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CD-Spektroskopie
Seminar zur Vorlesung »Proteinchemie & Enzymologie«
Leipzig, 14.06.2019
Ferdinand Holzhausen
Gliederung des Vortrags
CD-SPEKTROSKOPIE
1. Polarisationen des Lichts
2. Aufbau eines Spektropolarimeters
3. Circulardichroismus von Proteinen
4. Physikalische Größen & Grundgleichung
5. Auswertung von CD-Spektren
6. Einsatz von CD-Spektren
Leipzig, 14.06.2019
Ferdinand Holzhausen
3 3
CD-Spektroskopie | Ferdinand Holzhausen Institut für Biochemie, Brüderstraße 34, 04103 Leipzig
[1] www.chemgapedia.de (Ausbreitung elektromagnetischer Wellen, 2016)
POLARISATIONEN DES LICHTS
LICHT ALS ELEKTROMAGNETISCHE WELLE
4 4
CD-Spektroskopie | Ferdinand Holzhausen Institut für Biochemie, Brüderstraße 34, 04103 Leipzig
[2] www.spektrum.de/lexikon/optik/polarisation/2616 (Polarisation, Spektrum Akademischer Verlag, 1999, Heidelberg)
linear zirkulär elliptisch
AUFBAU EINES SPEKTROPOLARIMETERS
GERÄTEBAUTEILE & UMWANDLUNG DES LICHTS
5 5
CD-Spektroskopie | Ferdinand Holzhausen Institut für Biochemie, Brüderstraße 34, 04103 Leipzig
[3] G. Richter, Praktische Biochemie – Grundlagen und Techniken, Georg Thieme Verlag, 2004, Stuttgart, S. 122-124
Lichtquelle Monochro-
mator Polarisator
elektro-
optischer
Modulator
Probe Detektor
a) b) c) d)
a) monochromatisches Licht
b) linear polarisiertes Licht
c) alternierend rechts und links zirkular polarisiertes Licht
d) elliptisch polarisiertes Licht
CIRCULARDICHROISMUS VON PROTEINEN
6 6
CD-Spektroskopie | Ferdinand Holzhausen Institut für Biochemie, Brüderstraße 34, 04103 Leipzig
[4] F. Lottspeich, J. W. Engels, Bioanalytics – Analytical Methods and Concepts in Biochemistry and Molecular Biology, Wiley-VCH Verlag, 2018, Weinheim
[5] www.spektrum.de/lexikon/biologie/cotton-effekt/15551 (Cotton-Effekt, Spektrum Akademischer Verlag, 1999, Heidelberg)
Circulardichroismus: unterschiedliche Absorption von links und rechts
zirkulär polarisiertem Licht durch chirale Moleküle, z.B. Proteine, DNA
Cotton-Effekt: abrupte Änderung der optischen Aktivität in Abhängigkeit von
der Wellenlänge aufgrund eines elektronischen Übergangs (Absorption)
BEGRIFFSKLÄRUNG & FUNKTIONSWEISE
CIRCULARDICHROISMUS VON PROTEINEN
7 7
CD-Spektroskopie | Ferdinand Holzhausen Institut für Biochemie, Brüderstraße 34, 04103 Leipzig
[4] F. Lottspeich, J. W. Engels, Bioanalytics – Analytical Methods and Concepts in Biochemistry and Molecular Biology, Wiley-VCH
Verlag, 2018, Weinheim
PDB ID: 3RGK, Hubbard, S.R., Lambright, S.G., Boxer, S.G., Hendrickson, W.A. (1990) J. Mol. Biol. 20: 215-218.
A.S. Rose, A.R. Bradley, Y. Valasatava, J.D. Duarte, A. Prlić, P.W. Rose (2018) NGL viewer: web-based molecular graphics for large complexes.
Bioinformatics (doi:10.1093/bioinformatics/bty419)
RCSB PDB (rcsb.org): H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne (2000)
The Protein Data Bank Nucleic Acids Research, 28: 235-242.
BEGRIFFSKLÄRUNG & FUNKTIONSWEISE
CIRCULARDICHROISMUS VON PROTEINEN
8 8
CD-Spektroskopie | Ferdinand Holzhausen Institut für Biochemie, Brüderstraße 34, 04103 Leipzig
[4] F. Lottspeich, J. W. Engels, Bioanalytics – Analytical Methods and Concepts in Biochemistry and Molecular Biology, Wiley-VCH
Verlag, 2018, Weinheim
PDB ID: 3RGK, Hubbard, S.R., Lambright, S.G., Boxer, S.G., Hendrickson, W.A. (1990) J. Mol. Biol. 20: 215-218.
A.S. Rose, A.R. Bradley, Y. Valasatava, J.D. Duarte, A. Prlić, P.W. Rose (2018) NGL viewer: web-based molecular graphics for large complexes.
Bioinformatics (doi:10.1093/bioinformatics/bty419)
RCSB PDB (rcsb.org): H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne (2000)
The Protein Data Bank Nucleic Acids Research, 28: 235-242.
BEGRIFFSKLÄRUNG & FUNKTIONSWEISE
PHYSIKALISCHE GRÖSSEN & GRUNDGLEICHUNG
EXTINKTION & ELLIPTIZITÄT
9 9
CD-Spektroskopie | Ferdinand Holzhausen Institut für Biochemie, Brüderstraße 34, 04103 Leipzig
[6] M. Helm, S. Wölfl, Instrumentelle Bioanalytik – Eine Einführung für Biologen, Biochemiker, Biotechnologen und Pharmazeuten,
Wiley-VCH Verlag, 2007, Weinheim, S. 31-33
LAMBERT-BEER‘sches Gesetz:
Einführung der Elliptizität:
Ψ =ln(10)
4∙180°
𝜋∙ 𝑐 ∙ 𝑑 ∙ (𝜀𝐿 − 𝜀𝑅)
Δ𝐸 = 𝐸𝐿 − 𝐸𝑅 = (𝜀𝐿 − 𝜀𝑅) ∙ 𝑐 ∙ 𝑑
(E: Extinktion, Ψ: Elliptizität, 𝜀: Extinktionskoeffizient, c: Konzentration, d: Schichtdicke)
Ψ ER-EL
ER+EL
PHYSIKALISCHE GRÖSSEN & GRUNDGLEICHUNG
DEFINITIONEN DER ELLIPTIZITÄT
10 10
CD-Spektroskopie | Ferdinand Holzhausen Institut für Biochemie, Brüderstraße 34, 04103 Leipzig
[6] M. Helm, S. Wölfl, Instrumentelle Bioanalytik – Eine Einführung für Biologen, Biochemiker, Biotechnologen und Pharmazeuten,
Wiley-VCH Verlag, 2007, Weinheim, S. 31-33
spezifische Elliptizität: Einheit: grad ∙ cm2 ∙g-1
molare Elliptizität: Einheit: grad ∙ cm2 ∙ dmol-1
MRW Elliptizität: Einheit: grad ∙ cm2 ∙ dmol-1
Θ 𝜆𝑇 =
Ψ 𝜆𝑇 ∙ 𝑀
100
Ψ 𝜆𝑇 =
Ψ
𝑐 ∙ 𝑑
(M: molare Masse, 100: historische Gründe, MRW: mean residue weight, mittlere Aminosäuremasse)
Θ 𝑀𝑅𝑊 =Ψ 𝜆
𝑇 ∙ 𝑀𝑅𝑊
100
AUSWERTUNG VON CD-SPEKTREN
AM BEISPIEL VON POLY-L-LYSIN
11 11
CD-Spektroskopie | Ferdinand Holzhausen Institut für Biochemie, Brüderstraße 34, 04103 Leipzig
[7] www.chemgapedia.de (Circulardichroismus und Proteinstruktur, 2016)
ferner UV-Bereich (170-250 nm)
Absorption der Peptidbindungen
naher UV-Bereich (250-300 nm)
Absorption der aromatischen Seitenketten
und Disulfidbrücken
n→π* und π→π* Übergänge
Quenching-Effekte
AUSWERTUNG VON CD-SPEKTREN
AM BEISPIEL VON LYSOZYM AUS HÜHNEREIWEISS
12 12
CD-Spektroskopie | Ferdinand Holzhausen Institut für Biochemie, Brüderstraße 34, 04103 Leipzig
PDB ID: 1DPX , Weiss, M.S., Palm, G.J., Hilgenfeld, R. (2000) Acta Crystallogr., Sect. D 56: 952-958.
A.S. Rose, A.R. Bradley, Y. Valasatava, J.D. Duarte, A. Prlić, P.W. Rose (2018) NGL viewer: web-based molecular graphics for large complexes.
Bioinformatics (doi:10.1093/bioinformatics/bty419)
RCSB PDB (rcsb.org): H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne (2000)
The Protein Data Bank Nucleic Acids Research, 28: 235-242.
AUSWERTUNG VON CD-SPEKTREN
AM BEISPIEL VON LYSOZYM AUS HÜHNEREIWEISS
13 13
CD-Spektroskopie | Ferdinand Holzhausen Institut für Biochemie, Brüderstraße 34, 04103 Leipzig
[8] Arnaudov, L. N., & de Vries, R. (2005). Biophysical Journal, 88(1), 515-526.
pH = 3,0 pH = 2,0 pH = 4,0
(a) Molecular residue ellipticity of HEWL at pH 2.0 for a range of temperatures between 25ºC and 85ºC.
(b) Molecular residue ellipticity of HEWL at pH 3.0 for a range of temperatures between 25ºC and 85ºC.
(c) Molecular residue ellipticity of HEWL at pH 4.0 for a range of temperatures between 25ºC and 90ºC.
AUSWERTUNG VON CD-SPEKTREN
AM BEISPIEL VON LYSOZYM AUS HÜHNEREIWEISS
14 14
CD-Spektroskopie | Ferdinand Holzhausen Institut für Biochemie, Brüderstraße 34, 04103 Leipzig
[8] Arnaudov, L. N., & de Vries, R. (2005). Biophysical Journal, 88(1), 515-526.
pH = 3,0 pH = 2,0 pH = 4,0
Tapping mode AFM height images of 2.0 wt % HEWL heated for 13 days at 57ºC
(a) pH 2.0; (b) pH 3.0; (c) pH 4.0.
EINSATZ VON CD-SPEKTREN
ANWENDUNGSGEBIETE
15 15
CD-Spektroskopie | Ferdinand Holzhausen Institut für Biochemie, Brüderstraße 34, 04103 Leipzig
[7] www.chemgapedia.de (Circulardichroismus und Proteinstruktur, 2016)
Bestimmung der Anteile von Sekundärstrukturelementen
Beobachtung von Konformationsänderungen, z.B. durch pH, Temperatur
Überprüfung der Konformationen von Proteinen unterschiedlichen
Ursprungs, z.B. natives und rekombinantes Protein
CD-Spektroskopie | Ferdinand Holzhausen
Vielen Dank für
Eure Aufmerksamkeit! Für Fragen und Anregungen stehe ich nun gerne zur Verfügung.
DISKUSSION
AUSBLICK
18 18
CD-Spektroskopie | Ferdinand Holzhausen Institut für Biochemie, Brüderstraße 34, 04103 Leipzig
[7] www.chemgapedia.de (Circulardichroismus und Proteinstruktur, 2016)
SRCD: synchrotron radiation circular dichroism
Hochvakuum-UV-Bereich (120-180 nm)
höhere Intensität der Synchrotron-Strahlung