SerumenzymeDiagnostik, Messung, Anwendung und Interpretation

Enzyme - EigenschaftenDie Bestimmung von Enzymaktivitten in Serum, Plasma oder Harn hat fr die Diagnostik und zur Verlaufs- und Therapiebeurteilung immer noch einen vorrangigen Stellenwert eingenommen.Die Menge von Enzymen im Plasma ist sehr gering, wenn man sie in Konzentrationen angibt z.B. ALAT (GPT) 100 g/ Liter (Gesamteiwei 60-80 g/l)Enzyme, die ihre Aufgaben im Blut haben, z.B. Cholinesterase (CHE), Gerinnungsfaktoren kommen in hheren Konzentrationen vor.Enzyme gelangen meistens durch die Zellumsatz ins Blut.

Enzyme - EigenschaftenEnzyme mit physiologischer Funktion im Blut z.B. Thrombin, Plasmin, Cholinesterase zeigen bei Schdigung der Ursprungszellen einen Abfall der Aktivitt im Blut.Enzyme von sekretorischen (exokrinen) Drsen z.B. Pankreasamylase, -lipase zeigen bei Schdigung der Ursprungszellen einen Anstieg der Aktivitt im Blut.Enzyme mit physiologischer Funktion in der Zelle z.B. LDH, GOT, GPT, CK - zeigen bei Schdigung der Ursprungszellen einen Anstieg der Aktivitt im Blut.

Enzyme - EigenschaftenVon der im Serum enthaltenen Aktivitt eines Enzyms, das spezifisch in einem Organ synthetisiert und ins Blut sezeniert wird z.B. CHE -, kann auf eine Schdigung des Herkunftsorgans geschlossen werden, wenn die Enzymaktivitt im Blut sinkt.Von der im Serum enthaltenen Aktivitt eines Enzyms, das spezifisch in einem Organ synthetisiert wird, aber nicht ins Blut abgegeben wird z.B. CK -, kann auf eine Schdigung des Herkunftsorgans geschlossen werden, wenn die Enzymaktivitt im Blut steigt.

Enzyme - EigenschaftenEinige Enzyme kommen als Isoenzyme vor das heit, dass sie die gleiche Reaktion katalysieren. Sie kommen in verschiedenen Geweben bzw. Organen vor z.B. Lactatdehydrogenase oder LDH, die als Tetramer in 5 verschiedenen Isoformen vorkommt. Man kann die LDH elektrophoretisch trennen, um das Herkunftsorgan herauszubekommen.LDH-1 kommt berwiegend im Herzmuskel und Erythrozyten, LDH-5 dagegen in der Leber und Skelettmuskulatur vor.Die Isoformen sind H4 (LDH-1), H3M (LDH-2), H2M2 (LDH-3), HM3 (LDH-4) und M4 (LDH-5) (H=Herz; M=Muskel)

Serumenzyme Diagnostisches NtzenDas Erscheinen bzw. Verschwinden von Enzymen im bzw. aus dem Serum kann wichtige Vorgnge im Krper widerspiegeln. Nicht nur die Geschwindigkeit des An- oder Absteigens eines Enzyms, sondern das Verhltnis von Enzymen zueinander, gibt zustzliche Information zu einem Krankheitsverlauf bzw. zur Effizienz einer Therapie.Es gibt verschiedene Komponente der Enzymkinetik, die separat betrachtet werden mssen, um ein diagnostischen Nutzen der Ergebnisse zu optimieren.

Enzyme Messung der AktivittDie Internationale Union fr Biochemie (IUB) hat schon 1961 Empfehlungen fr die optimierte Bestimmung von Enzymaktivitten erarbeitet. Die Bedingungen fr diese optimierten Methoden sind:Optimaler pH-WertDefinierte Temperatur d.h. 37 C Optimale SubstratkonzentrationOptimale CoenzymkonzentrationOptimale Konzentration an Aktivatoren

Enzyme Messung der AktivittEnzymaktivitt wird in Einheiten/l (U/l) angegeben.1 internationale Einheit (U) ist diejenige Enzymaktivitt, die pro Minute unter definierten Bedingungen die Umwandlung von 1 mol Substrat katalysiert. (Dies wird fr Plasma und Serum auf 1 Liter bezogen).Die Messtemperatur ist 37 C (definierte und validierte Referenzbereiche sind oft nur fr 25 C vorhanden!)

Enzyme - NomenklaturDie Enzyme Commission (EC)-Nummer beschreibt die Funktion eines Enzyms. Die ganze Liste befindet sich im Enzyme Nomenclature [1972] sowie dem Enzyme Handbook und seinen Supplements (Springer-Verlag).Die EC-Nummer hat 4 Komponente:Stelle 1 definiert die Funktion z.B. 1 = OxidoreduktasenStelle 2 definiert die Donorgruppe z.B. 1 = CH-OHStelle 3 definiert die Akzeptorgruppe z.B. 1 = NAD(P)Stelle 4 ist die Enzymnummer innerhalb der Gruppe.Beispiel: EC 1.1.1.71 = Alkoholdehydrogenase (NAD(P)) oder Alkohol: NAD(P) OxidoreduktaseReaktion Alkohol + NAD(P) = Aldehyd + reduziertes NAD(P)

Enzyme - NomenklaturDie Hauptgruppen von Enzymen sind:1.x.x.x Oxidoreduktasen (z.B. GLDH: EC 1.4.1.3, LDH: EC 1.1.1.27)2.x.x.x Transferasen (z.B. Gamma-GT: EC 2.3.2.2, ASAT/GOT: EC 2.6.1.1, ALAT/GPT: EC 2.6.1.2)3.x.x.x Hydrolasen (z.B. alkalische Phosphatase: EC 3.1.3.1, -Amylase: EC 3.2.1.1, Lipase EC 3.1.1.3)4.x.x.x Lyasen (z.B. Adenylatcyclase: EC 4.6.1.1)5.x.x.x Isomerasen (z.B. Glucose-6-Phosphat Isomerase: EC 5.3.1.9)6.x.x.x Ligasen / Synthetasen (z.B. Harnstoff-carboxylase: EC 6.3.4.6)

Enzyme Messung der AktivittIn klinisch-chemischen Vollautomaten wird alles automatisch geregelt. Die Temperierung der Messzelle findet automatisch statt. Das Gleiche gilt fr das Pipettieren der Reagenzien, eventuelle Verdnnungen und Umrechnung der Ergebnisse.

Es gibt verschiedene Messmglichkeiten: kontinuierliche Verfahren (Kinetik); diskontinuierliche Verfahren (2-Punkt Messung) oder Endpunktverfahren.

Enzyme Berechnung der AktivittBerechnung des molaren Extinktionskoeffizienten - Die Konzentration der zumessenden Substanz in der Probe errechnet sich nach der Gleichung:

c = (E / [ mol * d])

c = Konzentration der SubstanzE = Extinktionsdifferenz zwischen Analysen- und Leerwert bzw. Extinktionsdifferenz durch Verbrauch oder Bildung von NAD(P)Hd = Schichtdicke der Kuvette in cm mol = spezifischer mikromolare Extinktionskoeffizient

Enzyme Berechnung der Aktivitt

Die Enzymaktivitt entspricht der nderung der Konzentration von Substrat oder Produkt whrend der Messzeit (t). Meist wird bei einer Enzymaktivitts-bestimmung aus mehreren Messungen das durchschnittliche /Minute ermittelt. Von diesen Beobachtungen haben wir:Volumenaktivitt = c / t = E / (t* mol *d) mol/min * ml Messlsungc = nderung der Konzentration von Substrat oder Produktt = Messzeit in Minuten

Enzyme Berechnung der Aktivitt

Ein Substratumsatz von 1 mol/min = 1U. Analog zur Bestimmung von Metabolitkonzentrationen sind das Volumen der Messlsung und das Probenvolumen zu bercksichtigen.Volumenaktivitt = E * V/ (t* mol *d * v) U/mlV = Volumen der Messlsungv = Volumen, das in dem Test eingesetzten ProbeDa man Ergebnisse meistens in U/l angibt, muss man mal mit dem Faktor 1000 multiplizieren.Wird verdnntes Material eingesetzt, muss dies auch bercksichtigt werden.

Serumenzyme - HerkunftSekretionsenzyme CholinesterasenReaktion: Acylcholin + H2O Cholin + R.COOHEs gibt zwei Gruppen von Cholinesterasen: die wahre Acetyl(thio)cholinesterase (AChE) (2 Typen bekannt) und die Pseudocholinesterasen (CHE) (Serumcholinesterasen, ca. 18 Typen bekannt), die neben Acetylcholin auch Butyrylcholin und andere Acylcholine sowie Thiocholine spalten. Die Bestimmung von AChE hat im Gegensatz zur CHE so gut wie keine klinische Bedeutung. Die CHE biologische Halbwertzeit im Serum betrgt ca. 10 Tage.

Cholinesterase diagnostisches NutzenAktivittsnderungen bei der Cholinesterase:Erhhung bei: Proteinverlustsyndrom (nephrotisches Syndrom), unkomplizierte Fettleber (Frhform der alkoholischen Leberschdigung), funktionelle Hyperbilirubinmie, Hypertriglyceridmie, Adipositas, Diabetes mellitus.Erniedrigung bei: chronischer Hepatitis, Leberzirrhose, Kwashiokor, ChE-Inhibitoren [ Physostigmin, Cyclophosphamid ], Schwangerschaft (2. Trimenon bis 6 Wochen post partum), Verschiedenes ( Septikmie, Verbrennungen, postoperativ, Antikontrazeptiva, Malignome, Anmien)

Weitere Serumenzyme Beispiele und diagnostische Anwendung in der GerinnungAndere Enzyme mit Aktivitt im Plasma sind die, die mit der Blutgerinnung zu tun haben. Hierzu gehren u.a. Urokinase, Gewebetyp Plasminogenaktivator (t-PA) und Thrombin sowie die berwiegende Zahl der Gerinnungsfaktoren, die je in einer inaktiven Form vorliegen, die whrend des Gerinnungsprozesses stufenweise aktiviert werden. Normalerweise werden die Enzyme selber nicht gemessen, sondern ihre biologische Aktivitt im Form von globalen Tests, wie der Quick-Wert [auch Thromboplastinzeit, TPZ oder Prothrombinzeit genannt]. Hier werden eine Verminderung der Faktoren II, V, VII, X sowie Vitamin-K und Fibrinogen erfasst. Der Quick-Wert wird u.a. zur Kontrolle einer Cumarin-Derivat Antikoagulantientherapie angewendet. Die Werte werden normalerweise als Prozent eines Normal-Poolplasmas angegeben (Normal: 70-130%).

Serumenzyme als Globalteste in der GerinnungAndere Globalteste (mit hnlichen Abkrzungen!) sind:Partielle Thromboplastinzeit [PTT] und aktivierte partielle Thromboplastinzeit [aPTT] Prft die Faktoren XII, XI und IX sowie die gemeinsame Endstrecke der Gerinnung (Faktoren X, VIII, II, V und I). Mit der aPTT erfasst man auch Prokallikrein und HMW-Kininogen durch den Zusatz von Oberflchenaktivatoren, wie Kaolin.Plasma Thrombinzeit [PTZ] Die PTZ wird eingesetzt, um ein Fibrinogenmangel zu prfen.

Enzyme Messung der AktivittKinetisch-Optischer Test - IFCC MethodeDie Bestimmung der LDH-Aktivitt im Serum.Reaktion: Lactat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+Messprinzip: Die Zunahme der Extinktion durch das Entstehen des Coenzyms NADH bei 339 nm im Spektralphotometer.Als Substrat dient Lactat.Im Prinzip kann man die Reaktion in die entgegengesetzten Richtung steuern. Man muss dann Pyruvat im berschuss haben und einen anderen pH-Wert einstellen. NAD+ - Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid - oxidierte FormNADH NAD reduzierte Form

Enzyme Messung der Aktivitt Zusammengesetzter optischer Test mit IndikatorreaktionDie Bestimmung des ASAT (GOT) im SerumASAT Aspartat-Amino-TransferaseGOT Glutamat-Oxalacetat-Transaminase

Reaktion: Enzym ASAT/GOTL-Aspartat + -Oxoglutarat L-Glutamat + OxalacetatIndikatorreaktion: Enzym/MalatdehydrogenaseOxalacetat + NADH + H+ Malat NAD+

Messprinzip Abnahme der Extinktion bei 334 nm (Oxydation des NADH)

Enzyme Messung der AktivittZusammengesetzter optischer Test mit Hilfs- und Indikatorreaktion

Bestimmung der Creatinkinase (CK) im Serum:

Reaktion: Enzym CreatinkinaseCreatinphosphat + ADP Creatin + ATPHilfsreaktion: Enzym HexokinaseATP + D-Glucose ADP + D-Glucose-6-PhosphatIndikatorreaktion: Enzym G-6-P-dehydrogenaseG-6-P + NADP+ 6-Phosphogluconat + NADPH + H+

Messprinzip: Messung der Extinktionszunahme bei 334 nm (Reduktion des NADP zu NADPH)

IFCC Methode Creatin KinaseMessbedingungen fr die CKTemperatur: 37,0 C 0,1 CWellenlnge: 339 nm 1 nmBandbreite: 2 nmLichtweg (in der Kuvette): 10,00 mm 0,01 mmInkubationszeit: 180 sVerzgerungszeit: 120 sMessinterval: 120 sAnzahl der Messpunkte: mindestens 6

Enzyme Messung der AktivittVerfahren zur Messung im Bereich des sichtbaren LichtesBestimmung der alkalischen Phosphatase im Serum:

Reaktion: p-Nitrophenylphosphat (pNPP) pNP + PO4pNPP ist farblos; pNP dagegen gelb bei pH 10Messprinzip: AP katalysiert die Hydrolyse von pNPP bei pH 9,8 unter Zunahme der Farbe (Extinktion) bei 405 nm)Kontinuierliche (kinetische) MessungAls Cofaktoren werden Mg+2 und Ca+2 bentigtEDTA- bzw. Citratplasma knnen, wegen ihrer komplexierenden Eigenschaften nicht als Probe benutzt werden.

Enzyme - DiagnostikGPT / ALATWird zur Lebererkrankungs-Diagnostik eingesetztGPT ist berwiegend im Zytoplasma der Leberparenchymzellen zu finden.Wichtigster Leberzellnekroseparameterin kleinen Mengen auch in der Niere, Herz- und Skelettmuskulatur Strungen Stark lipmische Seren knnen nicht analysiert werden.Referenzbereiche: (37 C) m:

Enzyme - DiagnostikGOT / ASATWird zur Lebererkrankungs-Diagnostik eingesetztGOT ist berwiegend in der Leber sowie im Herz- und Skelettmuskulatur zu finden in kleinen Mengen auch im GehirnWichtiger Leberzellnekroseparameter, in Verbindung mit der GPT Hinweis auf die Schwere der Leberzellschdigung.Erhhte Werte: akuter und chronischer Hepatitis, Leberzirrhose, Fettleber, aber auch Herzinfarkt und Muskeldystrophie. Strungen Stark lipmische Seren knnen nicht analysiert werden.Referenzbereiche: (37 C) m:

Enzyme - DiagnostikLaktatdehydrogenase - LDH LDH kommt in allen Geweben vor, wobei sich die hchste Aktivitt in Skelettmuskulatur, Herzmuskel, Niere, Gehirn und Leber findet Aufgrund der fehlenden Organspezifitt eignet sich die Gesamt-LDH allein nur wenig als diagnostischer Parameter.LDH-1 als Sptindikator fr einen HerzinfarktLDH erhht bei: hmolytische Anmien, Lungenembolie Skelettmuskelerkrankungen Leber und Gallenwegserkrankungen (LDH-5): akute Hepatitis, akute Parenchymzellschdigung durch IntoxicationenStrungen Hmolytische Seren knnen nicht analysiert werden. IFCC Referenzmethode (37 C) - m:

Enzyme - DiagnostikGlutamatdehydrogenase - GLDH Wird zur Leber-Diagnostik eingesetzt, da GLDH ausschlielich intramitochondrial in Leber vorkommt. Ein starker Anstieg der GLDH weist immer auf eine schwere Leberschdigung hin, insbesondere der zentroazinren Abschnitte, z.B. bei akuter Stauungsleber. Reaktion:-Oxoglutarat + NADH + NH4 L-Glutamat + NAD+ + H2OReferenzbereiche: (37 C) m:

Enzyme - DiagnostikGamma-Glutamyltransferase GT GT findet sich in der Leber berwiegend in den kanalikulren Segmenten der Hepatozytenmembran und in den Epithelien der intrahepatischen Gallenwege. GT ist ein Leberzellnekrose- und CholestaseparameterReaktion:-Glutamyl-p-Nitroanilid (farblos) + Glycylglycin -Glutamyl-Glycylglycid + p-Nitroanilin (gelb) (405 nm)Referenzbereiche: (37 C) m:

Enzyme - DiagnostikAlkalische Phosphatase - APCholestaseparameter und Knochenerkrankungen mit erhhter Osteoblastenaktivitt Isoenzyme: Leber-AP, Knochen-AP und Nieren-AP. Die Aktivitt im Normalserum ist hauptschlich auf das Leber- und Knochenisoenzym zurckzufhren. Strungen nur Serum bzw. Heparinplasma, nicht Citrat und EDTA verwenden.Referenzbereiche: (37 C) m:

Enzyme - Diagnostik Bei Cholestase steigen AP und -GT im Serum an.erhhte gesamt AP kommt auch bei andere Erkrankungen vor: Osteopathie mit erhhter Osteoblastenaktivitt, Nierenerkrankungen, Rachitis, Schwangerschaft (letztes Trimenon), maligne Tumoren. -GT Erhhungen im Serum sind bei etwa 95% aller Flle durch eine hepatobiliren Erkrankung zustande gekommen.-GT ist ein guter Marker fr AlkoholabususMig erhhte -GT kommt bei einer chronisch aktiven Hepatitis, primr bilire Zirrhose und chronische Pankreatitis vor.

Bedeutung von Quotientenbildung De-Ritis Quotient = GOT/GPT - akute Virushepatitis: < 0,7 unkompliziert, >0,7 nekrotisierend - chronische Hepatitis, Leberzirrhose: ca.1 - nicht hepatisch (Trauma/Herzinfarkt): >1

Quotient (GOT+GPT)/GLDH gilt als Mastab fr den Schweregrad der Hepatozytenschdigung. - < 20 bei schwerer Schdigung - 20 50 bei miger Schdigung

Bedeutung von QuotientenbildungBeispiele von Quotienten bei einer Hepatitis-ATypischer ikterischer Verlauf / cholestatischer Verlauf

Enzyme - DiagnostikCreatinkinase - CK CK kommt in hoher Aktivitt in der Skelettmuskulatur, im Herzmuskel und im Gehirn3 Isoenzyme: CK-MB (Myokardtyp), CK-MM (Muskeltyp) und CK-BB (Gehirntyp)Skelettmuskelerkrankungen: Rhabdomyolyse, Myositis, progressive Muskeldystrophie, Polytrauma, Muskeltrauma (inkl. i.m. Injektionen) Herzmuskelerkrankungen: akuter Myokardinfarkt (Diagnostik und Verlaufskontrolle), Kontrolle einer Thrombolysetherapie, Myokarditis Referenzbereiche: (37 C) m:

Enzyme - Diagnostik beim HerzinfarktCK-MB erreicht im Myokard ihre hchste Konzentration Obwohl CK-MB nicht vollstndig kardiospezifisch ist, wird sie in Verbindung mit der Gesamt-CK neben den kardialen Troponinen weiterhin als biochemischer Marker fr den akuten Herzinfarkt eingesetzt.Cardiac-Troponin-T - Methode der Wahl, da standardisiert Cardiac-Troponin-I Troponin-C ist nicht spezifisch genug fr die Herzinfarktdiagnostik.CK,CK-MB und Troponin T steigen 2-6 h nach einem Infarkt.Myoglobin nach 1-2 h; GOT nach 4-6 h; LDH-1 (HBDH) nach 6-12 h;

Serumenzyme Referenzbereiche fr gesunde Erwachsene 37 C-GT M: < 50 U/l; F: < 32 U/L (IFCC)AP M: 40-120 U/l; F: 30-90 U/LGPT M: < 40 U/L; F: < 33 U/L (IFCC mit P-5-P)GOT M: < 43 U/L; F: < 36 U/L (IFCC mit P-5-P)CK M: 24-207 U/L; F: 24-170 U/L(IFCC)CK-MB M: < 18 U/L; F: < 18 U/LGLDH M: < 6,7 U/L; F: < 4,8 U/LLDH M: 135-225 U/L; F: 135-215 U/L (IFCC)LDH-1 (HBDH) M: < 171 U/L; F: < 202 U/L

(Wood et al.: Clin Lab 2004; 50: 455-75)