Kurze Mitteilungen 47

entsprechenden Stellen herausgenommen. Das Morphin wur- de durch direkte Behandlung mit w~il3riger Pufferl6sung und Extraktion mit Chloroform/Isopropanol eluiert und an- schlieBend enzymimmunologisch bestimmt. Leerwerte wur- den in gleicher Weise bearbeitet.

Experimentelles

1. Chemikalien. Mercko-Test EMIT-Dau-Opiattest; Dau- Kalibratoren und Dau-Hilfsreagentien, EMIT-Puffer: 0,025 M Tris-Maleat-Puffer, pH 6,0.

2. Spektralphotometer. Coleman 55 (Firma Perkin-Elmer), Rechner Hewlett-Packard 97S.

3. Arbeitsbedingungen. Reaktionstemperatur 37 _+ 0,1 ~ C. Zeit bis zur Messung 10 s, Absorption fiber 40 s, Wellenl~inge: 436 nm:

4. Arbeitsweise. Wie von Syva vorgeschrieben 1. Die Extink- tionsdifferenz wird automatisch als 103 x A E ausgedruckt.

Je 5 lag Morphin werden als L6sung auf Kieselgel GF254 aufgetragen und mit dem Laufmittel Chloroform/Isopro- panol/Di~ithylamin (180:20:10) bei KammersS, ttigung ent- wickelt und die Platten anschlieBend bei 100~ fiir 1 h be- lfiftet. H-Rf Morphin: 12, H-Rf Codein: 63 [2].

a) Morphin wurde sowohl im kurzwelligen als auch im langwelligen UV lokalisiert und das Kieselgel an der betref- fenden Stelle zusammen mit Leerwerten aus dem gleichen H- Rf-Bereich herausgekratzt.

b) Das morphinhaltige Kieselgel wurde nach Lokalisie- rung im UV herausgenommen, in pH 9-Puffer suspendiert und 2 x mit Chloroform/Isopropanol (80/20) extrahiert. Nach filtern und eindunsten wurde der Rfickstand in 1 ml >>EMIT<<-Puffer aufgenommen.

c) Die Platten wurden nach Trocknuug uud Abk/ihlung mit Dragendorffs Reagens angef/irbt und das Morphin zusammen mit Leerwerten nach dem Trocknen der Schicht herausgenommen.

d) Die mit Dragendorffs Reagens angef/irbten Morphin- flecken wurden bei pH 9 in wfil3riger L6sung 2 x mit dem gleichen Volumen Chloroform/Isopropanol (80/20) extra- hiert, dieses nach filtrieren eingedunstet und der Rfickstand in 1 ml >>EMIT<<-Puffer aufgenommen.

Das Kieselgel aus 4a und 4c wurde in Eppendorf- ReaktionsgeffiBen (1,5 ml) in je 1 ml ~>EMIT<<-Puffer suspen- diert und kurze Zeit bei 90 ~ C erwS, rmt. Nach Zentrifugieren

Anlage zu den Reagentien

konnte die fiberstehende L6sung abgegossen werden. In allen Pufferl6sungen wurde das Morphin wie in Urinproben bestimmt.

Ergebnisse

1. Bestimmung der Prdzision. 10 Morphinbestimmungen (5 lag) ergabeu eiuen Mittelwert yon 103• A E = 118,3 mit einer Standardabweichung a = _+ t.4; Negative-Calibrator

Am Mitte133.

2. Die direkte Elution des Morphins aus Kieselgel ohne Anffarbung ergab Ausbeuten yon 92,0, 88,6, 87,5, 92,0 und 89,8 %; Mittelwert = 90,0 % des theoretischen Wertes.

3. Extraktion des mit pH-9-Puffer behandelten nicht ange- fffirbten Kieselgels mit Chloroform/Isopropanol, anschlieBen- der Verdunstung und Aufnahme mit >>EMIT<c-Puffer (1 ml) ergab 95,1, 98,1, 90,6, 83,2 und 83,2 % (Mittelwert = 90,0 %).

4. Die Elution der mit Dragendorffangef~trbten Morphinpro- ben ergab Ausbeuten von 100, 97,5, 98,3, 96,6 und 97,0%; Mittelwert = 97,9%.

5. Die Elution der Flecken nach Extraktion bei pH 9 mit Chloroform/Isopropanol ergab Ausbeuten von 95,0, 98,0, 90,6, 83,2 und 85,5 %; Mittelwert = 90,4 %.

Blur- und Leberproben wurden entsprechend aufgearbei- tet, die Extrakte dfinnschicht-chromatographiseh getrennt und die Flecken wie unter 4 beschrieben eluiert. Es zeigte sich, dab Proben aus Verkehrsleichen keine Erh6hung der Extink- tionsdifferenz ergaben, w/ihrend die Morphinkonzentratio- nen in positiven Ffillen dem nach einem fluorimetrischen Verfahren kontrolliertem Ergebnis entsprachen [1].

Wichtig erscheint an dieser Stelle der Hinweis, dab die Zeitspanne zwischen der Zugabe der Reagentien und dem Beginn der Messung stark in die Mel3ergebnisse eingeht und bei Routinemessungen einen fiberaus gleichmfiBigen Arbeits- ablauf erforderlich macht. Eine Verz6gerung um nur 15 s zwischen dem Mischen der Substanzen und der ersten Extinktionsmessung hat eine Abnahme der Extinktionsdiffe- renz um etwa 25 % zur Folge.

Literatur

1. Klug, E.: Beitr. Ger. Med. 29, 333 (1971) 2. Klug, E.: Beitr. Ger. Med. 28, 157 (1972)

Eingegangen am 7. Juni 1978

Fresenius Z. Anal. Chem. 294, 4 7 - 4 8 (1979) - �9 by Springer-Verlag 1979

Separation and Determination of Ergotoxine and Dihydroergotoxine Alkaloids by a TLC Method

G. Szepesi, J. Molnfir, and Sz. Nyiredy sen.

Chem. Works of Gedeon Richter Ltd., P.O. Box 27, H-1475 Budapest, Hungary

Trennung und Bestimmung von Ergotoxin- ond Dihydroergotoxin-Alkaloiden mit Hilfe einer DC-Methode

Key words: Best. von Ergotoxinalkaloiden, Dihydro- ergotoxinalkaloiden; Chromatographie, Dfinnschicht/ Spektralphotometrie; Vanillinreagens

After having worked out an HPLC procedure for the separation and determination ofergotoxine and dihydroergo- toxine alkaloids [1], we now developed a thin-layer chromato- graphic method for the same purpose, which offers the advantage that the c~- and fl-isomers of ergocriptine and dihydroergocriptine are separated, what was not the case in our earlier method [1]. A silica gel plate and acetone/ammonium carbonate/ethanol as solvent proved to

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be optimum. For the spectrophotometric determination we employed a modified van Urk reaction with a vanilline reagent, which offers a considerably increased sensitivity and a stable reaction product. The relative standard deviation was found to be + 3.5 %. Separation possibilities for this method and for the HPLC method [1] are shown in Table 1.

Procedure. Weigh the sample with 0.1 mg accuracy in such a quantity that about 30 ~tg of the compounds are transferred on the plate. Dissolve in methanol, fill up to 10ml with methanol and transfer 40 gl of this solution in 3 cm bands on the chromatographic plate (Polygram Sil G-UV254, Macherey & Nagel). Thus the plate should be divided into three equal vertical parts. Place the plate into a vessel, which had previously been presaturated for 15min with freshly prepared solvent mixture (acetone/0.1 M ammonium carbonate/ethanol, 32.5 : 67.5 : 1). Allow the solvent front to run to a distance of 15 cm in a dark place (about 90 min). Dry the chromatogram in a dark place in an air stream of room temperature, mark the spots in 254 nm UV light and scrape them off. Transfer the scrapped silica gel separately into 10 ml volumetric flasks, accurately add 2 ml of 5 % sulphuric acid in methanol, close the flasks and shake for 5 min. Fill up with freshly prepared reagent solution (0.125g of vanilline in 100 ml of 70 % aqueous sulphuric acid) to the mark, while continuously cooling and shaking. Allow to stand in a dark place and shake from time to time for 15 min. Filter through a G-3 sintered glass filter and determine the absorbance at 545 nm in 2 cm glass cells against a blank prepared in the same way using unspotted parts of the plate. For calculation, refer the absorbance of the individual component to the total

Table 1

Compounds TLC HPLC [1] Rj. k '

Ergometrine 0.78 Ergometrinine 0.73 Ergotamine 0.65 Ergocornine 0.60 a-Ergocriptine 0.53 fl-Ergocriptine 0.50 Ergocristine 0.45 Ergotaminine 0.38 Ergocorninine 0.33 Ergocriptinine 0.25 Ergocristinine 0.16 Dihydroergocornine 0.63 a-Dihydroergocriptine 0.58 fl-Dihydroergocriptine 0.55 Dihydroergocristine 0.51

0.81 1.84 7.27

11.86

18.65

20.50 29.60 38.20 60.60

~:70

14.60

17.60

absorbance, taking into account the ratio of the individual molecular weight to the average molecular weight.

Reference

1. Szepesy, L., Feh~r, I., Szepesi, G., Gazdag, M.: J. Chromatogr. 149, 271 (1978)

Received .qpril 8, 1978; revised July 27, 1978