Radioanalytik in der Bioanalytik - Universität Regensburg · G Pyrimidin C 2 1 6C H R1 N R2 G C N N 3 4 5 C 7 G 8 C H Purin C 2 1 6C 9 R1 N N. Sonden zur Nukleinsäureanalytik Isotop

Radioanalytik in der Bioanalytik

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6. Anwendung in den Biowissenschaften

Radioimmunoassay

DNA-Sequenzierung


Weiterführende Literatur: Lotspeich et al., Bioanalyitk

Radioimmunoassay (RIA)

Immunochemische Reaktionen

Radionuklide als Tracer zur Isolation

erstmals 1959 von Yalow und Berson beschrieben

seitdem breit angewendet in klinischer Medizin

alle RIAs gehören zu den Proteinbindungs-methoden

Basis

jährlich mehr als 10.000.000 allein in den USA

Radioimmunoassay

Messung der Konzentration von

• Serumproteinen

• Hormonen

• Enzymen

• bakterielle Antigene

• Drogen (Rechtsmedizin)

• andere in Blut, Körperflüssigkeiten oder Geweben

Radioimmunoassay

Spezifische Einweiskörper

Antikörper

Zell- oder Membranproteine

Art des Radioassays

Serum

Radio-Immuno-Assay (RIA) immunradiometrischer Assay (IRMA)

kompetitiver Protein-Bindungsassay (CPBA)

Radio-Rezeptorassay (RRA)

Radioimmunoassay (RIA)

wichtigster Radioassay: RIA

Radioimmunoassay

Vorteile: Spezifität

Sensitivität

Versatilität

präzise Messgenauigkeit

Radioimmunoassay

Nachteile: Aufwand beim Umgang mit radioaktiven Stoffen

fehlende Lagerfähigkeit wegenradioaktiven Zerfall

Bei kurzlebigen: Aktivität verschwindet

Bei langlebigen: Radiolyse

Radioimmunoassay

Antigen-Antikörper-Reaktion in Lösung

Kompetitiver RIA

Mischung radioaktiv markierten löslichen Antigens („heißes“ Antigen)

mit steigenden Mengen nicht markierten („kaltem“) Antigen.

Radionuklide: meist 125I, 3H

Radioimmunoassay

• „heißes“, durch Radioaktivität messbares Antigen

Kompetitiver RIA

• durch „kaltes“ Antigen ersetzt

• Verdrängung durch bekannte Antigenmengen kalibriert

• an Standardkurve unbekannte Antigenmenge bestimmt

RadioimmunoassayPharmakokinetik

kinetischen Grundlagen der Antigen-Antikörper-Reaktion

Massenwirkungsgesetz

[Ag] + [Ak] [AgAk] k1

k2

Ag: Konzentration des freien AntigensAk: Konzentration des freien AntikörpersAgAk: Konzentration des gebundenen Antigens

(Antigen-Antikörper-Komplex)

RadioimmunoassayPharmakokinetik des RIA

[AgAk]

[Ag]·[Ak]

k1

k2

Gleichgewichtskonstante: K = =

molare Konzentration der gesamten

(freien F und gebundenen G) Antikörperbindungsstellen

[Akges] = [Ak] + [AgAk]

Das Verhältnis von gebundenem zu freiem Antigen ergibt eine Gerade mit der Steigung K.

RadioimmunoassayPharmakokinetik des RIA

GF

= K · ([Akges] - G)

Das Verhältnis von gebundenem zu freiem Antigen ergibt eine Gerade mit der Steigung K.

RIA

0

50

100

1 10 100 1000

kaltes Antigen [pg]

geb

un

den

es r

ad

iom

ark

iert

es A

nti

gen

[%

]

U.A.

0

50

100

1 10 100 1000

kaltes Antigen [pg]

ge

bu

nd

en

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mark

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nti

ge

n [

%]

U.A.

0

50

100

1 10 100 1000

RadioimmunoassayMessung der gebundenen Antigenmenge erfordert die Trennung vom nicht gebundenen Antigen.

z.B. durch Fällung des Antikörpers

Dabei muss das nicht gebundene Antigen in Lösung bleiben

Fällung von Antikörpern geschieht z.B. in

• Adsorption des Immunkomplexes an Bentonit/Aktivkohle

• 35-50% gesättigter Ammoniumsulfatlösung

• Kopplung an unlöslichen Träger

Entfernung des gebundene Antigens vom nicht-gebundenen

• durch Waschen entfernen

RadioimmunoassayTests für die verschiedensten Plasmabestandteile

Plasmabestandteile Nachweisbare Konzentration [pg/mL]

Proteohormone ACTH

Insulin

Calcitonin

Steroidhormone Testosteron

Progesteron

Pharmaka Digoxin

Drogen Morphin

2

5

10

50

20

100

100

RadioimmunoassayAblauf

• Herstellung reiner Antigene zur Markierung

• radioaktive Markierung der Antigene z.B. 125I, 3H

• Herstellung der spezifischen Antikörper

• Trennung der freien von den gebundenen Antigenen

Reaktionsbedingungen sind genau einzuhalten:

Inkubationszeit, Temperatur, pH, Proteinkonzentration, Molarität und Ionenstärke.

Inkubationszeiten: wenigen Stunden bis mehrere Tage.

Ablauf : DNA-Sequenzierung


Zellwände werden aufgebrochen

doppelsträngige DNA wird denaturiert in Einzelstrangstücke

Konzentration durch Zentrifugation

Durch Anwendung von Enzymen werden die Nukleotidketten weiter in kleinere Stücke zerteilt.

Zu diesen werden markierte Verbindungen hinzugefügt die selektiv an die verschiedenen Fragmente binden.

Ablauf : DNA-Sequenzierung


ursprünglicher DNA-Strang kann in einem Klonprozess direkt markiert werden, z.B. mit 32P

geklonte DNA wird dann aufgeschnitten in Fragmenten mit verschiedenen Restriktionsenzymen

Eletrophorese in einem Gel z.B. Polyakrylamid

Autoradiographie: Charakteristische Linien

Informationen über das Individuum, von dem die DNA entnommen wurde

Markierungspositionen


Hauptsächlich: Nucleosidtriphophate

Am häufigsten: 32P oder 33P-Phosphatmarkierung:

Austauschposition - oder -Position der Phosphatreste in

2`-Desoxyribo-, 3`-Desoxyribo(Cordycepin)- oder 2`-Ribonucleotiden.

Im Fall von 35S erfolgt der Austausch gegen ein Sauerstoffatom des -Phosphats.

Markierungspositionen


A

O O O

│ │ │ O

O P O P O P O CH2

││ ││ ││ │

O O O

│ H H

H H

R2

R1

R1

= H; R2

= OH 2`-Desoxyribose

R1

= OH; R2

= H 3`-Desoxyribose

R1

= R2

= OH Ribose

Purin- oder

Pyrimidin-

base

Sonden zur Nukleinsäureanalytik

B R2

│

C R3

N34 5C

│ Pyrimidin

C2 1

6C H

R1

N

R2

│

C N N3

4 5C 7

│ 8C H Purin

C2 1

6C9

R1

N N

Sonden zur Nukleinsäureanalytik

Isotop Art der

Strahlung

EMax

[MeV]

Halbwerts-

Zeit

Anwendungen Eigenschaften

3H 0,0118 12,3 Jahre in situ niedrige Sensitivität

hohe Auflösung

35S 0,167 87,4 Tage Filter-Hybridisierung mittlere Sensitivität

gute Auflösung

125I 0,035

0,035

60,0 Tage in situ mittlere Sensitivität

hohe Auflösung

32P 1,71 14,2 Tage Filter-Hybridisierung

Sequenzierung

höchste

Strahlungsenergie

höchste Sensitvität

mittlere Auflösung

(Streustrahlung)

DNA-Sequenzierung: Detektion radioaktiver Nucleinsäuren


• Autoradiographie

Strahlende Fläche

Membran,

Gel,

Zellrasen,

Gewebsschnitt

wird direkt mit dem Röntgenfilm in Kontakt gebracht.



• Flourographie

Strahlende Fläche wird mit floureszierenden Chemikalien überschichtet; die die radioaktive Strahlungsenergie in Floureszenz umwandelt.

Flourophore: 2,5-Diphenyloxazol (PPO) und Natriumsalicylat.



• Indirekte Autoradiographie mit Verstärkungsfolien

(intensifyer screens):

Hochenergetische -Strahlung wird durch Phosphatreste der Verstärkungsfolie absorbiert und in blaues Licht umgewandelt. Cerenkov-Effekt



• Flüssige Emulsionen für cytologische oder cytogenetische in situ-Anwendungen:

niedrig- bis mittelenergetischen 3H- bzw. 35S-Strahler verlangen direkten Kontakt des Detektionsmediums

die feste Emulsion wird bei 45°C verflüssigt und der Objektträger eingetaucht. Nach Trocknen erfolgt die Exposition bei 4 °C unter Lichtausschluss für Tage bis zu mehreren Monaten.



• Vorexponierte Röntgenfilme für direkte Autoradiographie und Fluorographie:

nur für Fluorographie oder Verstärkungsfolien (Lichprozesse)

Gelgestützte DNA-Sequenzierungsverfahren


quervernetzte Polyacrylamidgele zwischen planaren Glasplatten und linear polymerisierte Gele in Glaskapilaren.

beruhen auf der Erzeugung von basenspezifisch endenden DNA-Populationen, die in einer nachfolgenden denaturierenden Polyacrylamidgelelektrophorese nach ihrer Größe getrennt werden.

Gelgestützte DNA-Sequenzierungsverfahren


Die Erzeugung dieser Populationen kann auf zwei unterschiedlichen Wegen erfolgen:

Die Reaktionsprodukte können durch die Synthese eines DNA-Stranges erzeugt werden.

Die Gelelektrophorese wird in ultradünnem Gelen (d < 0,35 mm) oder Kapillaren durchgeführt. Die Verwendung von Kapillaren ist jedoch mit Problemen bei der Befüllung der Kapillaren, der Polymerisation der Gelmatrizen und damit geringeren Leseweiten behaftet.

Sequenzierung nach Sanger: Didesoxy-Verfahren


Kettenbruchverfahren oder Terminatorverfahren

basiert auf der enzymatisch katalysierten Synthese einer Population von basenspezifisch terminierten DNA-Fragmenten,

die nach ihrer Größe gelelektrophoretisch getrennt werden können.

Ausgehend von einer bekannten Startsequenz wird durch Zugabe

• eines Sequenzierungsprimers

• eines Nucleotidgemischs und

• einer DNA-Polymerase

die Synthese eines komplementären DNA-Stranges initiiert



Primer ist notwendig, um

• eine definierte Startstelle zu erhalten

•den Synthesebeginn der DNA-Polymerase einzuleiten.

Primer: ein kurzes DNA-Oligonucleotid von ca. 20 Bp



Start:

Reaktion wird in vier parallelen, aliquoten Ansätzen gleichzeitig gestartet, die sich nur durch die Verwendung eines unterschiedlichen Nucleotidgemischs unterscheiden.

Die mit A, C, G und T bezeichneten Reaktionen enthalten eine Mischung aus

• natürlich vorkommenden 2´-Desoxynucleotiden und

• synthetischer 2´, 3´-Didesoxynucleotide als Terminatoren.



Verlauf:

Während der Strangsynthese durch die schrittweise Kondensation von Nucleosidtriphosphaten in 5´ → 3´-Richtung kann es nur zu zwei unterschiedlichen Reaktionsereignissen kommen:

(A) Bei der Kondensation der 5´-Triphosphatgruppe eines 2´-Desoxynucleotids (dNTP) mit dem freien 3´-Hydroxyende des DNA-Strangs entsteht unter Freisetzung von anorganischem Pyrophosphat ein um eine Base verlängertes DNA-Molekül, das wiederum die freie 3´-Hydroxygruppe besitzt.

Die Synthese kann also im nächsten Schritt fortgesetzt werden.



Verlauf:

Während der Strangsynthese durch die schrittweise Kondensation von Nucleosidtriphosphaten in 5´ → 3´-Richtung

kann es nur zu zwei unterschiedlichen Reaktionsereignissen kommen:

(B) Kommt es hingegen zu einer Kondensationsreaktion zwischen dem freien 3´-Hydroxyende eines DNA-Strangs der 5´-Triphosphatgruppe eines 2´, 3´-Didesoxynucleotids, ist nach Einbau dieses Nucleotids eine Verlängerung des Strangs nicht mehr möglich, da keine freie 3´-Hydroxygruppe vorhanden ist.

Der Strang ist terminiert.


A

PPi

Desoxynucleotid

B

PPi

Didesoxynucleotid

PPP H OHPPP

H

A T

A

5´ OH 5´

T G A CT G A C

T G T A

T

OH

3´ 3´

PPP

5´ 5´

A C T G T A A

G T A

T G A C

OH

A

3´

A C T

OH

A

PPP

C

G AT

T G A C

OH

3´

A C T

Es entstehen Reaktionsprodukte von bis zu 1000 Bp Länge

Radioanalytik in der Bioanalytik Prinzip des Kettenabbruchverfahrens nach Sanger

In einer geprimten, durch eine Polymerase katalysierten DNA-Synthesereaktion werden basenspezifisch teminierte DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge syntethisiert. Diese Fragmente erzeugen in der Gelelektrophorese ein spezifiches Bandmuster, das zur Rekonstruktion der Basenfolge dient.


Primer 5´ 3´

Matrize 3´

+ dNPTs + Polymerase

+ ddATP + ddCTP + ddGTP + ddTTP

GCTCTCA GC G GCT

GCTC GCTCTCAG GCTCT

GCTCTC

A C G T

▬▬▬ G 3´

▬▬▬ A

▬▬▬ C

▬▬▬ T

▬▬▬ C

▬▬▬ T

▬▬▬ C

▬▬▬ G 5´

5´

Ele

ktr

oph

ore

se

Lese

rich

tun

g

Radioanalytik in der Bioanalytik A C G T

▬▬ A

▬▬ T

▬▬ C

▬▬ ▬▬ G

▬▬ G

▬▬ G

▬▬ C

▬▬ ▬▬ T

▬▬ C

▬▬ G

▬▬ T

▬▬ ▬▬ G

▬▬ T

▬▬ G

▬▬ C

▬▬ ▬▬ G

▬▬ T

▬▬ T

▬▬ A

▬▬ ▬▬ C

▬▬ C

▬▬ T

▬▬ C

▬▬ ▬▬ G

▬▬ A

▬▬ C

▬▬ A

▬▬ ▬▬ G

▬▬ T

▬▬ T

▬▬ G

▬▬ ▬▬ T

▬▬ G

▬▬ T

▬▬ A

▬▬ ▬▬ G

▬▬ C

▬▬ T

▬▬ G

▬▬ ▬▬ G

▬▬ A

▬▬ C

▬▬ G

▬▬ ▬▬ T

Autoradiogramm eines Sequenzierungslaufes.Jeweils vier benachbarte Spuren repräsentieren die Teilreaktionen A, C, G und T eines Klons. Entsprechend der Laufrichtung des Gels befinden sich die kleineren Reaktionsprodukteam unteren Ende der Abbildung. Jede Bande unterscheidet sich von der vorhergehenden im Idealfall um eine Base.

Radioanalytik in der Bioanalytik Markierungstechniken und Nachweisverfahren (Isotopenmarkierung)

Basis der Verwendung radioaktiver Isotope in der DNA-Sequenzierung:

• Sie diskriminieren nicht zwischen verschiedenen Isotopen

• Der Einbau in DNA-Strang führt zu keinen Mobilitätsänderungen im Gel.

• 32P und 35S

• Expositionszeiten bei Autoradiographie mit 32P kürzer

• Ortsauflösung mit 32P ist jedoch aufgrund der energetisch bedingten größeren Schwärzungsbereiche bedeutend geringer

• für längere DNA- Sequenzierungsläufe 35S bevorzugt

Radioanalytik in der Bioanalytik Markierung erfolgt:

durch radioaktiv markierten Primer oder

während der Sequenzierungsreaktion

Die radioaktive Markierung eines DNA-Sequenzierungsprimers erfolgt durch eine Phosphatierung mit gamma-32P-ATP und Polynucleotid-Kinase.

Die durch chemische Synthese produzierten Primer besitzen freie 5´-OH-Gruppe, die direkt, d.h. ohne Dephosphorylierung phospohoriliert werden können.

Die Markierung während der Didesoxy-Sequenzierungsreaktion erfolgt durch Zugabe von alpha-32P-ATP.

Das Isotop wird in den synthetisierten DNA-Strang eingebaut, der somit nachweisbar wird.

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