siRNA-vermittelte Hemmung antiapoptotischer Gene in HarnblasenkarzinomzelllinienDoreen Kunze 1, Kai Krämer 1, Susanne Füssel 1, Oliver W. Hakenberg 2, Manfred P. Wirth 1, Marc-Oliver Grimm 1

1 Klinik und Poliklinik für Urologie, Technische Universität Dresden, Deutschland, 2 Urologische Klinik und Poliklinik, Universitätsklinikum Rostock, Deutschland

.

P16

Gefördert durch die Else Kröner Fresenius-Stiftung. Referenznummer 106-162502554-48

Ergebnisse

Die mRNA-Expressionsniveaus der Zielgene konnten sowohl in den Einzel-siRNA-Behandlungen als auch in den Kombinations-

behandlungen deutlich reduziert werden (Abb. 1). Einzel- und Kombinationsbehandlungen bewirken vergleichbare Hemmraten.

Für BCL2 und XIAP wurde auch auf Proteinebene eine signifikante Expressionsreduktion nachgewiesen (Abb. 2).

Die Hemmung von SVV führte zur stärksten Reduktion der Zellzahl und zur Bildung multinukleärer Zellen (Abb. 3, 5).

In den Kombinationsbehandlungen wurde eine höhere Apotoserate als in den Einzelbehandlungen festgestellt (Abb. 4)

Schlussfolgerung

Die kombinierte Hemmung von BCL2, BCL-XL, SVV und XIAP führt zur Senkung

der mRNA-Expression aller Targets und verursacht eine höhere Apoptoseinduktion

als die Einzel-siRNA-Behandlungen. Da Tumorzellen die Ausschaltung eines

Apoptoseinhibitors durch Erhöhen der Expression eines anderen antiapoptotischen

Genes umgehen können, könnte die gleichzeitige Ausschaltung mehrerer Apoptose-

relevanter Gene eine vielversprechendere BCa-Therapieoption darstellen.

Abb. 1: Reduktion der Target-mRNA-Expressionsniveaus in Einzel- und Kombinationsbehandlungen in EJ28-Zellen, 48h nach Transfektion.

Abb. 3: Zellzahl relativ zur ns-siRNA-Kontrolle in EJ28-Zellen, 72h nach Transfektion.

Abb. 4: Apoptoserate relativ zur ns-siRNA-Kontrolle in EJ28-Zellen, 72h nach Transfektion.

Abb. 4: Bildung multinukleärer Zellen nach Survivin-Inhibition in EJ28-Zellen (A), 48 h nach Transfektion. Im Vergleich dazu unbehandelte EJ28 (B). 200-fache Vergrößerung.

Ziel

Methode

Pro Zielgen wurden zwei siRNAs (D1&D2) ausgewählt. Diese wurden einzeln (10 nM siRNA) bzw. in Kombinationen von 4 (je 10 nM

einer siRNA pro Target) oder 8 siRNAs (je 5 nM pro siRNA) lipidvermittelt in EJ28-BCa-Zellen transfiziert. Als Kontrolle und zur

Normierung diente, eine „non-silencing siRNA“ (ns-siRNA) ohne Homologie zu humanen mRNAs (10 bzw. 40 nM).

48 und 72 Stunden nach Transfektion Bestimmung von:

mRNA-Expressionsniveaus der Targets: quantitative PCR mit TBP (TATA box binding protein) als Referenzgen

Protein-Expressionsniveaus von BCL2 und XIAP: Western Blot primäre Antikörper: BCL2 - Klon 28, BD-Biosciences;

XIAP - Klon 124, Dako; Referenz: β-Aktin (Sigma); Sekundärantikörper: Anti-Mausimmunoglobine HRP (Dako)

Zellzahl als Maß für die Wachstumshemmung

Apoptoserate: Annexin V-Propidiumiodid-Färbung

Ein wichtiges Ereignis in der Tumorentstehung ist die Fehlregulation des natürlichen Zelltodes (Apoptose), welche insbesondere durch

die Überexpression antiapoptotischer Gene, wie z.B. Survivin (SVV), XIAP, BCL2 und BCL-XL, gekennzeichnet ist. Die gezielte,

gleichzeitige Hemmung dieser Gene, z.B. mittels „small-interfering RNAs“ (siRNAs), könnte eine geeignete Option zur Therapie des

Blasenkarzinoms (BCa) darstellen.

Abb. 2: Reduktion der BCL2- und XIAP-Proteinniveaus in Einzel- und Kombinationsbehandlungen in EJ28-Zellen, 48h nach Transfektion.

A B

0

20

40

60

80

100

120

rela

tive

Zel

lzah

l

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

rela

tive

Ap

op

tose

rate

[%

]

0

20

40

60

80

100

120

ns-siRNA BCL2-D1 BCL2-D2 4er-D1 4er-D2 8er

BC

L2/

TB

P (

zmo

l/zm

ol)

0

20

40

60

80

100

120

ns-siRNA BCL-XL-D1 BCL-XL-D2 4er-D1 4er-D2 8er

BC

L-X

L/T

BP

(zm

ol/z

mo

l)

0

20

40

60

80

100

120

ns-siRNA XIAP-D1 XIAP-D2 4er-D1 4er-D2 8er

XIA

P/T

BP

(zm

ol/z

mo

l)

0

20

40

60

80

100

120

ns-siRNA SVV-D1 SVV-D2 4er-D1 4er-D2 8er

SV

V/T

BP

(zm

ol/z

mo

l)

BCL2 (26 kDa)

XIAP (57 kDa)

β-Aktin (42 kDa)

BCL2-D

1

BCL2-D

2

XIAP-D

1

XIAP-D

2

ns-s

iRNA

unbe

hand

elt

BCL2 (26 kDa)

XIAP (57 kDa)

β-Aktin (42 kDa)

4er-D

1

4er-D

2

8er

ns-s

iRNA