Spezielle Kapitel der Immunologie 1- Signaltransduktion 1 ... Kapitel...آ  class switch recombination

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  • Spezielle Kapitel der Immunologie

    1- Signaltransduktion 1

    2- Signaltransduktion 2

    3- Effektormechanismen

    4- Hypersensitivität

    5- Genetik der Rekombination, Hypermutation und des Klassenwechsel

    6- NK, NK/T Zellen und NK Rezeptorgene

    7- Autoimmunität

    8- Tumor-Immunität

    http://mailbox.univie.ac.at/Erhard.Hofer/ Student Point

  • Lehrbuch: A.K. Abbas, A.H. Lichtman, S. Pillai (6th edition, 2007) Cellular and Molecular Immunology Saunders Elsevier

    Reviews / Publikationen Kapitel 1- Genetik der Rekombination, Hypermutation und des Klassenwechsel

    D.G.Schatz and D.Baltimore (1988). Stable Expression of immunoglobulin gene V(D)J recombinase activity by gene transfer into 3T3 fibroblasts. Cell 53, 107-115.

    D.G. Schatz (1997). V(D)J recombination moves in vitro. Seminars in Immunology 9, 149-159.

    M. Gellert (2002). V(D)J recombination: RAG proteins, repair factors and regulation, Annu. Rev. Biochem. 71, 101-132

    C.H. Bassing, W. Swat and F.W. Alt (2002). The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell 109 Suppl., S45-S55

  • Y. Ma et al. (2002). Hairpin opening and overhang processing by an Artemis/DNA-dependent protein kinase complex in nonhomologous end-joining and V(D)J recombination. Cell 108, 781-794.

    M.A. Oettinger (2004). Hairpins at split ends in DNA. Nature 432, 960-961

    A. Agrawal et al. (1998). Transposition mediated by RAG1 and RAG2 and its implications for the evolution of the immune system, Nature 394, 744-751

    F.N. Papavasiliou and D.G. Schatz (2002). Somatic hypermutation of Immunoglobulin genes: Merging mechanisms for genetic diversity. Cell 109, S35-S44.

    S. Longerich et al. (2006). AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opinion in Immun.18, 164-174.

    V.H. Odegard and D.G. Schatz (2006). Targeting of somatic hypermutation. Nature Rev. Immun. 6, 573-583.

  • Genetik der Antigenrezeptoren

    komplexes genetisches System Ziel: Selbst - Nicht-Selbst Unterscheidung

  • Das spezifische Immunsystem der Vertebraten ist evolviert, um die Unterscheidung von Selbst und Nicht-Selbst somatisch zu lernen

    Möglichkeiten für Abwehrsystem: Rezeptoren für Selbst-Marker Rezeptoren für Nicht-Selbst Strukturen:

    vererbt oder für somatische Selektion

  • 108 bis 109 B und T Lymphozyten

    nahezu jede Zelle einen verschiedenen klonal exprimierten Rezeptor Herstellung der Rezeptoren nach dem „Zufallsprinzip“

    Klonale Selektionstheorie Macfarlane Burnet, 1961

    wie möglich ? Keimbahntheorie Somatische Mutationstheorie

  • Keimbahnorganisation der humanen Ig Gen Loci

  • Keimbahnorganisation der humanen TZR Loci

  • Rekombination auf DNA Ebene V, D, J nach Baukastensystem unpräzises Verknüpfen der Segmente „junctional diversity“

    Primäres Kern-Transkript (alternatives) Splicing

    mRNA Protein Membraninsertion oder Sezernierung

  • Rekombination nach Baukastensystem

  • Rekombination und Expression der Gene für die Ig-Ketten

  • Rekombination und Expression der Gene für die TZRα und TZRβ Ketten

  • Mechanismus der V(D)J Rekombination

    Signale auf DNA Ebene: RSS

    Rekombinasekomplex

    Spaltung und Verknüpfung der Segmente

  • V(D)J Rekombination

    Deletion und Inversion

  • Erkennungssequenzen auf DNA Ebene RSS: „recognition signal sequences“

    1-turn Signal: Heptamer-12-Nonamer

    2-turn Signal: Heptamer-23-Nonamer

    Rekombination nur zwischen 1-turn Signal und einem 2-turn Signal möglich

  • weiss: 1-turn schwarz: 2-turn

    Anordnung der RSS für einen Lokus identisch, bei verschiedenen Loci unterschiedlich

  • Verknüpfung der Signalenden: präzise Verknüpfung der kodierenden Segmente: „unpräzise“

  • Einzelschritte der V(D)J Rekombination:

    Zusammenführung der Signale

    Spaltung und Bildung der Haarnadelschleife

    Öffnen der Haarnadelschleife und Endbearbeitung

    Reparatur und Ligation

  • gpt: xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (mycophenolic acid)

    neo: neomycine phosphotransferase (G418)

  • V(D)J Rekombinase: RAG1 und RAG2 (recombination activation genes)

    einzige lymphoid-spezifische Faktoren für Rekombination andere Faktoren in allen Zellen vorhanden

    k.o. Mäuse: keine reifen T und B Zellen, keine anderen Defekte

    RAG1 + RAG2 binden RSS und spalten DNA zwischen Heptamer und kodierendem Segment

    2 Stufen: Nick am 5´-Ende des Heptamers Hairpin Bildung

    Mg2+ HMG1 und 2 erhöhen Effizienz der Spaltung am 2-turn RSS und bevorzugte 1-turn + 2-turn Paarung

  • Rag1+Rag2 Bindung

    Endonukeolytische Spaltung eines Stranges

    Nukleophiler Angriff der 3´-OH gruppe am Phosphat des gegenüberliegenden Stranges

  • Synapse:

    kombiniertes Schneiden, Zusammenführen der Enden

    in Komplex, der alle 4 Enden bindet

  • Spätere Stadien der Rekombination: Spalten des Hairpin und Verknüpfung der Enden

    DNA Doppelstrangbruch-Reparaturenzyme:

    DNA-PK Artemis Ku Proteine DNA Ligase IV XRCC4 Histon H2AX Mre11/Rad50/Nbs1 Komplex

  • Öffnen des Hairpin:

    DNA-PK phosphoryliert und aktiviert Artemis, Endonuklease, welche Hairpin spaltet

  • „Junctional Diversity“

  • „Coding joints“

    Nukleotide gehen verloren, kommen neu dazu (ohne Template)

    P-Nukleotide: „hairpin“

    N-Nukleotide: TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) bis zu 15 N

    Nuklease kann ss-Enden abspalten

  • Artemis: bei Defekt humane SCID Form DNA-PK bindet und aktiviert Artemis durch Phosphorylierung, Artemis bekommt dadurch Endonuklease-Aktivität für Hairpin und 5´- und 3´-überhängende Einzelstrang-DNA

    DNA-PK besteht aus Katalyt. DNA-PKs Untereinheit und Ku Protein-Heterodimer (Ku70 und Ku80) Ku bindet DNA, überbrückt Enden

    DNA Ligase IV / XRCC4 Komplex auch wichtig, da defekte Zellen bestrahlungssensitiv sind, und keine signal- oder coding joints machen können

    weiters vermutlich beteiligt: Histon H2AX

    Mre11/Rad50/Nbs1 Komplex: DNA repair in Hefe fördert Verknüpfung von DNA an Mikrohomologien

  • Nonhomologous DNA end-joining proteins

  • Regulation der Zugänglichkeit eines Lokus

    Hypothesen: Germline Transkription DNA Demethylierung Histon Acetylierung

  • Rekombination und transkriptionelle Aktivität

  • Non T cells

    Early thymocytes

    Eβ deleted

    Germline Transkription

  • Stadien der B Zellreifung

  • Stadien der T Zellreifung

  • M

  • Evolution der Antigenrezeptorgene

    RAG1 + 2 ist eine Transposase

    Hairpin Formierung: direkte Transesterbildung wie bei Mu Transposase oder HIV Integrase

    RAG1/2 kann in vitro mit RSS exogene DNA attackieren ohne Sequenzbevorzugung 5 bp staggered ends

  • Transposition über beide Enden

  • (Knorpelfische)

    Evolutionärer Ursprung der AG-Rezeptorgene durch Transposoninsertion ?

  • Transposition mit einem Ende

    Reversible Reaktion

  • Possible chromosomal translocation by RAG-promoted transposition

  • Analogien Rag1/2 Rekombination und Transposons:

    Invertierte repeats - DNA Signale Bindung Transposase an Signalsequenzen Mechanismus Spaltung: nick ss, Transesterbildung Hairpin + blunt end

    Unterschiede:

    Transposase mit herausgespaltenem Fragment attackiert DNA Insertion des Transposons 5 bp staggered ends

    Rag1/2 Rekombination: nach hairpin + blunt end Bildung normal weiter dann mit ds-Reparatursystem, Degradierung/Inversion DNA zwischen Signalsequenzen aber: in vitro kann auch Insertion mit geringer Häufigkeit

  • Somatische Hypermutation (SH)

    Genkonversion (GC) und

    Klassenwechsel (class-switch) -Rekombination (CSR)

  • gemeinsamer Basismechanismus für SHM, GC, CSR

  • Activation-induced cytidine deaminase (only lymphocyte-specific factor required for SHM, GC, CSR)

    Homologie zu RNA editierendem Enzym C to U deamination in vitro vor allem exprimiert in sekundären lymphoiden Organen Defizienz: keine CSR und SHM In Chicken/Rabbits keine Genkonversion

    direkte Aktivität auf dC in DNA U-G mismatch Läsionen: C-T and G-A Transitionen base excision Reparatur - jedes Nukleotid mismatch Reparatur mit Polymerase mit hoher Fehlerquote Template-vermittelte Reparatur mit Sister-Chromatid oder V-Pseudogen Läsion in switch site: Reparatur mit anderer switch site

  • Affinitätsreifung

  • Somatische Mutationen in Ig V Genen Mutations clustered in CDRs (complemetarity determining region)

    Kd: dissociation constant

  • Mutationsrate 10-3, 106x höher als normal hauptsächlich Punktmutationen Mutationen proportional der Transkriptionsrate

  • Modell 2002 für somatische Hypermutation:

    Promoter bestimmt Region Enhancer lizensiert Locus