SIMONE SCHILLINGER NACHWEIS MAP-SPEZIFISCHER geb.uni- ?· SIMONE SCHILLINGER NACHWEIS MAP-SPEZIFISCHER…

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    05-Jun-2018

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<ul><li><p>SIM</p><p>ON</p><p>E SC</p><p>HILLIN</p><p>GER</p><p> N</p><p>AC</p><p>HW</p><p>EIS M</p><p>AP</p><p>-SP</p><p>EZ</p><p>IFISC</p><p>HER</p><p> A</p><p>NTIK</p><p>R</p><p>PER</p><p>SIMONE SCHILLINGER</p><p>Durchflusszytometrischer Nachweis von </p><p>Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis-</p><p>spezifischen Antikrpern im Blut von Rindern</p><p>9 7 8 3 8 3 5 9 5 9 6 9 9</p><p>VVB LAUFERSWEILER VERLAGSTAUFENBERGRING 15D-35396 GIESSEN</p><p>Tel: 0641-5599888 Fax: -5599890redaktion@doktorverlag.dewww.doktorverlag.de</p><p>VVB LAUFERSWEILER VERLAGdition scientifique</p><p>VVBVVB LAUFERSWEILER VERLAG</p><p>dition scientifique</p><p>ISBN: 978-3-8359-5969-9</p><p>INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet. </p><p>beim Fachbereich Veterinrmedizin der Justus-Liebig-Universitt Gieen</p></li><li><p>Das Werk ist in allen seinen Teilen urheberrechtlich geschtzt. </p><p>Jede Verwertung ist ohne schriftliche Zustimmung des Autors oder des Verlages unzulssig. Das gilt insbesondere fr Vervielfltigungen, bersetzungen, Mikroverfilmungen</p><p> und die Einspeicherung in und Verarbeitung durch elektronische Systeme.</p><p>1. Auflage 2012</p><p>All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted, </p><p>in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise, without the prior </p><p>written permission of the Author or the Publishers.</p><p>st1 Edition 2012</p><p> 2012 by VVB LAUFERSWEILER VERLAG, GiessenPrinted in Germany </p><p>VVB LAUFERSWEILER VERLAG</p><p>STAUFENBERGRING 15, D-35396 GIESSENTel: 0641-5599888 Fax: 0641-5599890 </p><p>email: redaktion@doktorverlag.de</p><p>www.doktorverlag.de</p><p>dition scientifique</p></li><li><p>Aus dem Institut fr Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere der Justus-Liebig-Universitt Gieen </p><p>Betreuer: Prof. Dr. R. Bauerfeind </p><p>Durchflusszytometrischer Nachweis von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis-spezifischen Antikrpern im Blut von Rindern </p><p>INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines </p><p>Dr. med. vet. beim Fachbereich Veterinrmedizin der Justus-Liebig-Universitt Gieen </p><p>eingereicht von </p><p>Simone Schillinger </p><p>Tierrztin aus Freiburg </p><p>Gieen, 2012 </p></li><li><p>Mit Genehmigung des Fachbereichs Veterinrmedizin der Justus-Liebig-Universitt Gieen </p><p> Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. Martin Kramer Gutachter: Prof. Dr. Rolf Bauerfeind Prof. Dr. Michael Blte Tag der Disputation: 17.12.2012 </p></li><li><p>Fr meine Mutter und Martin </p></li><li><p>Inhaltsverzeichnis </p><p>Inhaltsverzeichnis...................................................................................................... iv </p><p>Abkrzungsverzeichnis........................................................................................... viii </p><p>Verffentlichungen ................................................................................................... xii </p><p>I Einleitung......................................................................................................... 1 </p><p>II Schrifttum ........................................................................................................ 3 </p><p>1 Die Paratuberkulose des Rindes ....................................................................... 3 </p><p>1.1 Taxonomie und Charakterisierung des Erregers........................................ 3 </p><p>1.2 Wirtsspektrum ........................................................................................... 5 </p><p>1.3 bertragung und Anflligkeit...................................................................... 6 </p><p>1.4 Stadien der MAP-Infektion......................................................................... 7 </p><p>2 Die MAP-spezifische humorale Immunantwort des Rindes................................ 8 </p><p>2.1 Verlauf der MAP-spezifischen humoralen Immunantwort........................... 9 </p><p>2.2 TH1- und TH2-assoziierte Antikrpersubtypen .......................................... 11 </p><p>2.3 Antigene von MAP und deren Verwendung zum Nachweis MAP-</p><p>spezifischer Antikrper ............................................................................ 13 </p><p>2.3.1 Antigengemische................................................................................................13 </p><p>2.3.2 Lipidhaltige Antigene ..........................................................................................15 </p><p>2.3.3 Proteinantigene ..................................................................................................16 </p><p>2.3.3.1 Nachweislich in vitro exprimierte Proteine mit bekannter Funktion oder Lokalisation....................................................................................... 19 </p><p>2.3.3.2 Rekombinant hergestellte Proteine ohne nachweisliche Expression in vitro ....................................................................................................... 23 </p><p>3 Serologische Nachweisverfahren fr MAP-Infektionen beim Rind ................... 25 </p><p>3.1 Komplementbindungsreaktion ................................................................. 25 </p><p>3.2 Agargelimmunodiffusionstest................................................................... 26 </p><p>3.3 Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay ................................................... 26 </p><p>3.4 Durchflusszytometrie-basierter Antikrpernachweis ................................ 33 </p><p>III Material und Methoden ................................................................................. 34 </p><p>1 Bakterienstmme ............................................................................................ 34 </p><p>2 Betriebe........................................................................................................... 35 </p><p>2.1 MAP-unverdchtige Rinderbetriebe......................................................... 35 </p><p>2.2 MAP-Problembetriebe ............................................................................. 36 </p></li><li><p>Inhaltsverzeichnis v </p><p>3 Rinder ............................................................................................................. 38 </p><p>3.1 Khe........................................................................................................ 38 </p><p>3.2 Klber der experimentellen Infektionsstudie ............................................ 39 </p><p>3.3 Klber der Feldstudien............................................................................. 41 </p><p>3.3.1 Kohortenstudie 1 ................................................................................................41 </p><p>3.3.2 Kohortenstudie 2 ................................................................................................41 </p><p>4 Experimentelle Infektionsstudie....................................................................... 44 </p><p>5 Serumproben .................................................................................................. 46 </p><p>6 Kotproben ....................................................................................................... 46 </p><p>7 Verbrauchsmaterialien und Lsungen ............................................................. 46 </p><p>8 Bakteriologische Methoden ............................................................................. 46 </p><p>8.1 Anzucht der Bakterienstmme................................................................. 46 </p><p>8.2 Keimzahlbestimmung .............................................................................. 49 </p><p>8.2.1 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability and Counting Kit ............................49 </p><p>8.2.2 KbE-Bestimmung und OD660-Messung ..............................................................52 </p><p>8.3 Herstellung der Test- und Pradsorptionsantigene .................................. 52 </p><p>8.4 Herstellung der Inokula und Scheininokula .............................................. 53 </p><p>9 Serologische Methoden................................................................................... 56 </p><p>9.1 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ...................................... 56 </p><p>9.1.1 Svanovir-ELISA ................................................................................................57 </p><p>9.1.2 Pourquier-ELISA...............................................................................................58 </p><p>9.1.3 Cattletype-ELISA ..............................................................................................59 </p><p>9.2 Durchflusszytometrische Antikrper-Tests (DFZM-Ak-Tests)................... 60 </p><p>9.2.1 Etablierung und Optimierung der DFZM-Ak-Tests.............................................60 </p><p>9.2.2 Test- und Pradsorptionsantigene .....................................................................61 </p><p>9.2.3 Durchfhrung der DFZM-Ak-Tests.....................................................................61 </p><p>9.2.4 Gating-Strategie und Auswertung der DFZM-Ak-Tests .....................................63 </p><p>10 Statistische Auswertung .................................................................................. 65 </p><p>IV Ergebnisse..................................................................................................... 66 </p><p>1 Identifizierung von MAP-unverdchtigen Betrieben ......................................... 66 </p><p>2 Etablierung und Evaluierung der DFZM-Ak-Tests an adulten Rindern............. 69 </p><p>2.1 Serum- und Sekundrantikrperkonzentrationen..................................... 69 </p><p>2.2 MAP-Wachstumsphase ........................................................................... 69 </p><p>2.3 Konzentration der Pradsorptions- und Testantigene .............................. 71 </p></li><li><p>Inhaltsverzeichnis vi </p><p>2.4 Titerberechnung ...................................................................................... 74 </p><p>2.5 Art des Pradsorptionsantigens............................................................... 75 </p><p>2.6 Vergleichende Untersuchung der Testqualitt von DFZM-Ak- </p><p>Testvarianten und kommerziellen ELISAs ............................................... 78 </p><p>3 Etablierung des LIVE/DEAD BacLight-Kits................................................. 82 </p><p>3.1 Gating-Strategie bei der LIVE/DEAD BacLight-Analyse...................... 82 </p><p>3.2 Korrelation der verschiedenen Keimzhlmethoden.................................. 84 </p><p>4 Ergebnisse der experimentellen Infektionsstudie............................................. 87 </p><p>4.1 Ergebnis der Inokulationsdosis-berprfung ........................................... 87 </p><p>4.2 MAP-Status der Muttertiere ..................................................................... 88 </p><p>4.3 Ergebnis der klinischen berwachung der Klber.................................... 90 </p><p>4.4 Dynamik MAP-spezifischer Antikrper in der Kontroll- und in der </p><p>Infektionsgruppe...................................................................................... 91 </p><p>4.5 Dynamik der MAP-spezifischen DFZM-Ak-Titer beim einzelnen Kalb ...... 96 </p><p>4.6 Antikrpertiter im Pourquier-ELISA ...................................................... 102 </p><p>4.7 Ergebnisse der kulturell-bakteriologischen und molekularbiologischen </p><p>Untersuchungen .................................................................................... 105 </p><p>5 Ergebnisse der Feldstudien........................................................................... 107 </p><p>5.1 Nachweis MAP-spezifischer maternaler Antikrper bei Klbern und </p><p>Jungrindern (Kohortenstudie 1) ............................................................. 107 </p><p>5.2 Nachweis der MAP-spezifischen Serokonversion bei Jungrindern </p><p>(Kohortenstudie 2) ................................................................................. 113 </p><p>V Diskussion................................................................................................... 119 </p><p>VI Zusammenfassung...................................................................................... 145 </p><p>VII Summary...................................................................................................... 147 </p><p>VIII Literaturverzeichnis .................................................................................... 149 </p><p>IX Anhang......................................................................................................... 173 </p><p>1 Reagenzien und Materialien.......................................................................... 173 </p><p>2 Puffer, Medien und Lsungen ....................................................................... 176 </p><p>3 Gerte........................................................................................................... 178 </p><p>Tabellenverzeichnis................................................................................................ 179 </p><p>Abbildungsverzeichnis........................................................................................... 181 </p></li><li><p>Inhaltsverzeichnis vii </p><p>Danksagung ............................................................................................................ 183 </p></li><li><p>Abkrzungsverzeichnis </p><p>Abkrzung Begriff </p><p>Abb. Abbildung </p><p>A. bidest. Aqua bidestillata </p><p>ad auffllen bis </p><p>A. dest. Aqua destillata </p><p>AGIT Agargelimmunodiffusionstest </p><p>Ahp Alkylhydroperoxid-Reduktase </p><p>Ak Antikrper </p><p>ATCC American Type Culture Collection </p><p>AUC engl.: area under the curve </p><p>bp Basenpaar </p><p>C Grad Celsius </p><p>ca. circa </p><p>CD engl.: cluster of differentiation </p><p>DC Dentritische Zellen </p><p>DFZM Durchflusszytometer </p><p>DM Darmmukosa </p><p>DNA Desoxyribonukleinsure </p><p>DSMZ Deutsche Sammlung fr Mikroorganismen und Zellkulturen </p><p>E. coli Escherichia coli </p><p>ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay </p><p>FACS engl.: fluorescence activated cell sorting </p><p>FG Feuchtgewicht </p><p>FITC Fluoreszein-Isothiozyanat </p><p>FSC engl.: forward scatter </p><p>g Erdschwerebeschleunigung </p></li><li><p>Abkrzungsverzeichnis ix </p><p>GPL Glycopeptidolipide </p><p>h Stunden </p><p>HEPES Hydroxyethylpiperazinethansulfonsure </p><p>HEYM-Agar Herrolds Egg Yolk Medium-Agar </p><p>HRP engl.: horseradish-peroxidase </p><p>Hsp Hitzeschockprotein </p><p>IFN- Interferon- </p><p>IFTN Institut fr Tierrztliche Nahrungsmittelkunde; Justus-Liebig-Universitt Gieen </p><p>Ig Immunglobulin </p><p>IL Interleukin </p><p>IS Insertionselement </p><p>k.A. keine Angabe </p><p>KbE Koloniebildende Einheit </p><p>KBR Komplementbindungsreaktion </p><p>kDa Kilo-Dalton </p><p>KWS Klinik fr Wiederkuer und Schweine; Justus-Liebig-Universitt Gieen </p><p>LAM Lipoarabinomannan </p><p>LT Lebenstag </p><p>M. Mycobacterium </p><p>M Molaritt (mol/l) </p><p>MAA Mycobacterium avium subspecies avium </p><p>MAP Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis </p><p>MB7H9 Middlebrook 7H9-Medium </p><p>MFLI Mittlere relative Fluoreszenzintensitt </p><p>mg Milligramm </p><p>g Mikrogramm </p><p>MGIT engl.: Mycobacteria growth indicator tube </p></li><li><p>Abkrzungsverzeichnis x </p><p>MHC engl.: major histocompatibility complex </p><p>min Minuten </p><p>ml Milliliter </p><p>l Mikroliter </p><p>mm Millimeter </p><p>m Mikrometer </p><p>Mo Monat </p><p>MP Mycobacterium phlei </p><p>M.p.i. Monate post infectionem </p><p>mRNA engl.: messenger RNA </p><p>n Anzahl unabhngiger Versuche </p><p>N2 Summenformel des molekularen Stickstoffs </p><p>NaCl Natriumchlorid </p><p>OD optische Dichte </p><p>OD660 optische Dichte bei 660 nm </p><p>OIE franz.: Office International des Epizooties </p><p>PBS engl.: phosphate buffered saline </p><p>PBMC engl.: peripheral blood mononuclear cell </p><p>PCR engl.: polymerase chain reaction </p><p>PI Propidiumjodid </p><p>PPA protoplasmatisches Antigen </p><p>PPD engl.: purified protein derivative </p><p>Pq Pourquier-ELISA </p><p>Prad. Pradsorption </p><p>Q Quantil </p><p>r Korrelationskoeffizient </p><p>RNA Ribonukleinsure </p><p>ROC engl.: receiver operating characteristic </p></li><li><p>Abkrzungsverzeichnis xi </p><p>rpm engl.: rounds per minute </p><p>RT Raumtemperatur </p><p>sec Sekunde </p><p>SOD Superoxiddismutase </p><p>s...</p></li></ul>