa -Stammes TB (siehe Ergebnisse 4.5.2.).

Weiterhin wurde eine ExoU-defiziente Mutante von P. aeruginosa PA 34 im Vergleich

zum WT getestet. Auch hier konnten Unterschiede in der Abtötung unter Calcium-

Depletion festgestellt werden, die im normalen Medium nicht auftraten (siehe

Ergebnisse 4.5.3.).

Zusätzlich wurden die beiden P. aeruginosa-Stämme PA 14 und PAO 1 im neuen C.

elegans-System untersucht. Im Gegensatz zu den anderen eingesetzten Stämmen

konnten bei PA 14 keine Unterschiede zwischen normalem und Calcium-depletierten

Medium festgestellt werden. PAO 1 zeigte geringe, jedoch reproduzierbare

Unterschiede in der Abtötung in normalem oder depletierten Medium (siehe

Ergebnisse 4.5.5.).

Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass ein Teil der festgestellten Virulenz in

diesem C. elegans-System auf Typ III Sekretion zurückzuführen ist. Auffällig ist, dass

die Unterschiede in der Virulenz zwischen den SCVs und den jeweiligen WT nur

unter Calcium-Depletion nachzuweisen waren. Das gleiche galt für die Unterschiede

zwischen SCV und exsA-Mutante, bzw. WT und exsA-Mutante im Fall von CHA und

TB. Auch die Unterschiede zwischen der ExoU-Mutante und ihrem WT war nur unter

Calcium-Depletion nachzuweisen. Die Calcium-Depletion ist seit langem als ein

Stimmulator des Typ III Sekretionssystems bekannt (VALLIS et al., 1999a).

PA 14 besitzt ein funktionstüchtiges Typ III Sekretionssystem, ist jedoch nicht in der

Lage, ExoS zu produzieren (MIYATA et al., 2003). Hier könnte der Grund liegen

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Diskussion 132

warum bei der Untersuchung von PA 14 keine Unterschiede zwischen dem Calcium-

depletierten und dem normalen Medium festgestellt wurden. Den Einfluss der

einzelnen Effektorproteine auf die Abtötung gilt es in zukünftige Studien zu testen.

ExoU scheint in dem neuen C. elegans-Pathogenitätsmodell von Bedeutung zu sein.

Die klinischen Isolate 20265, 52 und 8226 scheinen kein ExoU zu produzieren, auch

CHA ist ExoU-defizient. Dies ist für viele CF-Isolate der Fall. Nur etwa ein Drittel

besitzt das Gen für ExoU (FELTMANN et al., 2001). Weitere Studien haben ergeben,

dass in der Regel entweder ExoS oder ExoU vorhanden ist (ROY-BURMAN et al.,

2001). Die ExoU-defiziente Mutante von PA 34 zeigte im Vergleich mit dem WT eine

verminderte Virulenz, teilweise konnten die Würmer sogar länger als 24 h überleben

(etwa 5 %), was sonst bei keinen der getesteten Bakterien auftrat. PA 14 besitzt

ExoU und Studien mit Galleria mellonella haben ergeben, dass in diesem System

ExoU eine große Rolle in der Virulenz spielt (MIYATA et al., 2003). Auch

Untersuchungen der Typ III Sekretions-bedingten Virulenz in Dictyostelium

discoideum ergaben, dass ExoU einen großen Anteil an der pathogenen Wirkung

hatte (PUKATZKI et al., 2002). Außerdem ist die Pathogenität von ExoU in vielen

Zellkultur-Modellen (FINCK-BARBACON et al., 1997; VALLIS et al., 1999b; HAUSER

et al. 1998, 1999) und im Mausmodell (HAUSER et al., 1998) beschrieben. Auch die

ExoU-defiziente Mutante von PA 34 zeigte sich im Vergleich mit dem WT im

Mausmodell attenuiert (siehe Ergebnisse 4.5.3.). SATO et al. konnten 2003

feststellen, dass ExoU lipolytische Eigenschaften besitzt. Sie konnten eine Patatin-

ähnliche Phospholipase-Domäne in der Aminosäure-Sequenz ausmachen. Patatin ist

ein Enzym mit Esterase-, Lipd-Acyl-Hydrolase- und Acyl-Transferase-Eigenschaften.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Typ III Sekretions-bedingte Virulenz sich

in diesem neuen C. elegans-System nachweisen lässt. Den Anteil, den die einzelnen

Bestandteile dieses Sekretionsapparats an der Virulenz haben, gilt es in zukünftigen

Studien herauszufinden. Ob es möglich ist, dieses System für die Typ III Sekretion

durch Variation der Versuchsbedingungen weiter zu spezifizieren, ist abzuwarten, da

auch viele andere Virulenzfaktoren in dieses System eingreifen, wie unter Punkt 5.4.

gezeigt.

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Zusammenfassung 133

6. Zusammenfassung

Doris Jordan (2004): Charakterisierung von zytotoxischen Pseudomonsa

aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert aus dem Respirationstrakt von Patienten mit Cystischer Fibrose

In der Pathogenese der Cystischen Fibrose (CF) bewirken chronische

respiratorische Infektionen mit P. aeruginosa die schwerwiegendste Komplikation.

Klinische Isolate von P. aeruginosa aus CF-Patienten bilden nach Wachstum auf

diagnostischen Festmedien verschiedenartige Kolonieformen (klonale Morphotypen).

Lange Zeit richtete sich der Fokus auf mukoide Phänotypen von P. aeruginosa, bis

1999 die small colony variants (SCVs) mit chronischen Infektionen von CF-Patienten

in Verbindung gebracht werden konnten. Diese werden in der Routine-Diagnostik

aufgrund ihrer geringen Größe leicht übersehen. Sie korrelieren aber mit einer

besonders schlechten Lungenfunktion der CF-Patienten und erhöhter antibiotischen

Resistenz. Ihre Rolle im Rahmen der Pathogenese der chronischen Infektion ist

jedoch unklar. Deren Aufklärung könnte Einfluss auf neuartige Therapien zur

Bekämpfung chronischer Infektionen mit P. aeruginosa haben. In vorangegangenen

Studien konnte bei einem repräsentativen Vertreter einer autoaggregativen

Subgruppe von SCVs festgestellt werden, dass sowohl auf Transkriptomebene als

auch auf Proteomebene die SCV im Gegensatz zum klonalen Wildtyp (WT) Gene,

bzw. Proteine des Typ III Sekretionssystems um ein Vielfaches hochreguliert hatte.

In der vorliegenden Arbeit sollte die Funktionalität dieser erhöhten Expression

von Typ III Sekretion charakterisiert werden. Dazu wurde ein Zellkultur-Modell zur

Messung Typ III-bedingter Zytotoxizität und ein akutes Pneumonie-Mausmodell

verwendet. Des Weiteren sollte versucht werden, mit Hilfe des Nematoden C.

elegans ein Modell zu etablieren, in dem es möglich ist, Typ III-bedingte Virulenz zu

detektieren. Durch Komplementation der SCVs mit dem Gen pvrR sollte dessen

Bedeutung für den SCV-Phänotyp charakterisiert werden.

Bei Zytotoxizitäts-Versuchen mit 15 klinischen Isolaten von SCVs und klonalen

WT wurde festgestellt, dass vier SCVs gegenüber ihrem WT deutlich zytotoxischer

waren. Alle vier SCVs gehörten in die Subgruppe von sieben autoaggregativen

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Zusammenfassung 134

SCVs. Acht nicht-autoaggregative SCVs zeigten keine Zytotoxizität. Damit ergab sich

eine signifikante Korrelation zwischen dem Phänotyp der autoaggregativen SCVs

und erhöhter, Typ III-bedingter Zytotoxizität.

In vivo Versuche mit BALB/c-Mäusen ergaben, dass die erhöhte Zytotoxizität

der SCVs mit einer erhöhten Mortalität korrelierte, wobei auch hier die Typ III

Sekretion als wichtiger Pathomechanismus eine Rolle spielte. Erhöhte Virulenz

korrelierte zudem mit erhöhten Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz.

Histopathologische Untersuchungen ergaben unterschiedliche Lokalisationen der

Infektion in der Lunge nach Infektion mit SCVs, bzw. den klonalen WT. Durch den

Einsatz einer Mutante mit einem Knock-out im Regulator-Gen exsA der Typ III

Sekretion konnten Typ III Sekretion-spezifische Veränderungen festgestellt werden.

Die Etablierung eines neuen C. elegans-Modells brachte die Möglichkeit,

erstmals Typ III Sekretion-vermittelte Virulenz unter diesen Bedingungen

nachzuweisen und es wurde damit ein neues Screening-Modell geschaffen, mit dem

es möglich ist, unterschiedlichste Virulenzmechanismen von P. aeruginosa zu

detektieren. Die unter Standard-Bedingungen avirulenten SCVs zeigten in diesem

neuen Modell ebenfalls Virulenz, die zu einem Teil auch auf der erhöhten Typ III

Sekretion beruhte.

Versuche, der Ursache des SCV-Phänotyps auf den Grund zu gehen, wurden

mit Komplementation durch pvrR durchgeführt. Überexpression dieses Zwei-

Komponenten-Regulators führte bei allen verwendeten SCVs zu einer teilweisen

Wiederherstellung des WT-Phänotyps. Einige SCV-Eigenschaften, wie die erhöhte

Zytotoxizität, blieben jedoch erhalten, was dafür spricht, dass die Entstehung des

SCV-Phänotyps auf mikroevolutionären Prozessen in der stark selektiv wirkenden

CF-Lunge beruht, die über mehrere Schritte ablaufen.

Die hier beschriebenen SCVs zeigen deutlich, dass die bisher angenommene

verminderte Virulenz von P. aeruginosa in chronisch infizierten CF-Lungen nicht für

alle Morphotypen gilt. Letztendlich könnte das Wissen um die Existenz und die

teilweise hohe Virulenz – nicht zuletzt durch stark erhöhte Typ III Sekretion bedingt –

von SCVs die Entwicklung neuer Therapieansätze gegen chronisch infizierende P.

aeruginosa vorantreiben.

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Zusammenfassung 135

Summary

Doris Jordan (2004): Characterization of cytotoxic Pseudomonas aeruginosa ‘small colony variants’ isolated from the respiratory tract of patients with cystic fibrosis

Chronic respiratory infections with P. aeruginosa are the main complications

in the pathogenesis of cystic fibrosis (CF). Clinical isolates of P. aeruginosa form

various morphotypes when grown on diagnostic solid media. For a long time there

was a focus on mucoide phenotypes, until in 1999 small colony variants (SCVs) were

associated with chronic infections of CF patients. Based on their slow growth these

morphotypes are easily ignored in routine diagnostics, but they can be correlated

with poor lung functions in the CF patients and enhanced antibiotic resistance. The

role of the P. aeruginosa SCVs in the pathogenesis of chronic infections remains

unclear. Detailed analyses may have influence on new therapeutic approaches

against chronic P. aeruginosa infections. In previous studies with one representative

strain of an autoaggregative subgroup of SCVs showed, that with both, transcriptome

and proteome analysis, the SCV showed an upregulation of genes or proteins of the

type III secretion system in comparison to the clonal wildtype (WT).

The objective of this study was to characterize the functionality of this

upregulation of type III secretion. Therefore, a cell culture model to detect type III-

mediated cytotoxicity and a mouse model of acute pneumonia were used.

Furthermore, one objective was to establish a model to detect type III-mediated

virulence by using the nematode C. elegans. By complementation of the SCVs with

the gene pvrR the function of this gene in the SCV phenotype was characterized.

In cytotoxicity experiments with 15 clinical isolates (SCVs and clonal WT) it

was found, that four SCVs showed increased cytotoxicity in comparison to their

clonal WT. All four SCVs belonged to the subgroup of seven autoaggregative SCVs.

Eight non-autoaggregative SCVs showed no cytotoxicity. So there was a significant

correlation between the phenotype of autoaggregative SCVs and increased

cytotoxicity.

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Zusammenfassung 136

In vivo experiments with BALB/c mice showed, that increased cytotoxicity of

SCVs could be correlated with increased mortality of mice in an acute model of

pneumonia. In this model type III secretion was an important pathomechanism.

Increased virulence also correlated with increased bacterial numbers in lung, liver

and spleen. Hisopathological examinations showed that the localization of infection

was different after infection with SCVs or wildtypes. By using a knock out mutant of

the type III secretion regulator exsA type III secretion-dependent alterations could be

found.

In the C. elegans model established it was possible to detect type III

secretion-mediated virulence for the first time in this system. On the other hand a

new screening model was created to detect various virulence factors. Thus, the

SCVs, which were avirulent under standard assay conditions, also showed virulence

in this new model. One part of this virulence was mediated by the increased type III

secretion.

Experiments to find out the development of the SCV phenotype were done by

complementation of SCVs with pvrR as already described for other SCVs.

Overexpression of this two-component-regulator led to a partial restoration of the

wildtype phenotype in all SCVs that were used. But some SCV features, for example

the increased cytotoxicity, still remained. Thus, the development of the SCV

phenotype is likely to be based on microevolutionar processes in the CF lung that

includes several steps.

The SCVs used in this study showed, that the previous assumption of reduced

virulence of P. aeruginosa in chronic infections in the CF lung does not apply to all

morphotypes. Furthermore the knowledge of the existence and the partially

increased virulence – in part dependent on increased type III secretion – of SCVs

may further the development of new therapies against P. aeruginosa in chronic

infected patients.

Page 137: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

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Page 168: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Anhang 168

8. Anhang

8.1. Tabellen- und Abbildungsverzeichnis

SeiteTab. 1 Verwendete Isolate von P. aeruginosa SCVs und WT 34/35Tab. 2 P. aeruginosa TB und Transposon-Mutanten 36Tab. 3 P. aeruginosa -Stämme aus Frankreich 37Tab. 4 Vergleich des Twitching-Vermögens von WT, SCV und

SCVpED202 73Tab. 5 Vergleich der Autoaggregation von WT, SCV und SCVpED202 74Tab. 6 Vergleich des Slow- und Fastkillings von C. elegans durch

Mutanten von P. aeruginosa CHA 98Tab. 7 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch hitzeinaktivierte

Bakterien von CHA und Mutanten 101Tab. 8 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch Kulturüberstände

von CHA und Mutanten 101Tab. 9 Genort und Funktion der mutierten Gene von Transposon-

Mutanten von P. aeruginosa TB 104Tab. 10 Vergleich von TB-Mutanten im Slow- und Fastkilling 106Tab. 11 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch hitzeinaktivierte

Bakterien von TB und ausgewählten Transposon-Mutanten 108Tab. 12 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch Kulturüberstände

von TB und ausgewählten Transposon-Mutanten 108

Page 169: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Anhang 169

SeiteAbb. 1 Schematische Darstellung des Typ III Sekretionssystems gram-

negativer Bakterien 19Abb. 2 Morphotypen WT und SCV von P. aeruginosa 20265 auf

Columbia-Blutagar nach 48 h Inkubation bei 37 °C 26Abb. 3 Der Nematode C. elegans 29Abb. 4 Prinzip der Substratumsetzung im Zytotoxizitäts-Assay 45Abb. 5 Beispielhafte Darstellung der Auswertung des Zytotoxizitäts-

Assays 47Abb. 6

Vergleich der Zytotoxizität von WT und autoaggregativen SCVs

im Zytotoxizitäts-Assay mit J774.A1-Maktophagen (A – G) 58/59Abb. 7 Vergleich der Zytotoxizität von nicht autoaggregativen SCVs

und ihrem klonalen WT (A, B) 61Abb. 8 Silbernitrat-Färbung von SDS-Gelen mit SCVs und ihrem

jeweiligen klonalen WT (A, B) 63Abb. 9 Western Blot mit spezifischen Antikörpern gegen ExoS und

PcrV (A, B) 65Abb. 10 Nachweis von pvrR in den P. aeruginosa-Isolaten 20265, 52,

8226 und 231

66

Abb. 11 Nachweis des Plasmids pED202 (A, B) 68Abb. 12 Nachweis des pvrR-Gens in 52 SCVpED202 68Abb. 13 Vergleichende Darstellung der Koloniemorphologie von WT,

SCV und SCVpED202 70Abb. 14 Vergleichende Darstellung des Schwimmverhaltens von WT,

SCV und SCVpED202 72Abb. 15 Vergleich der Zytotoxizität von WT, SCV und SCVpED202 im

Zytotoxizitäts-Assay mit J774.A1-Makrophagen (A – D) 75Abb. 16 Vergleich der Mortalität von WT und SCV von 20265, 52, 8226

und 231 (A – D) 78Abb. 17 Vergleich der Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz von mit WT,

SCV oder SCVexsA infizierten BALB/c-Mäusen (A, B) 80

Page 170: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Anhang 170

SeiteAbb. 18 Vergleich der histopathologischen Veränderungen in der Lunge

nach Infektion mit 20265 WT, SCV oder SCVexsA; x200 (A–C) 82Abb. 19 Vergleich der histopathologischen Veränderungen in der Lunge

nach Infektion mit 20265 WT, SCV oder SCVexsA; x630 (A–C) 83Abb. 20 Vergleich der histopathologischen Veränderungen in der Lunge

nach Infektion mit 52 WT oder SCV (A – D) 84Abb. 21 Bakterienansammlungen in den Alveolen von SCV-infizierten

Tieren (A, B) 85Abb. 22 Histopathologische Veränderungen im Nasopharynx infizierter

Mäuse (A – C) 86Abb. 23 Vergleich der Abtötung durch WT und SCV in Calcium-

depletiertem VB-Medium (A – C) 89Abb. 24 Vergleich der Abtötung durch WT und SCV in normalem VB-

Medium (A – C) 90Abb. 25 Vergleich der Abtötung durch Typ III-defiziente Mutanten und

die entsprechenden WT in Calcium-depletiertem VB-Medium (A

– C) 92Abb. 26 Vergleich der Abtötung durch Typ III-defiziente Mutanten und

die entsprechenden WT in normalem VB-Medium (A – C) 93Abb. 27 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch PA 34 WT und

eine ExoU-defiziente Mutante (A – D)

94/95

Abb. 28 Vergleich der Virulenz von PA 34 und einer ExoU-defizienten

Mutante im BALB/c-Mausmodell 96Abb. 29 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch P. aeruginosa

CHA unter Standard-Slow- und Fastkilling-Bedingungen (A, B) 98Abb. 30 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch CHA und

ausgewählten Mutanten unter Flüssigkultur-Bedingungen 100Abb. 31 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch PA 14 in

Flüssigkultur unter verschiedenen Bedingungen (A, B)

102

Page 171: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Anhang 171

SeiteAbb. 32 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch PAO 1 in

Flüssigkultur unter verschiedenen Bedingungen (A, B) 103 Abb. 33 Abtötung von C. elegans durch TB WT im Slowkilling- und

Fastkilling-Assay (A, B) 105Abb. 34 Vergleich der Abtötung von C. elegans durch TB und

ausgewählten Mutanten unter Flüssigkultur-Bedingungen 107

Page 172: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Anhang 172

8.2. Geräte

Brutschrank, Fa. Heraeus

Brutschrank, CO2-AUTO-ZERO, Fa. Heraeus

Blotkammer B34, Fa. Biometra

Easy Enhanced Analysis System ((Easy RH-3, Videokamera 429K), Fa. Herolab

Elektrophoresekammer für SDS-Gele, Fa. Biometra

Elektrophoresekammer für Agarose-Gele, Fa. Bio-Rad

ELISA Reader Titertek Multiskan MCC/340, Fa. Flow Laboratories GmbH

Fotomikroskop Axioskop MC80DX, Modell J2-21, Fa. Zeiss

Homogenisator (Ultra-Turrax T8), Fa. IKA Labortechnik

Nematodenschrank (Chromatographieschrank) 2023, Mini Cold Lab, Fa.

Pharmacia LKB

Phasenkontrastmikroskop, Fa. Zeiss

pH-Meter 761 Calimatic, Fa. Knick

Photometer Ultrospec III, Fa. Pharmacia LKB

Schüttelinkubator (Incubator Shaker Model G 25), New Brunswick Scientific Co.

Inc. NJ, USA

Schüttelinkubator (für die Nematoden) KS 130 basic, Fa. IKA Labortechnik

Schüttler Vari-Mix M487220-33, Fa. Thermolyne

Schüttler Rocky, Fa. LTF Labortechnik

SpeedVac Concentrator, Fa. Savant

Thermocycler (PCR), Fa. Landgraf

Tischzentrifuge, Fa. Bachofer

Tischzentrifuge Biofuge 13, Fa. Heraeus

Vortexer, Fa. Heidolph REAX 2000

Zentrifuge Minifuge GL, Fa. Heraeus

Zentrifuge Modell J2-21, Fa. Beckmann

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Anhang 173

8.3. Gebrauchsmaterialien Artikel Firma Best. Nr.

Einmalskalpell, Nr. 15 Feather 0399

Einmalpipetten, 5 ml Sarstedt 86.1253.001

Einmalpipetten, 10 ml Sarstedt 86.1254.001

Falcontubes, 15 ml Greiner Cellstar 188261

Falcontubes, 50 ml Greiner Cellstar 227261

Gel-Blotting-Papier Schleicher&Schuell 10426972

Gene Pulser Cuvette BIO-RAD 165-2086

Impfschlingen Sarstedt 86.1562.050

Küvetten Sarstedt 67.742

Nitrozellulose Transfer- Schleicher&Schuell 401196

Membran (Porengröße 0,45µm)

Pipettenspitzen, gelb Sarstedt 70.760.002

Pipettenspitzen, blau Sarstedt 70.762

PS-Microplatte 96K Greiner Cellstar 650101

PS-Röhrchen, 4,5 ml Greiner Cellstar 120160

PS-Röhrchen, 14 ml Greiner Cellstar 191160

Reagiergefäße, 1,5 ml Sarstedt 72.690

Röntgenfilm, 18 x 24 cm amersham pharmacia biotech RPN 2103K

(HyperfilmTMECLTM)

TC-Plate, 24 well Greiner Cellstar 662160

Wurmplatten (Ø 5 cm) Greiner Cellstar 30625

Zellkulturflasche, 250 ml Greiner Cellstar 658170

Zellschaber, 30 cm TPP 99003

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Anhang 174

8.4. Medien und Zusätze

NGM (Nematode Growth Medium)-Agar 1,5 g NaCl, 8,5 g Agar (Bitek) und 1,25 g Pepton werden in 500 ml Aqua dest. gelöst

und nach Zugabe von Nystatin (5 mg/100 ml) und den unten beschriebenen

Zusätzen* sterilfiltriert.

Agar für den Slowkilling-Assay 1,5 g NaCl, 8,5 g Agar (Bitek) und 1,75 g Pepton werden in 500 ml Aqua dest. gelöst

und nach Zugabe von Nystatin (5 mg/100 ml) und den unten beschriebenen

Zusätzen* sterilfiltriert.

PGS (Pepton Glukose Sorbitol)-Agar für den Fastkilling-Assay 5 g Bactopepton, 5 g NaCl und 8,5 g Bactoagar werden in 500 ml Aqua dest. gelöst

und nach Zugabe von 5 g Glukose, 13,67 g Sorbitol, Nystatin (5 mg/100 ml) und den

unten beschriebenen Zusätzen* sterilfiltriert.

Zusätze für die oben mit * bezeichneten Nährmedien Jeweils 0,5 ml 1 M CaCl2, 0,5 ml Uracil (2 mg/ml), 0,25 ml Cholesterol in Ethanol (10

mg/ml), 12,5 ml 1 M KPO4-Puffer (pH 6,0) und 0,5 ml 1 M MgSO4 werden zu 500 ml

Agaransatz hinzugegeben.

Müller-Hinton-Agar (Difco) 2 g Rindfleischextrakt, 17,5 g Caseinhydrolysat, 1,5 g Stärke und 17 g Agar werden

in 1000 ml Aqua dest. gelöst und autoklaviert.

LB-Medium (Difco) 20 g LB-Broth-Base werden in 1000 ml Aqua dest. gelöst und autoklaviert

Page 175: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Anhang 175

LB-Agar (Difco) 10 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl und 15 g Bactoagar werden in 1000 ml

Aqua dest. gelöst und autoklaviert.

Modifiziertes VB-Medium 3,3 mM MgSO4

11,3 mM Citrat

27,8 mM NaNH4HPO4

37,4 mM K2HPO4

0,2 M Kaliumglukonat

wird mit 1 N NaOH auf pH 7,2 eingestellt und sterilfiltriert.

Ca-depletiertes VB-Medium s.o.

zusätzlich werden zugegeben:

5 mM EGTA

20 mM MgCl2

Swimming-Agar Bitek-Agar 0,3 %: 0,75 g / 250 ml LB

Twitching-Agar Bitek-Agar 1,0 %: 2,5 g / 250 ml LB

Page 176: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Anhang 176

8.5. Puffer und Lösungen

M9-Puffer 21,7 mM KH2PO4

42,3 mM Na2HPO4

86,2 mM NaCl

1 mM MgSO4

5 M NaOH-Lösung 200g NaOH werden in 1000 ml Aqua dest. gelöst und sterilfiltriert.

Puffer A, pH 6, 1 M (zur Herstellung der Zusätze zu Wurmplatten)

1 M K2HPO4 (~ pH 9)

1 M KH2PO4 (~ pH 4)

werden gemischt bis pH = 6 erreicht ist.

Elektrophoresepuffer für SDS-Page Stammlösung (5-fach konzentriert):

60,5 g Tris, 285,3 g Glycin und 100 ml 10%ige SDS-Lösung werden mit Aqua bidest.

auf 2000 ml aufgefüllt.

Gebrauchslösung:

Die Stammlösung wird 1:5 mit Aqua bidest. verdünnt.

(Endkonzentration 25 mM Tris, 190 mM Glycin, 0,1 % SDS)

Blotpuffer für Western Blot Stammlösung (10-fach konzentriert):

58,2 g Tris und 29,3 g Glycin werden mit Aqua bidest. auf 1000 ml aufgefüllt.

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Anhang 177

Gebrauchslösung:

Die Stammlösung wird 1:10 mit Aqua bidest. verdünnt und autoklaviert.

(Endkonzentration 48 mM Tris, 39 mM Glycin)

TBS-T Puffer (für die Chemolumineszenz-Entwicklung von Western Blots)

6,05 g Tris, 8,76 g NaCl und 500 µl Tween 20 werden mit Aqua bidest. auf 1000 ml

aufgefüllt (Endkonzentration 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl)

Silbernitrat-Färbelösungen Fixierer: 30 ml 100% Ethanol und 10 ml 100% Essigsäure werden mit Aqua bidest.

auf 100 ml aufgefüllt (Endkonzentration: 30% Ethanol, 10% Essigsäure)

Lösung II: 30 ml 100% Ethanol, 50 ml 1 M Na-Acetat, 2 ml 25% Glutaraldehyd und 2

ml 10% Na-Thiosulfat werden mit Aqua bidest. auf 100 ml aufgefüllt

(Endkonzentration: 30% Ethanol, 0,5 M Na-Acetat, 0,5% Glutaraldehyd, 0,2%

Thiosulfat)

Silbernitratlösung (Lösung III): 0,1% Silbernitratlösung werden mit 0,01%

Formaldehyd versetzt

Lösung IV: 12,5 ml 20% Na-Carbonat (Endkonzentration 2,5%) werden mit 0,01%

Formaldehyd versetzt

Lösung V: 0,05 M EDTA-Lösung

TBE-Puffer Stammlösung (10-fach konzentriert):

216 g Tris, 110 g Borsäure (H3BO3) und 80 ml einer 0,5 M EDTA-Lösung (pH 8,0)

werden mit Aqua bidest. auf 2000 ml aufgefüllt.

Gebrauchslösung:

Die Stammlösung wird 1:10 mit Aqua bidest. verdünnt

(Endkonzentration 89 mM Tris, 89 mM H3BO3, 2 mM EDTA)

Page 178: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Anhang 178

8.6. Chemikalien

Substanz Firma Best.Nr.___

Acrylamid-Lösung, 30% AppliChem A 1672.0250

Agarose BioWhittaker Molekular 840.004

Applications

Bacto-Agar Difco 0140-01

Bitek-Agar Difco 0138-17

1-Butanol AppliChem A 3066.0100

Calciumchlorid Sigma C-3881

Carbenicillin Serva 15875

Cholesterol ICN Biomedicals 101381

Citrat Sigma C-1909

Cytotoxicity Detection Kit Roche Biochemicals

DMEM Biochrom AG FG 0435

Dneasy Tissue Kit Qiagen 69504

EDTA Merck 1.08421.1000

EGTA Sigma E-8145

Essigsäure Merck 100058

Ethanol J.T.Baker 8006

Formaldehyd Sigma F-1635

Gentamicin Sigma G-1397

D-(+)Glucose Sigma 50-99-7

Glutaraldehyd Sigma G-6257

Glycerin Merck 1.04093.1000

Kaliumdihydrogenphosphat Merck 1.04873.1000

Kaliumglukonat Sigma G-4500

Di-Kaliumhydrogenphosphat Merck 1.05099.10000

LB-Broth-Base Difco 12780-052

LB-Agar Difco 240110

Lumi-Light Western Blotting Substrat Roche Biochemicals

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Anhang 179

Magermilch Merck 1.15363.0500

Magnesiumchlorid Sigma M-4880

Magnesiumsulfat Sigma M-9397

Mini-Plasmidpräparation Kit Machery-Nagel

(NucleoSpin® Plasmid)

Müller-Hinton-Agar Difco 225220

Natriumacetat Merck 1.06265.1000

Natriumammoniumhydrogenphosphat Fluka 71284

Natriumcarbonat Merck 1.6392.0500

Natriumchlorid Merck 106.404.5000

Di-Natriumhydrogenphosphat Merck 1.06580.1000

Natriumhydroxid Merck 1.06498.1000

Natriumhypochlorid, 10-13 % Aldrich/Sigma 42.504-4

Natriumthiosulfat Merck 1.06516.0500

Nystatin Calbiochem 475914

Pepton Merck 1.07214.2500

Proteinstandard Gibco BRL 10748-010

D-Sorbitol Sigma S-1876

SDS Merck 8.22050.1000

Silbernitrat Roth 1493

Temed AppliChem A 1148.0100

Tergitol Fluka 86452

Tetracyclin Sigma T-3383

Tris Serva 37180

Tryptan-Blau-Lösung 0,4% Sigma T-8154

Trypton Difco 0123-15

Uracil Fluka 94220

Page 180: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Anhang 180

8.7. Software

Zur Anfertigung dieser Dissertation wurden die Programme Microsoft Office,

SigmaPlot 2001, SigmaStat 2.0, SPSS 7.0 und Adobe PhotoShop 7.0 verwendet.

Page 181: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Anhang 181

Danksagungen

Mein besonderer Dank gilt Herrn PD Dr. Ivo Steinmetz für die Überlassung des Themas, die

kontinuierliche Betreuung und die vielen anregenden Diskussionen, die diese Arbeit begleitet

haben.

Herrn Prof. Dr. Gerald-Friedrich Gerlach möchte ich herzlich dafür danken, dass er sich

bereit erklärt hat, die Betreuung dieser Dissertation von Seiten der Tierärztlichen Hochschule

zu übernehmen.

Diese Arbeit wurde am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der

Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt. Darum möchte ich auch den Leitern

dieses Instituts, ehemals Herr Prof. Dr. D. Bitter-Suermann und jetzt Herr Prof. Dr. S.

Suerbaum, dafür danken, dass ich meine Arbeit in diesem Umfeld durchführen durfte.

Herrn Prof. Dr. Dr. B. Tümmler möchte ich dafür danken, dass er mich im Europäischen

Graduiertenkolleg „Pseudomonas: Pathogenicity and Biotechnology“ aufgenommen hat und

ich so die Möglichkeit erhalten habe, internationale Erfahrungen im Bereich der

Pseudomonas-Forschung zu machen.

Mein Dank gilt der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die Finanzierung der

Arbeit.

Dem Caenorhabditis Genetics Center, University of Minnesota, St. Paul, MN, USA sei

gedankt für die Überlassung von C. elegans; besonderer Dank gilt in diesem

Zusammenhang Theresa Stiernagle für die prompte und problemlose Zusendung der

bestellten Nematodenstämme.

Ohne meine Arbeitsgruppe wäre ich hoffnungslos verloren gewesen. Deshalb gilt ein ganz

besonderes Dankeschön Birgit Brenneke und Jessika Garlisch für die vielen Tipps und das

offene Ohr, wenn ich kurz vor dem Verzweifeln war. Außerdem möchte ich Torsten Jäger,

Sonja Klocke, Meike Diedrich, Sabine Pilatz, Franz von Götz, Holger Bruns, Nadine Hein und

André Strüßmann für die lustige Gemeinschaft im manchmal sehr anstrengenden Laboralltag

danken. André gilt außerdem ganz besonderer Dank für seinen Einsatz bei

Page 182: Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert ... · Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus

Anhang 182

Formatierungsproblemen und beim Korrekturlesen dieser Arbeit. Außerdem ein herzliches

Dankeschön an alle für die vielen schönen gemeinsamen Abende.

Dr. Ina Attree und Dr. Lutz Wiehlmann möchte ich für die Überlassung der von mir

eingesetzten P. aeruginosa -Mutanten danken.

Ein weiteres Dankeschön gilt Herrn Prof. Dr. K. Kamino und Herrn Arndt aus dem Institut für

Pathologie der MHH für die Unterstützung bei der histopathologischen Bearbeitung und

Diagnostik der Mausexperimente.

Nicht zuletzt gilt mein Dank meinem Bruder Harald, seiner Frau Birgit, ihren Kindern und

dem tierischen Anhang dafür, dass sie mir für die Zeit meines Schreibens ein Zuhause

geboten haben und ich neben aller Konzentration sehr viel Spaß in der Heide hatte.

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Anhang 183

Veröffentlichung von Teilergebnissen

v. Götz, F., Häußler, S., Jordan, D., Saravanamuthu, S., Wehmhöner, D., Lauber, J.,

Attree, I., Buer, J., Tümmler, B. and Steinmetz, I.

Expression analysis of a cytotoxic and biofilm forming small colony variant of

Pseudomonas aeruginosa isolated form a cystic fibrosis lung

J. Bacteriol., in press

Juhas, M., Wiehlmann, L., Huber, B., Jordan, D., Lauber, J., Salunkhe, P., Limpert,

A. S., v. Götz, F., Steinmetz, I., Eberl, L. and Tümmler, B. (2004)

Global regulation of quorum sensing and virulence by VqsR in Pseudomonas

aeruginosa

Microbiology 150: 831-841

Jordan, D., Strüßmann, A., Wiehlmann, L., Ziegler, I., Tümmler, B., Attree, I. and

Steinmetz, I.

working title: Characterization of Pseudomonas aeruginosa virulence using a new

liquid medium based Caenorhabditis elegans fast killing model

Poster: Jordan, D., v. Götz, F., Häußler, S., Tümmler, B., Attree, I. and Steinmetz, I.

Characterization of cytotoxic Pseudomonas aeruginosa ‘small colony variants’

(SCVs) isolated from the respiratory tract of cystic fibrosis patients.

Pseudomonas International Meeting 2003, Québec City, Québec, Canada

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Anhang 184

Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung

ADP Adenosin-Diphosphat

AG Arbeitsgruppe

AHL N-Acyl-Homoserin-Lacton

Aqua dest. Aqua destillata

Aqua bidest. Aqua bidestillata

Bp Basenpaare

C. Caenorhabditis

°C Grad Celsius

Ca Calcium

CF Cystische Fibrose

CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator

CFU Colony Forming Unit

CGC Caenorhabditis Genetics Center

depl. depletiert

DNA Desoxyribonucleinsäure

DMSO Dimethylsulfoxid

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGTA Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraessigsäure

Fa. Firma

g mittlere Erdbeschleunigung 9,81 m/s2

h Stunde(n)

HSL Homoserin Lacton

kb Kilobasen

L Larve

LB Luria-Bertani

LDH Laktat-Dehydrogenase

M Molar

min Minute(n)

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Anhang 185

MHH Medizinische Hochschule Hannover

NGM Nematode Growth Medium

OD Optische Dichte

P. Pseudomonas

PA Pseudomonas aeruginosa

PBS Phosphat-gepufferte NaCl-Lösung

PGS Pepton Glucose Sorbitol

pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration

s Sekunde

SCV Small Colony Variant

SDS-Page Sodiumdodecylsulfate Polyacrylamid-Gelelektrophorese

spp. Spezies

syn. synonym

Tab. Tabelle

ÜN Über Nacht

WT Wildtyp

VB Vogel-Bonner

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Anhang 186

Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation "Charakterisierung von zytotoxischen

Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’ isoliert aus dem Respirationstrakt von

Patienten mit Cystischer Fibrose" selbständig verfasst habe.

Bei der Anfertigung wurden keine Hilfen Dritter in Anspruch genommen.

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten

(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir

unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für die Arbeiten erhalten, die im

Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.

Ich habe die Dissertation am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene

der Medizinischen Hochschule Hannover durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für

Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover angefertigt.

Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen

Zweck zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der

Wahrheit entsprechend gemacht habe.

.........................................................

Doris Jordan

Hassel, den