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Stavros Kromidas Der HPLC-Experte · HPLC for Pharmaceutical Scientists 2007 978-0-471-68162-5, auch als e-Books erhältlich. Stavros Kromidas Der HPLC-Experte Möglichkeiten und

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Stavros Kromidas

Der HPLC-Experte

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978-0-471-68162-5, auch als e-Books

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Stavros Kromidas

Der HPLC-Experte

Möglichkeiten und Grenzen der modernen HPLC

AutorDr. Stavros KromidasConsultant, SaarbrückenRosenstr. 1666125 SaarbrückenDeutschland

n Alle Bücher von Wiley-VCH werden sorgfältigerarbeitet. Dennoch übernehmen Autoren,Herausgeber und Verlag in keinem Fall, einschließ-lich des vorliegenden Werkes, für die Richtigkeit vonAngaben, Hinweisen und Ratschlägen sowie füreventuelle Druckfehler irgendeine Haftung

Bibliograf ische Informationder Deutschen NationalbibliothekDie Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diesePublikation in der Deutschen Nationalbibliografie;detaillierte bibliografische Daten sind im Internetüber <http://dnb.d-nb.de> abrufbar.

© 2014 Wiley-VCH Verlag & Co. KGaA, Boschstr. 12,69469 Weinheim, Germany

Alle Rechte, insbesondere die der Übersetzung inandere Sprachen, vorbehalten. Kein Teil dieses Buchesdarf ohne schriftliche Genehmigung des Verlages inirgendeiner Form – durch Photokopie, Mikro-verfilmung oder irgendein anderes Verfahren –

reproduziert oder in eine von Maschinen, insbeson-dere von Datenverarbeitungsmaschinen, verwendbareSprache übertragen oder übersetzt werden. DieWiedergabe von Warenbezeichnungen, Handels-namen oder sonstigen Kennzeichen in diesem Buchberechtigt nicht zu der Annahme, dass diese vonjedermann frei benutzt werden dürfen. Vielmehr kannes sich auch dann um eingetragene Warenzeichenoder sonstige gesetzlich geschützte Kennzeichen han-deln, wenn sie nicht eigens als solche markiert sind.

Satz Reemers Publishing Services GmbH, KrefeldDruck und Bindung Markono Print Media Pte Ltd,SingaporeUmschlaggestaltung Formgeber, Mannheim

Print ISBN: 978-3-527-33306-6ePDF ISBN: 978-3-527-67660-6ePub ISBN: 978-3-527-67658-3Mobi ISBN: 978-3-527-67659-0oBook ISBN: 978-3-527-67661-3

Gedruckt auf säurefreiem Papier.

Inhaltsverzeichnis

Vorwort XIII

Zum Aufbau des Buches XV

Autorenverzeichnis XVII

1 LC/MS-Kopplung 11.1 Stand der Technik in der LC/MS-Kopplung 11.1.1 Einleitung 11.1.2 Ionisationsmethoden bei Atmosphärendruck-Massenspektrometern 21.1.2.1 Übersicht API-Methoden 41.1.2.2 ESI 51.1.2.3 APCI 71.1.2.4 APPI 81.1.2.5 APLI 81.1.2.6 Bestimmung der Ionensuppression 91.1.2.7 Beste Ionisationsmethode für die jeweilige Fragestellung 101.1.3 Massenanalysatoren 101.1.4 Zukünftige Entwicklungen 131.1.5 Worauf sollten Sie beim Kauf eines Massenspektrometers achten? 131.2 Technische Aspekte und Fallstricke der LC/MS-Kopplung 141.2.1 Apparative Gesichtspunkte 151.2.1.1 Das passende Massenspektrometer zur analytischen Fragestellung 151.2.1.2 (U)HPLC und Massenspektrometrie 191.2.2 MS-Kompatibilität von LC-Methoden – die Trennchemie passt

sich an 341.2.2.1 Flussrate und Ionisationsprinzip 351.2.2.2 Eluentenzusammensetzung 371.2.3 Qualität der MS-Spektren und der LC/MS-Chromatogramme 391.2.3.1 Kein Signal 391.2.3.2 Schlecht angepasste Quellenbedingungen und ihre Auswirkung auf das

Chromatogramm 401.2.3.3 Ionensuppression 42

V

1.2.3.4 Unbekannte Massensignale im Massenspektrum 431.2.3.5 Apparative Gründe für Fehlinterpretation von Massenspektren 481.2.4 Fazit 501.2.5 Abkürzungen 511.3 LC/MS-Kopplung in der Praxis – Anwender berichten 51

2 HPLC-GC-Kopplung in der Praxis: Grundlagen, Applikationsbeispiele undAusblick 61

2.1 Einleitung 612.2 Allgemeiner Aufbau 632.3 LC-GC oder LCxGC – Heartcut vs. Comprehensive 642.4 HPLC als Vortrennung für die GC 662.5 Instrumentelle Anforderungen an die HPLC 682.6 LC-GC-Transfer und Echtzeitverdampfung 702.7 PTV-Solvent-Split 712.8 Geschwindigkeitskontrollierte Injektion 732.9 At-Once-Injection/Rapid LV-Injection 752.10 On-Column-Techniken 752.11 Alternative On-Column-Transfertechniken 772.12 Solvent Trapping und Bandenverbreiterung 782.13 Der frühe Dampfausgang (SVE) 802.14 Simultane Lösungsmittelverdampfung (concurrent solvent

evaporation) 812.15 Partiell simultane Lösungsmittelverdampfung (partially concurrent

solvent evaporation) 832.16 Erfahrungen aus der Praxis und Fehlersuche 852.17 Anwendungsbeispiele 912.18 Fazit und Ausblick 98

3 Optimierungsstrategien in der RP-HPLC 1013.1 Einführung 1013.1.1 Geschwindigkeit der Analyse 1013.1.2 Verbesserung der Auflösung, besonders bei komplexen Proben 1023.1.3 Senkung von Nachweis- und Bestimmungsgrenzen 1023.1.4 Senkung der Kosten einer Methode 1033.2 Grundlagen 1043.2.1 Auflösung der Peaks im Chromatogramm 1043.2.2 Grundlagen der kinetischen Optimierung 1093.2.3 Der Einfluss der Säulendimensionen 1133.3 Methodik der Optimierung 1163.3.1 Die Optimierung der Selektivität 1163.3.1.1 Die praktische Methodenoptimierung und die Rolle der

Selektivität 1173.3.1.2 Wie steuern wir die Selektivität in der HPLC? 1183.3.2 Die Rolle der Temperatur in der HPLC 126

VI Inhaltsverzeichnis

3.3.2.1 Retention und Selektivitätskontrolle per Temperatur – Möglichkeitenund Grenzen 126

3.3.2.2 Methodenbeschleunigung durch Temperaturerhöhung 1303.3.3 Zusammenhänge zwischen Eluentenzusammensetzung und

Temperatur bei der Optimierung der HPLC 1383.3.4 Methodenbeschleunigung durch Verbesserung der Trennleistung

stationärer Phasen 1433.3.4.1 Die systematische Geschwindigkeitsoptimierung über Teilchendurch-

messer und Säulenlänge 1433.3.4.2 Der Reiz von Monolithen und Solid-Core-Materialien 1523.3.5 Optimierung der Auflösung über den Teilchendurchmesser und/oder

die Säulenlänge 1553.3.6 Hochauflösende HPLC in einer oder mehreren Dimensionen 1583.3.7 Optimierung von Nachweis- und Bestimmungsgrenzen 1663.3.7.1 Massendetektionslimit 1673.3.7.2 Konzentrationsdetektionslimit 1683.3.8 Optimierung in der Praxis 1703.3.8.1 Prinzipielle Vorgehensweise 1703.3.9 Formeln und Regeln im Überblick 1713.4 Ausblick 1793.4 Danksagung 181

4 Der Gradient in der RP-Chromatographie 1834.1 Aspekte der Gradientenoptimierung 1834.1.1 Einführung 1834.1.2 Besonderheiten des Gradienten 1834.1.3 Einige chromatographische Größen und Formeln 1854.1.3.1 Bemerkungen zu Gl. 4.2, 4.3 und 4.4 oder isokratische vs. Gradienten-

trennungen 1874.1.4 Nachweisgrenze, Peakkapazität, Auflösung – Möglichkeiten der

Optimierung 1894.1.4.1 Nachweisgrenze 1894.1.4.2 Peakkapazität und Auflösung 1904.1.5 Gradienten-„Mythen“ 1954.1.6 Beispiele zur Optimierung von Gradientenläufen: ausreichende

Auflösung in einer adäquaten Zeit 1964.1.7 Gradienten-Aphorismen 2124.2 Vorhersage von Gradienten 2144.2.1 Lineares Modell – Vorhersage aus 2 Chromatogrammen 2144.2.1.1 Was sagt der Retentionsfaktor k aus? 2144.2.1.2 Was bedeuten die beiden Retentionsfaktoren kg und ke? 2194.2.1.3 Wie sieht das Integrations- und Steuersystem den Gradienten? 2214.2.1.4 Wie sieht die HPLC-Säule den Gradienten? 2214.2.1.5 Wie sehen die Analysesubstanzen den Gradienten? 2224.2.1.6 Interpretation des ln(k)- zu % B-Diagramms 222

Inhaltsverzeichnis VII

4.2.1.7 Die apparative Gradientenverzögerung (Dwell Time) 2264.2.1.8 Verlängerung des Gradienten nach unten bei gleicher Steigung 2284.2.2 Kurvilineares Modell – mehr als zwei Eingabechromatogramme 2304.2.2.1 Die ln(k)-Geraden sind oft gar nicht gerade 2304.2.2.2 Die ln(k)- zu % B-Anpassung nach Neue 2324.2.2.3 Vorhersage mit Excel 2344.2.2.4 Die Wechselwirkung ist temperaturabhängig 2374.2.2.5 Optimierungsparameter 2374.2.2.6 Kommerzielle Optimierungsprogramme 2394.2.2.7 Wie genau muss die Vorhersage von kg und ke sein? 2414.2.3 Wie gehe ich systematisch vor? 2424.2.4 Abkürzungsverzeichnis 243

5 Vergleich und Auswahl von modernen HPLC-Säulen 2455.1 Trägermaterialien 2455.1.1 Warum Kieselgel? 2465.2 Stationäre Phasen für die HPLC – die geschichtliche Entwicklung 2475.3 pH-Stabilität und Restriktionen beim Einsatz von Kieselgel 2505.4 Die Kerneigenschaften von Umkehrphasen 2525.4.1 Die Hydrophobie der Umkehrphasen 2525.4.2 Die hydrophobe Selektivität 2525.4.3 Die silanophile Aktivität 2535.4.4 Die molekulare Formerkennung (shape selectivity) 2535.4.5 Die polare Selektivität 2545.4.6 Der Metallgehalt 2545.5 Charakterisierung und Klassifizierung von Umkehrphasen 2555.5.1 Über die Aussagekraft von Retentions- und Selektivitätsfaktoren bei

Säulentests 2565.5.1.1 Vorbemerkung 2565.5.1.2 Kriterien zum Vergleich von Säulen 2595.5.2 Säulenvergleich, Vergleichskriterium: Ähnlichkeit von

Selektivitäten 2625.5.3 Zwei einfache Tests zur Charakterisierung von RP-Phasen 2655.6 Vorgehensweise bei der Methodenentwicklung in der Praxis 2665.6.1 Das Zusammenspiel zwischen mobiler und stationärer Phase 2675.6.2 Welche Trennsäulen sollten verwendet werden und wie setze ich

diese ein? 2685.6.3 Was tun, wenn die Analyten sehr polar sind und auf den genannten

Säulen keine Retention aufweisen? 2715.6.3.1 AQ-Säulen, polare RP-Säulen und Ionenpaarchromatographie 2715.6.3.2 Mixed Mode Säulen 2735.6.3.3 Ionenausschlusssäulen/Ligandenaustauschchromatographie 2745.6.3.4 HILIC (hydrophilic interaction liquid chromatography) 2745.6.3.5 Poröser Kohlenstoff 276

VIII Inhaltsverzeichnis

5.7 Säulenscreening 2765.8 Säulendatenbanken 281

6 Trenntechniken in der Biochromatographie 2856.1 Einleitung 2856.2 Übersicht stationäre Phasen 2886.2.1 Basismaterialien 2886.2.2 Charakterisierung von stationären Phasen 2886.2.2.1 Partikelform 2886.2.2.2 Partikelgröße 2906.2.2.3 Porengröße und Oberfläche 2916.2.2.4 Beladungsdichte 2936.2.2.5 Reinheit 2946.2.2.6 Funktionelle Gruppe 2956.3 Reversed Phase-Chromatographie von Peptiden und Proteinen 2956.3.1 Retentionsverhalten von Peptiden und Proteinen 2956.3.2 Gradientendesign 2956.3.3 Organische Modifier 2976.3.4 Ionenpaarreagenz 2986.3.5 Einfluss des pH-Wertes 2996.3.6 Porengröße 3006.3.7 Belegung 3006.4 IEX-Chromatographie von Peptiden und Proteinen 3006.4.1 Parameter der IEC 3016.5 Size-Exclusion-Chromatographie von Peptiden und Proteinen 3046.5.1 Parameter der SEC 3056.6 Weitere Chromatographiearten – Kurzbeschreibungen 3076.6.1 Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC) 3076.6.2 Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) 3086.6.3 Affinity Chromatography (AC) 3086.7 Zusammenfassung und Ausblick 309

7 Vergleich moderner Chromatographie-Datensysteme 3117.1 Einleitung 3117.2 Die Vorläufer der CDS 3117.3 Das CDS heute 3127.3.1 Datenbank- oder filebasierendes System 3127.3.1.1 Vor- und Nachteile filebasierender CDS 3127.3.1.2 Vor- und Nachteile datenbankbasierender CDS 3137.3.2 Das CDS im Netzwerk 3147.3.3 Gerätesteuerung 3157.3.4 Dokumentation und Compliance 3167.3.5 Aktuelle Systeme im Überblick 3177.4 Tabellarischer Vergleich von Empower und Chromeleon sowie

OpenLAB CDS 319

Inhaltsverzeichnis IX

7.5 Das CDS von morgen 3197.5.1 MS-Integration 3197.5.2 Große Installationen 3197.5.3 Einfache und intuitive Bedienung 3227.5.4 Spezielle Erweiterungen 3237.5.4.1 Integrationsunterstützung 3237.5.4.2 Säulenverwaltung 3247.5.4.3 Geräteauslastung 3247.5.4.4 Anbindung von Waagen 3247.5.5 Offene Schnittstellen 3257.5.6 Geräteintegration 3267.6 Das CDS in 20 Jahren 327

8 Möglichkeiten der Integration heute 3298.1 Peaküberlagerung – Auswirkung auf das Chromatogramm 3298.2 Abtrennmethoden für überlagerte Peaks 3308.2.1 Lotmethode 3318.2.2 Tangentiale und Valley-to-valley Abtrennmethode 3328.2.3 Gauß- und exponentielle Abtrennmethode 3328.3 Anwendung der Abtrennmethoden 3338.4 Chromatogrammsimulation 3338.5 Dekonvolution 3348.6 Evaluierung von Abtrennmethoden 3378.7 Praktische Anwendung der Dekonvolution 339

9 HPLC im reglementierten Bereich 3459.1 Intelligente Dokumentation 3459.1.1 Einführung 3459.1.2 Ziele der Dokumentation 3479.1.2.1 Dokumentation aus Sicht der Organisation 3489.1.2.2 Dokumentation aus Sicht der Prozesse 3499.1.2.3 Dokumentation aus Sicht der Kommunikation 3529.1.2.4 Dokumentation aus Sicht der Information 3549.1.2.5 Dokumentation aus Sicht der Wissensspeicherung 3619.1.2.6 Behördliche Vorgaben für die Dokumentation im Labor 3619.1.3 Das Lebenszyklusmodell für regulierte Dokumente in der Praxis 3639.1.4 Umgang mit Hybridsystemen aus Papier und elektronischen

Aufzeichnungen 3659.1.4.1 Vor- und Nachteile von Papier vs. elektronischen Dokumenten 3659.1.4.2 Umsetzungsstrategie 3679.1.5 Ausblick 3689.2 Tipps für eine gelungene FDA-Inspektion 3699.2.1 Einführung 3699.2.2 Vorbereitung mit dem Inspektionsmodell 371

X Inhaltsverzeichnis

9.2.2.1 Materialien, Reagenzien, Referenzstandards 3719.2.2.2 Räumlichkeiten und Ausrüstung 3729.2.2.3 Laborkontrollen 3749.2.2.4 Personal 3769.2.2.5 Qualitätsmanagement 3779.2.2.6 Dokumente und Aufzeichnungen 3789.2.3 Typischer Ablauf einer FDA-Inspektion 3799.2.4 Während der Inspektion 3829.2.4.1 Verhalten in Inspektionen 3839.2.4.2 Ablauf des Laborrundgangs (lab walk through) 3859.2.4.3 Die Inspektion im Audit-Raum 3859.2.4.4 Umgang mit offensichtlich schwerwiegenden Beobachtungen 3869.2.4.5 Die Dokumentation von Beobachtungen auf dem

Formblatt FDA 483 3879.2.5 Nachbereitung der Inspektion 388

10 Eff iziente Informationsbeschaffung im Zeitalter von Web 2.0 am Beispielder HPLC 391

10.1 Suchmaschinen: Möglichkeiten und Grenzen 39110.2 Spezielle Suchdienste 39310.3 Suche nach Fachinformationen 39410.3.1 Stoffdaten 39410.3.2 Applikationen/Methoden 39510.3.2.1 Behörden und Institutionen 39510.3.2.2 Hersteller von Analysengeräten und Zubehör 39510.3.2.3 Zeitschriften und Portale 39710.3.3 Troubleshooting 39710.3.4 Hintergrundinfos und Theorie 39910.3.5 Produktinformationen 40010.3.6 Literatur 40110.3.6.1 Fachzeitschriften 40110.3.6.2 Fachbücher 40410.3.6.3 Master-/Diplom- und Doktorarbeiten 40510.3.6.4 Konferenzberichte 40510.4 Welche Mehrwerte bieten Firmenseiten? 40510.5 Kostenpflichtige Inhalte 40610.6 Apps für Tablets und Mobiltelefone 40710.7 Einsatzmöglichkeiten sozialer Netzwerke 40810.8 Prognose: Wie werden sich soziale Netzwerke entwickeln? 40910.9 Wie kann man sich über aktuelle Neuigkeiten auf dem

Laufenden halten? 409

Inhaltsverzeichnis XI

11 Trends in der Detektionstechnik 41111.1 Einführung und Funktionsprinzip von Aerosoldetektoren 41111.2 Gemeinsame Charakteristika, Vor- und Nachteile der einzelnen

Detektoren 412

Stichwortverzeichnis 415

XII Inhaltsverzeichnis

Vorwort

Der HPLC-Anwender findet heute erfreulicherweise viele gute Lehrbücher zurHPLC-Methodik. Auch anwendungsbezogene Literatur z. B. zur Pharma-Analytik,zu Techniken wie der UHPLC oder der Gradientelution werden offeriert.Im vorliegenden Buch spannen wir einen Bogen über verschiedene Themen der

modernen HPLC: Wir möchten aktuelle Entwicklungen aufzeigen und gehenferner auf Techniken ein, welche unlängst den Weg in das HPLC-Labor gefundenhaben oder denen dies alsbald bevorsteht.Parallel dazu bieten wir Wissen in komprimierter Form an. In 11 Kapiteln wenden

sich Fachleute an den erfahrenen Anwender und den praxisorientierten Laborleiter,die auf der Suche nach fundiertem (Hintergrund-)Wissen und neuen Erkenntnissensind. Unser Ziel ist es, zum einen den Leser auf – ihm unbekannte – Fehlerhinzuweisen und zum anderen ihm aktuelle Infos und Tipps anzubieten, die indieser verdichteten Form nur unter erheblichem Aufwand zu erhalten sind. Ichhoffe, dass die Themenwahl die Zustimmung der Leserschaft findet.Mein herzlicher Dank gilt den Kollegen, die ihre Erfahrung und ihr Wissen zur

Verfügung gestellt haben. WILEY-VCH und speziell Frank Weinreich danke ichfür die besonders gute Zusammenarbeit.

Saarbrücken, November 2013 Stavros Kromidas

XIII

Zum Aufbau des Buches

Das Buch enthält folgende Kapitel:Kapitel 1 (LC/MS-Kopplung) ist der wichtigsten Kopplungstechnik der modernen

HPLC gewidmet. Oliver Schmitz gibt im ersten Teil einen Überblick über denStand der Technik in der LC/MS-Kopplung und stellt die unterschiedlichen Modigegenüber. Im zweiten Teil zeigt Markus Martin Fallstricke der LC/MS-Kopplungauf und gibt konkrete Hinweise, wie die LC/MS-Kopplung im Alltag erfolgreicheingesetzt werden kann. LC/MS-Kopplung wird oft mit Life Science und Umwelt-analytik in Verbindung gebracht. Alban Muller und Andreas Hofmann zeigen hierals etwas ungewohnte Anwendung ein praktisches Beispiel aus der Ionenchroma-tographie.Bei komplexen Proben und „schwierigen“ Matrices stößt die Kopplung Chroma-

tographie-Spektroskopie häufig an ihre Grenze, die Kopplung zweier Trenntech-niken könnte eine Alternative sein. Marco Nestola und Erik Becker berichten inKapitel 2 aus der praktischen Sicht eines Auftragsinstituts über die HPLC-GC-Kopplung in der Praxis sowie über Theorie, Applikationsbeispiele und Ausblick.In Kapitel 3 gehen Frank Steiner, Stefan Lamotte und Stavros Kromidas ausführ-

lich auf Optimierungsstrategien in der RP-HPLC ein und diskutieren anhand vonausgesuchten Beispielen, welche Parameter jeweils Erfolg versprechend erschei-nen.Kapitel 4 beschäftigt sich mit der Gradientelution; Stavros Kromidas, Frank

Steiner und Stefan Lamotte besprechen im Teil 1 in verdichteter Form Aspekteder Gradientenoptimierung und bieten einfache „To-do“-Regeln an. Im Teil 2 zeigtHans-Joachim Kuss, dass mit EXCEL Vorhersagen von Gradienten sehr treffsichersein können und das oft benutzte lineare Modell eine vereinfachte Näherungdarstellt.Im Kapitel 5 geht es um Vergleich und Auswahl von modernen HPLC-Säulen;

Stefan Lamotte, Stavros Kromidas und Frank Steiner geben einen Überblick überdie unterschiedlichen Säulen und machen – auf verschiedene Fragestellungenbezogene – Vorschläge für pragmatische Säulentests und Säulenportfolios.In Kapitel 6 stellt Jürgen Maier-Rosenkranz Trenntechniken in der Biochromato-

graphie vor, geht auf deren Spezifika im Vergleich zu der RP-HPLC ein undbespricht Vor- und Nachteile der einzelnen Modi.

XV

Auswerteprogramme haben unterschiedliche Stärken, Umfänge und Möglich-keiten. Arno Simon zeigt in Kapitel 7, Vergleich moderner Chromatographie-Datensysteme, als neutraler Insider Vor- und Nachteile der bekanntesten Software-programme auf.Bei der Integration von nicht basisliniengetrennten Peaks kann es zu enormen,

oft nicht erkannten Fehlern kommen. In Kapitel 8, Möglichkeiten der „richtigen“Integration heute, stellt Mike Hillebrand u. a. zwei Softwaretools vor, mit derenHilfe sowohl die Abweichung vom Sollwert objektiv festgestellt als auch die„richtige“ Peakfläche ermittelt werden kann.Kapitel 9 handelt von der HPLC im reglementierten Bereich. Im ersten Teil

beschreibt Stefan Schmitz verschiedene Möglichkeiten und gibt Praxistipps füreine intelligente Dokumentation. Iris Retzko und Stefan Schmitz zeigen imzweiten Teil in ihren Tipps für eine gelungene FDA-Inspektion, welche entschei-dende Rolle Psychologie und einfache Tricks dabei spielen.Da intelligentes Beschaffen von Informationen nicht nur bei Geheimdienstlern

von enormer Bedeutung ist, lautet das Thema von Torsten Beyer: EffizienteInformationsbeschaffung im Zeitalter von Web 2.0 am Beispiel der HPLC. ImKapitel 10 führt er spezielle Suchdienste für Fachinformationen auf und kom-mentiert zusätzlich die Qualität der Quellen.Bei isobaren Verbindungen tut sich die MS-Kopplung schwer; manches interes-

sante Molekül ist zudem nicht UV-aktiv und der Brechungsindexdetektor kommtschließlich ob der Notwendigkeit einer Gradientelution als Detektor ebenfalls nichtinfrage. Im Kapitel 11, Trends in der Detektionstechnik, gibt Stefan Lamotte einenkompakten Überblick über Aerosoldetektoren und stellt ihre Vor- und Nachteilevor.Das Buch muss nicht linear gelesen werden. Die einzelnen Kapitel wurden so

verfasst, dass sie abgeschlossene Module darstellen – ein „Springen“ ist jederzeitmöglich. Damit haben wir versucht, dem Charakter des Buches als Nachschlage-werk gerecht zu werden. Der Leser möge davon profitieren. Zum Schluss nochFolgendes: Mancher Leser möchte vielleicht das EXCEL-Makro von Hans-JoachimKuss für die Vorhersage von Gradienten nutzen. Auch die Softwaretools von MikeHillebrand zum Abschätzen der Fehler bei der Integration könnten das Interesseder Leser geweckt haben. Schließlich kann die Linksammlung von Torsten Beyer„Gold“ wert sein und unnötiges Suchen ersparen. Wir möchten Ihnen die Mög-lichkeit geben, diese Tools online zu nutzen. WILEY-VCH stellt folgenden Linkzur Verfügung: www.wiley-vch.de/textbooks. Dort finden Sie das Original-Makrovon Hans-Joachim Kuss zur Vorhersage von Gradienten, je eine Demo-Version derzwei Integrationstools von Mike Hillebrand sowie die Linkliste von Thorsten Beyer,die stets aktualisiert wird.

XVI Zum Aufbau des Buches

Autorenverzeichnis

Erik BeckerInstitut Kirchhoff GmbHAlbestr. 3–412159 BerlinDeutschland

Torsten BeyerDr. Beyer Internet-BeratungWeimarer Straße 3064372 Ober-RamstadtDeutschland

Mike HillebrandSanofi-Aventis Dtl. GmbHIndustriepark Höchst65926 FrankfurtDeutschland

Andreas HofmannNovartis Institutes forBioMedical ResearchNovartis Campus4056 BaselSchweiz

Stavros KromidasRosenstr. 1666125 SaarbrückenDeutschland

Hans-Joachim KussNeubiberger Str. 5485640 PutzbrunnDeutschland

Stefan LamotteBASF SECompetence Center Analytics,GMC/C-E21067056 LudwigshafenDeutschland

Jürgen Maier-RosenkranzAlltech Grom GmbHGrace Materials TechnologiesIn der Hollerhecke 167547 WormsDeutschland

Markus M. MartinThermo Fisher ScientificDornierstr. 482110 GermeringDeutschland

Alban MullerNovartis Institutes forBioMedical ResearchNovartis Campus4056 BaselSchweiz

XVII

Marco NestolaInstitut Kirchhoff GmbHAlbestr. 3–412159 BerlinDeutschland

Iris RetzkoCMC Pharma GmbHM5, 8–968161 MannheimDeutschland

Oliver SchmitzUniversity of Duisburg-EssenFacult. of Chem. S05 T01 B35Universitätsstr. 545141 EssenDeutschland

Stefan SchmitzCMC Pharma GmbHM5, 8–968161 MannheimDeutschland

Arno Simonbeyontics GmbHAltonaer Straße 79–8113581 BerlinDeutschland

Frank SteinerThermo Fisher ScientificDornierstr. 482110 GermeringDeutschland

XVIII Autorenverzeichnis

1LC/MS-KopplungOliver Schmitz, Markus M. Martin, Alban Muller, Andreas Hofmann

1.1Stand der Technik in der LC/MS-KopplungOliver Schmitz

1.1.1Einleitung

Die drastisch gestiegenen Anforderungen an qualitative und quantitative Analysenvon immer komplexeren Proben stellen eine immense Herausforderung für diemoderne instrumentelle Analytik dar. Für komplexe organische Proben (z. B.Körperflüssigkeiten, Naturprodukte oder Umweltproben) erfüllen nur chromato-graphische oder elektrophoretische Trennungen mit anschließender massenspek-trometrischer Detektion diese Anforderungen. Aktuell ist jedoch ein Trend zubeobachten, bei dem eine komplexe Probenvorbereitung und Vortrennung durchhochauflösende Massenspektrometer mit Atmosphärendruck-Ionenquellen ersetztwerden.Dabei sind jedoch zahlreiche Ionen-Molekül-Reaktionen in der Ionenquelle – vor

allem bei komplexen Proben, aufgrund einer unvollständigen Trennung – mög-lich, weil die Ionisation in typischen Atmosphärendruck-Ionisationquellen unspe-zifisch ist [1]. Somit führt diese Vorgehensweise oft zu einer Ionensuppressionund Artefaktbildung in der Ionenquelle, vor allem bei der Elektrospray-Ionisation(ESI) [2], siehe dazu auch Abschnitt 1.1.2.Trotzdem können Quellen wie die ASAP (atmospheric-pressure solids-analysis

probe), DART (direct analysis in real time) und DESI (desorption electrosprayionization) oft sinnvoll eingesetzt werden. In ASAP wird ein heißer Stickstoffflussaus einer ESI- oder „atmospheric pressure chemical ionization”(APCI)-Quelle alsEnergiequelle für die Verdampfung eingesetzt und die einzige Änderung gegen-über einer APCI-Quelle ist die Installation einer Einschubmöglichkeit, um dieProbe in den heißen Gasstrom innerhalb der Ionenquelle zu platzieren [3]. DieseIonenquelle ermöglicht eine schnelle Analyse von flüchtigen und schwerflüchti-gen Verbindungen und wurde beispielsweise eingesetzt, um biologische Gewebe[3], Polymeradditive [3], Pilze und Zellen [4] und Steroide [3, 5] zu analysieren.

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Der HPLC-Experte: Möglichkeiten und Grenzen der modernen HPLC, 1. Auflage.Herausgegeben von Stavros KromidasCopyright © 2014 by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Published 2014 by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.

ASAP hat viele Gemeinsamkeiten mit DART [6] und DESI [7]. Die DART-Ionen-quelle erzeugt einen Gasstrom, der langlebige elektronisch angeregte Atomenenthält, die mit der Probe interagieren können und so eine Desorption mitanschließender Ionisation der Probe mittels Penning-Ionisation [8] oder Protonen-transfer von protonierten Wasserclustern [6] induzieren. Die DART-Quelle wirdfür die direkte Analyse von festen und flüssigen Proben eingesetzt. Ein großerVorteil dieser Quelle ist die Möglichkeit der Analyse von Verbindungen aufOberflächen, wie z. B. illegale Substanzen auf Dollarnoten oder Fungizide aufWeizen [9]. Im Gegensatz zu ASAP und DART ist der große Vorteil von DESI, dass– wie bei der klassischen ESI – die Flüchtigkeit der Analyten keine Voraussetzungfür eine erfolgreiche Analyse ist. DESI ist am empfindlichsten für polare undbasische Verbindungen und weniger empfindlich für Analyten mit einer geringenPolarität [10]. Diese sehr nützlichen Ionenquellen haben einen gemeinsamenNachteil. Alle oder fast alle in der Probe befindlichen Substanzen sind in derGasphase und während der Ionisation zeitgleich in der Ionenquelle vorhanden.Die Analyse komplexer Proben kann daher zu einer Ionensuppression und Arte-faktbildung in der Atmosphärendruck-Ionenquelle aufgrund von Ionen-Molekül-Reaktionen auf dem Weg zum MS-Einlass führen. Aus diesem Grund werdeneinige ASAP-Anwendungen mit steigender Temperatur des Stickstoffgases in derLiteratur beschrieben [5, 11, 12]. Auch wurden DART-Analysen mit verschiedenenHeliumtemperaturen [13] oder mit einem Heliumtemperaturgradienten [14] be-schrieben, um eine teilweise Trennung von Analyten aufgrund der unterschiedli-chen Dampfdrücke der Analyten zu realisieren. Eine mit DART und ASAPverwandte und erst 2012 beschriebene Ionenquelle, die Direct-Inlet-Probe APCI(DIP-APCI) der Firma Scientific Instruments Manufacturer GmbH (SIM) nutzteine temperierbare Schubstange zum Direkteinlass von festen und flüssigenProben mit anschließender chemischer Ionisation bei Atmosphärendruck [15].Abbildung 1.1 zeigt eine DIP-APCI-Analyse einer Safranprobe (Feststoff, Gewürz)ohne Probenvorbereitung mit den safranspezifischen Biomarkern Isophoron undSafranal. Als Detektor wurde ein Agilent Technologies 6538 UHD Accurate-MassQ-TOF eingesetzt. Im oberen Teil der Abbildung ist der TIC der gesamten Analyseund im unteren Teil exemplarisch das Massenspektrum zum Zeitpunkt 2,7 mindargestellt. Die Analyse wurde bei 40 °C gestartet und die Probe mit 1 °/s auf einefinale Temperatur von 400 °C aufgeheizt.So nützlich und zeitersparend diese Ionenquellen auch sein mögen, um komplexe

Proben quantitativ und quantitativ analysieren zu können, ist eine chromatographi-sche oder elektrophoretische Vortrennung sinnvoll. Neben der Reduzierung vonMatrixeffekten ermöglicht der Vergleich der Retentionszeiten zudem noch eineAnalyse von Isomeren (eine entsprechend leistungsstarke Trennung vorausgesetzt).

1.1.2Ionisationsmethoden bei Atmosphärendruck-Massenspektrometern

In den letzten 10 Jahren wurden einige neue Ionisationsmethoden für Atmosphä-rendruck (AP)-Massenspektrometer entwickelt. Davon stehen manche nur in

2 1 LC/MS-Kopplung

Abb. 1.1 Analyse von Safran mittels DIP-APCI und einem hochauflösenden qTOF-MS

1.1 Stand der Technik in der LC/MS-Kopplung 3

einigen Arbeitskreisen zur Verfügung, weshalb hier lediglich vier kommerziellerhältliche Ionenquellen näher vorgestellt werden sollen.Die am weitesten verbreitete Atmosphärendruck-Ionisierungstechnik (API) ist

ESI, gefolgt von APCI und Atmosphärendruck-Photoionisation (APPI). Eine deut-lich geringere Bedeutung hat die „atmospheric pressure laser ionization“ (APLI),die allerdings für aromatische Verbindungen hervorragend geeignet ist und z. B.für die PAK-Analytik den Gold-Standard darstellt. Dieses Ranking spiegelt mehroder weniger die chemischen Eigenschaften der Analyten, die mit API-MSbestimmt werden, wider:Die meisten Analyten aus dem pharmazeutischen und biowissenschaftlichen

Bereich sind eher polar, wenn nicht sogar ionisch, und werden somit effizient mitESI ionisiert (Abb. 1.2). Es besteht jedoch auch ein beträchtliches Interesse an API-Techniken zur effizienten Ionisierung von weniger oder nicht-polaren Verbindun-gen. Für die Ionisation solcher Substanzen ist ESI weniger geeignet.

1.1.2.1 Übersicht API-MethodenIonisationsmethoden, die bei Atmosphärendruck arbeiten, wie z. B. die „atmo-spheric pressure chemical ionization” (APCI) und die „electrospray ionization”(ESI), haben den Anwendungsbereich der Massenspektrometrie sehr stark erwei-tert [16–19]. Durch diese API-Techniken können chromatographische Trennver-fahren, wie beispielsweise die Flüssigchromatographie (LC), leicht an Massenspek-trometer gekoppelt werden.Ein fundamentaler Unterschied zwischen APCI und ESI besteht im Ionisations-

mechanismus. Bei der APCI erfolgt die Ionisierung des Analyten in der Gasphasenach der Verdampfung des Lösungsmittels. Bei ESI findet die Ionisierung bereitsin der flüssigen Phase statt. Beim ESI-Prozess werden in der Regel protoniertebzw. deprotonierte Molekülionen aus stark polaren Analyten gebildet. Eine Frag-mentierung wird selten beobachtet. Dagegen erfolgt die Ionisierung von wenigerpolaren Substanzen bevorzugt mittels APCI durch Reaktion von Analyten mitPrimärionen, die mithilfe einer Coronaentladung erzeugt werden. Die Ionisie-rungseffizienz von unpolaren Analyten ist mit beiden Techniken sehr gering.Für diese Substanzklassen wurden andere Methoden entwickelt, wie beispiels-

weise die Kopplung der ESI mit einer elektrochemischen Vorstufe [20–31], das„coordination ion-spray“ [31–46] oder die „dissociative electron-capture ionization“

Abb. 1.2 Geeigneter Polaritätsbereich von Ana-lyten für die Ionisation mit verschiedenen API-Techniken. Hinweis: Der erweiterte Massenbereichder APLI gegenüber APPI und APCI ergibt sich ausder Ionisation von unpolaren aromatischen Ana-lyten in einem Elektrospray.

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[37–41]. Die von Syage et al. [42, 43] vorgestellte Atmosphärendruck-Photoionisa-tion (APPI) bzw. die von Robb et al. [44, 45] als dopant-assisted (DA) APPIweiterentwickelte Methode, stellen ein relativ neues Verfahren zur Photoionisation(PI) von unpolaren Substanzen mittels Vakuum-UV (VUV)-Strahlung dar. BeideTechniken basieren auf der Einphotonenionisation, die schon seit Längerem in derIonenmobilitäts-Massenspektrometrie [46–49] und im Photoionisationsdetektor(PID) [50–52] eingesetzt wird.

1.1.2.2 ESIIn der Vergangenheit war eines der Hauptprobleme massenspektrometrischerAnalysen von Proteinen oder anderen Makromolekülen, dass deren Massen außer-halb des Massenbereiches der meisten Massenspektrometer lag. Um größereMoleküle, wie beispielsweise Proteine analysieren zu können, musste eine Hydro-lyse von Proteinen und dann die Analyse dieser Peptidmischungen durchgeführtwerden. Durch ESI ist es nun möglich auch große Biomoleküle ohne vorherigeHydrolyse ionisieren und mittels MS analysieren zu können.Basierend auf Vorarbeiten von Zeleny [53], Wilson und Taylor [54, 55] im 20.

Jahrhundert erzeugten Dole und Mitarbeiter hochmolekulare Polystyrolionen inder Gasphase aus einer Benzol/Aceton-Mischung des Polymers mittels Elektro-spray [56]. Diese Ionisationsmethode wurde schließlich durch die Arbeiten vonFenn 1984 [57] etabliert und 2002 mit dem Nobelpreis für Chemie belohnt.Um den gesamten Vorgang der Ionenbildung bei ESI zu beschreiben, ist eine

Unterteilung der Abläufe in drei Abschnitte sinnvoll:

• Bildung ladungstragender Tropfen• Verkleinerung der Tropfen• Bildung gasförmiger Ionen

Um positive Ionen zu erzeugen, wird an die enge Kapillarspitze (10−4 m Außen-durchmesser) eine Spannung von 2–3 kV zwischen Kapillare und dem MS-Eingang(Gegenelektrode) angelegt. In der aus der Kapillare austretenden Elektrolytlösungerfolgt eine Ladungstrennung, bei der Kationen an der Flüssigkeitsoberflächeangereichert und zur Gegenelektrode gezogen werden. Anionen wandern dagegenzum positiv geladenen Kapillarende und werden dort entladen bzw. oxidiert. DieAnreicherung von positiver Ladung an der Flüssigkeitsoberfläche ist Ursache derBildung eines Flüssigkeitskonus, da die Kationen zum negativen Pol, der Kathode,gezogen werden. Dieser sog. Taylor Konus (Taylor cone) resultiert einerseits ausdem elektrischen Feld und andererseits aus der Oberflächenspannung der Lösung.Ab einer bestimmten Distanz zum Kapillarende erfolgt eine zunehmende Destabi-lisierung und es werden Tropfen mit positiver Überschussladung in einem stabilenSpray emittiert. Die Größe der gebildeten Tropfen hängt ab von:

• der Flussrate der mobilen Phase und der Hilfsgase,• der Oberflächenspannung,• der Viskosität,

1.1 Stand der Technik in der LC/MS-Kopplung 5

• der angelegten Spannung und• der Konzentration des Elektrolyten.

Diese Tropfen verlieren durch Verdampfen Lösungsmittelmoleküle und bei Errei-chen des Raleigh-Limits (elektrostatische Abstoßung der Oberflächenladungen >Oberflächenspannung) werden viel kleinere Tropfen (sog. Mikrotropfen) emittiert(Abb. 1.3). Dies geschieht aufgrund elastischer Oberflächenvibrationen der Trop-fen, die zur Bildung Taylor cone ähnlicher Strukturen führen.Am Ende solcher Ausstülpungen werden kleinere Tropfen mit einem erheblich

reduzierten Masse/Ladungs-Verhältnis gebildet. Durch Wiederholung dieses Pro-zesses erhöht sich das Verhältnis von Oberflächenladung zur Zahl der gepaartenIonen im Tropfen dramatisch. Somit sind nur die hochgeladenen Mikrotropfen fürdie letztlich erfolgende Ionenbildung verantwortlich.Charakteristisch für den ESI-Prozess ist die Bildung von mehrfach geladenen

Ionen bei großen Analytmolekülen. Daher findet man beispielsweise für Peptideund Proteine entsprechend ihrer Masse eine Serie von Ionensignalen, die sichjeweils um eine Ladung (normalerweise eine Addition eines Protons im + Modeoder Substraktion eines Protons im – Mode) unterscheiden.Für die eigentliche Bildung der gasförmigen Analytionen werden zurzeit zwei

Mechanismen diskutiert. Zum einen der von Cole [58] und Kebarle und Peschke [59]vorgeschlagene „charged residue mechanism“ (CRM) und der von Thomason undIribarne [60] postulierte „ion evaporation mechanism“ (IEM). Beim CRM werden dieTropfen so lange reduziert, bis nur noch ein Analytmolekül im Mikrotropfenvorhanden ist, an das dann ein oder mehrere Ladungsträger addiert werden. BeimIEM werden die Tropfen bis zu einem sog. kritischen Radius (r < 10 nm) reduziertund dann geladene Analytionen aus diesen Tropfen emittiert [61].Essenziell für den Anwender ist, dass genügend Ladungsträger im Eluat vor-

handen ist. Dies kann durch Zugabe von z. B. Ammioniumformiat zum Eluentenoder Eluat realisiert werden. Ohne diese Zugabe ist ESI zwar in Acetonitril/Wasser-Mischungen prinzipiell möglich (in MeOH/Wasser jedoch nicht), ein

Abb. 1.3 Reduzierung der Tröpfchengröße

6 1 LC/MS-Kopplung

stabileres und reproduzierbareres Elektrospray mit einer höheren Ionenausbeutegelingt aber nur durch Zugabe von Ladungsträgern vor oder nach der HPLC-Trennung.

1.1.2.3 APCIBei dieser von Horning 1974 [62] eingeführten Ionisationsmethode wird das Eluatdurch einen Verdampfer (400–600 °C) in die Ionenquelle eingebracht. Trotz derhohen Temperatur des Verdampfers wird nur selten eine Zersetzung der Probebeobachtet, da die Energie für die Verdampfung des Lösungsmittels verbrauchtwird und die Probe sich normalerweise nicht über 80–100 °C erwärmt [63]. ImAustrittsbereich des Gasstroms (Eluat und Analyt) ist eine Metallnadel (Corona)angebracht, an der eine Hochspannung angelegt ist. Gelangen die Lösungsmittel-moleküle in den Bereich der Hochspannung, bildet sich ein Reaktionsplasma nachdem Prinzip der Chemischen Ionisation. Ist der Energieunterschied zwischenAnalyten und Reaktantionen groß genug, werden die Analyten z. B. durch Pro-tonentransfer oder Adduktbildung in der Gasphase ionisiert.In der APCI wird anstelle des Filaments (CI) bei der GC-MS eine Coronaent-

ladung zur Emission von Elektronen eingesetzt (der Atmosphärendruck würdezum schnellen Durchbrennen des Filamentes führen).Mit Stickstoff als Sheath- und Nebulizer-Gas und atmosphärischem Wasser-

dampf (ist auch im 5.0 Stickstoff in ausreichender Menge vorhanden) in derAPCI-Quelle werden durch Elektronenionisation primär N2

+- und N4+-Ionen ge-

bildet. Diese kollidieren mit den verdampften Lösungsmittelmolekülen und for-men sekundäre Reaktantgasionen, wie z. B. H3O

+ und (H2O)nH+ (Abb. 1.4).

Das häufigste Sekundär-Clusterion ist (H2O)2H+ zusammen mit signifikanten

Mengen an (H2O)3H+ und H3O

+. Diese geladenen Wassercluster kollidieren mitden Analytmolekülen, wodurch es zur Bildung von Analytionen kommt:

H3O+ + M → [M + H]+ + H2O

Die hohe Kollisionsfrequenz resultiert in einer hohen Ionisationseffizienz derAnalyten und führt zu Adduktionen mit nur wenig Fragmentierung.Im Negativ-Mode bilden die Elektronen, die bei der Coronaentladung emittiert

werden, mit Wassermolekülen in Gegenwart großer Mengen von N2 OH−-Ionen.

Da die Gasphasenazidität von H2O sehr gering ist, bilden die OH−-Ionen in derGasphase durch Protonentransferreaktion mit den Analyten H2O und [M – H]−

(mit M = Analyt) [63].Problematisch bei der APCI ist die simultane Bildung von unterschiedlichen

Adduktionen. So können je nach Eluentzusammensetzung und Matrixkomponen-

Abb. 1.4 Reaktionsmechanismus bei der APCI

1.1 Stand der Technik in der LC/MS-Kopplung 7

ten beispielsweise Na+- und NH4+-Addukte neben protonierten Analytmolekülen

auftreten, wodurch die Auswertung erschwert wird.

1.1.2.4 APPIDie APPI ist für die Ionisation von unpolaren Analyten geeignet, wobei diePhotoionisation eines Moleküls M zur Bildung des Molekül-Radikalkations M∙+

führt. Wenn die Ionisierungspotenziale (IP) aller anderen Matrixbestandteilegrößer als die Photonenenergie sind, ist dieser Ionisationsprozess spezifisch fürden Analyten. In der APPI können allerdings sehr unterschiedliche Prozesse dieDetektion von M∙+ stark beeinflussen. Zum einen können in der Gegenwart vonLösungsmittelmolekülen und/oder anderen im großen Überschuss vorhandenenKomponenten Ionen-Molekül-Reaktionen ablaufen. Zum anderen werden VUV-Photonen effizient von der Gasphasenmatrix absorbiert. So wurde z. B. beobachtet,dass in der APPI in Gegenwart von Acetonitril (häufiger Eluent in der HPLC)hauptsächlich [M + H+] gebildet wird, obwohl das IP von CH3CN mehr als 2,2 eVüber der vorhandenen Photonenenergie liegt [64]. Generell wird in der APPI beipolaren, in CH3CN/H2O-Mischungen gelösten Verbindungen meistens die Bil-dung von [M + H+] beobachtet, während unpolare Verbindungen, wie beispiels-weise Naphthalin, normalerweise M∙+ bilden [65]. Ein detaillierter Mechanismuszur Bildung von [M + H]+ wurde von Syage vorgeschlagen [66]. Die Ionenausbeuteist bei der APPI aufgrund des limitierten VUV-Photonenflusses und den Wechsel-wirkungen mit Lösungsmittelmolekülen eingeschränkt. Daher wurde von Bruinsund Mitarbeitern die „dopant-assisted atmospheric-pressure photoionization” (DA-APPI) [65] als neue Ionisationsmethode eingeführt. Hier wird die Gesamtzahl anIonen, die durch die VUV-Strahlung gebildet wird, durch Zugabe einer direkt zuionisierenden Komponente (Dopant) deutlich erhöht. Wird der Dopant so aus-gewählt, dass die resultierenden Dopantphotoionen eine relativ hohe Rekombina-tionsenergie bzw. eine geringe Protonenaffinität haben, dann kann das Dopantiondurch Ladungsaustausch oder Protonentransfer die zu analysierenden Verbindun-gen ionisieren. Neben Aceton und Toluol erwies sich Anisol als sehr effektiverDopant bei der APPI [67]. Durch Zugabe eines Dopants kann zwar die Sensitivitäterhöht werden, aber die möglichen Adduktbildungen führen oftmals zu deutlichkomplizierteren APPI-Massenspektren [44, 65, 67]. Neuere Untersuchungen deu-ten darauf hin, dass der direkte Protonentransfer von primär gebildeten Dopantio-nen nur eine sehr untergeordnete Rolle spielt, vielmehr scheint eine sehr kom-plexe, thermodynamisch kontrollierte Clusterchemie zu dominieren.

1.1.2.5 APLIDie „atmospheric pressure laser ionization“ (APLI) wurde 2005 entwickelt [68].Dabei handelt es sich um eine weiche Ionisierungsmethode mit einfach zu inter-pretierenden Spektren für unpolare aromatische Substanzen, bei der Fragmentie-rungen der Analyten nur untergeordnet auftreten. APLI basiert auf der resonanz-verstärkten Mehrphotonenionisation (REMPI), allerdings bei Atmosphärendruck.Die REMPI-Methode erlaubt die empfindliche und selektive Ionisierung von

zahlreichen Verbindungen. Dabei wird z. B. folgender Ansatz genutzt:

8 1 LC/MS-Kopplung

M + m hn → M* (a)M* + n hn → M∙+ + e− (b)

Die Reaktionen (a) und (b) repräsentieren einen klassischen (m + n) resonanz-verstärkten Mehrphotonen-Ionisations (REMPI)-Prozess, der mit n = m = 1 häufigsehr vorteilhaft zur Ionisierung von polyaromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK)eingesetzt wird. Da die Absorptionsbanden von PAK bei Raumtemperatur relativbreit sind, können aufgrund der hohen molekularen Absorptionskoeffizienten imnahen UV und der relativ langen Lebensdauer der S1- und S2-Zustände häufigFestfrequenzlaser für die Anregung genutzt werden, beispielsweise die 248 nmLinie eines KrF-Excimerlasers. Unter diesen Bedingungen kann eine nahezuselektive Ionisation von aromatischen Kohlenwasserstoffen erreicht werden. Eingroßer Vorteil der APLI im Vergleich zur APPI ist, dass weder Stickstoff undSauerstoff noch die typischerweise in der HPLC eingesetzten Lösungsmittel (z. B.Wasser, Methanol, Acetonitril) im verwendeten Wellenlängenbereich merklicheAbsorptionsquerschnitte aufweisen. Eine Schwächung der Photonendichte inner-halb der Ionenquelle, d. h. eine merkliche Einkopplung von elektronischer Energiein die Matrix, wie in der APPI beobachtet, findet in der APLI nicht statt. Die APLIist sehr sensitiv bei der Bestimmung von PAKs und stellt daher eine wertvolleAlternative zur APCI und APPI dar. Die APLI ist aber nicht nur auf die Analyseeinfacher aromatischer Verbindungen beschränkt. Es können auch komplexereoligo- oder polymere Strukturen sowie metallorganische Verbindungen analysiertwerden [69]. Zudem besteht die Möglichkeit Analyten über ihre funktionelleGruppe mit sog. Ionisationsmarkern, in Analogie zu Fluoreszenzderivatisierung,zu modifizieren und dann über den aromatischen Ionisationsmarker auch nicht-aromatische Substanzen mittels APLI zu ionisieren [70]. Dabei profitiert man vonder Selektivität der Ionisierung (nur aromatische Systeme) und der herausragen-den Sensitivität der Methode. Auch wurde bereits die parallele Ionisation vonProbenbestandteilen mit ESI bzw. APCI und APLI realisiert [71, 72]. Dadurchkönnen sowohl polare (ESI) bzw. nicht-aromatische mittelpolare Analyten (APCI)gemeinsam mit Aromaten (APLI) einer massenspektrometrischen Detektion zu-gänglich gemacht werden.

1.1.2.6 Bestimmung der IonensuppressionBei vielen massenspektrometrischen Analysen von komplexen Proben erschwertdie Ionensuppression die Quantifizierung und erfordert oftmals eine aufwendigeProbenvorbereitung. Es sollte deshalb immer im Vorfeld untersucht werden, ob eszu einem signalreduzierenden Einfluss der Matrix kommt.Für diese Untersuchung wird hinter der Trennsäule über ein T-Stück eine

mittels HPLC-Pumpe geförderte Analytlösung mit dem durch die Trennsäuletransportierten Eluat/Matrix-Gemisch vermengt und die Massenspur des Analytendetektiert. Nach dem Passieren der Säule werden die getrennten Matrixbestand-teile im T-Stück mit der Analytlösung vermischt und gelangen dann gemeinsam indie Ionenquelle. Die Intensitätsänderung der Analyt-Massenspur vor und nach derInjektion der Matrix gibt Auskunft über eine evtl. stattfindende Ionensuppression.

1.1 Stand der Technik in der LC/MS-Kopplung 9

Abbildung 1.5 zeigt die Ionensuppressionsbestimmung einer PAK-Analyse in Urinmit APCI-qTOF. Im Analysenbereich von 80 und 400 s sinkt die Massenspurdeutlich ab und erreicht erst ab ca. 450 s wieder das normale Niveau. Somiteluieren zwischen 80 und 400 s störende, also Ionensuppression verursachende,Matrixbestandteile des Urins von der Trennsäule.

1.1.2.7 Beste Ionisationsmethode für die jeweilige FragestellungAnhand von Abb. 1.2 kann grob abgeschätzt werden, mit welcher Methode dieinteressierenden Analyten am effektivsten ionisiert werden können. Je nachPolarität werden die Analyten dabei sinnvollerweise mit ESI (polare), APCI (mittel-polare), APPI (unpolare) oder mit APLI (Aromaten) ionisiert. Allerdings spieltauch die Matrix bei dieser Entscheidung eine wichtige Rolle. Bei komplexenProben ist eine mögliche Ionensuppression bei der Elektrospray-Ionisation wahr-scheinlicher bzw. stärker ausgeprägt als bei den anderen hier besprochenenIonisationsmethoden. Auch spielt die Ionenstrahlführung im Einlassbereich desMassenspektrometers eine wichtige Rolle. So zeigen ESI-Ionenquellen mit einemZ-Spray-Einlass oftmals weniger Ionensuppression als normale ESI-Ionenquellen.Auch der Eluatfluss muss der jeweiligen Ionenquelle angepasst werden. Sokönnen bei APCI-Quellen oftmals etwas höhere Flüsse als bei ESI-Quellen einge-setzt werden. Auch wenn Gerätehersteller andere Flussraten versprechen, ist eshinsichtlich Spraystabilität, Reproduzierbarkeit und Ionensuppression sicherlichsinnvoll ESI-Quellen mit Flüssen unter 300 μL/min und APCI-, APPI- und APLI-Quellen mit Flüssen unter 500 μL/min zu betreiben. Natürlich können applikati-onsbedingt auch größere Flüsse eingesetzt werden, woraus sich allerdings oftmalsdie genannten Probleme ergeben.

1.1.3Massenanalysatoren

Am häufigsten werden folgende Massenspektrometer routinemäßig mit der LCgekoppelt:

• Quadrupol• Triplequad• IonTrap• oaTOF• Orbitrap

Hinsichtlich Empfindlichkeit und Preis-Leistungs-Verhältnis (inkl. Wartung) istein Quadrupol-MS eine sehr sinnvolle Anschaffung. Im Single Ion Mode (SIM)werden sehr gute Sensitivitäten erreicht und bei einem schnellen Quadrupol (abca. 25–50 Hz) kann sogar die UHPLC als schnelle Trennmethode mit demQuadrupol gekoppelt werden.Eine auf dem Quadrupol-MS basierende Weiterentwicklung stellen die Triple-

quadrupol-Massenspektrometer dar, die vor allem bei der Targetanalytik in kom-

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