Spezielle Kapitel der Immunologie

1- Signaltransduktion 1

2- Signaltransduktion 2

3- Effektormechanismen

4- Hypersensitivität

5- Genetik der Rekombination, Hypermutation und des Klassenwechsel

6- NK, NK/T Zellen und NK Rezeptorgene

7- Autoimmunität

8- Tumor-Immunität

http://mailbox.univie.ac.at/Erhard.Hofer/Student Point

Lehrbuch:A.K. Abbas, A.H. Lichtman, S. Pillai (6th edition, 2007)Cellular and Molecular ImmunologySaunders Elsevier

Reviews / Publikationen Kapitel 1- Genetik der Rekombination, Hypermutation und des Klassenwechsel

D.G.Schatz and D.Baltimore (1988). Stable Expression of immunoglobulin gene V(D)J recombinase activity by gene transfer into 3T3 fibroblasts.Cell 53, 107-115.

D.G. Schatz (1997). V(D)J recombination moves in vitro.Seminars in Immunology 9, 149-159.

M. Gellert (2002). V(D)J recombination: RAG proteins, repair factorsand regulation, Annu. Rev. Biochem. 71, 101-132

C.H. Bassing, W. Swat and F.W. Alt (2002). The mechanism and regulationof chromosomal V(D)J recombination. Cell 109 Suppl., S45-S55

Y. Ma et al. (2002). Hairpin opening and overhang processing by an Artemis/DNA-dependent protein kinase complex in nonhomologousend-joining and V(D)J recombination. Cell 108, 781-794.

M.A. Oettinger (2004). Hairpins at split ends in DNA. Nature 432, 960-961

A. Agrawal et al. (1998). Transposition mediated by RAG1 and RAG2and its implications for the evolution of the immune system,Nature 394, 744-751

F.N. Papavasiliou and D.G. Schatz (2002). Somatic hypermutation ofImmunoglobulin genes: Merging mechanisms for genetic diversity.Cell 109, S35-S44.

S. Longerich et al. (2006). AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opinion in Immun.18, 164-174.

V.H. Odegard and D.G. Schatz (2006). Targeting of somatic hypermutation.Nature Rev. Immun. 6, 573-583.

Genetik der Antigenrezeptoren

komplexes genetisches SystemZiel: Selbst - Nicht-Selbst Unterscheidung

Das spezifische Immunsystem der Vertebratenist evolviert, um die Unterscheidung von Selbstund Nicht-Selbst somatisch zu lernen

Möglichkeiten für Abwehrsystem:Rezeptoren für Selbst-MarkerRezeptoren für Nicht-Selbst Strukturen:

vererbt oder für somatische Selektion

108 bis 109 B und T Lymphozyten

nahezu jede Zelle einen verschiedenen klonal exprimierten RezeptorHerstellung der Rezeptoren nach dem „Zufallsprinzip“

Klonale SelektionstheorieMacfarlane Burnet, 1961

wie möglich ?KeimbahntheorieSomatische Mutationstheorie

Keimbahnorganisation der humanen Ig Gen Loci

Keimbahnorganisation der humanen TZR Loci

Rekombination auf DNA EbeneV, D, J nach Baukastensystemunpräzises Verknüpfen der Segmente „junctional diversity“

Primäres Kern-Transkript (alternatives) Splicing

mRNAProteinMembraninsertion oder Sezernierung

Rekombination nach Baukastensystem

Rekombinationund Expressionder Gene fürdie Ig-Ketten

Rekombinationund Expressionder Gene für dieTZRα und TZRβKetten

Mechanismus der V(D)J Rekombination

Signale auf DNA Ebene: RSS

Rekombinasekomplex

Spaltung und Verknüpfung der Segmente

V(D)JRekombination

Deletion undInversion

Erkennungssequenzen auf DNA EbeneRSS: „recognition signal sequences“

1-turn Signal: Heptamer-12-Nonamer

2-turn Signal: Heptamer-23-Nonamer

Rekombination nur zwischen 1-turn Signalund einem 2-turn Signal möglich

weiss: 1-turnschwarz: 2-turn

Anordnung der RSS für einen Lokus identisch,bei verschiedenen Loci unterschiedlich

Verknüpfung der Signalenden: präziseVerknüpfung der kodierenden Segmente: „unpräzise“

Einzelschritte derV(D)JRekombination:

Zusammenführungder Signale

Spaltung undBildung derHaarnadelschleife

Öffnen derHaarnadelschleifeund Endbearbeitung

Reparatur undLigation

gpt: xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (mycophenolic acid)

neo: neomycinephosphotransferase(G418)

V(D)J Rekombinase:RAG1 und RAG2 (recombination activation genes)

einzige lymphoid-spezifische Faktoren für Rekombinationandere Faktoren in allen Zellen vorhanden

k.o. Mäuse: keine reifen T und B Zellen, keine anderen Defekte

RAG1 + RAG2 binden RSS und spalten DNA zwischenHeptamer und kodierendem Segment

2 Stufen:Nick am 5´-Ende des HeptamersHairpin Bildung

Mg2+HMG1 und 2 erhöhen Effizienz der Spaltung am 2-turn RSSund bevorzugte 1-turn + 2-turn Paarung

Rag1+Rag2 Bindung

Endonukeolytische Spaltung eines Stranges

Nukleophiler Angriffder 3´-OH gruppeam Phosphat des gegenüberliegendenStranges

Synapse:

kombiniertes Schneiden,Zusammenführen der Enden

in Komplex, der alle 4 Endenbindet

Spätere Stadien der Rekombination:Spalten des Hairpin und Verknüpfung der Enden

DNA Doppelstrangbruch-Reparaturenzyme:

DNA-PKArtemisKu ProteineDNA Ligase IVXRCC4Histon H2AXMre11/Rad50/Nbs1 Komplex

Öffnen des Hairpin:

DNA-PK phosphoryliert und aktiviert Artemis,Endonuklease, welche Hairpin spaltet

„JunctionalDiversity“

„Coding joints“

Nukleotide gehen verloren, kommen neu dazu (ohne Template)

P-Nukleotide: „hairpin“

N-Nukleotide: TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) bis zu 15 N

Nuklease kann ss-Enden abspalten

Artemis: bei Defekt humane SCID FormDNA-PK bindet und aktiviert Artemis durch Phosphorylierung,Artemis bekommt dadurch Endonuklease-Aktivität für Hairpin und5´- und 3´-überhängende Einzelstrang-DNA

DNA-PKbesteht aus Katalyt. DNA-PKs Untereinheit und Ku Protein-Heterodimer (Ku70 und Ku80)Ku bindet DNA, überbrückt Enden

DNA Ligase IV / XRCC4 Komplexauch wichtig, da defekte Zellen bestrahlungssensitiv sind, und keine signal- oder coding joints machen können

weiters vermutlich beteiligt:Histon H2AX

Mre11/Rad50/Nbs1 Komplex: DNA repair in Hefefördert Verknüpfung von DNA an Mikrohomologien

Nonhomologous DNA end-joining proteins

Regulation der Zugänglichkeit eines Lokus

Hypothesen:Germline TranskriptionDNA DemethylierungHiston Acetylierung

Rekombination und transkriptionelle Aktivität

Non T cells

Early thymocytes

Eβ deleted

Germline Transkription

Stadien der B Zellreifung

Stadien der T Zellreifung

M

Evolution der Antigenrezeptorgene

RAG1 + 2 ist eine Transposase

Hairpin Formierung: direkte Transesterbildungwie bei Mu Transposase oder HIV Integrase

RAG1/2 kann in vitro mit RSS exogene DNA attackierenohne Sequenzbevorzugung5 bp staggered ends

Transposition über beide Enden

(Knorpelfische)

Evolutionärer Ursprung derAG-Rezeptorgene durch Transposoninsertion ?

Transposition mit einem Ende

Reversible Reaktion

Possible chromosomal translocation by RAG-promoted transposition

Analogien Rag1/2 Rekombination und Transposons:

Invertierte repeats - DNA SignaleBindung Transposase an SignalsequenzenMechanismus Spaltung: nick ss, TransesterbildungHairpin + blunt end

Unterschiede:

Transposase mit herausgespaltenem Fragment attackiert DNAInsertion des Transposons5 bp staggered ends

Rag1/2 Rekombination:nach hairpin + blunt end Bildungnormal weiter dann mit ds-Reparatursystem,Degradierung/Inversion DNA zwischen Signalsequenzenaber: in vitro kann auch Insertion mit geringer Häufigkeit

Somatische Hypermutation (SH)

Genkonversion (GC) und

Klassenwechsel (class-switch)-Rekombination (CSR)

gemeinsamer Basismechanismus für SHM, GC, CSR

Activation-induced cytidine deaminase(only lymphocyte-specific factor required for SHM, GC, CSR)

Homologie zu RNA editierendem Enzym C to U deamination in vitrovor allem exprimiert in sekundären lymphoiden OrganenDefizienz: keine CSR und SHMIn Chicken/Rabbits keine Genkonversion

direkte Aktivität auf dC in DNA U-G mismatch Läsionen: C-T and G-A Transitionenbase excision Reparatur - jedes Nukleotidmismatch Reparatur mit Polymerase mit hoher FehlerquoteTemplate-vermittelte Reparatur mit Sister-Chromatid oder V-PseudogenLäsion in switch site: Reparatur mit anderer switch site

Affinitätsreifung

Somatische Mutationen in Ig V GenenMutations clustered in CDRs(complemetarity determining region)

Kd: dissociation constant

Mutationsrate 10-3, 106x höher als normalhauptsächlich PunktmutationenMutationen proportional der Transkriptionsrate

Modell 2002 für somatische Hypermutation:

Promoter bestimmt RegionEnhancer lizensiert Locus

„Mutatorsome“

A. Ig Enhancer bindet Mutator-Faktor (rot)B. Enhancer-Promoter Interaktion C. Mutator-Faktor bei TICD. Transkription ist wichtig

Mutator-Faktor fährt mit TC mitE. Assymetrischer DSB (nicht unbedingt notwendig)F. 5´-end Resektion, 3´-overhang lagert sich an intaktes Sister Chromatid Reparatur durch homologe RekombinationG. DNA Synthese führt zu Punktmutationen Polymerase mit hoher Irrtumsrate (wie DNA Pol.-iota)

Modell:AID Funktion imersten Schritt:Nick und Initiierung des Doppelstrangbruches

Modell 2006

SHM Modell 2006BER: base excision repairMMR: mismatch repair

TA

AID: activation-induced cytidine deaminaseTarget ist ssDNA(kleine Regionen ssDNA enstehen transient bei Transkription)dC - deamination U - G mismatch

- Replication w/o repair: C - T, G - A transition

- BER: base excision repair with error prone Polymerase: U excised by UNG: Uracil N-Glycosylase removes the U residue, leaving abasic site replaced by any other (transition and transversion)

-MMR: mismatch repair machineryMutations at A/T pairs near UG lesionExo1, MSH (homologue of E.coli MutS)DNA polymerase eta

-ds Bruch:MRE11 (meiotic recombination 11 homologue)-Rad50 complexcleaves DNA at abasic site, generates 3´-ends that cannot be extended by normal DNA polymerase ?

B Zellselektion in„germinal centers“der LymphknotenundDifferenzierung zuAk-sezernierendenPlasmazellen

Klassenwechselder schwerenKetten

AID und„germline“ Transkriptionführen zuDoppelstrangbrüchenIn „switch“ Regionen

SHM CSR Introduction and repair of lesions

Hauptwege der Reparatur:

mutations-assoziierte Brüche normalerweise

durch homologe Rekombination repariert

oder

nicht-homologes end-joining: NHEJist Mechanismus bei CSR

CSR und SHM - AID notwendig: CSR: ds BruchSHM: ss Mutation und ds Bruch ?

- verschiedene Reparatur: CSR durch NHEJ SHM durch BER, MMR und homol. Rek. ?

Wichtig für Lymphomagenese

Die meisten Lymphome entstehen in den Germinal Centersaus B Zellen

50 % zeigen translocation break points innerhalb der Targetsequenzen für CSR, die anderen dürften mit Fehlern bei SHM zusammenhängen

SHM kann auch auf Protoonkogene in Tumorzellen übergreifen,In gleichen Regionen: Translokationen und Mutationenauch ohne Translokation

Fehler im Targeting der SHM und CSR Mechanismenoder in der Reparatur der DNA Brüche ?

M

Genetik der NK Rezeptoren:NK Rezeptor- und Leukozytenrezeptor-Genkomplex

AktivierungInhibitionMHCSelektion

NK und NK/T Zellen

NK Zellen und DCs

Rezeptoren auf myeloiden Zellen: DCs, macrophages

Reviews:

A. Moretta et al. (2002). What is a natural killer cell ?Nature Immunol. 3, 6-8

L. Moretta et al. (2002). Surface receptors that regulate theNK cell function: beyond the NK cell scope. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 266, 11-22

J. Trowsdale (2001). Genetic and functional relationships betweenMHC and NK receptor genes. Immunity 15, 363-374

D.H. Raulet et al. (2001). Regulation of the natural killer cellreceptor repertoire. Annu. Rev. Immunol. 19, 291-330

Hamerman, J. A., Ogasawara, K., Lanier, L. L. (2005). NK cells in innate immunity. Curr Opin Immunol 17, 29-35.

W.M. Yokoyama and S. Kim (2006). Licensing of natural killerCells by self-major histocompatibility complex class I.Immunol. Rev. 214, 143-154.

J.G. Sambrook and S. Beck (2007). Evolutionary vignettes of natural killer cell receptors. Curr. Op. Immun. 19. 553-560

E. Tupin, Y. Kinjo and M. Kronenberg (2007). The unique roleof natural killer T cells in the response to microorganisms.Nat. Rev. Microbiol. 5, 405-417.

H.-G. Ljunggren and K.-J. Malmberg (2007). Prospects for the useof NK cells in immunotherapy of human cancer.Nat. Rev. Immun. 7, 329-339.

Focus on NK cells in Nature Immunol, May 2008:

J. Di Santo (2008). Natural killer cells: Diversity in search of a niche.Nature Immunol. 9, 473-475.

M. Terme et al. (2008). Natural killer cell-directed therapies:moving fromunexpected results to successful strategies. Nature Immunol. 9, 486-494.

NK ZelleLGL (grosser granulärer Lymphozyt)

3 Aktivitäten:K (Killer) - ADCC (Ab-dependent cellular cytotoxicity)NKLAK - Lymphokin-aktivierter Killer

Spontanes Killing von Tumor- und virusinfizierten ZellenHybridresistenz

FcγIII Rezeptor / CD16: K AktivitätNK Rezeptoren: NK (und LAK Aktivität)

Marker:p46+CD56+ CD3-TZR-

HSZ

Lymphoide VZ

T + NK VZ B VZ

B Lymphozyt

T Lymphozyt(Thymus)

NK Zelle

Hybridresistenz

A Maus B Maus

AB

Bone Marrow Transplantationx x

Killing von No-Self ?

Activating: NCR: natural cytotoxicity receptorsCD94/NKG2-C

Inhibitory:KIR: Killer Inhibitory ReceptorsCD94/NKG2-A

2B4: coreceptor

NKG2-D: activatingNK, T cells, macrophages(ligands: MIC, RAE)

RAEs

Funktionen:

Virusabwehr in früher InfektionsphaseTumor-Killing„Hybridresistenz“, Problem Knochenmarktransplantationen

γ-IFN ProduktionAktivierung und Killing reguliert durch NK RezeptorenADCC: CD16

Funktion in Interphase natürliches / spezifisches Immunsystem

Missing-self hypothesis: MHC class IKIRs: Ig-likeNKG2A/CD94: lectin-like

Ig-domain

lectin-domain

NKG2ACD94

KIR2D KIR3D KIR3Ddimer

HLA-C HLA-B HLA-E

ITIM

Ligands on normal cell

NK orNK/Tc

KIRs erkennen kleine Gruppenvon HLA Allelen

Activating NK receptorsActivating KIRs(NCRs: Ig-like)NKG2C/CD94: lectin-like

Ig-domain

lectin-domain

NKG2CCD94/

KIR2S KIR3S

HLA-C HLA-B HLA-E

ITAM

Ligands onvirus-infected ortumor cell

NKG2ECD94/

HLA-E

NKG2D

MICA/B

DAP12 DAP12 DAP12 DAP12 DAP10

NK orNK/T

NK Rezeptoren:inhibierende und aktivierende Formen

Ig-Typ:inhibierend: KIR (nur human) - Liganden: MHC class I / Peptidaktivierend:

KIR Homologe (nur human) - Liganden: MHC class I / Peptid ?NCR (NKp30, NKp44, NKp46) - Liganden: virales Hämagglutinin

+ zelluläre Liganden ? nicht identifiziert

Lectin-Typ:inhibierend:Ly49 (nur Maus) - Liganden: MHC class I CD94/NKG2A (Human und Maus) - Liganden: HLA-E, Qa-1

mit Peptid von MHC class Iaktivierend:CD94/NKG2C (Human und Maus) - Liganden: HLA-E/Peptid ?CD94/NKG2E

NKG2D (Human und Maus) - Liganden: MICA/B, ULBP, Rae

Genomic localization

hChr19 LRChChr12 NKC

Recent evolution human - mouse: convergent evolution

Interactions MHC and MHC-like proteins

Polymorphisms

chr

chr

The human NKC

Konvergente Evolution:2 unterschiedlicheRezeptorklassenfür gleiche FunktionIn Mensch und Maus

keine funktionellenKIR´s

keine funktionellenLy49

NKG2-D und Stress / virale Infektionen / Tumore

3 Liganden hochreguliert bei Stress, Virusinfektion, in Tumorzellen:MIC-A, -B (MHC class I chain related genes)RAEs (retinoic acid inducible early genes)ULBPs (UL binding proteins)

CMV (cytomegalovirus) immune evasion strategies

HCMV:reguliert MHC class I hinunterUL40 Peptid bringt HLA-E wieder hoch / inhibitive CD94/NKG2A InteraktionUL18 ist MHC class I mimic / KIR Interaktion

HCMV:UL16 inhibiert ULBP und MIC Interaktion mit NKG2D

NK Zellen mitNKG2C/CD94Rezeptor in Personen mit HCMV Infektionerhöht

Some newer concepts:

NK cells and dendritic cells

NKR on T cells: NK/T cells

NK cells and tumors

NK cells in cellular therapies

Acquisition of receptor repertoire

Development and liscensing of NK cells

„NK“ receptors on T lymphocytes and other cell types

KIR und CD94/NKG2A /NKG2C: nur NK Zellen und Subpopulationen von NKT Zellen

ILT, LAIR, NKG2D: auch auf anderen LeukozytenMonocyten, Makrophagen, dendritischen Zellen, B Zellen

Acquisition of receptor repertoire

Hypothesis: NK cell education(not fully understood)

each NK cell has several inhibitory and activating receptors,developing NK cell initiates inhibitory receptor gene expressionin a sequential, cumulative and stochastic fashion

class I deficient mice: NK cells are tolerant

„at least one“ hypothesis: formation of repertoire regulated such that „at least one“ inhibitory receptor for one or another self MHCis present

Possibility:first stimulatory receptors,induce expression inhibitoryreceptors until zero sumbetween stimulation andInhibition

Question:NK cells are alloreactivebut self-tolerant

Focus on natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 471-510 (2008)

Viewpoint on NK cells. Eur.J.Immunol. 38, 2927-2964 (2008)

Further points:

More NK subpopulations ?

Tregs and NK cells ?

CD56 bright NK cells, progenitor or separate subpopulation ?

NK cell diversity -subpopulations

F

Figure 1. Mature NK cells develop from precursor cells, for instance, in theLN (1); mature NK cells proliferate (2), produce cytokines (3), rejectallogeneic BMG (4) and exert cytotoxic activity towards tumour cells andvirally infected cells (5). All these NK cell properties are inhibited by Treg.The mechanism is in most cases TGF-b release by Treg, which, amongother effects, induces downregulation of the activating NK cell receptorNKG2D. NK cells can also be killed by Treg in a perforin/granzyme B-dependent manner. GRZ B: granzyme B; ???: mechanism

Figure 1. Functions and development of tonsilar NK cells. Non-cytotoxicCD56brightCD16� NK cells, which constitute the majority of tonsilar NK cells,secrete cytokines upon activation by DC. These block pathogens, like EBV,which breach mucosal barriers, and assist DC in the priming of Th1polarized T-cell responses. They might originate from bloodCD56brightCD16� NK cells that home to secondary lymphoid tissues, and canat least partially mature to cytotoxic Eur. J. Immunol. 2008. 38: 2927–2968

F

Hypersensitivität und Autoimmunität

Immunantwort - Gewebeschädigungunkontrolliert oder abnorm induziert

Typ I: Immediate (unmittelbare) Hypersensitivität(IgE, mast cells)

Typ II: Antikörper-vermittelte

Typ III: Immunkomplex-vermittelte

Typ IV: T Zell- vermittelte(delayed type)

Entwicklung Autoimmunität

Lymphozyten: Fehler Selbst-Toleranz

zentral: AIRE (autoimmune regulator gene)presentation of tissue specific proteinsin thymic epithelial cells

periphär: Ko-Stimulatoren, B7Inhibitoren, CTLA-4Apoptose B/T Zellen: FasT Zell-Suppression Treg

IL2, IL2Rchain FoxP3

B Zell-Toleranz: polyklonale Akt.

Entwicklung Autoimmunität (weiter)

Genetic deficiencies of complement proteins

NOD2: intracellular microbial sensor

SHP-1: failure negative regulation B cells

PTPN22: reduced inhibition by tyr phophatase

Entwicklung Autoimmunität

Genetische Faktoren:

MHC Klasse II (auch Klasse I)

nicht MHC Gene: ca. 20 bei IDDM(MHC aber am stärksten)Polymorphismus IL2Defizienz KomplementproteineFas, Fas-L

SLE: Systemic lupus erythematosus AITD: autoimmune thyroid diseaeRA: rheumatoid arthritis T1D: type 1 diabetes

Susceptibility loci for autoimmune diseases

Einzelne Aminosäurenam Rand der Grube des MHC class II Molekülssind wichtig für Prädisposition oderProtektion

GAD: glutamic acid decarboxylase

IA-2: islet tyrosine phosphatase

Systematic analysis of T cell epitopes in autoimmune diabetes

Black: HLA-DQ38

Diagonal strips: HLA-DR3

Grey: HLA-DR4

Entwicklung Autoimmunität

Infektionen: lokale Entzündung (bystander effect)

Molecular Mimicry: Kreuzreaktivität S-Antigen

Weitere Faktoren: anatomische Änderungen durchEntzündung IschemiaTrauma

S-Antigenfreisetzung

Therapie

CorticosteroideAnti- IL1, -TNF, -B7, -CD40Depletion B cells (anti-CD20)CsAMethotrexate

Toleranzinduktion: exp. StadiumInducing tolerance in disease-producing lymphocytesInducing Tregs